一、捕捉法ELISA检测登革热病人血清IgM抗体用于快速诊断（论文文献综述）
黄瑶[1]（2021）在《基于呼吸道病毒感染监测探讨中医疫疠之邪》文中研究说明疠气,疫疠之气,是一类具有强烈致病性和传染性的外感病邪,是中医病因学里重要组成部分。疠气作为中医温病病因的提出最早源自晋代葛洪（283-363）《肘后备急方》,后代医家也有所发挥,直至到十七世纪的明末时期,吴又可在《瘟疫论》里真正指出了疠气是脱离六淫邪气以外的另一种外感病因,是一种客观存在的,人眼所观测不到的细小致病性物质,它的存在和气候、地域、时节都密切相关,正是它的传播导致了疾病的流行,这比十九世纪西方提出的传染病学说早了足足200多年,这在当时的历史条件下实属难得,古人为中医病因学的发展开辟了一个新的天地,至今仍有深刻的理论及重要实践价值,但是迄今为止,关于疠气引起的各种疾病的流行病学特点是什么,流行本质是什么,相关研究少。急性呼吸道病毒感染（Acuterespiratory tract infection,ARTI）是最常见的病毒性感染性疾病,常见为流行性感冒、病毒性肺炎等,疫气不同,其导致的疫病也不相同,一气一病,每一种疫疠之气所导致的疫病,都有别于其他疫病的临床特征和病变规律,搞清楚每一种疫疠之气的发病特点,分析其致病相关因素,探讨其病因病机,对于中医药在疫病的辨证治疗及“未病先防”方面都有着积极的意义。因此我们首次将中医疫病疠气研究与呼吸道病毒感染主动监测相结合,以流行性感冒、病毒性肺炎及新型冠状病毒肺炎为切入点,从传染特点、发病时间、发病地域、病因属性、症状体征、体质因素与传变规律、康复与复发特点、病毒微观定量与西医辨病等8个方面探讨中医疫疠之邪,以期丰富、完善呼吸道病毒感染疫病的中医辨证体系,为中医药在呼吸道传染病防治防未病上提供有益的借鉴。为研究流感疠气的流行特点,本实验室依托国家流感网络实验室平台,开展流感样病例主动监测,随机抽检本地区国家级流感监测哨点医院25059例流感样病例（Influenza-like illness,ILI）咽拭子标本,开展荧光PCR病原学检测、MDCK细胞病毒分离、分离毒株的HA基因序列进化分析及氨基酸位点分析,得出本地区甲型流感HA基因进化特点、氨基酸分子变异特点,结果显示本地区流感流行优势毒株多为两种或两种以上组合,每年优势毒株不尽相同;进化与变异分析显示,近几年分离到的新甲H1N1毒株以6B为主,只有两株为6C;H3N2以3C为主,2014年以后以3C.2a为主,同年分离的毒株序列并不完全在一个进化分支上,部分与疫苗株相隔较远;无论是新甲H1N1还是H3N2,在HA的抗原性及受体结合位点均出现了变异,提示病毒抗原性及毒性出现潜在变化。收集病例监测基本信息及同期气候、环境等资料,结合病原学监测数据,利用SPSS20.0建立数据库,发现流感疠气流行特点呈现明显的冬春季节性,与温度、相对湿度、空气质量PM10呈正相关,O3指数呈负相关。7-17岁学生为流感易感人群,主要症状以发热、咳嗽、恶寒、头痛为主,流感疠气病因属性为“风、寒、湿、热”。7-17岁学生,所处封闭教室环境,疠气易于聚集传播,是其易感原因。流感疠气流行受环境时节影响巨大,其主要病因为气温低,温差大,人体正气下降,寒邪入侵是主要诱因（H3N2兼有湿邪）,此时疠气本身受环境的“寒”“风”“燥”及空气中可悬浮颗粒物PM10增多,造成疠气的活跃及传播范围变广,人体卫外功能下降,正气不足,易于感受外邪而发病。为研究病毒性肺炎疠气流行特点、病因属性、发病相关因素,本实验室于2017年1月-2020年7月开展常见呼吸道病毒病毒性肺炎主动监测,共随机抽检1109例住院肺炎病例咽拭子标本,实时荧光定量PCR检测五种常见呼吸道病毒核酸,包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病、副流感III型病毒、人肠道病毒。我们发现病毒性肺炎全年都有检出,女性比男性占比高,年龄为0-6岁孩童高发,流行季节为冬季,主要症状为以鼻塞、咳嗽、恶寒、乏力、憋喘为主,其病因属性为“风、寒、湿、热”。主要病原为流感病毒及呼吸道合胞病毒,此类病毒正常情况下感染机体只会诱发普通上呼吸道症状,甚至不发病,其病因病机主要是因为机体本身正气不足,造成脏腑功能不足,外感疠气而发病,与疠气流行有一定关联,但不是主要原因。0-6岁幼儿为主要易感人群,正因为幼儿免疫力较低,体内正气不足,在幼托机构等聚集场所疠气聚集,容易交叉感染呼吸道病毒,易进展为肺炎。病毒性肺炎流行与PM2.5指数相关,病毒可以吸附在PM2.5颗粒,从而在空气中停留时间长,飘散距离远,而易于传播。为探讨本地新型冠状病毒肺炎疠气流行特点、病因属性、发病相关因素,我们于2020年1月21日-3月3日开展新型冠状病毒肺炎病例主动监测筛查,共筛查8433份病例,发现37名新型冠状病毒感染者,其中23名为新型冠状病毒肺炎确诊病例,14名为无症状感染者,横断面研究群体调查方法收集这37名感染者基本信息,实验室检测数据、临床症状、发病时间、出院时间、流行病史、血液指标及治疗情况进行分析,探讨使用数字QuantStudioTM3D数字PCR芯片,建立一种更高灵敏度、准确度的新型冠状病毒数字PCR检测方法,并将其应用于本地区新型冠状病毒感染者主动追踪监测,与实时荧光PCR同步检测感染者的咽、肛、血液、尿液标本共计1190份,定位不同时间新型冠状病毒肺炎疠气藏身之处,及其排毒时间。发现新型冠状病毒感染者发病时间集中在:1月15日-2月11日,季节为冬季,节气为小寒、大寒、立春,六气为终之气与初之气,平均温度5.15±2.60℃,平均湿度80.7±8.59%,确诊病例中以轻型和普通型为主,重症仅为一例。临床症状主要为发热与咳嗽,占比均为91.3%,确诊病例湿邪症状身重肢倦,乏力胸闷的症状最多,占43.48%,37位感染者有7位在出院或隔离解除后又出现“复阳”乃至反复“复阳”特征,比例为18.92%,距发病99天,仍有病例咽拭子核酸检测为阳性,复阳反复次数最多达5次。新型冠状病毒感染者长期追踪检测结果显示,发病初期采集呼吸道标本,尽量采集下呼吸道标本;发病中后期及恢复期,采集呼吸道标本及肛拭子标本双份标本。血液标本和尿液标本不适合作为新型冠状病毒肺炎监测采样标本类型。建立的数字PCR检测方法灵敏度、准确性均优于现时使用的荧光PCR核酸检测方法,可以与现时荧光PCR方法相结合,提高病毒检出率,明确荧光PCR结果不明确标本的判定,减少样本的采样次数。流感病毒与病毒性肺炎,都具有流行季节性,病因属性为“风、寒、湿、热”,易感人群为幼童、学生,二者的发病均与正气有关,但流感的发病与疠气流行程度相关更大,而病毒性肺炎发病受正气影响更大。新型冠状肺炎暴发于冬季,寒冷高湿节气暴发,全民易感,病机特点为湿性疠气,初络即入肺,湿性泛滥致疫毒郁肺,其发病与正气相关不大。但病毒间歇性排毒造成的“复阳”,从中医角度,可归属于“差后病复”,“除毒务尽”、“扶助正气”、“改善体质”三大原则可以有效防止该现象发生。新型冠状病毒肺炎疠气流行与温度、湿度、地域关系密切,病因属性以“湿、寒”为主,叶天士在《温热论》中说“温邪上受,首先犯肺”,这是温病学的经典理论。湿邪主要伤脾胃,这是已有理论的共识,但这次的新型冠状病毒肺炎的病因以寒湿为主,主要病位却在肺,疠气的性质虽以温热者居多,但也有属于寒性者,如寒疫病,根据新型冠状病毒肺炎我们提出“湿疫病”,值得进一步研究。本病的无症状感染者多见,确诊患者治愈后多次复阳,为疫情防范增加了难度,针对新型冠状病毒肺炎疠气隐匿反复特点提高检测能力,时刻关注疠气之变化,从提高易感人群免疫力入手,开展主动监测,早发现早诊断早治疗,中西医结合治未病,方能有效防控疫情。
罗正汉,汪春晖,张锦海[2]（2021）在《新发传染病鉴定技术研究进展》文中进行了进一步梳理近年来,人与野生动物日益频繁的接触,再加上病原微生物本身不断的变异和进化,导致新发传染病（emerging infectious diseases, EIDs）的发生呈持续增长态势,暴发频率不断增加,给全球公共卫生带来极大威胁与挑战。在下一次新发传染病暴发之际,希望能通过合理运用相关技术方法准确快速回答"病原体是什么"、"病原体来自哪"两大问题,从而及时有效预警并从源头控制新发传染病的大流行。对当前新发传染病病原体的鉴定技术进行归纳介绍,并探讨各种技术的优劣势以及各自应用领域。
王天禹[3]（2019）在《寨卡病毒与中东呼吸综合征冠状病毒血清学检测新方法研究》文中研究表明背景和目的寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）属于黄病毒科黄病毒属病毒,最早于1947年首次分离于非洲恒河猴,全球有过数次ZIKV感染暴发流行。2016年我国也确诊了 ZIKV输入性感染病例。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）首次于2012年在沙特阿拉伯发现,起初因其临床症状与重症急性呼吸综合征（SARS）相似,所以也称为“类SARS-CoV病毒”。MERS-CoV感染主要流行于中东地区,欧亚、北美也先后有感染病例,且均和中东有着直接或者间接的关系,死亡率高达35%。我国于2015年首次确诊了一例由韩国输入的MERS病人。随着全球化进一步扩大,以上两种新发传染病均有可能在我国流行,甚至暴发,可能带来极大的经济和疾病负担,是可能面临的重大公共卫生问题之一。因此,建立相关的快速血清学检测方法对于防止疾病流行具有重要意义。荧光素酶免疫吸附方法（Luciferase immunosorbent assay,LISA）是本实验室建立的依赖于新型荧光素酶——Nano-luciferase的高通量、高灵敏度的抗体检测方法,具有简单,快速,灵敏度高,不需要特异性种属第二抗体的优点。本实验室已经将其运用于抗HIV抗体的检测并取得了良好的效果。本课题研究的目的是基于LISA平台,建立新的检测抗ZIKV和抗MERS-CoV抗体的检测方法。研究方法确定ZIKV的NS1和NS2B蛋白以及MERS-CoV的S1、S2、RBD、NTD和NP蛋白作为检测抗原,构建相关荧光素酶表达质粒,转染至293T细胞表达荧光素酶-目标抗原融合蛋白,收集获得的含有融合抗原的细胞裂解物用以建立相关LISA方法。以Protein G固定于固相载体表面作为捕捉抗体分子,加入待测样本一起孵育,捕获样本中总的IgG抗体。加入表达细胞表达荧光素酶-目标抗原融合蛋白的细胞裂解物,目标抗原与固相载体表面的特异性抗体结合依附于固相载体,洗去多余裂解物后加入荧光素酶底物反应。检测荧光强度以此确定待测样本中特异性抗体的存在及浓度。收集不同来源的人以及动物血清样本,与ZIKV和MERS-CoV抗体商业化试剂盒检测结果进行对比,评价所建立的LISA方法的灵敏度以及特异度。研究结果本研究确定了ZIKV的NS1蛋白的羧基端（C-NS1）作为寨卡病毒的最佳检测抗原,建立了相关的抗体检测方法。C-NS1-LISA检测结果与微量中和实验结果吻合,灵敏度比商用ELISA试剂盒高4倍以上。但与黄病毒属其他病毒感染样本存在一定的交叉反应,假阳性率分别为:登革病毒（DENV）8.5%（4/47）,日本脑炎病毒（JEV）0%（0/6）,黄热病病毒（YFV）20%（2/10）,丙型肝炎病毒（HCV）0%（0/10）;与披膜病毒科基孔肯雅热病毒（CHIKV）的交叉反应发生率为33%（3/9）。但是,ZIKV NS1和NS2B抗原联合使用,检测结果的假阳性率分别为:登革病毒（DENV）2%（1/47）,日本脑炎病毒（JEV）0%（0/6）,黄热病病毒（YFV）0%（0/10）,丙型肝炎病毒（HCV）0%（0/10）,基孔肯雅热病毒（CHIKV）11%（1/9）,可以显着提高检测方法的特异性。此外,确定了MERS-RBD,MERS-S1,MERS-NP蛋白可以作为MERS-CoV抗体检测方法的目标抗原,其中RBD效果最好,检测结果与商用ELISA试剂盒和假病毒中和实验结果吻合,灵敏度比商用ELISA试剂盒高16倍。所建立的两种病毒的LISA检测方法均可用于人或其他不同种属动物样本检测。
成依依[4]（2019）在《缅甸部分边境地区登革热流行调查》文中研究表明[目 的]调查与中国云南相邻的缅甸部分边境地区登革热媒介分布及组成、登革病毒自然带毒率、登革热血清型及其当地健康人群登革热IgG抗体水平,为边境地区制定有效登革热防控措施提供依据。[方法]在与云南相邻的缅甸东掸邦第四特区小勐拉镇和缅甸掸邦第二特区南邓特县,各选取1个调查点并采用GPS收集调查点经纬度及海拔数据;对调查点居民采集健康人群静脉血（3-5ml）,离心分离血清,标记登记编号置-20℃冰箱,采用ELISA法进行登革病毒IgG抗体检测;在两调查点的诊所或卫生院,采集疑似登革热病人静脉血（3-5ml）,离心分离出血清、编号登记储存于-70℃低温冰箱,在实验室接种C6/36细胞分离病毒和采用RT-PCR检测鉴定病毒;在缅甸小勐拉调查点居民区采用电动捕蚊器法白天采集成蚊,在缅甸南邓调查点畜圈和人房采用诱蚊灯法通宵捕蚊,对上述捕获的成蚊进行鉴定、计数、记录、分类并按不同蚊虫种类分别冻存于液氮罐中保存;对现场捕获的蚊虫采用接种C6/36细胞分离病毒和RT-PCR法进行病毒检测与鉴定。[结果]共采集健康人血清443份（其中缅甸小勐拉镇180份、缅甸南邓县263份）,DENV IgG阳性49份（阳性率为11.06%）,其中包括28份来自缅甸南邓（血清DENV IgG阳性率10.65%,28/263）,其余21份为缅甸佤邦小勐拉（血清DENV IgG阳性率11.67%,21/180）;经比较发现,两调查点健康人群DENV IgG抗体水平无显着差异（P>0.05）。从23份疑似登革热病人血清样本中获得1株有细胞病变分离物,经鉴定为登革病毒1型。共捕获6属22种1516只成蚊,构成比在前10位的蚊虫种类依次是中华按蚊 40.17%（609/1516）、三带喙库蚊 10.82%（164/1516）、骚扰阿蚊 9.83%（149/1516）、埃及伊蚊 7.65%（116/1516）、白纹伊蚊 7.32%（111/1516）、致倦库蚊 7.32%（111/1516）、多斑按蚊 4.68%（71/1516）、微小按蚊 3.89%（59/1516）、伪威氏按蚊2.11%（32/1516）和威氏按蚊1.72%（26/1516）,其余12种蚊虫的构成比均小于1.00%。其中,白天电动捕蚊器捕捉法共采集4属6种622只成蚊,登革热传播媒介埃及伊蚊和白纹伊蚊为当地优势蚊种,分别占捕获蚊虫总数18.65%（116/622）和 17.85%（11 1/622）;其次分别为骚扰阿蚊占 16.56%（103/622）、中华按蚊16.24%（101/622）;流行性乙型脑炎传播媒介三带喙库蚊占捕获蚊虫总数的15.27%（95/622）,其次是致倦库蚊15.43%（96/622）。夜晚诱蚊灯捕蚊法共采集到4属20种894只,其中疟疾传播媒介中华按蚊为当地优势蚊种占捕获蚊虫总数56.76%（508/894）,其次分别是多斑按蚊7.94%（71/894）、三带喙库蚊 7.72%（69/894）、微小按蚊 6.60%（59/894）、骚扰阿蚊 5.15%（46/894）。从上述1516只蚊虫样本中共获得5株有细胞病变分离物,经鉴定为3株版纳病毒,2株未知病毒,未分离出登革病毒。[结 论]缅甸边境地区健康人群登革热血清抗体水平较高,登革热流行程度高;登革热媒介埃及伊蚊和白纹伊蚊在缅甸边境地区分布广,登革热流行风险较高;登革病毒1型可能是该地区的主要登革病毒流行血清型,上述调查结果建议缅甸相关部门应加强登革热媒介及其病例监测,防止登革热暴发流行。
曹佳琪[5]（2019）在《2014-2015年广州市和西双版纳自治州登革热分子流行病学及临床特征的研究》文中提出登革热病毒（DENV）属黄病毒科、黄病毒属,是单股正链RNA病毒,通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。登革病毒引发的登革热,可能发展为登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS）。2014年和2015年的登革热流行期间,在广州和西双版纳地区共收集133份疑似登革热感染患者的急性期血清样本,并对样本的病毒血症水平、病毒血清阳性率、血清型分布、感染类型、临床症状以及系统发育情况进行分析。通过荧光RT-PCR检测可知,在133个血清样本中有69例（51.88%）表现为DENVRNA阳性。在112份实验室诊断为登革感染的病例中,92例（82.14%）表现为DENV的IgM抗体阳性。对登革IgG抗体进行检测,有47例（41.96%）被归为原发感染,39例（34.82%）被归为继发感染,26例（23.21%）为未确定感染类型。通过对样本的病毒滴度检测发现病毒血症水平与IgM抗体呈负相关关系,但与感染类型无关。在广州市,DENV-1型基因V型占主导地位,DENV-2型大都会基因型在西双版纳占主导地位并伴有少量的DENV-1型基因Ⅰ型共同流行。临床症状与血清型之间的相关性分析发现在本实验中DENV-2型感染者可表现出更严重的临床症状,并具有发展成为重症登革热的可能。对分离出的毒株进行系统发育分析,结果表明在西双版纳地区DENV-2型的氨基酸序列中出现了一个氨基酸取代位点（包膜基因中的D215N）,但是并未对这一氨基酸取代与疾病严重程度的关系进行研究。本研究中分离得到的2014-2015年间的登革毒株与从中国其他地区获得的毒株以及最近在东南亚国家分离的毒株亲缘关系较近。这些研究结果也表明,在我国的一些地区由登革病毒引发的登革热已经逐渐从输入性流行病向低地方性流行病转换,所以我国有必要对登革热进行广泛的分子流行病学研究并对传播媒介采取有效的控制措施。
闫芳域[6]（2018）在《出血热相关病毒核酸检测技术研究》文中提出病毒性出血热（Viral hemorrhagic fevers,VHFs）是一组病毒性疾病,主要以出血、突起发热和休克为特征。出血热相关的病毒性疾病起病急,随着全球经济一体化及现代交通运输方式的快速发展,传染病跨境传播的风险不断加大,对相应病毒性传染病的组合检测技术提出了更高的要求。目前,实验室主要是通过病毒分离,检测病毒核酸、抗原以及特异性抗体等方法进行实验室诊断。病毒分离被认为是诊断病毒感染的金标准,但是由于耗费时间长,需要标本量大,无法进行多元的检测。本科室已建立了按照症候群和科属分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法,在分地区组合的检测方法上还有待完善。本实验的主要内容是针对按地区分组的出血热及其相关病毒病分组的核酸检测方法,包括实时荧光定量PCR法和液相芯片法。实时荧光定量PCR技术是一种定量分析的方法,这种方法在PCR反应体系中加入荧光基团,并同时利用荧光积累,实时监测整个PCR进程,最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术的灵敏度高且特异性强,特点是省时、便利和快捷,并可以进行绝对或相对定量分析,是实验室常用的检测方法。液相芯片技术是1995年美国Lutminex公司开发的一种高通量检测平台,它可以定性或定量的在一个反应体系中检测100种不同分析物,其优点是节省时间、节省标本,高通量。目前较多应用于蛋白质和核酸的检测研究,如细胞因子的活动水平检测、肿瘤标记物、激素水平和PCR产物的检测等。为了满足出血热相关病毒性疾病跨境传播检出的需要,本研究拟建立按照地区分组的病毒核酸检测方法。首先将纳入病毒按照高发地区进行分组后,分别设计病毒的引物和探针。针对实时荧光定量PCR方法使用的探针为TaqMan探针,针对液相芯片技术的探针5’端添加12C连接臂后进行氨基修饰。使用体外转录得到的各个病毒RNA参考品对两种方法进行灵敏度的评价。1.利用RNA参考品进行分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各个检测的灵敏度,检出限在101～103拷贝/μl。利用50份未感染人血清和所有纳入病毒的模拟标本进行特异性评价,未见有扩增,表明此方法具有良好的特异性。最后通过重复性实验验证各组检测方法的稳定性,显示组内变异系数小于6.84%,组间变异系数小于8.33%。2.将探针偶联到羧基荧光微球后对RNA参考品分组进行的Tem-PCR扩增产物进行检测,评价检测方法的灵敏度和稳定性。利用50份健康人血清标本和30份未感染纳入疾病的病人血清进行特异度检测。结果显示所建立的基于荧光微球的核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102～106拷贝/μl,特异性为100%,组内变异系数均在18%以下,组间变异系数在25%以下,稳定性尚可。本研究建立了出血热及其相关病毒病的快速组合核酸检测技术,并对其进行了初步评价,对纳入病毒病的出入境检测和临床诊断具有积极意义。
福建省预防医学会[7]（2017）在《福建省人兽共患病学科发展报告》文中研究说明回顾了福建省人兽共患病学科发展历程,重点介绍该学科在福建省重要人兽共患病监测与防控、突发重大传染病疫情处置、能力建设、科学研究等方面的工作现状与成就,并提出新形势下学科发展的挑战与展望。
陈何嵩[8]（2017）在《基孔肯雅病毒样颗粒的制备及其特异性IgM检测方法的初步建立》文中提出【背景】基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus,CHIKV）属于披膜病毒科甲病毒属,其基因组为单股正链RNA,共编码4种非结构蛋白（Non-structural protein,NSP1-4）和5种结构蛋白:C、E3、E2、6K、E1蛋白,其中E2蛋白是中和抗体的主要靶标。CHIKV是一种蚊媒（埃及伊蚊和白纹伊蚊）传播的病毒,主要引起以发热、皮疹和关节疼痛为主要症状的基孔肯雅热（Chikungunya fever,CHIKF）。最初CHIKV主要流行于非洲和东南亚地区,自2004年以来它在印度洋地区造成了数百万人感染,并逐渐传播到了多个地区,包括欧洲、中东和太平洋等地区。2013年10月CHIKV在西半球首次出现,在短短9个月内,它就已经扩散到中美洲和南美洲的22个国家,造成100多万人感染。CHIKF为自愈性疾病,一般不会造成患者死亡,但由于其对关节的损伤能够导致患者高度虚弱,且通过蚊媒传播易导致该病大流行,使得CHIKV感染已经成为当前最重要的全球性公共卫生问题之一。近年来,我国尚未出现CHIKF的爆发流行,但输入性病例时有发生,同时由于我国广泛分布着白纹伊蚊和埃及伊蚊这两种传播媒介,使得该病在我国爆发流行的可能性较大。因此,关于CHIKF的防治研究有着重要意义。在CHIKV感染的诊断方面,由于病毒血症期短,病毒特异性IgM是早期感染的主要指标。目前,最为准确和常用的方法是利用IgM捕捉酶联免疫吸附法（IgM antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay,Mac-ELISA）检测CHIKV感染早期产生的IgM,此法不受血清标本中IgG、类风湿因子（Rheumatoid factor,RF）及抗核抗体（Antinuclear antibody,ANA）等的干扰。国际上已有利用Mac-ELISA法检测CHIKV感染的商品化试剂盒,但大多使用灭活病毒作为抗原,品质参差不齐,而且存在一定的生物安全风险。而在我国,目前尚未报道有针对CHIKV IgM检测商品化的试剂盒。本研究利用杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system,BEVS）表达CHIKV病毒样颗粒（Virus like particle,VLP）,然后基于CHIKV VLP初步建立一种Mac-ELISA检测法,为今后研制CHIKV感染的早期诊断试剂盒奠定基础。【方法】设计引物并扩增CHIKV BNI-CHIKV899株的结构蛋白编码基因及E2蛋白编码基因,分别克隆到pFastBac?-Dual转移载体和pFastBac?-His A转移载体中,构建重组转移载体（pFastBac?-Dual-CHIKV和p FastBac?-HisA-E2）并进行酶切鉴定和序列测定;将构建正确的两种重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞,进行蓝白斑筛选并提取两种重组杆粒（rBacmid-CHIKV和rBacmid-E2）,利用通用引物M13和特异性引物进行鉴定;将鉴定正确的两种重组杆粒分别转染Sf9（Spodoptera frugiperda 9,Sf9）昆虫细胞制备两种重组杆状病毒（Recombinant baculovirus,rBv）（rBV-CHIKV和rBV-E2）,传代、测定滴度并利用免疫荧光法（Indirect immunefluorescence assay,IFA）鉴定病毒感染后目的蛋白的表达。将rBV-CHIKV感染Sf9细胞,待细胞发生明显的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）后,通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察细胞内VLP的形成情况;并通过反复冻融致细胞裂解的方法大量收集胞内的CHIKV VLP,采用蔗糖密度梯度离心法纯化VLP,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western-blot,WB）鉴定CHIKV VLP。将rBV-E2感染Sf9细胞,待细胞发生明显的CPE后,大量收集细胞上清并通过Nickel磁珠吸附方法纯化E2蛋白,利用SDS-PAGE和WB鉴定E2蛋白。将纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠三次后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞经过PEG1500促进细胞融合后进行杂交瘤细胞的选择性培养,而后利用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释法对ELISA筛选出来的阳性杂交瘤细胞进行克隆化,确认得到单克隆的杂交瘤细胞后建系扩大培养。利用rBV-CHIKV感染的Sf9细胞抗原片进行IFA鉴定获得的各单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）与CHIKV VLP的结合活性,选取活性较好的细胞株进行后续实验。最后将杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔内进行抗体的大量制备,收集小鼠腹水并利用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化,以得到纯化的抗E2蛋白mAb。通过SDS-PAGE检测抗体纯度,同时以汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）、登革病毒（Dengue virus,DENV）、乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、Ⅰ型疱疹病毒（Herpes simplex virusⅠ,HSV-1）、Ⅱ型疱疹病毒（Herpes simplex virusⅡ,HSV-2）五种病毒的抗原片进行IFA鉴定抗体的特异性,并利用WB和间接ELISA检测其与CHIKV VLP的结合活性。在上述工作的基础上,初步建立基于CHIKV VLP的IgM捕捉法ELISA（Mac-ELISA）。首先利用抗人IgM抗体（μ链特异性抗体）包被固相载体,作为“捕捉抗体”吸附待检血清中的IgM,再加入CHIKV VLP与“捕捉”到的相应IgM抗体结合,最终利用前面制备的mAb与VLP结合,加入酶标二抗及TMB于450nm波长处测定吸光值。通过VLP与抗体梯度稀释配对的方法对同一阳性血清进行检验,确定VLP及抗体的最适工作浓度;以CHIKF患者血清、肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）患者血清、乙型脑炎患者血清、正常人血清进行Mac-ELISA检测以检验该法的特异性;连续对两份高OD值阳性血清和低OD值阳性血清重复检测4次以检验该法的重复性。最后以核酸检测确诊的阳性患者和正常人血清为对象,同时利用建立的基于VLP的Mac-ELISA法和商品化的Chikungunya IgM检测试剂盒进行检测,并对两组检测结果进行统计学比较分析。【结果】1.CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定将CHIKV C-E3-E2-6K-E1结构蛋白编码基因及E2蛋白编码基因分别克隆入pFastBac?-Dual-CHIKV及pFastBac?-His A-E2后,利用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组转移载体,电泳结果显示,两种载体都切出与目的条带大小相符的条带,测序比对结果显示无核酸突变,表明两种重组转移载体构建成功。对两种重组杆粒的PCR结果显示,均扩增出与预期大小相一致的条带,表明重组杆粒rBacmid-CHIKV及rBacmid-E2构建成功。将两种重组杆粒转染Sf9昆虫细胞后获得了两种rBV（rBV-CHIKV和r BV-E2）,IFA结果显示,两种rBV感染的细胞中均可观察到特异的绿色荧光,而正常Sf9细胞中未观察到特异性荧光,表明两种rBV构建成功。将rBV-CHIKV感染Sf9细胞后,电镜结果显示细胞内可见直径大小约为60-90nm左右的小球形颗粒,直径大小与CHIKV VLP一致。裂解细胞收集的VLP经过蔗糖密度梯度离心后,测得其浓度为1 mg/ml。SDS-PAGE及WB结果显示,检测到与目的蛋白大小相符的特异性条带。将rBV-E2感染Sf9细胞后,收集的上清经过Nickel磁珠纯化,SDS-PAGE和WB检测结果显示,检测到与目的蛋白大小相符的特异性条带。2.抗CHIKV E2蛋白单抗的制备、鉴定纯化后的E2蛋白经过免疫、细胞融合、选择性培养、阳性杂交瘤细胞鉴定及3次亚克隆后,共鉴定得到6株能稳定分泌抗E2蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为3B1、2B8、4A4、3G9、2H4、2D2。利用rBV-CHIKV感染的Sf9细胞抗原片对各杂交瘤细胞株上清进行IFA筛选,结果提示2H4细胞株分泌的抗体活性较好。收集2H4杂交瘤细胞制备小鼠腹水,纯化后的抗体测得蛋白浓度为10 mg/ml。SDS-PAGE结果显示,纯化的抗体在55 KD和25 KD左右出现两条明显条带,其他杂带较少,证实获得了较高纯度的mAb。IFA鉴定抗体特异性结果显示,除了用rBV-CHIKV感染的Sf9细胞可观察到特异的绿色荧光外,HTNV、DENV、JEV、HSV-1、HSV-2感染细胞的抗原片均未观察到特异荧光,表明该mAb具有较好的特异性。WB检测结果显示,纯化2H4 mAb组在47 KD左右可见明显条带,与E2蛋白大小一致,而阴性对照组无条带,说明2H4 mAb能特异识别CHIKV VLP。间接ELISA结果显示纯化的2H4抗体效价为1:100,000。3.基于VLP的特异性IgM检测方法的初步建立基于上述基础建立Mac-ELISA检测法并优化条件,进行方法评价,结果显示,该检测法在检测按常规的1:100稀释CHIKF患者血清时,当CHIKV VLP的使用浓度为5μg/ml,mAb 2H4使用浓度为20μg/ml时,P/N值高于2.1,区分度最高。进一步以该工作浓度进行特异性和重复性检测,结果显示,利用该法检测HFRS、乙型脑炎患者血清时无交叉反应,证实该方法的特异性较好;连续4次对高OD与低OD值的阳性血清检测结果基本稳定,证实该方法的重复性亦较好。在与商品化试剂盒的对比实验中,当VLP和抗体以最适浓度工作时,利用该法检测10份核酸检测结果为阳性的患者血清,结果有9份血清检测为阳性,检测10份正常人血清的结果均为阴性;商品化的Chikungunya IgM试剂盒检测10份核酸确诊血清的结果均为阳性,检测10份正常人血清结果有9份血清为阴性、1份为弱阳性。统计学对比分析表明两组检测结果并无显着差异,本研究所建立的检测方法的敏感性和特异性与商品化试剂盒基本一致。【结论】本研究通过BEVS表达获得了CHIKV VLP及E2蛋白,并利用纯化的E2蛋白制备筛选了E2蛋白特异性抗体2H4,最终通过CHIKV VLP和2H4抗体初步建立了一种Mac-ELISA检测法,并证实了该法的特异性及重复性均较好,与商品化试剂盒的对比实验也证实该方法的敏感性和特异性与商品化试剂盒基本一致。本研究为CHIKV早期感染的快速诊断提供了一种检测方法,同时为进一步研制CHIKV感染早期快速诊断试剂盒奠定了基础。
曹雪锋[9]（2017）在《5种出血热病毒RPA检测方法的建立及其假病毒阳性参考品的制备》文中研究指明病毒性出血热（Viral hemorrhagic fevers,VHFs）是一类由RNA病毒引起,并以发热和出血为主要临床表现特征的可危及人类和动物生命健康的急性传染病[1],该病主要由丝状病毒科、黄病毒科、沙粒病毒科和布尼亚病毒科等4种不同科的病毒引起。出血热病死率高,危害严重,并且大部分无可用疫苗和有效的治疗手段,因此,建立出血热病毒快速、简便,尤其是适用于现场的应急检测方法,对于及时筛查可疑患者及早控制病毒的传播流行具有重要意义。扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire ebolavirus,ZEBOV）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan ebolavirus,SEBOV）、拉沙病毒（Lassa virus,LASV）、马尔堡病毒（Marburg virus,MARV）和黄热病毒（Yellow fever virus,YFV）等均属于出血热相关病毒,具有很高的传染性和致死率,并且都曾在国外引起不同程度的暴发流行,造成了极大的危害。目前在我国未曾发现这些病毒的传播和流行,但是随着我国对外交流日益频繁,这些病毒的输入性风险不断增大[2],为防范于未然,我们有必要对这些病毒进行更加深入的研究,并建立该类病毒快速简便的检测技术,以便及早地发现和鉴别病原体,为有效阻断病毒的传播奠定基础。目前对于出血热病毒的实验室检测方法主要包括病毒分离鉴定、核酸检测[3]、抗原抗体检测等。其中,病毒分离鉴定是疾病诊断的金标准,但通常需要较高的实验室条件和操作技能,而且耗时较长,存在着生物安全风险[4]。核酸检测技术主要通过对病毒靶基因的特异性扩增来进行鉴别诊断,主要包括普通PCR和实时荧光定量PCR技术。普通PCR技术简单易行,耗时短,但敏感性不高。实时荧光定量PCR技术具有快速、灵敏和特异性高的特点[5-8],可以实时观察整个扩增过程,并对初始扩增模板进行定量分析。以PCR为基础的核酸检测方法虽然简单快速,但都需要较为昂贵的仪器设备并在实验室中完成检测。抗原抗体检测目前应用较多的主要是ELISA检测技术,虽然该检测方法已经发展较为成熟,但与核酸检测技术相比,过程仍旧较为繁琐耗时。由此可见,以上病毒实验室检测方法在突发传染病的现场快速检测中存在局限。本研究针对上述5种出血热病毒建立一种基于新型核酸等温扩增技术-重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）[9,10]的检测方法。该技术通过模拟体内DNA复制的酶反应过程,可以在恒温37℃-42℃之间对模板DNA进行指数式扩增,无需变性,在20分钟之内即可完成整个扩增过程。RPA技术操作简单,对设备要求低,具有灵敏度高、特异性强等特点。本研究根据上述5种病毒的基因保守区域设计并合成多套相应的RPA引物和探针,进行筛选优化,得到具有灵敏度高、特异性强的RPA引物探针。其次,根据基因保守片段制备含5种出血热病毒目的基因的假病毒作为RPA反应体系的阳性参考品。最后,对RPA反应体系进行优化,并和Real-time PCR检测方法进行灵敏度的比较,对RPA反应体系扩增性能进行了评价。将制备的假病毒作为模拟样本处理,然后提取核酸进行RPA扩增,同时取本室保存的黄热病毒减毒株17D（YF17D）提取病毒核酸,进行RPA扩增,以验证建立的RPA扩增技术的检测效果。扩增结果表明,本次建立的RPA检测技术在37℃-42℃之间对这5种出血热病毒的RNA可以进行有效的扩增,具有良好的特异性。而扩增的灵敏度,黄热病毒和马尔堡病毒RPA扩增与实时荧光PCR相同,达到1.5×102 copies/反应,扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒和拉沙病毒RPA扩增灵敏度为1.5×103 copies/反应。在检测YF17D核酸时,其扩增灵敏度与Real-time PCR一致。由此显示,本实验建立的RPA检测技术扩增效果好,可适用于非实验室条件下的现场应急检测应用当中。
张宇丝[10]（2016）在《汉滩病毒感染引起血管内皮细胞炎症因子的产生及诱发炎症反应的机制》文中提出汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）感染在人类可引起的严重的死亡率高达2%-10%的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）,全球每年约有100,000病例,其中90%以上发生在我国,陕西省为HFRS的高发区。HFRS患者的主要临床表现为发热、出血、血小板数量下降和急性肾功能不全。由于HTNV感染在宿主啮齿类动物上无疾病表现,因缺乏合适的动物模型,目前对于HTNV感染导致HFRS的致病机制尚不清楚。血小板功能障碍和毛细血管内皮细胞损伤为HFRS患者的主要病理表现,有研究表明,过度活化的免疫应答和炎症反应引起的“细胞因子风暴”可能是导致HFRS致病的机理之一。但目前对于HTNV感染通过怎样的机制引起细胞因子产生以及如何诱发“细胞因子风暴”尚不清楚。在我们前期工作中,用Luminex技术检测了HFRS患者血清中多种细胞因子的表达,其中CXCL10是表达最高的一种细胞因子。CXCL10又称为IFN-γ诱导蛋白10,是CXC趋化因子家族的成员,主要由内皮细胞,上皮细胞和角质形成细胞分泌产生。CXCL10与受体CXCR3结合后,可趋化淋巴细胞至感染发生部位,还可介导凋亡,细胞生长以及血管生成。在其他病毒感染性疾病,如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、呼吸道轮状病毒、鼻病毒、登革病毒等感染性疾病中,CXCL10均急剧升高,并与疾病的进展及严重程度相关。CXCL10可趋化淋巴细胞至感染发生部位,发挥抗感染的功能;也可作为“细胞因子风暴”中的一员加重机体炎症反应,趋化淋巴细胞至病毒感染的靶细胞,引起靶细胞发生免疫病理损伤。所以,cxcl10究竟是起保护宿主的作用还是起损伤宿主的作用取决于宿主的免疫状态及其基因背景。在htnv感染模型中,尚不清楚cxcl10可能发挥的作用。有研究发现很多信号通路如jak-stat途径、pi3k/akt途径以及traf2/tak1途径可调控cxcl10的表达,nf-κb、irf1和irf3等转录因子也被报道可结合于cxcl10的启动子区。尽管geimonen等报道htnv感染内皮细胞可引起cxcl10的表达升高,但是对于htnv通过怎样的途径调控cxcl10产生仍不清楚。在本课题第一部分中,我们将解决两个以下两个问题:（1）研究cxcl10在hfrs疾病中可能发挥的作用;（2）htnv通过怎样的信号转到途径诱导cxcl10的产生。首先,我们收集了hfrs患者的血清,检测hfrs患者血清中cxcl10的含量,并分析cxcl10的含量与病情之间的关系。随后建立体外htnv感染原代内皮细胞模型,探索cxcl的产生来源,并研究在内皮细胞中,htnv调控cxcl10产生的可能的分子机制。在本研究中,我们发现,hfrs患者血清中cxcl10表达急剧升高,在hfrs发病急性期尤为显着。通过相关性分析我们发现cxcl10与hfrs患者的白细胞计数、尿素氮和血清肌酐呈正相关,与血小板计数呈负相关,且血浆病毒载量高的患者其cxcl10的水平也高。随后通过检测hfrs外周血淋巴细胞各亚群表面cxcl10受体cxcr3的表达水平,发现在hfrs发病急性期,单核细胞表面cxcr3急剧升高,提示在发病急性期,高水平的cxcl10可能可诱导单核细胞至内皮细胞。在体外实验中我们发现,htnv感染后的原代内皮细胞可表达大量的cxcl10。而且,htnv并非通过其病毒蛋白调控cxcl10的表达,而是通过其病毒rna中的dsrna结构,激活tlr3、rig-i和mda-5途径,引起转录因子nf-κb和irf7发生磷酸化和核转位,随后nf-κb的亚基p50和p65以及irf7结合于cxcl10的启动子区,调控cxcl10的转录过程。这些研究有助于我们理解cxcl10及其参与其中的“细胞因子风暴”在病毒感染性疾病中的作用,可更好的为hfrs的治疗提供理论依据。il-33是il-1细胞因子家族的新成员,以往研究发现il-33是“孤受体”st2的配体。在细胞处于静止或凋亡状态下,il-33可作为转录因子存在与细胞核内,当细胞发生坏死,il-33则可从胞内释放。因此,il-33被认为是“警报素”,作为危险相关模式分子（danger-associatedmolecularpattern,damp）家族的成员,il-33的释放可警示免疫系统机体受到感染或损伤。研究发现,il-33可激活th2介导的免疫反应,促进th2相关的细胞因子,如il-4、il-5和il-13的产生。在以th2免疫应答介导的疾病中,il-33可引起内皮细胞和上皮细胞发生炎症反应。il-33的受体st2由于编码后对蛋白的剪切不同,可形成三种不同的蛋白剪切体,分别为膜表面st2l、膜表面变体型st2v和分泌至胞外的可溶型sst2。可溶型sst2可作为il-33的诱饵受体,竞争il-33与st2l的结合,中和il-33/st2l途径激活后可产生的生理或病理效果。st2l与il-33结合后,st2l与il-1受体辅助蛋白（il-1raccessoryprotein,il-1racp）形成复合体,募集myd88,激活mapk和nf-κb途径,促进促炎因子的释放。很多研究报道了il-33/st2途径在不同疾病中的表达及作用。在呼吸道炎症疾病、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病中,il-33/st2途径参与炎症病理损伤的发生过程。然而在hfrs中,il-33/st2如何调控免疫反应仍不清楚。在本课题的第二部分中,我们将解决以下两个问题:（1）研究il-33/st2途径在hfrs中如何发挥免疫调节的作用;（2）研究il-33/st2与htnv感染协同作用诱导内皮细胞炎症反应的分子机制。首先,我们收集hfrs患者血浆,检测其血浆中il-33及sst2的含量,并分析二者与hfrs患者病情的相关性。随后,在体外htnv感染内皮细胞模型中,检测il-33/st2对内皮细胞发生炎症反应的调控。最后,应用体外htnv感染内皮细胞模型探索il-33/st2与htnv感染协同调控内皮细胞炎症反应的分子机制。在本研究中,我们发现il-33及其诱饵受体sst2在hfrs血浆中均高表达。通过相关性分析发现,il-33与sst2与患者病情严重程度均呈正相关,且二者含量之间也呈正相关。随后,我们在体外htnv感染内皮细胞模型中发现,il-33可通过st2介导的途径促进htnv感染的内皮细胞产生大量的促炎细胞因子,引起“细胞因子风暴”,促进内皮细胞发生炎症反应。而sst2则可抑制内皮细胞炎症反应的发生。而且,il-33和htnv可通过共同活化nf-κb途径达到协同促进炎症反应的作用。该研究提示IL-33可能是HTNV感染导致“细胞因子风暴”的诱发因子,而该炎症反应的过程可被sST2抑制。IL-33/ST2共同调控HTNV感染后的免疫应答,为治疗HFRS提供了新的思路。
二、捕捉法ELISA检测登革热病人血清IgM抗体用于快速诊断（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、捕捉法ELISA检测登革热病人血清IgM抗体用于快速诊断（论文提纲范文）
（1）基于呼吸道病毒感染监测探讨中医疫疠之邪（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于流感主动监测探讨中医疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 资料收集及诊断标准 |
| 1.3 实验室检测 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 监测采样情况 |
| 2.2 病原学监测 |
| 2.3 流感病例症状及病因属性 |
| 2.4 流感疠气流行因素调查 |
| 3. 分析与讨论 |
| 3.1 流感流行人群分布 |
| 3.2 流感症状及病因属性分布 |
| 3.3 流感疠气流行型别及进化变异 |
| 3.4 流感疠气四季分布 |
| 3.5 流感疠气节气分布 |
| 3.6 流感疠气六气分布 |
| 3.7 流感疠气与气象、空气质量因素相关性 |
| 3.8 流感疠气流行病因 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于病毒性肺炎主动监测探讨中医疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 资料收集 |
| 1.3 咽拭子采样 |
| 1.4 实验室检测 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 监测采样情况 |
| 2.2 病原检测结果 |
| 2.3 病毒性肺炎流行人群分布 |
| 2.4 病毒性肺炎临床症状统计及病因属性 |
| 2.5 病毒性肺炎疠气流行因素调查 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 病毒性肺炎流行人群分布 |
| 3.2 病毒性肺炎症状及病因属性分布 |
| 3.3 病毒性肺炎疠气四季分布 |
| 3.4 病毒性肺炎疠气节气的分布 |
| 3.5 病毒性肺炎疠气六气分布 |
| 3.6 病毒性肺炎疠气与气象、空气质量因素相关性 |
| 3.7 病毒性肺炎流行病因 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于新型冠状肺炎主动监测及3D数字PCR方法探讨中医疫疠之邪 |
| 一 基于新型冠状病毒肺炎主动监测探讨中医疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病例筛查 |
| 1.2 标本采集 |
| 1.3 实验室检测 |
| 1.4 资料收集 |
| 2. 结果 |
| 2.1 新型冠状病毒肺炎监测情况 |
| 2.2 新型冠状病毒肺炎流行特点 |
| 2.3 实验室检测及治疗 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 二 基于3D数字PCR技术探讨新型冠状肺炎疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 样本来源 |
| 1.3 建立新型冠状病毒3D数字PCR检测方法 |
| 1.4 新型冠状病毒感染者追踪监测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 3DPCR反应条件的确定 |
| 2.2 3D数字PCR准确性及灵敏度试验 |
| 2.3 3D数字PCR重复性试验 |
| 2.4 3D数字PCR特异性试验 |
| 2.5 新型冠状病毒感染病例追踪监测结果 |
| 2.6 不同病程阶段,新型冠状病毒感染者不同样本类型核酸阳性检出率 |
| 2.7 新型冠状病毒感染者“复阳”比例 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 新型冠状病毒3D数字PCR检测方法建立 |
| 3.2 新型冠状病毒在不同类型生物标本中的分布特点 |
| 3.3 新型冠状病毒感染者“复阳”现象之探究 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 新型冠状病毒检测技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（2）新发传染病鉴定技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 基于核酸检测 |
| 1.1 循环扩增技术 |
| 1.1.1 RT-PCR |
| 1.1.2 dPCR |
| 1.2 恒温扩增技术 |
| 1.2.1 LAMP技术 |
| 1.2.2 NASBA技术 |
| 1.2.3 RPA技术 |
| 1.3 全基因组测序(WGS)技术 |
| 2 基于抗原抗体反应 |
| 2.1 酶联免疫吸附法 |
| 2.2 胶体金免疫层析法 |
| 2.3 免疫磁珠分离技术 |
| 3 基于生物传感器 |
| 3.1 适配体 |
| 3.2 DNA电化学生物传感器 |
| 4 小 结 |
（3）寨卡病毒与中东呼吸综合征冠状病毒血清学检测新方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 寨卡病毒的研究现状 |
| 1.2 中东呼吸综合征冠状病毒的研究现状 |
| 1.3 荧光素酶免疫吸附方法(LISA)简介 |
| 第二章 LISA方法的建立 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2 目的基因的修饰与扩增 |
| 2.3 重组表达质粒的构建 |
| 2.4 细胞复苏与传代 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 获取目标抗原 |
| 2.7 Western Blot验证抗原表达 |
| 2.8 LISA方法进行样本检测 |
| 2.9 其他检测方法与LISA的比较 |
| 第三章 检测抗ZIKV抗体的LISA方法的验证与评价 |
| 3.1 实验样本 |
| 3.2 重组抗原的表达鉴定 |
| 3.3 最佳抗原的确定 |
| 3.4 LISA与商用试剂盒以及中和实验的比较 |
| 3.5 LISA检测不同种属动物样本 |
| 3.6 基于NS1基因检测的交叉反应 |
| 3.7 针对寨卡病毒抗体交叉反应的进一步探究 |
| 第四章 检测抗MERS-CoV抗体的LISA方法的验证与评价 |
| 4.1 实验样本 |
| 4.2 重组抗原的表达鉴定 |
| 4.3 不同抗原检测效果比较 |
| 4.4 LISA与商用试剂盒以及假病毒中和实验的比较 |
| 4.5 LISA检测不同种属动物样本 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）缅甸部分边境地区登革热流行调查（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 调查点与调查时间 |
| 2 样本的采集 |
| 3 主要试剂、材料及其设备 |
| 4 检测方法 |
| 结果 |
| 1 登革病毒IgG抗体水平 |
| 2 疑似登革热病例标本病毒分离与鉴定 |
| 3 蚊虫种类组成 |
| 4 蚊虫样本蚊媒病毒分离与鉴定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）2014-2015年广州市和西双版纳自治州登革热分子流行病学及临床特征的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、登革病毒及登革热流行概况 |
| 1.1 登革病毒及其分型 |
| 1.2 传播媒介 |
| 1.3 国内外流行概况 |
| 二、登革热的临床表现 |
| 三、感染机制 |
| 3.1 二次感染学说 |
| 3.2 毒力变异学说 |
| 3.3 宿主基因背景学说 |
| 3.4 细胞免疫作用和T细胞的激活及抗原表位学说 |
| 四、登革热疫苗的现状 |
| 五、本研究的目的及意义 |
| 试剂耗材 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验试剂 |
| 三、实验耗材 |
| 四、实验仪器 |
| 实验方法 |
| 一、登革病毒遗传多样性 |
| 二、血清学检测 |
| 结果 |
| 一、登革热病例的人口统计学特征 |
| 二、在登革热疑似患者中病毒RNA的阳性率、病毒滴度以及抗体水平 |
| 三、临床表征及实验室检测指标与感染类型的相关性 |
| 四、系统发育分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）出血热相关病毒核酸检测技术研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 登革病毒 |
| 1.2 基孔肯雅病毒 |
| 1.3 寨卡病毒 |
| 1.4 黄热病毒 |
| 1.5 汉坦病毒 |
| 1.6 发热伴血小板减少综合征病毒 |
| 1.7 沙粒病毒 |
| 1.8 克里米亚刚果出血热病毒 |
| 1.9 裂谷热病毒 |
| 1.10 马尔堡病毒 |
| 1.11 埃博拉病毒 |
| 1.12 鄂木斯克出血热病毒和科萨努尔森林病病毒 |
| 1.13 中东呼吸道综合征冠状病毒 |
| 1.14 蜱传脑炎病毒 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 病毒基因 |
| 2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 缓冲液配方 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 引物探针的设计 |
| 3.3 标准品的制备和稀释 |
| 3.4 荧光定量RT-PCR实验及标准曲线的绘制 |
| 3.5 Tem-PCR |
| 3.6 微球与捕获探针的偶联 |
| 3.7 Luminex TM 200仪器的校准 |
| 3.8 Tem-PCR产物的检测 |
| 4. 结果 |
| 4.1 按地区分组实时荧光定量PCR结果 |
| 4.2 按地区分组液相芯片方法检测结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 实时荧光定量PCR |
| 5.2 液相芯片检测技术 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1: DENV-CHIKV病毒样颗粒的制备及免疫原性研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 病毒毒株、细胞株 |
| 2.3. 抗体和抗原 |
| 2.4. 主要试剂及耗材 |
| 2.5. 溶液配方 |
| 2.6 实验仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 重组杆状病毒适宜扩增条件的选取及扩增 |
| 3.2. 病毒样颗粒的制备 |
| 3.3. 抗原的鉴定 |
| 3.4 动物实验 |
| 3.5 免疫实验及滴度的确定 |
| 4. 结果 |
| 4.1 DENV-CHIK VLPs重组杆状病毒的制备与核酸鉴定 |
| 4.2 DENV-CHIK VLPs重组杆状病毒制备条件与鉴定 |
| 4.3 DENV-CHIK VLPs的制备与鉴定 |
| 4.4 IgG抗体水平 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录2: 建立检测方法的检测限和特异性汇总 |
| 结论 |
| 致谢 |
（7）福建省人兽共患病学科发展报告（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 1福建省人兽共患病学科发展现状 |
| 1.1病毒性疾病 |
| 1.1.1乙型脑炎 |
| 1.1.2肾综合征出血热 (HFRS) |
| 1.1.3流感和禽流感 |
| 1.1.4登革热 |
| 1.1.5狂犬病 |
| 1.2细菌性疾病 |
| 1.2.1布鲁氏菌病 |
| 1.2.2沙门菌感染 |
| 1.2.3猪链球菌病 |
| 1.3寄生虫病 |
| 1.3.1血吸虫病 |
| 1.3.2广州管圆线虫病 |
| 1.3.3并殖吸虫病 |
| 1.3.4日本棘隙吸虫病 |
| 1.4其他病原所致人兽共患病 |
| 1.4.1恙虫病 |
| 1.4.2莱姆病 |
| 1.4.3钩端螺旋体病 |
| 1.5媒介生物 |
| 1.6生物安全三级实验室发挥作用 |
| 2人兽共患病学科面临的挑战 |
| 2.1社会和经济发展及全球化导致人兽共患病风险增加 |
| 2.2疾病监测网络尚未完善 |
| 2.3公共卫生应急处置体系急需加强 |
| 3福建省人兽共患病学科发展展望 |
| 3.1疾病监测网络与监测技术发展 |
| 3.1.1建设思路 |
| 3.1.2监测内容发展框架 |
| 3.1.3监测技术发展 |
| 3.2多部门多学科联防联控体系建设 |
| 3.3人兽共患病实验室诊断与筛查技术 |
| 3.3.1新发与不明原因疾病病原快速诊断技术 |
| 3.3.2福建本省重要人兽共患病的快速诊断技术 |
| 3.4继续完善生物安全三级实验室 |
| 3.5人才队伍建设 |
（8）基孔肯雅病毒样颗粒的制备及其特异性IgM检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种、载体 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 培养基与缓冲液 |
| 1.6 实验仪器与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 含CHIKV C-E3-E2-6K-E1结构蛋白及E2蛋白编码基因的rBV的制备 |
| 2.2 CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 含CHIKV C-E3-E2-6K-E1结构蛋白及E2蛋白编码基因的rBV的制备结果 |
| 3.2 CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 抗CHIKV E2蛋白单克隆抗体的制备、鉴定以及基于VLP的特异性IgM检测方法的初步建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物和细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 血清和抗体 |
| 1.4 培养基与缓冲液 |
| 1.5 实验仪器与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗CHIKV E2蛋白mAb的制备、鉴定 |
| 2.2 基于VLP的特异性IgM检测方法的初步建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗CHIKV E2蛋白mAb制备的结果 |
| 3.2 基于VLP的特异性IgM检测方法的建立结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 1.CHIKV VLP及E2蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.CHIKV E2蛋白单克隆抗体的制备以及基于VLP的特异性IgM检测法的建立 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）5种出血热病毒RPA检测方法的建立及其假病毒阳性参考品的制备（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 病毒简介 |
| 1.1 埃博拉病毒 |
| 1.2 马尔堡病毒 |
| 1.3 拉沙病毒 |
| 1.4 黄热病毒 |
| 2 研究方法简介 |
| 2.1 实时荧光定量PCR检测技术 |
| 2.2 RPA检测技术 |
| 3 本课题研究的目的与意义 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 常规溶液的配制 |
| 1.3 主要实验仪器与设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 5 种病毒靶基因片段的扩增 |
| 2.2 融合PCR扩增 |
| 2.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.4 假病毒的制备 |
| 2.5 假病毒颗粒的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 5种出血热病毒RPA检测方法的建立 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 RPA反应体系优化 |
| 2.2 RPA检测特异性实验 |
| 2.3 RPA和Real-time PCR扩增实验 |
| 2.4 假病毒模拟样本实验 |
| 2.5 黄热病毒减毒株 17D RPA扩增实验 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）汉滩病毒感染引起血管内皮细胞炎症因子的产生及诱发炎症反应的机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉滩病毒及肾综合征出血热概述 |
| 1.1 汉坦病毒的发现历史及分类 |
| 1.2 汉坦病毒的结构 |
| 1.3 汉坦病毒的流行病学特征 |
| 1.4 汉坦病毒感染后的临床表现 |
| 1.5 汉坦病毒感染性疾病的诊断 |
| 1.6 汉坦病毒感染性疾病的治疗 |
| 1.7 汉坦病毒的发病机制 |
| 1.8 汉坦病毒感染引起的免疫应答 |
| 2 CXCL10的研究进展 |
| 2.1 CXCL10及其受体 |
| 2.2 CXCL10的功能 |
| 2.3 CXCL10的信号传导途径 |
| 2.4 CXCL10在感染性疾病中的研究进展 |
| 2.5 CXCL10在治疗中的应用 |
| 3 IL-33的研究进展 |
| 3.1 IL-33及其受体ST2的结构和功能 |
| 3.2 IL-33/ST2与疾病 |
| 第一部分 汉滩病毒通过TLR3、RIG-I和MDA-5 途径诱导表达升高的CXCL10与HFRS病情相关 |
| 实验一 HFRS患者血清CXCL10的水平与病情的关系 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 CXCR3在HFRS患者淋巴细胞表面的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 体外细胞模型探索HTNV感染后CXCL10的产生来源 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 HTNV感染HUVEC产生CXCL10的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 IL-33/ST2调节汉滩病毒感染引起内皮细胞的炎症反应 |
| 实验一 肾综合征出血热患者血浆IL-33和sST2的水平与病情的关系 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 IL-33促进HTNV感染的HUVEC产生促炎细胞因子 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4.讨论 |
| 实验三 IL-33通过内皮细胞ST2受体介导炎症反应 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 IL-33通过NF-κB途径调节HTNV感染的内皮细胞产生细胞因子 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、捕捉法ELISA检测登革热病人血清IgM抗体用于快速诊断（论文参考文献）
- [1]基于呼吸道病毒感染监测探讨中医疫疠之邪[D]. 黄瑶. 扬州大学, 2021
- [2]新发传染病鉴定技术研究进展[J]. 罗正汉,汪春晖,张锦海. 公共卫生与预防医学, 2021(02)
- [3]寨卡病毒与中东呼吸综合征冠状病毒血清学检测新方法研究[D]. 王天禹. 南方医科大学, 2019(09)
- [4]缅甸部分边境地区登革热流行调查[D]. 成依依. 昆明医科大学, 2019(06)
- [5]2014-2015年广州市和西双版纳自治州登革热分子流行病学及临床特征的研究[D]. 曹佳琪. 北京协和医学院, 2019(02)
- [6]出血热相关病毒核酸检测技术研究[D]. 闫芳域. 中国疾病预防控制中心, 2018(05)
- [7]福建省人兽共患病学科发展报告[J]. 福建省预防医学会. 海峡科学, 2017(08)
- [8]基孔肯雅病毒样颗粒的制备及其特异性IgM检测方法的初步建立[D]. 陈何嵩. 第四军医大学, 2017(03)
- [9]5种出血热病毒RPA检测方法的建立及其假病毒阳性参考品的制备[D]. 曹雪锋. 安徽医科大学, 2017(02)
- [10]汉滩病毒感染引起血管内皮细胞炎症因子的产生及诱发炎症反应的机制[D]. 张宇丝. 第四军医大学, 2016(02)