一、胞浆CD_3检测在早期T淋巴细胞白血病诊断中的应用（论文文献综述）
李青[1]（2021）在《ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸》文中研究指明肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道,过去的40年里,肺癌的5年生存率小于21%。肺腺癌（Lungadenocarcinoma,LUAD）作为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）最重要的亚型,发病率逐渐增多,成为备受关注的NSCLC亚型。伴随着靶向治疗的出现,晚期LUAD患者的5年总生存有所改善,但仍面临靶向药物耐药、获益人群受限、缓解率不高等问题。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade,ICB）及以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的过继性T细胞转移（ACT）治疗的出现为晚期肺癌患者带来了新的希望。而目前PD-I/PD-L1抑制剂在实体瘤的临床有效率及瘤种反应率不尽相同。单纯抗PD-1/PD-L1免疫治疗在晚期NSCLC的客观有效率仅为20%,除了患者选择不足和肿瘤自身免疫原性低外,复杂的免疫抑制微环境,包括抑制性免疫细胞、细胞因子和代谢物,以及肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）数量和功能下降,是T细胞免疫和有效ICB治疗的主要障碍。因此,寻找新的免疫检查点分子作为替代或补充,以突破肿瘤免疫抑制性屏障,逆转肿瘤免疫抑制微环境是目前肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,而肿瘤浸润T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中参与抗肿瘤免疫应答的最重要的免疫细胞,如何提高肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的浸润水平及功能是当下免疫治疗的研究热点。成熟T淋巴细胞膜表面可表达CD3分子,根据T细胞表面分化抗原的不同,T细胞可分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞二个亚群。CD4+T淋巴细胞,通过与外源性抗原肽-MHCII分子结合发挥辅助作用;CD8+T淋巴细胞,主要与内源性抗原肽-MHC-I分子结合、活化,借助于颗粒酶、穿孔素等发挥特异性杀伤功能,是机体免疫系统中最重要的效应细胞。目前研究表明肿瘤浸润淋巴细胞,特别是CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）的存在与肿瘤患者较好的预后及肿瘤免疫治疗的疗效相关。FOXP3是Tregs的特异性转录因子。它不仅控制其表型,而且维持其免疫抑制功能,是应用最广泛的Treg标记。Treg通常通过接触依赖方式抑制Teffertor、NK或APC的激活,或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制因子介导免疫抑制功能。目前大部分研究表明,在绝大多数肿瘤类型中,细胞毒性抗肿瘤免疫应答的主要细胞(如细胞毒CD8+T细胞、Th1导向的CD4+T细胞、三级淋巴结构（TLSs,tertiary lymphoid structures）的存在与良好的临床结果相关。相反,Tregs表达者预后较差。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中Tregs和抑制性检查点分子等复杂的免疫抑制因子可以限制T细胞的浸润和杀伤能力,而这对于肿瘤的根除至关重要。因此,开展肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的研究对肿瘤的免疫治疗尤为重要。ILT4作为免疫球蛋白样转录子抑制性受体的一种,主要在髓系固有细胞（DC细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞）中表达,通过与经典或非经典组织相容复合体I类分子（MHC-I）结合,在维持母婴免疫耐受、器官移植耐受及炎症反应中发挥重大作用。研究表明,免疫细胞中ILT4的表达可有效抑制CD4+T细胞、CD8+细胞毒T细胞、NK细胞及树突状细胞的免疫活性,同时亦能诱导不同类型Treg细胞发挥免疫抑制作用。其虽在免疫学研究中取得十足的进展,但在肿瘤领域的研究相对较少。近年来,研究发现ILT4在NSCLC、白血病、乳腺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞中存在表达,且与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等多种恶性生物学行为息息相关。此外,ILT4在髓系抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）中高表达,可促进肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAM）的M2极化,在创造肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。但肿瘤源性ILT4对实体肿瘤免疫抑制性微环境中T淋巴细胞亚群的调控作用及相关机制尚无报道。研究目的1.通过免疫组化染色方法和大数据统计分析ILT4在肺腺癌中的表达及其与T细胞浸润与亚群分布的相关性,以及二者与患者预后的相关性,明确ILT4对免疫抑制微环境的调控作用。以此为基础构建肺腺癌患者预后Nomogram列线图模型,为患者预后的预测提供量化工具。2.体外利用CD3+、CD4+和CD8+T细胞及敲低/过表达ILT4的肺腺癌细胞株构建T细胞-肿瘤细胞共培养体系,应用CCK-8和流式细胞术检测T细胞的增殖和凋亡情况。旨在探讨肿瘤源性ILT4抑制T细胞浸润的可能机制。方法1.收集216例经烟台市烟台山医院病理科诊断明确的原发性肺腺癌患者的病理组织标本及临床病理资料,并通过电话随访的方式获得入组患者的生存资料。应用免疫组织化学染色法检测其ILT4及CD3、CD4、CD8、FOXP3在肿瘤癌巢及间质的表达情况;结合免疫组化结果和GEO公共数据库统计分析ILT4与肺腺癌预后的关系。其次,分别统计ILT4的表达与上述T淋巴细胞亚群在癌巢及间质的分布密度关系,探讨ILT4与T淋巴细胞两者共表达对肺腺癌患者生存预后的影响。2.利用KM-plotter在线工具（http://kmplot.com/）数据库分析肺腺癌患者ILT4的生存情况。对基因表达综合数据库（GEO）中的720例和461例LUAD患者分别进行无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析。自动选择每个队列的最佳截止值,其他所有参数均为默认设置。从GEO数据库下载LUAD患者的基因表达谱（GSE50081;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50081）,GSE50081的基因注释基于微阵列平台GPL570,对127个L UAD样本进行了进一步的研究。对于癌症基因组图谱（TCGA）队列,泛癌的RNASeq数据从UCSC xena下载（https://xenabrowser.net/datapages/）,共纳入515个样本。用ssGSEA函数对R package GSVA中的Treg浸润评分进行量化。采用Spearman相关系数评价ILT4表达与Treg浸润的相关性。3.利用患者临床病理资料、ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据创建可评估患者预后生存的诺谟图。其中,利用Lasso回归,基于Lambda.1se筛选有意义的指标,将能够反应免疫微环境状态（即ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据）的这些自变量与其回归系数组成一个计算评分,即为lasso系数。将lasso回归筛选得到的指标联合临床病理参数制作诺谟图,以估算NSCLC患者2年和3年的生存率。其中模型的构建采用R语言3.0.1（R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria）和glmnet package进行LASSO Cox回归模型分析,并运用图形校准法检验模型的一致性/标定度（Calibration）及C-Index值评价模型的区分度。4.利用基因转染技术,分别敲低/过表达LUAD细胞系-H1975中ILT4的表达,应用Western blot、RT-PCR方法分别检测ILT4的转染效率。然后,运用Ficoll-Paque分离液分离健康志愿者全血中的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用相应T细胞亚群磁珠分选试剂盒分选并利用CD3单抗活化人CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群。将敲低/过表达ILT4的LUAD H1975细胞系（H1975-shILT4与H1975-ILT4）分别与活化的CD3+、CD4+及CD8+T细胞按2:1比例共培养48h。然后,分离共培养之后的T细胞。分别利用CCK-8法和流式细胞术检测共培养体系中T淋巴细胞亚群增殖和凋亡情况。结果1.ILT4在LUAD高表达,正常邻近组织低表达,其表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及较差的PFS、OS相关。此外,ILT4的表达与肿瘤浸润T淋巴细胞的减少有关。进一步行T细胞亚群分析显示,ILT4高表达肿瘤中癌巢和间质中浸润的CD8+T淋巴细胞的减少,Treg浸润增加,而与CD4+T淋巴细胞亚群的浸润密度无关。同时ILT4highCD8low/ILT4highTreghigh肺腺癌患者的OS更差。因此,ILT4与CD8/Treg联合相比任何单一标记具有更好的生存预测价值。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可以有效的预测患者2年及3年的生存率,为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者的2年、3年生存概率。3.应用RT-PCR及Western blot方法分别检测敲低/过表达肺腺癌细胞H1975中ILT4的转染效率满意。敲低H1975细胞中ILT4表达后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性增加,而凋亡比例明显减少。而过表达H1975细胞中ILT4后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性受到抑制,凋亡比例明显增加。但两组中均未观察到CD4+T淋巴细胞亚群的浸润变化。结论1.肿瘤源性ILT4的表达与肺腺癌免疫抑制T淋巴细胞亚群的浸润和不良的临床预后相关。提示ILT4可能成为LUAD患者潜在的免疫治疗靶点和预后生物标记物。同时,ILT4与CD8/Treg联合可作为评估LUAD患者预后的更佳指标。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者生存概率。3.肿瘤源性ILT4通过调控T细胞亚群增殖、凋亡诱导肺腺癌的免疫逃逸。
张莹[2]（2021）在《外周血流式细胞术在皮肤淋巴组织肿瘤诊断中的临床应用》文中进行了进一步梳理皮肤淋巴组织肿瘤是一组发生在皮肤的、相对罕见的、异质性的淋巴造血组织肿瘤,诊断具有挑战性。蕈样肉芽肿和Sézary综合征（MF/SS）是最常见的原发性皮肤T细胞淋巴瘤,外周血受累是MF/SS患者的独立不良预后因素。因此,准确的评估外周血肿瘤负荷对患者疾病分期、指导治疗十分必要。红皮病是以全身弥漫性发红为特征的重症皮肤病,病因复杂。红皮病型蕈样肉芽肿和Sézary综合征（EMF/SS）常模仿多种炎症性红皮病（IE）,部分EMF/SS患者组织学无特征性,鉴别诊断困难,但前者预后较差。因此,早期准确识别红皮病患者的潜在病因,尤其是鉴别EMF/SS引起的红皮病及IE对患者的对因治疗及改善预后非常重要。流式细胞术（FCM）可对单个细胞同时进行多参数分析,具有快速、客观、定量等优势,但目前尚无标准的用于评估MF/SS患者外周血肿瘤负荷的FCM检测和分析方案。因此,本研究通过建立多参数FCM对不同分期MF/SS患者及不同病因红皮病患者的外周血T淋巴细胞进行TCR-vβ克隆性及多种免疫表型检测,探讨FCM在MF/SS患者诊断、外周血肿瘤负荷评估以及EMF/SS与IE患者鉴别诊断中的临床应用。母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）是一种罕见的侵袭性造血系统恶性肿瘤,常以皮肤损害为首发表现。E2-2是调控BPDCN的一种重要转录因子。因此,本研究探讨了 E2-2免疫组化检查及外周血FCM检测在以皮损为首发临床表现的BPDCN患者诊断及肿瘤负荷评估中的临床应用。第一部分外周血流式细胞术在蕈样肉芽肿/Sézary综合征及其相关红皮病诊断中的临床应用第一章外周血流式细胞术在蕈样肉芽肿/Sézary综合征中的临床应用目的探讨外周血FCM在MF/SS中的临床应用。方法建立多参数FCM方案,并对2017-2020年在中国医学科学院皮肤病医院诊断的69例不同分期MF/SS患者的78份外周血标本进行TCR-vβ克隆性检测及T淋巴细胞免疫表型分析。结果78份MF/SS标本中,30份检测到克隆性TCR-vβ表达,在早期、肿瘤期、Ⅲ期MF及SS患者中分别占13.9%、54.8%、50%和100%。在对应分期标本中,克隆细胞比例平均分别为6.5%、18.3%、12.2%和74.9%。克隆性TCR-vβ种类呈明显异质性。在37份（47.4%）MF/SS标本中检测到至少一种全T淋巴细胞标记表达异常,主要为CD7表达减弱或丢失,其次为CD3及CD4表达减弱,偶见CD2、CD5及CD45表达异常。克隆性TCR-vβ细胞与表达CD4+CD7-CD26-表型细胞具有明显一致性。其中2例肿瘤期MF显示肿瘤细胞计数>1000/μl,诊断由ⅡB期修订为Ⅳ期。仅在2例SS患者中检测到CD164表达。结论外周血受累可见于任何疾病分期的MF/SS患者。FCM检测外周血T淋巴细胞免疫表型及TCR-vβ克隆性,可明确诊断SS患者,辅助诊断MF患者,客观准确的评估外周血肿瘤负荷,有助于准确分期。第二章外周血流式细胞术在淋巴瘤相关红皮病中的临床应用目的探讨外周血FCM在红皮病中的临床应用。方法对2017-2020年在我院就诊的33例不同病因红皮病患者（6例EMF,5例SS,22例IE）的外周血进行FCM检测。结果在3例EMF及所有SS患者中检测到克隆性TCR-vβ表达,而所有IE患者均为阴性,TCR-vβ克隆阳性对MF/SS诊断的特异性和阳性预测值均为100%。所有EMF/SS患者均检测到至少一种全T细胞表型表达异常,而仅在4份（18.2%）IE标本中检测到CD7表达减弱或丢失,余免疫表型无异常。在SS患者中,TCR-vβ克隆细胞计数均>1000/μl,CD4/CD8比值均>10,CD4+CD7-CD26-细胞比例均大于30%,与MF及IE患者的差异均具有统计学意义（P<0.05）。T淋巴细胞功能亚型分析显示,EMF/SS的肿瘤细胞主要为TCM,而IE患者以TEM浸润为主。此外,研究显示CCR4和CLA在EMF/SS患者中表达明显高于IE患者,CCR4在泛发性湿疹及药疹患者中的表达高于健康志愿者,而CXCR3及CCR5在红皮病型银屑病中的表达高于湿疹和EMF/SS患者。结论外周血FCM检测可明确诊断SS患者,可辅助EMF与IE的鉴别诊断,对不同病因IE患者间的鉴别诊断亦具有指导意义。第三章流式细胞术结合临床病理分析在伴大细胞转化的蕈样肉芽肿诊断中的研究目的探讨伴大细胞转化的蕈样肉芽肿（TMF）患者的临床、病理特征及预后。方法回顾性分析2014-2020年我院诊断的24例TMF患者的临床、病理和免疫组化资料,以及16份TMF患者的外周血FCM资料。结果24例TMF患者中,早期9例,肿瘤期15例。组织病理显示,20例患者大细胞呈弥漫性分布,其中,4例肿瘤期患者可见瘤巨细胞形成,另4例患者大细胞呈灶状分布。免疫组化显示,CD30在18例患者中呈阳性表达,其中9例阳性大细胞比例>75%。外周血FCM显示,表达克隆性TCR-vβ的患者比例及克隆细胞比例在T M F患者中（分别为7 5.0%及15.4%）均高于不伴大细胞转化的MF患者（分别为22.8%和10.8%）,且肿瘤细胞前向角散射明显增大。随访结果显示,5例（20.8%）肿瘤期患者死亡,平均为发生大细胞转化后3.3年。结论大细胞转化可发生于任何疾病分期的MF患者,常提示疾病进展、预后不良。结合皮损组织学检查及外周血FCM检测,有助于TMF患者的早期明确诊断及肿瘤负荷评估。第二部分流式细胞术结合临床病理分析在母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤诊断中的研究目的探讨以皮损为首发临床表现的BPDCN患者的诊断。方法回顾性分析2010-2020年我院诊断的28例BPDCN患者的临床、病理和免疫组化特征,并对6例患者的外周血行FCM分析。结果BPDCN患者的发病年龄呈双峰分布模式。皮损主要表现为多发性（65%）、散在（20%）或孤立性（15%）斑块、结节或肿块。组织学上,多数病变（67.9%）显示肿瘤细胞呈弥漫性结节状浸润,少数呈间质性（14.3%）、浅表带状（7.1%）或血管附属器周围（10.7%）浸润模式。所有病变均无血管侵犯及坏死,仅1例显示表皮及附属器受累。肿瘤细胞类似于淋巴母细胞或髓系母细胞,细胞核轻度或明显异型,1例显示肿瘤细胞呈免疫母细胞样形态。免疫组化显示,CD4和CD56分别在17.9%和7.1%的BPDCN患者中表达丢失,CD 123和TCL-1各在2例髓系肉瘤患者中弱阳性表达,仅65%的BPDCN患者同时表达上述4种标记。E2-2染色显示,在27例BPDCN患者中呈弥漫强阳性表达,另1例显示阳性细胞比例约为20%,而所有髓系肉瘤患者均为阴性。六例BPDCN患者外周血流式细胞术检查均检测到肿瘤细胞,比例从1.5%到83.4%不等,且CD56呈异质性表达。结论BPDCN患者皮损的临床和组织学均呈异质性,E2-2可作为诊断BPDCN敏感且特异的免疫标记,BPDCN病程呈侵袭性,FCM有助于早期识别外周血受累,并评估肿瘤负荷。
潘莹[3]（2021）在《T细胞亚群在急性B淋巴细胞白血病患者外周血中的分布及其对CD19 CAR-T细胞治疗疗效的影响》文中研究表明第一部分急性B淋巴细胞白血病患者外周血T细胞亚群的分布及意义背景急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）是急性白血病的一种,在成人和儿童中均是常见的白血病类型,主要累及淋系造血干祖细胞。根据细胞表型可分为B细胞型和T细胞型,其中绝大多数为B细胞型。其发病机制复杂,已知基因突变、遗传物质异常及免疫微环境均是导致其发病的重要因素。然而,在急性白血病的发生、发展过程中,机体免疫微环境不是一成不变,而是动态变化的。免疫微环境的改变可以导致患者外周循环包括T细胞亚群在内的各种免疫细胞亚群发生变化,即通过外周血T细胞免疫状态可以间接反应机体免疫微环境。因此,需要进一步探索急性B淋巴细胞白血病（B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia,B-ALL）患者外周T细胞亚群的分布,及其与不同疾病时期及治疗疗效的相关性,最终为优化诊治、判断预后提供依据。目的分析B-ALL患者在疾病的不同阶段外周血T细胞亚群的分布,并评估其与疗效的相关性。材料与方法收集并分析60例成人B-ALL患者的临床资料,其中初诊B-ALL患者16例,完全缓解20例,缓解后复发24例,利用直接荧光素法标记细胞表面抗原后,用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测B-ALL患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值、CD4+Treg细胞水平。同时选取40例健康成人作为健康对照组。结果初诊B-ALL患者外周血T细胞亚群的分布与临床特征如年龄、性别、初诊白细胞数、首次诱导治疗是否达缓解间无明显相关性。存在高危分子学或遗传学异常患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4/CD8比值更低,而CD4+Treg细胞更高。与健康对照组相比,初诊组外周血CD4+T细胞表达降低,缓解时升高,复发时再次降低。初诊组、缓解组及复发组的CD8+T细胞表达明显高于正常对照组。CD4/CD8比值方面,同正常对照组相比,初诊患者CD4/CD8比值明显降低,缓解时一定程度恢复,复发时再次显着降低。在CD4+Treg细胞方面,初诊组和复发组患者CD4+Treg细胞均高于正常对照组及完全缓解组,且复发组高于初诊组。此外,我们还分析了8例B-ALL患者在初诊时及诱导化疗达完全缓解时的T细胞亚群,结果表明,初诊时异常升高的CD4+Treg细胞,在患者病情达到完全缓解时明显下降（P=0.001）,两组在CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4/CD8比值之间无明显差异。结论初诊B-ALL患者外周循环CD8+T细胞、CD4+Treg细胞明显升高,CD4/CD8比值明显降低,提示T细胞免疫功能紊乱可能参与B-ALL患者的发病。积极有效的治疗能改善B-ALL患者体内存在的T细胞免疫失衡状态。然而,在疾病再次复发时,T细胞免疫失衡状态则再次出现,进一步表明T细胞免疫功能的异常可能也参与B-ALL疾病复发、进展。第二部分T细胞亚群对靶向CD19嵌合抗原受体T细胞治疗复发/难治性B-ALL疗效的影响背景复发/难治性B-ALL预后差、治疗手段有限。近年来,新出现靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen receptor T Cell,CAR-T）免疫治疗。该疗法在复发/难治性B-ALL中的缓解率高。但长期随访发现30%50%患者出现缓解后再复发,此外,约10%20%的患者不能获得缓解。治疗失败及再复发目前已成为CD19 CAR-T细胞临床治疗的一重大挑战。CAR-T细胞治疗疗效与其能否在患者体内持续存在相关,而患者的免疫状态、肿瘤的生物学特性等诸多因素又能影响CAR-T细胞的存留时间。前期我们研究发现机体的T细胞免疫功能与B-ALL的发生、进展相关,因此,需要进一步探索患者外周T细胞亚群在复发/难治性B-ALL患者CAR-T细胞治疗中的意义。目的探索CD19 CAR-T细胞治疗前后,复发/难治性B-ALL患者外周循环T细胞亚群水平,并分析其对CAR-T细胞治疗疗效的影响。方法利用直接荧光素法标记细胞表面抗原,用流式细胞术检测46例成功接受CAR-T细胞免疫疗法的复发/难治性B-ALL患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值、CD4+Treg细胞水平,分析患者输注CD19 CAR-T细胞前、输注CAR-T细胞1周时患者免疫状态差异及其与临床特征、CAR-T细胞治疗不良反应、CAR-T细胞治疗短期疗效、再复发及长期生存的关系。结果（1）与健康对照组相比,复发/难治性B-ALL患者输注CAR-T细胞前外周血CD8+T细胞、CD4+Treg细胞显着升高,CD4/CD8比值降低。回输CAR-T细胞1周时,患者外周血CD4+Treg细胞明显高于正常对照组,但较回输前无明显差异。CAR-T细胞治疗缓解组外周血CD4+Treg细胞水平明显低于未缓解组。（2）通过受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic,ROC）确定CD4+Treg细胞为预测CAR-T细胞治疗疗效最优的回输前T细胞亚群指标,曲线下面积（Area Under Curve,AUC）为0.770（P=0.013）。回输前较高Treg细胞组较较低Treg细胞组总体生存（Overall Survival,OS）更短,此外,无复发生存（Relapse Free Survival,RFS）时间亦更短。多因素Cox比例风险模型示回输前高Treg细胞是影响复发/难治性B-ALL患者CAR-T细胞治疗RFS和OS的独立不良预后因素。回输前T细胞亚群与细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome,CRS）的发生无明显相关性,回输前CD3+T细胞、CD8+T细胞及CD4+Treg细胞与CAR-T细胞在外周血存留时间呈负相关（R=-0.673,-0.511和-0.631,P=0.002,0.025和0.004）。（3）利用ROC曲线和AUC,确定回输后CD4+Treg细胞最佳临界值为5.02%,比较回输后较高和较低Treg细胞组的OS和RFS,结果显示回输后较高Treg细胞组较较低Treg细胞组有更短的OS和RFS。多因素Cox比例风险模型示回输后高Treg细胞是影响CAR-T细胞治疗复发/难治B-ALL患者RFS和OS的独立不良预后因素;预处理前正常血小板是影响患者RFS的独立保护因素;预处理前高LDH和回输前活动性EMD是影响患者RFS的独立危险因素。回输后Treg细胞水平与CRS等级无明显相关性,但与CAR-T细胞在患者外周血存留时间呈负相关（R=-0.579,P=0.019）。（4）CAR-T细胞治疗缓解后进行造血干细胞移植的患者较未移植的患者有更长的RFS和OS,两组在年龄、既往复发次数存在差异,在性别、肿瘤负荷、活动性髓外病变及回输前后外周血CD4+Treg细胞的表达方面无明显差异。结论复发/难治性B-ALL患者体内存在严重的T细胞亚群分布失衡,尤其是存在异常升高的Treg细胞。回输CAR-T细胞前及回输后1周时患者外周血异常升高的Treg细胞可以预测CAR-T细胞治疗的疗效及复发,且回输后1周时的Treg细胞预测价值更大。此外,回输前后患者体内的Treg细胞水平与CAR-T细胞治疗不良反应无明显关联,但与患者体内CAR-T细胞的存留时间呈负相关关系。CAR-T细胞治疗后行造血干细胞移植有益于减少B-ALL的再复发、提高生存,在一定程度上可能纠正或逆转Treg细胞异常升高所致的不良预后。综上,我们认为复发/难治性B-ALL患者体内异常升高的Treg细胞能影响CAR-T细胞治疗效果,并可能成为今后提高CAR-T细胞治疗疗效、降低复发的重要靶点。
李美蓉[4]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究指明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
王伟伟[5]（2020）在《多参数流式细胞术检测急性髓系白血病免疫表型及临床应用》文中提出背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是急性白血病（acute leukemia,AL）的一种常见类型,属于造血系统恶性肿瘤,成人多见。AML发病迅速,临床出现不同程度的发热,出血,贫血,骨痛及淋巴结、肝、脾肿大,可危及患者生命。该类疾病患者机体髓系白血病细胞异常克隆增殖,分化成熟障碍,并伴有凋亡减少,髓系白血病细胞在细胞形态,治疗反应及预后均具有较强的异质性[1],法美英（FAB）协作组诊断标准-形态学检查是AML诊断的基础,但人为主观性较大,已不能满足临床诊疗的需要。目前AML诊断分型现多采用MICM有机结合来诊断AML。随着流式细胞术（flow cytometry,FCM）的快速发展,FCM以其高通量、客观且对样本要求低等优势已成为AML诊断不可缺少的方法,该项技术能快速准确检测出AML细胞的系列,抗原分布情况及分化阶段,对指导临床诊断,分层治疗及预后判断具有重要意义[2]。目前关于AML细胞分化抗原表达分析研究较多,而对预后疗效相关的白血病细胞分化抗原尤其是非髓系分化抗原表达与预后疗效完全缓解（complete remission,CR）率之间关系的文献报道较少且缺乏系统性研究。目的研究分析AML免疫表型和非髓系分化抗原表达特征,探讨AML细胞分化抗原表达与预后疗效的关系。方法根据诊断需求,设计抗体组合方案,采用BD FACSCalibur流式细胞仪,通过Cellquest软件分析,以CD45联合侧向散射光SSC设门,对109例AML进行免疫表型检测。采用SPSS18.0统计学分析软件χ2检验,分析比较AML相关抗原表达呈阳性和阴性者的CR率;比较伴AML1-ETO阳性表达的15例AML-M2b中CD56阳性和CD56阴性两组患者1疗程缓解率及1年内复发率。结果1.免疫表型显示AML细胞髓系分化抗原阳性率由高到低依次为CD13,CD117,CD33,MPO,CD15,其中CD117,CD13,CD33,MPO阳性率差异无统计学意义（P>0.05）,并且均高于CD15阳性率（均P<0.05）。2.AML细胞非系列特异性抗原CD34,CD38,HLA-DR,CD123阳性率差异亦无统计学意义（P>0.05）。3.AML细胞非髓系分化抗原CD9,CD200,CD56,CD7阳性率依次降低,均高于CD25,CD19,CD2,CD10,CD4,Cy CD79a,Cy CD3阳性率（均P<0.05）,Cy CD3未见表达;AML亚型中M5非髓系分化抗原的种类和阳性率频度较多,M3型CD9阳性高频高强度率表达。4.109例AML患者接受化疗后,预后达到CR者为71例,CR率为65.1%。109例AML中CD7,CD34,CD56,CD25呈阳性的患者CR率依次为44.1%（15/34）,45.8%（44/96）,43.8%（21/48）,37.5%（6/16）,并且均低于表达阴性患者的CR率70.7%（53/75）,76.9%（10/13）,75.4%（46/61）,62.4%（60/93）,并且差异均具有统计学意义（χ2=7.027,P=0.008;χ2=4.427,P=0.035;χ2=11.368,P=0.001;χ2=4.171,P=0.041）;MPO,CD19表达呈阳性AML患者的CR率分别为70.9%（66/93）,61.5%（8/13）,均高于阴性者的31.3%（5/16）,31.3%（30/96）,并且差异均具有统计学意义（χ2=9.483,P=0.002;χ2=4.625,P=0.032）。5.伴AML1-ETO阳性表达的15例AML-M2b患者中CD56阳性组1疗程CR率低于CD56阴性组,CD56阳性组1年内复发率高于CD56阴性组,差异均具有统计学意义（χ2=5.000,P=0.025;χ2=5.000,P=0.025）。结论免疫学分型及非髓系分化抗原表达分析对AML的诊断及预后判定有重要临床意义,是AML诊疗的主要依据之一。
赵飞[6]（2020）在《外周血淋巴细胞的形态及亚群特点与非霍奇金淋巴瘤诊断的相关性研究》文中研究指明目的:探讨外周血异型淋巴细胞的形态和比例特点及TB淋巴细胞亚群测定与成人非霍奇金淋巴瘤（NHL）之间的关系。方法:选取河北北方学院附属第一医院2017年9月-2018年9月收治的32例初诊的成人非霍奇金淋巴瘤患者资料（所有非霍奇金淋巴瘤患者均经过淋巴结病理确诊）,其中男21例,女11例;年龄28～87岁,平均（60.59±11.98）。同期选择77例成人淋巴结炎患者的资料,其中男33例,女40例;年龄18～63岁,平均（44.43±11.40）;小儿EB病毒25例资料,其中男14例,女11例,年龄2个月～16岁,平均（5.12±5.01）。小儿其他病原体感染者36例资料,其中男21例,女15例,年龄2个月～14岁,平均（3.94±3.86）;40例体检结果为正常健康者资料作为阴性对照组,其中男22例,女18例,年龄9～52岁,平均（33.42±16.92）。各组间性别、年龄均无显着差异。所有入选者均签署医院科研伦理知情同意书。分别对其EDTA-K2抗凝的外周血液标本开展外周血白细胞分类计数和TB淋巴细胞亚群检测,比较各组TB淋巴细胞亚群检测的水平,并分析之间的关系;观察成人淋巴瘤患者年龄分布的特点与外周血异型淋巴细胞分布的情况,分析两者之间的相关性。结果:1、成人NHL组外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、NK细胞比例、异型淋巴细胞比例以及CD4+/CD8+比值分别为59.12±27.40%、24.25±11.90%、34.93±17.01%、20.84±19.30%、11.90±10.98%、21.59±11.37%、0.79±0.43。成人NHL组外周血CD3+T、CD4+T、NK细胞比例、CD4+/CD8+均低于淋巴结炎组和健康对照组（p<0.05）,CD8+T细胞和异型淋巴细胞比例高于淋巴结炎组和健康对照组（p<0.05）;CD19+B细胞比例与淋巴结炎组及健康对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）;2、小儿EB病毒组外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、NK细胞比例、异型淋巴细胞比例以及CD4+/CD8+比值分别为72.44±10.27%、27.80±7.71%、38.48±14.16%、14.40±6.14%、13.76±4.70%、8.76±7.21%、0.85±0.40%。小儿EB病毒组与其他病原体组和健康对照组比较CD3+T细胞、CD8+T细胞比例增多,CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+比例降低,差异均有统计学意义（p<0.05）;异型淋巴细胞比例高于其他病原体组和健康对照组,差异有统计学意义（p<0.05）;CD19+B细胞和NK细胞比例与其他病原体组和健康对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）;3、成人非霍奇金淋巴瘤患者的年龄与其外周血异型淋巴细胞百分比呈正相关（r=0.478,p<0.05）;4、成人NHL组外周血涂片分类中以Ⅱ型异型淋巴细胞（不规则型）多见,处在婴幼儿阶段的EB病毒感染者以Ⅲ型（幼稚型）多见;5、各实验组之间EB病毒相关抗体检测结果除小儿EB病毒感染组中的EB病毒衣壳抗原抗体Ig M（VCA-Ig M）与其他组比较差异具有统计学意义（p<0.05）之外,EB病毒衣壳抗原抗体Ig G（VCA-Ig G）、早期抗原抗体（EA-Ig G）、核心抗原（EBNA）均未见明显差异（p>0.05）。结论:1、成人非霍奇金淋巴瘤患者的细胞免疫功能低下;2、成人非霍奇金淋巴瘤患者的年龄与其外周血异型淋巴细胞百分比呈正相关;3、外周血异型淋巴细胞比例增高者或者反复的EB病毒感染者有潜在的发展为恶性非霍奇金淋巴瘤的可能,应该动态监测淋巴细胞亚群的变化或者是完善影像学检查如B超等减少漏诊和误诊。
涂宏蕾[7]（2020）在《运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用》文中进行了进一步梳理目的:血液恶性肿瘤的免疫治疗在近几年已经实现了重大的突破。然而,部分患者免疫治疗后出现耐药和复发,不同患者或同一患者不同阶段,对相同免疫疗法反应不同,存在严重异质性,然而,我们现阶段,对免疫治疗异质性的理解还严重不足。传统的研究方法是基于大样本,从整体水平来研究肿瘤对治疗的反应,而忽视了单个免疫细胞活性状态的差异,免疫突触的形成,免疫细胞对肿瘤靶细胞的识别,以及免疫细胞杀伤效率存在异质性的问题。为了克服这个缺陷,本课题基于急性髓系白血病（AML）免疫治疗的需求,设计了能在单细胞层面观察免疫细胞和白血病细胞相互识别,相互作用的微流控芯片。运用该微流控芯片,能够精确控制白血病细胞和T细胞的数量和比例,以及所处的内环境,同时,利用微流控芯片高通量的优点,能够一次追踪大量的T细胞与白血病细胞之间动态的相互作用。我们期望我们建立的单细胞研究平台在未来,有潜力可以作为辅助诊断工具,更好的评估患者接受过继性免疫细胞疗法的疗效以及异质性,为临床个体化的免疫治疗方案的设计提供技术支持。方法:1.设计并制备一种微流控芯片,与细胞原位孵育系统及显微镜延时成像系统（time-lapse imaging）整合,追踪T细胞和白血病细胞的动态运动轨迹,以定量分析T细胞的效应功能。2.通过调控输入细胞浓度的初始浓度,从1?106/m L-20?106/m L,以及不同的效靶比,以使单个微流控芯片井中获得最佳的T细胞-白血病细胞对。3.选择OT-I＿OVA体系用于体外单细胞研究抗原提呈,T细胞活化。细胞分组情况如下:（1）阳性对照组:OT-I＿C1498-OVA+;（2）阴性对照组:Na?ve T细胞＿C1498-OVA+,Na?ve T来自于普通C57BL/6小鼠的脾脏;（3）阴性对照组:OT-I＿C1498-OVA-。4.Fluo-4钙离子荧光探针预处理OT-I细胞,研究T细胞免疫突触形成的异质性。5.充分混合的OT-I细胞和C1498细胞悬浮液中加入小鼠来源抗PD-1抗体,来研究免疫检查点抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响。实验分两组:（1）治疗组:OT-T＿C1498+PD-1抗体;（2）对照组:OT-T＿C1498。结果:1.我们发现OT-I＿C1498-OVA+组显示出明显更高的细胞死亡,且随时间不断增加,显着高于Na?ve T细胞＿C1498-OVA+和OT-I＿C1498-OVA-组,5小时内三组的细胞死亡率分别为32.89%,16.09%和14.75%。63.28%的OT-I细胞能够在5小时内杀死了一个或多个OVA+的白血病细胞（C1498）,对OVA-的C1498细胞,仅有9.51%的OT-I细胞能够识别并且发挥细胞毒作用,同样,Na?ve T细胞对C1498细胞基本不能识别,仅表现了非特异性杀死,杀伤率为8.30%,后两组比较（OT-I＿C1498-OVA-和Na?ve T细胞＿C1498-OVA+）没有明显的统计学差异。2.由于T细胞抗原受体的参与和T细胞活化,同一来源的单个T细胞发挥细胞毒性所需的时间具有很强的异质性。51%的OT-I细胞能够在50分钟内杀死白血病C1498细胞。只有16.3%的OT-I细胞能够在20分钟内杀死白血病细胞,在20-30分钟之间杀死白血病细胞的T细胞占14.5%。自T细胞的激活,18.2%的T细胞需要大于等于60分钟才能杀死白血病C1498细胞。3.T细胞发挥杀伤作用时,T细胞与白血病细胞之间的初始距离从0μm到18μm不等。当T细胞和C1498细胞直接接触时,有85%的C1498细胞被杀死,而初始距离在1至15μm之间时,有15%的C1498细胞被杀死。4.同种来源的T细胞杀伤能力的异质性:有54.5%的T细胞在5小时内杀死了1个白血病细胞,而有4.9%的T细胞杀死了2个白血病细胞,只有0.78%的T细胞杀死了3个或更多的白血病细胞,剩余占39.8%的T细胞没有杀死任何白血病细胞。5.从最初的白血病细胞与T细胞相互接触到白血病细胞死亡,我们总共分析了522个被T细胞杀死的白血病细胞。细胞死亡时间从20分钟到300分钟不等,重要的是,自T细胞与靶细胞最初接触,有90%的杀伤发生在相互接触90分钟之后。白血病细胞死亡数量最多是发生在接触后3.5小时到4小时,占死亡总数的22.4%。6.我们分析了对照组中1024个OT-I细胞的杀伤效率和有PD-1抗体的实验组中的777个OT-I细胞的杀伤效率。结果显示:微环境中加入PD-1抗体后,OT-I细胞在5小时内的杀伤效率明显增强,并且PD-1抗体能部分加速T细胞对靶细胞的杀伤。在3.5小时的时候,对照组和治疗组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为37.52%±5.33 vs 61.48%±7.86（p<0.05）;在5小时的时候,两组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为63.28%±2.93 vs 73.04%±3.7（p<0.05）。7.在5小时内,在对照组中,没有发挥细胞毒性的T细胞占总T细胞的39.8%。而在使用了PD-1抗体的实验组中,仅有27.3%的T细胞没有发挥细胞毒性,明显低于对照组（p<0.05）。此外,在对照组中,分别杀死1、2和3个白血病C1498细胞的T细胞分别占统计的总的T细胞数量的54.47%,4.92%和0.77%,均明显低于加入了PD-1抗体的治疗组,治疗组结果为:60.77%,10.53%和1.43%。8.在行免疫检查点（PD-1）抑制治疗后,在对照组（没有用PD-1抗体）中,在2小时内被T细胞攻击致死的C1498细胞数量占死亡总数的12.06%,而在治疗组中,2小时内被杀死细胞的比例为30.85%。在治疗组中,当C1498细胞与T细胞接触时间在3-3.5之间,细胞死亡的比例达到最大,比对照组的3.5-4小时达到最大比例提前了半小时。结论:使用我们的微流控芯片和OT-I＿OVA系统能够很好的体外观察T细胞的抗原识别,杀伤,具备在单细胞水平研究T细胞-靶细胞相互作用的异质性的可行性。本研究成功阐述了单个免疫细胞-靶细胞的异质性,以及免疫检查点抑制（PD-1/PD-L1）对细胞异质性的影响。此外,从方法学来看,这项研究基于微流控芯片,为探讨细胞间间隙连接,细胞内脂质变化,旁分泌以及细胞耐药提供了一个新的技术平台。此平台具有方便,快速,高通量和易操作的优点。能够为研究疾病的早期诊断以及细胞间的相互作用提供帮助。该技术平台为在单细胞水平上研究癌症免疫治疗的疗效和耐药性开辟了新的途径,增强我们对癌症免疫治疗基础理论的探索,为设计个性化的癌症免疫疗法提供理论支持。
陈晓晨[8]（2020）在《PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究》文中指出研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治（R/R）DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体（PD-1）是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法（1）应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血（40例）和淋巴结（30例）T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆（40例）可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组（正常人群及淋巴结反应性增生患者）对比,分析PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征（病理亚型,IPI评分）亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。（3）建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果（1）与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降（45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036）,而CD8+T细胞比例则相应升高（43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045）,且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023）。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降（23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002）;CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显着性（P>0.05）,但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001）。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升（4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002）,PD-L1水平也明显上升（1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039）。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征（病理亚型,IPI评分）相关;生存分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组（P<0.05）;动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效（PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%）,总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感（P<0.05）;免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好（P<0.05）。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显（CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001）。（3）成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加（30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001）,且其TIM-3表达明显下调（20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001）;体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组（P<0.05）;凋亡明显低于另外两组（P<0.05）;PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组（P<0.05）。结论（1）DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征（病理亚型,IPI评分）及生存（OS/PFS）密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。（3）BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达（IL-2、IFN-γ及TNF-α）等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。
郭玉萍[9]（2020）在《中晚期宫颈癌淋巴细胞KLRG1、2B4的表达及SALL4特异性免疫反应及其临床意义》文中指出目的:1)回顾性分析2015年1月至2019年6月新疆医科大学附属肿瘤医院中晚期宫颈鳞癌患者外周血T细胞亚群与临床特征、预后的关系。2)KLRG1、2B4在中晚期宫颈癌患者中的表达情况与临床特征及预后的相关性。3)分析中晚期宫颈癌患者SALL4特异性CD4、CD8+T细胞IFN-γ、IL-13、IL-2、MIP-1β、TNF-α的水平。方法:1)收集新疆医科大学附属肿瘤医院经组织病理证实的IIB～IVA期宫颈鳞癌患者393例,分析患者外周静脉血T细胞亚群与临床特征及预后的关系。2)收集新疆医科大学附属肿瘤医院初次治疗的68例IIB～IVA期宫颈鳞状细胞癌患者的外周静脉血和宫颈癌组织标本。采用流式细胞术检测患者宫颈癌组织及初治和治疗结束时外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞表达KLRG1、2B4的情况。分析外周静脉血和癌组织CD4+T细胞、CD8+T细胞表达KLRG1、2B4水平的差异,进一步分析KLRG1、2B4的表达与宫颈癌患者临床特征和预后的相关性,为中晚期宫颈鳞癌患者放疗联合免疫治疗、制定个体化治疗方案提供理论基础。3)经SALL4抗原肽刺激IIB～IVA期宫颈鳞癌患者和健康对照者PBMCs,采用胞内细胞因子染色的方法,检测IFN-γ、IL-13、IL-2、MIP-1β、TNF-α的表达情况。结果:1)IIB～IVA期宫颈鳞癌患者T细胞亚群分析检测结果显示,CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T与宫颈癌临床分期、肿瘤直径有关（P<0.05）。肿瘤FIGO分期越晚、肿瘤直径越大,CD8+T细胞越高,CD4+T/CD8+T比值越低;SCC-Ag水平越高,宫颈鳞癌患者外周血CD8+T细胞越高。SCC-Ag水平与肿瘤FIGO分期、肿瘤直径、淋巴结转移和HPV感染有关。肿瘤FIGO分期越晚、肿瘤直径越大、淋巴结转移和HPV阳性的患者,SCC-Ag水平越高。Log-rank单因素分析结果显示,FIGO分期、肿瘤直径和治疗方式对患者的无病生存期PFS有显着影响（P<0.001）。肿瘤FIGO分期（P<0.001）、肿瘤直径（P=0.004）和治疗方式（P<0.001）对患者的OS有显着影响。COX多因素分析结果显示,BMI值、肿瘤FIGO分期、治疗方式和HPV感染是影响患者PFS的独立因素。BMI值、肿瘤FIGO分期、治疗方式和SCC-Ag是影响患者OS的独立因素。CD4+T、CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T对患者PFS、OS无显着影响。2)宫颈癌患者外周静脉血标本CD8+T细胞KLRG1的表达水平显着高于健康对照者（P=0.0056）。2B4在宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞上的表达显着高于健康对照者（P=0.0441）。KLRG1在宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞上的表达水平显着高于在癌组织中的表达（P<0.0001）。2B4在宫颈癌患者外周静脉血CD4+T细胞上的表达水平高于宫颈癌组织中的表达水平（P=0.0003）。KLRG1在CD4+T和CD8+T细胞上的表达与临床特征的关系显示:KLRG1在CD8+T细胞表达与年龄和HPV感染有关。68例宫颈癌患者中位年龄54岁,KLRG1在年龄≥54岁的宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞的表达量为65.58%,要显着高于年龄<54岁的患者50.55%（P=0.001,95%CI:0.0698,0.2394）。HPV阴性的宫颈癌患者CD8+T细胞上的KLRG1的表达为66.27%,要显着高于HPV阳性的宫颈癌患者55.77%（P=0.026,95%CI:-0.1962,-0.2393）。2B4在CD8+T细胞的表达与年龄、是否绝经有关。2B4在年龄≥54岁的宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞的表达量为64.94%,要显着高于年龄<54岁的患者78.10%（P<0.001,95%CI:0.06023,0.2068）。绝经的宫颈癌患者CD8+T细胞上的KLRG1的表达为94.99%,要显着高于未绝经的宫颈癌患者63.76%（P=0.006,95%CI:-0.1915,-0.0331）。宫颈癌组织CD8+T细胞KLRG1的表达与淋巴结转移密切相关,KLRG1在盆腔淋巴结阳性宫颈癌组织CD8+T细胞表面的平均表达为34.41%,盆腔淋巴结阴性患者的平均表达水平22.97%,KLRG1在盆腔淋巴结阳性宫颈癌组织CD8+T细胞上的表达水平更高（P=0.016,95%CI:-0.2068,-0.02206）。有34例宫颈癌患者搜集了治疗结束时外周静脉血标本,分析显示KLRG1在CD4+T（P=0.0158）和CD8+T（P=0.0187）细胞上的表达水平,较放疗前显着降低。KLRG1在宫颈癌组织CD4+T细胞上高表达的患者,客观有效率更低。3)中晚期宫颈鳞癌患者CD4+T细胞IL-2、IL-13、IFN-γ、TNF-α高于健康对照者,差异具有统计学意义（P<0.05）,MIP-1β的表达差异不具有统计学意义（P=0.827）。中晚期宫颈鳞癌患者CD8+T细胞IL-2高于健康对照者,差异具有统计学意义（P=0.019）,IL-13、IFN-γ、TNF-α和MIP-1β差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:1)CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T与宫颈癌临床分期、肿瘤直径有关。肿瘤FIGO分期越晚、肿瘤直径越大的患者,CD8+T细胞表达越高,CD4+T/CD8+T比值越低。宫颈癌患者BMI值、肿瘤FIGO分期、治疗方式是影响患者PFS和OS的重要因素。CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T对患者的PFS和OS无显着影响。2)在中晚期宫颈鳞癌患者的外周静脉血和癌组织CD4+T、CD8+T细胞上均能检测到KLRG1和2B4的表达。宫颈癌组织中CD8+KLRG1+T细胞的表达量随着CD4+KLRG1+T表达量的升高而升高。KLRG1在外周静脉血CD8+T细胞的表达与患者年龄、HPV感染密切相关。KLRG1在宫颈癌组织CD8+T细胞的表达与盆腔淋巴结转移密切相关。2B4在外周静脉血CD8+T细胞表面的表达与年龄、绝经史密切相关。放疗可引起宫颈鳞癌患者机体免疫系统变化,放疗后KLRG1在CD4+T和CD8+T细胞上的表达水平较放疗前显着降低。为宫颈癌放疗联合免疫治疗提供指导意义。3)采用SALL4抗原肽刺激中晚期宫颈鳞癌患者PBMCs,SALL4抗原肽可能成为宫颈癌的有效细胞刺激物。中晚期宫颈鳞癌患者CD4+T细胞IL-2、IL-13、IFN-γ、TNF-α高于健康对照者,中晚期宫颈鳞癌患者CD8+T细胞IL-2高于健康对照者。采用胞内细胞因子染色技术可较精准地确定中晚期宫颈鳞癌患者分泌多种细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群比例及功能改变。
赵芳芳[10]（2020）在《自噬介导的日本脑炎DNA疫苗免疫增强效应及机制研究》文中认为目的:探讨自噬介导的日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）DNA疫苗免疫增强效应及机制,为新型JE疫苗的研发提供新的思路。研究方法:1.pJME-LC3的构建及鉴定根据GenBank检索到的小鼠LC3B基因序列,利用RT-PCR法合成LC3B基因,重组至含JEV prME蛋白编码基因的pJME构建重组质粒,命名为pJME-LC3,BamH I/EcoR I双酶切、测序鉴定;脂质体法将pJME-LC3按不同时间、不同浓度转染CHO-K1细胞,western blot法检测prME-LC3融合蛋白的表达;用G418对pJME-LC3转染CHO-K1细胞进行筛选,光镜下观察抗性克隆株的形成,western blot法检测数代稳定转染株细胞中prME-LC3的表达;将pJME-LC3转染至CHO-K1细胞,光镜下观察自噬性细胞集落的形成,透射电镜观察细胞内自噬小体的形成,western blot法检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ及底物蛋白p62的表达;用HBAD-GFP-LC3及pJME-LC3处理细胞,间接免疫荧光法标记后通过共聚焦显微镜观察prME-LC3融合蛋白与内源性LC3蛋白在自噬体中共定位。2.动物分组及免疫120只BALB/c鼠随机分为6组,其中pcDNA3.1（+）阴性对照组、pJME常规DNA疫苗对照组、pJME-LC3实验组及药物抑制自噬活性的pJME-LC3+3-MA组给予相应质粒100μg/100μL肌注,其余两组分别接受PBS（100μL肌注）或100μL JEV-L腹腔注射,共免疫3次,每次间隔两周,pJME-LC3+3-MA组从首次免疫开始至末次免疫结束每天加用60μg自噬抑制剂3-MA腹腔注射。3.病毒攻击第一批:每组15只BALB/c鼠共6组,免疫流程同前;第二批:每组20只BALB/c鼠共6组,其中PBS（100μL肌注）,pcDNA3.1（+）、pJME、pJME-LC3及pJME-LC3+3-MA组分别200μg/100μL肌注,JEV-L组100μL腹腔注射,具体免疫流程同前。pJME-LC3+3-MA组从首次免疫开始至末次免疫结束每天加用60μg自噬抑制剂3-MA腹腔注射。末次免疫后3周,小鼠腹腔注射JEV（野生强毒株YN2016-1,105PFU/500μL）进行病毒攻击。4.JE DNA疫苗pJME-LC3免疫效应及机制研究末次免疫后3周,每组20只小鼠断颈处死,无菌取脾脏分离淋巴细胞及DCs。间接免疫荧光法观察prME-LC3融合蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达;流式细胞术分析免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran能力及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群;乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测免疫鼠JEV特异性CTL活性;每次免疫后间隔一周及末次免疫后连续三周（第1、3、5、6、7w）采集免疫鼠外周血分离血清,ELISA法检测免疫鼠脾脏淋巴细胞经JEV刺激后分泌细胞因子（IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-12）水平及血清样本中JEV特异性IgG1/IgG2a抗体相对滴度;Western blot法检测IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet中信号通路蛋白及下游转录因子T-bet的表达。5.JE DNA疫苗pJME-LC3免疫记忆及保护性免疫研究流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD4+/CD8+记忆性T淋巴细胞亚群;攻毒后3周内观察各组小鼠状态及存活数量,并计算存活率;80%空斑减少中和试验（PRNT80）检测免疫鼠血清中和抗体滴度。结果:1.成功构建pJME-LC3测序分析结果显示:JEV prME蛋白及LC3B蛋白编码基因与GenBank检索到的基因序列相符。琼脂糖凝胶电泳显示:pJME-LC3经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后释出的DNA片段之一与LC3B基因（390bp）大小一致,另两个片段与pJME经相同酶切后释出的基因片段pcDNA3.1（+）（5428bp）及prME（2001bp）大小一致,提示重组质粒pJME-LC3构建成功。2.pJME-LC3编码蛋白在CHO-K1细胞内快速及稳定表达prME-LC3融合蛋白在转染后12h即有大量表达,且随作用时间（12-36h）及质粒浓度（1-4mg/mL）的增加而上升;G418对pJME-LC3转染后抗性克隆株进行筛选,发现pr ME-LC3融合蛋白蛋白能够在数代抗性克隆株细胞内稳定表达而未出现衰减现象。3.pJME-LC3促进CHO-K1细胞自噬活性增加光镜下pJME-LC3组自噬性细胞集落形成明显多于pJME组,作用与Rapamycin相似;透射电镜下pJME-LC3组细胞内自噬小体数量多于pJME组;western blot检测pJME-LC3组自噬标志蛋白LC3 II明显高于pJME组,而作为自噬底物的负性调节蛋白p62的表达则呈相反趋势。4.pJME-LC3编码蛋白与CHO-K1细胞内源性LC3蛋白共定位于自噬体共聚焦显微镜下pJME-LC3组用于标记细胞内源性LC3蛋白的绿色荧光呈颗粒状聚集于胞浆及胞膜,并与红色荧光标记的质粒编码蛋白共定位于自噬体呈现融合的黄色荧光,而pJME组绿色荧光弥散存在于胞浆中,且未与红色荧光融合。5.pJME-LC3促进质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达荧光显微镜下观察发现:作为常规JE DNA疫苗对照的pJME组少量DCs胞浆中可见质粒编码蛋白表达;pJME-LC3实验组大量DCs胞浆中均可见质粒编码蛋白表达;而pJME-LC3+3MA自噬活性抑制组仅有少量DCs胞浆中质粒编码蛋白表达;作为阴性对照的pcDNA3.1（+）空载体组DCs中未见质粒编码蛋白表达。6.pJME-LC3促进免疫鼠脾脏DCs内吞能力pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran的能力明显强于JEV-L对照组（P<0.05）,作为常规DNA疫苗对照的pJME组（P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（P<0.05）,后3组两两之间差异无统计学意义。7.pJME-LC3增加CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞数量pJME-LC3实验组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（45.66±5.04）%,明显高于其它组（P<0.05）;作为常规DNA疫苗对照的pJME组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（37.40±5.23）%,与JEV-L对照组（35.84±2.75）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（34.46±3.87）%两两之间无显着性差异;作为阴性对照的pcDNA3.1（+）组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（26.38±4.69）%,与PBS空白对照组（25.25±3.82）%基本一致,均低于其它组（P<0.05）。pJME-LC3实验组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（30.23±1.43）%,明显高于其它组（P<0.05）;作为常规DNA疫苗对照的pJME组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（15.89±1.45）%,与JEV-L对照组（15.07±0.96）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（13.42±1.58）%两两组间差异无统计学意义;PBS空白对照组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（9.98±1.80）%,与作为阴性对照的pcDNA3.1（+）阴性对照组基本一致,显着低于其它组（P<0.05）。8.pJME-LC3增加JEV特异性CTL活性当设效应靶细胞:靶细胞为10:1时,LDH释放法对不同免疫组小鼠脾细胞JEV特异性CTL活性检测的结果显示:pJME-LC3组CTL杀伤活性为（55.72±2.34）%,显着高于JEV-L对照组（39.43±2.85）%,pJME常规DNA疫苗对照组（37.88±2.47）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（28.96±3.21）%,差异有统计学意义（P<0.05）。9.pJME-LC3促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子pJME-LC3实验组T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ水平为（48.26±5.47）pg/mL,显着高于JEV-L对照组的（19.45±5.76）pg/mL（P<0.01）、pJME常规DNA疫苗对照组（35.09±7.16）pg/mL（P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（33.64±4.80）pg/mL（P<0.05）,而后3组中JEV-L组明显低于其它2组,差异均有统计学意义（P<0.05）;PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组IFN-γ水平分别为（5.65±1.28）pg/m L、（7.82±1.94）pg/mL,均低于其它组（P<0.05）。IL-12在pJME-LC3实验组为（62.19±9.75）pg/mL,显着高于作为常规DNA疫苗对照的pJME组（44.61±7.49）pg/mL（P<0.05）、pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（39.88±9.04）pg/mL（P<0.05）及JEV-L对照组（29.64±6.32）pg/mL（P<0.01）,而后3组中JEV-L组明显低于其它2组,差异均有统计学意义（P<0.05）;作为空白对照的PBS组、pcDNA3.1（+）阴性对照组IL-12水平分别为（15.24±4.21）pg/mL、（16.90±6.46）pg/mL,均低于其它组（P<0.05）。细胞因子IL-4、IL-10水平在各组间无显着性差异（P>0.05）。10.pJME-LC3促进JEV特异性IgG2a抗体生成根据各样本孔OD值评估IgG1抗体相对滴度发现:PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组在初次免疫后1、3、5、6、7周无明显变化,均低于其它免疫组,且各时间点两组间无显着性差异;JEV-L对照组、pJME常规DNA疫苗对照组、pJME-LC3实验组及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组IgG1抗体相对滴度均随免疫时间延长逐渐上升,在初次免疫后第1、3、5、6、7周两两组间差异均统计学意义。IgG2a抗体相对滴度自初次免疫后1、3、5、6、7周在PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组均处于低水平,各时间点数值无显着性差异;pJME-LC3实验组IgG2a抗体滴度快速上升,至初次免疫后第7周达到最高值,而JEV-L对照组、pJME常规DNA疫苗对照组及自噬活性抑制的pJME-LC3+3-MA组在初次免疫后1、3、5、6周IgG2a抗体上升速度及绝对值均低于pJME-LC3实验组,且在第7周出现衰减。11.pJME-LC3促进脾脏T淋巴细胞pJAK2、pSTAT1蛋白及转录因子T-bet的表达pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏T淋巴细胞中pJAK2、pSTAT1蛋白及转录因子T-bet的表达均显着高于作为减毒疫苗对照的JEV-L组、pJME常规DNA疫苗对照组及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组,差异有统计学意义（P<0.01）;而后3组之间无显着性差异;PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组与JEV-L组3种蛋白的表达量无显着性差异。12.pJME-LC3促进BALB/c鼠CD4+、CD8+TCM/TEM比值CD4+TCM/TEM比值在pJME-LC3实验组为（2.34±0.79）,高于pJME常规DNA疫苗对照组（1.93±0.64,P<0.05）、JEV-L对照组（1.58±0.27,P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（1.56±2.02,P<0.05）;后3者之间差异无统计学意义;CD4+TCM/TEM在作为空白对照的PBS组（0.94±0.59）与pcDNA3.1（+）阴性对照组（0.99±0.37）中比值基本一致,均低于其它组（P<0.05）。CD8+TCM/TEM比值在pJME-LC3实验组为（0.62±0.30）,高于pJME常规DNA疫苗对照组（0.40±0.29,P<0.05）、JEV-L对照组（0.36±0.13,P<0.05）、pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（0.36±0.21,P<0.05）;而CD8+TCM/TEM比值在PBS空白对照组为（0.28±0.17）与pcDNA3.1（+）阴性对照组的（0.27±0.05）基本一致,均低于其它组（P<0.05）。13.pJME-LC3促进JEV特异性中和抗体快速、持续生成pJME-LC3实验组小鼠血清中和抗体效价早在攻毒前2天即有升高（1:20）,攻毒后14天达到1:160,此外其余各组中和抗体滴度均在攻毒后21天下降,而pJME-LC3实验组未见衰减。提示pJME-LC3免疫组小鼠血清抗体产生速度、效价增长速度、效价绝对值、抗体效价持续时间均优于pJME常规DNA疫苗对照组、JEV-L对照组或pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组。14.pJME-LC3增强对JE BALB/c鼠的保护性免疫用JEV野生强毒株YN2016-1对小鼠进行攻击后第2天,大部分小鼠开始有不同程度的毛色晦暗潮湿、食欲不振、体重减轻等症状,之后陆续出现死亡。至攻毒后第21天,第一批:pJME-LC3实验组存活率为（13/15,86.67%）,高于JEV-L对照组（12/15,80%）,pJME常规DNA疫苗对照组（8/15,53.33%）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（7/15,46.67%）。第二批:pJME-LC3实验组存活率为（91.67±2.36）%,显着高于JEV-L组（81.67±2.36）%,pJME组（61.67±2.36）%及pJME-LC3+3-MA组（56.67±2.36）%。结论:1.构建的pJME-LC3可在体外快速、稳定表达,激活自噬并将prME-LC3融合蛋白传递至细胞自噬途径;2.pJME-LC3促进DCs对prME-LC3融合蛋白的摄取,并通过提高免疫鼠脾CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞数量增强JEV特异性的CTL活性;3.pJME-LC3通过增加Th1型细胞因子分泌水平诱导Th1型细胞免疫应答,同时促进以IgG2a为主体的体液免疫应答;4.pJME-LC3通过IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet途径促进初始CD4+T淋巴细胞向Th1型细胞分化,可成为自噬介导JE DNA疫苗免疫增强效应机制之一;5.pJME-LC3通过增加JEV特异性CD4+、CD8+TCM/TEM比例,诱导长效免疫记忆;6.pJME-LC3通过促进JEV特异性中和抗体的快速、持续生成诱导强效免疫保护。
二、胞浆CD_3检测在早期T淋巴细胞白血病诊断中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胞浆CD_3检测在早期T淋巴细胞白血病诊断中的应用（论文提纲范文）
（1）ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分: 肺腺癌中ILT4过表达与免疫抑制性T细胞亚群浸润及患者的不良预后相关 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 肿瘤源性ILT4通过抑制T细胞增殖及诱导T细胞凋亡介导肿瘤免疫逃逸 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌与免疫抑制细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（2）外周血流式细胞术在皮肤淋巴组织肿瘤诊断中的临床应用（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 外周血流式细胞术在蕈样肉芽肿/Sézary综合征及其相关红皮病诊断中的临床应用 |
| 第一章 外周血流式细胞术在蕈样肉芽肿/Sézary综合征中的临床应用 |
| 引言 |
| 对象(材料)与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 外周血流式细胞术在淋巴瘤相关红皮病中的临床应用 |
| 引言 |
| 对象(材料)与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 流式细胞术结合临床病理分析在伴大细胞转化的蕈样肉芽肿诊断中的研究 |
| 引言 |
| 对象(材料)与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 流式细胞术结合临床病理分析在母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤诊断中的研究 |
| 引言 |
| 对象(材料)与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述(非论文相关) Cutaneous manifestations and treatment advances of adult T-cell leukemia/lymphoma |
| References |
| 综述(论文相关) 流式细胞术在皮肤病中的应用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章及参加学术活动情况 |
| 致谢 |
（3）T细胞亚群在急性B淋巴细胞白血病患者外周血中的分布及其对CD19 CAR-T细胞治疗疗效的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 急性B淋巴细胞白血病患者外周血T细胞亚群的变化及意义 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 第二部分 T 细胞亚群对靶向CD19嵌合抗原受体T细胞治疗复发/难治性B-ALL 疗效的影响 |
| 1.引言 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 CAR-T细胞在复发/难治性血液恶性肿瘤中的进展 |
| 参考文献 |
（4）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）多参数流式细胞术检测急性髓系白血病免疫表型及临床应用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 AML概述 |
| 1.2 AML免疫分型概述 |
| 1.3 多参数流式细胞术(MFC)检测AML免疫分型方法介绍 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 技术路线 |
| 3 结果 |
| 3.1 109例AML髓系分化抗原的表达 |
| 3.2 109例AML非系列特异性分化抗原的表达 |
| 3.3 109例AML非髓系分化抗原的表达 |
| 3.4 AML患者的免疫表型与诱导化疗后疗效CR率的关系 |
| 3.5 伴AML1-ETO阳性表达的15例AML-M2b中 CD56 阳性和CD56阴性两组患者1疗程缓解率及1年内复发率比较 |
| 附图 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 创新之处 |
| 7 需要完善补充的工作及进一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 多参数流式细胞术在急性髓系白血病诊断预后中的临床应用及研究进展 |
| 参考文献 |
（6）外周血淋巴细胞的形态及亚群特点与非霍奇金淋巴瘤诊断的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 非霍奇金淋巴瘤临床诊疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词简表 |
| 1 引言 |
| 第一部分 用于AML单细胞研究的微流控芯片的设计与优化 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 芯片的结构和尺寸 |
| 3.2 实验的设置 |
| 3.3 芯片内细胞分布 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 运用微流控芯片在单细胞水平研究AML免疫治疗的异质性 |
| 5 材料与方法 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 本课题中OT-I_OVA细胞体系的选择与验证 |
| 6.2 在微流控芯片上研究T细胞免疫突触形成的异质性 |
| 6.3 T细胞与靶细胞的初始距离对T细胞细胞毒性的影响 |
| 6.4 T细胞与癌细胞的初始比例对T细胞杀伤效率的影响 |
| 7 讨论 |
| 第三部分 免疫检查点(PD-1/PD-L1)抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响 |
| 8 材料与方法 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 9 结果 |
| 9.1 免疫检查点(PD-1)抑制后,T细胞杀伤效率的评估 |
| 9.2 免疫检查点(PD-1)抑制对单个T细胞杀伤能力的影响 |
| 9.3 免疫检查点(PD-1)抑制对单个白血病细胞死亡时间的影响 |
| 10 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 AML患者的免疫机制及治疗进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（8）PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达以及血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| 一、外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第二部分 PD-1阻断策略临床应用于难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| 一、PD-1单抗临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、PD-1基因敲减的CAR-CD19T细胞临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第三部分 小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察及机制研究 |
| 一、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 淋巴瘤免疫治疗的现状及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）中晚期宫颈癌淋巴细胞KLRG1、2B4的表达及SALL4特异性免疫反应及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分:中晚期宫颈癌外周血T细胞亚群与临床特征、预后的关系 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分:KLRG-1、2B4 在中晚期宫颈癌患者中的表达情况与临床特征及预后的相关性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 随访 |
| 1.7 数据分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分:SALL4 抗原肽诱导宫颈癌患者外周血特异性免疫反应研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 随访 |
| 1.7 数据分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫检查点在宫颈癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学硕士/博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（10）自噬介导的日本脑炎DNA疫苗免疫增强效应及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LC3与JEV prME蛋白真核表达重组质粒的构建和鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 RT-PCR法扩增小鼠LC3B基因 |
| 2.3.2 JEV prME蛋白与小鼠LC3B蛋白编码基因重组质粒的构建 |
| 2.3.3 pJME-LC3 转染CHO-K1 细胞及稳定转染细胞株的筛选 |
| 2.3.4 pJME-LC3 编码蛋白及诱导自噬相关蛋白的western blot分析 |
| 2.3.5 结晶紫染色观察pJME-LC3 诱导自噬性细胞集落形成 |
| 2.3.6 透射电镜观察pJME-LC3 诱导自噬小体形成 |
| 2.3.7 共聚焦显微镜观察pJME-LC3编码蛋白与LC3 蛋白在自噬体中共定位 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pJME-LC3 的构建及鉴定 |
| 3.1.1 LC3B蛋白编码基因的合成 |
| 3.1.2 pJME-LC3 的构建、鉴定 |
| 3.2 pJME-LC3 编码蛋白的体外表达 |
| 3.2.1 pJME-LC3 编码蛋白的瞬时表达 |
| 3.2.2 pJME-LC3 编码蛋白的稳定表达 |
| 3.3 pJME-LC3 体外激活自噬 |
| 3.3.1 pJME-LC3 促进自噬性细胞集落的形成 |
| 3.3.2 pJME-LC3 促进CHO-K1 细胞自噬小体的形成 |
| 3.3.3 pJME-LC3 促进CHO-K1 细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 3.4 pJME-LC3 编码蛋白与LC3 蛋白共定位于自噬体 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:自噬增强JE DNA疫苗免疫效应及机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pJME/pJME-LC3 的大量提取与纯化 |
| 2.3.2 BALB/c鼠分组及免疫 |
| 2.3.3 免疫鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 2.3.4 免疫鼠脾脏淋巴细胞和DCs的分离 |
| 2.3.5 间接免疫荧光法检测质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达 |
| 2.3.6 流式细胞术检测免疫鼠脾脏DCs内吞能力 |
| 2.3.7 流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群 |
| 2.3.8 LDH活性释放法检测免疫鼠JEV特异性CTL活性 |
| 2.3.9 ELISA法检测免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子水平 |
| 2.3.10 ELISA法检测免疫鼠血清JEV特异性Ig G1/Ig G2a抗体相对滴度 |
| 2.3.11 Western blot法检测IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet信号通路蛋白表达 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pJME-LC3 促进质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达 |
| 3.2 pJME-LC3 增强免疫鼠脾脏DCs内吞能力 |
| 3.3 pJME-LC3 促进免疫鼠脾脏CD3+CD4+/CD3+CD8+T 淋巴细胞数量 |
| 3.4 pJME-LC3 促进免疫鼠JEV特异性CTLs活性 |
| 3.5 pJME-LC3 促进免疫鼠JEV特异性Ig G2a抗体相对滴度快速、持续升高 |
| 3.6 pJME-LC3 促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-12 |
| 3.7 pJME-LC3 促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞pJAK2、pSTAT1 蛋白及下游转录因子T-bet的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:pJME-LC3 促进BALB/c鼠保护性免疫及免疫记忆的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pJME/pJME-LC3 的大量提取与纯化 |
| 2.3.2 BALB/c鼠分组及免疫 |
| 2.3.3 免疫鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 2.3.4 流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD4+/CD8+记忆性T淋巴细胞亚群 |
| 2.3.5 病毒攻击 |
| 2.3.6 观察各免疫组小鼠存活率 |
| 2.3.78 0%空斑减少中和试验(PRNT80)检测免疫鼠JEV特异性中和抗体滴度 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pJME-LC3 促进免疫鼠CD4+、CD8+TCM/TEM比值 |
| 3.2 pJME-LC3 增强对JE小鼠模型的保护性免疫 |
| 3.3 pJME-LC3 促进JEV特异性中和抗体生成 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、胞浆CD_3检测在早期T淋巴细胞白血病诊断中的应用（论文参考文献）
- [1]ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸[D]. 李青. 山东大学, 2021(10)
- [2]外周血流式细胞术在皮肤淋巴组织肿瘤诊断中的临床应用[D]. 张莹. 北京协和医学院, 2021
- [3]T细胞亚群在急性B淋巴细胞白血病患者外周血中的分布及其对CD19 CAR-T细胞治疗疗效的影响[D]. 潘莹. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [5]多参数流式细胞术检测急性髓系白血病免疫表型及临床应用[D]. 王伟伟. 安徽医科大学, 2020(04)
- [6]外周血淋巴细胞的形态及亚群特点与非霍奇金淋巴瘤诊断的相关性研究[D]. 赵飞. 河北北方学院, 2020(06)
- [7]运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用[D]. 涂宏蕾. 武汉大学, 2020(07)
- [8]PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究[D]. 陈晓晨. 苏州大学, 2020(06)
- [9]中晚期宫颈癌淋巴细胞KLRG1、2B4的表达及SALL4特异性免疫反应及其临床意义[D]. 郭玉萍. 新疆医科大学, 2020(08)
- [10]自噬介导的日本脑炎DNA疫苗免疫增强效应及机制研究[D]. 赵芳芳. 中国医科大学, 2020(01)
标签：肿瘤; 对照组; pd-1; 急性淋巴细胞性白血病; 肿瘤免疫;