一、大鼠和人胎、肝、肺微粒体酶对苯并(a)芘代谢的研究（论文文献综述）
黄丽佳[1]（2021）在《基于烟草吸食有害性成分在不同吸烟人群体内代谢的研究》文中认为目前,在烟草与健康的大背景下,开展烟草品质及吸食产生的有害性代谢成分化学与仪器分析技术具有重要意义。本课题前期已研究与烟草品质有关的代谢物仪器分析方法,而与烟草吸食产生的有害性代谢物分析方法的研究将在本论文重点展开。为了科学的研究烟草吸食有害性相关代谢成分,本论文以不同吸烟人群血液为研究对象,建立了四类化学成分苯并[a]芘及其代谢物、烟草特有亚硝胺及其代谢物、烟碱及其代谢物和氧化应激反应关键代谢产物的检测方法,通过测定不同吸烟人群血液中各类化学物质及其代谢物的含量,结合数理统计分析各目标物之间的相互关系,探讨各类化学成分在体内与吸烟暴露量的代谢规律,为烟草与健康之间的相关性规律提供参考。[目的]以不同吸烟人群血液为研究对象,建立化学仪器分析方法检测体内几类烟草化学成分及其关键代谢产物的含量,并探讨吸烟暴露量对人体各类化学成分的代谢差异。[方法]（1）建立了血液中苯并[a]芘及其代谢产物在线液相-液相二维色谱法;血液中烟草特有亚硝胺及其代谢产物在线液相-液相二维色谱法;血液中氧化应激关键代谢产物在线液相-液相二维色谱法;血液中烟碱及其代谢产物的液相色谱-串联质谱法。（2）采用单因素方差分析x±s探讨吸烟暴露量对四类化学成分的代谢差异。（3）采用典型相关分析探讨四类化学成分的相互关系。（4）采用多元统计主成分分析和聚类分析综合评价吸烟暴露量影响四类化学成分的相似性规律。[结果]（1）通过建立不同吸烟人群血液中几类化学成分分析方法。结果表明带有样品净化系统、固相萃取富集功能的在线液相-液相二维色谱检测方法,可以满足吸烟人群血液中痕量及微量烟草化学成分及其代谢产物的测定。可实现样品净化、固相萃取和仪器分析检测同时进行,极大的简化了样品前处理步骤。所构建的方法检测灵敏度高,精密度好,选择性强,实验效果理想。（2）单因素方差分析x±s说明吸烟暴露量对不同人群血液中几类化学成分具有显着的代谢差异,烟草特有亚硝胺类、烟碱类、氧化应激反应类的代谢差异具有明显规律:重度吸烟组>中度吸烟组>轻度吸烟组>不吸烟组;而苯并芘类的代谢差异只在重度吸烟组具有统计学意义。（3）典型相关分析说明几类化学成分相互间具有显着相关性。烟碱类与亚硝胺类、氧化应激类强相关,与苯并芘类中等相关;氧化应激类与亚硝胺类、苯并芘类中等相关;亚硝胺类与苯并芘类弱相关。（4）多元统计分析表明重度吸烟组的四类化学成分指标综合得分最高,与不吸烟组、轻度吸烟组的综合得分具有显着差异,但其含量仍在纳克级别,与健康的深入研究有待进一步探讨。[结论]带有净化系统、固相萃取功能的在线液相-液相二维色谱适用于复杂基质血液中痕量及微量烟草化学成分的测定,且血液样品净化、固相萃取与富集、仪器分析检测可同时进行,极大的简化了样品前处理步骤。方法检测灵敏度高,精密度好,选择性强,实验效果理想。数理统计说明,各类化学成分在体内代谢受吸烟暴露量的影响显着且具有相似性规律,并且各类化学成分间显着相关,各指标在体内代谢相互作用,相互影响。
蔡文建[2]（2020）在《人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究》文中指出目的:通过构建不同组合的人源化肝细胞二维共培养体系,从细胞活性及主要细胞色素酶基因表达层面比较不同共培养体系作为代谢活化系统的优越性,并通过体外微核试验对优势共培养体系的代谢活化能力进行初步的验证,为人源化细胞共培养代谢活化系统在遗传毒性试验和致突变性试验中的应用提供理论基础和技术支持。方法:1.共培养模型的构建及细胞生长状态的观察与测定:应用穿孔法制作共培养6孔板。选择人肝癌HepG2/C3A细胞、人结直肠腺癌Caco-2细胞、人肾小管上皮HK-2细胞、人脐静脉内皮HUVEC细胞、人肝星形LX-2细胞作为共培养模型构建的待选细胞系。分别设置各细胞的单独培养组,四种双细胞共培养组 HepG2/C3A-Caco2（CL）、HepG2/C3A-HK2（CH）、HepG2/C3A-HUVEC（CU）和 HepG2/C3A-LX2（CL）,以及六种三细胞共培养组HepG2/C3A-Caco2-HK2(（COH）、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC（COU）、HepG2/C3A-Caco2-LX2（COL）、HepG2/C3A-HK2-HUVEC（CHU）、HepG2/C3A-HK2-LX2（CHL）和HepG2/C3A-HUVEC-LX2（CLU）。每组设置3个重复。培养基联通后连续培养4d,观察细胞生长情况并应用CCK-8法测量细胞生长情况。单独培养组和共培养组处理一致。2.HepG2/C3A细胞主要代谢活化相关酶基因表达情况:将连通后的共培养组细胞及单独培养细胞继续培养24h后收获细胞,加入裂解液进行裂解提取RNA。在不同共培养模型及单独细胞培养模型中,用RT-qPCR方法测量不同模型中的HepG2/C3A细胞的主要I相代谢酶CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9 以及主要Ⅱ相代谢酶 GSTA1/2 和UGT1A1的表达情况。3.优势共培养代谢活化模型的微核试验初步验证:选取细胞生长状态良好、主要P450代谢酶基因表达水平升高的共培养模型作为代谢活化系统。以体外胞质分裂阻滞微核试验验证模型的代谢活化效能。用典型需要代谢活化的致突变阳性物环磷酰胺（9.5、19和38μg/ml）和不需代谢活化的致突变阳性物甲磺酸乙酯（0.325、0.65和1.3μg/ml）进行染毒,设置空白对照和溶剂（超纯水和DMSO）对照组,试验操作与染毒组一致。滴片后用吉姆萨进行染色,计数1000个双核细胞的微核细胞数。结果:1.共培养模型的构建及细胞生长状态的观察与测定:细胞接种24h后贴壁生长,加培养基连通共培养孔,连续观察4d,细胞生长状况良好,显微镜观察共培养细胞与单独培养细胞的形态均未发生显着变化。培养后2、3、4d的生长情况结果显示:在双细胞共培养模型中,除HepG2/C3A-HK2共培养模型中HK2细胞出现生长抑制,其余三种双细胞共培养模型在共培养2d及4d,细胞生长活性与单独培养的细胞差异无统计学意义（P>0.05）。在三细胞共培养模型中,除HepG2/C3A-HUVEC-LX2共培养模型中各细胞与单独培养时生长情况的差异无统计学意义（P>0.05）,其余各培养组在培养第3d或第4d,其共培养模型细胞活性显着大于单独培养模型中的活性（P<0.05）。2.HepG2/C3A细胞主要代谢活化相关酶基因表达情况:Ⅰ相代谢酶基因表达水平在不同模型中差别较大。CYP1A2基因在HepG2/C3A-HUVEC、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC 和 HepG2/C3A-Caco2-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,分别为单独培养组的6.54、2.34、3.42倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP2B6基因在HepG2/C3A-HUVEC共培养组表达量升高,为单独培养组的1.47倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP2C9基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的4.2倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP2E1基因 在 HepG2/C3A-Caco2、HepG2/C3A-HK2、HepG2/C3A-LX2、HepG2/C3A-HUVEC 和 HepG2/C3A-HUVEC-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,分别为单独培养组的1.63、1.33、1.85、1.62、3.4倍,差异有统计学意义（P<0.05）。CYP3A4基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的2.88倍,差异有统计学意义（P<0.05）。UGT1A1基因在 HepG2/C3A-HK2、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC 和 HepG2/C3A-Caco2-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的2.27、4.40、4.75倍,差异有统计学意义（P<0.05）。GSTA1A2基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的5.11倍,差异有统计学意义（P<0.05）。3.优势共培养代谢活化模型HepG2/C3A-Caco2-LX2的微核试验初步验证:不需要代谢活化的致突变阳性物甲磺酸乙酯染毒后,单独培养组的微核率分别为16‰、15‰、16‰,共培养组微核率分别为14‰、16‰、15‰,二者的微核率无明显差异（P>0.05）。环磷酰胺共培养组微核率（21‰、18‰、16‰）明显高于单独培养组（微核率12‰、13‰、12‰）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.双细胞共培养模型对细胞的生长状况影响较小,三细胞共培养模型中HepG2/C3A-HK2-Caco2共培养模型和HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型的细胞生长活性优于各细胞的单独培养模型,且生长稳定,有望成为稳定的共培养体系。2.HepG2/C3A细胞在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型中主要的Ⅰ相及Ⅱ相代谢酶基因表达升高。3.以HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型作为代谢活化系统能够在不加入S9的情况下验证致突变阳性物环磷酰胺的致突变性。
傅志强[3]（2017）在《P450酶活性中心催化有机阻燃剂和多环芳烃转化机制的计算模拟》文中提出细胞色素P450酶催化转化是多数外源化合物在生物体内代谢消除的重要途径。P450酶代谢转化能够起到解毒作用,使污染物极性增强,促进其排泄过程;然而,反应过程的中间体或产物可能易与生物大分子（如蛋白质、核酸）结合产生毒性增强效应。因此,研究P450酶的代谢反应机制对评价有机污染物的生物转化归趋、毒理效应和健康风险具有重要意义。基于活体动物和试管实验等传统方法探究P450酶代谢转化过程面临动物伦理、耗时费力、依赖设备、化学标准品缺乏等困境,难以捕捉和定性高活性反应中间物种,难以满足数量巨大且不断增长的有机化学品生态风险评价的客观需求。因此,有必要发展外源化合物的P450酶代谢转化路径和产物的预测方法。随着量子化学理论方法的快速发展以及计算机性能的高速提升,计算模拟已成为解决上述问题的重要手段,在预测有机物的理化性质、环境转化路径和产物分布、动力学等方面具有优势。已有P450酶催化反应机制的研究主要集中于常规化学底物（如烷烃、苯等）、内源激素、药物分子等。相比之下,种类众多且结构各异（烷基、芳基、卤代）的环境有机污染物的P450酶代谢转化机制仍有待揭示。本研究采用计算模拟方法,考察了 P450酶活性中心（Compound Ⅰ）催化典型阻燃剂和多环芳烃类污染物的代谢转化机制,揭示了 Compound Ⅰ催化转化多溴联苯醚（PBDEs）生成二羟基化（di-HO-PBDEs）和多溴二苯并二恶英（PBDD）产物的分子机制,预测了典型有机磷系阻燃剂（OPFRs）被Compound Ⅰ代谢转化的路径和产物,阐明了多环芳烃（PAHs）被Compound Ⅰ代谢活化反应特征及其与P450酶的结合模式,具体研究内容和结论如下:（1）采用量子化学密度泛函理论（DFT）计算,以2,2’,4,4’-四溴联苯醚（BDE-47）为模型化合物研究了 PBDEs被Compound Ⅰ催化转化的机制,发现PBDEs首先被Compound Ⅰ氧化产生羟基化产物（HO-PBDEs）。苯环碳原子π加成是反应的限速步骤,PBDEs未取代碳原子是优势反应位点,且低溴代PBDEs更容易反应。与PBDEs羟基化机制不同,di-HO-PBDEs需要以HO-PBDEs为先导底物,通过Compound Ⅰ催化的HO-PBDEs酚羟基摘氢和羟基反弹机制生成。二羟基化过程不涉及环氧化物中间体,解释了环氧化物水解酶对反应结果无影响的实验现象。计算发现仅有异环di-HO-PBDEs（OH连接醚键邻位和间位碳原子）能进一步代谢成PBDD:di-HO-PBDEs与Compound Ⅰ发生酚羟基摘氢反应,生成的二酮中间体经芳基双自由基偶联机制生成HO-PBDD。产物结构已被PBDEs大鼠肝微粒体代谢实验证实。（2）基于DFT计算和分子对接方法,以磷酸三苯酯（TPHP）、三（2-丁氧乙基）磷酸酯（TBOEP）和三（1,3-二氯-2-异丙基）磷酸酯（TDCIPP）为模型化合物,预测了 OPFRs被Compound Ⅰ代谢转化的机制。发现TPHP发生苯环羟基化,TBOEP和TDCIPP发生烷烃羟基化。OPFRs的代谢反应活性具有结构依赖性,反应由易到难的次序为:烷基取代（TBOEP）>芳基取代（TPHP）>氯烷基取代（TDCIPP）。TPHP苯环羟基化产物与TBOEP/TDCIPP烷烃羟基化产物的二次代谢反应机制各有差异,预测的主要产物与他人试管实验的结果相符。揭示了 TPHP经质子穿梭形成para-HO-TPHP及OPFRs经O-脱烷基/芳基反应生成相应的二酯类产物（DPHP,BBOEP,BDCIPP）的新机制。还发现磷酸二酯类产物的进一步代谢过程受到分子解离形态的影响,离子化使得DPHP和BDCIPP反应活性增强,但显着降低BBOEP的反应活性。（3）基于DFT计算和分子对接方法,研究了 Compound Ⅰ催化16种美国环保局优先控制PAHs的代谢反应,并考察了人CYP1A2酶与PAHs的结合过程。发现Compound I与16种PAHs芳烃碳原子的π加成反应具有位点选择性。在五种可能产物（环氧化物、四面体加和物、环己烯酮、N-质子化中间体和羟基化产物）中,环氧化物是主要的中间产物。发现6种致癌性PAHs（窟、茚并[1,2,3-c,d]芘、苯并（g,h,i）芘、二苯并（a,b）蒽、苯并（a）芘和苯并（a）蒽）K区碳原子与Compound Ⅰ的π加成反应能垒和显着小于其他区域,容易生成K区环氧化物,与前人代谢实验结果一致。分子对接计算发现PAHs与CYP1A2的结合作用主要取决于PAHs的环数目和疏水性（Kow）。6种致癌性PAHs的M区原子与CYP 1A2活性中心距离最近,阐明了双区理论中M区最容易被代谢的原因。
宁静[4]（2017）在《中药蟾酥中蟾蜍甾烯类活性成分的体外代谢研究》文中研究表明背景:蟾酥是由蟾蜍科两栖爬行动物的耳后腺及皮肤腺分泌物经加工而成,是我国着名传统中药材。蟾蜍甾烯类化合物是中药蟾酥中的主要药效成分,是麝香保心丸、六神丸、六应丸等着名中药复方的重要活性成分,具有强心、局部麻醉抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。随着蟾蜍甾烯类化合物抗肿瘤活性越来越受到重视,针对该类化合物的新药开发案例不断涌现。虽然蟾毒灵等蟾蜍甾烯类化合物对多种人源肿瘤细胞显现了极强的杀伤能力,该类化合物在活体内的药效活性并不令人满意,提示其成药性上可能存在缺陷。多方面信息证实,蟾蜍甾烯在人及实验动物中均会被快速代谢清除,严重影响其体内药效发挥。目前,蟾蜍甾烯类化合物的体内代谢研究时有报道,但绝大多数代谢研究均是基于实验动物开展的。然而,考虑到药物代谢酶等药物处置蛋白上普遍存在的显着种属间差异,这些信息及数据的可信程度仍值得商榷。时至今日,蟾蜍甾烯在人体内及不同种属实验动物体内的代谢路径,以及蟾蜍甾烯与其他药物间的代谢酶介导的潜在相互作用均尚未被很好的研究与揭示。目的:1)明确中药蟾酥中主要蟾蜍甾烯类化合物在人体内的主要代谢路径,关键代谢酶及动力学行为;从定性和定量两方面剖析蟾蜍甾烯取代基变异对其代谢酶选择性及代谢速率的影响。2)寻找蟾蜍甾烯代谢酶选择性及催化效率的关键决定因素,揭示清除的关键代谢酶以及结构代谢规律。3)系统开展蟾蜍甾烯类化合物的代谢种属间差异研究,从代谢角度分析及比较人与常用实验动物处置蟾蜍甾烯类化合物的相似性及差异性。4)开展蟾蜍甾烯-人体关键代谢酶细胞素色P450相互作用研究,分别明确蟾蜍甾烯代表性化合物蟾毒灵对细胞素色P450的抑制情况以及潜在共服药物对细胞素色P450介导的蟾毒灵代谢的影响效果。为蟾蜍甾烯类新药的研发以及含该类成分的中药复方在临床的安全合理使用提供研究基础和理论依据。方法:1)首先借助体外代谢研究手段,利用人源肝组织匀浆,以代表性蟾蜍甾烯为研究对象,开展的I相及II相代谢路径研究。经由代谢轮廓分析、代谢产物制备等研究手段对该类化合物的代谢物谱进行确证;经由特异性抑制剂抑制分析、相关性分析等对该类化合物的主要代谢酶进行归属;经由代谢动力学分析、清除半衰期等研究对该类化合物的代谢稳定性进行表征。2)此外,借助分子对接计算化学手段,揭示负责催化蟾蜍甾烯代谢的关键氨基酸及影响代谢过程的核心结构域。3)借助体外代谢抑制研究手段,分别开展蟾毒灵对细胞色素P450的抑制选择性、抑制能力（IC50）、抑制动力学及参数（Ki、KI、Kinact）、抑制机制研究,以及蟾毒灵共服药物对细胞色素P450介导的蟾毒灵代谢的抑制能力研究（IC50）。结果:一、蟾蜍甾烯体外代谢属性研究1)I相代谢研究:在前期对华蟾毒精I相代谢的基础上,分别对蟾毒灵、脂蟾毒配基、蟾毒它灵、日蟾毒它灵和沙蟾毒精的I相代谢路径开展了系统的研究。研究发现,在人肝微粒体中,上述蟾蜍甾烯均选择性被细胞色素P450 3As（包括CYP3A4和CYP3A5）催化代谢,主要分别生成1-羟基和5-羟基产物。然而,蟾蜍甾烯化合物间在代谢稳定性,以及与CYP3A4、CYP3A5的催化选择性、动力学参数上存在显着差异。2)蟾蜍甾烯结构-细胞色素P450 3As（CYP3As）关系研究:研究发现,蟾蜍甾烯与CYP3As的亲和力参数Km分别与该类化合物在人肝微粒体中的代谢稳定性以及与CYP3A5在I相代谢路径中的贡献具有一定的相关性。针对人肝微粒体中的动力学参数分析发现,人肝微粒体中Km值小的蟾蜍甾烯清除率则偏高,代谢稳定性较差。而针对人重组单酶CYP3A中Km分析发现,多种取代基的引入可不同程度的改变蟾蜍甾烯与CYP3A4和CYP3A5的亲和力,影响CYP3A4和CYP3A5在蟾蜍甾烯代谢中的贡献率。蟾蜍甾烯-I相代谢关系如下:11位羟基、12位酮基可增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性;16位乙酰基、19位醛基在降低与CYP3A4的亲和力同时增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性。3)II相代谢研究:分别对华蟾毒精、蟾毒灵、脂蟾毒配基、远华蟾毒精、去乙酰基华蟾毒精、蟾毒它灵的II相代谢路径开展了系统的研究。在人肝S9中,上述蟾蜍甾烯会选择性被磺酸转移酶2A1催化代谢,生成产物3-O-磺酸盐。不同蟾蜍甾烯的3位磺酸结合反应符合底物抑制动力学,但动力学参数Km、Ksi和Vmax等均变化显着。4)蟾蜍甾烯结构-磺酸转移酶2A1（SULT2A1）关系研究:研究结果揭示,蟾蜍甾烯3位羟基构型是决定该类化合物能否发生磺酸结合反应的关键,SULT2A1催化活性空腔中His99是负责识别蟾蜍甾烯类化合物的关键氨基酸残基。而蟾蜍甾烯在SULT2A1活性空腔中的构象与朝向,及其与His99间的能否形成相互作用等均是影响磺酸结合反应能否发生的关键因素。研究蟾蜍甾烯-II相代谢关系如下:亲水取代基（如C11、C14、C16位羟基）会显着削弱蟾蜍甾烯与SULT2A1的亲和力,而C5位羟基作为例外则会显着增强与SULT2A1的亲和力;C19位醛基会阻碍磺酸结合反应;C16位乙酰基会降低与SULT2A1的亲和力。二、蟾蜍甾烯体外代谢种属差异研究1)I相代谢种属差异研究:在多种动物肝微粒体中,蟾蜍甾烯类化合物蟾毒灵和脂蟾毒配基的代谢轮廓与人肝微粒体中较为相似。CYP3A亚家族是催化该反应的主要代谢酶。然而,不同种属间微粒体催化蟾毒灵和脂蟾毒配基代谢的动力学行为和动力学参数上显着差异。小型猪和小鼠肝微粒体催化蟾毒灵发生5位羟化反应的动力学行为及相关参数与人肝微粒体观察到的相关信息更为相近,而猴肝微粒体介导的脂蟾毒配基的5位羟化反应在动力学行为上与脂蟾毒配基在人肝微粒体中的代谢行为更为相近。猴肝微粒体催化5位单羟化产物生成的效率显着高于人肝微粒体和其他动物肝微粒体,小鼠肝微粒体中蟾毒灵和脂蟾毒配基5位羟化反应的清除率与人肝微粒体中对应的数值更为相近。2)II相代谢种属差异研究:在多种动物肝微粒体中,小鼠和狗S9缺少磺酸结合代谢路径,而在大鼠、兔、豚鼠、小型猪、猴S9中,蟾毒灵和脂蟾毒配基的代谢路径与人肝S9中一致。不同动物种属中SULT2A1是催化该反应的主要代谢酶。兔肝S9催化二者磺酸结合产物生成效率高,磺酸结合产物在肝S9间的体外代谢内在清除率顺序为兔或人>小型猪>豚鼠>猴>大鼠。三、蟾毒灵对细胞色素P450 3As的抑制作用研究1)蟾毒灵（BF）和其3位氧化代谢产物3-酮-蟾毒灵（KBF）是细胞色素P450 3As（CYP3As）的强选择性抑制剂,IC50值分别是10.4和0.22μM。抑制动力学研究提示BF和KBF对CYP3As的抑制均符合混合抑制模型,Ki分别为1.90和0.20μM。2)BF对CYP3A4的抑制作用存在基于时间的抑制情况,这种现象产生的原因与CYP3A4介导的KBF生成有关系,提示BF对CYP3A4的抑制作用属于自杀式抑制。不仅如此,KBF与人肝微粒体催化孵育30分钟后可进一步提高对CYP3A4的抑制作用,IC50值由0.37降低至0.036μM。BF和KBF对CYP3A4的失活呈现时间-和浓度-依赖的特性,并符合一级动力学过程。在人肝微粒体中,BF失活CYP3As的KI和Kinact分别为21.1μM和0.141 min-1;KBF失活CYP3As的KI和Kinact分别为0.66μM和0.064 min-1。在人CYP3A4重组单酶中,BF失活CYP3A4的KI和Kinact分别为1.13μM和0.097 min-1;KBF失活CYP3A4的KI和Kinact分别为0.25μM和0.161 min-1。3)通过清洗试验和保护剂保护实验对KBF介导的CYP3A4基于时间抑制作用的机制进行初步揭示。研究提示KBF可能通过代谢生成的高活性代谢产物而诱发对CYP3A4的不可逆抑制作用。抑制过程可能导致CYP3A4功能快速丧失而引发严重的药物药物相互作用,亦或导致蟾毒灵以及其结构类似物代谢受阻而诱发急慢性心脏毒、肝毒性以及其他难以预料的严重毒性反应。结论:1)细胞色素P450介导的羟化反应和磺酸转移酶介导的磺酸结合反应分别被鉴定为蟾蜍甾烯系列化合物在人体中代谢清除的I相和II相代谢路径。蟾蜍甾烯的5位和1位碳是该类化合物的主要羟化位点,催化这一代谢反应的代谢酶被归属为细胞色素P450 3As。此外,蟾蜍甾烯的3位羟基是该类化合物的主要磺酸结合位点,催化这一代谢反应的代谢酶被归属为磺酸转移酶2A1。而蟾蜍甾烯3位羟基构型是决定该类化合物能否发生磺酸结合反应的关键。2)蟾蜍甾烯类化合物结构母核上的取代基可显着影响自身与代谢酶的相互作用,因此,这类化合物在人体内的代谢行为和动力学参数千差万别。研究发现,蟾蜍甾烯结构母核上不同位点的取代基可显着影响蟾蜍甾烯与代谢酶CYP3As和SULT2A1的结合作用,集中体现于表观动力学参数Km值。蟾蜍甾烯-I相代谢关系研究提示,11位羟基、12位酮基可增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性;16位乙酰基、19位醛基在降低与CYP3A4的亲和力同时增强与CYP3A5的亲和力,提升CYP3A5的催化选择性。研究蟾蜍甾烯-II相代谢关系时发现:亲水取代基（如C11、C14、C16位羟基）会显着削弱蟾蜍甾烯与SULT2A1的亲和力,而C5位羟基作为例外则会显着增强与SULT2A1的亲和力;C19位醛基会阻碍磺酸结合反应;C16位乙酰基会降低与SULT2A1的亲和力。3)多种实验动物肝制备物中蟾蜍甾烯类化合物蟾毒灵和脂蟾毒配基的I相和II相代谢轮廓与人肝制备物中二者的代谢轮廓较为相似,但小鼠和狗肝S9缺少磺酸结合代谢路径。CYP3As和SULT2A1被分别鉴定为不同种属动物肝脏中介导蟾毒灵和脂蟾毒配基发生I相和II相代谢的主要代谢酶。然而,不同种属间肝脏制备物对蟾毒灵和脂蟾毒配基的催化效率间存在显着差异。4)蟾毒灵和其3位氧化代谢产物3-酮-蟾毒灵是CYP3A4的强选择性抑制剂。我们首次发现3-酮-蟾毒灵可能通过代谢生成的高活性代谢产物而诱发对CYP3A4的不可逆抑制作用。而正是在此过程中,CYP3A4由于介导蟾毒灵的代谢而引起了自身催化功能的丧失,属于自杀式抑制作用。因此,蟾毒灵及其代谢产物对CYP3A4的抑制作用不仅会影响蟾毒灵及其结构类似物的代谢,还可能通过灭活CYP3A4而干扰其他共服药物的代谢而导致严重的药物药物相互作用。
邓义佳[5]（2016）在《调控肝微粒体酶对鱼/虾中常见真菌毒素危害的消减机制》文中研究表明背景:随着国家对农业的高度重视,水产养殖的规范化为农业经济开辟了巨大的前景。但科学普及程度较低使养殖专业化不高,水产养殖过程中易出现各种问题且不能得到及时解决。如养殖过程中饲料受潮发霉产生真菌毒素污染,严重制约着水产养殖业的发展。近年来,水产饲料的生产逐渐以廉价的植物性蛋白源取代动物蛋白源,在降低生产成本的同时也增加了真菌毒素污染的风险,且水产饲料在生产、运输和贮藏过程中都有可能发生霉变。由霉变产生的真菌毒素,极其容易造成鱼、虾等水生动物生长减缓,机体损伤使毒素代谢率降低,加工成水产食品极易出现毒素残留,造成严重的食品安全问题,危害人体健康。研究表明,芦丁、槲皮素及茶多酚等植物性次生代谢产物对酶活性具有诱导效应,且代谢酶具有可诱导性。因此,可通过由饲料引入诱导剂对代谢酶进行调控,增加水产动物对真菌毒素的代谢能力,降低损伤和毒素残留。对控制水产品真菌毒素暴露的危害具有重要意义。目的:研究T-2、AFB1、OTA、DON毒素经饲料暴露对凡纳滨对虾和罗非鱼生长、代谢及病理损伤效应,并通过引入槲皮素、芦丁和茶多酚三种诱导剂,对四种真菌毒素对对虾和罗非鱼损伤的拮抗效应进行研究。方法:采用微胶囊饵料法制备含有四种真菌毒素、三种诱导剂、均含有毒素与诱导剂的鱼虾饲料;采用20 d定期递增法对鱼虾进行饲喂染毒;采用LC-MS/MS法对鱼/虾肝部位和肌肉进行真菌毒素残留检测;采用病理学组织观察及代谢酶活性检测方法,探究真菌毒素对水产动物的蓄积损伤效应以及诱导剂对损伤的拮抗效应。结论:（1）四种真菌毒素暴露使对虾与罗非鱼增重率、存活率明显下降,对虾肝细胞均呈现不同程度损伤,其中胚细胞减少最为明显,高剂量暴露后出现细胞自噬现象。DON暴露后罗非鱼肝细胞呈浅染紫色,细胞质内肝糖原显着消耗。随真菌毒素暴露剂量升高,对虾与罗非鱼肌纤维间隙增大,肌肉碎片化明显,20 d可明显观察到单条状纤维,说明毒素暴露对肌肉的损伤具有不可修复性。真菌毒素暴露剂量与对虾机体内残留量呈明显正相关。对虾肝胰腺内四种真菌毒素残留蓄积顺序为:AFB1>T-2>OTA>DON。罗非鱼肝脏毒素残留顺序为T-2>AFB1>OTA。I、II相代谢酶活性呈倒“U”型变化趋势,符合毒物刺激效应模型。（2）槲皮素、芦丁和茶多酚添加后鱼虾增重率与存活率明显降低。芦丁添加显着升高对虾肝重比,对虾肝细胞出现星状管腔异常,轻微空泡化,细胞溶解现象较为明显。槲皮素次之,茶多酚肝细胞损伤最小。三个诱导剂组中对虾和罗非鱼均呈现肌纤维间隙增多现象。对虾和罗非鱼肝微粒体细胞色素b5含量均显着升高,说明三种添加物对激活由b5介导的还原反应均具有显着效果。槲皮素、芦丁和茶多酚组SULT酶活性呈现显着性升高。茶多酚添与槲皮素和芦丁组相比,诱导酶种类相对较多,且病理组织学损伤明显低于槲皮素和芦丁组。（3）DON与诱导剂联合暴露后对虾增重率显着升高,但在四种毒素中仍然最低。AFB1组罗非鱼肝重比与其他真菌毒素组相比相对较高、增重率下降,说明AFB1在罗非鱼机体内强蓄积。T-2、AFB1、OTA、DON与诱导剂联合暴露后残留量均比单独暴露组低,表明诱导剂在消除毒素残留方面具有一定的效果。其中茶多酚对T-2、AFB1消减效果较好,芦丁对OTA与DON消减较好。对虾和罗非鱼肌肉中残留蓄积及组织损伤程度均比肝组织强。茶多酚诱导的四种真菌毒素暴露后对虾和罗非鱼损伤最小,细胞结构相对完整,且茶多酚诱导使机体b5含量升高,对代谢酶诱导率较高,说明茶多酚对真菌毒素暴露后对虾和罗非鱼损伤的拮抗效应最为明显。因此,茶多酚可作为添加入饲料以降低真菌毒素对水产动物机体损伤的最佳酶诱导剂。
季明辉[6]（2016）在《香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究》文中进行了进一步梳理在人类57种CYP450酶中,仅有十几个酶负责外源化学物的代谢,这些代谢酶存在组织特异性,人细胞色素P450 2A13 （CYP2A13）是一种主要在呼吸系统中表达的肝外代谢酶。前期研究发现,CYP2A13高效代谢活化AFB1生成多种代谢产物,与I)NA、RNA和蛋白质等生物大分子结合形成加合物,引发细胞毒性、炎症、DNA损伤、肿瘤等毒效应。吸烟导致呼吸道损伤,而长期吸烟易高发肺癌,NNK和尼古丁是香烟烟雾中公认的CYP2A13底物,研究表明NNK可经CYP2A13的代谢活化导致小鼠肺癌的发生。尼古丁是香烟烟雾抽提物（CSE）中含量最多的物质,约占CSE总含量的1%。研究表明,尼古丁及其代谢产物介导的物质毒性相对较低,但可能导致CYP2A13的急剧消耗,进而抑制CYP2A13对香烟烟雾其他物质的代谢活化。前期研究发现,去除尼古丁可导致CYP2A13介导的CSE毒性显着增强,由于NNK在CSE中的含量很低,因此推测CSE中可能存在含量相对较高的CYP2A13新底物。为此,本研究利用标准参比烟3R4F,采用经高效液相色谱系统结合已经建立的稳定表达人CYP2A13的BEAS-2B细胞（B-2A13）,解析CSE中与CYP2A13代谢活化相关组分,并进一步分离、纯化和鉴定,试图发现CYP2A13的新底物；然后利用体外代谢反应进一步确定与CYP2A13代谢相关的单体；再利用B-2A13和B-2A5细胞以及CYP2A5敲除小鼠（CYP2A5-/-）,系统阐明CYP2A13在代谢活化候选单体所致呼吸道损伤中的作用,明确CYP2A13与候选CSE组分单体的关系。研究结果不仅可为吸烟所致呼吸系统损伤的机制研究提供新的研究策略,也可为控制吸烟并寻找切实可行的预防控制措施提供依据,有望为环境空气污染物／致癌物的健康风险评估提供可行的技术支撑。第一部分CSE中CYP2A13的新底物5-HMF的发现与鉴定目的：利用色谱技术结合细胞毒性评价,初步筛选CSE中与CYP2A13代谢相关的组分,并利用质谱和核磁共振技术鉴定出候选化学物。方法：利用HPLC将CSE分离及通过B-2A13与B-V细胞毒性筛选毒性组分、候选组分的进一步分离、纯化后采用GC-MS/MS、NMR、HPLC鉴定,运用纯品进行B-2A13与B-V细胞代谢毒性验证,并与标准品进行毒性比对确认。结果：（1）利用HPLC将CSE分为尼古丁部分和非尼古丁部分,结果发现,非尼古丁部分对B-2A13细胞的毒性显着增强,4%浓度时的细胞活力仅10%左右,且可被CYP酶抑制剂8-MOP所逆转,而尼古丁部分的毒性较弱；（2）按照CSE在HPLC中的保留时间按每10min收集为4组,分别处理B-2A13细胞和B-V细胞,结果发现前10min的组分细胞毒性最强,而含NNK的组分（10-20 min）并未显示出明显毒性；将前10min组分按每分钟收集再处理细胞,发现5min段的组分细胞毒性最强； （3）将5min段的CSE组分进行再分离、纯化、浓缩后进行鉴定,GC-MS/MS显示该组分单体在4.88min处有明显的吸收峰,结合离子特征和数据库,推定可能为5-羟甲基糠醛（5-HMF）; NMR的检测结果也证明,该物质与5-HMF的结构极为相似； （4）无论是HPLC检测还是细胞毒性实验,均显示该物质与5-HMF标准品完全一致。结论：CSE中存在CYP2A13的新的底物,该物质极有可能是5-HMF,且可被CYP2A13代谢活化增强其细胞毒性。第二部分CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性研究目的：构建体外代谢反应体系,评价CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性,明确两者间的代谢关系。方法： （1）为了获得有蛋白活性的CYP2A13,建立了POR与CYP2A13蛋白在Baculovirus/sf9中共表达的体系： 首先通过分子克隆构建pFastBac-dual-POR-CYP2A13质粒,再运用DH10Bac大肠杆菌将其转化为杆状病毒)NA （Bacmid-POR-CYP2A13）,然后将杆状病毒DNA转化入sf9细胞产生CYP2A13-POR的病毒液并表达有代谢活性的CYP2A13和POR蛋白。（2）采用western b1 ot检测CYP2A13和POR蛋白的表达、经CO差示光谱法和细胞色素C还原法分别检测CYP2A13和POR蛋白的活性、以NNK为代谢底物检验共表达CYP2A13和POR蛋白的代谢能力。（3）将制备的CYP2A13蛋白用于5-HMF的代谢研究中,分析其代谢产物,评价其代谢动力学和代谢活性。结果：（1）采用Baculovirus/Sf9系统体外联合表达CYP2A13和POR蛋白,免疫印迹结果显示,所获得的微粒体蛋白中存在较明亮的CYP2A13和POR蛋白的特异性条带,提示联合表达成功；（2）经CO差示光谱法和细胞色素C还原法,CYP2A13活性为0.62 pmol/min/pmol蛋白,POR蛋白的活性为38.9nmol/min/mg蛋白；采用CYP2A13的经典底物NNK进行验证,结果显示表达的CYP2A13可显着代谢NNK生成其代谢产物NNAL,代谢动力学结果显示其代谢活性为：Vmax （pmol/min/pmol）:2.5±0.4; Km （μM）:12.0±2.6; Vmax/Km：0.208；进一步提示所表达的CYP2A13表达具有良好的代谢活性； （3）CYP2A13可在120min内将5-HMF完全代谢生成其代谢产物5-HMFA;代谢动力学结果显示其代谢活性为：Vmax （pmol/min/pmol）:2.7±0.2; Km （μM）: 50.9±8.3; Vmax/Km:0.05;结果提示CYP2A13对5-HMF有较好的代谢活性。结论：体外成功地表达了具有较好活性的CYP2A13和POR蛋白,5-HMF是CYP2A13的新的底物。第三部分CYP2A13/CYP2A5对CSE中5-HMF所致呼吸毒性的影响目的：通过动物实验,初步阐明CYP2A13在代谢5-HMF及其所致小鼠呼吸系统急性损伤中的作用。方法：小鼠CYP2A5与人CYP2A13同源,两者在功能上非常接近,由于同步构建的人源化CYP2A13小鼠未能在呼吸系统检测到CYP2A13蛋白,因此采用同期构建的CYP2A5敲除小鼠（CYP2A5-/-）进行功能研究。（1）为评价CYP2A5与CYP2A13在代谢活化5-HMF中的功能差异,先利用pLJM慢病毒体系构建稳定表达CYP2A5的BEAS-2B细胞（B-2A5）；经鉴定构建成功后,检测其5-HMF的代谢毒性,并与B-2A13细胞的代谢毒性相比较。 （2）5-HMF鼻腔滴注染毒CYP2A5-/-小鼠以及野生型小鼠,通过病理学检查比较两者的鼻腔、肺损伤；通过检测肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞数量与种类以及炎症因子的表达比较两者肺部炎症情况。结果：（1）经GFP验证,拟构建的B-2A5细胞绿色荧光明亮、充满,转染效率接近100%； （2）细胞毒性结果显示,5-HMF对B-2A5和B-2A13细胞的毒性基本一致,且都可以被8-MOP所逆转,提示CYP2A5对5-HMF也具有相近的代谢活化作用； （3）动物实验显示,5-HMF处理的野生型小鼠可见鼻中隔粘膜结构破损断裂、纤毛脱落,大量嗜酸性粒细胞浸润,而CYP2A5-/-小鼠的纤毛结构完整、上皮细胞排列整齐；野生型小鼠的肺部炎症明显、肺泡壁细胞显着增厚,而CYP2A5-/-小鼠肺的炎症不明显；5-HMF处理的野生型小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞显着高于5-HMF处理的CYP2A5-/-小鼠,肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6、TNF-α的浓度也显着升高。结论：CYP2A5可显着介导5-HMF的呼吸毒性,由于CYP2A5与CYP2A13的同源性以及对5-HMF代谢活化作用的一致性,因此可以推断CYP2A13可以通过代谢活化5-HMF导致呼吸系统的急性损伤。
李淑均[7]（2014）在《VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及机制研究》文中研究说明冠心病（coronary artery diseases, CAD）是一种常见的严重危害人们身心健康的疾病,动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是其病理生理基础,研究表明内皮功能不全及炎症反应是动脉粥样硬化形成的核心环节,但其机制尚未完全阐明。血管过氧化物酶（Vascular peroxidase, VPO）是本课题组发现并命名的一种新的过氧化物酶,其为过氧化物酶家族成员之一,与髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）具有高达44.5%的同源性,二者均可催化过氧化氢（H202）（弱氧化剂）成为次氯酸（HOC1）（强氧化剂）从而发挥其生物学功能,与MPO主要由中性粒细胞和单核巨噬细胞分泌不同,VPO主要存在于血管及心肌组织中,目前已证实VPO具有两种亚型,VPO1和VP02,在血管内皮中的以VPO1表达为主。我们之前的研究证实冠心病患者血浆中VPO1浓度显着升高,且与氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）呈明显正相关。此外,VPO1基因沉默后可显着抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡,其机制与抑制NADPH gp91phox蛋白表达,从而抑制ROS/p38MAPK/caspase-3通路有关,提示VPO1可能与AS发生发展密切相关。但目前VPO1在AS形成中的作用及机制尚不完全清楚。因此,本研究拟探讨VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及其机制。本研究将有助于阐明VPO1的生物学功能,为研发新的抗动脉粥样硬化药物提供理论依据。第一部分VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全中的作用及机制目的：从分子细胞水平,运用转染VPO1shRNA等分子生物学技术,探讨VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全中的作用及其机制。方法：实验分为两个部分：（1）研究ox-LDL诱导内皮细胞VPO1的表达。分组如下：量效实验：分为4组：对照组和不同浓度的ox-LDL组（用含50μng/ml、100μg/ml及200μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24h）。时效实验：分为8组：不同时间的对照组（不加任何干预因素,用培养基培养内皮细胞0、12、24、48h）和ox-LDL组（用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞0、12、24、48h）,提取细胞总蛋白,采用western-blot方法检测细胞内VPO1的表达,采用荧光法检测细胞内HOC1水平。（2）研究VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞NO/eNOS/DDAH/ADMA系统及细胞内HOCl生成的影响。分组如下：分为6组：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA（非特异性sh RNA）后,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；ox-LDL组：用含109μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA（非特异性sh RNA）后,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；提取细胞上清液检测NO（氧化还原法）及ADMA含量（HPLC法）,提取细胞总蛋白采用western-blot方法检测细胞内eNOS/DDAH的表达,采用荧光法检测细胞内HOCl水平。结果：（1） ox-LDL显着促进内皮细胞VPO1蛋白表达及HOCl水平。（2）与对照组相比,ox-LDL （100μg/ml）培养内皮细胞24h显着抑制内皮细胞NO生成、eNOS及DDAH表达,而VPO1基因沉默可逆转ox-LDL对内皮细胞的上述抑制作用,转染非特异性shRNA对ox-LDL的损伤作用无显着影响。VPO1基因沉默的内皮细胞或转染非特异性shRNA的内皮细胞,对细胞NO、eNOS及DDAH无显着影响。（3）与对照组相比,ox-LDL （100μg/ml）培养内皮细胞24h显着增加内皮细胞上清液中ADMA含量,促进内皮细胞内HOCl生成, VPO1基因沉默可显着降低ox-LDL诱导的ADMA及HOCl水平,而转染非特异性shRNA对ox-LDL诱导的ADMA及HOCl含量升高无显着影响。VPO1基因沉默的内皮细胞或转染非特异性shRNA的内皮细胞,对细胞ADMA及HOCl含量无显着影响。结论：（1）证实ox-LDL可显着增加内皮细胞VPO1表达；（2）成功构建VPO1基因沉默的内皮细胞模型,并首次发现VPO1调控了ox-LDL诱导的内皮细胞NO生成,其机制与HOCl/DDAH/ADMA/eNOS通路有关。第二部分VPO1在ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应中的作用及机制目的：探讨VPO1在ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应中的作用及其机制。方法：实验分为三个部分：（1）VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞的ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表达的影响。实验分组如下：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA（非特异性sh RNA）后,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;ox-LDL组：用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA（非特异性sh RNA）后,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；提取细胞蛋白采用western-blot方法检测ICAM-1、P-selectin、 NF-κB和p38MAPK的蛋白表达。（2）HOCl对内皮细胞ICAM-1和P-selectin蛋白表达的影响。分为4组：对照组和不同浓度的HOCl组（用含3μM、10μM及30μM HOCl的培养液孵育内皮细胞24h）,提取蛋白,采用western-blot方法检测细胞内ICAM-1和P-selectin的蛋白表达。（3） HOCl对内皮细胞NF-κB和p38MAPK的影响。分组如下：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；SB203580组：加入终浓度为20μM的SB203580（p38MAPK的特异性阻断剂）孵育细胞1h后,用PBS继续孵育内皮细胞24小时；PDTC组：加入终浓度为100μM的PDTC（NF-κB的特异性阻断剂）孵育细胞1h后,用PBS继续孵育内皮细胞24小时；HOCl组：用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时；+SB203580组：加入终浓度为20μM的SB203580（p38MAPK的特异性阻断剂）孵育细胞1h后,用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时；+PDTC组：加入终浓度为100μM的PDTC （NF-κB的特异性阻断剂）孵育细胞1h后,用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时。采用western-blot方法检测细胞内NF-κB和p38MAPK的蛋白表达。结果：（1）与对照组相比,ox-LDL （100μg/ml）培养内皮细胞24h显着促进内皮细胞ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.01）；而VPO1基因沉默可显着抑制ox-LDL诱导的内皮细胞上述蛋白表达,转染非特异性shRNA对ox-LDL的促炎作用无显着影响。VPOl基因沉默的内皮细胞或转染非特异性shRNA的内皮细胞,对细胞ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表达无显着影响。（2）3μM、10μM及30μM GOCl孵育内皮细胞24h呈浓度依赖性地增加内皮细胞ICAM-1和P-selectin蛋白表达,与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）。（3）用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时,可显着促进内皮细胞内NF-κB的蛋白表达,与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）,预先给予20μM SB203580（p38MAPK的特异性阻断剂）或100μM的PDTC （NF-κB的特异性阻断剂）孵育细胞1h后,可显着抑制HOCl诱导的NF-κB蛋白表达,但预先给予100μM的PDTC孵育细胞1h后,对HOCl诱导的p38MAPK蛋白表达无明显抑制作用。结论：VPO1基因沉默后,可显着抑制ox-LDL诱导的内皮细胞炎症因子P-selectin和ICAM-1表达,其机制与抑制HOCl生成,从而抑制p38MAPK/NF-κB通路有关。
齐琳[8]（2013）在《苯并[a]芘对大鼠肝脏生物标志物的研究》文中研究指明目的：检测苯并[a]芘（BaP）染毒大鼠肝组织中3-羟基苯并[a]芘（3-OHBaP）、（+）-anti-7,8-二氢二醇-9,10-环氧苯并[a]芘（BPDE）-DNA加合物、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、丙二醛、8羟基脱氧鸟苷的含量，研究其变化规律以及苯并[a]芘对大鼠肝脏组织的暴露生物标志物和效应生物标志物的可行性。方法：准确称取一定量的BaP标准品溶于玉米油中，配置成高剂量100mg/kg、中剂量50mg/kg、低剂量5mg/kg的灌胃液待用。雄性SD大鼠224只，体重180-220g，随机分为A、B、C、D四个组。A、B、C三个组为暴露组，分别为高、中、低剂量组，每组56只。D组为非暴露空白组。所有大鼠处理前12h禁食，自由饮水。A、B、C组分别灌胃2mL高剂量、中剂量、低剂量溶液，D组灌胃2mL空白玉米油。并于灌胃后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h共7个时间点断头处死大鼠，迅速取出肝置于生理盐水中，洗净，滤纸吸干组织表面水份，称取脏器湿重，平均分成2份，一份装袋密封，另一份加4倍生理盐水匀浆，制成组织匀浆液，2份均-20℃保存。取大鼠肝组织匀浆液样品100μL于离心管中，加入200μL乙腈，涡旋混合1min，离心10min（10000r/min），取20μL上清液，利用高效液相色谱-荧光法在甲醇/水（97/3），pH=4.5，流速：0.5mL/min，激发波长：365nm，检测波长：450nm的色谱条件下外标法检测3-OHBaP在大鼠肝组织中的含量。将解冻的大鼠肝组织用解剖刀切成小碎块，取50mg组织用组织基因组DNA提取试剂盒处理，提纯的组织总DNA在0.1moL/L HCL、90℃恒温水浴箱中水解4h，乙酸乙酯提取酸水解产物——苯并[a]芘-四醇，挥干乙酸乙酯，加入200μL二甲基亚砜复溶，取20μL，利用高效液相色谱-荧光法在甲醇/水（55/45），pH=7.0，流速：1.0mL/min，激发波长：245nm，检测波长：395nm的色谱条件下外标法检测苯并[a]芘-四醇在大鼠肝组织中的含量，以其来间接反应（+）-anti-BPDE-DNA加合物在大鼠肝组织中的含量。分别用超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、微量还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、大鼠8羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）酶联免疫分析试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定大鼠肝组织中SOD、GSH、MDA、8-OHDG的含量及蛋白浓度。用SPSS17.0软件对结果进行统计分析，符合正态分布，以均值±标准差表示，并用Pearson法分析染毒剂量与两种代谢产物含量的相关性。结果：除了低剂量染毒组检测不出（+）-anti-BPDE-DNA加合物，高、中剂量染毒组均可检测出3-OHBaP和（+）-anti-BPDE-DNA加合物。染毒剂量和BaP代谢产生的3-OHBaP、（+）-anti-BPDE-DNA加合物存在显着正相关（p<0.01）。染毒剂量和MDA、8-OHDG存在正相关。染毒后大鼠肝脏内GSH含量在低剂量时最多，随着染毒浓度的增加而减少。染毒后大鼠肝脏内SOD含量随染毒浓度的增高而增多，在中剂量时最多，随后下降。结论：3-OHBaP和（+）-anti-BPDE-DNA加合物可考虑为大鼠肝组织BaP的暴露生物标志物，SOD、GSH、MDA、8-OHDG可考虑为大鼠肝组织的效应生物标志物。
侯宏卫,张小涛,熊巍,唐纲岭,胡清源[9]（2012）在《苯并[a]芘生物标志物3-羟基苯并[a]芘研究进展》文中提出苯并[a]芘（B[a]P）是卷烟烟气中的重要有害成分,其在人体内产生的代谢物3-羟基苯并[a]芘（3-OHB[a]P）,可作为B[a]P接触生物标志物用于区分不同暴露剂量人群（如吸烟者和非吸烟者,职业暴露和普通人群）及预测可能的作用机制。本文对B[a]P的危害性、3-OHB[a]P来源及检测方法进行了综述;并从3-OHB[a]P研究存在的问题和现状出发,对其在感受烟气和普通人群中进行生物监测的应用进行了展望。
王静[10]（2012）在《RNA干扰用于支气管上皮细胞5-脂氧合酶对苯并（a）芘活化及DNA损伤研究》文中进行了进一步梳理[目的]研究人支气管上皮细胞（HBE）中苯并（a）芘氧化活化与DNA损伤的关系,进一步证实LOX是P450氧化代谢的替代途径,也为LOXsiRNA可能通过抑制LOX发挥防治化学物毒性作用的新线索提供有力证据。[方法]基因沉默实验：通过AgeI和EcoRI酶切质粒并用T4Ligase和shRNA Oligo片段连接,构建pAJ-U6-shRNA-CMV-GFP重组体,通过慢病毒载体系统,进行共转染293T细胞最后得到病毒浓缩液来感染目的细胞,之后通过PCR和Western-blot的方法检测基因沉默的效果。细胞实验：以不同浓度的苯并（a）芘对HBE细胞和经5-LOXsiRNA处理后的细胞组染毒,通过MTT实验检测苯并（a）芘对两组细胞存活率的影响；用Western-blot印记法检测各组5-LOX蛋白表达的情况；同时用单细胞凝胶电泳实验及流式细胞计数检测各组的DNA损伤情况。最后检测苯并（a）芘染毒后经过5-LOXsiRNA和化学抑制剂处理组对细胞的毒性和DNA损伤,并比较化学抑制剂和5-LOXsiRNA的细胞组抑制效果的差异。[结果]通过PCR鉴定转化子和阳性克隆后的测序以及病毒感染HBE细胞后通过PCR和Western-blot的方法检测,说明沉默5-LOX基因位点是较为成功。苯并（a）芘可以使HBE细胞内5-LOX蛋白表达增加,AA-861对5-LOX蛋白表达基本没有影响；苯并（a）芘可以对HBE产生明显细胞毒作用和DNA损伤,经5-LOXsiRNA,5-LOX抑制剂AA-861处理后的细胞组可以抑制苯并（a）芘毒性和DNA损伤,且5-LOXsiRNA细胞组抑制效果最为显着。[结论]5-LOX在HBE细胞内的蛋白表达可以经苯并（a）芘调节,特异性5-LOX抑制剂AA-861和5-LOXsiRNA都可抑制苯并（a）芘对细胞的毒性和DNA损伤,推测B（a）P可能是主要通过5-LOX介导的氧化活化生成亲电子物质,与DNA结合导致其损伤；这种DNA损伤可能与B（a）P的致癌作用有关,而利用RNA干扰技术抑制5-LOX可有效的阻止这一现象的发生发展。
二、大鼠和人胎、肝、肺微粒体酶对苯并(a)芘代谢的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠和人胎、肝、肺微粒体酶对苯并(a)芘代谢的研究（论文提纲范文）
（1）基于烟草吸食有害性成分在不同吸烟人群体内代谢的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 吸烟人群血液中四类化学成分及其代谢产物检测方法的建立 |
| (一) 血液中苯并[a]芘及其代谢产物在线液相-液相二维色谱法的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 在线液相-液相二维色谱法的构建 |
| 2. 血液样品制备溶剂的选择 |
| 3. 在线凝胶净化条件的选择 |
| 4. 固相萃取过柱介质的选择 |
| 5. 色谱条件的优化 |
| 6. 工作曲线、检测限和定量限 |
| 7. 方法回收率和精密度 |
| 8. 不同吸烟程度人群血液中苯并芘及代谢产物的含量检测 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| (二) 血液中的烟草特有亚硝胺及其代谢产物在线液相-液相二维色谱法的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 血液样品制备溶剂的选择 |
| 2. 一级色谱组分切割条件选择 |
| 3. 在线固相萃取柱的选择 |
| 4. 二级色谱分析条件的选择 |
| 5. 方法线性关系、检出限和定量限 |
| 6. 方法回收率和精密度 |
| 7. 不同吸烟人群血液中TSNAs及代谢物NNAL的检测结果 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| (三) 血液中氧化应激反应关键代谢产物在线液相-液相二维色谱法的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 样品制备溶剂的选择 |
| 2. 固相萃取柱材料的选择 |
| 3. 在线固相萃取富集条件的选择 |
| 4. 色谱和质谱分析条件的选择 |
| 5. 方法的工作曲线、检测限和定量限 |
| 6. 方法的加标回收率和精密度 |
| 7. 不同吸烟人群血液中氧化应激反应关键代谢产物的检测结果 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| (四) 血液中烟碱及其代谢产物液相色谱-串联质谱法的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 血液样品前处理溶剂的选择 |
| 2. 血液样品基质效应的优化 |
| 3. 色谱条件的优化 |
| 4. 方法的线性关系、检出限和定量限 |
| 5. 方法的加标回收率和精密度 |
| 6. 不同吸烟人群血液中尼古丁及可替宁的检测结果 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 不同吸烟程度对血液中四类化学成分代谢差异性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 分析材料 |
| 2. 分析方法 |
| 分析结果 |
| 1. 苯并[a]芘类化学成分的代谢差昇 |
| 2. 烟草特有亚硝胺类化学成分的代谢差异 |
| 3. 烟碱类化学成分的代谢差昇 |
| 4. 氧化应激反应关键产物化学成分的代谢差异 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 血液中四类化学成分的相互关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 分析材料 |
| 2. 分析方法 |
| 分析结果 |
| 1. 烟草特有亚硝胺类与氧化应激关键代谢产物的相互关系 |
| 2. 多环芳烃类与氧化应激关键代谢产物的相互关系 |
| 3. 烟碱类与氧化应激关键代谢产物的相互关系 |
| 4. 烟碱类与烟草特有亚硝胺类的相互关系 |
| 5. 烟碱类与多环芳烃的相互关系 |
| 6. 烟草特有亚硝胺类与多环芳烃的相互关系 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多元统计综合评价不同吸烟暴露量对血液中四类化学成分的影响规律 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 分析材料 |
| 2. 分析方法 |
| 分析结果 |
| 1. 主成分分析综合评价不同吸烟暴露量对各成分的影响规律 |
| 2. 聚类分析综合评价不同吸烟暴露量对各成分的影响规律 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 综述烟草吸食有害性成分及其代谢产物检测方法的研究进展 |
| 1. 研究背景及意义 |
| 2. 相关领域研究现状 |
| 2.1 二维液相色谱技术 |
| 2.1.1 二维液相色谱的原理 |
| 2.1.2 二维液相色谱的应用 |
| 2.2 烟草吸食有害性成分苯并[α]芘及其代谢物的分析 |
| 2.3 烟草吸食有害性成分烟草特有亚硝胺及其代谢物的分析 |
| 2.4 烟草吸食有害性成分烟碱及其代谢物的分析 |
| 2.5 烟草吸食有害性成分氧化应激反应关键代谢产物的分析 |
| 参考文献 |
| 附件1 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 共培养模型的构建及模型中细胞活性的测定 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.2 共培养细胞基本情况与共培养分组 |
| 1.3 细胞生长情况的测量 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 共培养细胞生长状况 |
| 2.2 CCK-8法比较单独培养与共培养细胞的生长情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 模型中肝细胞主要代谢相关酶基因表达情况 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 细胞基本情况和共培养及单独培养组别设置 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 主要Ⅰ相代谢酶基因的表达情况 |
| 2.2 主要Ⅱ相代谢酶基因的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 共培养模型代谢活化能力的初步验证 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 细胞基本情况 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 微核试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 HepaRG肝细胞的基本特征和应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及在学期间发表论文 |
（3）P450酶活性中心催化有机阻燃剂和多环芳烃转化机制的计算模拟（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 主要缩写表 |
| 1 P450酶催化转化有机阻燃剂和多环芳烃的研究进展及选题依据 |
| 1.1 P450酶简介及其对污染物的代谢转化 |
| 1.1.1 P450酶简介及其代谢反应 |
| 1.1.2 P450酶催化循环 |
| 1.1.3 有机污染物的P450酶代谢的实验研究方法 |
| 1.2 P450酶催化有机物转化反应机制的量子化学预测及研究进展 |
| 1.2.1 密度泛函理论(DFT)及常用泛函简介 |
| 1.2.2 过渡态理论 |
| 1.2.3 耦合量子力学/分子力学方法(QM/MM)简介 |
| 1.2.4 有机物的P450酶促转化机制的计算模拟研究进展 |
| 1.3 有机阻燃剂和多环芳烃的环境水平、毒性效应及生物转化 |
| 1.3.1 多溴联苯醚(PBDEs) |
| 1.3.2 有机磷系阻燃剂(OPFRs) |
| 1.3.3 多环芳烃(PAHs) |
| 1.4 本论文选题依据、研究目的、内容和技术路线 |
| 1.4.1 选题依据 |
| 1.4.2 研究目的和内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 P450酶活性中心催化转化PBDEs生成二羟基化及二恶英产物的机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 计算模型和方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 BDE-47羟基化反应 |
| 2.3.2 Di-HO-PBDEs的形成机制 |
| 2.3.3 PBDD二恶英的形成机制 |
| 2.4 小结 |
| 3 P450酶活性中心催化转化不同取代类型OPFRs的路径和产物预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 计算模型与方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 TPHP的苯环羟基化 |
| 3.3.2 二羟基TPHP和DPHP的形成 |
| 3.3.3 DPHP的进一步代谢转化 |
| 3.3.4 TBOEP和TDCPP的烷烃羟基化 |
| 3.3.5 BBOEP和BDCIPP的形成及后续转化反应 |
| 3.4 小结 |
| 4 典型PAHs被P450酶活性中心代谢转化活性及两者的结合模式 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 计算模型与方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PAHs与Compound Ⅰ的π-加成反应 |
| 4.3.2 PAHs与CYP1A2的结合 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（4）中药蟾酥中蟾蜍甾烯类活性成分的体外代谢研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部 蟾酥中主要蟾蜍甾烯类成分的体外孵育代谢研究 |
| （一）前言 |
| （二）材料和方法 |
| 1. 主要试剂及仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 孵育体系构成 |
| 2.2 孵育基本操作 |
| 2.3 代谢产物结构鉴定 |
| 2.4 体外代谢通路研究 |
| （三）结果 |
| 1. 蟾蜍甾烯类化合物的PhaseⅠ代谢研究 |
| 1.1 蟾蜍甾烯在人源肝脏制备物中的PhaseⅠ代谢研究 |
| 1.2 蟾蜍甾烯结构-细胞色素P450代谢关系研究 |
| 1.3 潜在共服药物对蟾毒灵代谢的抑制作用 |
| 2. 蟾蜍甾烯类化合物的PhaseⅡ代谢研究 |
| 2.1 蟾蜍甾烯在人源肝脏制备物中的PhaseⅡ代谢研究 |
| 2.2 蟾蜍甾烯结构-SULT代谢关系研究 |
| （四）讨论 |
| （五）结论 |
| （六）参考文献 |
| 第二部 蟾酥中重要蟾蜍甾烯类成分蟾毒灵和脂蟾毒配基的体外代谢种属差异研究 |
| （一）前言 |
| （二）材料和方法 |
| 1. 主要试剂及仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 孵育体系构成 |
| 2.2 孵育基本操作 |
| 2.3 体外代谢通路研究 |
| （三）结果 |
| 1. 蟾蜍甾烯类化合物PhaseⅠ代谢的体外种属差异研究 |
| 1.1 脂蟾毒配基的Phase Ⅰ代谢体外种属差异研究 |
| 1.2 蟾毒灵的Phase Ⅰ代谢体外种属差异研究 |
| 1.3 小结 |
| 2. 蟾蜍甾烯类化合物Ⅱ相代谢的体外种属差异研究 |
| 2.1 蟾毒灵磺酸结合代谢的体外种属差异研究 |
| 2.2 脂蟾毒配基磺酸结合代谢的体外种属差异研究 |
| 2.3 小结 |
| （四）讨论 |
| （五）结论 |
| （六）参考文献 |
| 第三部 蟾酥中重要蟾蜍甾烯类成分蟾毒灵对细胞色素P450抑制作用研究 |
| （一）前言 |
| （二）材料和方法 |
| 1. 主要试剂及仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 孵育体系构成 |
| 2.2 孵育基本操作 |
| 2.3 体外代谢酶抑制研究 |
| （三）结果 |
| 1. 蟾毒灵对人CYP450的直接抑制作用 |
| 2. 蟾毒灵对人CYP450的基于时间的抑制作用研究 |
| 3. 蟾毒灵及其代谢产物对人CYP3As的抑制作用研究 |
| 4. 蟾毒灵对人CYP3As抑制动力学研究 |
| 4.1 蟾毒灵对人CYP3As直接抑制动力学研究 |
| 4.2 蟾毒灵对人CYP3As基于时间抑制动力学研究 |
| 5. 蟾毒灵介导CYP3As失活机制研究 |
| 5.1 清洗试验对人CYP3As失活过程的作用 |
| 5.2 保护剂对人CYP3As失活过程的作用 |
| （四）讨论 |
| （五）结论 |
| （六）参考文献 |
| 综述 体外药物代谢在中药有效成分代谢研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）调控肝微粒体酶对鱼/虾中常见真菌毒素危害的消减机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景及进展 |
| 1.2.1 四种常见真菌毒素的来源、分布及危害 |
| 1.2.2 四种常见真菌毒素对水产饲料的污染现状 |
| 1.2.3 四种常见真菌毒素对水产动物的危害 |
| 1.2.4 水产动物机体代谢酶对T-2、AFB_1、OTA和DON的调控机制 |
| 1.2.5 芦丁、槲皮素、茶多酚对水产代谢酶的诱导效应研究 |
| 1.3 本研究的立题依据、研究内容及意义 |
| 1.4 研究技术路线和创新点 |
| 1.4.1 技术路线 |
| 1.4.2 创新点 |
| 2 四种真菌毒素对对虾和罗非鱼的蓄积毒性效应研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂与配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 对虾和罗非鱼饲养环境管理 |
| 2.3.2 染毒梯度设置及饲料制备 |
| 2.3.3 样品采集及前处理 |
| 2.3.4 微粒体蛋白浓度测定 |
| 2.4 蓄积毒性效应指标测定 |
| 2.4.1 增重率与存活率的测定 |
| 2.4.2 肝重比测定 |
| 2.4.3 对虾和罗非鱼肝与肌肉部位四种真菌毒素残留量的测定 |
| 2.4.4 对虾和罗非鱼肝组织与肌肉病理组织学分析 |
| 2.4.5 肝微粒体Ⅰ相代谢酶测定 |
| 2.4.6 肝微粒体Ⅱ相代谢酶测定 |
| 2.5 数据处理与分析 |
| 2.6 结果分析 |
| 2.6.1 标准曲线建立 |
| 2.6.2 对对虾与罗非鱼生长的影响 |
| 2.6.3 对对虾与罗非鱼肝重比的影响 |
| 2.6.4 对虾与罗非鱼肝组织与肌肉中T-2、AFB_1、OTA和DON残留量与暴露剂量相关性分析 |
| 2.6.5 对对虾与罗非鱼肝组织病理组织学影响 |
| 2.6.6 对对虾与罗非鱼肌肉部位病理组织学影响 |
| 2.6.7 对对虾与罗非鱼肝微粒体Ⅰ相代谢酶活性的影响 |
| 2.6.8 对对虾及罗非鱼肝微粒体Ⅱ相代谢酶活性的影响 |
| 2.6.9 真菌毒素暴露对虾和罗非鱼代谢酶活性诱导与抑制概率性分布分析 |
| 2.7 讨论 |
| 2.8 小结 |
| 3 槲皮素、芦丁、茶多酚对对虾和罗非鱼生长及代谢的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 主要试剂与配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 槲皮素、芦丁和茶多酚饲料添加量梯度设置 |
| 3.3.2 样品采集及前处理 |
| 3.4 实验指标的测定 |
| 3.4.1 对虾和罗非鱼增重率及死亡率的测定 |
| 3.4.2 肝重比测定 |
| 3.4.3 对虾与罗非鱼肝部位与肌肉病理组织学分析 |
| 3.4.4 肝微粒体b5含量、Ⅰ相代谢酶NCCR、AH和EROD活性测定 |
| 3.4.5 肝微粒体Ⅱ相代谢酶GST、UGT和SULT活性测定 |
| 3.5 数据处理与分析 |
| 3.6 结果 |
| 3.6.1 对对虾及罗非鱼生长的影响 |
| 3.6.2 对肝重比的影响 |
| 3.6.3 对对对虾与罗非鱼肝部位病理组织学影响 |
| 3.6.4 对对虾与罗非鱼肌肉病理组织学影响 |
| 3.6.5 对对虾与罗非鱼肝微粒体Ⅰ相代谢酶活性的影响 |
| 3.6.6 对对虾与罗非鱼肝微粒体Ⅱ相代谢酶活性的影响 |
| 3.6.7 对虾和罗非鱼代谢酶活性诱导与抑制概率性分布分析 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 4 槲皮素、芦丁、茶多酚对四种真菌毒素暴露凡纳滨对虾和罗非鱼损伤的拮抗效应研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 槲皮素、芦丁、茶多酚及T-2、AFB_1、OTA和DON饲料添加量梯度设置 |
| 4.3.2 样品采集及前处理 |
| 4.4 实验指标的测定 |
| 4.4.1 对虾和罗非鱼增重率率及存活率的测定 |
| 4.4.2 肝重比测定 |
| 4.4.3 肝部位与肌肉中真菌毒素残留量分析 |
| 4.4.4 肝部位与肌肉病理组织学分析 |
| 4.4.5 肝微粒体Ⅰ相代谢酶细胞色素b5、NCCR、AH和EROD活性测定 |
| 4.4.6 肝微粒体Ⅱ相代谢酶GST、UGT和SULT活性测定 |
| 4.5 数据处理 |
| 4.6 结果分析 |
| 4.6.1 对对虾与罗非鱼生长的影响 |
| 4.6.2 对对虾与罗非鱼肝重比的影响 |
| 4.6.3 对虾肝胰腺与肌肉T-2、AFB_1、OTA和DON残留量分析 |
| 4.6.4 罗非鱼肝脏与肌肉部位真菌毒素残留量分析 |
| 4.6.5 真菌毒素与诱导剂联合暴露对虾与罗非鱼肝部位病理组织学分析 |
| 4.6.6 真菌毒素与诱导剂联合暴露对对虾与罗非鱼肌肉病理组织学影响 |
| 4.6.7 对对虾与罗非鱼肝微粒体Ⅰ相代谢酶活性的影响 |
| 4.6.8 对对虾与罗非鱼肝微粒体Ⅱ相代谢酶活性的影响 |
| 4.6.9 特定诱导剂诱导不同真菌毒素暴露后对虾肝微粒体细胞色素b5和代谢酶活性变化趋势分析 |
| 4.7 讨论 |
| 4.8 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（6）香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 CSE中CYP2A13的新底物5-HMF的发现与鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 CYP2A13/CYP2A5对CSE中5-HMF所致呼吸毒性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 研究的创新性发现 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 细胞色素P450酶家族2(CYP2)在外源化合物所致毒热度中的作用 |
| 参考文献 |
| CYP450药物代谢研究：基因表达调控，醇活性以及基因多态性 |
| 参考文献 |
| 附录 主要缩略词中英文对照(按字母排序) |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 血管过氧化物酶1在氧化性低密度脂蛋白诱导的内皮功能不全中的作用及机制探讨 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 试剂和仪器 |
| 2.2 细胞株及其生物学特征 |
| 2.3 人脐静脉血内皮细胞的培养 |
| 2.4 实验设计和分组 |
| 2.5 VPO1 shRNA重组质粒的构建 |
| 2.6 稳定转染VPO1 shRNA人脐静脉内皮细胞株的构建 |
| 2.7 氧化性低密度脂蛋白提取 |
| 2.8 细胞上清液中NO含量的测定 |
| 2.9 内皮细胞eNOS及DDAH蛋白表达的测定 |
| 2.10 细胞上清液ADMA含量的测定 |
| 2.11 内皮细胞VPO1蛋白表达的测定(Western印迹法检测) |
| 2.12 次氯酸的测定 |
| 2.13 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ox-LDL对内皮细胞VPO1表达及细胞内HOCl的影响 |
| 3.2 稳定转染VPO1 shRNA的内皮细胞的鉴定 |
| 3.3 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞NO水平的影响 |
| 3.4 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞eNOS表达的影响 |
| 3.5 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞DDAH表达的影响 |
| 3.6 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞ADMA水平的影响 |
| 3.7 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞HOCl水平的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 血管过氧化物酶1在氧化性低密度脂蛋白诱导的血管内皮炎症反应中的作用及机制探讨 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 试剂和仪器 |
| 2.2 细胞株及其生物学特征 |
| 2.3 人脐静脉血内皮细胞的培养 |
| 2.4 实验设计和分组 |
| 2.5 氧化性低密度脂蛋白提取 |
| 2.6 稳定转染VPO1 shRNA人脐静脉内皮细胞株的构建 |
| 2.7 内皮细胞ICAM-1,P-selectin,p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达的测定 |
| 2.8 次氯酸测定 |
| 2.9 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞ICAM-1和P-selectin表达的影响 |
| 3.2 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞NF-κB蛋白表达的影响 |
| 3.3 VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞p38 MAPK蛋白表达的影响 |
| 3.4 HOCl对内皮细胞ICAM-1和P-selectin蛋白表达的影响(量效实验) |
| 3.5 HOCl对内皮细胞内NF-κB蛋白表达影响 |
| 3.6 HOCl对内皮细胞p38MAPK蛋白表达影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）苯并[a]芘对大鼠肝脏生物标志物的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 结果 |
| 2.1 方法的专属性 |
| 2.2 标准曲线和定量限 |
| 2.3 提取回收率和精密度 |
| 2.4 大鼠肝组织中各指标的测定结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）苯并[a]芘生物标志物3-羟基苯并[a]芘研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 苯并芘的危害性 |
| 1.1 流行病学研究 |
| 1.2 遗传毒理学和致癌性研究 |
| 2 3-OHB[a]P的来源 |
| 3 3-OHB[a]P的检测方法 |
| 4 3-OHB[a]P在生物监测中的应用 |
| 4.1 职业暴露人群生物监测 |
| 4.2 吸烟和普通人群的生物检测 |
| 5 展望 |
（10）RNA干扰用于支气管上皮细胞5-脂氧合酶对苯并（a）芘活化及DNA损伤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究技术路线 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 实验材料说明 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 shRNA序列设计与合成 |
| 2.5.2 shRNA表达载体的构建 |
| 2.5.3 慢病毒包装 |
| 2.5.4 细胞感染 |
| 2.5.5 Real-time PCR |
| 2.5.6 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.5.7 MTT实验 |
| 2.5.8 FITC-PI双染流式细胞术 |
| 2.5.9 单细胞凝胶电泳(SCGE) |
| 2.6 数据分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 HBE和HaCat细胞中5-LOX蛋白的表达 |
| 3.2 5-LOX抑制剂AA-861对HBE细胞5-LOX蛋白表达的影响 |
| 3.3 5-LOX基因沉默 |
| 3.3.1 重组质粒构建后阳性克隆筛选 |
| 3.3.2 克隆测序 |
| 3.3.3 慢病毒滴度检测 |
| 3.3.4 慢病毒感染HBE细胞 |
| 3.4 Real-time PCR检测B(a)P对慢病毒感染HBE 5-LOX的影响 |
| 3.5 Western Blot检测B(a)P对慢病毒感染HBE 5-LOX的影响 |
| 3.6 苯并(a)芘对HBE存活率的影响(MTT) |
| 3.7 苯并(a)芘对HBE凋亡和死亡率的影响(FCM) |
| 3.8 苯并(a)芘对HBE DNA损伤(单细胞凝胶电泳) |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 苯并(a)芘对支气管上皮细胞和表皮细胞中5-LOX蛋白表达的调节 |
| 4.2 5-LOX慢病毒载体制备和HBE细胞转染效率 |
| 4.3 5-LOX介导苯并(a)芘活化所致的细胞毒性和DNA损伤 |
| 4.4 RNAi在氧化酶研究中作为一种有效的抑制策略运用的可能性 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已完成的相关论文 |
四、大鼠和人胎、肝、肺微粒体酶对苯并(a)芘代谢的研究（论文参考文献）
- [1]基于烟草吸食有害性成分在不同吸烟人群体内代谢的研究[D]. 黄丽佳. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]人源化肝细胞共培养系统为基础的代谢活化系统研究[D]. 蔡文建. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [3]P450酶活性中心催化有机阻燃剂和多环芳烃转化机制的计算模拟[D]. 傅志强. 大连理工大学, 2017(09)
- [4]中药蟾酥中蟾蜍甾烯类活性成分的体外代谢研究[D]. 宁静. 大连医科大学, 2017(08)
- [5]调控肝微粒体酶对鱼/虾中常见真菌毒素危害的消减机制[D]. 邓义佳. 广东海洋大学, 2016(04)
- [6]香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究[D]. 季明辉. 南京医科大学, 2016(02)
- [7]VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及机制研究[D]. 李淑均. 中南大学, 2014(02)
- [8]苯并[a]芘对大鼠肝脏生物标志物的研究[D]. 齐琳. 大连医科大学, 2013(05)
- [9]苯并[a]芘生物标志物3-羟基苯并[a]芘研究进展[J]. 侯宏卫,张小涛,熊巍,唐纲岭,胡清源. 科技导报, 2012(32)
- [10]RNA干扰用于支气管上皮细胞5-脂氧合酶对苯并（a）芘活化及DNA损伤研究[D]. 王静. 中南大学, 2012(02)