一、迟缓爱德华氏菌的溶血特性（论文文献综述）
孙永灿[1]（2021）在《杀鱼爱德华氏菌fucR基因缺失株构建及其生物学特性分析》文中指出杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida,E.piscicida）是一种重要的水产动物病原菌,主要感染鱼类,严重威胁着水产养殖业的健康发展。研究证实多种细菌可以利用宿主肠道岩藻糖成分来调控其定植、致病性和代谢等多种生理功能,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）O157:H7可以通过岩藻糖操纵子来利用岩藻糖,但E.piscicida对岩藻糖的利用、岩藻糖及岩藻糖操纵子调控E.piscicida生物学特性的机制仍不明确。本研究在前期研究的基础上,解析E.piscicida中岩藻糖操纵子关键基因fucR的作用机理。本研究利用同源重组原理成功构建了E.piscicida岩藻糖操纵子关键基因fucR的缺失株ΔfucR,并与E.piscicida野毒株EIB202进行了一系列的比较分析。生长特性测定结果表明,L-岩藻糖能显着增加EIB202的生长速度,fucR基因缺失显着降低了EIB202利用岩藻糖的能力。半数致死量(LD50)测定结果表明,fucR基因的缺失降低了E.piscicida的致病性,EIB202的LD50值1.38×107CFU/fish,ΔfucR的LD50值为2.75×107CFU/fish。通过在含有岩藻糖和不含岩藻糖培养基中培养EIB202和ΔfucR,应用q PCR测定岩藻糖操纵子主要基因的转录水平,结合生长曲线结果分析发现,E.piscicida主要通过岩藻糖操纵子利用岩藻糖,fucR基因编码E.piscicida岩藻糖操纵子的激活子。但fucR基因的缺失并没有完全抑制E.piscicida利用岩藻糖,与在含有30m M L-岩藻糖LB液体培养基中培养相比,在不含岩藻糖的培养基中,ΔfucR的岩藻糖代谢基因fuc I和fuc O的转录水平无显着性差异（P＞0.05）,而fuc P、fuc A、0292（ETAE＿0292）、fuc K和fuc U的转录水平显着性上调（P＜0.05）,推测E.piscicida可能还具有其他利用岩藻糖的途径。前期研究表明,E.piscicida在含有30m M L-fucose的LB培养基中,其生长特性达到最佳状态,因此,我们测定了该浓度下E.piscicida野毒株EIB202和fucR基因缺失菌株ΔfucR的转录组。转录组数据结果表明,与EIB202相比,ΔfucR的Ⅳ型分泌系统、四环素抗性、转座酶和脂多糖合成相关基因的转录水平均显着下调。进一步通过在含有岩藻糖和不含岩藻糖培养基中培养EIB202和ΔfucR,应用q PCR分析发现,岩藻糖上调E.piscicida的Ⅳ型分泌系统、四环素抗性、脂多糖和转座酶基因的转录水平（P<0.01）,而fucR基因本身可以上调E.piscicida的Ⅳ型分泌系统、四环素抗性和脂多糖合成相关基因的转录水平（P<0.01）,并通过控制岩藻糖的利用来上调转座酶基因的转录水平（P>0.05）。细菌粘附和定植能力是细菌致病力的重要指标,我们测定了EIB202和ΔfucR在罗非鱼肠道中的定植载量。6h时ΔfucR在罗非鱼肠道中定植量显着低于EIB202（P＜0.05）;12h时,定植总数与EIB202无显着性差异（P>0.05）;并且在24h以后ΔfucR的定植量迅速降低;72h以后肠道中检测不到ΔfucR,而EIB202直到1周时才检测不到。感染定植结果表明,岩藻糖具有增强E.piscicida在罗非鱼肠道定植的作用。鱼类细胞因子具有抗病原菌感染的作用,我们用EIB202和ΔfucR感染罗非鱼（EIB202组和ΔfucR组）,测定了白介素-1β（IL-1β）、干扰素-γ（INF-γ）、凝集素（lectin）和趋化因子（CXC）基因的转录水平。结果显示,两个试验组细胞因子转录水平均在6h～36h之间达到最高,而ΔfucR组的细胞因子比EIB202组转录水平降低更快,说明fucR基因缺失以后,改变了E.piscicida对罗非鱼细胞因子的诱导能力,可能与其定植能力和LPS合成能力改变有关。总之,E.piscicida中fucR基因编码其岩藻糖操纵子的激活子,可以促进其Ⅳ型分泌系统、四环素抗性和脂多糖的合成,并通过影响岩藻糖的利用进一步促进其转座酶的合成,岩藻糖本身对E.piscicidaⅣ型分泌系统、四环素抗性、脂多糖和转座酶的合成有显着的促进作用,可能会进一步促进耐药基因的转移。本试验初步研究了E.piscicida fucR基因的功能,为细菌耐药基因传播探明新的途径,为E.piscicida致病机制和研发爱德华氏菌病的防控技术提供了新的思路和理论,具有重要研究意义。
马东梅[2]（2021）在《Ⅱ型TA系统yefM-yoeB在杀鱼爱德华氏菌抗逆性和致病性中的作用》文中提出杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）是威胁全球水产养殖行业的主要病原体之一,可感染牙鲆、大菱鲆和罗非鱼等多种海水及淡水动物,严重制约了水产养殖业的健康发展,它已被认为是研究感染胞内病原菌的模型生物。Ⅱ型毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin,TA）系统在参与细菌病原体适应环境压力、感染宿主的过程中起着重要作用,它可以帮助病原菌提高其致病力。目前Ⅱ型TA系统在多种临床病原菌中被广泛研究,但是有关杀鱼爱德华氏菌Ⅱ型TA系统的研究报道比较少见。在本研究中,我们通过生物信息学分析及共转录分析,确定了杀鱼爱德华氏菌的yefM-yoeB属于Ⅱ型TA系统,其中yefM是抗毒素基因,yoeB是毒素基因。通过构建yoeB和yefM-yoeB基因框内缺失突变株TX01ΔyoeB和TX01ΔyefM-yoeB及yefM-yoeB的回补株TX01ΔyefM-yoeBC,研究了yoeB和yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌在H2O2、高温及血清中存活能力的影响。试验结果表明,在H2O2中野生株TX01的存活率为78.30%,而TX01ΔyefM-yoeB的存活率仅为30.31%,显着低于野生菌株,而TX01ΔyoeB的存活率为87.56%,与TX01无明显区别;与野生株TX01相比,TX01ΔyefM-yoeB的耐高温能力及抗血清杀伤能力显着增强,其在血清中不仅没有被杀死反而增长了20%,而TX01ΔyoeB的存活率为77.52%,无显着差异;回补株TX01ΔyefM-yoeBC在H2O2、高温及血清中的存活率与野生株TX01无明显差异。上述结果初步证实了yefM-yoeB与杀鱼爱德华氏菌的抗逆性有关。通过检测TX01、TX01ΔyoeB、TX01ΔyefM-yoeB和TX01ΔyefM-yoeBC的生物被膜形成能力、罗非鱼体内感染试验及体外细胞感染试验,研究了yoeB和yefM-yoeB在杀鱼爱德华氏菌致病性中的作用。试验表明,TX01ΔyefM-yoeB的生物被膜的形成能力显着强于TX01;体外感染试验表明,yefM-yoeB的失活显着增强细菌对宿主FG细胞的粘附能力;通过侵染罗非鱼进行鱼体内细菌传播和毒力分析试验发现,与野生株TX01相比,TX01ΔyefM-yoeB感染的鱼脾脏中细菌数升高,感染TX01ΔyefM-yoeB的罗非鱼死亡率为100%,致死率明显增强;而TX01ΔyoeB感染的鱼脾脏中的细菌数无明显变化,且感染20d后存活率为20%与TX01无明显变化;回补株TX01ΔyefM-yoeBC无论是在体内还是体外感染试验中,均与野生株TX01无明显差异。试验结果证实了yefM-yoeB在杀鱼爱德华氏菌致病性中的作用。通过β-半乳糖苷酶活性试验及EMSA试验,分析了yefM-yoeB自身启动子P345与yefM-yoeB的关系。结果显示,DH5α/p SCP345/p T的活性值为2197.07 Miller Units,与其相比,DH5α/p SCP345/p TYefM的活性值无显着差异,为2080.47 Miller Units,而DH5α/p SCP345/p TYefM-YoeB的活性值显着降低,仅为8.28 Miller Units;EMSA试验表明,YefM蛋白可以直接与yefM-yoeB启动子P345结合。试验结果证实了YefM蛋白可直接结合到自身启动子P345上,并且抑制了启动子P345的活性,而YoeB蛋白同YefM蛋白的结合加强了YefM蛋白对启动子P345的抑制作用。综上所述,本研究揭示了杀鱼爱德华氏菌的yefM-yoeB是Ⅱ型TA系统,是该菌抗逆性和致病性的重要参与者,这将有助于进一步阐明该菌对鱼类的致病机制,为杀鱼爱德华氏菌病的防治提供新方法和新思路。
李昊轩[3]（2021）在《传染性脾肾坏死病毒和鲶爱德华氏菌重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的建立与应用》文中研究表明鳜（Siniperca chuatsi）和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）是两种重要的淡水养殖鱼类,具有优异的肉质和极高的经济价值,在我国具有比较大的养殖规模。近年来,随着集约化养殖的迅速发展,传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）和鲶爱德华氏菌导致的传染病不断爆发,给我国的鳜和黄颡鱼养殖业造成了严重的经济损失。为了有效地控制这两种传染病的暴发和传播,快速、灵敏地检测ISKNV和鲶爱德华氏菌至关重要。因此,我们希望建立一种能够在现场检测ISKNV和鲶爱德华氏菌的快速检测方法。在本研究中,我们将RPA技术应用于ISKNV和鲶爱德华氏菌的检测,建立了ISKNV和鲶爱德华氏菌的RPA快速检测方法,从而实现对两种病原的早期诊断,有效地控制这两种传染病的暴发和传播。本研究分为ISKNV RPA快速检测方法的建立和鲶爱德华氏菌RPA快速检测方法的建立两个部分。1、ISKNV RPA快速检测方法的建立。我们针对ISKNV的MCP和ORF007基因,设计了6组RPA引物,其中引物MCPF181/MCPR182和007F197/007R198被选为最适引物,用于后续的ISKNV RPA检测。然后我们对建立的ISKNV RPA和RPA-LFD检测方法的反应条件进行优化,发现38°C为ISKNV RPA和RPA-LFD方法的最适反应温度,30 min为ISKNV RPA和RPA-LFD方法的最适反应时间,并将该条件用于后续的ISKNV RPA和RPA-LFD检测试验。我们以不同病原的核酸样品作为模板,用ISKNV RPA和RPA-LFD方法进行检测,发现只有ISKNV的DNA检测为阳性。我们以梯度稀释的质粒作为模板,用ISKNV RPA和RPA-LFD方法进行检测,发现ISKNV RPA和RPA-LFD方法的最低检测限都为102 copies/μl,比PCR方法的最低检测限低10倍。我们以鳜的临床样品DNA作为模板,用RPA、RPA-LFD和PCR方法进行检测,发现ISKNV RPA和RPA-LFD方法对临床样品检测出的阳性率与PCR方法相同。总之,我们建立的ISKNV RPA和RPA-LFD检测方法只需在38°C条件下反应30 min就可以完成检测,而且具有高度的特异性,灵敏性也比PCR方法高10倍,还可以达到和PCR一样的临床样品检测效果。2、鲶爱德华氏菌RPA快速检测方法的建立。我们针对鲶爱德华氏菌的serC基因,设计了9种RPA引物组合,其中引物serCF564/serCR569的扩增效果最好,被选为最适引物,用于后续的鲶爱德华氏菌RPA检测。然后我们对建立的鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD检测方法的反应条件进行优化,发现38°C为鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD方法的最适反应温度,30min为鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD方法的最适反应时间,并将该条件用于后续的鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD检测试验。我们以不同病原的核酸样品作为模板,用鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法进行检测,发现只有鲶爱德华氏菌的DNA检测为阳性。我们以梯度稀释的质粒和基因组DNA作为模板,用鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法进行检测,发现鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法对质粒的最低检出浓度都为102 copies/μl,对基因组DNA的最低检出浓度都为1 pg/μl。我们以黄颡鱼的临床样品DNA作为模板,用RPA、RPA-LFD、实时RPA和PCR方法进行检测,发现鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA方法对临床样品检测出的阳性率与PCR方法相同。总之,我们建立的鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA检测方法只需在38°C条件下反应30 min就可以完成检测,而且灵敏性与q RT-PCR方法相同,比PCR方法高10倍,还具有高度的特异性,在临床样品检测方面,具有和PCR方法一样的实用性。本研究的结果表明,我们针对ISKNV和鲶爱德华氏菌开发的RPA相关检测方法很适用于ISKNV和鲶爱德华氏菌的快速检测,其中ISKNV和鲶爱德华氏菌的RPA-LFD检测方法因为操作简单,不需要复杂的仪器,所以在这两种病原的现场检测中具有很大的应用潜力。
王荻[4]（2021）在《虹鳟源鲁氏耶尔森菌主要生物学特性及减毒活疫苗研究》文中研究指明鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）是肠炎红嘴病（enteric redmouth diseases,ERM）的病原,主要感染鲑科鱼类并引起患病鱼体表出血、肠炎等临床症状。近年来,ERM在国内外养殖虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中均有大规模爆发,严重制约虹鳟养殖产业的绿色健康发展。抗菌药物的使用仍是防治ERM的主要手段之一,然而细菌多重耐药性和食品安全等问题使得药物的治疗效果和应用受到越来越多的限制,因此研究新型疫苗对预防该病发生具有重要意义。鲁氏耶尔森菌感染宿主范围和地理分布广泛,在我国已从西伯利亚鲟（Acipenser baerii）、黄颡（Pelteobagrus fulvidraco）、鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）等养殖鱼类中分离到该菌,而对虹鳟源鲁氏耶尔森菌的研究报道较少。鲁氏耶尔森菌的毒力受其生物被膜、温度及周围环境中的铁元素含量等多种因素影响,但其分泌的细胞外毒素——溶血素（hemolysin,yhl）仍是其最主要的致病因子之一。本研究旨在探索虹鳟源鲁氏耶尔森菌YR01株的生物学特性,建立q PCR分子检测技术用于临床快速诊断;构建动物感染模型,结合转录组测序结果,评价鲁氏耶尔森菌对虹鳟的致病性及虹鳟抗感染应答;针对鲁氏耶尔森菌的溶血素基因进行功能验证并构建基因突变株,评价其作为减毒活疫苗候选株的可行性,以期为ERM的免疫防控技术研究提供理论依据和指导。患病虹鳟来自青海省某冷水鱼养殖场,其临床症状表现为摄食及游泳行为异常,体色发黑,眼球外突,口腔及鳍基部出血;剖检可见血性腹水、肝脾肿大及严重肠炎。无菌条件下从患病鱼肝脏和脾脏取样划线培养获得一株优势菌株,命名为YR01。人工感染试验表明,YR01株对虹鳟幼鱼具有较强的致病性,致死率可高达90%,患病鱼临床症状与自然发病一致;经计算YR01株对虹鳟幼鱼的半致死浓度(LD50)约为6.5×107CFU/m L。组织病理观察表明,感染YR01株的虹鳟肝、脾、肾、肠等组织均出现不同程度的病变。YR01株为革兰阴性菌,在TSA平板上形成表面光滑、边缘整齐、微黏、稍微隆起的直径2 mm左右的乳白色菌落。透射电镜观察发现YR01株的每个细胞有6-8条周生鞭毛,大小约为0.7μm×（1.8-2.7）μm。经Biolog系统及16S r RNA基因序列比对分析,将YR01株鉴定为鲁氏耶尔森菌。为快速和定量检测鲁氏耶尔森菌,本研究根据rup A基因设计一对特异性引物YRI-F/R,建立了鲁氏耶尔森菌的q PCR检测方法。结果表明,所设计的引物特异性良好,可特异性扩增鲁氏耶尔森菌rup A基因;检测方法灵敏度较高,最低检测限为60 copy/μL。此外,本研究构建了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟的病理模型,通过腹腔注射方式对12 g左右的虹鳟幼鱼接种100μL浓度为2.0×107CFU/m L菌悬液可成功造模,该模型中供试虹鳟的临床症状明显且组内差距较小,病症发展时间及情况适中,更适用于后期致病机理研究。为探讨虹鳟和鲁氏耶尔森氏菌互作机制,本研究采用高通量测序技术测定了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟24 h后脾脏的转录组。结果显示,共获得147 927 000个读长序列,84.81%-85.99%的数据可与虹鳟参考基因组数据完全匹配。在鲁氏菌感染组共鉴定出2498个差异表达基因（DEGs）,其中有2083个（83.39%）基因呈上调表达趋势,415个（16.61%）基因呈下调表达趋势。GO注释表明,这些DEGs分别注释到23个生物学过程（BPs）、19个细胞组分（CCs）和16个分子功能（MFs）。KEGG分析结果表明,这些DEGs在NLR、TLR、RLR、细胞因子受体相互作用等多个信号通路中富集。进一步筛选到78个免疫应答相关的DEGs,其中74个上调表达DEGs主要分布于20条KEGG免疫相关通路中,富集DEGs最多的前三条通路分别为NLR信号通路（31个基因）、RLR信号通路（35个基因）和TLR信号通路（51个基因）。随机选取IL-1β、IL-8、TNF、NOD1、HSP90、CCR9、CARD9和TLR8a2等8个DEGs进行RT-q PCR验证,提示转录组测序与RT-q PCR结果基本一致,表明转录组分析可靠准确。为进一步探讨鲁氏耶尔森菌毒力因子溶血素yhl基因的特性,将yhl基因分段截短表达并验证原核表达产物对RTG-2细胞的毒性。结果表明,YR01株yhl基因四个片段的原核表达产物（yhl-A1/A2/A3/B）对细胞增殖均有一定抑制作用,其抑制率分别达到30.77%、26.92%、15.38%和53.84%。接种72 h后,yhl-B可诱导RTG-2细胞IL-2和IL-1β基因显着上调表达,分别为对照的7.6倍和4.2倍。接种yhl-A1/A2/A3的RTG-2细胞生长基本正常,未见明显病变;而接种yhl-B的RTG-2细胞出现变圆、脱落现象,在紧密生长的细胞中形成大量空斑,空斑边缘可见细胞互相牵连呈葡萄状。采用G-DOC和λRed同源重组系统敲除了YR01株的yhl-B基因,成功构建YR01-△yhl B突变株,进而分析其生物学特性和致病性。结果显示,YR01-△yhl B株的菌落形态、理化特性及生长特性与野生株相比无明显差异;药敏特性发生变化,YR01-△yhl B株对恩诺沙星、头孢哌酮、链霉素和红霉素的耐药性增强,而对卡那霉素、阿米卡星和呋喃妥因的敏感性增强。YR01株全菌悬液接种RTG-2细胞引起的病变程度明显高于YR01-△yhl B株;两株菌的培养上清对RTG-2细胞无明显毒性,但可引起细胞中免疫相关基因IL-β的上调表达。靶动物毒性评估结果表明,YR01株和YR01-△yhl B株对虹鳟幼鱼均有一定毒性,且YR01株毒性远高于YR01-△yhl B株;突变株和野生株均可引起受试虹鳟脾脏内免疫相关基因的上调表达。以YR01-△yhl B株腹腔注射免疫虹鳟幼鱼28 d后,其对虹鳟的相对保护率（RPS）约为66.7%。本研究通过对虹鳟源鲁氏耶尔森菌YR01株的病原学分析,确定了菌株基本生物学特性;建立的q PCR快速检测技术为临床快速诊断提供依据;构建了虹鳟ERM病理模型,鉴定到多个参与虹鳟抵御鲁氏耶尔森菌感染的差异表达基因;构建了YR01-△yhl B突变株,注射免疫可诱导虹鳟产生较好的免疫应答,对虹鳟幼鱼具有一定的免疫保护作用。研究结果对于虹鳟ERM的免疫防控技术研发具有重要意义。
刘少杰[5]（2021）在《秦皇岛地区狐源大肠杆菌分离鉴定与胞外产物免疫原性研究》文中指出大肠埃希氏菌（Escherichia coli,E.coli）给狐狸养殖业带来严重损失,临床上除了使用抗生素治疗E.coli病之外,疫苗也是防控E.coli病的有效途径。本研究分离鉴定出狐源致病性E.coli,以CHL-147菌株为试验菌株,对其胞外产物（Extracellular products,ECP）提取纯化。对ECP的酶活性、致病性、免疫原性检测并分析、鉴定其蛋白成分。为发掘新的E.coli潜在亚单位疫苗提供参考数据。本试验在毛皮动物养殖场采集的165份样本中,通过实验室常规方法,分离鉴定出47株狐源大肠杆菌,检出率为28.5%,其中36株菌具有致病性。通过玻板凝集试验,36株致病性E.coli检测出7种不同的血清型。O1和O78型为本地区的优势血清型。采用饱和硫酸铵沉淀法对E.coli CHL-147株的ECP进行提取并纯化,使用平板扩散法对ECP的酶活性进行初步见检测,结果表明E.coli CHL-147株ECP具有蛋白酶活性和溶血素活性;使用SDS-PAGE凝胶电泳对ECP的蛋白成分进行初步鉴定,SDS-PAGE图谱显示ECP的蛋白主要分布在180 k Da和110 k Da处;使用小鼠对其腹腔注射ECP检测ECP的致病性,结果显示E.coli CHL-147株ECP具有很弱的致病性,但ECP与CHL-147株共同感染小鼠时可使CHL-147株的半数致死量从1.01×107 CFU下降到7.08×105 CFU。将E.coli CHL-147株ECP对小鼠进行免疫,结果发现免疫ECP能够激发小鼠的体液免疫系统,使小鼠抗体水平升高;但不能激发细胞免疫系统。免疫后对小鼠进行CHL-147株攻菌,结果显示免疫过的小鼠对该菌株具有较好的抵抗力,保护率为60%。利用LC-MSMS方法对ECP中的蛋白进行分析,共检出852种蛋白,具有广泛的生物学功能。参与抗生素的合成、氨基酸的合成以及碳代谢等多种信号通路。结论:36株致病性狐源E.coli中以O1和O78血清型为主。CHL-147菌株ECP具有溶血素和蛋白酶活性,可降低CHL-147菌株的半数致死量;ECP含有852种蛋白成分,免疫小鼠可激发小鼠体液免疫系统,具有良好免疫保护效果。
陈皓祥[6]（2021）在《花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究》文中指出花鲈（Lateolabrax maculatus）是我国海水捕捞的重要对象之一,也是第二大海水养殖鱼种。但是海鲈病害频繁发生且日趋严重,给海鲈养殖产业造成极大的经济损失,严重制约了海鲈养殖业的发展。根据本课题组的流行病学调查;哈维弧菌（Vibrio harveyi）是海水花鲈养殖产业中最主要的病原菌之一。为防治花鲈哈维弧菌病。本课题组决定进行花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的实验室研制。1.本实验从实验室菌库中挑选出21株不同分子分型的哈维弧菌,并对21株哈维弧菌进行初筛,再从筛选出的菌株中进行复筛,最终筛选出疫苗菌株和备用菌株。最后检测疫苗菌株间的交叉保护效果。实验结果显示:从21株哈维弧菌中筛选出2株强毒株5#和16#作为疫苗制备菌株,1株次强毒株3#作为备用菌株;疫苗菌株间的交叉保护效果差,需要制备二价疫苗。2.对菌株的生物学性状及生长特性进行研究。绘制了菌株的生长曲线;利用单因素实验方法对温度、盐度、pH值以及培养基进行了筛选,同时利用正交实验的方法比较了温度、盐度、pH值对哈维弧菌生长的影响;最后测定菌株的半致死浓度。实验结果显示:菌株接种16h后即可进入平台期,菌液吸光度与菌液浓度的线性关系良好;在培养基为营养肉汤培养基,pH值为7,盐度为3%,培养温度28℃时,哈维弧菌生长情况最好,其中盐度对生长的影响最大,其次是温度,pH值的影响最小;在培养基筛选试验中,2216E培养基中菌株生长效果更好。3#、5#、16#菌株的半致死浓度分别是3.09×105CFU/g、4.04×105CFU/g、4.02×105CFU/g。3.研究了疫苗的安全性及免疫效力,确定最佳灭活条件;检测疫苗对鱼苗的安全性;研究疫苗对花鲈生长的影响;确定最小免疫剂量;测试疫苗的免疫保护期与相对保护率和受免鱼的血清抗体效价。结果显示:最佳灭活条件为甲醛终浓度0.4%、灭活时间24h、温度28℃、摇床转速200rmp。接种疫苗对花鲈安全,且不会影响花鲈的生长。疫苗浓度为9.6×107 CFU/g时,对花鲈的相对保护率最高。当疫苗最终注射剂量为4.78×107CFU/g时,第1周的相对保护率仅为21.4%,并在第2周对花鲈的相对保护率提升到了43.7%,从第7周开始,相对保护率超过50%,并且可以一直持续到第13周。即在第2周后的整个实验周期中,疫苗都可以为花鲈提供较好的相对保护效果,保护期为11周。免疫组血清抗体效价在第1周最低,为1:32～1:64,但已经和空白组、对照组差异显着;第2周快速上升,之后趋于平缓,但仍会处于一个较高的水平,此过程中血清抗体滴度最高可达1:2048,同时空白组和对照组的血清抗体效价一直比较稳定,处于1:8～1:32。综上所述,本实验为花鲈哈维弧菌甲醛灭活二价疫苗的后续研究提供了基础。
于交平[7]（2021）在《加州鲈源腐皮镰刀菌的分离鉴定、防控及其感染鱼后的转录组分析》文中认为加州鲈（Micropterus salmoides）肉质嫩,生长快,适应广,是我国重要的养殖品种之一。而病害成为制约其产业发展的因素之一。镰刀菌（Fusarium）分布广泛,能侵染各种植物、人类和水产动物等。鱼类在体表损伤或处于不良养殖环境时,容易感染镰刀菌,发病迅速,致死率较高,造成重大的经济损失,目前尚无有效的防治方法。因此,有必要开展镰刀菌病的研究。2019年7月,某循环水室饲养的加州鲈头部、胸鳍、背鳍、尾鳍出现充血发炎,随后逐渐溃烂,并附有白色丝状物,出现死亡现象。鉴此,本论文从加州鲈患病部位分离纯化到一株致病性腐皮镰刀菌,研究了其生物学特性和防治方法,同时对加州鲈感染镰刀菌前后的脾脏组织进行转录组测序,主要研究结果如下:1.从加州鲈患病处分离得到一株优势菌MY1,人工感染确定是致病菌,半数致死量(LD50)为1.03×104个/m L。通过形态特征和r DNA-ITS序列分析,鉴定MY1为腐皮镰刀菌（F.solani）。2.腐皮镰刀菌在10℃～35℃和p H=4.32～11.44时可生长,最适温度为25℃～30℃,最适p H 7.85。Na Cl≥10%时,不生长。最适生长培养基为PDA;最适碳源为乳糖;最适氮源为硝酸钠。光照对生长无显着影响。在10℃～35℃、p H=4.32～11.44时可产孢,最适温度25℃,最适p H 7.85。Na Cl≥8%时,不产孢。产孢最适培养基为PDA;最适碳源为淀粉和D-果糖;最适氮源为蛋白胨。光照利于产孢。3.腐皮镰刀菌菌丝对益康唑、大蒜和甲霜灵敏感,MIC值分别为4μg/m L、0.1 g/m L、25 mg/L;孢子对两性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素和甲霜灵敏感,MIC分别为8、16、8、32 ug/m L和50 mg/L。4.从加州鲈体表和养殖水中共分离到42株细菌,以腐皮镰刀菌MY1为指示菌,筛选出1株拮抗菌JK10。结合形态、生化特征和16S r RNA序列分析,确定JK10为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对氨曲南等9种抗生素耐药。JK10具安全性,且拮抗活性可稳定遗传给下一代。5.通过单因素试验和正交试验,确定菌JK10的最佳发酵条件:温度30℃,p H值8,转速180 r/min,接种量0.5%,装液量50 m L;最佳培养基组分为14 g/L乳糖,7 g/L酵母粉,10 g/L氯化钾。与优化前相比,对数末期提前2 h,OD600nm值为之前的1.15倍,抑菌率提高了9.5%。6.枯草芽孢杆菌JK10产蛋白酶、淀粉酶和挥发性物质,对腐皮镰刀菌的生长有一定的抑制作用。抑菌物质主要存在于沉淀物中,对热、酸碱和紫外线有较好的耐受性,适宜常温储存。7.对加州鲈感染镰刀菌前后的脾脏组织进行转录组分析,获得43.72 Gb clean reads,检测到表达的unigene 89458条,差异表达基因2195个,其中上调1519个,下调676个。GO条目分析,差异基因主要涉及小分子代谢、免疫过程、酮酸代谢过程等。差异基因KEGG通路富集到类风湿性关节炎、NF-k B信号通路、细胞因子受体相互作用等。另外,对随机筛选7个免疫基因进行q RT-PCR验证,表达趋势与RNA-seq一致,证实了转录组数据的可靠性。不仅丰富了加州鲈数据库,也为研究镰刀菌致病和免疫机制提供参考信息。本文研究了病原菌的生物学特性和防治方法,同时对感染腐皮镰刀菌前后的脾脏组织进行了转录组分析,为病害的防治提供了依据,也为加州鲈抗真菌感染的免疫机制研究奠定了基础。
刘锐[8]（2021）在《粘质沙雷氏菌Cpx双组分调控系统缺失菌株的构建及对生物学特性影响的研究》文中认为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌,属于肠杆菌科沙雷氏菌属。粘质沙雷氏菌是部分脊椎动物和无脊椎动物的条件致病菌,可导致家蚕、奶牛、中华鳖等患病,更成为临床上感染越来越频繁的病原菌,可造成呼吸道感染、伤口感染、败血症等,逐渐成为医院的严重威胁。在蚕桑业中,粘质沙雷氏菌是家蚕的主要致病菌之一,感染家蚕后造成患败血症,在较短时间内可导致家蚕死亡,给蚕桑业带来了巨大的经济损失。不少研究显示Cpx AR双组分系统广泛存在于多种致病菌中,在细菌的致病性、生物膜的形成、耐药性等多方面发挥着重要的调控作用,但在粘质沙雷氏菌中鲜有报道,其功能尚不清楚。本文通过构建粘质沙雷氏菌SCQ1的cpx A、cpx R、cpx AR基因缺失菌株,并对基因敲除菌株进行相关生物学特性检测,研究Cpx AR双组分系统在粘质沙雷氏菌SCQ1中的调控功能,帮助我们进一步了解粘质沙雷氏菌的致病机制。主要研究结果如下:1.构建目标基因缺失菌株和回补菌株,利用同源重组置换策略构建缺失菌株。通过PCR以及基因测序筛选验证,成功获得了基因缺失菌株Δcpx A、Δcpx R、Δcpx AR及其回补菌株CΔcpx A、CΔcpx R、CΔcpx AR。2.根据相关生物学特性分析显示,与野生株SCQ1相比,单敲菌株Δcpx A的菌落形态、生长、蛋白酶以及卵磷脂酶水解活性、运动性、应激耐受性、抗生素耐受性、溶血活性均无明显变化,Δcpx A的菌膜形成能力在培养72 h之前,较SCQ1无显着差异,但在96 h时显着弱于SCQ1;单敲菌株Δcpx R的卵磷脂酶水解活性,蛋白酶水解活性,溶血活性,应激耐受性与SCQ1相比没有显着变化。当培养12 h时,Δcpx R菌落呈粉色,当培养至36 h时呈红色,与野生株表型基本一致,其生长速率略低于SCQ1,但最终细胞密度与野生型无差别。SCQ1泳动圈面积和群集运动圈面积分别是Δcpx R的2.04倍和1.375倍,Δcpx R的运动能力明显减弱。Δcpx R的生物膜形成能力明显弱于SCQ1。抗生素耐受性试验结果显示Δcpx R较SCQ1,头孢霉素、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星MIC值分别都升高了16倍、8倍、4倍、8倍,其他抗生素抗性均与SCQ1保持一致。3.双敲菌株Δcpx AR的生长速率明显低于野生菌株SCQ1,生长受到显着抑制。随着培养时间的延长,菌落由白色逐渐变为浅粉色。Δcpx AR的运动能力丧失,不表现溶血活性。Δcpx AR的蛋白酶水解能力,卵磷脂酶水解能力,生物膜形成能力明显减弱。Δcpx AR对5%KCl和0.05%SDS的耐受性无明显变化,对1%H2O2的耐受性减弱。抗生素耐受性结果表明,Δcpx AR与SCQ1相比,头孢霉素、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星MIC值分别增大了8倍、4倍、8倍、16倍,2倍,2倍,阿奇霉素、氯霉素MIC值降低了16倍,4倍。4.毒力试验结果显示,Δcpx A和Δcpx R对家蚕的致病性较野生株相似,而Δcpx AR的LD50是SCQ1的8.92倍,表明Δcpx AR对家蚕的致病性明显减弱。通过q RT-PCR检测了12个相关毒力基因的转录水平,结果显示,与野生株SCQ1相比,在Δcpx A和Δcpx R中shl A、Pho P、Pho Q均有明显上调,在Δcpx A中hfq与SCQ1相比,表达量明显降低,在Δcpx A以及Δcpx R中其他基因均有一定程度的上调或下调表达,但均无显着变化。shl B在缺失菌株Δcpx A、Δcpx R、Δcpx AR中几乎没有表达。与SCQ1相比较,在Δcpx AR中shl A有一定量的上调,Flh C、Flh D、hfq、Pho P、Pho Q、wec A均有显着性降低。初步结果显示,在突变株中部分毒力相关基因的转录水平有一定变化,这些变化是否由Cpx双组分系统调控还有待进一步深入研究。综上所述,在粘质沙雷氏菌SCQ1的Cpx AR双组分系统中,双基因敲除株Δcpx AR对粘质沙雷氏菌的生长、产胞外酶、运动性、应激耐受、生物被膜形成、耐药性和致病性的影响显着大于单基因敲除株Δcpx R及Δcpx A。
王壮[9]（2020）在《斑马鱼细胞焦亡介导脓毒症急性肾损伤的分子机制》文中提出脓毒症（Sepsis）是临床上一种高发病率、高致死率的重症疾病,其主要病因是病原感染等因素导致宿主机体免疫调节失控,产生过度的免疫应答和强烈的炎症反应,从而引起组织损伤和器官功能紊乱甚至衰竭,最终导致机体死亡。急性肾损伤是脓毒症发生过程中一种常见的器官损伤并发症,被称为脓毒症急性肾损伤（Septic-acute kidney injury,S-AKI）。相比于非脓毒症急性肾损伤,脓毒症急性肾损伤具有发病快、肾脏损伤程度高等特点。目前,临床上对于脓毒症发生及其并发的多器官损伤研究仍然存在大量的空白。因此,建立有效的活体感染模型,解析脓毒症急性肾损伤发生分子机制,将对该疾病的临床治疗提供理论指导。细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是一种重要的内毒素成分,也是引发脓毒症的主要元凶之一。近年来研究发现,宿主细胞内的炎症性胱天蛋白酶（Caspase）能够识别LPS,并激活下游的级联信号通路导致细胞焦亡（Pyroptosis）,介导炎症反应以清除病原。虽然细胞焦亡是宿主免疫调节和控制感染的重要信号,但是,一旦细胞焦亡被过度激活,则会引发宿主免疫疾病,导致器官衰竭甚至死亡。而细胞焦亡信号是否在调控脓毒症急性肾损伤过程中发挥功能仍然有待解析。基于上述科学问题,本论文首先以致死剂量LPS浸泡感染斑马鱼幼鱼为模型,确定了幼鱼心包腔水肿和尾鳍溃烂等病理表型作为斑马鱼脓毒症发生指标。然后,通过基于CRISPR/Cas9原理的快速基因敲除技术（Crispants）对Go代斑马鱼幼鱼炎症小体相关基因进行敲除,筛选参与调控脓毒症发生的关键信号分子。通过表型分析发现,相对于野生型、caspy-/-、pycard-/-、casp3a-/-和gsdmea-/-幼鱼而言,caspy2-/-和gsdmeb-幼鱼的心包腔水肿和尾鳍溃烂等脓毒症病理表型明显缓解,并且其感染后的死亡率显着下降。同时,由于在之前的研究中已经证明斑马鱼非经典炎症小体caspy2/GSDMEb能够诱导细胞焦亡,因此上述结果表明细胞焦亡信号分子可能在斑马鱼脓毒症发生过程中发挥重要作用。为了进一步明确细胞焦亡信号调控斑马鱼脓毒症发生的分子机制,本论文建立了斑马鱼幼鱼活体PI染色模型,发现在LPS诱导鱼体脓毒症发生后,野生型斑马鱼幼鱼的近端肾小管区域出现了明显的阳性荧光信号,而在caspy2-/-和gsdmeb-/-幼鱼中则没有出现该现象。同时,通过近端肾小管细胞荧光标记的转基因斑马鱼进行实验,发现野生型幼鱼中出现了荧光弥散、小管结构不完整的表型,而在caspy2-/-和gsdmeb-/-幼鱼中这种现象得到了明显的缓解。该结果证明在LPS诱导的斑马鱼脓毒症发生过程中,非经典炎症小体caspy2/GSDMEb信号通路是介导近端肾小管细胞焦亡的关键。本论文还通过Crispants技术对免疫细胞标记荧光的转基因幼鱼中相关基因进行敲除,结果发现在感染后的野生型斑马鱼中近端肾小管处表现出明显的中性粒细胞招募现象,在caspy2-/-和gsdmeb-/-幼鱼中则没有观察到明显的招募,该结果初步表明细胞焦亡信号导致斑马鱼幼鱼近端肾小管出现了损伤效应,从而招募中性粒细胞到达损伤部位。为了进一步探索细胞焦亡信号与脓毒症急性肾损伤发生的关系,本论文对LPS感染后的幼鱼进行组织病理学分析。研究发现在野生型斑马鱼幼鱼中,近端肾小管出现明显空腔化,并伴随炎症浸润现象发生。同时,通过扫描电镜观察发现近端肾小管刷状缘上皮细胞明显脱落。另外,研究发现表征急性肾损伤发生的关键分子标志（包括kim-1,timp-2和igfbp7等基因）的表达显着上调。然而,在caspy2-/-和gsdmeb-/-幼鱼中,上述急性肾损伤相关病理指标均得到了明显缓解。表明在LPS诱导斑马鱼脓毒症发生过程中,非经典炎症小体调控的细胞焦亡信号是诱发脓毒症急性肾损伤的关键。据此,本论文基于caspy2/GSDMEb信号通路的相互作用靶点设计了竞争性肽抑制剂Ac-FEID-CMK,发现该抑制剂处理斑马鱼幼鱼后,可显着降低LPS感染导致的鱼体死亡,同时急性肾损伤相关病理指标也得到了明显缓解。上述研究结果证明了细胞焦亡信号通路在诱导脓毒症发生过程中扮演的重要角色,为该疾病临床治疗分子靶点寻找提供了理论依据。在斑马鱼脓毒症模型研究的基础上,本论文进一步依托小鼠模型进行了验证性实验,结果发现Casp11-/-和GSDMD-/-小鼠对于致死剂量LPS诱导的脓毒症具有明显缓解,血清中炎症因子和警报素（包括IL-1β,IL-18,TNF-α,HMGB1和LDH等）和急性肾损伤分子标志物（包括BUN,CK和NGAL）的表达量也显着低于野生型小鼠。同时,通过组织病理分析发现,caspase-11或GSDMD基因缺失能够有效缓解肾小管的病变。该结果进一步证实非经典炎症小体介导的细胞焦亡信号通路是诱导脓毒症急性肾损伤发生的关键,同时,也验证了本论文建立的斑马鱼脓毒症急性肾损伤发生与检测模型,为临床治疗脓毒症器官损伤靶向药物的筛选提供了新模型。最后,为了探索细菌感染导致的脓毒症及器官损伤的情况,本论文使用能够引起鱼类败血症的杀鱼爱德华氏菌浸泡感染斑马鱼幼鱼,结果发现该模型虽不能有效诱导脓毒症,但是在细菌定殖部位中性粒细胞发生明显招募,而在感染后期数量显着减少。另外,缺失中性粒细胞的幼鱼在细菌感染后存活率显着降低,细菌定殖数量明显增加。上述研究结果揭示了斑马鱼中性粒细胞在细菌感染过程中的免疫应答规律及其抗感染的重要功能,为后续深入研究细菌感染诱导宿主脓毒症发生的模型选择和分子机制奠定基础。综上所述,本论文成功建立了 LPS感染诱导斑马鱼幼鱼脓毒症发生模型,阐明了细胞焦亡信号在调控脓毒症急性肾损伤发生中的分子机制。同时,该研究成果发展了脓毒症研究活体模型,为临床筛选治疗脓毒症药物的靶点提供了理论基础和研究平台。
黄华,张建柏,徐晓莹,王鹤,王力勇,高雁,段钰[10]（2021）在《养殖大菱鲆细菌性腹水病及其防治方法研究进展》文中提出大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我国北方沿海地区重要的养殖经济鱼类,在北方沿海区域经济的快速发展中发挥了重要作用。但随着养殖的规模化和集约化发展,大菱鲆病害问题已成为产业可持续发展的主要瓶颈之一。文章综述了大菱鲆腹水病的临床症状、病原菌和致病条件,并结合养殖现状,提出在实际生产中采取免疫接种等综合预防措施、一旦发病选择西医结合的方法进行对症治疗的建议,可为大菱鲆腹水病的流行病学研究、疾病发生预警以及防治提供参考。
二、迟缓爱德华氏菌的溶血特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、迟缓爱德华氏菌的溶血特性（论文提纲范文）
（1）杀鱼爱德华氏菌fucR基因缺失株构建及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 爱德华氏菌的研究进展 |
| 1.1.1 爱德华氏菌的分类学 |
| 1.1.2 杀鱼爱德华氏菌的理化特性 |
| 1.1.3 杀鱼爱德华氏菌危害 |
| 1.2 杀鱼爱德华氏菌的毒力因子 |
| 1.2.1 Ⅲ型分泌系统 |
| 1.2.2 Ⅵ型分泌系统 |
| 1.2.3 Ⅳ型分泌系统 |
| 1.2.4 脂多糖 |
| 1.2.5 杀鱼爱德华氏菌其他的毒力因子 |
| 1.3 插入序列 |
| 1.4 鱼类免疫系统 |
| 1.4.1 鱼类免疫器官 |
| 1.4.2 鱼类免疫细胞 |
| 1.4.3 鱼类细胞因子 |
| 1.5 岩藻糖对细菌的影响 |
| 1.6 基因敲除技术 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 试验所用溶液及其配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌种复苏 |
| 2.2.2 杀鱼爱德华氏菌16S rRNA鉴定 |
| 2.2.3 fucR基因缺失菌株的构建 |
| 2.2.4 生长曲线测定 |
| 2.2.5 罗非鱼半数致死量(LD_(50))测定 |
| 2.2.6 岩藻糖对杀鱼爱德华氏菌中岩藻糖操纵子的影响 |
| 2.2.7 fucR基因在岩藻糖操纵子中的作用 |
| 2.2.8 转录组测序 |
| 2.2.9 岩藻糖和fucR基因对杀鱼爱德华氏菌Ⅳ型分泌系统的影响 |
| 2.2.10 岩藻糖和fucR基因对杀鱼爱德华氏菌四环素抗性的影响 |
| 2.2.11 岩藻糖和fucR基因对杀鱼爱德华氏菌转座酶的影响 |
| 2.2.12 岩藻糖和fucR基因对杀鱼爱德华氏菌脂多糖合成的影响 |
| 2.2.13 fucR基因缺失对EIB202在罗非鱼肠道定植和细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 杀鱼爱德华氏菌的鉴定结果 |
| 3.2 ΔfucR菌株的构建和鉴定 |
| 3.2.1 fucR基因缺失片段fucR-UD的构建 |
| 3.2.2 重组自杀质粒p DMK-fucR-UD的构建 |
| 3.2.3 单交换菌株的筛选 |
| 3.2.4 双交换突变株的筛选 |
| 3.3 fucR基因缺失显着降低了杀鱼爱德华氏菌对岩藻糖的利用 |
| 3.4 fucR基因缺失降低了杀鱼爱德华氏菌的致病性 |
| 3.5 岩藻糖增强杀鱼爱德华氏菌岩藻糖操纵子基因的转录 |
| 3.6 fucR基因编码杀鱼爱德华氏菌岩藻糖操纵子的激活子 |
| 3.7 转录组结果分析 |
| 3.7.1 转录组结果生物学重复分析 |
| 3.7.2 转录组结果的差异分析 |
| 3.8 岩藻糖和fucR基因均增强杀鱼爱德华氏菌T4SS相关基因的转录 |
| 3.9 岩藻糖和fucR基因均增强杀鱼爱德华氏菌四环素抗性基因的转录 |
| 3.10 杀鱼爱德华氏菌通过fucR基因利用岩藻糖增强转座酶基因的转录 |
| 3.11 岩藻糖和fucR基因均增强杀鱼爱德华氏菌脂多糖合成相关基因的转录 |
| 3.12 岩藻糖促进杀鱼爱德华氏菌在罗非鱼肠道定植 |
| 3.13 fucR基因缺失改变了杀鱼爱德华氏菌对罗非鱼细胞因子的诱导能力 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
（2）Ⅱ型TA系统yefM-yoeB在杀鱼爱德华氏菌抗逆性和致病性中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 水产养殖病害 |
| 1.2 杀鱼爱德华氏菌 |
| 1.2.1 杀鱼爱德华氏菌特征 |
| 1.2.2 杀鱼爱德华氏菌的病害 |
| 1.2.3 杀鱼爱德华氏菌的致病机理 |
| 1.3 Ⅱ型毒素-抗毒素系统 |
| 1.3.1 毒素-抗毒素系统的简介 |
| 1.3.2 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的简介 |
| 1.3.3 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的功能 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 培养基及抗生素 |
| 2.1.2 供试菌株及质粒 |
| 2.1.3 试验引物 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 试验细胞及动物 |
| 2.1.6 生物信息学分析工具 |
| 2.1.7 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 yefM-yoeB的生物信息学分析 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 基因组DNA的获取 |
| 2.2.4 基因组cDNA的获取 |
| 2.2.5 yefM基因与yoeB基因共转录的鉴定 |
| 2.2.6 YoeB内源毒性的分析 |
| 2.2.7 杀鱼爱德华氏菌yefM-yoeB、yoeB敲除株的构建 |
| 2.2.8 杀鱼爱德华氏菌yefM-yoeB回补株的构建 |
| 2.2.9 杀鱼爱德华氏菌不同菌株的逆境检测 |
| 2.2.10 杀鱼爱德华氏菌不同菌株的毒力检测 |
| 2.2.11 杀鱼爱德华氏菌不同菌株的持留菌形成能力检测 |
| 2.2.12 yefM-yoeB启动子的β-半乳糖苷酶酶活力测定 |
| 2.2.13 YefM蛋白表达及纯化 |
| 2.2.14 凝胶迟缓试验(EMSA) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 杀鱼爱德华氏菌II型TA系统yefM-yoeB的鉴定 |
| 3.1.1 yefM-yoeB的序列分析 |
| 3.1.2 yefM与yoeB共转录的鉴定 |
| 3.1.3 YoeB的内源毒性 |
| 3.2 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌抗逆性和致病性的影响 |
| 3.2.1 yoeB、yefM-yoeB突变株及yefM-yoeB回补株的构建 |
| 3.2.2 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌抗逆性的影响 |
| 3.2.3 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌致病性的影响 |
| 3.3 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌形成持留菌能力的影响 |
| 3.3.1 抗生素对不同菌株生长的影响 |
| 3.3.2 氯霉素最小抑菌浓度(MIC)检测 |
| 3.3.3 不同菌株的持留菌形成能力检测 |
| 3.4 杀鱼爱德华氏菌yefM-yoeB启动子的初步研究 |
| 3.4.1 yefM-yoeB启动子的β-半乳糖苷酶酶活力测定 |
| 3.4.2 YefM与yefM-yoeB启动子的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 杀鱼爱德华氏菌II型TA系统yefM-yoeB的鉴定 |
| 4.2 杀鱼爱德华氏菌yefM-yoeB抗逆性和致病性分析 |
| 4.2.1 敲除株与回补株的构建 |
| 4.2.2 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌抗逆性的影响 |
| 4.2.3 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌毒力的影响 |
| 4.3 yefM-yoeB对杀鱼爱德华氏菌持留菌形成能力的影响 |
| 4.4 杀鱼爱德华氏菌yefM-yoeB启动子的初步研究 |
| 5 结论 |
| 6 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）传染性脾肾坏死病毒和鲶爱德华氏菌重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 传染性脾肾坏死病毒 |
| 1.1 ISKNV的形态与结构 |
| 1.2 ISKNV的流行病学 |
| 1.3 ISKNV的感染症状和病理特征 |
| 2 鲶爱德华氏菌 |
| 2.1 鲶爱德华氏菌的生物学特性 |
| 2.2 鲶爱德华氏菌的流行病学 |
| 2.3 鲶爱德华氏菌的感染症状和病理特征 |
| 2.4 鲶爱德华氏菌的相关毒力因子 |
| 3 重组酶聚合酶扩增技术 |
| 3.1 RPA技术的反应原理 |
| 3.2 RPA检测方法的类型 |
| 3.3 RPA技术的应用现状 |
| 4 本研究问题的由来、目的和意义 |
| 第二章 试验材料和试验方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 鱼、病毒和菌株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 试验仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 核酸提取 |
| 2.2 RPA引物和探针的设计 |
| 2.3 RPA检测 |
| 2.4 PCR检测 |
| 2.5 实时荧光PCR检测 |
| 2.6 质粒标准品的构建 |
| 2.7 RPA引物和探针的筛选 |
| 2.8 RPA反应条件的优化 |
| 2.9 特异性检测 |
| 2.10 灵敏性检测 |
| 2.11 临床样品检测 |
| 第三章 试验结果与分析 |
| 1 ISKNV RPA快速检测方法的建立和应用 |
| 1.1 ISKNV RPA引物的评估和筛选 |
| 1.2 ISKNV RPA-LFD引物和探针的评估 |
| 1.3 ISKNV RPA和RPA-LFD的反应条件优化 |
| 1.4 ISKNV RPA和RPA-LFD的特异性评估 |
| 1.5 ISKNV RPA和RPA-LFD的灵敏性评估 |
| 1.6 ISKNV RPA和RPA-LFD的临床样品实用性评估 |
| 1.7 讨论 |
| 2 鲶爱德华氏菌RPA快速检测方法的建立和应用 |
| 2.1 鲶爱德华氏菌RPA引物的评估和筛选 |
| 2.2 鲶爱德华氏菌RPA-LFD引物和探针的评估 |
| 2.3 鲶爱德华氏菌实时RPA引物探针组合的评估和筛选 |
| 2.4 鲶爱德华氏菌RPA和RPA-LFD的反应条件优化 |
| 2.5 鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA的特异性评估 |
| 2.6 鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA的灵敏性评估 |
| 2.7 鲶爱德华氏菌RPA、RPA-LFD和实时RPA的临床样品实用性评估 |
| 2.8 讨论 |
| 第四章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）虹鳟源鲁氏耶尔森菌主要生物学特性及减毒活疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 虹鳟肠炎红嘴病(ERM) |
| 1.1.1 虹鳟养殖概况及ERM危害 |
| 1.1.2 ERM流行发生规律 |
| 1.1.3 ERM临床症状、病理变化及诊断方法 |
| 1.1.4 ERM的病原特性 |
| 1.2 鲁氏耶尔森菌致病机制 |
| 1.2.1 致病机制研究方法 |
| 1.2.2 不良环境生存能力 |
| 1.2.3 生物被膜系统 |
| 1.2.4 铁元素的获取与利用 |
| 1.2.5 细胞外毒素 |
| 1.2.6 血清型与毒力关系 |
| 1.2.7 毒力基因的表达调控 |
| 1.3 鲁氏耶尔森菌溶血素基因 |
| 1.3.1 溶血素命名及分类 |
| 1.3.2 溶血素致病机制 |
| 1.3.3 鲁氏菌溶血素基因研究进展 |
| 1.4 同源重组技术 |
| 1.4.1 RecA系统同源重组法 |
| 1.4.2 Red系统同源重组法 |
| 1.4.3 基于自杀载体的同源重组法 |
| 1.4.4 基于温敏型质粒的同源重组法 |
| 1.4.5 CRISPR/Cas系统介导的基因编辑法 |
| 1.5 ERM免疫防控 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株、实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 重组表达载体及质粒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鲁氏耶尔森菌的分离鉴定和致病性研究 |
| 2.2.2 鲁氏耶尔森菌q PCR快速检测方法的建立 |
| 2.2.3 虹鳟ERM病理模型 |
| 2.2.4 鲁氏耶尔森菌感染虹鳟后脾脏转录组表达分析 |
| 2.2.5 YR01株溶血素基因毒力片段筛选 |
| 2.2.6 YR01株yhl B基因突变株YR01-△yhl B的构建 |
| 2.2.7 YR01-△yhl B株的生长及理化特性分析 |
| 2.2.8 YR01-△yhl B株作为减毒疫苗的可行性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 YR01株鉴定结果 |
| 3.1.1 YR01株的形态特征 |
| 3.1.2 YR01株的理化特性 |
| 3.1.3 YR01株的分子特征 |
| 3.1.4 YR01株的致病性分析 |
| 3.1.5 YR01株感染虹鳟的组织病理学 |
| 3.2 qPCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 扩增引物的特异性检测 |
| 3.2.2 标准曲线构建 |
| 3.2.3 灵敏度检测 |
| 3.3 虹鳟ERM病理模型的构建 |
| 3.3.1 临床症状观察 |
| 3.3.2 组织病理观察 |
| 3.3.3 致病菌检测 |
| 3.3.4 病理模型评价 |
| 3.4 鲁氏耶尔森菌感染虹鳟后脾脏转录组水平分析 |
| 3.4.1 RNA测序与数据处理 |
| 3.4.2 与参考基因组的匹配情况 |
| 3.4.3 差异表达基因的识别与分析 |
| 3.4.4 免疫相关DEGs的识别与分析 |
| 3.4.5 qRT-PCR验证 |
| 3.5 鲁氏耶尔森菌溶血素基因各片段毒力分析 |
| 3.5.1 YR01株溶血素基因(yhl BA)分段克隆结果 |
| 3.5.2 YR01株yhl BA基因片段表达载体的构建 |
| 3.5.3 YR01株yhl BA基因片段原核表达产物纯化分析 |
| 3.5.4 YR01株yhl BA基因片段原核表达产物的细胞毒性比较分析 |
| 3.6 YR01突变株(YR01-△yhl B)的构建 |
| 3.6.1 同源臂Kan抗性基因的扩增 |
| 3.6.2 打靶载体p-yhl B的构建 |
| 3.6.3 YR01-△yhl B突变株的构建 |
| 3.7 YR01-△yhl B株的生长及理化特性分析 |
| 3.7.1 YR01-△yhl B株的菌落形态观察 |
| 3.7.2 糖醇发酵能力检测 |
| 3.7.3 生长特性检测 |
| 3.7.4 药敏特性检测 |
| 3.8 YR01-△yhl B株作为减毒疫苗的可行性分析 |
| 3.8.1 细胞毒性检测 |
| 3.8.2 靶动物毒性评估 |
| 3.8.3 YR01-△yhl B株的免疫保护效果评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ERM流行病学特征 |
| 4.1.1 ERM的发生及在我国的流行情况 |
| 4.1.2 鲁氏耶尔森菌的病原病理学特性比较 |
| 4.2 鲁氏耶尔森菌检测技术的探索突破 |
| 4.3 病理模型构建及其在研究中的应用 |
| 4.4 鲁氏耶尔森菌引起的虹鳟转录水平表达差异 |
| 4.4.1 细胞因子 |
| 4.4.2 细胞凋亡 |
| 4.4.3 模式识别受体 |
| 4.4.4 信号通路 |
| 4.5 鲁氏耶尔森菌溶血素基因致病性分析 |
| 4.6 鲁氏耶尔森菌YR01-△yhl B突变株特性分析 |
| 4.7 鲁氏耶尔森菌YR01-△yhl B突变株免疫原性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）秦皇岛地区狐源大肠杆菌分离鉴定与胞外产物免疫原性研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大肠杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 大肠杆菌的简介 |
| 1.1.2 大肠杆菌的类型 |
| 1.1.3 形态特征 |
| 1.1.4 培养特性 |
| 1.1.5 生化特性 |
| 1.1.6 抗原结构与血清型 |
| 1.1.7 致病因子 |
| 1.1.8 大肠杆菌疫苗的种类 |
| 1.2 胞外产物(ECP)的研究进展 |
| 1.2.1 胞外产物的简介 |
| 1.2.2 胞外产物的组成 |
| 1.2.3 胞外产物的致病性 |
| 1.3 研究的目的意义 |
| 第二章 秦皇岛地区狐源大肠杆菌分离鉴定、血清型及致病性检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要试剂、材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 菌株来源 |
| 2.1.5 试验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病原菌的分离培养 |
| 2.2.2 病原菌的染色镜检 |
| 2.2.3 病原菌生化鉴定 |
| 2.2.4 病原菌16S r RNA PCR检测 |
| 2.2.5 分离菌株致病性试验 |
| 2.2.6 致病性菌株血清型检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细菌分离培养及镜检结果 |
| 2.3.2 病原菌生化鉴定结果 |
| 2.3.3 分离菌株16S r RNA鉴定结果 |
| 2.3.4 分离菌株的致病性 |
| 2.3.5 致病性菌株的血清型 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 E.coli CHL-147 株胞外产物的提取、生物活性及致病性分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试验动物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌株复苏 |
| 3.2.2 大肠杆菌胞外产物的提取 |
| 3.2.3 胞外产物蛋白总含量的测定 |
| 3.2.4 胞外产物酶活性的分析 |
| 3.2.5 胞外产物SDS-PAGE分析 |
| 3.2.6 大肠杆菌ECP的致病性 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 ECP蛋白总含量检测结果 |
| 3.3.2 ECP酶活性测定结果 |
| 3.3.3 ECP SDS-PAGE图谱分析 |
| 3.3.4 致病性试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 E.coli CHL-147株ECP免疫保护效果评价与蛋白功能分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 试剂的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 ECP的制备 |
| 4.2.2 ECP蛋白疫苗的制备 |
| 4.2.3 ECP蛋白疫苗免疫小鼠 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清的采集 |
| 4.2.5 淋巴细胞转化试验 |
| 4.2.6 间接ELISA测定ECP免疫小鼠血清抗体效价 |
| 4.2.7 免疫小鼠保护效果观察 |
| 4.2.8 胞外产物蛋白成分鉴定及分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 ECP的制备 |
| 4.3.2 免疫小鼠淋巴细胞转化试验 |
| 4.3.3 免疫小鼠抗体水平检测 |
| 4.3.4 免疫小鼠保护效果 |
| 4.3.5 ECP质谱鉴定与蛋白功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.鱼用疫苗的研究进展 |
| 1.1 鱼用疫苗的分类 |
| 1.2 细菌性鱼用疫苗的研究进展 |
| 1.3 疫苗研制的关键 |
| 2 花鲈及其主要病原 |
| 2.1 花鲈 |
| 2.2 主要病原 |
| 3 花鲈疫苗的研究进展 |
| 4 哈维弧菌的研究进展 |
| 5 花鲈哈维弧菌疫苗研制的目的和意义 |
| 第1章 疫苗菌株的确定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 实验用鱼 |
| 1.1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 疫苗候选菌株初筛 |
| 1.2.2 疫苗候选菌株复筛 |
| 1.2.3 疫苗菌株间的交叉保护效果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 疫苗菌株筛选 |
| 1.3.2 菌株间的交叉保护 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 菌株生物学性状及生长特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验用鱼 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 吸光度与菌落数标准曲线制备 |
| 2.2.2 菌株生长曲线 |
| 2.2.3 菌株生长特性 |
| 2.2.4 疫苗菌株和备用菌株半致死浓度(LD_(50))测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 吸光度与菌落数标准曲线 |
| 2.3.2 菌株生长曲线 |
| 2.3.3 菌株生长特性 |
| 2.3.4 菌株半致死浓度 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 疫苗的安全性及免疫效力 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验用鱼 |
| 3.1.3 实验试剂及耗材 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 灭活条件优化 |
| 3.2.2 疫苗的安全性 |
| 3.2.3 疫苗对花鲈生长的影响 |
| 3.2.4 疫苗的最小免疫剂量 |
| 3.2.5 疫苗的免疫保护期与相对保护率 |
| 3.2.6 受免鱼的血清抗体效价 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 灭活条件优化 |
| 3.3.2 最小免疫剂量 |
| 3.3.3 疫苗的免疫保护期与相对保护率 |
| 3.3.4 受免鱼的血清抗体效价 |
| 3.4 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）加州鲈源腐皮镰刀菌的分离鉴定、防控及其感染鱼后的转录组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 致病性腐皮镰刀菌的分离鉴定 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 菌株的分离纯化 |
| 1.2.2 菌株观察 |
| 1.2.3 菌株鉴定 |
| 1.2.4 孢子液制备 |
| 1.2.5 人工感染 |
| 1.2.6 不同浓度孢子液人工感染 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 菌株的分离与观察 |
| 1.3.2 菌株r DNA-ITS序列分析 |
| 1.3.3 人工感染 |
| 1.3.4 不同浓度孢子液人工感染 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 腐皮镰刀菌的生物学特性研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 温度对腐皮镰刀菌生长和产孢的影响 |
| 2.2.2 pH值 |
| 2.2.3 盐度 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 碳源 |
| 2.2.6 氮源 |
| 2.2.7 光照 |
| 2.2.8 数据统计与分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 温度 |
| 2.3.2 pH值 |
| 2.3.3 盐度 |
| 2.3.4 培养基 |
| 2.3.5 碳源 |
| 2.3.6 氮源 |
| 2.3.7 光照 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 腐皮镰刀菌的药敏特性研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验菌株 |
| 3.1.2 药敏质控菌株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 药物储备液制备 |
| 3.2.2 药物对菌丝的作用 |
| 3.2.3 药物对孢子的作用 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 药物初筛结果 |
| 3.3.2 药物MIC值测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 腐皮镰刀菌拮抗菌的筛选鉴定及其拮抗特性研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 拮抗菌分离 |
| 4.2.2 拮抗菌筛选 |
| 4.2.3 拮抗菌鉴定 |
| 4.2.4 拮抗菌药敏试验 |
| 4.2.5 拮抗菌溶血试验 |
| 4.2.6 拮抗菌安全性试验 |
| 4.2.7 拮抗菌稳定性试验 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 拮抗菌分离与筛选 |
| 4.3.2 拮抗菌鉴定 |
| 4.3.3 拮抗菌药敏结果 |
| 4.3.4 拮抗菌溶血试验 |
| 4.3.5 拮抗菌安全性 |
| 4.3.6 拮抗菌稳定性 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 拮抗菌发酵条件优化和抑菌物质初步研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验菌株 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 拮抗菌生长曲线测定 |
| 5.2.2 拮抗菌发酵条件优化 |
| 5.2.3 拮抗菌培养基组分优化 |
| 5.2.4 优化后生长曲线的测定 |
| 5.2.5 抑菌物质初步研究 |
| 5.2.6 数据统计和分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 拮抗菌生长曲线 |
| 5.3.2 拮抗菌发酵条件优化 |
| 5.3.3 拮抗菌培养基组分优化 |
| 5.3.4 优化后生长曲线 |
| 5.3.5 抑菌物质初步研究 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 加州鲈感染腐皮镰刀菌的转录组学分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验菌株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 腐皮镰刀菌感染健康加州鲈 |
| 6.2.2 样品制备 |
| 6.2.3 RNA提取和文库构建 |
| 6.2.4 数据分析 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 测序数据质控 |
| 6.3.2 转录组从头组装及评估 |
| 6.3.3 功能注释 |
| 6.3.4 差异表达分析 |
| 6.3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 6.4 讨论 |
| 结论、创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间研究成果 |
| 致谢 |
（8）粘质沙雷氏菌Cpx双组分调控系统缺失菌株的构建及对生物学特性影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 粘质沙雷氏菌研究概述 |
| 1.1.1 粘质沙雷氏菌简介 |
| 1.1.2 粘质沙雷氏菌致病性 |
| 1.1.3 粘质沙雷氏菌的致病因子 |
| 1.2 Cpx双组分系统研究进展 |
| 1.2.1 Cpx双组分系统的组成 |
| 1.2.2 Cpx双组分系统的激活 |
| 1.2.3 Cpx双组分系统的研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 粘质沙雷氏菌Cpx双组分系统缺失株和回补株的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验菌株及质粒 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 主要培养基及抗生素的配制 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 cpx A基因,cpx R 基因和cpx AR 基因敲除株的构建 |
| 3.2.2 回补菌株的构建 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Δcpx A基因敲除株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 Δcpx R基因缺失株的构建及鉴定 |
| 3.3.3 Δcpx AR基因缺失株的构建及鉴定 |
| 3.3.4 Δcpx A、Δcpx R、Δcpx AR回补菌株的构建 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 粘质沙雷氏菌Cpx双组分系统缺失菌株相关生物学性状的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 实验试剂和主要培养基的配制 |
| 4.1.3 细菌生长形态观察 |
| 4.1.4 生长曲线检测 |
| 4.1.5 蛋白酶活性检测 |
| 4.1.6 卵磷脂酶活性检测 |
| 4.1.7 运动性检测 |
| 4.1.8 菌株生物被膜形成能力测定 |
| 4.1.9 细菌应激条件下存活率测定 |
| 4.1.10 抗生素敏感实验 |
| 4.1.11 溶血活性检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细菌生长形态观察结果 |
| 4.2.2 细菌生长曲线测定结果 |
| 4.2.3 蛋白酶活性检测结果 |
| 4.2.4 卵磷脂酶活性检测结果 |
| 4.2.5 运动性检测结果 |
| 4.2.6 菌株生物被膜形成能力测定 |
| 4.2.7 细菌应激条件下存活率测定 |
| 4.2.8 抗生素敏感试验 |
| 4.2.9 溶血活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 粘质沙雷氏菌Cpx双组分系统缺失菌株对家蚕的毒力试验 |
| 5.1 实验材料和实验方法 |
| 5.1.1 供试材料及试剂配方 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌悬液的制备 |
| 5.2.2 对家蚕的致病力实验 |
| 5.2.3 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 家蚕病发特征 |
| 5.3.2 家蚕的存活率 |
| 5.3.3 粘质沙雷氏菌的LD_(50) |
| 5.3.4 多种毒力相关基因在Δcpx A、Δcpx R、Δcpx AR中的转录水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表论文及参研项目 |
（9）斑马鱼细胞焦亡介导脓毒症急性肾损伤的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 固有免疫系统 |
| 1.1.1 模式识别理论 |
| 1.2 炎症小体 |
| 1.2.1 哺乳动物caspase-1依赖的经典炎症小体 |
| 1.2.2 哺乳动物caspase-4/5/11依赖的非经典炎症小体 |
| 1.3 细胞焦亡 |
| 1.3.1 GSDMD蛋白介导细胞焦亡 |
| 1.3.2 Gasdermin家族其他蛋白诱导细胞焦亡 |
| 1.3.3 细胞焦亡在感染和疾病中的作用 |
| 1.4 脓毒症 |
| 1.4.1 LPS诱导的脓毒症休克 |
| 1.4.2 炎症小体调控脓毒症发生 |
| 1.4.3 脓毒症急性肾损伤 |
| 1.5 斑马鱼炎症小体激活与细胞焦亡发生 |
| 1.6 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 斑马鱼脓毒症发生与筛选模型的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 sgRNA靶点、PCR引物及斑马鱼品系 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3培养基与相关溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 LPS浸泡感染斑马鱼幼鱼 |
| 2.3.2 感染后斑马鱼幼鱼表型观察 |
| 2.3.3 sgRNA转录模板合成及纯化 |
| 2.3.4 sgRNA体外转录及纯化 |
| 2.3.5 不同基因Crispants幼鱼制备 |
| 2.3.6 RNA抽提 |
| 2.3.7 Crispants幼鱼基因分型鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 LPS诱导的斑马鱼幼鱼脓毒症发生模型建立 |
| 2.4.2 调控脓毒症发生的炎症小体关键信号筛选模型建立 |
| 2.4.3 斑马鱼caspy2和GSDMEb调控LPS诱导的脓毒症发生 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 Caspy2/GSDMEb调控斑马鱼近端肾小管细胞焦亡 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 斑马鱼品系 |
| 3.2.2 实验试剂与缓冲液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 斑马鱼幼鱼PI活体染色及荧光观察 |
| 3.3.2 斑马鱼幼鱼冷冻切片制备及染色观察 |
| 3.3.3 转基因幼鱼荧光观察 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 斑马鱼幼鱼活体水平检测细胞焦亡模型建立 |
| 3.4.2 Caspy2/GSDMEb介导近端肾小管细胞焦亡 |
| 3.4.3 Caspy2/GSDMEb激活导致近端肾小管形态失常 |
| 3.4.4 Caspy2/GSDMEb激活导致近端肾小管处中性粒细胞招募明显 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 细胞焦亡诱导斑马鱼急性肾损伤发生机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 q-PCR引物、斑马鱼品系、细胞系及菌株 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 培养基与缓冲液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 荧光定量PCR |
| 4.3.2 kim-1原位杂交探针制备 |
| 4.3.3 斑马鱼幼鱼原位杂交 |
| 4.3.4 斑马鱼幼鱼组织石蜡切片 |
| 4.3.5 斑马鱼幼鱼组织透射电镜 |
| 4.3.6 ZF4细胞培养 |
| 4.3.7 ZF4细胞侵染 |
| 4.3.8 细胞LDH测定 |
| 4.3.9 Ac-FEID-CMK处理斑马鱼幼鱼 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Caspy2/GSDMEb激活导致急性肾损伤标志物基因表达上调 |
| 4.4.2 Caspy2/GSDMEb激活导致近端肾小管病理损伤 |
| 4.4.3 GSDMEb竞争性肽抑制剂Ac-FEID-CMK能够抑制急性肾损伤发生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 Caspase-11/GSDMD调控小鼠脓毒症急性肾损伤机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 LPS诱导小鼠脓毒症休克模型建立 |
| 5.3.2 感染后小鼠血清炎症因子水平检测 |
| 5.3.3 小鼠肾脏石蜡切片制备 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Caspase-11/GSDMD加剧LPS感染导致的小鼠脓毒症休克死亡 |
| 5.4.2 Caspase-11/GSDMD介导LPS感染后小鼠炎症相关因子上调表达 |
| 5.4.3 Caspase-11/GSDMD介导LPS感染后小鼠急性肾损伤相关酶上调表达 |
| 5.4.4 Caspase-11/GSDMD激活加剧LPS感染后小鼠肾脏病理损伤 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 斑马鱼中性粒细胞抗细菌感染机制探索 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 菌株、质粒、引物及实验动物 |
| 6.2.2 实验试剂、培养基和缓冲液 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 杀鱼爱德华氏菌EIB202感受态细胞制备 |
| 6.3.2 EIB202-mCherry菌株构建 |
| 6.3.3 杀鱼爱德华氏菌培养及处理 |
| 6.3.4 杀鱼爱德华氏菌浸泡感染 |
| 6.3.5 幼鱼体内细菌滴板计数 |
| 6.3.6 中性粒细胞缺失斑马鱼幼鱼品系构建 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 杀鱼爱德华氏菌浸泡感染斑马鱼幼鱼模型建立 |
| 6.4.2 杀鱼爱德华氏菌感染导致炎症因子和趋化因子上调明显 |
| 6.4.3 杀鱼爱德华氏菌感染导致中性粒细胞招募及数量减少 |
| 6.4.4 中性粒细胞在斑马鱼肠道黏膜免疫过程中发挥重要作用 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）养殖大菱鲆细菌性腹水病及其防治方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 临床症状 |
| 2 流行特点 |
| 3 发病原因 |
| 3.1 水质变化 |
| 3.2 饲料质量 |
| 3.3 鱼体应激反应 |
| 3.4 感染病原菌 |
| 3.4.1 病原菌种类 |
| 3.4.2 病原菌分离鉴定方法 |
| 3.5 药物使用不当 |
| 4 预防方法 |
| 4.1 选用健康苗种 |
| 4.2 保持良好水质 |
| 4.3 选择优质饲料 |
| 4.4 免疫预防 |
| 5 治疗方法 |
| 6 结语 |
四、迟缓爱德华氏菌的溶血特性（论文参考文献）
- [1]杀鱼爱德华氏菌fucR基因缺失株构建及其生物学特性分析[D]. 孙永灿. 山东农业大学, 2021
- [2]Ⅱ型TA系统yefM-yoeB在杀鱼爱德华氏菌抗逆性和致病性中的作用[D]. 马东梅. 黑龙江八一农垦大学, 2021(10)
- [3]传染性脾肾坏死病毒和鲶爱德华氏菌重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法的建立与应用[D]. 李昊轩. 华中农业大学, 2021
- [4]虹鳟源鲁氏耶尔森菌主要生物学特性及减毒活疫苗研究[D]. 王荻. 东北农业大学, 2021
- [5]秦皇岛地区狐源大肠杆菌分离鉴定与胞外产物免疫原性研究[D]. 刘少杰. 河北科技师范学院, 2021(08)
- [6]花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究[D]. 陈皓祥. 上海海洋大学, 2021(01)
- [7]加州鲈源腐皮镰刀菌的分离鉴定、防控及其感染鱼后的转录组分析[D]. 于交平. 上海海洋大学, 2021
- [8]粘质沙雷氏菌Cpx双组分调控系统缺失菌株的构建及对生物学特性影响的研究[D]. 刘锐. 西南大学, 2021(01)
- [9]斑马鱼细胞焦亡介导脓毒症急性肾损伤的分子机制[D]. 王壮. 华东理工大学, 2020(08)
- [10]养殖大菱鲆细菌性腹水病及其防治方法研究进展[J]. 黄华,张建柏,徐晓莹,王鹤,王力勇,高雁,段钰. 水产科技情报, 2021(02)