一、间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体（论文文献综述）
郝华芳[1]（2012）在《禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立》文中研究说明禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis， AE）是由禽脑脊髓炎病毒（avianencephalomyelitis virus，AEV）引起的以侵害雏鸡中枢神经系统为主的传染病。该病于1930年在美国首次发现，20世纪80年代初传至我国，随后在广东、河南、河北、内蒙古等地造成流行。陕西省自1997年报道AE以来，近年来疫情有上升的趋势。AE主要引起雏鸡发生运动失调和头颈部的快速震颤等症状，病死率为10%70%；产蛋鸡感染后主要表现为产蛋突然下降，降幅为16%43%，给养禽业造成了很大危害。市场上出售IDEXX公司的AEV抗体检测试剂盒，其价格昂贵，不适合我国基层的大批量检测；国内虽有研究但没有商品化试剂盒在市场上供应。因此寻求特异性强、灵敏度高、简单快速、适合于大批样品检测的方法势在必行。本研究从临床疑似AE的发病鸡群中分离到一株禽脑脊髓炎病毒（YL株），对AEV陕西分离株SX和YL株的VP1基因进行了克隆与分析，对SX株的VP1蛋白进行表达，以纯化的蛋白作为抗原初步建立了AEV抗体的ELISA检测方法。主要获得以下结果：1.从陕西杨凌地区的临床疑似禽脑脊髓炎的发病鸡群中分离到1株病毒，通过琼脂扩散试验、人工感染试验等鉴定，初步判定所分离的病毒株（YL）为禽脑脊髓炎病毒。根据GenBank中发表的AEV VP1基因序列，设计合成1对特异性引物，采用RT-PCR方法扩增AEV SX株和YL株的VP1基因，将其克隆到pMD18-T载体上，进行序列测定，然后与已知的AEV毒株序列进行比较，应用DNAStar生物软件对其进行分析。结果表明，AEV SX株和YL株的VP1基因全长均为810bp，编码270个氨基酸残基；两毒株与参考毒株VP1基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为88.5%99.8%和89.3%99.4%，两毒株仅存在部分碱基的突变，没有缺失和插入；系统进化树结果表明SX株、YL株均与1143、L2Z参考毒株的亲缘关系较近，与VR株、HB株、SD株和NH937株亲缘关系较远。2.将AEV SX株的VP1基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，连接到原核表达载体pET-32a（+）上，构建原核表达质粒pET32a-VP1，将其转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，用IPTG诱导表达，优化表达条件，经His亲和层析柱纯化。酶切鉴定及基因测序结果表明VP1基因成功连入表达载体中；VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达，确定的pET32a-VP1最佳诱导温度为37℃，最佳的IPTG诱导浓度为0.1mmol/L，最佳诱导时间是5h，SDS-PAGE结果可见分子量约为50ku的融合蛋白。Western blot结果分析，融合蛋白能够和AEV阳性血清发生特异的反应，且具有很好的反应原性。按确定好的条件大量诱导重组蛋白，经His亲和层析柱纯化得到380μg/mL的目的蛋白。3.以纯化的VP1融合蛋白作为抗原包被ELISA酶标板，建立AEV抗体的间接ELISA检测方法，并对反应的条件进行优化。结果通过筛选确定的最优ELISA工作条件为：重组抗原的包被浓度3.8μg/mL，37℃2h后4℃过夜包被，封闭液选择1%的BSA，封闭条件为37℃2h，待检血清的稀释倍数为1:50，37℃孵育0.5h，酶标抗体的最佳稀释倍数为1:4000，最佳工作条件为37℃作用30min，底物的显色选择为37℃5min。在此基础上对24份阴性血清进行测定，确定的临界值为0.360；建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高；临床检测180份样品，与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率达到91.9%。该方法可用于临床样品的大批量检测。综上所述，AEV SX株、YL株的VP1基因均与1143株、L2Z株的亲缘关系较近，与其他已知毒株亲缘关系较远，表明SX株、YL株与已知AEV毒株在进化方面存在一定程度的差异；AEV SX株VP1基因在原核表达系统中获得了高效表达，产物为50ku的可溶性融合蛋白，表达蛋白具有很好的反应活性；将纯化的蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好，适用于临床样品的大批量检测。
唐波[2]（2005）在《单克隆抗体介导的禽脑脊髓炎病毒检测方法的建立及其结构蛋白VP3的初步研究》文中进行了进一步梳理禽脑脊髓炎（Avian encephalomyelitis,AE）是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的以侵害幼禽中枢神经系统为主要特征的传染病,鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑均可感染本病,其临床疾病特征为病禽共济失调、震颤和非化脓性脑脊髓炎。该病现已遍及世界大多数国家。我国1980年以来,先后在广东、江苏、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古、福建、上海等省市区发生。 禽脑脊髓炎病毒可以经粪口水平传播,也可以通过鸡胚垂直传播,因此用感染了禽脑脊髓炎病毒的鸡群所产的鸡胚生产疫苗,就有可能使疫苗污染该病毒。有两种经典的方法被推荐用来检测疫苗中的AEV,这两种方法涉及到将疫苗接种6日龄易感鸡胚或1日龄雏鸡,然后观察其症状和病变,因此都比较繁琐、耗时且耗财。目前多采用免疫学方法,如免疫荧光（FA）和酶联免疫吸附法（ELISA）来直接检测抗原。这些方法中,为了避免非特异性反应,使用了提纯或吸收的抗血清。单克隆抗体特异性强,被认为是鉴定病毒因子的可靠方法,已用于多种病毒感染的诊断。国外已有用AEV单克隆抗体（VR9-1株）建立免疫组化、间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶染色方法检测AEV抗原的成功报道,并用于AEV的定量研究,而国内相关报道较少,成功应用的更少。 为了建立特异性检测禽脑脊髓炎病毒的方法,本研究利用鸡胚扩增了禽脑脊髓炎病毒,并通过氯化铯密度梯度离心进行提纯,用纯化的病毒制备了抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体,建立了单克隆抗体介导的间接ELISA法、Dot-ELISA法、间接免疫荧光法以及免疫组织化学法等检测禽脑脊髓炎病毒的方法。 小RNA病毒科中,结构蛋白VP3被认为与病毒的持续感染、T细胞免疫以及与病毒受体的相互作用有关,近期研究还表明AEV的结构蛋白VP3能够诱导宿主细胞的凋亡。AEV虽然目前在分类上属于肠道病毒属,但研究表明AEV在小RNA病毒科中与甲肝病毒属亲缘性最近。甲型肝炎病毒的VP3及脊髓灰质炎病毒的
李凯善[3]（2012）在《禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立》文中进行了进一步梳理禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis;AE）又称流行性震颤（Epidemictremor），是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害雏鸡中枢神经系统引起雏鸡非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，病雏主要表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状。具有突然出现和难以预测持续期等特点，能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降，成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。目前该病尚无有效的药物治疗，预防主要靠疫苗。灭活疫苗的免疫抗体产生较晚，免疫期较短，成本较高，使用不方便等，限制了该苗的推广应用。而弱毒疫苗可以用饮水的方式来免疫种鸡群，使其子代雏鸡通过母源抗体而获得被动免疫，方便高效，在很多国家得到了广泛的应用。目前国内还没有弱毒疫苗研制成功的报道。本研究用青岛易邦生物工程有限公司提供的禽脑脊髓炎病毒（AEV-YBF02株）进行毒力测定和活疫苗种子批的建立。主要研究内容及结果如下：（1）AEV-YBF02毒株毒力测定：毒力测定试验结果显示，病毒的EID50为10—5.7/0.2mL。AEV-YBF02毒株卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，接种后第10日观察，鸡胚不产生明显的病变。脑内接种1日龄SPF雏鸡，在第10日才开始发病，而各强毒株都在第5日左右发病。表明AEV-YBF02是一株毒力较弱的毒株。（2）禽脑脊髓炎弱毒疫苗种子批的建立：将AEV-YBF02毒株在SPF雏鸡脑内连续传12代，再用SPF鸡胚卵黄囊接种连传6代。取每代病毒测EID50和病毒的特异性试验，再分别作无菌、支原体和外源病毒的检验。结果显示：传代过程中病毒比较稳定，各代次病毒的EID50没有显着的变化，病毒能被AEV阳性血清特异性中和，且各代病毒纯净。（3）安全性试验和免疫效力试验：种子批建立以后，取2、5、10、15、18代毒种通过口服、肌肉、翅膀刺种接种1日龄、8～10周龄、180日龄的鸡时，只有口服1日龄的雏鸡会有10%左右的发病率，而其它途径接种不同日龄的鸡都不会引起临床症状。说明该毒株安全，致病力弱。对2、5、10、15、18代毒种进行免疫效力试验，用该毒口服免疫8～10周龄的鸡，免后21日抗体检测为全阳性，直至免后第12周抗体仍保持较高的水平。同时免后21日，用AEV-VR脑内接种攻毒，结果表明各代次毒种的免疫原性差异不显着，10只免疫鸡均保护9只以上，说明该毒免疫原性良好，且传代对各代毒种的免疫原性无显着影响。（4）毒力返强试验： AEV-YBF02株第12代基础种子毒通过口服的方法接种2周龄的SPF雏鸡，同居感染途径连传5代，取同居感染传代后分离的病毒，分别脑内接种1日龄SPF雏鸡、口服接种28日龄SPF鸡和180日龄的产蛋鸡。观察传代后的各代次毒对1、28日龄SPF鸡及产蛋鸡的致病性。结果表明，各代次的毒力基本相同，毒力没有返强，仍为非鸡胚适应毒。根据以上结果显示，AEV-YBF02符合弱毒苗的要求，建立的种子批性稳定安全，免疫原性好，且没有毒力返强现象，可以作活疫苗的种子批。
张艳艳[4]（2005）在《禽脑脊髓炎病毒的鉴定与弱毒疫苗的研制》文中提出禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis; AE）又称流行性震颤（Epidemictremor）,是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的一种主要危害4 周龄以下雏鸡,以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病。具有突然出现和难以预测持续期等特点,能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降,给养鸡业带来一定的威胁,成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。目前该病尚无有效的药物治疗,预防主要靠疫苗。灭活苗的免疫抗体产生较晚,免疫期较短,成本较高,使用不方便等,限制了该苗的推广应用。而弱毒疫苗可以饮水的方式来免疫鸡群,使其子代雏鸡通过母源抗体而获得被动免疫,方便高效,在很多国家得到了广泛的应用。目前国内还没有弱毒疫苗研制成功的报道,所需弱毒疫苗都依靠进口。因此国内研制出自己的弱毒疫苗,不但可以有效控制禽脑脊髓炎的发生,还能为国家节省外汇开支,具有很大的经济效益。本实验在鉴定了自国内分离的禽脑脊髓炎病毒的基础上,对该毒株的毒力进行了测定,证明其为弱毒株,并试制了一批弱毒活疫苗。论文主要分为以下三个方面: 第一部分为AEV-HD 毒株的病毒鉴定:从病毒的理化性质、血凝性质和形态大小上进行了常规鉴定,结果表明AEV-HD 性质稳定,不受胰酶、乙醚、氯仿、温度（57℃、1 h）影响,无血凝性。电镜下观察病毒为不正圆形,大小基本一致,直径在2530 nm。根据发表的AEV 基因序列设计了一对引物,对AEV-HD 进行了RT-PCR 鉴定,结果扩增出了900bp 目的片段。证明AEV-HD 为AEV 毒株。第二部分为AEV-HD 的病毒特异性和毒力的检测:将AEV-HD 与AEV阳性血清混合,37 ℃作用1 h后经卵黄囊接种6 日龄SPF 鸡胚,并设AEV-HD 病毒接种组对照。结果中和组鸡胚出壳后雏鸡发病率为10%,而病毒组发病率为75%,表明AEV-HD 能被AEV 阳性血清中和,病毒特异性良好。AEV-HD 接种6 日龄SPF 鸡胚后不引起明显的鸡胚病变,鸡胚平均脑系数为4.65%,接近正常鸡胚（4.67%）,而AEV-VR 强毒接种的鸡胚病变明显,平均脑系数为3.67%;脑内接种1 日龄SPF 雏鸡在第10 日才发病,而各强毒株都在第5 天左右发病。表明AEV-HD 是一株毒力较弱的毒株。第三部分为AEV-HD 弱毒疫苗的研制:根据中华人民共和国兽用生物制品质量标准
张淑霞[5]（2002）在《陕西省禽脑脊髓炎的调查、病毒分离鉴定及其诊断与防制研究》文中研究说明对陕［山打上／q、消南等地的24个鸡群进行了禽收l秆髓炎“以的凋查，所凋 查鸡群部］－；‘”蛋卜附山以小在发生产蛋下降，FW降幅度下均人 门．2％。用琼扩试验 （AGP）检测所太集的256份血活，AF p［卜I二率个均高达85．6QG；人10个鸡群阳性率达 100％。跟踪谰八2个f。【。鸡群，发现孵出的雏鸡从31－I龄月女3发病，I（tiR有疑似AE的 症状，宏发析雏鸡的脑纠织，接种6【1龄鸡朋、分离病毒，壮仆。代，琼扩检测分离毒， 呈AE扒辽仰冲1；，分小江川鸡肝中和试验测得。I。和指数为3比，刘为阳性。 理化特件U卜C表叫：该分离毒川差速残b法提纯后，经1％的磷钨酸染色，在7．2 力倍的透时电镜卜可观察到病毒粒于呈近似六边形和近似圆形等形态，无囊膜，直径 在25nfll～二。1＜l’Ill。X寸乙醚、氯仿、酸和胰蛋白酶有抵抗力，在50“C 60III条件下 可抵抗热效）《 人工感染l日龄雏鸡生制出与原发病鸡群州11啊山病例，人剂量感染3 月龄公鸡llJy｝现典个的八卜症状，感染雏鸡的病理组织学变化枝典型的是中枢神经系 统的)「化脓件脑脊髓炎，大J］l小t叫。胶质细胞增生和咖管套ig［结，肌肾 腺胄门二指 肠、胰腺的淋巴细胞聚集，其中小胶质细胞增牛和肌胃肌仁的淋巴细胞聚集只人独特 的诊断意义。以卜纪果i上明i亥分离页足AE汕向。 将禽脑介髓炎9内对（八E川队地分离株接利叫’6门龄鸡趴卯分囊，16 H龄时收取活 胚脑、胃肠汾和）M宁，匀浆灭活后qjd成乌(扩抗原，该抗原＼ A卜标徘阳性血清介 36 h 内出士见牛、7H州－的仇沈线，巾I＼ND、【山十76、八1、IB阳性血行‘3及S卜卜鸡血清不出现沉 淀线，川上L检测60份山山Y，48份￥八厂N卜仕，‘川］标准执原怆测的结果一致。 川八卜V分离株分＊般利·6H龄鸡肝和IIJ龄雏鸡两利。途径繁疮病毒制备抗原，大 活的抗原作人水相，与一定比例的汕相混合后，经乳化制成汕佐剂灭活疫苗。用该疫 ＆与进【I的川（汛违疫币分别兔疫11＊龄尼克红小公鸡，刨矢后盼d抗体水平均达到 峰值，内免疫纠抗体水‘厂并异个壮着门‘＞0．05）。在免疫后 50d用分离毒进行攻毒， 连续观察25d，呐利l疫lrrt免疫组及活苗讪生组的空白对照组均木出现异常，而火活茁 免疫组的空白对照组有8只鸡山现轻微的临床症状，取脑。胁腺等组织进行检测，均 为从抗原m州－。川问试验对免疫过的18个鸡群及下一批新鸡群跟踪调查2年，未有 AE发生，但何9个鸡场的周囚邻近鸡群囚仙川AE活茁或木免疫川（，牙致了“的发11 陕两省禽脑脊朋炎的凋＆、汕毒分离鉴定及几诊断＼Fji制b）恍生。山此表明，所研制的疫仙是安个户－效的，。。1－预防忧的发生。
刘赫[6]（2019）在《鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备》文中研究表明禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）属于呼肠孤病毒科（Reovirdae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）,主要引起肉鸡的病毒性关节炎和腱鞘炎。近年来,我国山东、江苏、河北、福建、浙江等地的肉种鸡场和商品肉鸡场先后发生该病疫情的报道,给肉鸡养殖业带来了严重损失。本研究针对ARV野毒株LY383建立了地高辛标记的核酸探针检测方法,同时对其主要抗原蛋白σC进行了原核表达,进而建立了ARV抗体的间接ELISA检测方法,并利用纯化的重组蛋白,制备了相应的单克隆抗体,为ARV的临床检测和后续研究提供了技术支持,具体研究内容如下:根据ARV S1基因序列,设计特异性的引物,通过RT-PCR扩增得到229bp的基因片段,将纯化后的胶回收产物利用地高辛进行标记,制备核酸探针,建立地高辛标记的核酸探针检测ARV的方法。特异性试验结果表明,H9亚型禽流感病毒（H9-AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、禽腺病毒（FAV）、新城疫病毒（NDV）的核酸无法与探针杂交显色,只有ARV与该探针杂交结果为阳性;敏感性试验结果表明,标记探针最低检出量为50pg/μL。对临床采集的13份疑似感染病料进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为100%。制备的探针保存在-20°C冰箱中90d后仍可继续用于检测,稳定性较好。以上结果表明所建立的ARV地高辛标记的核酸探针检测方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性,操作简便,可大批量检测临床样本。设计一对特异性引物,经RT-PCR反应扩增出ARVσC基因片段,克隆至pMD18-T载体,将测序鉴定正确的重组载体σC-pMD18-T和表达载体pET-32a（+）分别进行双酶切反应后,构建σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21（DE3）表达菌。通过优化蛋白诱导表达的条件,表达融合蛋白,经过尿素梯度洗涤法初步纯化和镍柱再次纯化后,进行SDS-PAGE电泳,确定目的蛋白的表达形式为包涵体,Western blot鉴定结果显示,表达的融合蛋白具有良好的反应性。利用表达的重组蛋白建立检测ARV抗体的间接ELISA方法:棋盘稀释法确定目的蛋白的最佳包被稀释度为1:1000;血清最佳稀释度为1:10;最佳封闭液为5%脱脂奶粉;兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗稀释度为1:500。该方法与其他病原体之间无阳性反应,板间和板内试验确定其变异系数为4.85%至7.93%,具有较好的重复性,可应用于大规模血清学调查和流行病学监测。将纯化后的σC重组蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经过筛选和亚克隆最终获得2株能稳定分泌σC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为A1S9、B2D9,通过抗体亚类试剂盒测定所获得的单抗为IgG1亚型、轻链为κ链。ELISA效价测定结果显示,上清效价为1:100,小鼠腹水的效价为1:128000和1:256000。Western blot和IFA鉴定结果显示制备的单抗可与ARV发生特异性反应。
刘青天[7]（2014）在《禽脑脊髓炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用》文中指出禽脑脊髓炎（avianencephalomyelitis，AE）首次在1932年被描述为一种侵害雏鸡的一种病毒性传染病。此后，已波及世界大多数国家，该病的特征是雏鸡表现为头和颈部的快速震颤和运动共济失调；产蛋鸡被该病毒感染后表现为一过性产蛋下降，不表现出神经症状，给养禽业尤其是种禽养殖业造成了较大的经济损失。目前传统的禽脑脊髓炎病毒（avianencephalomyelitisvirus，AEV）的检测方法存在费时费力、特异性差、容易被污染等缺点。因此，建立一种针对AEV的特异、敏感、可靠的检测方法势在必行。本研究旨在建立一种基于SYBRGreenI的AEV荧光定量RT-PCR检测方法，为AE高效检测及准确定量提供一种可靠的新方法。结果如下：根据GeneBank中AEV1143株基因序列，在高度保守的VP1基因序列区域设计一对荧光定量用特异性引物，用RT-PCR的方法扩增出AEVSX株VP1基因的部分序列（288bp），用常规方法对目的片段进行克隆并进行双酶切鉴定，测定重组质粒的浓度并通过测序比对进行鉴定，重组质粒的序列与AEVSX株的VP1基因序列100%匹配，质粒浓度为126ng/μL，OD260/OD280为1.92，将质粒模板标准品按10倍梯度稀释，进行荧光定量PCR扩增，通过对反应条件优化后，建立了针对AEV的标准曲线：y=-3.5714x+36.754，扩增效率为0.913，线性相关系数为0.9977，并对建立的方法进行特异性、重复性以及敏感性验证，结果表明该方法特异性强，灵敏度高，重现性好，检测极限为10拷贝/μL，敏感性是传统RT-PCR检测方法的100倍，可对AEV进行准确定性及定量分析。用AEV1143株接种7日龄SPF鸡胚，分别在3天和5天后剖检鸡胚，收集尿囊液，研磨脑和肝脏组织。用本实验建立的方法从接种3天后的SPF鸡胚中可检测出阳性样品，而普通RT-PCR方法需要在5天后才能检测出AEV。分别用建立的荧光定量RT-PCR方法和普通RT-PCR方法对18份临床样品进行检测并设置阴性对照，普通RT-PCR只检测出5份阳性样品，阳性率为28%，而本研究建立的方法检测出18份阳性样品，阳性率为100%，将13份检测结果不一致的脑组织病料用鸡胚盲传2代后，用建立的方法和普通RT-PCR进行检测，结果仍然是阳性结果。综上所述，本研究建立了一种针对AEV的高敏感、高特异、重复性好的SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法，可为AEV的检测提供有效的手段。
王劭,胡奇林,林锋强,程晓霞,欧阳岁东,陈仕龙[8]（2007）在《禽脑脊髓炎病毒检测技术研究进展》文中进行了进一步梳理禽脑脊髓炎是一种病毒性传染病,能引起雏鸡、雉、鹌鹑和火鸡感染,其特点是运动失调和快速震颤。文章就其检测技术,如病毒分离,血清学诊断和核酸探针等的研究进展做一阐述。
李志军[9]（2016）在《禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究》文中研究说明禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis,AE）是由禽脑脊髓炎病毒（avian encephalomyelitis virus,AEV）引起的,以幼禽头颈部快速震颤和共济失调等神经症状为主要特征的接触性传染病,成年鸡为亚临床症状,表现为一过性产蛋下降和种蛋孵化率降低。AEV是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,震颤病毒属成员。该病自1932年首次在美国发现以来,已经传播至全球多个国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。目前该病尚未有特定的治疗方法,只能依靠疫苗免疫进行预防控制。因此,研究AEV在雏鸡体内的组织分布对于AEV的致病机制研究有着重要意义。本研究对AEV咸阳株进行了分离鉴定,并运用荧光定量PCR和免疫组织化学方法测定了AEV XY13感染雏鸡后病毒在雏鸡体内的动态分布,获得以下结果:1.采集咸阳市某鸡场疑似AE感染雏鸡的脑组织进行病原的分离鉴定,经SPF鸡胚传代、免疫组织化学试验和动物回归试验,初步鉴定分离毒为禽脑脊髓炎病毒,并命名为AEV XY13。根据AEV 1143株VP1基因高度保守区设计特异性引物,经RT-PCR扩增,克隆至pMD19-T载体,转化DH 5α感受态细胞,然后进行序列测定,并与已知参考毒株进行遗传进化分析。结果表明,扩增的VP1目的片段长度为288 bp,编码96个氨基酸残基;AEV XY13与参考毒株的核苷酸同源性为74.6%99.7%,氨基酸同源性为76.0%97.9%;遗传进化分析结果表明,AEV XY13与SX株处于相同的分支;与1143、YL、L2Z株则同处于一个较大的分支上,亲缘关系较近,而与Van Roekel、NH-937和204C株则处于不同的分支上,亲缘关系较远;遗传进化距离估算结果表明,AEV XY13与1143、L2Z、SX和YL株的进化距离均小于0.011,而与NH-937、Van Roekel和204C株的进化距离则大于0.060。2.用荧光定量PCR测定AEV在雏鸡体内不同组织的病毒载量。将AEV病毒液以10倍梯度逐级递减稀释至10-7,卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,12天后收胚,观察并记录每个稀释度的鸡胚病变情况,计算病毒EID50。55只1日龄SPF雏鸡随机分成两组,试验组33只雏鸡每只口服接种105EID50病毒液,对照组22只雏鸡每只口服接种等量的PBS,观察并记录雏鸡生长状况。在接种后第2天、第4天、第6天、第7天、第8天、第10天、第12天、第15天、第18天、第22天和第24天随机选取试验组3只雏鸡和对照组2只雏鸡处死,采集脑、肝、肠、腺胃、法氏囊、脾和肾等组织器官,运用荧光定量PCR方法测定各器官内的病毒载量。结果表明,试验组雏鸡在攻毒后第6天,5只雏鸡开始出现AE临床症状,1只在发病后第2天死亡,攻毒后10天,发病雏鸡的神经症状逐步消失并恢复正常。病毒载量检测结果显示,病毒感染第2天就能在脑、肝脏、肠道、腺胃、法氏囊、脾和肾等被检器官中检测到病毒,且脑组织中的病毒载量最低;感染后6天,脑组织中病毒载量达到峰值,此时试验组部分雏鸡开始出现AE临床症状;肠道、腺胃等消化器官中的病毒载量在整个试验阶段基本保持平稳,而肝脏在感染前期逐步下降后到后期有所回升,表明AEV对胃肠道等消化器官具有较强的组织嗜性;法氏囊和脾脏等免疫器官中的病毒载量呈波动状态;肾脏中的病毒载量逐步下降。3.免疫组织化学试验检测病毒感染雏鸡第2天、第7天和第12天,脑、肝脏、肠道、腺胃、法氏囊、脾脏和肾脏等组织中病毒抗原在各器官中的定位,估算各组织中病毒抗原相对表达量,并分析第2天、第7天和第12天各组织中病毒载量与病毒蛋白相对表达量的相关性。结果显示,在病毒感染第2天、第7天和第12天各组织器官中均有大量的棕黄色阳性着色,表明在相应的组织中均有大量病毒定殖。相关性分析结果表明,病毒感染第2天、第7天和第12天各组织中的病毒蛋白相对表达量与病毒载量呈正相关。综上所述,AEV XY13株与SX、YL、1143和L2Z株的亲缘关系最近,而与NH-937、Van Roekel和204C株的亲缘关系较远,表明AEV XY13株与参考毒株相比,在遗传进化关系上存在一定的差异。组织器官中病毒载量测定结果表明,AEV对胃肠道等消化器官的组织嗜性较强,而对神经系统、免疫系统和泌尿系统等器官的嗜性则较弱。相关性分析结果表明,各器官中病毒蛋白相对表达量与病毒载量呈正相关,病毒载量与病毒蛋白抗原表达量呈对应关系,可以准确反映病毒的组织分布,为病毒的致病机理研究提供依据。
刘丽华[10]（2003）在《关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究》文中提出禽脑脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitis Virus,AEV）是一种小RNA病毒。侵害鸡的中枢神经系统和其它实质性器官，该病毒通过口-粪途径传播，具有水平和垂直传播的能力。由于它极大的稳定性，被污染的区域可能长期保持传染性。鸡胚适应株Van Roekel是高度嗜神经的，并且在鸡的肠道内不能有效的生长，而野毒株却是嗜肠道型的。尽管这样，野毒株和Van Roekel株的病毒多肽具有一致的抗原性。幼鸡感染该病毒后，引起麻痹、头颈震颤甚至共济失调，而成鸡常呈亚临床感染或导致产蛋量和孵化率下降。病毒的感染性不受氯仿、低pH、胃蛋白酶、胰酶和脱氧核糖核酸酶的影响，镁离子可增强病毒对热的稳定性，病毒的浮密度为1.31g／ml，直径为22-30nm，该病毒主要在鸡胚中增殖，在大多数细胞培养物中不生长。 1932年Jones首次报道了在1930年美国新英格兰地区幼鸡群爆发的禽脑脊髓炎。随后十年中，在欧洲、加拿大、日本和澳大利亚都有此病的报道。八十年代，该病传入我国。AEV一直被认为是最重要的禽病病原之一，尽管它很重要，但有关其基础生物学，发病机理的了解却较少。本项研究，旨在利用分子生物学的技术手段，搞清楚AEV基因组的序列和结构，从而探讨基因结构与功能的关系。 本研究共分四个部分：第一部分为AEV的增殖，纯化和电镜观察，用1:5倍稀释的AEV-NH937株和阴性对照PBS分别经卵黄囊接种于6dSPF鸡胚，继续孵化10d后，收集尿囊液。比较接种组和健康对照组鸡胚的大小，结果显示，健康对照组鸡胚明显大于接种组。分离、提纯AEV，把纯化的病毒在电镜下观察，证明确有大量AEV病毒粒子存在，说明AEV在鸡胚中成功扩增；第二部分是AEV-NH937基因组的序列测定工作。根据Calnek疫苗株序列设计了9对引物，利用反转录聚合酶链式反应，成功地扩增了AEV-NH937毒株的全基因。把它们分段克隆在pUCm-T载体上，经序列分析，获得了AEV-NH937毒株的基因组全序列及推导的氨基酸序列，基因组全长为7055个核苷酸，与calnek疫苗株具有94.3％的同源性，编码一个含2134个氨基酸的多聚蛋白。这是国内首次对AEV基因组全序列的分析；第三部分：AEV外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性研究。将VP1基因编码区的810bp片段插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后，用聚丙稀酰氨凝被电泳分析。结果表明，表达产物为53KD的融合蛋白。经超声波裂解，用尿素溶解包涵体，电泳纯化后，利用ELISA检测VP1 外壳蛋白，表明具有一定抗原性；第四部分：应用原位杂交检测 AEV i用 D i g 标记的探针与sd、10d、20d的攻毒鸡脑组织杂交，来检测那V的RNA。结果 显示，sd、10d、20d的攻毒脑组织切片均有阳性杂交信号，阴性对照却没有 杂交信号，该方法与其它检测方法具有良好的平行关系。
二、间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体（论文提纲范文）
（1）禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎病毒分子生物学特性及检测方法的研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒的形态特征 |
| 1.1.2 病毒的增殖培养 |
| 1.2 AEV 的分子生物学 |
| 1.2.1 AEV 基因组 |
| 1.2.2 主要的蛋白及功能 |
| 1.3 禽脑脊髓炎病毒的检测方法 |
| 1.3.1 病原的分离 |
| 1.3.2 琼脂扩散试验（AGP） |
| 1.3.3 荧光抗体技术（FA） |
| 1.3.4 病毒中和试验（VN） |
| 1.3.5 鸡胚易感性试验（ES） |
| 1.3.6 单克隆抗体技术（MAb） |
| 1.3.7 反转录聚合酶链反应（RT-PCR） |
| 1.3.8 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 1.4 小结 |
| 试验研究 |
| 第二章 禽脑脊髓炎病毒陕西分离株 VP1 基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 AE 毒株 |
| 2.1.2 AE 病料 |
| 2.1.3 SPF 鸡胚 |
| 2.1.4 载体与菌株 |
| 2.1.5 酶及试剂 |
| 2.1.6 AEV 的引物 |
| 2.1.7 AEV VP1 基因参考毒株 |
| 2.1.8 培养基及常用试剂的配制 |
| 2.1.9 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 AEV YL 株的分离鉴定 |
| 2.2.2 人工感染实验 |
| 2.2.3 病毒的增殖 |
| 2.2.4 AEV SX 株和 YL 株 RNA 的提取 |
| 2.2.5 RT-PCR 扩增 |
| 2.2.6 纯化 PCR 产物 |
| 2.2.7 产物的连接 |
| 2.2.8 产物的转化 |
| 2.2.9 重组质粒 pMD18-T-VP1 的提取 |
| 2.2.10 重组质粒 pMD18-T-VP1 酶切鉴定 |
| 2.2.11 AEV VP1 序列测定及分析 |
| 2.2.12 预测分析 VP1 编码蛋白的一级结构和抗原表位 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 AEV YL 株的分离鉴定 |
| 2.3.2 人工感染试验 |
| 2.3.3 AEV VP1 基因的扩增 |
| 2.3.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.3.5 AEV VP1 基因的核苷酸序列测定 |
| 2.3.6 AEV VP1 基因的同源性分析 |
| 2.3.7 AEV VP1 基因进化分析 |
| 2.3.8 AEV VP1 蛋白的抗原表位预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽脑脊髓炎病毒陕西分离株 SX VP1 基因的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、载体和菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 血清及酶标抗体 |
| 3.1.4 常用缓冲液配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 原核表达载体 pET32a-VP1 的构建 |
| 3.2.2 重组质粒 pET32a-VP1 的诱导表达 |
| 3.2.3 表达产物的检测 |
| 3.2.4 重组蛋白的制备纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒 pET32a-VP1 的诱导表达 |
| 3.3.3 Western blot 检测结果 |
| 3.3.4 重组蛋白的纯化结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 AEV 重组 VP1 蛋白间接 ELISA 方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 抗原 |
| 4.1.2 血清 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 ELISA 所用试剂的配制 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 间接 ELISA 方法的标准化 |
| 4.2.2 间接 ELISA 检测方法性能评价 |
| 4.2.3 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 ELISA 方法的标准化 |
| 4.3.2 间接 ELISA 检测方法性能评价的结果 |
| 4.3.3 临床样品检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）单克隆抗体介导的禽脑脊髓炎病毒检测方法的建立及其结构蛋白VP3的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 论文正文 |
| 研究一 禽脑脊髓炎病毒的扩增与纯化 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 研究二 禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用 |
| 材料和方法 |
| 结果与讨论 |
| 研究三 禽脑脊髓炎病毒结构蛋白VP3基因的克隆及原核表达 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 研究四 AEV结构蛋白VP3基因真核表达载体的构建及质粒免疫制备VP3抗体的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（3）禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1.1 AEV 的流行病学 |
| 1.1.1 传播方式 |
| 1.1.2 发病率和死亡率 |
| 1.1.3 潜伏期 |
| 1.1.4 流行特点 |
| 1.2. 病原学 |
| 1.2.1 AEV 的分类 |
| 1.2.2 病毒的结构和特性 |
| 1.2.3 病毒的致病性 |
| 1.2.4 病毒的培养 |
| 1.3 AEV 的临床症状及病理学变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4. 发病机理 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 病毒的分离 |
| 1.5.2 病毒的鉴定 |
| 1.5.3 病毒抗原的检测 |
| 1.5.4 血清学鉴定 |
| 1.6 鉴别诊断 |
| 1.7 免疫机理 |
| 1.7.1 主动免疫 |
| 1.7.2 被动免疫 |
| 1.8 AE 的防制措施 |
| 1.9 疫苗的研究 |
| 1.9.1 灭活苗的研究 |
| 1.9.2 活疫苗的研究 |
| 第二章 病毒毒力的测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒 EID50的测定 |
| 2.2.2 对 SPF 鸡胚的致病性 |
| 2.2.3 对雏鸡的毒力试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒 EID50的测定 |
| 2.3.2 对鸡胚致病性的试验结果 |
| 2.3.3 对雏鸡的毒力试验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 禽脑脊髓炎活疫苗种子批的建立及生物学特性的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 1 日龄 SPF 鸡脑内接种传代 |
| 3.2.2 6 日龄 SPF 鸡胚卵黄囊接种传代 |
| 3.2.3 病毒含量测定 |
| 3.2.4 特异性试验 |
| 3.2.5 病毒纯净试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 1 日龄 SPF 鸡脑内接种传代 |
| 3.3.2 6 日龄 SPF 鸡胚卵黄囊接种传代 |
| 3.3.3 病毒含量测定 |
| 3.3.4 特异性试验 |
| 3.3.5 病毒纯净性试验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 安全性试验和免疫效力试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 安全性试验 |
| 4.2.2 免疫效力试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性试验 |
| 4.3.2 免疫效力试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 毒力返强试验 |
| 5.1. 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 易感鸡同居感染传代对毒力影响试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 易感鸡同居感染传代对毒力影响试验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）禽脑脊髓炎病毒的鉴定与弱毒疫苗的研制（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒特性 |
| 1.2 病毒的基因组 |
| 1.3 生物学特性 |
| 1.4 病毒的实验室培养 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 传播方式 |
| 2.2 发病率和死亡率 |
| 2.3 流行新特点 |
| 2.4 潜伏期 |
| 3 临床症状 |
| 4 发病机理 |
| 5 病理变化 |
| 5.1 大体病变 |
| 5.2 组织学病变 |
| 6 诊断方法 |
| 6.1 病毒的分离 |
| 6.2 病毒抗原的检测 |
| 7 鉴别诊断 |
| 8 免疫机理 |
| 8.1 主动免疫 |
| 8.2 被动免疫 |
| 9 防制措施 |
| 9.1 疫苗免疫 |
| 9.2 控制措施 |
| 10 AE疫苗的研究 |
| 10.1 活毒疫苗 |
| 10.2 灭活苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 AEV的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 AEV-HD株的理化性质 |
| 2.2 病毒电镜观察 |
| 2.3 血凝性试验 |
| 2.4 RT-PCR鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 理化鉴定 |
| 3.2 RT-PCR鉴定 |
| 第三章 AEV-HD株的毒力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒EID50的测定 |
| 2.2 中和试验 |
| 2.3 病毒毒力的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 血清中和试验 |
| 3.2 病毒毒力的测定 |
| 第四章 AEV-HD株弱毒疫苗的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒纯净 |
| 2.2 毒种的稳定性 |
| 2.3 疫苗的试制 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒纯净性检验 |
| 3.2 毒种的稳定性 |
| 3.3 疫苗的试制 |
| 结论 |
| 存在的问题 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）陕西省禽脑脊髓炎的调查、病毒分离鉴定及其诊断与防制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 禽脑脊髓炎研究进展 |
| §1.1 禽脑脊髓炎病毒的一般特性 |
| §1.1.1 分类地位 |
| §1.1.2 形态学 |
| §1.1.3 理化学特性 |
| §1.1.4 生物学特性 |
| §1.2 禽脑脊髓炎病毒的分子生物学 |
| §1.2.1 AVE的基因组特征 |
| §1.2.2 病毒蛋白 |
| §1.2.3 2A蛋白质 |
| §1.2.4 AEV与甲肝等病毒的刊源性比较 |
| §1.2.5 AEV的复制 |
| §1.3 AE的致病性 |
| §1.1.1 易感动物 |
| §1.3.2 传播方式 |
| §1.3.3 发病率和死亡率 |
| §1.4 发病机理 |
| §1.5 临床症状 |
| §1.6 病理变化 |
| §1.6.1 剖检变化 |
| §1.6.2 组织学病变 |
| §1.7 AEV的分离 |
| §1.7.1 病料采集 |
| §1.7.2 病料的处理与接种 |
| §1.8 病毒鉴定 |
| §1.8.1 AEV病毒抗原的测定 |
| §1.8.2 血清学检查 |
| §1.8.3 鉴别诊断 |
| §1.9 AEV琼扩抗原的制备 |
| §1.10 免疫与防制 |
| §1.10.1 鸡对AEV的免疫应答 |
| §1.10.2 AE免疫细胞及因子的变化 |
| §1.10.3 AEV的免疫预防 |
| §1.10.4 防制措施 |
| 第二章 陕西省禽脑脊髓炎的调查、病毒分离鉴定及其诊断与防制研究 |
| §2.1 材料 |
| §2.1.1 病料 |
| §2.1.2 标准AE琼扩抗原与AE阳性血清 |
| §2.1.3 其他参考血清 |
| §2.1.4 犊牛血清 |
| §2.1.5 被检血清 |
| §2.1.6 鸡胚、雏鸡、青年公鸡 |
| §2.1.7 AE活毒疫苗 |
| §2.1.8 培养基 |
| §2.1.9 琼脂糖 |
| §2.1.10 脂溶剂及其它试剂 |
| §2.1.11 缓冲液 |
| §2.1.12 抗生素 |
| §2.1.13 油佐剂 |
| §2.1.14 主要仪器设备 |
| §2.2 方法 |
| §2.2.1 禽脑脊髓炎的调查 |
| §2.2.2 病毒的分离 |
| §2.2.3 病毒的鉴定 |
| §2.2.4 琼扩诊断抗原的研制及应用 |
| §2.2.5 AEV陕西分离株油佐剂灭活疫苗的研制 |
| §2.3 结果 |
| §2.3.1 禽脑脊髓炎的调查 |
| §2.3.2 病毒分离 |
| §2.3.3 病毒鉴定 |
| §2.3.4 琼扩诊断抗原的研制及应用 |
| §2.3.5 AEV陕西分离株油佐剂火活疫苗的研制 |
| §2.4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒感染的研究现状 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病性 |
| 1.1.4 防控措施 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒诊断方法的研究进展 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2.2 血清学诊断方法 |
| 1.2.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、细胞、载体、血清及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ARV地高辛核酸探针检测方法的建立 |
| 2.2.2 ARVσC蛋白的原核表达 |
| 2.2.3 检测ARV抗体间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.4 ARVσC蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARV核酸探针的制备 |
| 3.1.1 PCR扩增 |
| 3.1.2 敏感性试验 |
| 3.1.3 特异性试验 |
| 3.1.4 稳定性试验 |
| 3.1.5 临床样品的初步检测 |
| 3.2 ARVσC基因的原核表达 |
| 3.2.1 目的基因的扩增 |
| 3.2.2 重组表达载体σC-pET32a的双酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组蛋白最佳表达条件的优化 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化及表达形式的确定 |
| 3.2.5 Western-blot分析鉴定 |
| 3.2.6 蛋白浓度的确定 |
| 3.3 检测ARV抗体的间接ELISA方法建立 |
| 3.3.1 抗原最佳包被浓度与血清稀释度的确定 |
| 3.3.2 抗原最佳包被条件的确定 |
| 3.3.3 最佳封闭液的确定 |
| 3.3.4 兔抗鸡IgG-HRP酶标抗体最佳稀释度的确定 |
| 3.3.5 阴阳性临界值的确定 |
| 3.3.6 特异性试验 |
| 3.3.7 与商品化试剂盒的比较 |
| 3.3.8 重复性试验 |
| 3.3.9 临床样品的检测 |
| 3.4 ARVσC单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.4.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4.3 单克隆抗体亚类的测定 |
| 3.4.4 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.4.5 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 3.4.6 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.4.7 稳定性试验 |
| 3.4.8 腹水纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸探针的制备 |
| 4.2 ARV σC 蛋白的原核表达 |
| 4.3 检测 ARV 抗体间接 ELISA 方法的建立 |
| 4.4 ARV σC 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（7）禽脑脊髓炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎病毒研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 AEV 的形态学 |
| 1.1.2 病毒的增殖 |
| 1.2 分子生物学特性 |
| 1.2.1 AEV 基因组 |
| 1.2.2 VP1 基因及其编码的蛋白 |
| 1.2.3 AEV 与其他小 RNA 病毒的关系 |
| 1.3 AEV 的流行病学 |
| 1.3.1 传播方式 |
| 1.3.2 发病率和死亡率 |
| 1.3.3 潜伏期 |
| 1.3.4 临床症状 |
| 1.3.5 病理变化 |
| 1.3.6 发病机理 |
| 1.4 禽脑脊髓炎病毒的检测方法研究进展 |
| 1.4.1 病毒的分离 |
| 1.4.2 鸡胚易感性试验（ES） |
| 1.4.3 琼脂扩散试验（AGP） |
| 1.4.4 单克隆抗体技术（MAb） |
| 1.4.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 1.4.6 反转录聚合酶链反应（RT-PCR） |
| 1.4.7 核酸探针技术 |
| 1.4.8 环介导等温扩增技术（LAMP） |
| 1.5 鉴别诊断 |
| 1.6 防制措施 |
| 第二章 实时荧光定量 PCR 研究进展 |
| 2.1 实时荧光定量 PCR 技术的原理 |
| 2.2 实时荧光定量方法 |
| 2.3 荧光染料与荧光探针 |
| 2.4 产物特异性分析 |
| 2.5 动检领域的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 禽脑脊髓病毒荧光定量检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 AEV SX 毒株 |
| 3.1.2 SPF 鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 常用试剂及培养基的配制 |
| 3.1.6 荧光定量用引物设计 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒增殖 |
| 3.2.2 RNA 的提取 |
| 3.2.3 质粒模板标准品的制备 |
| 3.2.4 实时荧光定量 PCR 方法的建立 |
| 3.2.5 荧光定量 PCR 方法的评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 常规 PCR 扩增结果 |
| 3.3.2 质粒标准品的鉴定结果 |
| 3.3.3 标准品质粒的拷贝数计算 |
| 3.3.4 荧光定量 PCR 反应条件的优化结果 |
| 3.3.5 扩增曲线的建立 |
| 3.3.6 标准曲线的建立 |
| 3.3.7 熔解曲线分析 |
| 3.3.8 敏感性分析 |
| 3.3.9 重复性验证 |
| 3.3.10 特异性验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 实时荧光定量 RT-PCR 的初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 AEV 1143 毒株 |
| 4.1.2 SPF 鸡胚 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚毒的检测 |
| 4.2.2 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡胚病毒检测结果 |
| 4.3.2 临床样品的 Real-time PCR 与常规 RT-PCR 检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）禽脑脊髓炎病毒检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒的分离鉴定 |
| 1.1 雏鸡将病料脑内接种1日龄SPF雏鸡, 雏鸡多于5~ |
| 1.2 鸡胚 |
| 2 鸡胚易感性试验 |
| 3 琼脂扩散试验 |
| 4 血清学诊断 |
| 4.1 血清中和试验 |
| 4.2 酶联免疫吸附试验 |
| 4.3 间接荧光抗体检测法 |
| 5 分子生物学技术 |
| 5.1 核酸探针技术 |
| 5.2 聚合酶链式反应 |
| 6 结束语 |
（9）禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1.1 禽脑脊髓炎病毒研究进展 |
| 1.1.1 AEV的生物学特征 |
| 1.1.2 AEV的增殖 |
| 1.1.3 AEV基因组 |
| 1.1.4 AEV VP1基因及其编码的蛋白 |
| 1.1.5 AEV的分类 |
| 1.1.6 AEV检测方法 |
| 1.1.7 AE流行病学 |
| 1.1.8 AE的临床诊断 |
| 1.1.9 AE与其他疾病的鉴别诊断 |
| 1.1.10 AE的预防控制 |
| 1.2 禽脑脊髓炎病毒在动物体内的分布研究 |
| 1.2.1 AEV的致病性研究 |
| 1.2.2 AEV的分布研究 |
| 1.2.3 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 |
| 试验研究 |
| 第二章 禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料采集 |
| 2.1.2 实验动物及血清 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 引物合成 |
| 2.1.5 AEV参考毒株 |
| 2.1.6 主要试剂与培养基的配制 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒增殖 |
| 2.2.2 免疫组织化学试验 |
| 2.2.3 动物回归试验 |
| 2.2.4 病毒基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.5 目的基因的克隆 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸡胚病理变化 |
| 2.3.2 免疫组织化学检测结果 |
| 2.3.3 动物回归试验结果 |
| 2.3.4 PCR扩增结果 |
| 2.3.5 重组质粒鉴定结果 |
| 2.3.6 AEV XY13 VP1片段的序列测定 |
| 2.3.7 AEV XY13 VP1基因的同源性分析 |
| 2.3.8 AEV XY13 VP1基因的遗传进化分析 |
| 2.3.9 遗传进化距离比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽脑脊髓炎病毒在雏鸡体内不同组织病毒载量的测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒的增殖 |
| 3.2.2 EID50的测定 |
| 3.2.3 病料采集 |
| 3.2.4 病毒RNA的提取 |
| 3.2.5 cDNA合成 |
| 3.2.6 实时荧光定量PCR |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EID50测定结果 |
| 3.3.2 雏鸡临床观察 |
| 3.3.3 RNA纯度测定 |
| 3.3.4 AEV在雏鸡体内的病毒载量测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 禽脑脊髓炎病毒在雏鸡体内不同组织分布研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 血清 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要溶液配制 |
| 4.1.5 主要试验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病料采集 |
| 4.2.2 载玻片处理 |
| 4.2.3 石蜡切片的制作 |
| 4.2.4 免疫组织化学染色 |
| 4.2.5 病毒蛋白相对表达量的计算 |
| 4.2.6 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 一抗最佳稀释度的确定 |
| 4.3.2 DAB显色时间的确定 |
| 4.3.3 免疫组织化学结果 |
| 4.3.4 病毒蛋白相对表达量计算结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 1 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1.1 禽脑脊髓炎的流行病学调查 |
| 1.2 AEV的特性 |
| 1.3 临床症状及病理学变化 |
| 1.4 发病机理 |
| 1.4.1 鸡胚适应株 |
| 1.4.2 非鸡胚适应株 |
| 1.4.3 抗体的作用 |
| 1.5 禽脑脊髓炎的诊断 |
| 1.5.1 临床诊断 |
| 1.5.2 分离病毒的接种 |
| 1.5.3 AEV的实验室诊断 |
| 1.5.3.1 病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VN) |
| 1.5.3.2 鸡胚敏感试验(Embryo Susceptibility Test,ES) |
| 1.5.3.3 补体结合试验(Complement-fixation Assay,CF) |
| 1.5.3.4 间接免疫荧光法(Indirect Flouorescent Antibody Assay,IFA) |
| 1.5.3.5 琼脂扩散试验(Agar Gel Precipiti Test,AGP) |
| 1.5.3.6 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA) |
| 1.5.3.7 反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-plymerase Chain Reaction,RT-PCR) |
| 1.6 AEV的增殖 |
| 1.7 禽脑脊髓炎的预防与控制 |
| 1.7.1 免疫接种 |
| 1.7.1.1 活疫苗 |
| 1.7.1.2 灭活疫苗 |
| 1.7.2 其它措施 |
| 1.8 结束语 |
| 2 人类基因组研究进展 |
| 2.1 人类基因组计划大事记 |
| 2.2 人类基因组计划的目标 |
| 2.3 人类基因组计划的主要成果 |
| 2.4 DNA测序技术的发展 |
| 2.5 人类基因组计划的意义 |
| 2.6 人类基因组研究的发展趋势 |
| 2.6.1 生物信息学的产生 |
| 2.6.2 蛋白质组学的研究 |
| 3 病毒基因组研究进展 |
| 3.1 病毒基因组的结构特点 |
| 3.2 病毒基因组的研究 |
| 4 禽脑脊髓炎病毒基因组研究进展 |
| 4.1 AEV的RNA结构 |
| 4.2 AEV的感染和复制 |
| 4.3 AEV外壳蛋白的表达 |
| 5 本项研究的目的和意义 |
| 实验研究 |
| 第一部分 禽脑脊髓炎病毒的增殖、纯化及电镜观察 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒和SPF种蛋 |
| 1.2 病毒增殖 |
| 1.3 病毒提纯 |
| 1.4 电镜观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡胚增殖病毒结果 |
| 2.2 电镜观察结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株(AEV-NH937)基因组全序列分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 载体和菌株 |
| 1.3 酶类及相关试剂 |
| 1.4 引物设计合成 |
| 1.5 病毒增殖及纯化 |
| 1.6 病毒RNA的抽提 |
| 1.7 RT-PCR |
| 1.8 克隆与鉴定 |
| 1.9 序列分析及同源性比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 AEV-NH937全基因扩增结果 |
| 2.2 AEV-NH937九个阳性质粒的PCR鉴定 |
| 2.3 AEV-NH937九个阳性质粒的酶切鉴定 |
| 2.4 AEV-NH937全基因组序列分析及同源性分析结果 |
| 2.5 根据AEV-NH937开放阅读框架推导多聚蛋白的氨基酸序列 |
| 3 讨论 |
| 3.1 AEV基因组的特点 |
| 3.2 AEV-NH937基因组的变异 |
| 3.3 AEV寄生特点及年龄相关性 |
| 3.4 实验体会 |
| 4 结论 |
| 第三部分 禽脑脊髓炎病毒外壳蛋白VP_1基因在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒菌株和生化试剂 |
| 1.2 AEV RNA的提取 |
| 1.3 RT-PCR反应 |
| 1.3.1 引物设计 |
| 1.3.2 反转录(RT)反应体系和程序 |
| 1.3.3 PCR扩增反应体系及程序 |
| 1.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.5 克隆载体的构建及鉴定 |
| 1.6 表达载体的构建 |
| 1.7 诱导表达 |
| 1.8 表达产物的纯化 |
| 1.9 活性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP1基因的克隆结果 |
| 2.2 重组表达质粒的构建 |
| 2.3 VP1基因在大肠杆菌中的表达 |
| 2.4 表达蛋白纯化结果 |
| 2.5 ELISA检测抗原活性结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 融合表达 |
| 3.2 活性检测结果分析 |
| 4 结论 |
| 第四部分 应用原位杂交检测禽脑脊髓炎病毒 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 探针制备 |
| 1.3.1 引物设计 |
| 1.3.2 模板制备 |
| 1.3.3 随机引物法Dig标记探针 |
| 1.3.4 探针灵敏度检测 |
| 1.4 原位杂交 |
| 1.4.1 脑组织切片制备及杂交前预处理 |
| 1.4.2 杂交 |
| 1.4.3 杂交后检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 探针的特异性及灵敏度 |
| 2.2 原位杂交 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五部分 总结与总体结论 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、间接免疫荧光检测禽脑脊髓炎病毒抗体（论文参考文献）
- [1]禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立[D]. 郝华芳. 西北农林科技大学, 2012(01)
- [2]单克隆抗体介导的禽脑脊髓炎病毒检测方法的建立及其结构蛋白VP3的初步研究[D]. 唐波. 扬州大学, 2005(05)
- [3]禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立[D]. 李凯善. 西北农林科技大学, 2012(12)
- [4]禽脑脊髓炎病毒的鉴定与弱毒疫苗的研制[D]. 张艳艳. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [5]陕西省禽脑脊髓炎的调查、病毒分离鉴定及其诊断与防制研究[D]. 张淑霞. 西北农林科技大学, 2002(02)
- [6]鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备[D]. 刘赫. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]禽脑脊髓炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 刘青天. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [8]禽脑脊髓炎病毒检测技术研究进展[J]. 王劭,胡奇林,林锋强,程晓霞,欧阳岁东,陈仕龙. 畜牧兽医科技信息, 2007(02)
- [9]禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究[D]. 李志军. 西北农林科技大学, 2016(11)
- [10]关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究[D]. 刘丽华. 内蒙古农业大学, 2003(03)