一、猪胸腺素F5的制备和在细胞免疫研究中的应用（论文文献综述）
吴正可[1]（2021）在《嗜酸乳杆菌对肉鸡的益生作用及其机制研究》文中提出家禽感染病原菌后往往伴随着免疫性能的下降和肠道健康的受损,被污染的家禽及其肉、蛋产品是病原菌重要的携带者,这不仅在全世界范围内给畜禽养殖业带来巨大经济损失,同时也严重威胁着人类健康。因此,通过营养调控措施减少养殖过程中病原菌感染、氧化应激等因素引起的肠道损伤,对于维持家禽肠道及整体健康具有重要的意义。乳酸菌作为肉鸡肠道免疫系统的重要组成部分可通过促进肠道微生态平衡,提高肉鸡肠道屏障功能和免疫性能,在动物肠道健康调控方面具有显着优势。本研究通过七个试验在体内和体外水平上探讨了嗜酸乳杆菌的益生作用及其缓解肉鸡肠道炎症反应的机制。试验一评估了十株益生菌体外对病原菌大肠杆菌O157（以下简称大肠杆菌）和鸡白痢沙门氏菌（以下简称沙门氏菌）的抑菌活性,并挑选出一株抑菌效果较好的嗜酸乳杆菌E继续探究其抑菌物质及其对肉鸡饲喂效果。嗜酸乳杆菌E代谢产物中乳酸含量随培养时间线性升高,且其浓度与嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌（R2=0.9780）和沙门氏菌（R2=0.9714）的抑制能力呈线性相关。嗜酸乳杆菌E无溶血现象发生,抗生素敏感性良好,肉鸡饲喂结果发现嗜酸乳杆菌E显着提高了肉鸡1～14日龄的平均日采食量（ADFI,P<0.05）,并有提高肉鸡14日龄体重（BW,P=0.09）的趋势。血清结果表明嗜酸乳杆菌E降低了肉鸡21日龄血清中葡萄糖、总胆固醇、尿素氮（P>0.05）和甘油三酯（P<0.05）的含量。试验二研究了嗜酸乳杆菌E固态发酵饲料对肉鸡生长性能和肠道发育的影响。试验采用2×4因子试验设计,研究嗜酸乳杆菌E发酵饲料（制粒与不制粒）和添加水平（0,5%,10%,15%）及二者的交互作用,试验期为42d。试验结果表明,制粒与发酵对1～21日龄肉鸡BW、ADFI和饲料转化率（FCR）存在显着交互作用（P<0.05）;10%的发酵饲料显着提高了肉鸡全期ADG和ADFI（P<0.05）。嗜酸乳杆菌E发酵饲料提高了肉鸡42日龄小肠总长度和总重量,并提高了空肠绒毛高度与绒毛高度/隐窝深度（V/C）比值和养分消化率（P<0.05）,促进了肉鸡肠道发育。此外,发酵饲料下调了肉鸡空肠炎症因子IL-6、IL-8及i NOS m RNA的表达（P<0.05）,并上调了空肠屏障功能蛋白Occludin和Claduin-1 m RNA的表达（P<0.05）,提高了肉鸡肠道免疫功能和屏障功能。试验三研究了嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡生长性能和免疫功能的调节作用。试验采用3×2因子试验设计,研究嗜酸乳杆菌E（0,5×108CFU/kg和10×108CFU/kg）和大肠杆菌感染（大肠杆菌攻毒和不攻毒）及其交互作用。大肠杆菌感染降低了肉鸡第15～21日龄的ADG（P<0.05）、ADFI（P<0.05）和BW（P=0.083）;嗜酸乳杆菌E显着提高了肉鸡1～14日龄和15～21日龄的ADG和ADFI（P<0.05）,显着降低了大肠杆菌感染组肉鸡死亡率（P<0.05）。大肠杆菌感染降低了肉鸡外周血中CD3+（P<0.05）和CD8+（P>0.05）T淋巴细胞亚群比例及血清免疫球蛋白含量（P<0.05）。嗜酸乳杆菌E干预显着增加了大肠杆菌感染肉鸡外周血CD3+T淋巴细胞亚群的比例（P<0.05）。5×108CFU/kg和10×108CFU/kg水平的嗜酸乳杆菌E显着抑制了大肠杆菌感染肉鸡14日龄空肠NF-κB、TNF-α和IL-8 m RNA表达上调（P<0.05）,并上调了抑炎因子IL-10的表达量;嗜酸乳杆菌E干预下调了大肠杆菌感染组肉鸡21日龄脾脏i NOS和空肠IL-8 m RNA表达（P<0.05）。肉鸡日粮中添加嗜酸乳杆菌E提高了肉鸡生产性能和免疫性能,缓解了大肠杆菌感染引起的炎症反应。试验四在试验三的基础上进一步研究了嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡肠道发育和肠道屏障功能的调节作用。试验结果表明大肠杆菌感染显着增加了肉鸡14和21日龄血清中C反应蛋白（CRP）、二胺氧化酶（DAO）和内毒素LPS（P<0.05）含量,并有降低肉鸡小肠总长度的趋势（P>0.05）;同时,大肠杆菌感染下调了肉鸡14日龄空肠Occludin-1和Claudin-1 m RNA的表达。嗜酸乳杆菌干预则降低了大肠杆菌感染组肉鸡血清CRP、DAO和LPS的含量（P<0.05）,并上调了肉鸡14日龄和21日龄空肠Occludin和Claudin-1 m RNA和21日龄回肠Occludin、ZO-1和Claudin-1m RNA的表达（P<0.05）,缓解了大肠杆菌感染引起的炎症反应及其导致的肠道损伤。试验五研究了嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡回肠微生物区系的影响。大肠杆菌感染增加了肉鸡回肠中变形菌门和链球菌属、肠球菌属、大肠埃稀氏-志贺菌属和葡萄球菌属等致病菌的相对丰度,嗜酸乳杆菌E干预则显着降低了大肠杆菌感染组肉鸡回肠中幽门螺旋杆菌属、链球菌属、肠球菌属、大肠埃稀氏-志贺菌属和葡萄球菌属相对丰度（P<0.05）。嗜酸乳杆菌E和大肠杆菌感染均增加了肉鸡21日龄回肠食糜微生物Ace指数和Chao指数（P<0.05）,并降低了肉鸡回肠厚壁菌门的丰度,增加了蓝藻菌门、拟杆菌门和放线菌门的丰度（P<0.05）。肠道中致病菌葡萄球菌属、链球菌属和大肠埃稀氏-志贺菌属与肠道炎症因子和肠道屏障功能m RNA表达量呈显着正相关（P<0.05）。大肠杆菌感染增加了肉鸡回肠致病菌相关菌群的丰度,嗜酸乳杆菌E干预改善了由大肠杆菌感染引起的肠道菌群紊乱。试验六基于Lab-free蛋白组学技术进一步解析嗜酸乳杆菌E缓解大肠杆菌感染肉鸡肠道损伤作用机制。研究结果表明,大肠杆菌感染上调了回肠中凝血、止血、伤口愈合、体液水平调节、应对损伤、细菌防御反应、细胞死亡、凋亡等生物学过程,并通过上调NOD样和PPAR信号通路等过程启动免疫应答;嗜酸乳杆菌E干预上调了大肠杆菌感染肉鸡回肠Pyrin-like、溶菌酶、组蛋白、核糖体蛋白等的表达,并通过降低肉鸡肠道内分子转录水平及相关基因沉默调控,阻断了病原菌在炎症反应中的信号传递,下调了大肠感染肉鸡回肠中凝血、止血、伤口愈合、体液水平调节、应对损伤、氧化还原过程和应激反应等不利生物学过程,缓解了大肠杆菌感染对肉鸡肠道的损伤。试验七通过Caco-2细胞模型研究了嗜酸乳杆菌E抑制大肠杆菌诱导肠道炎症反应的机制。研究表明,大肠杆菌通过识别TLR-4/My D88依赖型途径激活NF-κB信号通路显着上调了Caco-2细胞炎症因子IL-6、IL-8和TNF-αm RNA的表达（P<0.05）,并显着上调了调控细胞凋亡过程关键蛋白Caspase-3、Capase8和P53-R m RNA的表达（P<0.05）,诱导细胞坏死。嗜酸乳杆菌E及其上清液提前干预可降低大肠杆菌在Caco-2细胞上的黏附（P<0.05）,缓解大肠杆菌感染Caco-2细胞的炎症反应,减少坏死细胞的数量并降低Caco-2单层细胞的通透性,对细胞起到保护作用。综上所述,嗜酸乳杆菌E对肉鸡具有促进生长和改善肠道健康的益生作用。大肠杆菌O157感染通过TLR-4/My D88依赖型途径激活NF-κB信号通路产生炎症反应,激发肠道细胞坏死性凋亡等生物学过程。嗜酸乳杆菌E提前干预从降低黏附、改善肠道菌群结构和机械、免疫屏障促进肠道发育等途径缓解了大肠杆菌感染引发的炎症反应及其导致的肠道损伤。
张丽[2]（2021）在《小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究》文中提出研究背景免疫衰老指随着年龄的增长,因免疫器官结构破坏和免疫反应功能障碍,造成先天性和适应性免疫受损,导致老年人免疫功能的改变,伴随以慢性炎症为特征的全身炎症状态,与感染、自身免疫性疾病以及肿瘤等的发生发展密切相关。目前免疫衰老的确切机制尚未完全明确。初级和次级淋巴器官结构和功能的破坏可导致免疫功能减退,因此免疫器官增龄性变化可能与免疫衰老的发生有关。胸腺和脾脏作为机体最大的中枢和外周免疫器官,随着年龄增加,结构和功能发生改变,正常微环境的破坏以及T淋巴细胞数目的减少引起机体免疫功能的减退,影响外周免疫的稳态,可能促进与年龄有关的机体炎症状态以及免疫衰老的发生。衰老引起的胸腺及脾脏结构和功能的变化可能与免疫衰老存在关联。目的胸腺和脾脏增龄性分子变化以及机制目前尚未明确。本实验通过基于整合转录组和蛋白质组学方法,揭示不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的增龄性分子变化,探讨胸腺、脾脏的增龄性变化在免疫衰老中潜在作用,为免疫衰老导致的相关疾病的诊治提供可能的候选靶标。方法本实验首先通过HE染色、免疫组化以及透射电镜超微观察等方法研究不同年龄组（6周龄,6月龄,20月龄）小鼠胸腺和脾脏免疫器官组织学变化。随后通过整合RNA-seq转录组学方法以及串联质谱标签（TMT）相对定量蛋白质组学技术,研究不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的表达差异变化,结合生物信息学方法分析其所富集的通路,筛选出增龄相关的差异基因和蛋白,并进一步验证筛选出的差异基因与蛋白。结果1.小鼠增龄性免疫器官重量及指数变化小鼠鼠体重随着年龄增长而增加。小鼠胸腺重量随年龄增加而减少,20月龄组和6月龄组小鼠胸腺重量均显着低于6周龄组,且具有统计学意义。小鼠脾脏重量随着年龄增加变化不显着,20月龄和6月龄组小鼠脾脏重量高于6周龄组,均无统计学差异。小鼠胸腺指数和脾脏指数均随年龄增加而显着减少。2.免疫器官组织学变化（1）胸腺HE染色:6周龄组小鼠胸腺皮髓质界限清晰,皮质着色深,淋巴细胞致密、染色较深;髓质着色较浅,结构稍疏松,淋巴细胞数目较皮质少,有大量TECs。6月龄组小鼠胸腺组织皮质成分变薄,皮髓质内胸腺细胞间隙增大,皮/髓比显着降低;髓质内TECs数目较少。20月龄组小鼠胸腺组织较6周龄、6月龄组明显萎缩、面积显着减少,周围可见结缔组织包绕、替代,皮髓质界限不清;胸腺细胞、TECs数量均较少,胸腺细胞深染、不规则,成纤维细胞数目增加。免疫组化:随着年龄增加,小鼠胸腺皮、髓质中CD3阳性T淋巴细胞、Ep CAM阳性TECs数目显着减少。20月龄组皮质TECs较6周龄与6月龄组显着减少,20月龄与6月龄组髓质TECs较6周龄组显着减少;20月龄与6月龄组皮质淋巴细胞较6周龄组显着减少,20月龄组髓质淋巴细胞较6周龄与6月龄组显着减少;20月龄与6月龄组巨噬细胞较6周龄组显着增加。超微结构:小鼠胸腺随年龄增长,细胞数目减少、结构疏松,淋巴细胞核趋于不规则,核质比小;可见坏死胸腺的上皮细胞。20月龄组可见凋亡现象增加,上皮细胞线粒体呈空泡变。（2）脾脏HE染色:6周龄组小鼠脾脏红、白髓、边缘区结构清晰,脾脏小体结构规则,淋巴滤泡深染,淋巴细胞致密。6月龄组小鼠脾脏红、白髓界限模糊,边缘区较6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,淋巴细胞较6周龄组稍疏松。20月龄组小鼠皮髓质界限模糊,脾脏小体结构不规则,白髓萎缩、面积减少,红髓面积相应增大,红/白髓比显着升高;边缘区较6月龄组与6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,实质内成纤维细胞、纤维结缔组织增生。免疫组化:随着年龄增加,小鼠脾脏白髓内淋巴细胞数目显着下降,白髓边缘区与生发中心内B淋巴细胞数目增加,边缘区巨噬细胞数目增龄性显着增加。超微结构:6周龄小鼠脾脏内淋巴细胞较致密,核规则呈圆形,核质比大,异染色质较多,胞浆线粒体、内质网、有力的核糖体较丰富;局部散在中性粒细胞、浆细胞、巨噬细胞等。6月龄小鼠脾脏内淋巴细胞部分核稍不规则,异染色质边聚,部分胞浆内可见线粒体空泡变;凋亡细胞增加。20月龄小鼠脾脏内淋巴细胞疏松,数目明显减少,核不规则,异染色质边聚,呈块状,凋亡细胞明显增加。3.ELISA检测细胞因子结果显示,小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6等有增龄性升高趋势,20月龄组中IL-10、TNF-α和IL-6水平高于6周龄组、6月龄组,20月龄、6月龄组中IFN-γ水平高于6周龄组,均无显着性统计学差异。4.胸腺转录组和蛋白组学结果分析RNA-Seq方法筛选出524个胸腺增龄相关差异表达基因,主要参与信号转导过程（PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路）、信号分子和相互作用过程（ECM-受体相互作用）、免疫系统（B细胞受体信号通路、补体和凝血级联、趋化因子信号通路）等信号通路;TMT技术确定113个胸腺增龄相关差异表达蛋白,主要参与能量代谢过程如柠檬酸盐循环（TCA循环）、细胞生长与死亡过程（细胞周期、凋亡过程）、遗传信息处理过程（剪接体）、内分泌系统（脂肪细胞因子信号通路）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与胸腺增龄相关的Fgf2、Flt1、BMP4、v WF、Lamc1、CD19、Cxcr5等重要差异基因以及CKS1、SRSF2、CASP-3、FGF2、CPT1B、PTMA、NASP等重要差异蛋白。5.脾脏转录组和蛋白组学结果分析基于RNA-Seq方法筛选出28个脾脏增龄相关差异表达基因,主要参与炎症反应、免疫相关通路,包括趋化因子信号转导途径,MAPK信号通路、Rap1信号通路等信号通路。TMT技术确定133个组织脾脏增龄相关差异表达蛋白,参与细胞生长与死亡过程（细胞周期）、遗传信息处理过程（翻译、核糖体）、细胞运动性过程（肌动蛋白细胞骨架调节）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与脾脏增龄相关的、vsig4、cfh、c7、cx3cl1、penk、ccl8、prkcz等重要差异基因以及CCNA2、ATOX1、CCR6、CXCL5、EIF3L、GZMA、RABL3、SLAMF1、RSL24D1等重要差异蛋白。结论随着年龄增长,小鼠免疫器官胸腺和脾脏在组织结构和免疫细胞分布上发生了变化,主要表现为微环境破坏、T淋巴细胞减少。衰老个体中炎症因子水平高于幼年组。不同年龄段小鼠胸腺和脾脏组织在基因和蛋白水平上表达存在明显差异性。增龄过程中,胸腺在基因水平上的变化表现为胸腺微环境受影响,脂肪生成活动增强,胸腺上皮细胞分化、生成以及胸腺细胞迁移、增殖或分化受影响,促炎作用增强等;在蛋白水平上表现为能量代谢增加,细胞生长、遗传物质传递相关过程受损,细胞凋亡活动增强、凋亡抑制作用减弱,脂质代谢增强,胸腺微环境受影响、促炎细胞因子分泌增加等。增龄过程中,脾脏在基因水平上的变化表现为T细胞增殖的抑制活动增强,促进细胞死亡活动增加,细胞凋亡的信号转导途径激活,促炎活动增强等。在蛋白水平上表现为细胞周期、蛋白质合成受损,细胞增殖活性减退、迁移过程受影响,抗氧化作用增强,T、B细胞激活作用增强、促炎反应增强等。衰老对胸腺和脾脏的影响主要包括影响其组织正常结构及其正常的生长、发育过程,此外促炎反应的增强可能与免疫衰老的炎症状态相关。本研究结果为阐明胸腺、脾脏增龄性分子变化以及探讨其在免疫衰老中可能存在的作用提供理论依据。
尹良伟[3]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中进行了进一步梳理自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
李晓聪[4]（2020）在《Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究》文中研究说明羊绒是重要的高端纺织品原材料,随着世界范围内羊绒市场的日益扩大,对羊绒产量及质量的要求也日益提高。绒山羊作为我国优良的畜种,其羊绒品质优良,但多年来在绒山羊选育中为了提高羊绒产量盲目进行杂交,造成山羊平均产绒量和羊绒质量降低、传统良种和改良品种所占比例不高等问题。利用现代生物技术对绒山羊进行分子育种是今后绒山羊育种的重要方向。胸腺素β4具有多种生物学功能,其对毛发生长的促进作用已在很多研究中被证实,但作用机制还没有明确的定论。本研究在利用基因编辑技术获得Tβ4基因定点整合绒山羊的基础上,对Tβ4基因定点整合绒山羊进行鉴定及健康状况评价,观察Tβ4基因对绒山羊绒毛生长的影响,利用Tβ4基因定点整合绒山羊进行扩繁并对后代进行检测,进一步结合转录组学及蛋白组学分析探究Tβ4基因促进绒毛生长的机制,为今后利用基因编辑技术培育高产优质绒山羊提供理论依据。一、Tβ4基因定点整合绒山羊的检测1、Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价本研究在利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术获得了Tβ4基因在CCR5位点定点整合绒山羊的基础上,对该基因编辑绒山羊进行了southern blot检测、Real-time PCR检测及免疫细胞化学检测,检测结果表明我们获得的绒山羊实现了Tβ4基因在CCR5位点的定点整合。另外,对基因编辑绒山羊的安全问题及健康状况进行检测,检测指标主要包括脱靶分析、插入位点CCR5基因邻近基因mRNA水平的检测、生长状况监测及血常规检测,结果表明在所检测到的潜在脱靶位点中未出现脱靶现象,CCR5邻近基因的表达也未受到影响,绒山羊的生长状况及血液指标与对照相比均无显着差异。说明Tβ4基因的定点整合并未影响整合位点周围内源基因的表达,且获得的基因编辑绒山羊生长状况及健康状况良好。2、Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测对绒山羊的产绒性能进行检测,检测指标主要包括绒纤维强伸度、细度、绒与毛的质量比及产绒量,检测结果表明,Tβ4基因定点整合绒山羊的绒纤维强伸度及细度与对照相比无显着差异,绒与毛的质量比与对照相比显着提高,产绒量与对照相比提高了74.5%。同时,还对绒山羊的皮肤组织进行了石蜡切片HE及免疫组织化学染色,结果表明Tβ4基因定点整合绒山羊的次级毛囊与初级毛囊的比（S/P）及次级毛囊处Tβ4基因的表达与对照相比显着提高。说明Tβ4基因主要作用于次级毛囊,并通过增加次级毛囊的数量进而提高产绒量。3、Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测对Tβ4基因定点整合绒山羊进行超数排卵处理,共获得20个2-8细胞期的胚胎,将这些胚胎分别移入4只受体羊中,共得到7只后代,其中有3只后代出生后不久死亡,经PCR鉴定,死亡的3只羔羊中有2只实现了Tβ4基因定点整合,存活的4只羔羊中有3只实现Tβ4基因定点整合。对4只存活羔羊的皮肤组织进行石蜡切片、HE染色、免疫组化及Tβ4基因的qPCR检测,发现Tβ4基因定点整合的羔羊表现出了更密集的次级毛囊分布及更高的S/P,并且Tβ4基因在次级毛囊处的表达量显着提高。对3只死亡羔羊进行解剖,取各内脏器官检测Tβ4基因mRNA表达情况,结果显示3只羔羊各脏器组织中Tβ4基因mRNA表达水平无显着差异,表明Tβ4基因的定点整合只会使其在皮肤组织中高表达而不会影响该基因在其它脏器中的表达,且利用基因编辑获得的Tβ4基因定点整合绒山羊可以将其优良性状稳定遗传给后代。二、Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究1、Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析将对照绒山羊与Tβ4基因定点整合绒山羊的皮肤组织进行高通量转录组测序,共筛选到差异基因1076个,其中上调基因463个,下调基因613个。上调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在肽酶活性的负调控、皮肤屏障的建立、皮肤失水的调节;在实现的分子功能中主要富集在生长因子受体的结合。下调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在多细胞生物过程的调控、细胞粘着;在实现的分子功能中主要富集在钙离子的结合。差异基因在KEGG富集分析中显着富集在了血管平滑肌收缩信号通路、cGMP-PKG信号通路、细胞黏附分子信号通路、肾素分泌信号通路、白细胞跨内皮细胞迁移信号通路。对差异基因富集的信号通路进一步分析,筛选了关键的差异基因,发现这些差异基因主要参与细胞间的连接,调节细胞间的运动并影响血管生成、血管舒张、血管通透性的改变及血管稳定性的维持等。对这些差异基因进行了实时定量PCR验证,结果与转录组测序相符。说明Tβ4可能通过影响细胞间的连接进而影响了细胞的运动,同时还影响了毛囊周围血管的生成及血管的舒张等,最终达到了促进绒毛生长的作用。2、Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析利用iTRAQ技术,分析Tβ4基因定点整合绒山羊与对照绒山羊皮肤组织中的差异蛋白,共筛选到875个差异蛋白,其中上调蛋白666个,下调蛋白209个。上调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在离子跨膜运输;在实现的分子功能中主要富集在有机阴离子跨膜转运体活性。下调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在醛生物合成的过程和组蛋白mRNA代谢过程;在实现的分子功能中主要富集在锂离子结合和碱金属离子结合。在KEGG富集分析中,差异表达的蛋白显着富集在囊泡运输中的相互作用信号通路及TRP通道炎症介质调控信号通路,筛选了关键的差异蛋白包括MAPK、CAMK、PKC等。将蛋白组学分析与转录组学分析进行关联,发现共同上调或下调的差异基因/蛋白,结合信号通路,分析结果表明Tβ4的过表达使TIMPs的表达降低,进而MMPs的表达升高,促进了基底膜及细胞外基质的降解,释放出了与蛋白多糖以非共价键连接的VEGF,VEGF与VEGFR-2结合后激活了p38 MAPK信号通路,另外,Tβ4也激活了PKC信号通路。说明Tβ4通过MAPK及PKC信号通路影响肌动蛋白的组装,影响细胞的迁移、调节细胞的增殖与分化,最终促进了毛发的生长。
魏惠平[5]（2020）在《当归醇提物对SHR血压及靶器官的影响及分子机制探讨》文中认为目的1.明确当归醇提物对SHR血压和靶器官的作用。2.基于Th17/Treg细胞平衡探讨当归醇提物干预SHR血压和靶器官损伤的分子机制。方法1.系统检索Cochrane、Web of science、PubMed、Embase、中国知网、万方、CBM七个数据库,纳入当归和含有当归的复方制剂治疗高血压及其并发症的相关研究。使用EXCEL 2013和SPSS 21对数据进行整合与处理,并通过气泡图来呈现结果。2.结合70%乙醇热回流法和喷雾干燥法制备当归有机酸;建立高效液相色谱法测定当归醇提物中阿魏酸含量的方法,通过阿魏酸含量控制当归醇提物的质量。3.动物分组:空白组9只WKY大鼠,模型组、阳性对照组（贝那普利）、当归醇提物低、中、高剂量组各9只SHR大鼠。空白组和模型组用等体积生理盐水,阳性对照组用贝那普利片10mg/d,当归醇提物低、中、高剂量组分别用对应剂量,进行灌胃,每日1次,连续8周。监测各组大鼠血压及其他生理参数;通过大鼠心脏彩超、HE染色、Masson染色评估心脏形态结构和功能;采用ELISA、Western Blot、RT-PCR实验方法检测血清中NF-κβ、VCAM-1、ET-1、ICAM-1、eNOS含量,并基于蛋白-基因层面监测RAAS系统和氧化应激成分的表达;评价当归醇取物对SHR肝肾功能的影响。4.基于网络药理学筛选当归治疗高血压及靶器官保护的信号通路。5.建立SHR模型,随机分为模型组、贝那普利组、当归醇提物高剂量组,并设空白组（WKY）。ELISA法检测血清炎症指标IL-6、CRP以及Th17、Treg表达因子IL-17、IL-23、IL-10、TGFβ1含量;流式细胞技术检测外周血中Th17、Treg细胞,并计算Th17/Treg比率;qPCR检测大鼠肾组织转录因子FoxP3和RORγt的表达;Western Blot检测大鼠肾组织p38、p-p38、FoxO1、p-FoxO1、SGK1和IL-23R表达。结果1.Evidence Mapping分析纳入的RCT研究,总有效性结局指标占69.4%,有效率与对照组相比具有统计学差异;纳入研究干预措施中所用的中药药性将其分为补气活血法、补气养血法、补气养阴活血法等八大类,大部分药性类型为活血化瘀方;纳入文献中治疗组与对照组在降压、靶器官保护,不良反应等方面具有统计学差异。2.当归醇提物的制备及质量控制当归醇提物呈棕褐色细粉。高效液相色谱条件为C18色谱柱,流动相由乙腈-0.1%磷酸溶液组成,梯度洗脱,洗脱时间为:0-30 min,A:95%-5%（v/v）,B:5%-95%（v/v）;检测波长为316 nm;该方法专属性强,精密度,回收率能满足体外分析要求;当归醇提物中阿魏酸平均含量为（151.525±0.002）%（μg/g）。3.当归醇提物对SHR的降压效果评价指标及肝肾功能影响血压及一般状况:给药2、4、6、8周后,贝那普利组、当归醇提物高剂量组收缩压和舒张压均低于模型组（P<0.01）。与模型组相比,贝那普利组与当归醇提物中、高剂量组大鼠活动积极,反应灵敏,睡眠少、体毛光泽,弓背表现少,体重升高。心脏形态结构和功能:（1）彩超:与空白组相比,模型组大鼠心脏LVEDD、LVESD减小,IVSTD及LVPWTD均明显增厚,EF、FS、E/A降低（P<0.05）。与模型组相比,贝那普利组LVEDD、LVESD增加,EF、FS、E/A提高,IVSTD、LVPWTD降低,高剂量当归醇提物明显增了LVEDD、LVESD、EF、FS、E/A,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）HE染色:与空白组比较,模型组SHR心肌细胞体积增大、心肌纤维走形紊乱、细胞核染色加深、细胞间隙增大伴明显的组织胶原沉积及炎症细胞浸润;与模型组相比,贝那普利组及当归醇提物高剂量组SHR心肌纤维走形整齐、细胞核染色正常,未见明显的炎症细胞浸润及细胞间质胶原沉积。（3）Masson染色显示:与空白组比较,模型组心肌组织间隙可见大量胶原纤维沉积、细胞间隙增宽、心肌细胞形态受压失去原有的梭形结构、血管周围大量的胶原沉积;与模型组比较,贝那普利及当归醇提物高剂量组心肌纤维间隙、血管周围胶原沉积明显减少、心肌细胞梭形结构清晰可见。血管内皮功能及RAAS系统指标:（1）与空白组比较,模型组大鼠VCAM-1、ET-1、ICAM-1蛋SHR白表达上升,基因表达明显上调,氧化应激因子eNOS蛋白表达下降,基因表达明显下调（P<0.01）;与模型组比较,贝那普利组及当归醇提物高剂量组VCAM-1、ET-1、ICAM-1蛋白表达下降,基因表达下调,而eNOS蛋白表达升高,基因表达上调（P<0.01）。（2）与空白组比较,模型组大鼠AT1-R蛋白表达升高,基因表达上调,AT2-R蛋白表达下降,基因表达下调（P<0.05）;与模型组比较,贝那普利组及当归醇提物组AT1-R蛋白表达下降,基因的表达下调,AT2-R蛋白表达升高,基因表达上调（P<0.05）。肝肾功能影响的初步评价:与空白组比较,实验各组大鼠血清生化指标ALT、AST、BUN、CREA均在同一水平,无统计学差异（P>0.05）。4.网络药理学探讨当归防治高血压的机制研究当归治疗高血压时主要涉及生物膜合成、脑肠轴发育、细胞内钙信号转导、平滑肌收缩、刺激cAMP合成、脂多糖反应、G蛋白耦连的信号转导等生物过程;MAPK/SGK1/FoxO1/RORγt/IL-23R信号通路可能通过调节Th17/Treg细胞的平衡发挥降低SHR模型血压及靶器官保护的作用。5.当归醇提物干预SHR血压和靶器官损伤的作用机制肾脏组织病理:与空白组比较,SHR模型组大鼠肾小球纤维化明显,肾小管上皮细胞肿胀,管腔变窄,肾小管周围的毛细血管受压,形态欠规则,间质肿胀,炎性细胞浸润;与模型组比较,贝那普利组、当归醇提物高剂量组大鼠肾小球纤维化减轻,肾小管形态规则,炎性浸润减少。血清炎症指标:（1）与模型组比较,贝那普利组、当归醇提物高剂量组IL-6、CRP的表达降低（P<0.05）。（2）与空白组比较,模型组大鼠Th17细胞百分比上升,Treg细胞百分比明显下降,Th17/Treg细胞比值上升;与模型组大鼠比较,贝那普利组、当归醇提物高剂量组Th17细胞百分比下降,Treg细胞百分比上升,Th17/Treg细胞比值明显下降（P<0.05）。（3）与模型组比较,贝那普利组、当归醇提物高剂量组IL-17、IL-23均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）与模型组比较,贝那普利组、当归醇提物高剂量组IL-10、TGFβ1均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。RORγt、FoxP3的表达:（1）与空白组相比,模型组RORγt表达降低（P<0.05）;贝那普利组、当归醇提物高剂量组RORγt表达均低于模型组（P<0.05）。（2）与空白组相比,模型组Fox P3表达升高（P<0.05）;贝那普利组、当归醇提物高剂量组Fox P3表达均升高于模型组（P<0.05）。p38/MAPK通路相关因子的表达:与空白组比较,模型组SHR肾脏组织中p-p38、SGK1、p-FoxO1和IL-23R的表达水平升高（P<0.05）;与模型组相比,贝那普利组、当归醇提物高剂量组大鼠肾脏组织中p-p38、SGK1、p-FoxO1和IL-23R的表达水平降低（P<0.05）。结论1.目前的研究现状提示当归对高血压治疗的降压及靶器官保护有效且不良反应较低,但其疗效有待更多的研究进一步证明。2.当归醇提物可以改善SHR一般情况,一定程度上降低SHR血压,能够逆转SHR心肌重塑、改善内皮功能,且无明显肝、肾功能影响。3.Th17/Treg平衡失调是SHR模型高血压发病的关键因素,当归醇提物高剂量组通过调节p38MAPK/SGK1/FoxO1/RORγt/IL-23R介导的Th17/Treg平衡,降低SHR血压,防治其靶器官损伤。
范柯琪[6]（2020）在《T淋巴细胞代谢嘌呤紊乱在焦虑症发病中的功能与调控机制研究》文中研究说明大脑是生物意识的物质基础,大脑中各种神经细胞的互相关联状态一直在复杂的变化之中。在外界不同的刺激下,动物体内会产生一系列生理变化最终导致精神状态的改变,长期的生理或心理压力会增强大脑的神经可塑性,增加抑郁和焦虑的风险。长期的外界压力也会引起外周免疫系统T淋巴细胞功能紊乱,已有研究证实精神系统的变化与免疫系统有关,但免疫系统在精神疾病中的具体病理作用和潜在调节机制尚不完全清楚。在本文中,我们通过一系列动物行为学实验和细胞生化实验发现,处于外界压力下的小鼠表现出显着的焦虑症状,同时外周免疫系统中T淋巴细胞比例升高。在焦虑小鼠体内,CD4+T细胞的线粒体严重碎裂,线粒体碎裂的CD4+T细胞通过过继转移可传递焦虑至受体小鼠,但EAE模型和细胞发育活化分析证实“焦虑”能力CD4+T细胞的免疫活性不受影响。进一步研究发现,CD4+T细胞的“焦虑”能力也可由于敲除线粒体外膜蛋白MIGA2或者MFN1/2获得,同样可以通过过继转移传递焦虑至受体小鼠。压力诱导焦虑小鼠的CD4+T细胞碎裂可能由于白三烯B4导致,用anti-CD4抗体去除CD4+T可使小鼠从焦虑状态恢复,这些结果证明外界压力使CD4+T细胞线粒体碎裂后对中枢神经系统产生某种影响。为了探索这种病理性CD4+T细胞具体影响精神系统的机制,我们对小鼠血清和大脑进行分析,从分析结果得知线粒体碎裂CD4+T细胞的嘌呤代谢紊乱,产生了过多的黄嘌呤进入体液循环,焦虑症患者的外周血内也检测CD4+T细胞线粒体碎裂和黄嘌呤含量上升的现象。穿过血脑屏障后,黄嘌呤在大脑左侧杏仁核区域通过嘌呤受体激活少突胶质细胞,使少突胶质细胞活化增殖后通过接触交流活化神经元,最终导致小鼠焦虑。我们还证实了线粒体碎裂CD4+T细胞内过量的黄嘌呤的合成途径为从头合成,以及代谢紊乱的原因与IRF-1的累积并促进数种嘌呤合成关键酶表达有关,抑制嘌呤的合成可使小鼠从焦虑状态恢复。本项研究将精神系统的变化与外周免疫系统相联系,探索了两者在焦虑疾病中的关联机制,CD4+T细胞在这一过程中发挥了关键性的作用,为免疫疾病和精神系统疾病的治疗提供了新的方向。
孙晓红,李萍,景洁,高洁,杨振,沈咏梅,张修月,岳碧松,孟杨[7]（2019）在《美洲大蠊胸腺素THY3的表达模式分析》文中研究说明美洲大蠊Periplaneta americana胸腺素基因具有THY1、THY2和THY3三个不同剪接体,其中THY3结构域最多。本研究使用实时荧光定量PCR技术比较分析了THY3在美洲大蠊不同性别、不同发育阶段及不同组织中的表达差异,以及大肠杆菌Escherichia coli诱导对美洲大蠊血淋巴和脂肪体中THY3表达的影响。结果表明:THY3在成虫期的表达量显着高于其他虫期,雌虫表达量显着高于雄虫,脂肪体表达量显着高于血淋巴、头部、肌肉、体壁组织。雌性成虫体腔注射大肠杆菌3 h后血淋巴中THY3表达量显着增高,而在脂肪体中12 h后才检测到THY3表达明显上调,研究结果为进一步研究美洲大蠊胸腺素的功能打下了基础。
刘璐[8]（2019）在《成血管分化过程中掺锂生物活性玻璃陶瓷的促进作用及其机制研究》文中认为目的血管新生在骨缺损修复过程中发挥重要作用。生物活性玻璃陶瓷（Bioactive glass ceramic,BGC）作为一种较为成熟的骨缺损修复材料,具有良好的成骨诱导活性,但其成血管诱导活性不理想。锂离子（Li+）近年来被报道具有良好的成血管促进作用,然而锂掺杂是否能够提高传统BGC材料的成血管诱导活性尚不清楚。因此,本论文在BGC基础上掺入锂离子,旨在系统探究掺锂生物活性玻璃陶瓷（Liincorporated Bioactive glass ceramic,Li-BGC）对体内外成血管分化的促进作用及其分子学机制。方法1.通过CCK-8、Ki67免疫荧光染色等检测Li-BGC浸提液对HUVECs增殖及体外成血管分化的促进作用,并筛选最佳浸提液浓度;2.通过Western blot等检测最佳浓度Li-BGC浸提液对HUVECs Wnt/β-catenin、AKT和NF-κB信号通路的激活情况,以及阻断相关信号通路后对Li-BGC介导成血管作用的影响,同时探究在Li-BGC介导的成血管作用中相关信号通路之间的交互作用;3.通过CCK-8、Real-time PCR等检测Li-BGC浸提液刺激BMSCs后所分泌的外泌体对HUVECs体外成血管分化的间接作用,并筛选最佳外泌体浓度;4.通过Real-time PCR及Western blot等检测Li-BGC浸提液刺激BMSCs后细胞内及所分泌的外泌体中成血管相关mi R-130a表达变化,以及对HUVECs PTEN/AKT信号通路的影响;并通过mi R-130a沉默实验验证mi R-130a/PTEN/AKT信号通路的功能作用;5.通过Van Gieson染色等验证空心管结构Li-BGC支架对体内成血管的促进作用。结果1.适宜浓度（1/16-1/64浓度）Li-BGC浸提液能够明显促进HUVECs增殖、成血管相关基因表达、迁移和体外成管能力,其作用呈剂量依赖性,且最佳浸提液浓度为12.5 mg/ml。2.在Li-BGC浸提液促进HUVECs成血管分化的过程中,可观察到Wnt/β-catenin、AKT和NF-κB信号通路的激活,通路抑制剂实验证实了阻断三条信号通路可不同程度阻断Li-BGC浸提液介导的成血管作用,且三条通路之间存在交互作用。3.Li-BGC浸提液刺激BMSCs后所分泌的外泌体（Li-BGC-Exo）能够明显促进HUVECs增殖、成血管相关基因表达、迁移和体外成管能力,其作用呈剂量依赖性,且最佳外泌体浓度为100μg/ml。4.Li-BGC浸提液刺激BMSCs后细胞内及所分泌的外泌体中成血管相关mi R-130a表达明显增加,Li-BGC-Exo刺激HUVECs后可引起细胞内PTEN/AKT信号通路的激活,mi R-130a沉默实验证实了mi R-130a/PTEN/AKT信号轴可能参与了Li-BGCExo介导的成血管作用;5.3D打印空心管结构Li-BGC支架材料内部可见更多血管染色,同时成血管相关基因及内皮细胞标记基因表达明显提高,证明其对体内血管再生具有显着的促进作用。结论本研究证实,Li-BGC浸提液不仅可以通过激活Wnt/β-catenin、AKT和NF-κB信号通路直接增强HUVECs体外成血管作用;同时可以通过提高BMSCs外泌体中mi R-130a表达,激活内皮细胞PTEN/AKT信号通路,间接促进HUVECs体外成血管过程。此外,体内实验证实Li-BGC支架的锂离子释放可显着促进体内血管新生。
何磊[9]（2018）在《胸腺素β4二聚体在心肌梗死中的保护功能及分子机制研究》文中认为心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）是指冠状动脉因血栓而出现血流急剧减少或中断,使相应的心肌发生缺血性坏死的心脏疾病。心肌梗死极易引发心力衰竭和心源性猝死,严重影响患者的生存质量。因目前缺乏有效的治疗药物,MI在临床上是一个棘手的问题。胸腺素β4（Thymosin Beta 4,Tβ4）是胸腺素组分中的一种43个氨基酸的多肽,在胚胎冠脉发育过程中至关重要。因其具有诱导血管新生,抑制心肌纤维化等特点被认为是可能从根本上治疗MI的有效药物。然而目前进入临床研究的均为化学合成的Tβ4产品,生产成本高,合成效率低下,污染环境比较严重。另一方面Tβ4又因其分子量较小而难以利用基因工程的方法进行生产,表达后纯化步骤繁琐而无法实现大规模生产。前期,本课题组根据文献报道和以往经验设计并生产了重组Tβ4二聚体（Dimeric thymosin beta 4,DTβ4）。该二聚体含有两个完整的Tβ4单体,分子量达到9500 Da,基因工程生产工艺简单,一步纯化率达到98%。该产品及生产工艺获得两项国家发明专利,它的促创伤愈合研究获得国家科技重大专项的资助（2011ZXJ091104-01B）,目前已经完成临床前研究,即将申报临床批件。鉴于野生型Tβ4在心肌梗死治疗中的重要作用,本课题拟在前期研究基础上开发DTβ4对发生心梗的心脏的保护应用,并且对其心脏保护功能的分子机制进行探索。为完成上述研究目的,我们进行了以下科学工作:1.细胞划痕、小管形成、Transwell实验、3D培养出芽实验、流式细胞术、Western Blot、免疫荧光等方法对比DTβ4与野生型Tβ4在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、SD大鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞中的生物学活性。2.结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死动物模型,DTβ4或Tβ4治疗后,利用动物心脏超声、马松染色、免疫荧光等方法对比DTβ4与野生型Tβ4对心梗后小鼠心脏的保护作用。3.转录组测序（RNA-seq）分析DTβ4相对野生型Tβ4促血管生成活性提高的分子机制,并通过实时定量PCR、RNA干扰、BrdU增殖实验、流式细胞术、免疫荧光等方法对测序结果进行验证。4.转录因子芯片、Western Blot、RNA干扰实验、双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）、探索DTβ4通过肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）,促进血管新生的分子机制。通过以上研究工作,我们得出了如下结论:DTβ4相比野生型Tβ4具有更强的促血管生成作用,对心肌梗死小鼠表现出更强的心脏保护功能;DTβ4通过上调MALAT-1促进血管内皮细胞的增殖进而促进血管生成,而Tβ4不上调MALAT-1,仅仅具有促血管内皮细胞迁移的作用,不具有促进血管内皮细胞增殖的功能;MALAT-1的表达被干扰后,DTβ4促血管生成的功能与Tβ4相当,并且促增殖作用消失;DTβ4通过抑制转录因子PROX1的泛素化降解从而上调MALAT1的转录,发挥促血管生成作用。本课题系统研究了DTβ4在心肌梗死中的保护作用,为进一步开发DTβ4保护心脏的应用奠定了基础,也为DTβ4的广泛应用提供了依据。此外,本课题的研究结果说明利用基因工程构建二聚体的方法是生产生物活性小分子多肽的有效手段,构建二聚体可能为生物活性小分子带来新的生物学功能。
徐磊[10]（2018）在《切向流过滤制备抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液及其质量评价》文中提出随着我国规模化养猪业的发展,猪群饲养密度加大、免疫抑制病、饲料霉菌毒素等诸多原因导致猪群免疫功能低下,使猪群抵抗力差、疫苗免疫后不能产生有效保护,甚至免疫失败时有发生,让我国养猪业面临巨大风险。其中,猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种重要的免疫抑制性疾病,已造成严重的经济损失。我国主要以疫苗免疫来防控PRRS,显示出一定效果,但至今我国PRRS的防控依然面临巨大压力。为提高PRRS疫苗免疫效力,PRRS疫苗免疫佐剂的研发是一项重要工作。转移因子（Transfer Factor,TF）是一种免疫增强佐剂,对于抗体或者抗生素控制不力的传染病及免疫缺陷疾病的预防起到重要作用。但目前国内兽用TF的生产均为非特异性TF（NonspecificTF，NTF）。在这种情形下,抗 PRRS 特异性 TF（SpecificTF against PRRS,PRRS-STF）的制造工艺及其质量评价将成为TF研发、生产的方向。基于此,本研究拟建立逐级切向流过滤技术生产PRRS-STF,对制备过程中的各项技术条件进行优化,为PRRS-STF的大规模生产提供可靠的参考依据,并对应用该工艺制备的PRRS-STF进行质量评价。1.PRRS-STF的制备及检验研究本试验从PRRS抗体阳性的免疫健康猪群,选取无牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、PRRS病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、伪狂犬病病毒（PRV）污染的猪脾脏,探索建立了 PRRS-STF的规模化制造工艺和特异性效力检验方法（白细胞粘附抑制法）,并对实验室试制的3批等渗PRRS-STF进行了检验。结果显示,3批PRRS-STF多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力和白细胞粘附抑制法效力检验特异性效力均较接近,分别达到2.5 mg/mL以上、55 μg/mL以上、12%以上和30%以上;鉴别检验时PRRS-STF的OD260nm/OD280S0nm比值均大于1.9且均在250 nm～260nm处有最大吸收峰,内毒素含量均不超过10EU/mL;蛋白质定性检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验（包括BVDV、PPV、CSFV、PCV-2、PRRSV、FMDV、PRV、致细胞病变检验和红细胞吸附性外源病毒检验）结果均为阴性。结果表明,3批PRRS-STF具有抗PRRS特异性,其多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力等指标均远高于TF人医国家标准（《转移因子注射液国家药品标准》）和兽用现行最高质量标准（《猪脾转移因子注射液质量标准（三类新兽药）》）,且中性等渗、无灭活剂残留的工艺效果使PRRS-STF适于与PRRS活疫苗的联合免疫。2.PRRS-STF的切向流过滤工艺研究在生物制药中切向流过滤技术从纯化、澄清、浓缩到目标分子的分离均应用广泛,而TF的分离工艺是TF制备的关键技术。基于此,本试验通过0.1 m2 0.22μm切向流微滤和0.1 m2 5 KD切向流超滤研究膜透压（TMP）、进液流量、浓缩倍数和透析倍数等关键参数对膜通量（Flux）的影响,确定上述切向流工艺关键参数。并将参数线性放大于2 m2微滤、2.5 m2超滤系统制备5批PRRS-STF,与传统Lawrence方法制备的5批PRRS-STF进行工艺过程、检验结果（性状、鉴别检验、蛋白质定性检验、多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力和白细胞粘附抑制法效力检验特异性效力）对比。结果显示,切向流过滤最佳条件为:进液流量、TMP、浓缩倍数、透析倍数和平均Flux,在0.22 μm微滤时分别为9.3 L/min/m2、2psi、3倍、0.5倍和11 LMH;在5 KD超滤时分别为5 L/min/m2、19.5 psi、6倍、1倍和51 LMH;线性放大后的Flux曲线与0.1 m2时接近。切向流过滤方法制备的PRRS-STF多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力和白细胞粘附抑制法效力检验特异性效力均高于传统Lawrence方法,且用时减少24h左右。结果表明,切向流过滤方法线性放大良好、生产效率高,所制备PRRS-STF有效成分含量和活性高。3.PRRS-STF的除病毒工艺研究本试验采用不同终浓度β-丙内酯（0.1%、0.02%、0.01%、0.005%）对含有PPV的离心上清液（PPV终毒价为105TCID50/mL）进行不同时间（12h、24h、36h、48 h）的灭活,灭活后样品经37℃水解2 h,采用猪睾丸ST细胞培养及三代盲传观察细胞病变,对第3代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体法检验灭活效果。结果显示,12 h～48h内,0.1%、0.02%和0.01%β-丙内酯PPV检验结果均为阴性;48h内,0.005%β-丙内酯PPV检验结果为阳性。考虑确保产品的安全性,因此规定:终浓度为0.01%的β-丙内酯在2～8℃下灭活24 h,灭活后置于37℃下水解2 h。本试验还采用5 KD超滤膜对分别含有终毒价为106 TCID50/mL PCV-2、PRRSV和PRV的微滤透过物进行超滤,PCV-2组的超滤透过物采用猪肾PK-15细胞培养和三代盲传,对第3代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体法检测,而PRRSV组、PRV组的微滤透过物采用PCR进行检测。结果显示,PCV-2、PRRSV、PRV检验结果均为阴性。这些结果表明,β-丙内酯和5 KD超滤膜等除病毒工艺确保了 PRRS-STF无外源病毒污染。4.PRRS-STF的药理学研究本试验采用试制的3批PRRS-STF进行药理活性研究,结果显示,3批PRRS-STF经家兔热原检查、小鼠异常毒性检查和豚鼠过敏反应检查均合格;家兔E玫瑰花试验时实验组E玫瑰花结百分率（23.3%、23.6%和26.2%）均显着高于对照组（13.2%）（P<0.05）;小鼠迟发型变态反应试验时实验组肿胀度（14.3、14.5及15.8 mg）均显着高于对照组（9.8 mg）和空白组（0.5 mg）（P<0.05）;小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验时实验组吞噬百分率（30.50%、30.83%、31.17%）及吞噬指数（0.68、0.67、0.71）均显着高于对照组（21.33%及0.45）（P<0.05）;小鼠碳粒廓清试验时实验组巨噬细胞K均值（0.0455、0.0487、0.0492）及α均值（6.97、6.95、7.39）均显着高于对照组（0.0263及5.97）（P<0.05）。结果表明,PRRS-STF可显着提高T淋巴细胞及巨噬细胞活性,促进T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞,提高机体免疫功能。5.PRRS-STF的安全性研究本研究开展了 PRRS-STF单独注射及与PRRS活疫苗联合免疫注射的安全性试验,对1日龄仔猪、4～6周龄保育猪、怀孕30天左右母猪、产前30天左右母猪和种公猪采用实验室试制的3批PRRS-STF分别进行一次单剂量、重复单剂量和一次超剂量单独肌肉注射。此外,还对3～4周龄仔猪、配种前1周左右母猪和种公猪进行了一次单剂量、一次超剂量的PRRS-STF与PRRS活疫苗联合免疫肌肉注射。结果显示,PRRS-STF单独注射及与PRRS活疫苗联合免疫注射的仔猪、保育猪、母猪和种公猪均没有不良反应,注射PRRS-STF的母猪分娩后产仔情况与非PRRS-STF注射组相比无差异,仔猪以及保育猪的平均日增重均高于非PRRS-STF注射组但差异不显着（P>0.05）。表明PRRS-STF对仔猪、保育猪、母猪和种公猪均安全。6.PRRS-STF的效力研究本试验通过PRRS-STF对猪淋巴细胞转化率（MTT法检测）和E玫瑰花结百分率,PRRS活疫苗免疫猪PRRSV抗体水平（Elisa法检测）、IFN-γ含量（液相芯片平台技术Luminex X-MAP法检测）和外周血淋巴细胞（Lym）、T淋巴细胞、CD4+CD8+双阳性T（DP T）淋巴细胞、CD4-CD8-双阴性T（DN T）淋巴细胞数量及比值（流式细胞技术绝对与相对计数法）,PRRS活疫苗攻毒保护力的影响研究,对试制的PRRS-STF效力进行评价。结果显示,单独注射PRRS-STF可提高猪淋巴细胞转化率和E玫瑰花结百分率,提高猪免疫功能;联合注射PRRS-STF可提高PRRS活疫苗（CH-1R株）免疫猪PRRSV抗体水平和IFN-γ含量,提高PRRS活疫苗的免疫效果。PRRS-STF可提高PRRS活疫苗（CH-1R株）攻毒保护力,对高致病性PRRSV（Highly Pathogenic PRRSV,HP-PRRSV）TJ-F5株的攻毒保护率由单独免疫猪攻毒保护率40%提高到联合免疫猪攻毒保护率达80%。免疫后3 d至21 d实验组DP T细胞数量、DP T/T比值高于其他两组,而免疫后7d至21d实验组DN T细胞数量、DN T/T比值始终低于其他两组;攻毒后第3d,各组Lym、T、DP T和DN T细胞数量均显着降低（P<0.01）,此时各组Lym、T、DP T和DN T细胞数量和DP T/T、DN T/T比值分别为攻毒前均值的35%、38%、27%、51%和72%、134%;至攻毒后第28d,各组存活猪Lym、T、DP T和DN T细胞数量和DP T/T、DN T/T比值分别为攻毒前均值的72%、60%、122%、36%和197%、59.8%。表明攻毒后DP T细胞的增加和DN T细胞的减少在抗PRRS感染免疫中发挥着重要作用,PRRS-STF可通过调节PRRS活疫苗免疫猪DP T、DN T、T、Lym细胞从而发挥免疫增效作用。上述研究结果表明,切向流过滤工艺制备PRRS-STF,容易进行生产关键点控制和线性放大,适合规模化生产;所制备PRRS-STF有效成分含量、非特异性效力和特异性效力高,可用于提高猪免疫功能和PRRS活疫苗免疫效果。
二、猪胸腺素F5的制备和在细胞免疫研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪胸腺素F5的制备和在细胞免疫研究中的应用（论文提纲范文）
（1）嗜酸乳杆菌对肉鸡的益生作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肉鸡肠道屏障功能研究 |
| 1.1.1 肠道机械屏障 |
| 1.1.2 肠道化学屏障 |
| 1.1.3 肠道微生物屏障 |
| 1.1.4 肠道免疫屏障 |
| 1.2 肉鸡肠道微生物区系 |
| 1.2.1 肉鸡肠道微生物菌群发育规律 |
| 1.2.2 肉鸡不同肠段菌群结构差异 |
| 1.3 肠道微生物对肠道健康的影响 |
| 1.3.1 肠道微生物对肠道发育及稳态的影响 |
| 1.3.2 肠道微生物对肠道免疫的影响 |
| 1.3.3 肠道微生物对营养物质代谢的影响 |
| 1.4 乳酸菌对肠道健康的调控作用 |
| 1.4.1 调控肠道菌群 |
| 1.4.2 影响肠道屏障功能 |
| 1.4.3 缓解肠道氧化应激 |
| 1.5 乳酸菌调节肉鸡肠道健康机制 |
| 1.5.1 代谢产物 |
| 1.5.2 表面活性成分 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 技术路线与研究内容 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 饲用益生菌筛选及其体外抑菌功能研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株 |
| 2.1.2 试验培养基及试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株活化及培养 |
| 2.2.2 双层琼脂斑点法测定益生菌抑菌能力 |
| 2.2.3 扩散法测定益生菌培养液抑菌能力 |
| 2.2.4 嗜酸乳杆菌E抑菌物质确定 |
| 2.2.5 有机酸含量及抑菌能力关系 |
| 2.2.6 抗生素敏感试验和细胞溶血试验 |
| 2.2.7 嗜酸乳杆菌E肉鸡饲喂效果 |
| 2.2.8 数据处理 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 琼脂斑点法益生菌抑菌活性 |
| 2.3.2 琼脂扩散法益生菌抑菌活性 |
| 2.3.3 p H值对嗜酸乳杆菌E无菌上清液抑菌活性的影响 |
| 2.3.4 嗜酸乳杆菌E胞外蛋白和多糖抑菌活性 |
| 2.3.5 有机酸含量对嗜酸乳杆菌E p H值和抑菌活性的影响 |
| 2.3.6 嗜酸乳杆菌E抗生素敏感性及溶血性 |
| 2.3.7 嗜酸乳杆菌E对肉鸡生长性能的影响 |
| 2.3.8 嗜酸乳杆菌E对肉鸡血清指标的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 嗜酸乳杆菌E抑菌物质及机理 |
| 2.4.2 嗜酸乳杆菌E的益生潜能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 嗜酸乳杆菌E发酵饲料对肉鸡生长性能和肠道发育的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物和试验地点 |
| 3.1.2 饲养管理 |
| 3.1.3 试验设计和日粮 |
| 3.1.4 生产性能 |
| 3.1.5 饲料养分表观消化率 |
| 3.1.6 屠宰性能 |
| 3.1.7 免疫器官指数 |
| 3.1.8 肠道组织形态 |
| 3.1.9 小肠发育 |
| 3.1.10 空肠总RNA提取及相关基因表达分析 |
| 3.1.11 数据统计与分析 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 日粮乳酸菌活菌计数 |
| 3.2.2 生产性能 |
| 3.2.3 屠宰性能 |
| 3.2.4 免疫器官指数 |
| 3.2.5 小肠发育 |
| 3.2.6 肠道形态 |
| 3.2.7 饲料养分表观消化率 |
| 3.2.8 空肠细胞因子m RNA表达量 |
| 3.2.9 空肠肠道屏障功能蛋白m RNA表达量 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 嗜酸乳杆菌E发酵饲料对肉鸡生产性能的影响 |
| 3.3.2 发酵饲料对肉鸡饲料养分消化率的影响 |
| 3.3.3 发酵饲料对肉鸡肠道发育的影响 |
| 3.3.4 发酵饲料对肉鸡空肠炎症因子表达的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡生长性能和免疫功能的调节作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物和试验地点 |
| 4.1.2 饲养管理 |
| 4.1.3 试验设计及日粮 |
| 4.1.4 攻毒模型 |
| 4.1.5 生长性能 |
| 4.1.6 血清免疫指标与外周血淋巴细胞亚群 |
| 4.1.7 肠道和脾脏RNA提取及基因表达量分析 |
| 4.1.8 数据统计与分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 肉鸡生长性能及死亡率 |
| 4.2.2 血清免疫球蛋白 |
| 4.2.3 外周血淋巴细胞亚群比例 |
| 4.2.4 脾脏细胞因子基因表达量 |
| 4.2.5 肉鸡14 日龄空肠细胞因子基因表达量 |
| 4.2.6 肉鸡21 日龄空肠细胞因子基因表达量 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡生长性能的影响 |
| 4.3.2 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡细胞免疫的影响 |
| 4.3.3 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡体液免疫的影响 |
| 4.3.4 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡细胞因子m RNA表达的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡肠道发育和屏障功能的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物和试验地点 |
| 5.1.2 饲养管理 |
| 5.1.3 试验设计及日粮 |
| 5.1.4 攻毒模型 |
| 5.1.5 血清内毒素 |
| 5.1.6 肠道组织形态 |
| 5.1.7 小肠长度 |
| 5.1.8 肠道RNA提取及基因表达量分析 |
| 5.1.9 数据统计与分析 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 肉鸡血清内毒素含量 |
| 5.2.2 肉鸡小肠发育 |
| 5.2.3 肉鸡空肠肠组织形态 |
| 5.2.4 肉鸡回肠组织形态 |
| 5.2.5 肉鸡空肠肠道屏障功能蛋白m RNA表达量 |
| 5.2.6 肉鸡回肠肠道屏障功能蛋白m RNA表达量 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡小肠发育的影响 |
| 5.3.2 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡肠道屏障功能的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡回肠微生物区系的影响 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验动物及地点 |
| 6.1.2 饲养管理 |
| 6.1.3 试验设计及日粮 |
| 6.1.4 样品采集 |
| 6.1.5 试剂耗材 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 肉鸡回肠内容物DNA提取、检测及测定 |
| 6.2.2 PCR扩增及文库构建 |
| 6.3 生物信息学分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 测序基本数据和信息 |
| 6.4.2 稀释曲线与Rank-abundance曲线分析 |
| 6.4.3 Alpha多样性分析 |
| 6.4.4 Beta多样性分析 |
| 6.4.5 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡回肠菌群门水平多样性分析 |
| 6.4.6 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染肉鸡回肠菌群属水平多样性分析 |
| 6.4.7 LEf Se多级别物种差异分析 |
| 6.4.8 肉鸡回肠微生物与生产性能和肠道免疫Spearman关联分析 |
| 6.4.9 PICRUSt1 功能预测 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 嗜酸乳杆菌E缓解肉鸡肠道损伤的蛋白质组学研究 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 试验动物及试验地点 |
| 7.1.2 饲养管理 |
| 7.1.3 试验设计及日粮 |
| 7.1.4 样品采集 |
| 7.1.5 试剂耗材 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 蛋白提取与浓度测定 |
| 7.2.2 肉鸡回肠蛋白液内酶解 |
| 7.2.3 质谱分析 |
| 7.2.4 质谱数据检索 |
| 7.2.5 生物信息学分析 |
| 7.3 试验结果 |
| 7.3.1 不同处理肉鸡回肠表达蛋白功能注释定性分析 |
| 7.4 大肠杆菌感染肉鸡回肠差异蛋白GO注释和KEGG分析 |
| 7.4.1 大肠杆菌感染组与对照组肉鸡回肠差异蛋白Heatmap图与互作关系 |
| 7.5 嗜酸乳杆菌E干预肉鸡回肠差异蛋白GO注释和KEGG分析 |
| 7.5.1 嗜酸乳杆菌E干预与大肠杆菌感染肉鸡回肠差异蛋白与互作关系 |
| 7.5.2 嗜酸乳杆菌E干预与大肠杆菌感染回肠差异表达蛋白GO注释 |
| 7.6 讨论 |
| 7.6.1 大肠杆菌感染致肉鸡肠道损伤的蛋白组分析 |
| 7.6.2 嗜酸乳杆菌E缓解大肠杆菌感染肉鸡肠道损伤的蛋白组分析 |
| 7.7 小结 |
| 第八章 嗜酸乳杆菌E调控大肠杆菌诱导Caco-2 细胞炎症反应的机制研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验菌株和细胞 |
| 8.1.2 大肠杆菌O157 毒素基因鉴定 |
| 8.1.3 细胞复苏与培养 |
| 8.1.4 大肠杆菌感染诱导Caco-2 细胞炎症反应模型建立 |
| 8.1.5 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染Caco-2 细胞炎症反应的影响 |
| 8.1.6 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌Caco-2 细胞粘附性的影响 |
| 8.1.7 嗜酸乳杆菌E和大肠杆菌对Caco-2 细胞单层通透性的影响 |
| 8.1.8 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染Caco-2 细胞凋亡和坏死的影响 |
| 8.1.9 数据统计 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 大肠杆菌O157 毒素基因鉴定 |
| 8.2.2 不同感染复数对Caco-2 细胞毒性和细胞因子m RNA表达的影响 |
| 8.2.3 不同感染时间对Caco-2 细胞毒性和细胞因子m RNA表达的影响 |
| 8.2.4 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌诱导Caco-2 细胞炎症反应的缓解作用 |
| 8.2.5 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染Caco-2细胞屏障功能及细胞凋亡的调控 |
| 8.2.6 嗜酸乳杆菌E及其上清液对大肠杆菌Caco-2 细胞粘附性的影响 |
| 8.2.7 嗜酸乳杆菌E和大肠杆菌对Caco-2 单层细胞通透性的影响 |
| 8.2.8 嗜酸乳杆菌E对大肠杆菌感染Caco-2 细胞凋亡和坏死的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 全文结论 |
| 9.1 主要结论 |
| 9.2 研究的创新点 |
| 9.3 有待进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不同年龄组小鼠免疫器官组织学变化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 样本采集 |
| 1.2.2 石蜡切片制备与HE染色 |
| 1.2.3 免疫组化 |
| 1.2.4 电镜检测 |
| 1.2.5 ELISA检测 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫器官重量及指数变化 |
| 2.2 免疫器官组织学变化 |
| 2.2.1 胸腺 |
| 2.2.1.1 HE染色 |
| 2.2.1.2 免疫组化 |
| 2.2.1.3 超微结构观察 |
| 2.2.2 脾脏 |
| 2.2.2.1 HE染色 |
| 2.2.2.2 免疫组化 |
| 2.2.2.3 超微结构观察 |
| 2.3 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠胸腺组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胸腺转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据分析 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 胸腺蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 差异表达蛋白验证 |
| 2.4 转录组学与蛋白质组学关联性分析 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠脾脏组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年龄组脾脏转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据及质量 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 脾脏蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 物信息学分析 |
| 2.3 验证差异表达蛋白 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 胸腺增龄性变化以及与疾病相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术成果 |
| 附录 |
（3）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（4）Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 Tβ4基因促进毛发生长的研究进展 |
| 1.1 Tβ4的分子和生化特性 |
| 1.2 Tβ4在细胞内的定位 |
| 1.3 Tβ4的功能研究进展 |
| 1.3.1 肌动蛋白结合蛋白 |
| 1.3.2 角膜修复及抗炎 |
| 1.3.3 加速皮肤伤口愈合 |
| 1.4 Tβ4促进毛发生长的研究进展 |
| 1.4.1 Tβ4通过激活毛囊干细胞促进毛发生长 |
| 1.4.2 过表达Tβ4促进牙齿异常发育及促进毛发生长 |
| 1.4.3 Tβ4 激活P38/ERK/AKT信号通路促进毛发生长 |
| 1.4.4 Tβ4 激活Wnt/β-catenin/ Lef-1 信号通路 |
| 1.4.5 Tβ4过表达增加绒山羊次级毛囊个数 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 Tβ4基因定点整合绒山羊的检测 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Southern blot检测 |
| 2.2.2 Real-time PCR检测 |
| 2.2.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.2.4 脱靶分析 |
| 2.2.5 基因位点检测 |
| 2.2.6 生长状况监测 |
| 2.2.7 血常规检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Southern blot检测 |
| 2.3.2 Real-time PCR检测 |
| 2.3.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.3.4 脱靶分析 |
| 2.3.5 基因位点检测 |
| 2.3.6 生长状况监测 |
| 2.3.7 血常规检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 试剂耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.2.2 免疫组织化学 |
| 3.2.3 绒样检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.3.2 免疫组织化学 |
| 3.3.3 绒样检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第三节 Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器设备 |
| 4.1.2 试剂耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Tβ4基因定点整合绒山羊的超数排卵 |
| 4.2.2 胚胎移植 |
| 4.2.3 子一代PCR检测 |
| 4.2.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.2.5 皮肤组织石蜡切片及HE染色 |
| 4.2.6 免疫组化 |
| 4.2.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.8 血常规检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 超数排卵 |
| 4.3.2 胚胎移植 |
| 4.3.3 子一代PCR检测 |
| 4.3.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.3.5 石蜡切片及HE染色 |
| 4.3.6 免疫组化 |
| 4.3.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.3.8 血常规检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第三章 Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.2.2 质控数据统计 |
| 5.2.3 序列比对分析 |
| 5.2.4 转录组质量评估 |
| 5.2.5 转录本组装 |
| 5.2.6 转录组功能注释 |
| 5.2.7 表达量分析 |
| 5.2.8 表达量差异统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.3.2 质控数据统计 |
| 5.3.3 序列比对分析 |
| 5.3.4 转录组质量评估 |
| 5.3.5 转录本组装 |
| 5.3.6 表达量差异统计 |
| 5.3.7 差异表达基因的分析 |
| 5.3.8 差异表达基因的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 仪器设备 |
| 6.1.2 试剂耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 皮肤组织总蛋白提取 |
| 6.2.2 总蛋白质浓度测定 |
| 6.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 6.2.4 还原烷基化和酶解 |
| 6.2.5 iTRAQ标记 |
| 6.2.6 高p HUPLC第一维分离 |
| 6.2.7 液相串联质谱 |
| 6.2.8 数据质控评估 |
| 6.2.9 全蛋白功能注释 |
| 6.2.10 差异蛋白分析 |
| 6.2.11 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.2.12 关联分析的验证 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 蛋白浓度测定 |
| 6.3.2 数据质控评估 |
| 6.3.3 差异蛋白统计 |
| 6.3.4 差异蛋白分析 |
| 6.3.5 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.3.6 关联分析的验证 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利 |
（5）当归醇提物对SHR血压及靶器官的影响及分子机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 当归防治高血压病的研究现状 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 文献来源 |
| 1.2 纳入排除标准 |
| 1.3 分析方法 |
| 1.4 结局指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 纳入研究的基本特征 |
| 2.2 Evidence Mapping |
| 3 讨论 |
| 3.1 当归及其复方制剂的有效性 |
| 3.2 当归及其复方制剂的安全性 |
| 3.3 纳入研究质量 |
| 3.4 当归的应用前景 |
| 3.5 优势与局限性 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 当归醇提物的制备及其质量控制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 当归醇提物的制备 |
| 1.2.2 阿魏酸含量的测定 |
| 1.2.3 当归醇提物中阿魏酸含量测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 系统适用性 |
| 2.2 标准曲线与线性范围 |
| 2.3 精密度、相对回收率和稳定性 |
| 2.4 阿魏酸含量测定 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 当归醇提物对SHR血压及靶器官的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 当归醇提物降低SHR血压的疗效评价 |
| 2.2 当归醇提物对SHR肝、肾功能影响的初步评价 |
| 3 讨论 |
| 3.1 当归醇提物逆转心肌重构作用机制 |
| 3.2 当归醇提物改善内皮功能的作用 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 网络药理学探讨当归防治高血压机制 |
| 1 资料方法 |
| 1.1 当归活性成分筛选 |
| 1.2 当归活性成分作用靶点预测 |
| 1.3 高血压疾病靶点预测 |
| 1.4 活性成分-靶点-疾病网络构建 |
| 1.5 靶蛋白互作网络构建 |
| 1.6 KEGG信号通路与GO生物过程富集分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 当归活性成分筛选 |
| 2.2 当归活性成分-靶点-疾病靶点网络构建 |
| 2.3 潜在靶点蛋白互作(PPI)网络图 |
| 2.4 当归治疗高血压KEGG信号通路富集分析 |
| 2.5 当归治疗高血压GO生物过程富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 当归醇提物降低SHR血压及靶器官保护的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 形态学评估当归醇提物对SHR模型靶器官的影响 |
| 1.2.2 当归醇提物对SHR血清IL-6和CRP的影响 |
| 1.2.3 当归醇提物对SHR血清Th17/Treg比例的影响 |
| 1.2.4 p38/MAPK通路相关因子的检测 |
| 1.2.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对SHR模型肾组织HE染色的影响 |
| 2.2 对SHR模型IL-6和CRP表达的影响 |
| 2.3 对SHR模型Th17和Treg表达的影响 |
| 2.4 对SHR模型IL17和IL-23表达的影响 |
| 2.5 对SHR模型IL-10和TGFβ1表达的影响 |
| 2.6 Th17和Treg 转录因子RORγt、FoxP3的表达 |
| 2.7 对SHR模型p38、p-p38、SGK1、FoxO1、p-FoxO1和IL-23R表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 展望与不足 |
| 附录 |
| 附录1 中英文缩略词对照表 |
| 附件2 系统评价检索策略 |
| 附件3 系统评价纳入文献基本信息 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）T淋巴细胞代谢嘌呤紊乱在焦虑症发病中的功能与调控机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 材料与试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 第2章 外周CD4~+T 细胞在应激型焦虑行为中起重要作用 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 电击小鼠足部诱导焦虑 |
| 2.1.2 慢性束缚小鼠诱导焦虑 |
| 2.1.3 旷场测试 |
| 2.1.4 十字高架迷宫 |
| 2.1.5 小鼠尾静脉注射 |
| 2.1.6 CD4~+或CD8~+T 细胞的纯化 |
| 2.1.7 外周免疫器官和外周血中的T细胞比例分析 |
| 2.1.8 数据统计分析 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 外界压力对小鼠T细胞比例的影响 |
| 2.2.2 焦虑症患者的T细胞比例变化 |
| 2.2.3 电击可诱导野生型小鼠产生焦虑样行为 |
| 2.2.4 CD4~+或CD8~+T 细胞的过继转移实验 |
| 2.3 总结与讨论 |
| 第3章 外周CD4~+T 细胞在外界压力诱导焦虑后线粒体碎裂 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 小鼠T细胞RNA-seq |
| 3.1.2 细胞能量代谢检测 |
| 3.1.3 细胞中线粒体的染色和拍摄 |
| 3.1.4 Western Blotting |
| 3.1.5 小鼠血清采集 |
| 3.1.6 小鼠腹腔注射 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 电击诱导焦虑小鼠T细胞不同亚群RNA-seq序列分析结果 |
| 3.2.2 电击诱导焦虑小鼠CD4~+T 细胞表现出异常的线粒体形态 |
| 3.2.3 CD4~+T 细胞线粒体碎裂与焦虑症状有关 |
| 3.2.4 花生四烯酸代谢产物LTB4 与焦虑症状有关 |
| 3.3 总结与讨论 |
| 第4章 线粒体碎裂的CD4~+T 细胞可诱导焦虑症状 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 Miga2 基因全部或部分敲除小鼠的制备 |
| 4.1.2 小鼠基因型鉴定 |
| 4.1.3 电镜超微结构拍摄 |
| 4.1.4 明暗箱实验 |
| 4.1.5 悬尾实验 |
| 4.1.6 实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型 |
| 4.1.7 十字高架迷宫学习实验 |
| 4.1.8 三箱社交实验 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 Miga2~(-/-)小鼠有明显焦虑表型 |
| 4.2.2 Miga2~(-/-)小鼠有明显抑郁和社交障碍表型 |
| 4.2.3 Miga2~(TKO)小鼠的T细胞发育和稳态分析 |
| 4.2.4 Miga2~(TKO)小鼠有明显焦虑表型 |
| 4.2.5 Miga2~(TKO)小鼠的EAE模型结果 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 第5章 CD4~+T 细胞线粒体碎裂后产生过量嘌呤 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 人类血清的收集 |
| 5.1.2 用于黄嘌呤检测的生物组织样品制备 |
| 5.1.3 用ELISA kit检测样品中黄嘌呤浓度的方法 |
| 5.1.4 小鼠大脑组织的单细胞制备 |
| 5.1.5 神经元的纯化 |
| 5.2 研究结果 |
| 5.2.1 Miga~(TKO)小鼠血清代谢谱分析结果 |
| 5.2.2 诱导焦虑模型小鼠及焦虑症病人体内黄嘌呤分析结果 |
| 5.2.3 黄嘌呤与焦虑症状的联系 |
| 5.3 总结与讨论 |
| 第6章 黄嘌呤活化左杏仁核少突胶质细胞 |
| 6.1 实验方法 |
| 6.1.1 制备小鼠大脑石蜡切片 |
| 6.1.2 小鼠脑切片染色 |
| 6.1.3 分离纯化少突胶质细胞 |
| 6.1.4 BrdU掺入法测定少突胶质细胞增殖 |
| 6.1.5 制备特异性沉默少突胶质细胞Adora1 受体的AAV腺相关病毒 |
| 6.1.6 小鼠杏仁核脑定位注射 |
| 6.2 研究结果 |
| 6.2.1 焦虑小鼠大脑冠状面切片组织学分析 |
| 6.2.2 小鼠大脑细胞单细胞RNA测序分析 |
| 6.2.3 焦虑小鼠大脑中少突胶质细胞改变 |
| 6.2.4小鼠左侧杏仁核脑定位注射AAV病毒实验 |
| 6.3 总结与讨论 |
| 第7章 线粒体碎裂的CD4~+T 细胞中黄嘌呤的合成途径 |
| 7.1 实验方法 |
| 7.1.1 C13葡萄糖示踪分析细胞代谢途径 |
| 7.1.2 实时荧光检测定量核酸扩镇 |
| 7.1.3 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 7.1.4 制备Miga2~(TKO)Pnp2~(KO)基因双敲小鼠 |
| 7.2 研究结果 |
| 7.2.1 焦虑小鼠体内CD4~+T 细胞耗氧量和糖酵解水平降低 |
| 7.2.2 Miga2~(TKO)小鼠CD4~+T 细胞C~(13)葡萄糖示踪分析结果 |
| 7.2.3 2-DG注射可减轻Miga2~(TKO)小鼠焦虑症状 |
| 7.2.4 Miga2~(TKO)小鼠的CD4~+T 细胞RNA-seq分析结果 |
| 7.2.5 Miga2~(TKO)Pnp2~(KO)基因双敲小鼠表型 |
| 7.3 总结与讨论 |
| 第8章 CD4~+T 细胞中IRF-1 累积导致黄嘌呤过量合成 |
| 8.1 实验方法 |
| 8.1.1染色质免疫共沉淀实验 |
| 8.1.2 制备Irf1~(KO)Miga2~(TKO)基因双敲小鼠 |
| 8.2 研究结果 |
| 8.2.1 IRF-1 累积并结合嘌呤合成关键酶启动子 |
| 8.2.2 Miga2TKOIrf1KO基因双敲小鼠表型 |
| 8.3 总结与讨论 |
| 第9章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（7）美洲大蠊胸腺素THY3的表达模式分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源及制备 |
| 1.2 大肠杆菌Escherichia coli刺激美洲大蠊虫体 |
| 1.3 总RNA的提取及cDNA第1链的合成 |
| 1.4 qPCR分析胸腺素THY3的表达 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 THY3在美洲大蠊不同性别、不同发育阶段的表达差异 |
| 2.2 THY3在美洲大蠊不同组织中的表达差异 |
| 2.3 大肠杆菌刺激对THY3表达的影响 |
| 3 讨论 |
（8）成血管分化过程中掺锂生物活性玻璃陶瓷的促进作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一章 成血管分化过程中掺锂生物活性玻璃陶瓷对内皮细胞增殖和体外分化的直接调控作用及其机制研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 掺锂生物活性玻璃陶瓷通过调节骨髓间充质干细胞外泌体分泌对内皮细胞成血管的间接调控作用及其机制研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 3D打印掺锂生物活性玻璃陶瓷支架对体内血管新生的作用研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要学术成果 |
（9）胸腺素β4二聚体在心肌梗死中的保护功能及分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 DTβ4心脏保护作用的体外研究 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 DTβ4心脏保护作用的体内研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 DTβ4通过上调MALAT-1的转录促进血管内皮细胞增殖 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 DTβ4抑制转录因子PROX1的泛素化降解上调MALAT-1 表达 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）切向流过滤制备抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液及其质量评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液的制备及检验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液的切向流过滤工艺研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液的除病毒工艺研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液的药理学研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液的安全性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液的效力研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究论文及成果 |
四、猪胸腺素F5的制备和在细胞免疫研究中的应用（论文参考文献）
- [1]嗜酸乳杆菌对肉鸡的益生作用及其机制研究[D]. 吴正可. 中国农业科学院, 2021(01)
- [2]小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究[D]. 张丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究[D]. 李晓聪. 内蒙古大学, 2020(01)
- [5]当归醇提物对SHR血压及靶器官的影响及分子机制探讨[D]. 魏惠平. 甘肃中医药大学, 2020(08)
- [6]T淋巴细胞代谢嘌呤紊乱在焦虑症发病中的功能与调控机制研究[D]. 范柯琪. 浙江大学, 2020(08)
- [7]美洲大蠊胸腺素THY3的表达模式分析[J]. 孙晓红,李萍,景洁,高洁,杨振,沈咏梅,张修月,岳碧松,孟杨. 四川动物, 2019(04)
- [8]成血管分化过程中掺锂生物活性玻璃陶瓷的促进作用及其机制研究[D]. 刘璐. 上海交通大学, 2019(06)
- [9]胸腺素β4二聚体在心肌梗死中的保护功能及分子机制研究[D]. 何磊. 中国人民解放军空军军医大学, 2018(04)
- [10]切向流过滤制备抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液及其质量评价[D]. 徐磊. 扬州大学, 2018(01)