一、通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株（论文文献综述）
田港[1]（2021）在《甘蓝型油菜BnMYBL2启动子的克隆及功能研究》文中指出
李刚[2]（2021）在《甘蓝型油菜BnTT8基因组编辑载体的构建及其遗传转化》文中认为
刘维妙[3]（2021）在《芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究》文中提出花粉发育和授粉受精过程是开花植物完成有性生殖的重要环节。花粉发育异常会影响其功能的正常完成,进而影响后代的繁衍。授粉受精过程的顺利进行离不开花粉管正常的萌发和伸长。花粉管的萌发通常起始于成熟花粉粒的内壁。在花粉管快速伸长的过程中尤其需要细胞壁的快速扩展,众多细胞壁合成和重塑蛋白都参与其中。植物扩展蛋白（expansins,EXP）是一类重要的细胞壁重塑蛋白,可以与细胞壁的多糖组分结合,通过破坏细胞壁组分之间的非共价键引起植物细胞壁的松弛,促进植物细胞的生长。扩展蛋白基因家族被细分为四个亚家族,分别是EXPA（expansin A subfamily,扩展蛋白A亚家族）、EXPB（expansin B subfamily,扩展蛋白B亚家族）、EXLA（expansin like A subfamily,扩展蛋白类A亚家族）和EXLB（expansin like B subfamily,扩展蛋白类B亚家族）。虽然近年来扩展蛋白基因的功能被广泛研究,但是有关扩展蛋白基因在植物生殖发育阶段的功能以及有关EXPA和EXPB亚家族基因协调作用都还鲜有报道。本文以白菜‘矮脚黄’（Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis cv.Aijiaohuang）核雄性不育两用系ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’和黑芥（B.nigra cv.Z1411-02）以及甘蓝（B.oleracea cv.Jingfeng 1）为材料,对芸薹属三个二倍体基本种的扩展蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,明确三个基本种扩展蛋白基因家族的进化特征,为探究扩展蛋白基因在花粉和花粉管发育过程中的功能提供相关基础;由基因家族分析筛选到两个在白菜花粉发育后期和花粉管中高表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9,通过人工microRNA技术研究BrEXPB4和BrEXPB9在白菜花粉和花粉管发育中的功能;采用CRISPR/Cas9技术和过表达技术对两者在模式植物拟南芥中的同源基因AtEXPB5进行生物学功能的分析,并对与其在花粉和花粉管发育阶段具有冗余功能的AtEXPA4进行验证;通过酵母单杂交和双荧光素酶实验对AtEXPB5和BrEXPB4/9可能参与的转录调控路径进行研究。取得的主要结果与结论如下:（1）通过三步分析法,鉴定了芸薹属三个基本种（白菜、甘蓝和黑芥）的扩展蛋白基因家族,并经与模式植物拟南芥的系统发育、基因结构和理化特性的比较分析对它们的扩张模式和进化细节进行了研究,发现经过独立的进化,扩展蛋白基因家族在这三个基本种中的相似性较多,而分歧较少。通过比较启动子和编码序列的差异,发现在拟南芥和三个基本种的直系同源物之间存在显着正相关性。随后的表达分析表明这三个物种的扩展蛋白基因家族中存在广泛的功能差异,特别是在生殖发育过程中筛选到两个在白菜花粉和花粉管发育阶段强烈表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9。（2）通过烟草和洋葱瞬时表达体系进行亚细胞定位的结果表明,BrEXPB4和BrEXPB9都定位在细胞壁上,这与它们都具有信号肽结构的预测结果一致。通过荧光定量PCR和GUS基因报告系统进行的时空表达分析表明,BrEXPB4和BrEXPB9的表达模式也很相似,都是从单核花粉后期开始表达,并随着花粉的发育,表达量逐步升高,并且可以一直持续到花粉管中。（3）采用人工microRNA技术分别和同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9的表达,进而对它们的生物学功能进行鉴定。当它们被单独抑制时,对植株的生长发育并没有造成明显的影响。然而当它们的表达被同时抑制时,却造成约50%的花粉败育,并不能正常萌发。对败育花粉的细致观察显示,花粉的败育起始于单核花粉晚期,进一步使小孢子细胞质和花粉内壁降解,最终造成花粉败育和萌发异常。（4）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPB5定位在细胞壁上,并且其编码基因在成熟花粉粒和花粉管中强烈表达。然而,无论是敲除AtEXPB5还是过表达AtEXPB5都未对拟南芥的生长发育造成显着影响。结合前人相关电子表达谱的研究,发现仅有AtEXPA4在生殖发育阶段与AtEXPB5具有相似的表达模式。构建了AtEXPA4的敲除和过表达材料,并通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5的双突变体,观察发现在双突变体中,花粉管伸长的速度显着减缓,并且无论是AtEXPB5还是AtEXPA4都可以恢复双突变体花粉管伸长减缓的表型,说明AtEXPA4和AtEXPB5冗余地参与了花粉管的发育。（5）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPA4定位在细胞壁上,其编码基因不仅在生殖发育阶段表达,也在拟南芥的根中优势表达。主根长度和根分生区的测量结果表明,AtEXPA4对于主根的生长具有促进作用。（6）通过酵母单杂交和双荧光素酶实验表明,AtEXPB5的表达可由AtTDF1和AtAMS共同激活,而这一调控途径在白菜中并不保守。这说明AtEXPB5和BrEXPB4/9的生物学功能产生分化,并且参与不同的转录调控路径。BrEXPB4/9及其同源基因AtEXPB5在表达模式、功能和调控网络上显示出巨大差异说明在进化过程中,同源基因物也会产生功能和调控的变化。
李晓伦[4]（2021）在《兴安落叶松同源异型盒基因LgKNOX2的表达特性和功能研究》文中研究指明兴安落叶松（Larix gmelinii）属于松科落叶松属,主要生长在我国东北大兴安岭地区,在经济、生态中发挥了重要的作用。由于其材质具有较强的机械性能,主要作为板材以及作为造纸的重要原料,研究其生长发育的调控可以为更大发挥兴安落叶松的价值提供理论和实验依据。KNOTTED1-Like HOMEOBOX（KNOX）基因家族编码植物同源基因TALE超类的植物特异性转录因子,在植物生长和发育中发挥重要作用。因此,深入研究兴安落叶松LgKNOX2基因的功能及表达特性具有重要意义。LgKNOX2是I类KNOX基因,在植物形态建成中发挥重要功能。本研究利用前期克隆的LgKNOX2的编码区以及LgKNOX2的启动子序列对其表达特性和功能进行了深入分析。LgKNOX2启动子的生物信息学分析发现,LgKNOX2启动子含有响应植物激素和逆境胁迫有关的一些顺式作用元件,表明LgKNOX2可能在响应光、胁迫、植物激素诱导中发挥作用。LgKNOX2启动子驱动GUS在拟南芥中的表达检测发现,在拟南芥营养生长阶段（一周龄至三周龄）p LgKNOX2::GUS在叶脉处表达量较高,其表达受赤霉素的诱导。为验证LgKNOX2的亚细胞定位,将其与GFP融合在烟草下表皮细胞瞬时表达,通过共聚焦显微镜观察发现LgKNOX2定位于细胞核内。利用酵母系统来研究其转录激活功能发现,LgKNOX2具有转录激活活性,且发挥功能的部位位于蛋白质的C端。为深入探究LgKNOX2的功能,构建了过表达转基因拟南芥株系,通过比较野生型与转基因拟南芥的生长差异,研究该基因的功能。结果显示,LgKNOX2的表达在拟南芥营养生长初期可以促进根的发育,增加拟南芥株高,并使其提前抽薹。同时,LgKNOX2的表达抑制了转基因拟南芥莲座叶叶片发育并使叶片锯齿化,但对茎生叶影响较小。其在一定程度上减少种子的千粒重但对萌发率无显着影响。本研究为进一步了解兴安落叶松的生长发育调控机制,深入分析LgKNOX2的功能奠定了基础,同时为利用该基因进行林木改良提供了有价值的候选基因。
王新文[5]（2021）在《拟南芥ABI5亚家族DPBF2、DPBF3、DPBF4、DPBF5及At5G42910基因的重组及其过表达转基因拟南芥的构建》文中认为ABI5（ABA insensitive 5）亚家族转录因子参与调控植物的生长发育过程以及对不同胁迫的响应。在无ABA情况下,因转录活性抑制区域的存在,过表达全长ABI5亚家族成员的转基因植株常常性状不够明显,也常有ABI5亚家族各成员作为下游基因的负调节因子或超表达植株的表型变化不一致的报道。ABI5亚家族转录因子在氨基酸序列上高度保守,根据其保守性及先前的研究显示ABI5亚家族9个成员的保守区II（CRII）均具有转录激活活性且DPBF4 CRII的转录激活活性最强,ABI5保守的磷酸化位点又对其转录激活活性有明显的抑制作用。据此我们去除各成员的转录抑制区域,选用DPBF4CRII和其他各成员的DNA结合域构建活性形式的重组转录因子,在拟南芥中超表达后筛选具有稳定遗传表型的转基因植株,通过各超表达植株的表型变化及组学测序分析,以期了解ABI5亚家族9个成员在植物生长发育过程中调控的生长表型及其分子机制,明确各成员精细的生物学功能。本论文的主要研究结果如下:（1）构建完成了ABI5亚家族中DBBF2、DBBF3、DBBF4、DBBF5及At5G42910重组遗传转化载体p1304-4IID2bZIP、p1304-4IID3bZIP、p1304-4IID4bZIP、p1304-4IID5bZIP及p1304-4II 910bZIP。（2）将p1304-4IID2bZIP、p1304-4IID3bZIP、p1304-4IID4bZIP、p1304-4IID5bZIP及p1304-4II910bZIP重组遗传转化载体进行农杆菌转化后花序浸染野生型拟南芥,获得超表达转基因植株A.thaliana 910共6个株系、A.thaliana D3共8个株系,A.thaliana D5共5个株系,均已完成筛选传代得到了T1代种子（目前正在进行T2代的筛选传代）,A.thaliana D2和A.thaliana D4均已筛选到10个转基因株系,正在进行T1代的筛选传代。（3）构建完成了ABI5亚家族9成员酵母双杂交载体AD/BD-ABF1bZIP、AD/BD-ABF2bZIP、AD/BD-ABF3bZIP、AD/BD-ABF4bZIP、AD/BD-ABI5bZIP、AD/BD-DBBF2bZIP、AD/BD-DBBF3bZIP、AD/BD-DBBF4bZIP及AD/BDAt5G42910bZIP。（4）通过酵母双杂交系统分析了ABI5亚家族9个成员可以形成的所有同源/异源二聚体模式。结果表明,这9个成员中仅ABF3和ABI5可以形成同源二聚体;ABI5和ABF2、ABF4之间可以形成异源二聚体,ABF1和ABI5也可以形成微弱的异源二聚体。（5）对重组ABI5（ABI5CRII-ABI5bZIP）超表达株系A.thaliana MX-1-1、超表达ABI5全长株系A.thaliana MX-4-4通过q RT-PCR检测了ABA信号通路中受ABI5调控的下游基因的表达。结果表明,随着幼苗生长,相较于野生型,ABI5和RD29A的m RNA表达量在A.thaliana MX-1-1中显着上调,在24天龄的幼苗时分别上升了246和1.8倍,而在A.thaliana MX-4-4中,ABI5至培养14天龄的幼苗中先上调了47倍,随着植物的生长发育在24天龄的幼苗中又下降至野生型的0.2倍,RD29A则在24天龄的幼苗中下降至野生型的0.6倍;FLC、SHB1、RD29B、At EM1和At EM6表达量在A.thaliana MX-1-1中和A.thaliana MX-4-4中随着幼苗的生长发育先上调后下降:在A.thaliana MX-1-1和A.thaliana MX-4-4中,FLC的m RNA表达量在14天龄的幼苗中分别上升了约6倍和10倍,24天龄的幼苗中又分别下降至野生型的0.3倍和0.1倍;SHB1的m RNA表达量在14天龄的A.thaliana MX-1-1中上升了2.5倍,在24天龄幼苗中的表达量与野生型无显着差异,在14天龄的A.thaliana MX-4-4中上升了3.5倍,在24天龄的幼苗中下降到野生型的0.4倍;A.thaliana MX-1-1中RD29B的m RNA表达量无显着变化,在24天龄的A.thaliana MX-4-4中RD29B的表达量下降至0.6倍;At EM1和At EM6表达量则在14天龄的A.thaliana MX-1-1中均上调了5倍左右,在24天龄时又分别下调至与野生型无显着差异,而两者在14天龄的A.thaliana MX-4-4中分别上调了约9倍和11倍,至24天龄时又均下调至野生型的0.2倍。以上这些结果表明在A.thaliana MX-4-4中这些相关基因的下调更为显着。（6）A.thaliana MX-1-1的蛋白质组学结果表明,相较于野生型,超表达转基因株系A.thaliana MX-1-1中共检测到35个差异蛋白,参与ABA合成代谢、免疫应答以及能量代谢等生物学过程。活性ABI5通过参与ABA的生物合成与代谢、GA信号途径等调控植物的生长发育。
朱熙[6]（2021）在《马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究》文中进行了进一步梳理丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）级联是真核生物中高度保守的信号转导模式,由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成。该级联途径通过三种激酶依次逐级磷酸化将感知的外源信号放大并传递下去,从而产生应激反应介导细胞增殖、分化和死亡。马铃薯（Solanum tuberosum L.）为世界第四大粮食作物,日益突出的土地干旱和盐碱化问题造成其减产。目前,关于植物MAPK在干旱、盐及渗透胁迫条件下的基因功能研究十分有限。迄今为止,马铃薯StMAPKs基因响应非生物胁迫和植物激素诱导表达模式的系统研究仍未见报道,而且其在马铃薯不同组织和器官中的表达模式也不清楚。本研究主要解析StMAPKs是否介导多种与胁迫相关的信号转导途径,StMAPKs是否在干旱、盐和渗透胁迫下起作用以及其潜在机制。本研究对StMAPKs响应不同非生物胁迫和植物激素处理表达模式行了分析,同时还分析了其在不同组织和器官中的表达模式。从马铃薯“大西洋”中分离得到一个与盐和渗透胁迫相关的StMAPK3功能基因和一个与干旱胁迫相关的StMAPK11功能基因,并通过亚细胞定位、酵母双杂文库筛选、酵母双杂检测互作蛋白、双分子荧光互补、磷酸化蛋白组学,以及对过表达和RNA干扰表达转基因的植株在胁迫下生理指标和光合指标的检测做了研究。取得的主要研究结果如下:1.通过qRT-PCR技术分析了马铃薯15个StMAPKs基因在不同非生物胁迫和植物激素处理以及不同组织和器官中的表达模式。结果表明:马铃薯中15个StMAPKs基因不仅在非生物胁迫和植物激素处理时表达差异显着,而且在不同组织和器官中的特异性表达差异也显着。2.从马铃薯中克隆得到两个促分裂原活化蛋白激酶基因StMAPK3和StMAPK11,其中StMAPK3是与盐和渗透胁迫相关,而StMAPK11与干旱胁迫相关,构建了pCAM35s-GFP-StMAPK3和pCAM35s-GFP-StMAPK11亚细胞定位载体,并在烟草表皮细胞中进行了瞬时表达。结果表明,StMAPK3和StMAPK11均定位于细胞膜和细胞核。3.构建了原核重组表达载体pET28b-StMAPK11,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,IPTG诱导并纯化StMAPK11重组蛋白,制备兔抗StMAPK11多克隆抗体,Western blot结果显示制备好的抗体可以很好的与StMAPK11蛋白特异性结合。4.分别构建了酵母双杂和双分子荧光互补载体,通过酵母双杂交和双分子荧光互试验验证结果显示,StMAPK3可以与StDof1、StSR2、StACS5、StMEK2和StMAPKK1发生互作,其中StMAPK3与StSR2在细胞核内相互作用。StMAPK11可以与StbZIP2、StPTP1和StVQP9发生互作,其中StMAPK11与StbZIP2在细胞核内相互作用。5.与盐和渗透胁迫相关StMAPK3基因的功能分析。在盐和渗透胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK3植株中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性和脯氨酸含量均增加,在RNA干扰表达植株中,结果相反,而在StMAPK3过表达植株中H2O2和丙二醛（MDA）含量减少,RNA干扰表达植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK3提高了盐和渗透胁迫下植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率,在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因植株相比都不同程度的降低。并且还发现在盐和渗透胁迫下转StMAPK3基因对马铃薯植株的气孔开合度、植株高度、茎粗、鲜重、根长和侧根数都有不同程度的影响。结果表明StMAPK3能明显提高马铃薯植株对盐和渗透胁迫的抗性。6.与干旱胁迫相关StMAPK11基因的功能分析。在干旱胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK11植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中CAT、POD、SOD酶活性和脯氨酸含量均增加,但在RNA干扰表达马铃薯植株中,结果相反,在StMAPK11过表达植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中H2O2和MDA含量减少,但在RNA干扰表达马铃薯植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK11提高了干旱胁迫下马铃薯植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率;在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因相比都不同程度的降低。并且还发现转StMAPK11基因在干旱胁迫下对马铃薯植株的鲜重、干重、根鲜重和根干重都有不同程度的影响。表明StMAPK11能明显提高植株（马铃薯、烟草和拟南芥）对干旱胁迫的抗性。7.对StMAPK3过表达和RNA干扰表达马铃薯植株进行磷酸化蛋白质组学分析共鉴定得到2180种磷酸化蛋白。通过修饰位点定量分析在两组中共同鉴定到的修饰位点2922个,其中差异显着的修饰位点总数78个,显着上调的修饰位点总数49个,显着下调的修饰位点总数29个。通过磷酸化蛋白差异分析两组共鉴定蛋白2023个,其中上调表达蛋白15个,下调表达蛋白14个。利用GO、KEGG、COG数据库对鉴定的磷酸化蛋白质进行功能注释,结果表明这些蛋白质主要在植株生长发育过程,信号转导和代谢途径中发挥相应功能。
梁娟红[7]（2021）在《过表达油菜BrMAPK4拟南芥抗逆性研究》文中认为植物在生长过程中会遭受各种胁迫（如干旱、高/低温、盐、紫外和重金属等）的影响,使植物的生长发育、品质和产量受到了严重的限制,特别是一些经济作物（如水稻、油菜、马铃薯、黄瓜和番茄等）的影响尤为严重。因此,植物已建立了多种防御机制来适应各种逆境胁迫,包括信号的识别、转导、传递及相关基因的表达。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联信号在响应逆境胁迫过程中发挥着重要的作用。MAPK级联信号主要通过逐级磷酸化被激活,使胞外信号级联放大,调控下游基因的转录水平。此外,MAPK级联信号还与其它信号传导途径或信号分子（H2O2、Ca2+、NO和H2S等）相互作用,响应植物逆境胁迫。冬油菜是我国北方重要的油料作物,在我国北方种植的过程中,通常会遭受低温、干旱等环境胁迫,造成其产量和品质的下降,所以对油菜抗性方面的研究具有一定的意义。本研究基于已报道的油菜MAPK信息,以具有超强抗寒性的“陇油6号”油菜为材料,首先对油菜BrMAPK4蛋白进行了生物信息学分析,然后在油菜中对BrMAPK4基因进行了不同胁迫诱导表达分析,并成功克隆了油菜BrMAPK4基因。通过Gateway技术构建BrMAPK4基因过表达载体,以农杆菌为介质获得过表达BrMAPK4的拟南芥植株,并进行盐胁迫和低温胁迫处理,进一步对过表达BrMAPK4基因植株进行生物学功能分析,探究过表达BrMAPK4植株在响应逆境胁迫中的调控机理。研究结果如下:1.油菜BrMAPK4蛋白的生物信息学分析对油菜BrMAPK4蛋白进行多序列比对以及系统发育分析发现,BrMAPK4蛋白与其他物种MAPK蛋白的结构相比,保守性较高,有11个保守结构域,在第Ⅶ和第Ⅷ结构域之间有TEY的双磷酸化基序。系统发育分析表明,BrMAPK4与AtMAPK4有较高的相似性,而AtMAPK4已证明能响应于多种非生物胁迫。2.不同胁迫处理下油菜BrMAPK4的表达分析为了探究BrMAPK4基因在油菜中的表达情况,通过qRT-PCR定量检测后发现BrMAPK4基因在油菜的根、茎、叶组织都有表达,且不同的组织中表达量不同,其中在叶片中的表达量最高,在茎中的表达量最低。因此选择其叶片作为后续的实验研究。对油菜叶片胁迫诱导表达分析发现,4℃处理和200 mMNaCl处理下,其表达量发生了显着性的上升,均呈先升高后降低的趋势;在20%PEG和UV处理后BrMAPK4基因的表达量增加的较为缓慢,但呈持续性升高的趋势。由此可见,油菜BrMAPK4基因在不同胁迫下的表达模式是不同的。3.油菜BrMAPK4基因过表达载体构建及拟南芥遗传转化本研究从油菜中克隆BrMAPK4基因,通过Gateway技术,构建过表达载体,使载体与BrMAPK4的cDNA序列连接,并用农杆菌浸花法转化Col-0拟南芥,成功获得4株BrMAPK4转基因拟南芥植株。通过qRT-PCR检测BrMAPK4在T2代转基因株系中的相对表达量,并用荧光显微镜检测其在蛋白水平的表达,最终选择表达量高的两个转基因拟南芥株系作为后续的实验材料,进一步研究BrMAPK4基因在不同胁迫下的功能。4.转基因拟南芥在不同非生物胁迫下的功能研究盐胁迫下,与野生型拟南芥相比,过表达BrMAPK4植株的根伸长较为显着,生长发育良好,表明过表达BrMAPK4拟南芥明显增强了盐胁迫的抗性。对过表达BrMAPK4基因拟南芥进行盐胁迫和低温胁迫处理,并对植株进行丙二醛（MDA）含量和相对电导率（%）检测发现,转基因植株中MDA含量和相对电导率均低于野生型植株,表明过表达BrMAPK4拟南芥能够减轻膜损伤程度。进一步对活性氧（ROS）和抗氧化酶（SOD、CAT和APX）活性的检测发现,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥中H2O2和超氧阴离子（O2·-）含量较低,而抗氧化酶（SOD、CAT和APX）活性高于野生型,表明过表达BrMAPK4拟南芥能够有效清除ROS,增强抗氧化酶活性。此外,对脯氨酸和可溶性糖的检测发现,野生型拟南芥均低于转基因株系,而叶绿素含量的测定发现,野生型拟南芥同样低于转基因株系,表明转基因拟南芥调节了渗透平衡,提高光合色素含量,增强植株耐受性。
金玉环[8]（2021）在《新疆荒漠环境典型短命植物小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）快速生长与耐逆性机制》文中研究说明近年来气候变化导致极端天气增多,全球人口不断增长给农业生产带来了前所未有的挑战,粮食安全是国家安全的重要基础。作物遗传改良能够促进粮食和营养安全,已经成为科学家关注的重要问题之一,但目前作物育种策略缺少足够的效率,还难以满足短期或长期的粮食生产需求,需要将传统育种、现代生物技术、基因组学研究与“speed breeding”（加速育种）相结合加速作物改良进程,帮助我们应对100亿人口粮食需求的挑战。基因组学能最大限度地发挥资源的有效利用、多样性、粮食产量和安全方面的作用,但需要在基因组和农艺性状水平上对尽可能多的种质资源进行鉴定,从而发掘和鉴定更多优良的基因资源将来应用于作物遗传改良。边际土地是保障我国粮食安全的战略后备耕地资源,我国新疆有3075.2万亩的边际土地,盐碱、沙性和干旱是主要的障碍因素。短命植物在新疆边际土地中广泛分布,起着防风固沙、保持水土、改善微生境、保护周边农田免受沙害等起着重要作用,因此对新疆尤其早春农业生物和生态环境的保护作出了重要贡献。开展短命植物适应环境的分子水平机理研究,为更好的合理利用和保护短命植物资源提供科学依据和理论支持,对未来作物育种、边缘土地的开发利用等有着重要的意义。小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）是生长在古尔班通古特沙漠南缘荒漠地带的十字花科植物,表现出快速开花结果、结实量大、光合效率高和耐盐抗寒的特点,蕴藏着丰富的抗性基因资源。本论文研究以小鼠耳芥为研究材料,从生理与细胞水平、分子生物学角度等建立生物学研究体系,结合RNA-seq技术等层面探索其适应特殊生境的机制及抗性基因挖掘和育种利用价值。本论文研究主要研究内容和结果如下:1.小鼠耳芥组织培养与遗传转化体系的建立首先开展了组织培养实验,以幼嫩的根、下胚轴、叶片和叶柄为外植体,有效地在诱导培养基上诱导出愈伤组织和多个不定芽。诱导培养基为添加0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤和0.1 mg/L萘乙酸的MS培养基。在同一培养基上,幼根、下胚轴、叶片和叶柄均可诱导愈伤组织,其中,幼根诱导率最高。进一步以生长4周龄幼苗的叶片和叶柄为外植体,以小鼠耳芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase 1）基因P5CS1为目的基因,潮霉素B为筛选抗生素,采用外植体预培养、感染、共培养等程序,研究了农杆菌GV3101介导的遗传转化方法。结果表明小鼠耳芥幼根、下胚轴、叶片和叶柄四种外植体均可以诱导形成愈伤和不定芽,其中,根外植体的愈伤组织诱导率最高,而下胚轴的愈伤组织诱导率最低。对叶片和叶柄进行农杆菌侵染,发现侵染所需最适宜的农杆菌浓度与侵染时间均不同,但在适宜浓度的农杆菌侵染下,都可以形成愈伤和不定芽。进一步运用花序侵染法对小鼠耳芥花序进行农杆菌侵染发现,在一定时间范围内适当延长侵染时间,可提高农杆菌的转化效率,当花序侵染时间为30 s时,筛选效率可以达到0.67%。2.筛选合适的内参基因合适的内参基因是实时荧光定量PCR（qRT-PCR）精确分析基因表达的重要前提,本研究鉴定了ACT1、ACT2、ALDH、EF1B、GAPDH、HAF1、LOS1、UBC35、UBQ9和UEP共10个候选内参基因,选择编码钾离子吸收渗透酶的KUP9作为验证基因。对小鼠耳芥进行了干旱、热激、冷和盐四种非生物胁迫,分别在0、3、6、12、24和48 h取样,以及七个不同的组织:根、下胚轴、子叶、莲座叶、茎、花和长角果,提取所有样品的RNA进行qRT-PCR试验。实验数据利用ge Norm、Norm Finder、Bestkeeper和Ref Finder 4个软件对10个内参基因的表达稳定性进行分析。综合排名表明:（1）不同组织中,合适的内参基因是ACT1和GAPDH;（2）10%PEG6000处理下,合适的内参基因是HAF1和UEP;（3）250 m M Na Cl胁迫处理,合适的内参基因是GAPDH和ACT1;（4）低温（4℃）胁迫处理,合适的内参基因是GAPDH和UBC35;（5）在高温（40℃）胁迫处理,合适的内参基因的是GAPDH和UBQ9。综合来看GAPDH和UBQ9是所有样本中最合适的内参基因组合。KUP9基因的表达特征进一步验证了筛选出的合适内参基因的稳定性,说明筛选的内参基因适合于基因表达的标准化。3.不同生长发育时期的RNA-seq分析小鼠耳芥在早春萌发以后迅速生长,统计自然生境下小鼠耳芥整个生长周期的表型变化。结果发现,萌发后一个月内株高和叶片数增加最明显,特别在抽薹期（Growth Stage 1,GS1）、始花期（GS2）、结荚期1（GS3）、结荚期2（GS4）、结荚期3（GS5）这5个时期表现出快速生长发育。半个月内形成幼苗到成苗的转变,从营养生长到开花结果、以及果荚增长的形态变化。接着选取GS1、GS2、GS3、GS4和GS5共5个生长时期的叶片开展RNA-seq分析。构建15个文库,测序产生694,576,138条raw reads和660,395,266条clean reads,总测序量达到99.06 G;相关系数和主成分分析发现,GS1与GS2这两个时期差异不显着,并且差异基因个数最少,其余组间差异非常显着。五个生长发育时期共鉴出29,994个差异表达基因。GO和KEGG富集分析,结果发现大多差异基因富集在光合作用、核糖体、生理节律、α-亚麻酸的新陈代谢、氧化磷酸化、类黄酮生物合成和芥子油苷生物合成等通路。其中GS3与GS2,GS4与GS3,GS4与GS4时期相比,生理节律相关的差异表达基因个数分别为24、27和24个;CO、GI和FT等15个光周期开花通路相关基因差异表达变化非常明显。此外,GO富集分析发现KT/HAK/KUP基因家族在整个结荚期明显富集,暗示它们在小鼠耳芥的生长发育调控中起着重要作用。4.钾离子转运蛋白KT/HAK/KUP基因家族的全基因组鉴定与分析利用小鼠耳芥全基因组序列鉴定出26个KUP基因,并从琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）、叶芽鼠耳芥（Arabidopsis helleri）、盐芥（Eutrema salsugineum）和亚麻荠（Camelina sativa）等4种十字花科植物中分别鉴定了14、14、16和40个KUP基因,系统进化分析表明123个KUP基因分为4个亚组。物种内共线性分析表明小鼠耳芥KUP的复制基因以全基因组复制（WGD）/片段重复方式为主,纯化选择是该家族基因进化的主要动力。利用15个组织的RNA-seq数据分析表明,超过1/3的基因成员在幼根中高表达,其次是种子和果柄组织。5个不同生长时期的RNA-seq数据分析表明,很多KUP成员参与植株快速生长,在结荚期（GS4和GS5）明显上调表达,表明该家族成员可能在植株增高和发育调控过程中起到非常重要的作用。qRT-PCR分析ApKUP基因响应逆境胁迫的表达特征,结果表明:（1）ApKUP基因表达明显响应高盐（250 m M Na Cl）、干旱（10%PEG6000）、低温（4℃）和高温（40℃）胁迫,表现出复杂的变化特征;（2）缺钾时,除Ap HAK5、ApKUP1.2和ApKUP6.1上调表达,其余ApKUP基因成员下调表达;（3）50μmo/L的茉莉酸甲酯（Me JA）和1μmo/L的脱落酸（ABA）显着影响ApKUP家族在根中的表达水平;（4）1μmo/L甲基紫精（MV）胁迫显着影响ApKUP在根和子叶中的表达水平。胁迫表达结果表明,ApKUP基因的表达积极响应非生物胁迫,但是不同复制基因对之间存在表达差异,说明KUP基因在进化中具有功能上的保守和分化。综合起来,本研究建立了小鼠耳芥遗传转化方法,筛选出了用于qRT-PCR实验的内参基因;以RNA-seq为基础挖掘了小鼠耳芥转录水平上参与生长调控的差异表达基因及代谢通路,如光合作用和生理节律,以及多个耐逆相关基因,如P5CS和KUP基因家族成员。发现这些基因在生长发育过程中快速响应逆境胁迫而上调表达,可能是赋予小鼠耳芥适应新疆荒漠环境快速开花成熟的适应性机制。本研究建立的研究系统为突破边际土地的改良工程体系与农作物育种技术体系提供理论参考,挖掘的基因资源可用于植物的抗性基因工程育种,为加快作物育种策略提供理论基础,为研究和开发更多短命植物资源提供思路,将来为新疆农业生物环境的改良和作物的遗传改良做出贡献。
张卡[9]（2021）在《BnaA03.WRKY28和BnWRKY33参与油菜菌核病抗性的分子机理》文中进行了进一步梳理油菜是世界上最重要的油料作物之一,但由核盘菌感染引起的菌核病对甘蓝型油菜的生长造成巨大危害,严重影响作物产量。植物先天免疫系统介导的防御反应是甘蓝型油菜抵抗核盘菌入侵的主要途径。BnWRKY33是油菜菌核病抗性的正调控因子,但其作用机制还不是非常清楚。本研究发现BnaA03.WRKY28和BnWRKY33两个转录因子均能结合BnWRKY33启动子,但对甘蓝型油菜菌核病的抗性起到相反的作用。通过分析BnaA03.WRKY28和BnWRKY33受核盘菌感染的诱导表达模式和对BnWRKY33启动子的作用方式,解析了甘蓝型油菜在应答核盘菌感染时由BnaA03.WRKY28和BnWRKY33介导的菌核病抗性机理,以此构建了一条较为完整的油菜菌核病抗性调控、生长和防御达到平衡的信号通路。主要研究结果如下:1.BnaA03.WRKY28生物学功能鉴定。在Jia9709和Westar两种甘蓝型油菜品系中分离到At WRKY28的5个同源拷贝,分别位于A01、C01、A03、A08、C08染色体上,其中位于A03上的拷贝BnaA03.WRKY28受到核盘菌感染诱导表达,其表达量在接种病原菌48 h后达到峰值。构建BnaA03.WRKY28超表达和基因编辑载体,转化Jia9709和Westar两种甘蓝型油菜品系,获得BnaA03.WRKY28超表达和纯合的BnaA03.WRKY28基因编辑遗传转化材料。对BnaA03.WRKY28遗传转化材料和转基因受体材料接种核盘菌,离体叶片接菌试验和茎秆接菌试验都显示BnaA03.WRKY28超表达株系相比野生型植株发病程度严重,而BnaA03.WRKY28基因编辑株系相比野生型植株发病程度轻微,表明BnaA03.WRKY28是甘蓝型油菜菌核病抗性的负调控因子。2.BnaA03.WRKY28调控下游靶基因表达。通过RNA-seq和ChIP-seq分析发现BnWRKY33可能是BnaA03.WRKY28的下游靶基因,并通过ChIP-q PCR、Y1H、双萤光素酶报告分析、EMSA等体内和体外试验证明了BnaA03.WRKY28与BnWRKY33启动子直接结合。进一步的分析发现BnWRKY33启动子区的W1和W3两个W-box是BnaA03.WRKY28的结合位点。BnaA03.WRKY28通过直接结合BnWRKY33的启动子来促进BnWRKY33的表达。BnWRKY33DD是BnWRKY33被磷酸化激活的形式,BnWRKY33DD也能直接结合BnWRKY33启动子并促进BnWRKY33的表达。但BnWRKY33DD的转录活性显着高于BnaA03.WRKY28。3.磷酸化激活BnWRKY33的MAPK级联通路分析。BnaA03.MKK4、BnaA06.MAPK3和Bna C03.MAPK3均受到核盘菌感染诱导表达,试验分析发现:BnaA03.MKK4能与BnaA06.MAPK3和Bna C03.MAPK3发生蛋白相互作用,而BnaA06.MAPK3和Bna C03.MAPK3均能与BnWRKY33发生蛋白相互作用。进一步通过体内双萤光素酶报告分析和体外磷酸化检测发现BnWRKY33是BnaA03.MKK4-BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3模块的磷酸化底物,BnWRKY33被磷酸化后,其转录活性显着增强。遗传转化结果证明BnaA03.MKK4-BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3介导的MAPK级联反应增强了甘蓝型油菜菌核病抗性,是植物体防御核盘菌感染的一条重要的应答路径。4.BnaA09.VQ12是BnaA03.WRKY28的辅助因子。VQ蛋白通常会与WRKY转录因子形成复合体,油菜受到核盘菌感染后BnaA09.VQ12与BnaA03.WRKY28具有相似的诱导表达趋势;通过Y2H、Bi FC、pull-down、Co-IP等试验证实了BnaA09.VQ12和BnaA03.WRKY28之间相互作用。在细胞核中,BnaA09.VQ12是通过结合到BnaA03.WRKY28的DNA结构域而与BnaA03.WRKY28形成蛋白复合体。此外,超表达BnaA09.VQ12减弱甘蓝型油菜菌核病抗性,而敲除BnaA09.VQ12增强抗病性。在甘蓝型油菜响应核盘菌感染的过程中,BnaA09.VQ12与BnaA03.WRKY28呈现出相似的生物学功能。5.BnWRKY33和BnaA03.WRKY28在菌核病抗性中的关系。BnWRKY33在核盘菌感染的早期高表达,而BnaA03.WRKY28在核盘菌感染的后期高表达,并且BnWRKY33在防御反应后期的表达显着低于早期。超表达BnaA03.WRKY28和BnaA09.VQ12抑制了植物体在防御反应早期BnWRKY33的表达;而BnaA03.WRKY28基因编辑株系和BnaA09.VQ12基因编辑株系中,BnWRKY33的表达持续维持在较高的水平。体外EMSA试验表明,BnaA09.VQ12通过结合BnaA03.WRKY28的DNA结构域增强BnaA03.WRKY28对BnWRKY33启动子的结合能力。体内双萤光素酶报告分析进一步表明,通过与BnaA09.VQ12形成复合体,BnaA03.WRKY28相比于BnWRKY33对BnWRKY33启动子的亲和力更强。6.BnaA03.WRKY28促进甘蓝型油菜侧枝形成。田间表型考察发现BnaA03.WRKY28超表达株系产生更多的分枝,特别是在一个叶腋处产生两个或两个以上的分枝,并且产生更多的高阶分枝。GUS染色分析表明BnaA03.WRKY28在生长点、叶腋处表达。q PCR分析发现,接种核盘菌48 h后,BnaA03.WRKY28超表达株系中与分枝形成密切相关的BnBRC1和BnBRC2,以及生长素介导的分枝形成相关基因BnAXR1表达下调,而编码生长素运输蛋白的基因BnPIN1表达上调。此外,EMSA试验显示BnaA03.WRKY28与Bna C03.BRC1启动子直接结合。因此推测BnaA03.WRKY28可能通过直接调控Bna C03.BRC1的表达,以及通过影响生长素介导的分枝形成的信号通路参与甘蓝型油菜分枝形成。综上所述,在甘蓝型油菜遭受核盘菌危害时,植物体先天免疫系统被激活,MAPK级联通过磷酸化将胁迫信号级联放大,并直接作用于转录因子BnWRKY33。被磷酸化激活的BnWRKY33的转录活性显着增强,并通过结合自身启动子大量诱导BnWRKY33的表达,抗病反应增强。随着病原菌的持续感染,BnaA03.WRKY28和BnaA09.VQ12被诱导表达,BnaA09.VQ12与BnaA03.WRKY28发生蛋白相互作用后,BnaA03.WRKY28对BnWRKY33启动子的结合能力增强,从而优先于BnWRKY33与BnWRKY33启动子结合,使抗病反应强度减弱。同时,在防御反应后期,在叶腋处表达的BnaA03.WRKY28通过调控Bna C03.BRC1、BnPIN1等与分枝相关基因的表达促进油菜侧枝形成,以实现油菜菌核病响应过程中生长与防御之间的权衡。
袁慧[10]（2021）在《基于miRNA的芥菜SSR标记开发及miR397功能的初步研究》文中提出芥菜（Brassicajuncea）为十字花科芸薹属植物,是世界各地广泛种植的重要油料作物和蔬菜作物,具有富集多种重金属的特性。微RNA（miRNA）是真核生物中普遍存在的一类小分子非编码RNA,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的调控作用。本研究基于芥菜miRNA序列数据开发了芥菜miRNA-SSR标记,对miR397进行了分子进化分析、表达分析和靶基因全基因组分析,并构建了 miR397过表达载体转化拟南芥。主要研究结果如下:（1）芥菜miRNA-SSR标记开发。利用MISA程序对芥菜miRNA序列和转录组序列进行SSR位点搜索,在芥菜的pri-miRNA和pre-miRNA中分别发现了279个、11个SSR位点,在115228条Unigene中发现了 32987个SSR位点。这些SSR都以单核苷酸重复为主,SSR长度均介于12～19bp之间。利用Primer3.0程序开发SSR引物30513对,从中随机选取26对进行验证,其中6对在11个芥菜品种中具有多态性。上述结果说明,基于miRNA序列开发SSR分子标记是开发芥菜SSR标记的有效途径。（2）芥菜miR397生物信息学与表达特性分析。从miRBase数据库中下载来自68种植物中共143条miR397序列,对其进行多序列比对,构建系统进化树并绘制成熟序列保守性Logo图。结果表明,芥菜miR397在进化上与拟南芥miR397同源关系较近,且成熟序列中的大多数碱基非常保守。psRNATarget软件预测结果显示miR397靶基因主要为漆酶基因。芥菜miR397启动子区中发现存在脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸以及厌氧诱导、节律调控等作用元件。qRT-PCR结果表明在芥菜幼苗根系中miR397表达量高于叶片中的表达量,Cd处理条件下miR397表达水平显着上升,说明miR397参与了芥菜对镉胁迫的响应。（3）芥菜miR397靶基因LAC基因的全基因组分析。将拟南芥LAC基因家族与芥菜转录本数据进行BlastP比对,并结合蛋白质结构域分析鉴定出芥菜57个LAC基因,理化性质分析结果表明大多为亲水性的稳定碱性蛋白,其分子量平均为66.94 kD,系统进化树分析表明可将这些基因聚类为7个亚家族。芥菜LAC蛋白定位于细胞质膜和各种细胞器膜上。利用MEME程序对蛋白保守基序分析发现,芥菜LAC蛋白家族中基本含有1～19基序;GSDS分析表明芥菜LAC基因中的内含子数量为4～15个不等。芥菜LAC启动子区域中含有多个与植物生长发育和逆境胁迫响应相关的ABRE、ARE和ERE等顺式作用元件。（4）芥菜MIR397基因过表达载体构建及其转化拟南芥。构建芥菜miR397过表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥。通过潮霉素抗性筛选以及PCR分子检测得到转基因植株,经自交传代获得纯合过表达株系。结果表明,过表达miR397的拟南芥的长势（根长和果荚数量）优于野生型;在一定镉浓度范围内,过表达miR397植株可提高拟南芥对镉的耐受性。上述研究结果为进一步揭示芥菜miR397功能奠定了基础。
二、通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株（论文提纲范文）
（3）芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物扩展蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.1.1 扩展蛋白的结构特点和起源 |
| 1.1.1.1 扩展蛋白的结构特点 |
| 1.1.1.2 扩展蛋白基因的起源 |
| 1.1.2 不同植物扩展蛋白基因家族成员的比较 |
| 1.1.3 进化过程中扩展蛋白基因亚家族的基因结构和结构域较保守 |
| 1.1.4 扩展蛋白基因在染色体上广泛分布 |
| 1.1.5 染色体片段重复是扩展蛋白基因家族主要扩张模式 |
| 1.1.6 扩展蛋白基因在不同植物组织中的表达丰度不同 |
| 1.2 扩展蛋白在植物生长发育中的作用 |
| 1.2.1 扩展蛋白基因在植物营养生长中的功能 |
| 1.2.1.1 种子萌发 |
| 1.2.1.2 根的生长发育 |
| 1.2.1.3 叶片的生长发育 |
| 1.2.2 扩展蛋白基因在植物生殖生长中的功能和调控 |
| 1.2.2.1 花粉管发育 |
| 1.2.2.2 果实成熟软化 |
| 1.3 花粉内壁的发育和调控 |
| 1.3.1 花粉壁的形成 |
| 1.3.2 花粉内壁发育的调控 |
| 1.3.2.1 参与拟南芥花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.3.2.2 参与水稻花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.4 花粉管的发育和调控 |
| 1.4.1 花粉管壁的组成和发育 |
| 1.4.2 细胞壁组分对花粉管生长的影响 |
| 1.4.2.1 果胶合成 |
| 1.4.2.2 纤维素合成 |
| 1.4.3 花粉管生长过程中细胞壁的重塑 |
| 1.4.3.1 细胞壁扩展蛋白和糖苷酶水解蛋白 |
| 1.4.3.2 阿拉伯半乳糖蛋白 |
| 1.4.3.3 果胶甲酯酶和果胶乙酰化酶 |
| 1.4.4 花粉管细胞壁结构蛋白的信号通路 |
| 1.4.4.1 细胞壁结构蛋白LRXs |
| 1.4.4.2 快速碱化因子家族RALFs |
| 1.4.4.3 类受体激酶CrRLK1Ls——ANX1/2和BUPS1/2 |
| 2 芸薹属三个基本种扩展蛋白基因家族的鉴定和进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 2.1.2 扩展蛋白家族成员的鉴定和理化性质预测 |
| 2.1.3 扩展蛋白家族成员系统发育遗传树的构建与结构分析 |
| 2.1.4 扩展蛋白家族基因的染色体分布、共线性和保留率分析 |
| 2.1.5 扩展蛋白家族基因编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.1.6 扩展蛋白家族基因的表达分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的鉴定 |
| 2.2.2 扩展蛋白基因的系统发育、基因结构和功能域分析 |
| 2.2.3 扩展蛋白基因的染色体分布、复制机制和保留比例 |
| 2.2.4 扩展蛋白基因的编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.2.5 扩展蛋白家族成员的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全基因组三倍化后芸薹属三个基本种的扩展蛋白基因家族规模 |
| 2.3.2 芸薹属三个基本种中EXLB亚家族在进化上最为保守 |
| 2.3.3 启动子的变异与扩展蛋白基因的编码序列进化密切相关 |
| 2.3.4 扩展蛋白基因在白菜生殖发育中可能扮演重要的角色 |
| 3 白菜扩展蛋白基因BrEXPB4和BrEXPB9 的表达模式和功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 3.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 3.1.3 总RNA 的提取(试剂盒法)与cDNA 的合成 |
| 3.1.4 BrEXPB4和BrEXPB9 的基因编码序列和启动子序列的扩增 |
| 3.1.5 氨基酸序列的特征分析 |
| 3.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 3.1.7 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS融合表达载体的构建 |
| 3.1.8 BrEXPB4::eGFP和 BrEXPB9::eGFP融合表达载体的构建 |
| 3.1.9 人工microRNA(amiRNA)载体的构建 |
| 3.1.9.1 amiRNA序列的设计与合成 |
| 3.1.9.2 p35S::ami REXPB4/9、p35S::amiREXPB4和p35S::ami REXPB9 载体的构建 |
| 3.1.10 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体的遗传转化 |
| 3.1.10.1 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体浸花法转化野生型拟南芥 |
| 3.1.10.2 阳性转基因拟南芥植株的筛选 |
| 3.1.10.3 阳性植株组织的GUS染色观察 |
| 3.1.11 BrEXPB4和BrEXPB9 的亚细胞定位 |
| 3.1.11.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.11.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.12 利用抽真空浸花法将amiRNA载体转化‘油青四九’菜心 |
| 3.1.13 菜心阳性转基因植株的筛选鉴定 |
| 3.1.13.1 转基因菜心基因组DNA的提取 |
| 3.1.13.2 利用PCR对转基因菜心植株进行初次筛选 |
| 3.1.13.3 利用qRT-PCR对转基因菜心植株进行再次筛选 |
| 3.1.14 阳性转基因菜心植株的表型观察 |
| 3.1.14.1 植株的形态学观察和角果长度的统计 |
| 3.1.14.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 3.1.14.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 3.1.14.4 花粉的半薄切片和透射电镜观察 |
| 3.1.14.5 花粉的体内萌发 |
| 3.1.14.6 花粉的体外萌发 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功扩增‘油青四九’菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的编码序列和启动子序列 |
| 3.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在成熟花粉粒和花粉管中表达 |
| 3.2.2.1 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在‘Bcajh97-01’的花序、三核花粉期以及授粉受精后优势表达 |
| 3.2.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 从单核晚期花粉中起始表达并持续到花粉管中 |
| 3.2.3 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.4 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.5 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达造成花粉和花粉管的发育异常 |
| 3.2.5.1 利用amiRNA技术实现对菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的表达抑制 |
| 3.2.5.2 抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达不会影响菜心的营养生长和花器官形态 |
| 3.2.5.3 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达导致花粉败育以及花粉萌发和伸长异常 |
| 3.2.5.4 BrEXPB4/9~(KD)的花粉败育发生在单核花粉晚期,导致花粉内容物含量降低并伴随异常的内壁沉积 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrEXPB4和BrEXPB9 具有相似的表达模式和亚细胞定位 |
| 3.3.2 BrEXPB4和BrEXPB9 冗余地参与白菜花粉发育和花粉管萌发 |
| 3.3.3 BrEXPB4和BrEXPB9 通过调控花粉内壁的沉积影响花粉管的萌发 |
| 4 拟南芥EXPA4和EXPB5 的表达模式和功能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 4.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 4.1.3 总RNA 的提取与cDNA 的合成 |
| 4.1.3.1 Trizol法提取总RNA |
| 4.1.3.2 cDNA的合成 |
| 4.1.4 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列的扩增 |
| 4.1.5 氨基酸序列的特征分析和启动子顺式作用元件分析 |
| 4.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 4.1.7 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS融合表达载体的构建 |
| 4.1.8 AtEXPA4::eGFP和 AtEXPB5::eGFP融合表达载体的构建 |
| 4.1.9 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除载体的构建 |
| 4.1.9.1 AtEXPA4和AtEXPB5 sgRNA的设计合成及中间载体的构建 |
| 4.1.9.2 构建以proYAO启动子驱动Cas9 表达的CRISPR/Cas9 载体 |
| 4.1.10 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5 的构建 |
| 4.1.11 利用浸花法将各载体转化野生型拟南芥以及T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.11.1 通过浸花法对拟南芥进行遗传转化 |
| 4.1.11.2 T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.12 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS植株的筛选和观察 |
| 4.1.13 AtEXPA4和AtEXPB5 的亚细胞定位 |
| 4.1.13.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.13.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.14 敲除植株的筛选鉴定 |
| 4.1.14.1 通过PCR检测敲除植株的T-DNA插入情况 |
| 4.1.14.2 敲除植株的基因编辑检测 |
| 4.1.14.3 敲除纯合植株的筛选 |
| 4.1.15 双突变体atexpa4expb5 的获得和F_2代基因分离比的统计 |
| 4.1.16 利用PCR和 qRT-PCR对过表达植株进行筛选和鉴定 |
| 4.1.17 双突变体atexpa4expb5 的回补实验 |
| 4.1.17.1 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5对atexpa4expb5 的遗传转化 |
| 4.1.17.2 利用PCR和 qRT-PCR对回补植株进行筛选 |
| 4.1.18 敲除、过表达以及回补植株的表型观察 |
| 4.1.18.1 植株的形态学观察 |
| 4.1.18.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 4.1.18.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 4.1.18.4 花粉的体内萌发 |
| 4.1.18.5 主根长度和根尖分生区长度的测量与统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列 |
| 4.2.2 AtEXPA4和AtEXPB5 的表达分析 |
| 4.2.3 AtEXPA4和AtEXPB5 定位在细胞壁上 |
| 4.2.4 AtEXPA4和AtEXPB5 突变体、过表达以及回补植株的获得 |
| 4.2.4.1 atexpa4和atexpb5株系T-DNA插入和基因编辑类型的统计 |
| 4.2.4.2 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除植株的脱靶检测 |
| 4.2.4.3 通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5 双突变体atexpa4expab5 |
| 4.2.4.4 导入过表达载体使野生型拟南芥和atexpa4expab5 中相应基因的表达量升高 |
| 4.2.5 AtEXPA4和AtEXPB5 的同时突变使花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变和过量表达对植株形态和花粉发育未观察到显着影响 |
| 4.2.5.2 双突变体atexpa4expab5 的花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.3 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变对花粉的竞争力和配子传递无明显影响 |
| 4.2.6 AtEXPA4或AtEXPB5 都可以恢复atexpa4expab5 花粉管的伸长速度 |
| 4.2.7 AtEXPA4 促进主根的伸长 |
| 4.2.8 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.2.9 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 AtEXPA4和AtEXPB5 冗余地参与花粉管的发育 |
| 4.3.2 AtEXPA4 参与主根的生长发育 |
| 4.3.3 AtEXPA4和AtEXPB5 可能在MYB转录因子的调控下参与花粉管的发育 |
| 5 AtEXPA4和AtEXPB5 与其白菜中的同源基因的功能分化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 5.1.2 转录因子TDF1、AMS和 MYB结合位点的分析 |
| 5.1.3 酵母单杂交实验 |
| 5.1.3.1 TFs-AD和 proBrEXPB4A-E-AbAi、proBrEXPB9A-C-Ab Ai、pAtEXPB5A-Ab Ai载体的构建 |
| 5.1.3.2 线性化启动子载体并转化Y1H感受态细胞 |
| 5.1.3.3 检测转录因子对目的基因的调控作用 |
| 5.1.4 双荧光素酶实验 |
| 5.1.4.1 报告器载体proBrEXPB4-LUC、proBrEXPB9-LUC、pAtEXPB5A-LUC和效应器载体TFs-SK的构建 |
| 5.1.4.2 效应器和报告器质粒电击法转化农杆菌GV3101(MP90)感受态细胞 |
| 5.1.4.3 效应器和报告器载体瞬时转化烟草叶片并检测荧光强度 |
| 5.1.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TDF1和AMS对白菜EXPB4/9 和拟南芥EXPB5 的转录激活分析 |
| 5.2.2 其他转录因子与BrEXPB4和BrEXPB9 的启动子结合分析 |
| 5.2.3 BrEXPA11/19/22 的表达模式及其在BrEXPB4/9~(KD)中的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtEXPB5 与其在白菜中的同源基因BrEXPB4和BrEXPB9 产生功能分化 |
| 5.3.2 AtEXPB5和BrEXPB4/9 参与不同的调控路径 |
| 5.3.3 白菜扩展蛋白基因家族在进化过程中产生功能分化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文 |
（4）兴安落叶松同源异型盒基因LgKNOX2的表达特性和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 KONX基因的研究现状 |
| 1.1.2 KNOX基因在植物发育过程中的调控机制 |
| 1.1.3 KNOX基因在木材形成过程中的作用 |
| 1.1.4 KNOX基因在营养器官中的作用 |
| 1.2 研究意义 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及培养方法 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 试剂及配制方法 |
| 2.2 兴安落叶松LgKNOX2的表达特性分析 |
| 2.2.1 兴安落叶松LgKNOX2启动子的生物信息学分析 |
| 2.2.2 pORE R1-pLgKNOX2::GUS载体构建 |
| 2.2.3 重组载体转化农杆菌感受态GV3101,拟南芥的遗传转化及鉴定 |
| 2.2.4 转基因拟南芥的组织GUS化学染色检测 |
| 2.3 兴安落叶松LgKNOX2的亚细胞定位分析 |
| 2.3.1 p CAMBIA1300-35S::LgKNOX2-GFP载体构建 |
| 2.3.2 农杆菌介导LgKNOX2-GFP融合蛋白在烟草下表皮的瞬时表达 |
| 2.4 利用酵母系统验证兴安落叶松LgKNOX2的转录激活功能 |
| 2.4.1 兴安落叶松LgKNOX2的生物信息学分析 |
| 2.4.2 p GBKT7-LgKNOX2载体的构建 |
| 2.4.3 PEG/LiAC法转化酵母菌AH109 |
| 2.4.4 酵母系统验证目的基因转录激活功能 |
| 2.5 兴安落叶松LgKNOX2的功能分析 |
| 2.5.1 pBI101-LgKNOX2载体构建 |
| 2.5.2 重组载体转化农杆菌感受态和拟南芥的遗传转化及鉴定 |
| 2.5.3 过表达株系拟南芥生长指标检测 |
| 2.5.4 q-PCR检测转基因拟南芥中LgKNOX2的表达水平 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 兴安落叶松LgKNOX2的表达特性分析 |
| 3.1.1 兴安落叶松pLgKNOX2的生物信息学分析 |
| 3.1.2 双酶切法构建pORER1-pLgKNOX2::GUS载体 |
| 3.1.3 重组载体转化农杆菌,拟南芥的遗传转化及鉴定 |
| 3.1.4 转基因拟南芥的GUS组织染色 |
| 3.2 兴安落叶松LgKNOX2 的亚细胞定位分析 |
| 3.2.1 双酶切法构建pCAMBIA1300-35S::LgKNOX2-GFP载体 |
| 3.2.2 重组载体转化农杆菌感受态GV3101,烟草下表皮瞬时表达融合蛋白 |
| 3.3 .酵母系统验证兴安落叶松LgKNOX2的转录激活功能 |
| 3.3.1 兴安落叶松LgKNOX2 蛋白质序列的生物信息学分析 |
| 3.3.2 双酶切法构建pGBKT7::LgKNOX2(1、2、3、4) |
| 3.3.3 重组载体转化酵母菌感受态AH109 |
| 3.3.4 酵母系统验证目的基因转录激活功能 |
| 3.4 兴安落叶松LgKNOX2的功能分析 |
| 3.4.1 双酶切法构建pBI101-LgKNOX2 |
| 3.4.2 重组载体转化农杆菌,拟南芥的遗传转化及鉴定 |
| 3.4.3 筛选纯合转基因株系,进行RT-PCR鉴定 |
| 3.4.4 转基因拟南芥的表型分析 |
| 3.4.5 q-PCR检测转基因拟南芥中LgKNOX2的表达水平 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）拟南芥ABI5亚家族DPBF2、DPBF3、DPBF4、DPBF5及At5G42910基因的重组及其过表达转基因拟南芥的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词表(Abbreviations) |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 ABA信号通路 |
| 1.1.1 高等植物体内ABA的合成与代谢 |
| 1.1.2 ABA信号通路 |
| 1.2 ABI5亚家族 |
| 1.2.1 ABI5亚家族简介 |
| 1.2.2 ABI5亚家族研究进展 |
| 1.3 ABI5亚家族在ABA信号转导中的作用 |
| 1.3.1 ABI5亚家族转录因子的磷酸化/去磷酸化修饰 |
| 1.3.2 ABI5亚家族转录因子的泛素化/类泛素化修饰 |
| 1.4 研究的目的意义及内容 |
| 1.4.1 研究目的意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第2章 重组基因4IID2bZIP、4IID3bZIP、4IID4bZIP、4IID5bZIP 及4II910bZIP 及其转基因拟南芥的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组载体p1304-4II910bZIP构建 |
| 2.2.2 DPBFs各成员重组载体的构建 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α感受态的制备 |
| 2.2.4 重组质粒转化大肠杆菌DH5α |
| 2.2.5 质粒提取 |
| 2.2.6 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 重组质粒冻融法转化农杆菌GV3101 |
| 2.2.8 农杆菌浸花法转化拟南芥 |
| 2.2.9 转基因拟南芥的抗性筛选及鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组基因4II910bZIP的克隆 |
| 2.3.2 重组基因4IID2bZIP、4IID3bZIP、4IID4bZIP及4IID5bZIP的克隆 |
| 2.3.3 转基因拟南芥的筛选鉴定 |
| 第3章 ABI5亚家族9个成员的同/异二聚体模式 |
| 3.1 目的与意义 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂及溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 酵母双杂交载体的亚克隆 |
| 3.3.2 酵母双杂交重组载体的鉴定 |
| 3.3.3 酵母感受态细胞的制备 |
| 3.3.4 酵母感受态细胞的转化 |
| 3.3.5 酵母双杂交 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 酵母双杂交载体的PCR扩增及双酶切鉴定 |
| 3.4.2 ABI5亚家族成员同/异二聚体模式 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 超表达重组ABI5植株的蛋白质组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要溶液的配制 |
| 4.1.3 植物培养 |
| 4.1.4 qRT-PCR分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 ABI5下游基因在转录水平的表达 |
| 4.2.2 A.thaliana MX-1-1 蛋白质组学分析 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A |
| 附录B |
（6）马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 Abbreviations |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物MAPK级联途径 |
| 1.1.1 植物MAPK级联途径组成 |
| 1.1.2 植物中的MAPKKK |
| 1.1.3 植物中的MAPKK |
| 1.1.4 植物中的MAPK |
| 1.2 植物MAPK级联途径参与植物激素信号转导 |
| 1.2.1 乙烯信号转导 |
| 1.2.2 脱落酸信号转导 |
| 1.2.3 茉莉酸信号转导 |
| 1.2.4 水杨酸信号转导 |
| 1.2.5 生长素信号转导 |
| 1.2.6 油菜素甾醇信号转导 |
| 1.2.7 赤霉素信号转导 |
| 1.3 MAPK级联参与调控植物非生物胁迫 |
| 1.3.1 盐胁迫 |
| 1.3.2 干旱胁迫 |
| 1.3.3 温度胁迫 |
| 1.3.4 氧化应激响应 |
| 1.3.5 臭氧胁迫 |
| 1.3.6 创伤响应 |
| 1.3.7 重金属胁迫 |
| 1.4 植物中磷酸化蛋白组学研究的应用 |
| 1.5 研究内容及目的意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究目的意义 |
| 第二章 马铃薯StMAPKs的差异表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 生化试剂 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 植物材料及处理 |
| 2.1.4.1 非生物胁迫和植物激素处理 |
| 2.1.4.2 马铃薯植株不同组织器官的取样 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 2.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.1.5.3 实时荧光定量qRT-RCR分析StMAPKs表达谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 非生物胁迫及植物激素处理下的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.2.1.1 脱落酸处理 |
| 2.2.1.2 干旱处理 |
| 2.2.1.3 乙烯处理 |
| 2.2.1.4 赤霉素处理 |
| 2.2.1.5 H_2O_2处理 |
| 2.2.1.6 高温处理 |
| 2.2.1.7 生长素处理 |
| 2.2.1.8 茉莉酸处理 |
| 2.2.1.9 低温处理 |
| 2.2.1.10 NaCl处理 |
| 2.2.1.11 PEG处理 |
| 2.2.1.12 水杨酸处理 |
| 2.2.2 不同组织器官中的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 马铃薯StMAPK3 抗盐和渗透胁迫相关的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生化试剂 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 植物材料及处理 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 3.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.1.5.5 回收目的片段 |
| 3.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 3.1.5.7 马铃薯StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.1.5.8 酵母双杂试验 |
| 3.1.5.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.1.5.10 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 3.1.5.11 盐和渗透胁迫条件下生理指标分析 |
| 3.1.5.12 盐和渗透胁迫条件下生长指标和气孔的分析 |
| 3.1.5.13 盐和渗透胁迫条件下光合指标的分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK3 基因的分离 |
| 3.2.2 载体的构建 |
| 3.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk3 的构建 |
| 3.2.2.3 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.4 酵母双杂表达载体的构建 |
| 3.2.2.5 双分子荧光互补(BiFC)表达载体的构建 |
| 3.2.3 StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.2.4 酵母双杂交筛选与StMAPK3 互作蛋白 |
| 3.2.4.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK3 毒性与自激活检测 |
| 3.2.4.2 StMAPK3 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 3.2.4.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 3.2.5 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 3.2.6 转基因马铃薯的植株的获得与检测 |
| 3.2.7 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生理指标分析 |
| 3.2.8 NaCl、甘露醇和PEG处理下的光合指标分析 |
| 3.2.9 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生长指标及气孔分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 马铃薯StMAPK11 抗旱胁迫相关的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生化试剂 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 植物材料及处理 |
| 4.1.4.1 马铃薯材料及处理 |
| 4.1.4.2 烟草材料及处理 |
| 4.1.4.3 拟南芥材料及处理 |
| 4.1.5 试验方法 |
| 4.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 4.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 4.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 4.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.5.5 回收目的片段 |
| 4.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 4.1.5.7 马铃薯StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.1.5.8 原核表达马铃薯StMAPK11 蛋白 |
| 4.1.5.9 原核表达马铃薯StMAPK11 重组蛋白抗体制备 |
| 4.1.5.10 Western blot |
| 4.1.5.11 酵母双杂试验 |
| 4.1.5.12 双分子荧光互补试验 |
| 4.1.5.13 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.14 烟草遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.15 拟南芥遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.16 干旱胁迫条件下马铃薯植株生理指标分析 |
| 4.1.5.17 干旱胁迫条件下烟草的生理指标分析 |
| 4.1.5.18 干旱胁迫条件下拟南芥的生理指标分析 |
| 4.1.5.19 干旱胁迫条件下马铃薯植株的生物量和生长指标分析 |
| 4.1.5.20 干旱胁迫条件下光合指标的分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK11 基因的分离 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk11 的构建 |
| 4.2.2.3 拟南芥和烟草表达载体pART-CAM-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.4 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.5 原核重组表达载体pET28b-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.6 酵母双杂表达载体pGBKT7-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.7 双分子荧光互补(BiFC)试验表达载体的构建 |
| 4.2.3 原核表达StMAPK11 及抗体制备 |
| 4.2.3.1 原核重组StMAPK11 蛋白表达 |
| 4.2.3.2 间接ELISA法检测兔抗StMAPK11 抗血清效价 |
| 4.2.3.3 兔抗StMAPK11 抗血清的Western blot鉴定 |
| 4.2.4 StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.2.5 酵母双杂交筛选与StMAPK11 互作蛋白 |
| 4.2.5.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK11 毒性与自激活检测 |
| 4.2.5.2 StMAPK11 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 4.2.5.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 4.2.6 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 4.2.7 转基因马铃薯植株的获得与检测 |
| 4.2.8 转基因烟草植株的获得与检测 |
| 4.2.9 转基因拟南芥植株获得与检测 |
| 4.2.10 干旱胁迫下的生理指标分析 |
| 4.2.10.1 干旱胁迫下马铃薯植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.2 干旱胁迫下烟草植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.3 干旱胁迫下拟南芥植株的生理指标分析 |
| 4.2.11 干旱胁迫下的光合指标分析 |
| 4.2.12 干旱胁迫下的生长指标及生物量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 马铃薯StMAPK3 磷酸化修饰定量蛋白组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 总蛋白提取 |
| 5.1.2.2 蛋白质检 |
| 5.1.2.3 蛋白酶解 |
| 5.1.2.4 磷酸化修饰多肽富集 |
| 5.1.2.5 液质检测 |
| 5.1.2.6 蛋白质的鉴定和定量 |
| 5.1.2.7 蛋白质和差异表达蛋白质的功能分析 |
| 5.1.2.8 基序分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 磷酸化蛋白质组学数据质控与鉴定 |
| 5.2.2 磷酸化蛋白功能注释 |
| 5.2.3 磷酸化修饰位点分析 |
| 5.2.4 磷酸化蛋白差异分析 |
| 5.2.5 差异磷酸化蛋白生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 导师简介 |
（7）过表达油菜BrMAPK4拟南芥抗逆性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 非生物胁迫对植物的影响 |
| 1.1.1 盐胁迫对植物的影响 |
| 1.1.1.1 盐胁迫对植物光合作用的影响 |
| 1.1.1.2 盐胁迫对植物体渗透调节物质的影响 |
| 1.1.2 植物耐盐性的应答机制 |
| 1.1.2.1 离子稳态调节 |
| 1.1.2.2 抗氧化防御系统 |
| 1.1.3 低温对植物的影响 |
| 1.1.3.1 低温对活性氧代谢的影响 |
| 1.1.3.2 低温对渗透调节物质的影响 |
| 1.1.3.3 低温对植物光合作用的影响 |
| 1.2 植物蛋白激酶 |
| 1.2.1 植物中的MAPK |
| 1.2.1.1 植物MAPK级联途径的组成及作用机理 |
| 1.2.2 植物MAPK的功能 |
| 1.2.2.1 植物MAPK在温度胁迫中的功能 |
| 1.2.2.2 植物MAPK在盐胁迫中的功能 |
| 1.3 Gateway克隆技术 |
| 1.4 立题依据和研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 油菜BrMAPK4 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 BrMAPK4 蛋白的生物信息学分析 |
| 第3章 油菜BrMAPK4 基因的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料培养 |
| 3.1.2 实验材料处理 |
| 3.1.3 油菜mRNA的提取 |
| 3.1.4 cDNA的合成 |
| 3.1.5 不同处理下油菜BrMAPK4 基因的表达量分析 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 油菜BrMAPK4 基因的表达分析 |
| 3.2.1.1 油菜BrMAPK4 基因在不同组织中的表达分析 |
| 3.2.1.2 油菜BrMAPK4 基因在不同胁迫条件下的表达分析 |
| 第4章 油菜BrMAPK4 基因过表达载体构建及拟南芥遗传转化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 实验用到的各种试剂、酶和试剂盒 |
| 4.1.4 MS培养基配制 |
| 4.1.5 实验引物设计 |
| 4.1.6 实验仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 植物材料的培养 |
| 4.2.2 带特异性接头的MAPK4 基因的扩增 |
| 4.2.3 MAPK4 基因过表达载体构建 |
| 4.2.3.1 入门载体的构建 |
| 4.2.3.2 LR反应构建过表达载体 |
| 4.2.3.3 LR反应产物转化DH5α |
| 4.2.3.4 菌落PCR鉴定阳性克隆 |
| 4.2.3.5 摇菌、菌种保存与质粒提取 |
| 4.2.4 农杆菌GV3101 感受态的制备和重组质粒转化农杆菌GV3101 及鉴定 |
| 4.2.5 农杆菌花侵染法转化拟南齐 |
| 4.2.6 转基因材料的鉴定及筛选 |
| 4.2.7 转基因路线图 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 带特异性接头的MAPK4 基因的扩增 |
| 4.3.1.1 油菜总RNA的提取 |
| 4.3.1.2 GW-MAPK4 基因的扩增 |
| 4.3.2 Gateway技术构建MAPK4 基因过表达载体 |
| 4.3.2.1 BP反应阳性克隆的鉴定 |
| 4.3.2.2 LR反应阳性克隆的鉴定 |
| 4.3.3 过表达载体转化农杆菌阳性克隆的鉴定 |
| 4.3.4 过表达BrMAPK4 载体构建及转基因拟南芥的筛选鉴定 |
| 4.3.5 BrMAPK4 在转基因拟南芥中的表达水平分析 |
| 第5章 BrMAPK4 转基因拟南芥的抗性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 材料培养 |
| 5.1.3 生理指标的测定及方法 |
| 5.1.3.1 盐胁迫下根长的测定 |
| 5.1.3.2 拟南芥的不同胁迫处理 |
| 5.1.3.3 生理生化指标的测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BrMAPK4 在盐胁迫条件下的研究 |
| 5.2.1.1 盐胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥生长表型的影响 |
| 5.2.1.2 盐胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥活性氧含量的影响 |
| 5.2.1.3 盐胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥膜脂过氧化及膜通透性的影响 |
| 5.2.1.4 盐胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥渗透调节物质的影响 |
| 5.2.1.5 盐胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥抗氧化酶活性的影响 |
| 5.2.1.6 盐胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥光合色素含量的影响 |
| 5.2.2 BrMAPK4 在低温胁迫条件下的研究 |
| 5.2.2.1 低温胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥活性氧含量的影响 |
| 5.2.2.2 低温胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥膜脂过氧化及膜通透性的影响 |
| 5.2.2.3 低温胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥渗透调节物质含量的影响 |
| 5.2.2.4 低温胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥抗氧化酶活性的影响 |
| 5.2.2.5 低温胁迫对过表达BrMAPK4 拟南芥光合色素含量的影响 |
| 第6章 讨论与结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 油菜BrMAPK4 在抵抗非生物胁迫中的作用 |
| 6.2 主要结论 |
| 6.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在校期间发表的学术论文及研究成果 |
（8）新疆荒漠环境典型短命植物小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）快速生长与耐逆性机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 2 国内外研究现状 |
| 2.1 我国粮食生产面临的主要问题 |
| 2.1.1 粮食生产和安全所面临的问题 |
| 2.1.2 未来我国提高粮食生产的方法 |
| 2.1.3 新疆农业生产的资源优势及面临的问题 |
| 2.1.4 农业生产与育种的“卡脖子”问题 |
| 2.2 新疆短命植物的研究进展 |
| 2.2.1 新疆短命植物资源 |
| 2.2.2 短命植物研究进展 |
| 2.3 植物应答环境的发育机制 |
| 2.3.1 植物的生长发育 |
| 2.3.2 钾离子对植物生长发育的影响 |
| 2.3.3 KT/HAK/KUP钾离子转运蛋白家族 |
| 2.3.4 植物响应盐胁迫的分子机制研究 |
| 2.4 小鼠耳芥研究进展 |
| 3 研究目的和意义 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 小鼠耳芥遗传转化体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂和培养基配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠耳芥全基因组中鉴定出4 个ApP5CS基因 |
| 2.2 ApP5CS基因在小鼠耳芥不同组织中的表达特征 |
| 2.3 ApP5CS响应逆境胁迫的表达特征 |
| 2.4 ApP5CS1.1 基因的克隆和构建过表达载体 |
| 2.5 小鼠耳芥四种不同外植体的再生诱导 |
| 2.6 建立组织培养遗传转化体系 |
| 2.7 阳性植株鉴定和ApP5CS1.1 基因表达分析 |
| 2.8 小鼠耳芥花序侵染遗传转化方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 小鼠耳芥基因表达分析内参基因的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 候选内参基因和靶基因的扩增特异性和扩增效率 |
| 2.2 候选内参基因的表达分析 |
| 2.3 候选内参基因表达稳定性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 小鼠耳芥不同生长发育时期的转录组测序 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 所用试剂 |
| 1.2 样品统计和收集 |
| 1.3 RNA-seq文库准备 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠耳芥快速生长时期的变化分析 |
| 2.2 转录组数据统计 |
| 2.3 转录组与参考基因组比对 |
| 2.4 基因表达定量 |
| 2.5 差异基因统计 |
| 2.6 差异基因富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 小鼠耳芥钾转运蛋白KT/HAK/KUP基因家族的鉴定及响应非生物胁迫的表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 小鼠耳芥KT/HAK/KUP基因家族同源序列搜索鉴定 |
| 1.2 系统进化分析 |
| 1.3 染色体位置和共线分析 |
| 1.4 基因结构和蛋白质保守结构域分析 |
| 1.5 不同组织转录组数据库 |
| 1.6 不同生长发育时期转录组数据库 |
| 1.7 盐胁迫转录组数据库 |
| 1.8 茉莉酸甲酯、脱落酸和甲基紫精胁迫处理和取样 |
| 1.9 缺钾、干旱和极端温度胁迫处理和取样 |
| 1.10 RNA提取、反转录和q RT分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 KT/HAK/KUP基因家族的鉴定及命名 |
| 2.2 系统进化分析 |
| 2.3 基因家族复制分析 |
| 2.4 基因结构、保守结构域和启动子分析 |
| 2.5 染色体定位和共线分析 |
| 2.6 ApKUP基因在不同组织中的表达分析 |
| 2.7 ApKUP基因在不同发育时期的表达分析 |
| 2.8 ApKUP基因在盐胁迫下的表达分析 |
| 2.9 ApKUP基因在MeJA(50μmo/L)胁迫下的表达分析 |
| 2.10 ApKUP基因在甲基紫精(MV,1 μmo/L)胁迫下的表达分析 |
| 2.11 ApKUP基因在ABA(1μmo/L)胁迫下的表达分析 |
| 2.12 ApKUP基因在10%PEG6000 胁迫下的表达分析 |
| 2.13 ApKUP基因在缺钾胁迫下的表达分析 |
| 2.14 ApKUP基因在高低温胁迫下的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 研究结论、创新点和展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（9）BnaA03.WRKY28和BnWRKY33参与油菜菌核病抗性的分子机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 Abbreviation list |
| 1 文献综述 |
| 1.1 油菜菌核病概述 |
| 1.1.1 核盘菌的病原特征和病理循环 |
| 1.1.2 核盘菌的致病机理 |
| 1.1.3 甘蓝型油菜菌核病抗性研究进展 |
| 1.2 植物先天免疫系统 |
| 1.2.1 两条支路PTI和 ETI |
| 1.2.2 MAPK级联反应 |
| 1.2.3 MAPK级联下游的转录因子/底物参与植物免疫 |
| 1.2.4 植保素参与植物免疫反应 |
| 1.3 WRKY转录因子 |
| 1.3.1 WRKY转录因子的基本特征 |
| 1.3.2 WRKY转录因子参与植物非生物胁迫响应 |
| 1.3.3 WRKY转录因子参与植物生物胁迫响应 |
| 1.3.4 WRKY转录因子参与植物的生长发育 |
| 1.4 VQ蛋白 |
| 1.4.1 VQ蛋白参与植物逆境胁迫响应 |
| 1.4.2 VQ蛋白参与植物的生长发育 |
| 1.4.3 VQ蛋白与WRKY转录因子相互作用 |
| 1.5 植物生长-防御的权衡(trade-off) |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和生长条件 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 基因序列信息和登陆号 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BnWRKY28 在油菜中的基因克隆和序列分析 |
| 2.2.2 植物RNA提取和c DNA合成 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.4 核盘菌接种和菌核病抗性鉴定 |
| 2.2.5 SA和JA处理油菜叶片 |
| 2.2.6 超表达载体构建 |
| 2.2.7 基因编辑载体构建 |
| 2.2.8 油菜遗传转化 |
| 2.2.9 转录组测序和数据分析 |
| 2.2.10 染色质免疫沉淀(ChIP)及ChIP-seq数据分析 |
| 2.2.11 酵母单杂交(Y1H) |
| 2.2.12 原核表达和蛋白纯化 |
| 2.2.13 凝胶阻滞电泳试验(EMSA) |
| 2.2.14 拟南芥原生质体分离与转化 |
| 2.2.15 双萤光素酶活性测定 |
| 2.2.16 酵母双杂交(Y2H) |
| 2.2.17 pull-down |
| 2.2.18 Co-IP |
| 2.2.19 体外磷酸化检测 |
| 2.2.20 双分子荧光互补(Bi FC) |
| 2.2.21 亚细胞定位 |
| 2.2.22 GUS染色 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BnaA03.WRKY28 响应核盘菌处理诱导表达 |
| 3.2 BnaA03.WRKY28 负调控甘蓝型油菜菌核病抗性 |
| 3.3 BnaA03.WRKY28 直接结合到BnWRKY33 启动子 |
| 3.3.1 鉴定BnaA03.WRKY28 的下游靶基因 |
| 3.3.2 BnaA03.WRKY28 结合BnWRKY33 的启动子 |
| 3.4 比较BnaA03.WRKY28、BnWRKY33和BnWRKY33~(DD)的转录活性 |
| 3.4.1 BnaA03.WRKY28 促进BnWRKY33 的表达 |
| 3.4.2 蛋白修饰影响BnWRKY33 的转录活性 |
| 3.5 BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3 作用于BnWRKY33 的上游 |
| 3.5.1 BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3 受到核盘菌诱导表达 |
| 3.5.2 BnWRKY33与BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3 相互作用 |
| 3.5.3 BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3 参与油菜对核盘菌的防卫 |
| 3.6 BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3磷酸化激活BnWRKY33 |
| 3.6.1 体内双萤光素酶报告分析 |
| 3.6.2 体外磷酸化检测 |
| 3.7 BnA03.MKK4是BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3 的上游激酶 |
| 3.7.1 BnA03.MKK4 受到核盘菌诱导表达 |
| 3.7.2 BnA03.MKK4与BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3 相互作用 |
| 3.7.3 超表达BnA03.MKK4 增强甘蓝型油菜菌核病抗性 |
| 3.8 BnA09.VQ12与BnaA03.WRKY28 形成蛋白复合体 |
| 3.8.1 BnA09.VQ12 受到核盘菌诱导表达 |
| 3.8.2 BnA09.VQ12和BnaA03.WRKY28 相互作用 |
| 3.9 BnA09.VQ12 负调控甘蓝型油菜菌核病抗性 |
| 3.10 BnaA03.WRKY28和BnWRKY33 竞争结合BnWRKY33 启动子 |
| 3.10.1 油菜叶片抗病能力与基因表达的关系 |
| 3.10.2 BnWRKY33 在几种转基因材料中的表达情况 |
| 3.10.3 BnA09.VQ12 增强BnaA03.WRKY28对BnWRKY33 启动子的亲和力 |
| 3.11 BnaA03.WRKY28 参与甘蓝型油菜侧生分枝形成 |
| 3.11.1 BnaA03.WRKY28 超表达植株表现出分枝过多的表型 |
| 3.11.2 BnaA03.WRKY28 在叶腋处表达 |
| 3.11.3 BnaA03.WRKY28 调控分枝相关基因表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BnaA03.WRKY28和BnWRKY33 的作用机制 |
| 4.2 生长与防御的trade-off |
| 4.2.1 抗病是一个代价高昂的生理反应 |
| 4.2.2 能量分配与资源制约是trade-off的主要原因之一 |
| 4.3 BnWRKY33和BnaA03.WRKY28 精细调控油菜菌核病抗性和生长 |
| 4.3.1 磷酸化激活触发 BnWRKY33 的转录爆发、菌核病抗性爆发 |
| 4.3.2 BnaA03.WRKY28 的抗病“刹车”效应 |
| 4.4 VQ蛋白作为WRKY转录因子的辅助因子发挥作用 |
| 4.5 MAPK级联、WRKY33、WRKY28、VQ12 在油菜菌核病抗性中的生物学意义 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 本研究部分常用实验方法 |
| 附录Ⅱ 本实验所用引物 |
| 附录Ⅲ BnaA03.WRKY28 转基因各株系菌斑面积 |
| 附录Ⅳ RNA-seq和 ChIP-seq重叠基因中的转录因子列表 |
| 附录Ⅴ 用于绘制热图的基因列表 |
| 附录Ⅵ 作者简历及研究生阶段发表论文成果 |
| 致谢 |
（10）基于miRNA的芥菜SSR标记开发及miR397功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 miRNA的概述 |
| 1.1.1 miRNA的生物合成机制 |
| 1.1.2 miRNA的作用机制 |
| 1.2 SSR的研究进展 |
| 1.2.1 SSR分子标记及其特点 |
| 1.2.2 miRNA-SSR分子标记 |
| 1.2.3 SSR分子标记的在芥菜中的应用 |
| 1.3 miR397研究进展 |
| 1.3.1 miR397的靶基因 |
| 1.3.2 miR397在植物生长发育中的作用 |
| 1.3.3 miR397在非生物胁迫中的作用 |
| 1.3.4 miR397在生物胁迫中的作用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 1.5 研究方案 |
| 2 芥菜miRNA-SSR标记的开发 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.3 DNA提取 |
| 2.2.4 序列组装与筛选 |
| 2.2.5 芥菜miRNA-SSR的鉴定与分析 |
| 2.2.6 SSR引物设计及筛选验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 芥菜SSR位点的分布特点 |
| 2.3.2 芥菜miRNA-SSR与转录组SSR比较 |
| 2.3.3 芥菜SSR引物的有效性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 芥菜miR397的生物信息学分析与表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器和试剂 |
| 3.2.3 芥菜总RNA的提取 |
| 3.2.4 miR397序列获取 |
| 3.2.5 miR397的成熟序列和前体序列的保守性和进化分析 |
| 3.2.6 芥菜miR397的靶基因预测 |
| 3.2.7 实时荧光定量(qRT-PCR)表达量分析 |
| 3.2.8 芥菜miR397启动子顺式作用元件分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 miR397物种分布 |
| 3.3.2 miR397保守性和进化关系分析 |
| 3.3.3 芥菜miR397的靶基因预测 |
| 3.3.4 芥菜miR397表达水平分析 |
| 3.3.5 芥菜miR397启动子顺式作用元件分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 芥菜miR397靶基因LAC的全基因组鉴定与分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 芥菜LAC基因家族成员的鉴定 |
| 4.2.2 芥菜LAC基因家族的理化性质分析 |
| 4.2.3 芥菜LAC基因家族的进化分析 |
| 4.2.4 芥菜LAC基因家族的蛋白序列保守性分析 |
| 4.2.5 芥菜LAC基因结构和启动子区顺式作用元件分析 |
| 4.2.6 芥菜LAC基因家族成员受调控的miRNA预测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 芥菜LAC基因家族的鉴定 |
| 4.3.2 芥菜LAC基因家族的蛋白理化性质和亚细胞定位分析 |
| 4.3.3 芥菜LAC基因家族的染色体定位分析 |
| 4.3.4 芥菜LAC基因家族的进化分析 |
| 4.3.5 芥菜LAC基因家族的蛋白序列保守性分析 |
| 4.3.6 芥菜LAC基因结构和启动子区顺式作用元件分析 |
| 4.3.7 芥菜LAC基因家族成员受调控的miRNA预测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 芥菜miR397过表达载体的构建及转化拟南芥 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 仪器与试剂 |
| 5.2.3 芥菜基因组DNA提取 |
| 5.2.4 芥菜MIR397基因克隆 |
| 5.2.5 表达载体构建与农杆菌转化 |
| 5.2.6 花序浸染法转化拟南芥 |
| 5.2.7 转基因拟南芥的筛选与鉴定 |
| 5.2.8 转基因拟南芥植株表型分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 芥菜miR397过表达载体构建 |
| 5.3.2 转基因拟南芥阳性植株的鉴定 |
| 5.3.3 过表达miR397对拟南芥植株表型的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录 攻读学位期间的主要研究成果 |
| 致谢 |
四、通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株（论文参考文献）
- [1]甘蓝型油菜BnMYBL2启动子的克隆及功能研究[D]. 田港. 长江大学, 2021
- [2]甘蓝型油菜BnTT8基因组编辑载体的构建及其遗传转化[D]. 李刚. 长江大学, 2021
- [3]芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究[D]. 刘维妙. 浙江大学, 2021(01)
- [4]兴安落叶松同源异型盒基因LgKNOX2的表达特性和功能研究[D]. 李晓伦. 内蒙古大学, 2021(12)
- [5]拟南芥ABI5亚家族DPBF2、DPBF3、DPBF4、DPBF5及At5G42910基因的重组及其过表达转基因拟南芥的构建[D]. 王新文. 兰州理工大学, 2021(01)
- [6]马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究[D]. 朱熙. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [7]过表达油菜BrMAPK4拟南芥抗逆性研究[D]. 梁娟红. 西北师范大学, 2021(12)
- [8]新疆荒漠环境典型短命植物小鼠耳芥（Arabidopsis pumila）快速生长与耐逆性机制[D]. 金玉环. 石河子大学, 2021(01)
- [9]BnaA03.WRKY28和BnWRKY33参与油菜菌核病抗性的分子机理[D]. 张卡. 华中农业大学, 2021
- [10]基于miRNA的芥菜SSR标记开发及miR397功能的初步研究[D]. 袁慧. 中南林业科技大学, 2021(01)