一、猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF_5基因的克隆及序列分析（论文文献综述）
丁耀忠[1]（2021）在《QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原,猪是其唯一宿主。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,不分节段的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,根据抗原特性和基因组特征分为两个基因型:欧洲型（European,Eu）,即1型PRRSV;北美型（North American,NA）,即2型PRRSV。该病毒的基因组长度约为15 kb,具有九个或十个重叠的开放阅读框（ORF）:ORF 1a-1b,ORF 2-7（病毒结构蛋白GP2,E,GP3,GP4,ORF5a,ORF5,M和N）。与马动脉炎病毒（equine arteritis virus,EAV）,乳酸脱氢酶升高病毒（lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV）和猴出血热病毒（simian hemorrhagic fever virus）为同一属病毒。我们分离了一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）,将其命名为QH-08（Gen Bank:KU201579）。对其进行溯源后发现,其与HUN4和JXA1的进化变异几乎没有差异,全序列同源性分别为97.2%和97%,同时与HP/Thailand19500LL/2010（泰国,KF735060）、PRRSV/MZ/IND/1A/18（印度,MK287894）和BH58/10（老挝,JN626287）的全序列同源性为95.7%、93.8%和95.9%;遗传进化表明,这5株2型PRRSV分离株处在同一个进化分支上,而且QH-08分离株在进化谱系上与HUN4分离株具有更高的亲源性;同时在分子水平上比较34株分离株的同源性后得到了一种假想,即PRRSV-2型ORF1α1b的同源性差异是导致PRRS疫苗对于同源毒株攻毒保护力差异的重要原因,从而为疫苗选择和实时real-time RT-PCR的建立提供分子理论基础。对于天然抗病毒通路,如TLR 3凋亡途径,能否被有关刺激因子激活从而抑制PRRSV的感染能力;另外,选择一种可以防控QH-08 PRRSV的感染的疫苗对于将来促进PRRSV的防控可以提供一种参考依据;同时,由于PRRSV-2存在大量重组现象,建立能够覆盖经典毒株和变异毒株的、特异性检测PRRSV-2型的实时定量PCR技术,对于PRRSV-2型的防控具有积极意义。因此,在基于对不同的PRRSV-2型分子分析的基础上,进行了一些系列的研究。首先,通过病毒噬斑、qPCR和IFA等检测方法评估了刺激因子—盐酸吗啉胍对QH-08在Marc-145细胞上的复制有一定的抑制作用,其抑制机理是盐酸吗啉胍诱导在细胞水平上诱导TLR 3依赖的凋亡途径,进一步激活了caspas-8和caspas-3凋亡途径进而抑制了PRRSV复制,而且,这种抑制作用与caspase-3激活后Mcl-1表达量下调有关。这种通过激活caspase-8和caspase-3天然抗病毒信号通路或负调控Mcl-1表达来发挥其抗PRRSV的复制的机制,能够为天然抗病毒途径的研发提供启发作用。其次,选用了四种疫苗,分别为Ingelvac PRRS MLV、CH-1a、JXA1和JXA1-RMLV疫苗,其疫苗毒株的特性为ORF1α1b序列同源性为25.3-96.3%,而ORF2-ORF7同源性为85.8-99.6%。其中,第1组和第4组（n=5）的仔猪分别使用上述四种疫苗按照一一对应的方式分别进行免疫,第5组和第6组（n=3）仅仅注射PBS作为阳性和阴性对照。免疫28 d后,除阴性对照组外,第1组-第5组分别使用等量QH-08 PRRSV进行攻毒;与攻毒后14 d,将所有仔猪处死后进行尸检。研究表明,与第5组猪（阳性对照）相比,接种疫苗的猪的体温、肺损伤程度、血清和肺组织中的病毒含量水平显着降低（p<0.05）;在攻毒期内,JXA1和JXA1-R MLV疫苗对QH-08 PRRSV攻击提供了100%的保护,保护率显着的高于Ingelvac PRRS MLV和CH-1a疫苗的保护率。最后,基于QH-08分离株与其余毒株序列特性建立了一种检测2型PRRSV的实时定量PCR技术,研究表明,其检测最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性是多重RT-PCR的10倍;特异性良好,不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应性。对临床样品的阳性检出率和阴性检出率均为100%;研制的3批试剂盒在一定保存期内,其重复性、特异性和敏感性良好,可以满足2型PRRSV的临床检测和防控的需求。
关淼[2]（2021）在《辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）临床主要引起母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸困难,可以造成感染仔猪的死亡,哺乳仔猪死亡率高达60%以上,保育仔猪达10%～30%不等。高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）感染可以使发病率和死亡率明显增加,仔猪发病率可达100%,死亡率可达70%以上,成年猪发病率和死亡率可达50%以上,母猪流产率达到30%以上。猪群中经典株和高致病株均有流行,在日常免疫和感染后确诊时,都需要加以明确和区分。针对PRRS没有有效的治疗药物,临床主要施行免疫接种对该病进行预防,严格的执行免疫接种防控措施是防控该病最积极有效的措施之一。目前该病在世界范围内普遍存在和流行,由其引发的PRRS疫情不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,同时也严重的威胁着人类的食品安全。我国各地区PRRSV优势血清型存在差异,通过使用问卷调查、病原学、分子生物学以及血清学方法,对辽宁地区PRRS的发生和流行进行研究,结果显示在辽宁各地区PRRSV优势血清型和PRRS发生情况不尽相同,因此针对地方优势毒株和流行趋势有针对性的建立区域性精准分型方法和防制策略势在必行。通过结合本研究建立的分型方法和血清学、分子生物学等方法,对全省猪群PRRSV病原感染及免疫抗体情况进行研究。推荐并施行精准防制策略,最后对免疫效果进行评估。为今后辽宁地区PRRS精准防控措施的制定和指导猪场临床生产提供一定的科学依据和技术支撑。主要研究内容和结果如下:（1）PRRSV分型检测方法的建立及应用本研究根据PRRSV基因组NSP2编码区缺失基因的两端设计2条特异性引物,成功的建立了可以鉴别检测PRRSV经典株与高致病株的RT-PCR方法,并对其引物浓度、反应时间和反应温度等条件进行了优化。研究结果发现,该反应的最佳退火温度为58℃,体系中最佳引物浓度为0.4μmol/L。特异性试验结果表明,该方法与CSFV、PRV、PCV2和PEDV等常见感染猪的病毒无交叉反应,具有良好的特异性。通过敏感性试验,表明该方法可以在10-3稀释度扩增出经典株目的条带,在10-4稀释度扩增出高致病性株目的条带,具有良好的敏感性。重复性试验结果表明,试验检测结果之间无明显的差异,具有良好的重复性。本研究建立的分型检测方法对HP-PRRSV具有更高的检出率,经典株检出率与国标检测结果一致。本方法适合兽医实验室和养殖场对PRRSV进行鉴别筛查,指导辽宁地区PRRSV精准防控策略的制定和执行,为PRRSV的快速检测及预警提供了快捷、有效的检测方法和检测依据。（2）PRRS发病情况和病原体核酸检测及分析1)猪群PRRS临诊发病情况及分析通过对2014年～2015年辽宁省内14个地市596家不同规模化的养猪场进行调查,调查结果显示,总体上猪群PRRS临诊发病率为7.05%;随着养猪场养殖规模的增加,PRRS发病率呈下降的趋势;2014年和2015年的PRRS临诊发病情况较为平稳;2015年辽南地区PRRS临诊发病率最低为5.06%,2014年辽北地区最高为8.96%。PRRS临诊发病没有明显的地域特征,在辽宁地区处于一个比较普遍流行的状况,因此做好PRRSV免疫防制是必不可少的。2)病原检测及分析2014年～2018年5年间辽宁省假定健康猪群HP-PRRSV病原核酸平均阳性率为5.96%,其中2015年HP-PRRSV平均阳性率最高（14.70%）,2017年最低（0.97%）;四个季度HP-PRRSV平均阳性率第一季度最高（8.93%）,第三季度最低（8.40%）;辽北地区平均阳性率最高（7.54%）,辽南地区最低（4.26%）。2017年至2018年较2014年至2016年,辽宁省HP-PRRSV病原检出率下降。使用PRRSV分型检测方法进行检测,结果表明2016年和2017年疑似感染病例高致病株检出数量高于经典株,至2018年经典株检出数量高于高致病株,在辽宁省范围内高致病株为主要流行株,同时伴有经典株的流行,近年来高致病株流行趋势下降,经典株感染病例相应增多。在制定免疫政策的时候,应该根据具体情况选择弱毒疫苗免疫。对猪群进行主要传染性疫病病原核酸检测结果表明,PRRSV和PCV2混合感染率最高（43.72%）,与PRV的混合感染率最低（0.64%）。3)PRRSV及其他主要病毒性疫病分子演化分析本研究测定的基因序列均为HP-PRRSV株。ORF5基因间同源性为91.5%～99.0%,NSP2基因间同源性为92.9%～99.5%。与VR-2332相比,ORF5氨基酸序列的第39位均由L39突变为I39,与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJM相同;和VR-2332相比,第13位均由Q突变为R,LNeast2015第151位由R突变为K;同时在第137位均为S,表明本研究鉴定的毒株均为野毒株。进化树分析表明辽宁省PRRSV毒株发生了一定程度的基因变异,并且与疫苗毒有很近的亲缘关系。这些疫苗株相关分离株的出现可能与减毒修饰的活PRRS疫苗的广泛使用有关,结合氨基酸序列分析,提示为野毒株和疫苗株的基因重组毒株。对CSFV、PRV和PCV2目的基因进行序列分析结果表明,病原出现不同程度的变异并且发现部分强致病性毒株,辽宁地区部分病原与其他地区病原亲缘关系较近,存在较大的传入风险。（3）PRRSV疫苗免疫后抗体检测及分析2014年～2018年5年间辽宁省猪群PRRSV抗体平均阳性率为91.33%,其中2015年最高（94.26%）,2017年最低（87.76%）;四个季度抗体平均阳性率第四季度最高（93.31%）,第一季度最低（89.99%）;辽东地区抗体平均阳性率最高（93.82%）,辽南地区抗体平均阳性率最低（89.24%）。PRRSV抗体阳性率始终保持在70%以上,能够对群体提供免疫保护。不同生长时期猪血清样品PRRSV抗体总阳性率为94.39%,其中断奶仔猪最低（81.67%）,后备母猪、经产母猪和种公猪最高（100%）;病原总体阳性率为6.52%,其中种公猪最低（0%）,育肥猪最高（16.67%）;不同品系猪群血清样品中大白猪群PRRSV抗体阳性率最高（96%）,二元杂交阳性率最低（78%）。不同年龄阶段、不同品系PRRSV抗体阳性率差异不显着,并且都可以达到70%以上。对弱毒苗免疫后仔猪进行抗体动态检测结果表明,免疫后第1至4周仔猪体内抗体水平较低,免疫后5周开始上升,8～9周抗体水平达到峰值,可以持续到免疫后16周。免疫高致病株PRRSV弱毒苗的仔猪比免疫经典株PRRSV弱毒苗的早一周到达抗体阳性率峰值,但是二者之间没有显着的差别。因此建议在25～35日龄对仔猪进行首免,4个月后二免。（4）PRRS精准免疫防制措施实施效果及分析结合本研究建立的PRRSV分型检测方法和免疫程序,推荐精准免疫防制策略,在猪场实施以后取得了良好的效果,为辽宁地区PRRSV防控计划和猪场免疫防制措施的制定提供了很高的参考价值。试验猪场在实施精准免疫防制措施后,免疫抗体阻断率明显升高,水平趋于一致,大部分达到了0.8以上。PRRSV病原核酸检测结果表明,免疫后病原检出率明显降低。比对免疫前后母猪和哺乳仔猪的生产指标可以看出,免疫后母猪的流产发生率、木乃伊胎以及总死亡率明显降低,保胎率和仔猪成活率升高。按照推荐免疫程序进行免疫的猪群产生的抗体离散度更低,个体之间抗体水平差异性较小,具有更好的整体保护力。对辽宁地区抽样猪场进行调查及检测结果表明,2016年猪群免疫均为PRRSV高致病株疫苗,2017年、2018年PRRSV高致病株疫苗使用率降低,经典株疫苗使用率增加;在辽西、辽北部分市推广使用精准免疫措施后,辽西和辽北地区PRRS发生率下降;2018年相较2017年,各地区PRRSV高致病株检出数量均减少,辽西地区和辽北地区的经典株检出数量减少;2018年相较2017年,辽西地区和辽北地区抗体阳性率上升。2018年精准免疫防制措施推广场与未推广场相比,具有更低的病原阳性率和平均发病率,具有更高的抗体阳性率。猪场在制定并施行免疫防制策略的时候,应根据本猪场、周边环境、整个县市的PRRSV流行趋势,选择适合本猪场的弱毒苗和免疫程序。PRRSV阴性场如果周边场、县没有HP-PRRSV的流行应该尽量选择经典株弱毒苗进行免疫;PRRSV阳性场,应先确定本猪场发生的是哪种PRRSV血清型感染,再选择弱毒苗进行紧急的全群免疫。
宋健颖[3]（2021）在《规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整》文中进行了进一步梳理随着我国养猪业的规模化发展,猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和猪伪狂犬五种主要疾病防控尤为重要,一旦发病就会造成重大经济损失。本研究通过对新疆南疆某地区3个规模化母猪场母猪群的猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬和口蹄疫等五种主要疫病进行抗体水平监测、病原检查,了解规模化母猪场抗体水平、是否存在野毒感染、野毒基因型,更好地评价免疫程序是否合理,以期提高免疫效果。1.2018年至2020年,对新疆南疆某地区3个规模猪场（A～C）采集的1604份血液进行了猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和圆环病毒2型的抗体检测。检测结果显示,猪瘟抗体阳性率分别为:A场92.30%（2018）、97.74%（2019）和89.22%（2020）;B场95.27%（2018）、93.04%（2019）和86.81%（2020）;C场91.67%（2018）、86.50%（2019）和90.80%（2020）;伪狂犬病抗体分阳性率别为:A场100.00%（2018）、99.25%（2019）和97.06%（2020）;B场98.82%（2018）、93.67%（2019）和94.44%（2020）;C场98.12%（2018）、84.00%（2019）和96.55%（2020）;猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率分别为:A场86.15%（2018）、75.19%（2019）和55.88%（2020）;B场86.39%（2018）、88.61%（2019）和88.89%（2020）;C场91.94%（2018）、96.50%（2019）和95.40%（2020）。口蹄疫抗体阳性率分别为:A场90.77%（2018）、100%（2019）和98.04%（2020）;B场100%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场95.97%（2018）、97.50%（2019）和96.55%（2020）;圆环病毒2型抗体阳性率分别为:A场80.00%（2018）、100.00%（2019）和92.16%（2020）;B场95.27%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场97.04%（2018）、97.50%（2019）和98.85%（2020）。2.以“发现疫病或证明无疫”的抽样策略采集A规模化母猪场血清样本,采用圆环病毒2型抗原ELISA检测,检测结果阳性率为4.4%,证明A场存在圆环病毒2型感染。3.对A规模化母猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪的样本,采用猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因序列特异性引物经RT-PCR扩增、测序、核苷酸同源性比较、系统进化树分析,结果证明,该样本测序结果与NADC30毒株同源性最高,为93.5%,属于类NADC30毒株。4.猪繁殖与呼吸综合征免疫程序进行调整初探,调整后母猪每年普免3次,每次免疫间隔4个月,采集调整后试验的猪群50份血清,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测,抗体阳性率达到96%以上。
冯全文[4]（2021）在《猪圆环病毒2型ORF5基因突变毒株的构建及感染特性研究》文中认为猪圆环病毒2型（PCV2）是单股负链环状DNA病毒,基因组长度1 767～1 768 bp,病毒粒子呈二十面体对称结构,无囊膜,病毒粒子大小约17 nm。PCV2导致猪免疫系统损害和抑制,严重损害猪的健康,并常继发或混合感染其他病原体,造成更为严重的损害。对PCV2的致病机制的揭示有助于更好的做好防控工作,对病毒编码产物的鉴定和功能研究是揭示PCV2致病机制的基础。生物信息学分析发现,PCV2的基因组中至少包含11个潜在的开放阅读框（ORF）,目前报道的有6个（ORF1-6）,其中ORF5是本研究团队发现和鉴定的一个PCV2新编码蛋白。前期研究结果表明,ORF5蛋白可引起宿主细胞周期阻滞,诱导内质网应激反应和细胞自噬,促进病毒复制等,以上结果主要是以ORF5蛋白为研究对象获得的,在ORF5在病毒水平的作用还需要深入研究。本研究克隆获得了PCV2全基因组序列,通过点突变技术将ORF5基因的起始密码子（ATG）突变,拯救获得了PCV2克隆毒株（rPCV2）和ORF5基因突变毒株(PCV2△ORF5)。进一步研究了ORF5对病毒生长特性、细胞感染作用,实验动物感染方面的作用,在病毒水平明确了ORF5的作用,为PCV2致病机制的揭示提供了新的资料。本研究获得了以下结果:（1）获得了PCV2克隆毒株和ORF5基因突变毒株克隆获得PCV2全基因,分别构建插入PCV2全基因序列的重组质粒PUC57-rPCV2和突变ORF5基因的重组质粒PUC57-PCV2△ORF5,经单酶切、体外自环化连接、连接产物转染细胞、盲传等实验操作,分别获得了rPCV2和PCV2△ORF5毒株。（2）ORF5基因突变降低了病毒复制增殖及诱导细胞内质网应激、细胞自噬的作用以rPCV2、PCV2△ORF5毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,分别用透射电镜观察法、RT-PCR、western blot、流式细胞术等方法对病毒复制增殖、对细胞功能的影响进行分析。结果表明,rPCV2、PCV2△ORF5毒株在细胞中的复制增殖具有一致性,但ORF5基因突变在36h时显着降低了病毒的复制增殖能力（P<0.05）;rPCV2、PCV2△ORF5毒株均诱导了细胞内质网应激、细胞自噬和细胞凋亡,但是ORF5基因的突变使感染细胞的内质网应激、细胞自噬、细胞晚期凋亡和细胞周期阻滞作用显着降低（P<0.05或P<0.01）。研究结果从病毒水平证实了ORF5蛋白在病毒感染中具有诱导宿主细胞内质网应激、细胞自噬和细胞周期阻滞的作用。（3）ORF5基因突变降低了病毒在实验动物体内的复制增殖、诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用分别用PCV2、rPCV2、PCV2△ORF5病毒液通过腹腔注射途径接种昆明系小鼠4次,每天1次,4此接种后每隔7 d尾静脉采血,荧光定量PCR方法检测血液中的病毒载量;当感染小鼠血液中出现高滴度病毒载量时（感染后28 d）麻醉处死各组小鼠,无菌操作分别采取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等组织器官,RT-PCR和western blot检测各组织中的病毒载量、内质网应激和细胞自噬标志因子的表达;将各组织器官分别制成电镜和普通病理切片,进行观察。结果显示,三种病毒感染小鼠的肝、脾、肾、肺中病毒载量均较高,但PCV2△ORF5组感染小鼠相同组织中的病毒载量低于PCV2和rPCV2组（P<0.01或P<0.05）,说明ORF5基因突变降低了病毒在动物体内的复制增殖能力;病毒载量与组织中内质网应激和细胞自噬标志因子的表达呈正相关性,肝、脾、肾和肺中GRP78、Beclin1和LC3Ⅰ/Ⅱ的表达高于其他组织（P<0.01或P<0.05）,但PCV2△ORF5组感染小鼠相同组织中的标志因子表达显着低于PCV2和rPCV2感染组,说明ORF5基因突变降低了病毒诱导细胞内质网应激和细胞自噬的作用。通过病理组织学观察结果显示,三种病毒感染的小鼠组织中出现炎性细胞浸润、淋巴细胞减少、细胞凋亡、细胞变性等病理变化,但各组之间无显着差异。研究结果表明,ORF5基因突变对病毒感染性和病理变化无显着影响,但是降低了病毒的复制增殖、诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用。本研究构建了突变ORF5基因的PCV2毒株,ORF5的突变降低了病毒在体内外的复制增殖水平,降低了病毒在体内外诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用,但对病毒的感染性和病理损伤无显着影响。本研究从病毒和体内外进一步明确了ORF5在PCV2感染中的作用,为PCV2感染和致病机制的阐明提供了新的资料,具有理论和潜在的应用价值。
王玥[5]（2021）在《2019～2020年我国部分地区PRRS流行病学调查及PRRSV嵌合病毒pMLV+NADC30的构建》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起猪的一种急性、高度传染性疫病。2014年,我国南方地区分离到NADC30-like PRRSV毒株,随后几年该毒株流行率迅速攀升。直至今日,该毒株已成为我国PRRSV新的优势流行毒株。针对PRRSV流行毒株研发特异高效的疫苗是进行PRRS防控的关键措施。为了解近年我国部分地区PRRSV流行情况和遗传演化规律,并为新型疫苗候选毒株的研究提供试验基础,本研究对2019年～2020年我国部分地区PRRSV流行毒株进行病原学检测和遗传演化分析;针对主要流行毒株,通过反向遗传技术构建PRRSV经典毒株以及嵌合毒株的感染性克隆并拯救病毒。主要结果如下:1.2019年～2020年我国PRRSV流行株研究。对2019年～2020年收集的4,238份样品,利用RT-PCR法进行病原学检测,结果表明2019年和2020年PRRSV阳性率分别为7.02%和10.57%。空间分布显示,2019年PRRSV在东北地区（10.00%）和华东地区（10.78%）,2020年在西北地区（13.43%）和华南地区（27.17%）的阳性率都较高。进一步对PRRSV ORF5进行测序和遗传进化分析,结果表明近两年的主要流行毒株是MLV-like毒株（亚群1）和NADC30-like毒株（亚群5）,尤其是NADC30-like毒株,2019年和2020年的阳性占比分别为67.61%和45.95%。2.PRRSV嵌合病毒株pMLV+NADC30的构建。以MLV-like毒株基因组为模板,将全长分四个片段扩增,依次连接至p WSK29-CMV载体上,构建出全长质粒pMLV,经转染Marc-145细胞成功拯救出感染性克隆。在此基础上,进一步将NADC30-like毒株的结构蛋白部分（ORF2-7）替换入pMLV相应编码区,构建出pMLV+NADC30嵌合质粒,转染后成功拯救出活病毒。两个拯救病毒生物学特性分析结果显示,pMLV和pMLV+NADC30的生长曲线与亲本毒株MLV相似。3.PRRSV嵌合病毒株pMLV+NADC30稳定性检测。分别测序嵌合质粒及嵌合病毒F5、F10代Nsp2、ORF3、ORF5序列并比对,结果显示嵌合病毒在Marc-145细胞上稳定传代,未发现突变。将嵌合病毒pMLV+NADC30分别与MLV-like毒株、NADC30-like毒株以及HP-PRRSV毒株以不同比例接种Marc-145细胞进行共感染实验,传至F10后病毒噬斑纯化并对Nsp2、ORF3、ORF5测序分析。比对结果显示嵌合病毒与三种不同亚群的毒株共感染时,未发现重组现象,且嵌合病毒pMLV+NADC30复制能力强于MLV-like毒株和HP-PRRSV毒株,弱于NADC30-like毒株。综上所述,分子流行病学发现MLV-like毒株和NADC30-like毒株是近两年我国主要流行毒株,且NADC30-like毒株占比最高;拯救病毒pMLV和pMLV+NADC30能在Marc-145细胞上稳定传代,且具有与亲本MLV毒株相似的增殖动态;嵌合病毒与三种亚群的流行毒株在细胞水平上共感染后较为稳定,未发现毒株间重组现象,且嵌合病毒复制能力强于MLV-like毒株和HP-PRRSV毒株,弱于NADC30-like毒株。
胡栋,朱迎春,赵情,庞恒,李传刚,王亭亭,常维山,彭军,吴家强[6]（2021）在《1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析》文中研究表明对山东省某地区初诊为猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproduction and respiatory syndrome,PRRS）的猪病料采用RT-PCR进行鉴定,获得1株PRRSV并命名为SD18。对该分离株的第2代细胞培养毒株进行全基因组测序,与其他参考毒株比较同源性并构建遗传进化树。结果显示,SD18毒株属于美洲型高致病性PRRSV变异株,该毒株Nsp2基因具有31个不连续的氨基酸缺失,已明显区别于以JXA1、HUN4、TJ株等为代表的30个不连续缺失高致病性分离株,其中第830位氨基酸位点是最新发现的缺失氨基酸。同时,该毒株的ORF3基因第17位插入1个丝氨酸（S）,而ORF5基因编码的第13位和第151位氨基酸均为具有强毒特性的精氨酸（R）,第137位则插入了具有野毒特性的丝氨酸（S）,这4个氨基酸位点也表现出不同于以往高致病性毒株变异的特征。采用基因重组分析软件RDP4分析表明,该新型缺失株的多个部位发生了基因重组;SD18毒株病毒以美洲经典毒株VR2332作为重组的主要亲本毒株,疫苗株JXA1-R和新型毒株NADC30-like提供重组片段,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化。本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据。综合分析表明,山东地区SD18分离株Nsp2、GP3、GP5相应氨基酸均出现了较大变异,特别是Nsp2出现一个新的氨基酸缺失,可能是该毒株形成了一个新的独立变异分支的重要原因;这些变异也提示该分离毒株在病毒编码蛋白及其免疫原性等方面出现了较大变化。该病毒株的成功分离鉴定与遗传进化分析为PRRSV衍化及流行病学调查积累了最新数据,也为预防控制该病提供参考。
张伟涛[7]（2020）在《Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定及Nsp2和GP5基因的克隆与分析》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由病毒引起的一种猪的繁殖性障碍和呼吸系统传染性疾病。临床特征是厌食,发热,怀孕的后期发生流产,死胎,木乃伊胎,幼龄猪发生呼吸系统疾病或死亡。此病最早在1987年美国中西部发现,之后在北美,德国,法国,荷兰等欧洲国家及亚洲国家发现。刚开始,因为不明白病因,欧洲的一些国家将本病称为“猪神秘病”,又由于发现部分病猪的耳部出现发紫现象,故又称此病为“猪蓝耳病”,还有人称其为“猪不孕与呼吸综合征”和“流行性流产与呼吸道综合征”。我国大陆由郭宝清等人在1996年首次分离到PRRSV,随后就在全国很多地方分离到了此病毒,如今PRRSV已经在我国广泛存在,并且疫情状况比较严重。为了解新乡地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在猪群体内的流行和进化情况,通过调研,本实验室收集了对该地区某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的组织病料,首先对送检病料进行PRRSV核酸鉴定,其次选择阳性样品进行病毒的分离鉴定。结果显示:送检疑似样品中有80%核酸阳性率,并从其中的一份阳性样品中成功分离出一株PRRSV,该株病毒经间接免疫检测结果发现其能与PRRSV特异性N蛋白抗体结合。分离出的PRRSV代表株为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在新乡地区的分子进化提供了分子证据。为了进一步研究Xinxiang2015株PRRSV的序列特征,本研究采用分子生物学技术,提取病毒感染细胞后的总RNA,经反转录、PCR扩增、目的基因回收、T载体连接、转化大肠杆菌、挑取阳性克隆、序列测序和序列分析等过程分别克隆了Xinxiang2015株PRRSV的非结构蛋白Nsp2和结构蛋白GP5蛋白的基因全长序列。Nsp2蛋白的实验结果显示:本次试验克隆出Xinxiang2015株PRRSV的Nsp2基因,该基因全长3483bp,与VR-2332株、Ch-1a株、HuN4株、HENAN-XINX株中的Nsp2基因进行核苷酸同源性分别为80.5%、96.0%、96.2%和67.8%,进一步比对结果发现Xinxiang2015株PRRSV NSP2蛋白与经典的PRRSV和高致病性PRRSV相比,该序列存在3处连续氨基酸的不连续缺失,即除了具有高致病性的2处不连续缺失外在第485488位还存在4个氨基酸的缺失;GP5蛋白的实验结果显示:Gp5蛋白基因全长603bp,该基因与VR-2332株,Lelystad virus株,Ch-1a株,HuN4株和HENAN-XINX株中的GP5基因进行核苷酸同源性的分析和对比,同源性分别为89.4%,49.6%,94.9%,99.3%和85.7%;NSP2蛋白和Gp5蛋白的进化树分析结果均表明Xinxiang2015株PRRSV属于高致病性PRRSV。本次试验的研究结果为进一步证实了河南省周边近年来流行的PRRSV为高致病性PRRSV,同时也为了解全国范围内猪繁殖与呼吸综合征病毒的进化研究提供了证据。
谭祥梅[8]（2020）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒HBap4/2018株遗传变异分析及致病性评价》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是近十多年来对我国生猪产业危害严重的动物疾病,其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的传染性较强,可导致母猪繁殖障碍以及仔猪和育肥猪严重的呼吸系统疾病。在外界环境和免疫压力下容易发生变异,不同PRRSV变异株其基因组遗传特性和致病性也不尽相同,及时监测PRRSV分离株遗传变异特征,可为指导PRRSV科学防控策略的制定和有效疫苗的研制提供有益帮助。本研究中我们首先对566份发病猪临床样品进行了PRRSV检测,结果发现其中246份样品呈PRRSV阳性。选择其中部分阳性样品的Nsp9、Nsp2和ORF5基因进行序列分析。结果显示:在PRRSV阳性样品中,18株ORF5基因主要分布于L1、L3和L8三个谱系中;28株毒株Nsp2基因主要分布于L1、L5和L8三个谱系中;10株Nsp9基因分布于L1和L8两个谱系中。氨基酸序列分析结果显示,不同毒株间Nsp2基因存在4种不同的氨基酸缺失模式,即:1+29 aa,111+1+19 aa,111+5+1+19 aa,1+29+14 aa。其中SHpd1/2018株Nsp2与NADC30株类似,存在131 aa缺失,而HBap4/2018株在此基础上,又新增加5 aa缺失的特征。其中,值得关注的是HBap4/2018和SHpd1/2018株,来自相同毒株的Nsp2和ORF5基因却分别属于不同基因亚群,我们推测这两个毒株其基因组可能发生了重组。为了分析HBap4/2018和SHpd1/2018毒株的特性,我们成功分离获到了这两株病毒,鉴定结果显示两株病毒均可被针对PRRSV HuN4株GP5和N蛋白单抗特异性识别,但HBap4/2018株和SHpd1/2018株却不被针对HuN4株Nsp2蛋白特异性单抗所识别。两株病毒在Marc-145细胞的增殖特点和噬斑形态与HuN4株基本类似。重组分析结果表明,两个毒株都是由HP-PRRSV-like毒株（主要亲本毒株）和NADC30-like毒株（次要亲本毒株）重组而来,但是其重组模式却不相同,其中SHpd1/2018株存在2个重组位点（2002 nt和3205nt）,均位于Nsp2基因的高变区内。而HBap4/2018株存在5个重组断点（2000 nt、5105 nt、6292 nt、7412 nt和14249 nt）,分别位于Nsp2、Nsp3、Nsp5、Nsp7和ORF7基因区域,属于一种新的PRRSV自然重组突变毒株。为了弄清PRRSV新型重组突变毒HBap4/2018株的致病特征,我们将HBap4/2018株感染30日龄的试验仔猪,通过对仔猪攻毒后的临床症状、血清中病毒载量、鼻拭子排毒以及组织病理学观察等检测指标,对其致病性进行了评价,结果显示:HBap4/2018株感染可使试验仔猪100%发病,主要表现持续高热、呼吸障碍、厌食和精神沉郁等典型临床症状;并且在感染后第4、15和28天各有1头仔猪死亡,死亡率达60%,通过本研究证实我们分离获得的新型重组变异毒株HBap4/2018对仔猪的致病性较强。本研究分析了近年来我国部分地区PRRSV流行毒株的遗传变异特征,分离获得了具有新的遗传特征的PRRSV自然重组毒株,该PRRSV重组变异株保留了与HP-PRRSV毒株毒力相关基因的遗传特征和生物学特性。并证实新出现的自然重组毒HBap4/2018株对仔猪致病性较强。研究结果将有助于深入了解我国PRRSV流行毒株的遗传变异特征和致病特点,为PRRSV科学防控策略的制定和新型疫苗的研制提供了新的参考依据。
许浒[9]（2020）在《我国Lineage 3 PRRSV的流行病学调查及其单克隆抗体的制备》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以仔猪呼吸障碍和母猪繁殖障碍为主要临床症状的烈性传染病。PRRSV于1996年在我国首次分离,给我国养猪业造成巨大经济损失。随着PRRSV在我国不断演化,其多样性变得更加复杂。形成了以Lineage 1和Lineage 8 PRRSV为主要流行毒株,Lineage 3 PRRSV持续存在的态势。Lineage 3 PRRSV（QYYZ-like）自2010年首次发现以来,主要流行于我国南方,但最近也有在我国其他地区分离这类病毒的报道。Lineage 3 PRRSV的早期毒株临床表现较为温和,因此未引起足够重视。而后的研究报道发现,Lineage 3 PRRSV与其他谱系毒株重组后毒力明显上升,因此加强对Lineage 3 PRRSV的监测是十分重要的。在动物疫病治疗、诊断、病原体生物学研究中,单克隆抗体发挥着重要作用。通过筛选具有阻断效果的针对PRRSV的单克隆抗体,是建立PRRSV抗体阻断ELISA的必备材料。目前国内报道的PRRSV单克隆抗体多数是针对HP-PRRSV,Lineage 3 PRRSV的单抗未见报道,因此制备Lineage 3 PRRSV的单抗对了解PRRSV基因组的结构与功能,以及进一步利用单抗制备PRRSV抗体阻断试剂盒具有重要意义。2017～2019年间,本研究对来自全国16个省、市、自治区的325份疑似感染PRRSV的病料进行RT-PCR检测。检测结果显示,阳性PRRSV样品数为103份,其中Lineage 3样品数为16份,约占阳性样品总数的16%。本研究对16份Lineage 3 PRRSV阳性样品进行ORF5基因测序,并在其中选择7个样品（LCL15、XNF10、XNF53、XNF60、XNF74、XNF78、XNF229）进行了全基因组测序,对获得的序列进行比对与分析。核苷酸序列同源性比对结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性与欧洲型代表株Lelystad virus的同源性为62.9%～65.0%,与美洲型代表株VR2332同源性在81.8%～85.1%;在美洲各型代表株中与QYYZ毒株（Lineage 3）的同源性最高,为91.2%～92.0%。全基因组同源性分析发现它们之间同源性较低,LCL15与Lineage 1代表株NADC30同源性最高,XNF53、XNF60、XNF78与Lineage 8代表株JXA1同源性最高,XNF10、XNF74、XNF229与Lineage 3代表株QYYZ同源性最高。基于ORF5基因的遗传演化分析结果显示,16份PRRSV毒株均属于在我国流行毒sublineage 3.5,而全基因组遗传演化分析显示XNF10、XNF74、XNF229属于sublineage3.5。XNF53、XNF60、XNF78属于sublineage 8.7,LCL15属于sublineage 1.8,与同源性分析结果相似。Nsp2基因推导氨基酸序列分析中发现,7株新发Lineage 3 PRRSV均在Nsp2区域存在大量复杂的缺失和插入。本研究报道的XNF10、XNF74、XNF78、XNF229在Nsp2蛋白上的缺失和插入模式均为首次报道。ORF5推导氨基酸序列比对结果表明Lineage 3PRRSV在Y38、S39、C66、S92、F117、I152、R196、H1998个位置的氨基酸存在特有的氨基酸突变,并且新发Lineage 3 PRRSV在线性抗原区域内存在大量氨基酸突变,这些位置的突变可能会导致疫苗免疫失败。重组分析结果显示7株新发Lineage 3 PRRSV毒株均为重组病毒,拥有非常复杂的重组关系,PRRSV毒株之间重组会对毒力造成较大影响。重组分析显示7株Lineage 3 PRRSV具有复杂的重组模式,其重组热点位于Nsp2、Nsp7、ORF2a和ORF3上。对新发Lineage 3 PRRSV进行病毒分离,成功分离XNF10株。本研究为深入探究Lineage3 PRRSV毒株在中国的变异和遗传进化提供了参考。本研究用超离纯化的Lineage 3 PRRSV XNF10株病毒免疫BALB/c小鼠三次,三免后7 d进行间接免疫荧光试验检测,结果显示小鼠血清转阳。将阳性小鼠脾脏在无菌条件下取出,冲出脾细胞并和SP2/0细胞进行细胞融合。经四次亚克隆,并对所筛选杂交瘤细胞分泌出的抗体进行稳定性验证,结果表明成功获得2株能够稳定分泌抗PRRSV MAb的阳性杂交瘤细胞株,命名为DD-1、DD-2;将所获得的阳性杂交瘤细胞大量培养,并接种小鼠制备腹水。经IFA测定DD-1、DD-2细胞上清的效价分别为1:64和1:128。DD-1、DD-2腹水效价分别为1:5000和1:10000。利用IFA方法对单克隆抗体细胞系进行广谱性检测结果显示DD-1、DD-2均能与美洲型PRRSV代表毒株SD53-1603（Lineage 1）、Hu N4-F112（Lineage 8）、CH-1R（Lineage 8）、MLV（Lineage 5）反应,但不能与欧洲型代表株DV反应。因此DD-1、DD-2在美洲型PRRSV中具有很好地广谱性。利用Western blot方法对DD-1、DD-2的结合蛋白进行鉴定结果发现,两株新制备单克隆抗体都能与PRRSV的GP3特异性结合。用纯化的XNF10全病毒作为包被抗原,单克隆抗体DD-2与病毒的结合可以被PRRSV阳性的猪血清阻断。本研究制备的DD-2单克隆抗体为建立美洲型PRRSV抗体方法提供了基础。
叶梦雪[10]（2020）在《新型PRRSV变异株鉴定及其致病力研究》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是严重危害全球养猪行业的重要动物疫病,每年给全球养殖业带来重大经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是变异最快的RNA病毒之一,自1995年首次在中国发现以来,PRRSV在中国的流行范围不断扩大,并且形成多种基因型与亚型共存的现状。新型PRRSV变异株的频繁出现,给PRRS防控带来巨大压力。针对上述问题,本文开展了以下研究工作。一、建立了新型的通用及四重PRRSV荧光定量RT-PCR方法,可对临床样品进行高效的鉴别检测。二、通过该检测方法,发现两株基因组高度同源但临床发病情况完全不同的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）变异毒株。动物攻毒试验证实其致病力存在显着差异,并通过全基因序列分析发现了氨基酸差异位点。三、构建并拯救了上述两株高度同源的HP-PRRSV变异株感染性克隆病毒,为进一步探究与致病力相关的关键位点提供了有效的技术平台。研究1.通用及四重PRRSV荧光定量RT-PCR方法建立为了建立高效便捷的PRRSV鉴别检测方法,本研究基于探针与引物结合的方法设计2对引物和1条通用探针用于鉴别检测欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV;同时设计4对引物和4条探针用于鉴别不同基因型与亚型PRRSV。通过优化检测体系和程序,建立了特异性强,敏感度高,重复性良好的PRRSV通用及鉴别检测方法。应用上述方法和常规RT-PCR检测2016-2019年间收集到的664份临床样品,结果表明本研究建立的通用和四重荧光RT-PCR与常规RT-PCR方法的吻合率分别为99.55%和99.40%。同时,应用四重检测方法发现了 2份类NADC30 PRRSV和HP-PRRSV共感染的样品,表明该方法可用于PRRSV共感染情况分析。该方法可在短时间内进行大量样本的鉴别检测,为PRRSV流行病学调查提供了一种更加便捷的鉴别检测方法。研究2.新型高致病性PRRSV毒株XJ17-5和JSTZ712-12的鉴定及致病性分析在应用四重荧光定量RT-PCR检测临床样品过程中,我们发现了两株HP-PRRSV变异株。病原分离后分别命名为XJ17-5和JSTZ1712-12。经过测序分析发现两个分离株全基因组长度均为14,960 bp且同源性达到99.45%。序列分析表明两个分离株Nsp2蛋白上均存在30个氨基酸的不连续缺失和120个氨基酸的连续缺失;经过进化分析表明其属于HP-PRRSV,同时以150个氨基酸不连续缺失为标志与GenBank中另外9个HP-PRRSV毒株形成一个新的进化分支。动物试验结果表明,XJ17-5具有高致病力,可引起仔猪60%的死亡率,而JSTZ1712-12无致病力。此外,全基因组分析发现34个氨基酸差异位点,可能与两个毒株间的致病力差异相关。新型高度同源的HP-PRRSV变异株的鉴定和致病力分析,有利于PRRSV的遗传进化和致病机制研究。研究3.XJ17-5和JSTZ1712-12毒株感染性克隆构建与病毒拯救为了探究XJ17-5与JSTZ1712-12毒株中与其致病性差异相关的氨基酸位点,本研究首先设计、构建并拯救了 XJ17-5和JSTZ1712-12毒株感染性克隆病毒。其次,利用成功建立的rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染性克隆平台,进一步构建并拯救了含荧光标记的rXJ-EGFP和rJS-RFP,用于分析两个拯救病毒的体外复制能力;然后,构建并拯救了 120个氨基酸回补株rXJ-120AA和rJS-120AA,可用于探究该缺失特征对毒株复制及其致病力的影响;最后,构建并拯救了 XJ17-5和JSTZ1712-12片段互换的嵌合感染性克隆病毒,可用于解析致病力相关关键区域。XJ17-5和JSTZ1712-12相关感染性克隆病毒的构建与拯救为后期致病力研究提供了有效的技术平台。
二、猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF_5基因的克隆及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF_5基因的克隆及序列分析（论文提纲范文）
（1）QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 PRRS病原特征及防控技术研究 |
| 1 PRRSV非结构蛋白及结构蛋白的基本功能 |
| 1.1 PRRSV非结构蛋白的基本功能 |
| 1.1.1 PRRSV 的 5' UTR 和 3' UTR 的分子特性 |
| 1.1.2 PRRSV ORF1a 和 ORF1b 的特征 |
| 1.2 PRRSV结构蛋白的基本特征 |
| 2 PRRSV致病过程中的天然免疫通路 |
| 2.1 细胞凋亡 |
| 2.2 NF-κB通路 |
| 2.3 干扰素反应 |
| 2.4 Toll样受体信号通路 |
| 3 PRRSV在中国的流行趋势 |
| 3.1 PRRSV-1 型在中国的流行趋势 |
| 3.2 PRRSV-2 型在国内的流行趋势 |
| 4 PRRSV的防控 |
| 4.1 PRRS的检测技术 |
| 4.1.1 PRRS病毒分离 |
| 4.1.2 PRRSV血清学检测方法 |
| 4.1.2.1 间接荧光抗体试验 |
| 4.1.2.2 免疫过氧化物酶单层试验 |
| 4.1.2.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.1.3 PRRSV核酸检测方法 |
| 4.2 PRRS 的疫苗 |
| 4.2.1 现有疫苗 |
| 4.2.2 新型疫苗研发 |
| 4.2.2.1 DNA疫苗 |
| 4.2.2.2 植物疫苗 |
| 4.2.2.3 病毒样颗粒的疫苗 |
| 4.3 疫苗佐剂 |
| 5 抗病毒因子 |
| 5.1 二氧化氯抑制PRRSV的复制 |
| 5.2 化学抗病毒因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 5.3 蛋白质因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 6 本课题研究目标和任务 |
| 第二章 QH-08 PRRSV分离株全序列特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 样品 |
| 1.3 序列比对及分析 |
| 1.4 ORF2-ORF7 序列的变异分析 |
| 1.5 ORF2-ORF7 序列二级结构 |
| 2 结果 |
| 2.1 QH-08 的基因组基本特征 |
| 2.2 34株PRRSV-2型的ORF2-7序列的进化变异 |
| 2.2.1 ORF 2 进化和变异 |
| 2.2.2 ORF3 分子进化和变异 |
| 2.2.3 ORF4 分子进化和变异 |
| 2.2.4 ORF5 分子进化和变异 |
| 2.2.5 ORF6 分子进化和变异 |
| 2.2.6 ORF7 分子进化和变异 |
| 2.3 ORF1α1b分子进化和变异 |
| 2.4 二级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 盐酸吗啉胍激活caspase-8 凋亡途径抑制QH-08PRRSV的复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒和试剂 |
| 1.2 Quantitative real-time RT-PCR(q PCR)检测 |
| 1.3 病毒感染试验 |
| 1.4 Annexin V和 PI双重染色检测细胞死亡 |
| 1.5 siRNA实验 |
| 1.6 Westernblot检测 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐酸吗啉胍对 PRRSV 复制和细胞死亡的抑制作用 |
| 2.2 盐酸吗啉胍诱导TLR3 凋亡信号通路 |
| 2.3 盐酸吗啉胍激活 caspase-8 和 caspase-3 途径 |
| 2.4 Mcl-1 蛋白是抑制 PRRSV 复制的主要因子 |
| 3 讨论 |
| 第四章 不同PRRSV疫苗对QH-08 毒株的保护性研究 |
| 1 病毒和疫苗 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 临床检查 |
| 2.3 血清学检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察 |
| 3.2 病毒 RNA 的检测 |
| 3.3 检测 PRRSV 的抗体 |
| 4 讨论 |
| 第五章 基于QH-08 分离株的一步法real-time RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂盒 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 real-time RT-PCR方法 |
| 2.1.1 引物 |
| 2.1.2 反应体系 |
| 2.2 多重RT-PCR检测方法 |
| 2.2.1 多重RT-PCR检测方法反应所用引物 |
| 2.2.2 RT-PCR反应体系和反应流程 |
| 2.3 检测结果判定 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 临床样品 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.7.1 试剂盒性状检测 |
| 2.7.2 重复性试验 |
| 2.7.3 敏感性试验 |
| 2.7.4 特异性性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 方法建立及标准曲线 |
| 3.2 敏感性试验 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 临床样品检测 |
| 3.5 保存期试验 |
| 3.5.1 重复性试验 |
| 3.5.2 试剂盒性状试验 |
| 3.5.3 敏感性试验 |
| 3.5.4 保存期特异性检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（2）辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1.1.1 PRRS国内外流行历史及现状 |
| 1.1.2 病原学特性 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.1.4 PRRSV分子生物学研究进展 |
| 1.1.5 PRRSV免疫学研究进展 |
| 1.1.6 PRRS诊断方法研究进展 |
| 1.1.7 PRRS的综合防制 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试病毒样品 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 主要生物制剂和化学试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品的来源、采集及前处理 |
| 2.2.2 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 2.2.3 猪群PRRS临诊发病情况调查 |
| 2.2.4 猪主要组织器官中病原核酸检测 |
| 2.2.5 目的基因序列扩增与分析 |
| 2.2.6 PRRSV疫苗免疫后抗体检测 |
| 2.2.7 PRRS精准免疫防制措施的实施及效果评估 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 3.1.1 RT-PCR体系及反应条件优化 |
| 3.1.2 特异性试验 |
| 3.1.3 敏感性试验 |
| 3.1.4 重复性试验 |
| 3.1.5 PRRSV分型检测方法与其他检测方法相符率的比较 |
| 3.2 猪群PRRS临诊发病情况 |
| 3.3 猪群病原核酸检测 |
| 3.3.1 假定健康猪群HP-PRRSV核酸检测 |
| 3.3.2 疑似感染PRRSV分型检测 |
| 3.3.3 PRRSV与 CSFV、PRV和 PCV2混合感染情况 |
| 3.4 PRRSV及其他主要病毒性疫病部分基因扩增与序列分析 |
| 3.4.1 PRRSV ORF5和NSP2基因的扩增 |
| 3.4.2 PRRSV目的基因序列分析 |
| 3.4.3 CSFV、PRV主要致病基因和PCV2基因的扩增及序列分析 |
| 3.5 PRRSV疫苗免疫后抗体检测 |
| 3.5.1 猪场PRRSV抗体检测 |
| 3.5.2 PRRSV抗体动态检测 |
| 3.6 PRRS精准免疫防制措施的实施及效果评估 |
| 3.6.1 免疫程序 |
| 3.6.2 PRRS精准免疫防制措施实施猪场一 |
| 3.6.3 PRRS精准免疫防制措施实施猪场二 |
| 3.6.4 各场抗体水平比较 |
| 3.6.5 辽宁地区 PRRS 精准免疫防制措施实施前后效果评估 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 4.2 PRRS发病情况和病原体核酸检测及分析 |
| 4.2.1 部分猪场PRRS临诊发病情况及分析 |
| 4.2.2 猪群病原检测及分析 |
| 4.2.3 PRRSV及其他主要病毒性疫病分子演化分析 |
| 4.3 PRRSV疫苗免疫后抗体检测及分析 |
| 4.4 PRRS精准免疫防制措施的实施效果及分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 病原学 |
| 1.1.3 猪瘟流行病学和临床症状 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 伪狂犬的研究概况 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 伪狂犬流行病学和临床症状 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概况 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 病原学 |
| 1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学和临床症状 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 口蹄疫病的研究研究概况 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 病原学 |
| 1.4.3 口蹄疫病流行病学和临床症状 |
| 1.4.4 诊断方法 |
| 1.5 圆环病毒2 型的研究概况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 病原学 |
| 1.5.3 圆环病毒2型病流行病学和临床症状 |
| 1.5.4 诊断方法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 3 个规模化母猪场5 种疫病抗体检测与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 规模母猪场猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.2 规模母猪场伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.3 规模母猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.4 规模母猪场口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.5 规模母猪场圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测结果分析 |
| 第三章 A规模化母猪场圆环病毒2 型抗原检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品来源及抽样原则 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 圆环病毒2 型抗原ELISA检测 |
| 3.3 检测结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 A规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型鉴定及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病料采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 引物设计与合成 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 病毒核酸提取 |
| 4.1.7 PCR产物纯化回收、测序 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PCR扩增结果 |
| 4.2.2 基因核苷酸同源性分析 |
| 4.2.3 基因遗传进化树分析 |
| 4.3 .讨论 |
| 第五章 A规模化母猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫程序调整试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 调整后母猪抗体检测结果 |
| 5.2.3 调整前后母猪抗体合格率对比 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）猪圆环病毒2型ORF5基因突变毒株的构建及感染特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2 型的研究进展 |
| 1.1 猪圆环病毒的发现和分类 |
| 1.2 猪圆环病毒的起源和进化 |
| 1.3 猪圆环病毒2 型的流行病学 |
| 1.3.1 传染源 |
| 1.3.2 传播途径和方法 |
| 1.3.3 易感动物及非猪源储存宿主 |
| 1.3.4 致病机制 |
| 1.3.5 临床表现和病理变化 |
| 1.4 PCV2 感染对宿主细胞的影响 |
| 1.4.1 PCV2 感染与细胞内质网应激反应 |
| 1.4.2 PCV2 感染与细胞自噬 |
| 1.4.3 PCV2 感染和细胞凋亡 |
| 1.5 PCV2 的基因定点突变 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 ORF5 基因突变毒株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌株 |
| 2.1.2 试剂、抗体、试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 溶液配制 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 PCV2 克隆毒株和ORF5 基因突变毒株PCV2~(△ORF5)的拯救 |
| 2.2.5 拯救病毒的观察 |
| 2.2.6 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株的复制曲线的绘制 |
| 2.2.7 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株感染细胞后ERS和自噬标志基因的检测 |
| 2.2.8 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株感染细胞后ERS和自噬标志蛋白的检测 |
| 2.2.9 病毒感染细胞的细胞凋亡和细胞周期测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒PUC57-PCV2和PUC57-PCV2~(△ORF5)的酶切鉴定 |
| 2.3.2 rPCV2和PCV2~(△ORF5)拯救病毒的获得 |
| 2.3.3 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株的电镜观察 |
| 2.3.4 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株的复制曲线绘制 |
| 2.3.5 ORF5 基因突变减弱了PCV2 对细胞ERS的诱导 |
| 2.3.6 ORF5 基因突变减弱了PCV2 对细胞自噬的诱导 |
| 2.3.7 ORF5 基因突变减弱了PCV2 诱导的细胞凋亡及细胞周期阻滞 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PCV2~(△ORF5)对小鼠感染作用和病理观察 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 主要抗体、试剂、试剂盒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.2.2 动物分组和处理 |
| 3.2.3 小鼠感染后各项指标的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ORF5 基因突变毒株PCV2~(△ORF5)成功感染小鼠模型 |
| 3.3.2 小鼠组织病理变化观察结果 |
| 3.3.3 感染组小鼠各组织中ERS和自噬标志基因的检测 |
| 3.3.4 感染组小鼠各组织中ERS和自噬标志蛋白的检测 |
| 3.3.5 透射电镜观察攻毒小鼠组织中自噬小体和内质网应激作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）2019～2020年我国部分地区PRRS流行病学调查及PRRSV嵌合病毒pMLV+NADC30的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1.1 PRRSV基因组与蛋白 |
| 1.2 PRRSV的遗传进化 |
| 1.3 PPRSV疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 MLV疫苗 |
| 1.3.2 灭活疫苗 |
| 1.3.3 DNA疫苗 |
| 1.3.4 亚单位疫苗 |
| 1.3.5 活载体疫苗 |
| 1.3.6 重组嵌合疫苗 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 我国部分地区PRRSV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂、仪器与耗材 |
| 2.1.3 主要所需溶液配制 |
| 2.1.4 PRRSV参考毒株 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 样品PRRSV GP5 基因的检测 |
| 2.2.2 核苷酸同源性分析 |
| 2.2.3 氨基酸同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PRRSV pMLV+NADC30 嵌合病毒的构建及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要试剂、仪器与耗材 |
| 3.1.2 主要细胞与毒株 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 |
| 3.1.4 参考毒株 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pMLV感染性克隆的构建和病毒拯救 |
| 3.2.2 嵌合病毒pMLV+NADC30 的构建和拯救 |
| 3.2.3 拯救病毒的鉴定 |
| 3.2.4 拯救病毒在Marc-145 细胞的生长曲线 |
| 3.2.5 嵌合病毒的遗传稳定性 |
| 3.2.6 嵌合病毒与主要流行株共感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附录 |
（6）1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品处理与病毒分离 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 PRRSV全基因组cDNA片段的RT-PCR扩增 |
| 1.5 PRRSV Nsp2、ORF3和ORF5基因的PCR扩增 |
| 1.6 目的基因的克隆测序 |
| 1.7 Nsp2、ORF3、ORF5基因的序列比对和分析 |
| 1.8 细胞传代后病毒Nsp2基因检测 |
| 1.9 重组分析 |
| 1.10 GP5蛋白信号肽预测 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 PRRSV分离株Nsp2基因扩增结果 |
| 2.3 Nsp2、ORF3、ORF5基因的PCR扩增 |
| 2.4 SD18毒株全基因组序列遗传进化树 |
| 2.5 SD18毒株部分氨基酸序列分析 |
| 2.5.1 Nsp2基因核苷酸及编码氨基酸序列分析 |
| 2.5.2 ORF3基因核苷酸与编码氨基酸序列分析 |
| 2.5.3 ORF5基因核苷酸与编码氨基酸序列分析 |
| 2.6 ORF5基因编码产物抗原性分析 |
| 2.7 分离株传代后Nsp2基因检测 |
| 2.8 基因重组分析 |
| 2.10 GP5蛋白信号肽预测 |
| 3 讨论 |
（7）Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定及Nsp2和GP5基因的克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 前言 |
| 2. PRRSV病毒颗粒及基因组 |
| 3. PRRSV在中国的流行情况 |
| 3.1 经典PRRSV的流行情况 |
| 3.2 高致病性PRRSV的流行情况 |
| 3.3 NADV30样PRRSV的流行情况 |
| 4. PRRSV的传播途径 |
| 5 PRRSV的免疫应答过程 |
| 6. PRRSV的预防与控制 |
| 7. 本项目的立题依据 |
| 第二章 Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 实验样品和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 RNA提取 |
| 2.3 第一链c DNA的合成 |
| 2.4 PCR扩增 |
| 2.5 Marc-145 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.6 PRRSV的分离 |
| 2.7 病毒的空斑纯化 |
| 2.8 纯化病毒间接免疫荧光 (IFA) |
| 2.9 纯化病毒的RT-PCR鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 临床样品的RT-PCR检测结果 |
| 3.2Marc-145 细胞的培养 |
| 3.3 病毒的分离 |
| 3.4 病毒的空斑纯化 |
| 3.5 纯化病毒的IFA检测 |
| 3.6 纯化病毒的RT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Xinxiang2015株PRRSV Nsp2基因的克隆与序列分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 Xinxiang2015株RNA的提取 |
| 2.3 第一链c DNA的合成 |
| 2.4 Xinxiang2015株Nsp2基因的扩增 |
| 2.5 Nsp2基因的回收与纯化 |
| 2.6 含有NSP2基因重组载体的构建 |
| 2.7 Xinxiang2015株PRRSVNsp2基因序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Xinxiang2015株PRRSV Nsp2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 Xinxiang2015株PRRSV Nsp2基因的重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3 Nsp2基因蛋白氨基酸序列比对 |
| 3.4 PRRSV Nsp2基因的系统进化树分析 |
| 3.5 PRRSV Nsp2基因的序列比对 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因的克隆与序列分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 Xinxiang2015株RNA的提取 |
| 2.3 第一链c DNA的合成 |
| 2.4 Xinxiang2015株GP5基因的扩增 |
| 2.5 GP5基因的回收与纯化 |
| 2.6 含有GP5基因重组载体的构建 |
| 2.7 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因的重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3 GP5基因蛋白氨基酸序列比对 |
| 3.4 系统进化树分析 |
| 3.5 PRRSV GP5基因的序列比对 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）猪繁殖与呼吸综合征病毒HBap4/2018株遗传变异分析及致病性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PRRSV概述 |
| 1.1.1 PRRSV病原学 |
| 1.1.2 PRRSV基因组结构 |
| 1.1.3 PRRSV结构蛋白与功能 |
| 1.1.4 PRRSV非结构蛋白与功能 |
| 1.1.5 PRRSV遗传变异与重组机制 |
| 1.2 我国PRRSV流行状况与防控 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 2017–2019年我国部分地区PRRSV分子流行病学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 临床样品采集 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料处理 |
| 2.2.2 病料的RNA提取 |
| 2.2.3 病毒cDNA的合成 |
| 2.2.4 样品检测 |
| 2.2.5 目的基因片段扩增 |
| 2.2.6 目的基因的PCR产物纯化 |
| 2.2.7 目的基因与载体连接 |
| 2.2.8 重组质粒的转化 |
| 2.2.9 菌液PCR鉴定与测序 |
| 2.2.10 遗传进化分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 样品检测结果 |
| 2.3.2 PRRSV特异性片段的扩增结果 |
| 2.3.3 Nsp2基因的遗传进化和同源性分析 |
| 2.3.4 Nsp2氨基酸序列比对 |
| 2.3.5 ORF5基因的遗传进化及同源性分析 |
| 2.3.6 GP5氨基酸序列比对 |
| 2.3.7 Nsp9基因的遗传进化分析及同源性分析 |
| 2.3.8 Nsp9氨基酸序列比对分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HBap4/2018株的分离鉴定与遗传变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病料 |
| 3.1.2 抗体、病毒和细胞 |
| 3.1.3 主要试剂与仪器 |
| 3.1.4 引物合成 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PRRSV毒株的分离 |
| 3.2.2 RT-PCR鉴定 |
| 3.2.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.4 噬斑形态观察 |
| 3.2.5 病毒生长曲线绘制 |
| 3.2.6 全长基因组扩增与克隆测序 |
| 3.2.7 PRRSV分离株的遗传变异分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 病毒分离的CPE观察 |
| 3.3.2 分离毒株的RT-PCR鉴定 |
| 3.3.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.3.4 病毒生长特性分析 |
| 3.3.5 病毒全长基因扩增 |
| 3.3.6 分离毒株的全基因组遗传进化分析 |
| 3.3.7 SHpd1/2018分离株的重组分析 |
| 3.3.8 HBap4/2018分离株的重组分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PRRSV自然重组毒HBap4/2018 对仔猪的致病性评价 |
| 4.1 实验材料及设备 |
| 4.1.1 毒株与实验猪 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 实验动物筛选与分组 |
| 4.2.2 实验猪攻毒 |
| 4.2.3 临床症状观察 |
| 4.2.4 样品采集及处理 |
| 4.2.5 PRRSV抗体检测 |
| 4.2.6 病毒载量检测 |
| 4.2.7 血液中病毒滴度检测 |
| 4.2.8 血液中病毒的分离与鉴定 |
| 4.2.9 剖检及组织病理学观察 |
| 4.2.10 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 试验猪临床症状观察 |
| 4.3.2 体温变化 |
| 4.3.3 日增重变化 |
| 4.3.4 试验猪存活率统计 |
| 4.3.5 血清中PRRSV抗体检测 |
| 4.3.6 鼻拭子排毒及病毒血症检测 |
| 4.3.7 血液中病毒滴度检测 |
| 4.3.8 血液中病毒的分离与鉴定 |
| 4.3.9 剖检病理观察 |
| 4.3.10 组织病理变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）我国Lineage 3 PRRSV的流行病学调查及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 1.2 PRRSV的病原学特征 |
| 1.2.1 病毒粒子的形态结构 |
| 1.2.2 理化特性 |
| 1.2.3 PRRSV基因组结构与功能 |
| 1.2.4 PRRSV的感染性 |
| 1.3 PRRSV流行病学 |
| 1.3.1 流行传播特点 |
| 1.3.2 PRRSV检测方法 |
| 1.3.3 PRRSV的分型 |
| 1.4 抗体和单克隆抗体 |
| 1.4.1 抗体分子的结构和功能 |
| 1.4.2 单克隆抗体 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样本材料 |
| 2.1.2 实验试剂与实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 病毒、细胞、单克隆抗体和感受态菌株 |
| 2.1.5 检测引物和Lineage 3 PRRSV扩增引物的设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样本材料的处理 |
| 2.2.2 PRRSV毒株测序 |
| 2.2.3 新发Lineage 3 PRRSV遗传演化分析 |
| 2.2.4 新发Lineage 3 PRRSV重组分析 |
| 2.2.5 PRRSV毒株的分离 |
| 2.2.6 免疫原的制备与纯化 |
| 2.2.7 小鼠的免疫 |
| 2.2.8 IFA检测 |
| 2.2.9 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.10 MAbs腹水的制备 |
| 2.2.11 MAbs生物学特性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样品PCR检测结果 |
| 3.2 Lineage 3 PRRSV同源性分析 |
| 3.2.1 ORF5核苷酸同源性分析 |
| 3.2.2 Lineage 3 PRRSV全基因组核苷酸同源性分析 |
| 3.3 Lineage 3 PRRSV遗传演化分析 |
| 3.4 Lineage 3 PRRSV ORF5 基因推导氨基酸序列比对 |
| 3.5 Lineage 3 PRRSV Nsp2 基因推导氨基酸序列比对 |
| 3.6 Lineage 3 PRRSV重组分析 |
| 3.7 Lineage 3 PRRSV分离结果 |
| 3.8 免疫原的纯化及鉴定 |
| 3.9 小鼠免疫结果确定 |
| 3.10 细胞融合及阳性MAbs筛选 |
| 3.11 MAbs生物学特性分析 |
| 3.11.1 MAbs广谱性 |
| 3.11.2 MAbs分泌抗体的稳定性 |
| 3.11.3 MAbs及腹水效价测定 |
| 3.11.4 MAbs中和活性确定 |
| 3.11.5 MAbs阻断效果 |
| 3.11.6 单克隆抗体结合蛋白的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCR检测结果分析 |
| 4.2 同源性分析 |
| 4.3 遗传进化分析 |
| 4.4 推导氨基酸比对 |
| 4.5 重组分析 |
| 4.6 免疫抗原的选择 |
| 4.7 细胞融合和阳性筛选 |
| 4.8 单克隆抗体生物学特性分析 |
| 4.9 单克隆抗体阻断性效果 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）新型PRRSV变异株鉴定及其致病力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述 |
| 1 PRRS历史 |
| 2 PRRSV的分子生物学 |
| 2.1 PRRSV及其分类 |
| 2.2 PRRSV基因组结构和功能 |
| 3 PRRS的流行病学与临床表现 |
| 4 PRRSV致病性 |
| 5 PRRS防控现状 |
| 第二章 PRRS诊断方法研究进展 |
| 1 病原学及血清学诊断技术 |
| 1.1 病原分离 |
| 1.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.3 间接免疫荧光(IFA) |
| 2 分子生物学诊断技术 |
| 2.1 常规RT-PCR |
| 2.2 荧光定量RT-PCR技术 |
| 第三章 PRRSV的反向遗传学 |
| 1 PRRSV反向遗传学的原理 |
| 2 PRRSV反向遗传学的应用 |
| 2.1 致病性研究方面 |
| 2.2 疫苗研究方面 |
| 3 研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 通用及四重PRRSV荧光定量RT-PCR方法建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株和临床样品 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 质粒标准品合成 |
| 2.3 核酸提取和反转录 |
| 2.4 标准曲线的绘制 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 组内和组间重复性试验 |
| 2.8 临床样品检测 |
| 2.9 ORF5测序 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准曲线绘制 |
| 3.2 特异性检测试验 |
| 3.3 敏感性检测试验 |
| 3.4 组内和组间重复性试验 |
| 3.5 临床应用与测序分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 新型高致病性PRRSV毒株鉴定及致病力研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、临床样品及抗体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品处理 |
| 2.2 临床样品检测 |
| 2.3 病毒分离和鉴定 |
| 2.4 全基因组序列扩增 |
| 2.5 病毒全基因组测序与遗传演化分析 |
| 2.6 动物攻毒试验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床样品检测 |
| 3.2 病毒分离与间接免疫荧光鉴定 |
| 3.3 病毒生长曲线测定 |
| 3.4 基因组分析比较 |
| 3.5 进化分析 |
| 3.6 致病性分析 |
| 3.7 病理变化 |
| 3.8 潜在的致病性相关氨基酸位点 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 新型HP-PRRSV变异株感染性克隆构建与病毒拯救 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 质粒构建 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 XJ17-5和JSTZ1712-12感染性克隆构建与拯救 |
| 2.3 含有荧光标记的XJ17-5和JSTZ1712-12感染性克隆的构建与拯救 |
| 2.4 XJ17-5和JSTZ1712-12 120个氨基酸回补感染性克隆的构建与病毒拯救 |
| 2.5 XJ17-5和JSTZ1712-12不同片段互换嵌合病毒构建与拯救 |
| 2.6 XJ17-5和JSTZ1712-12相关感染性克隆病毒鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染性克隆构建 |
| 3.2 感染性克隆拯救病毒细胞病变观察 |
| 3.3 拯救病毒间接免疫荧光检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
四、猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF_5基因的克隆及序列分析（论文参考文献）
- [1]QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立[D]. 丁耀忠. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用[D]. 关淼. 东北农业大学, 2021
- [3]规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整[D]. 宋健颖. 塔里木大学, 2021(08)
- [4]猪圆环病毒2型ORF5基因突变毒株的构建及感染特性研究[D]. 冯全文. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]2019～2020年我国部分地区PRRS流行病学调查及PRRSV嵌合病毒pMLV+NADC30的构建[D]. 王玥. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析[J]. 胡栋,朱迎春,赵情,庞恒,李传刚,王亭亭,常维山,彭军,吴家强. 中国兽医学报, 2021(02)
- [7]Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定及Nsp2和GP5基因的克隆与分析[D]. 张伟涛. 河南科技学院, 2020(11)
- [8]猪繁殖与呼吸综合征病毒HBap4/2018株遗传变异分析及致病性评价[D]. 谭祥梅. 中国农业科学院, 2020(01)
- [9]我国Lineage 3 PRRSV的流行病学调查及其单克隆抗体的制备[D]. 许浒. 东北农业大学, 2020(04)
- [10]新型PRRSV变异株鉴定及其致病力研究[D]. 叶梦雪. 扬州大学, 2020