一、基因重组B19病毒结构蛋白作为诊断抗原的研究进展（论文文献综述）
李艳伍[1]（2012）在《貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重组杆状病毒免疫特性研究》文中指出貂阿留申病病毒（Aleutian Mink Disease virus,ADV）属细小病毒科阿留申病毒属成员,可以引起水貂慢性进行性疾病,即水貂阿留申病（Aleutian disease of mink, AD）,以繁殖能力下降、貂体消瘦、自身免疫病、高免疫球蛋白血症、细菌感染的易感性增加、肾衰竭死亡为基本特征。目前,该病普遍存在于世界各地人工养殖的水貂种群中,给养貂业造成了极其严重的经济损失。中国黑龙江、吉林、辽宁、山东、新疆和内蒙古等省貂场也存在该病,血清抗体阳性率20%-30%。本研究从中国不同地区临床发病水貂分离鉴定获得3株ADV流行毒株,完成分离毒株编码区基因序列分析,建立成功该病毒TaqMan实时PCR和间接ELISA抗体检测方法,用杆状病毒表达系统成功表达该病毒VP2结构蛋白,阐明其免疫特性,为该病防控奠定了重要基础。具体研究内容分为以下5个部分：1.貂阿留申病病毒分离与鉴定用对流免疫电泳（CIEP）方法对国内主要的水貂养殖地区（山东、辽宁、黑龙江）疑似感染ADV症状的水貂进行ADV血清抗体检测,选择抗体阳性貂进行扑杀,剖检,无菌采取肝、脾、肾、肠系膜淋巴结样品,电镜观察发现细小病毒样颗粒。将研磨组织液过滤后加双抗,接种CRFK细胞,分离病毒,盲传6代,取细胞培养病毒液用PCR方法检测,证明分离获得3株ADV。将3株分离病毒接种健康水貂,隔离观察,接种后3天出现食欲减退,贫血,被毛无光泽,后期出现拒食、狂饮,死亡,个别貂具有神经症状,表现抽搐、痉挛、步态蹒跚,共济失调或后肢麻痹等症状,证明分离获得3株ADV,分别命名为ADV-LN1、ADV-LN2、ADV-LN3。2.貂阿留申病病毒分离株基因测定与分析采用PCR技术对ADV-LN1、ADV-LN2和ADV-LN3分离株进行编码区基因扩增、克隆和测序分析,结果获得完整编码区基因序列,长度为4543bp、4566bp和4566bp。基因序列分析结果显示,ADV-LN1、ADV-LN2、ADV-LN3与欧美毒株ADV-G、 ADV-Utahl、ADV-SL3相比核苷酸最高同源性结构蛋白VP1为97.4%,非结构蛋白最高同源性NS1、NS2、NS3分别为92.6%、93.3%、93.9%。推导的氨基酸最高同源性VP1为97.2%,NS1、NS2、NS3分别为89.2%、91.2%、92.0%。VP1基因长2064bp,编码688个氨基酸,与细小病毒属中PPV-Nanjing200801相似性最大（51.2%）,病毒VP1遗传进化树分析表明,本病毒与细小病毒属VP1亲缘关系最近,中国分离毒株可能为远离欧美的新毒株或由美国ADV-Utah1毒株进化而来。生物信息学分析结果显示,该蛋白是一种保守不合信号肽的外膜蛋白,具有7个潜在的N-糖基化位点和34个磷酸化位点。二级结构分析显示无规则卷曲含量最高,达68.75%,α螺旋、β折叠分别为16.42%和14.83%；同源建模比对,构建了具有较高合理性和可靠性的三维空间结构；预测抗原表位主要位于肽链第254-265、96-112、317-348、514-523、629-645位区段。3.貂阿留申病病毒TaqMan实时PCR检测方法的建立与应用根据GenBank ADV-G毒株VP2基因的保守序列,设计合成了一套引物和TaqMan探针,在国内首次建立了实时荧光定量PCR方法,用于检测ADV。结果显示,该方法具有较好的特异性和重复性,对ADV的DNA检测下限为47.7copy/μL,敏感性比常规PCR高106倍。分别用该法和普通PCR方法对辽宁、山东规模化水貂养殖场60份有阿留申病临床症状的水貂组织病料样品进行ADV检测,结果两种方法符合率为95%,表明该方法具有更快速、灵敏、准确、低污染等优点,为我国进口水貂检验检疫及国内水貂养殖场针对ADV诊断提供了快速检测方法。4.貂阿留申病病毒VP2主要功能区原核表达与间接ELISA抗体检测方法的建立本研究利用PCR技术扩增ADV VP2基因片段,其长度为950bp,克隆至pET-28a（+）原核表达载体,构建获得重组载体pET-28a（+）-VP2,经酶切、PCR扩增和测序分析确证目的基因阅读框正确。重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证明该表达产物分子质量约为42kD,与理论推测的蛋白分子质量一致,经Western-blot分析证明,该重组蛋白可被ADV阳性血清所识别。采用纯化的VP2蛋白为包被抗原,成功建立间接ELISA抗体检测方法,通过比较试验、特异性试验、阻断试验和重复性试验,表明该方法具有较高特异性和灵敏度,重复性较好。用建立的ELISA方法和对流免疫电泳同时检测120份血清样品,两者符合率为95.8%,证明该方法可用于ADV抗体检测。5.阿留申病病毒VP2基因重组杆状病毒的构建与免疫特性研究将阿留申病病毒ADV-LN2株VP2基因克隆到载体pFastBacTMDual中,构建重组转座栽体pFBD-VP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆茵,将VP2基因整合到Bacmid穿梭栽体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明ADV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约35kD。将重组VP2蛋白加入弗氏不完全佐剂,免疫BABL/c鼠,同时采用ADV-LN2病毒灭活佐剂苗、野生型杆状病毒佐剂苗和不免疫为阴性对照,两次免疫,间隔3周,首次免疫后3和6周采血检测ELISA抗体,并取脾脏进行淋巴细胞增殖试验,结果为：免疫后3周重组VP2病毒即能使小鼠产生ADV的特异性IgG抗体,免疫后6周,脾淋巴细胞增殖实验证明重组病毒抗原能够诱导细胞产生良好免疫反应,从而为ADV基因工程疫苗研究奠定了基础,有较好应用前景。
李云燕[2]（2020）在《广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立》文中研究表明禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科,A型流感病毒属。H9亚型AIV感染通常会使家禽表现出产蛋量下降、生长缓慢及呼吸道症状,严重危害家禽产业的健康发展。该亚型病毒不仅能感染家禽和鸟类,也能直接感染人类,还能为新的感染人的重组病毒如H5N6、H7N9、和H10N8等提供部分或全部内部基因,严重危害人类公共卫生安全。广西地理位置特殊,加强该地区H9亚型AIV生态进化的研究对禽流感的有效防控具有重要意义为了解广西地区野鸟源H9亚型AIV遗传进化情况,本研究对2017-2019年间从不同活禽市场采集的斑鸠、鸽子和山鸡等野鸟咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离和纯化,用RT-PCR方法扩增分离株全基因并克隆测序,同时对测序结果进行遗传进化分析。结果表明成功分离鉴定出15株H9亚型AIV,均符合低致病性禽流感的分子特征,遗传进化分析发现其全基因来源较为复杂,一共出现3种不同的基因组合形式。为了建立快速检测不同亚型禽流感病毒方法,本研究利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法快速、敏感和成本低的优点,从NCBI下载不同HA和NA基因序列,利用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/）在线软件设计多对HA（H9和H5）和NA（N2）LAMP特异性引物,同时又设计了四组使用不同荧光标记的探针（HA-H9-探针和NA-N2-探针组合,HA-H9-探针和HA-H5-探针组合）,成功建立了快速检测H9和N2亚型AIV和区分H9、H5亚型AIV的二重荧光RT-LAMP检测方法。
李小青[3]（2008）在《人细小病毒B19-XA2株VP1蛋白Bac-to-Bac系统表达及免疫学特性分析》文中提出人细小病毒B19（Human parvovirus B19,又称人微小病毒B19,简称B19病毒）是迄今发现的能感染人类的最小的单链线状DNA病毒之一。自1990年我们在国内首次证实我国存在B19病毒感染以来,越来越多的研究揭示我国B19病毒感染可诱发急性再障危象、急性血小板减少性紫癜及孕妇非免疫性流产等疾病,尤其对于免疫功能低下或缺陷患者,因缺乏有效治疗药物,B19病毒持续感染可致慢性贫血,甚至危及生命。因此,在我国乃至世界都需要建立有效的B19病毒防治体系。B19病毒基因存在较大的变异。目前B19病毒分为三种基因型:1型（原型）、2型（类A6-和LaLi-）、3型（V9）。不同基因型的分布存在着地理的差异。欧美等西方国家流行的病毒株大多属于1型,2、3型少见;3型多见于西非。此三型其DNA序列差异约为10%,其中大于20%序列差异位于p6启动子区域。在编码VP1/VP2蛋白的开放阅读框内,2、3型与1型比较,DNA序列变异分别为9%、12%,但氨基酸变异仅为1.1%、1.4%。我们在国家自然科学基金课题（39870021）的资助下,采用基因克隆测序技术,对收集到的中国大陆B19病毒流行株（XA株）进行基因分析,发现我国B19病毒流行株的VP1基因独特区有明显的变异,其基因组一级结构的差异,导致所编码氨基酸的改变,可能影响到B19病毒抗原位点及免疫特性的变化。B19病毒基因的变异可导致病毒毒力、致病机制的改变。VP1基因表达的蛋白与病毒的免疫原性及机体感染后产生保护性抗体密切相关,为建立我国B19病毒感染的防治技术,必须深入研究我国病毒流行株变异基因区表达的蛋白的结构和功能位点的变化。因此本实验通过在原核及真核系统表达B19-XA2株VP1蛋白,研究其空间结构和功能位点的变化及其变化对抗原性的影响,以揭示变异的VP1基因表达蛋白的生物学活性,促进B19病毒分子流行病学、致病机理及预防疫苗的研究。研究目的:本实验目的在于扩增获得B19-XA2 VP1基因全长,构建其原核表达载体,表达融合蛋白。同时构建VP1穿梭载体,在昆虫细胞Sf9中表达VP1蛋白,并以原核及真核表达蛋白为免疫原,免疫动物,制备具有一定敏感性和特异性的抗VP1蛋白的多克隆抗血清,用于检测VP1蛋白的免疫原性。分别以原核及真核表达蛋白为抗原,采用ELISA方法与临床患儿的血清反应,并与德国Parvovirus B19 IgM ELISA Kit检测结果比较,分析表达产物VP1蛋白的反应原性,从而为以后研究VP1蛋白的生物学功能,和B19病毒的防治奠定基础。实验方法:1.获得目的基因自行设计引物,按巢式PCR筛选阳性B19感染标本,自阳性标本中按照常规PCR方法扩增获得长度为2345bp的HPV B19 VP1全长基因（nt2623-nt4968）。2.原核表达重组蛋白将VP1基因克隆入载体pET28（a）,构建原核重组表达载体VP1-PET28（a）,并在E.coli BL21（DE3）中扩增,通过IPTG诱导表达VP1融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blot技术分析蛋白表达情况及初步鉴定表达蛋白。3.真核表达VP1蛋白将VP1基因及载体pFastbac1双酶切、连接、转化入DH10Bac,用抗生素及蓝白斑表型筛选阳性重组体,PCR鉴定,获得含目的基因的重组杆状病毒转移质粒VP1-Bacmid,用脂质体介导法将阳性重组体转入Sf9细胞,扩增病毒,循环冻融和裂解,超速离心,获溶解的蛋白质上清。4.以原核及真核表达的重组蛋白为抗原,免疫家兔,制备抗VP1蛋白的多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价;用重组菌超声裂解上清及转染后Sf9细胞裂解后上清（均含重组VP1蛋白）包被ELISA板,分别与临床患儿的血清反应,并与德国ELISA试剂盒检测结果比较,分析表达产物VP1蛋白的反应原性。实验结果:1.巢式PCR筛选到2份阳性B19感染标本,按照常规PCR方法扩增此2份标本,自其中1份标本获得B19 VP1全长基因（2345bp）,将其命名为B19-XA2株。2.原核表达载体VPl-PET28（a）经SalⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段分子量与预期结果相符（2345bp）,测序结果证实序列完全正确。3.将重组菌VP1-PET28（a）-BL21（DE3）经诱导剂IPTG诱导,可表达分子量约为87kDa的蛋白,经Western-blot鉴定,可与6-His抗体结合,证实为VP1融合蛋白。4.构建穿梭载体VP1-Bacmid,通过抗生素及蓝白斑表型双重筛选阳性重组体,经PCR鉴定,获得含目的基因的重组杆状病毒转移质粒VP1-Bacmid,用脂质体介导法将阳性重组体转入Sf9细胞,细胞出现典型病变,收集病变细胞,裂解后SDS-PAGE显示有分子量87kDa的蛋白表达,与预期分子量一致。5. ELISA检测原核系统表达蛋白刺激后产生抗VP1多克隆抗体效价可达1:12800。真核系统表达蛋白刺激后产生抗体效价可达1:50000。6.以重组杆状病毒表达的VP1蛋白作抗原,与B19病毒阳性血清有反应,其OD值略低于德国ELISA试剂盒检测结果。而大肠杆菌系统表达的重组VP1蛋白作为抗原,与B19病毒感染后阳性血清无反应。结论:1.成功构建了重组人细小病毒B19-XA2株VP1全长基因的E.coli.:VP1-PET28（a）-BL21（DE3）。2.成功构建了人细小病毒B19-XA2株VPl全长基因重组杆状病毒转移质粒VP1-Bacmid,并在昆虫细胞Sf9中成功表达VP1蛋白。3.两种表达系统表达的重组VP1蛋白作为抗原有诱导特异性抗体产生的能力,即具有良好的免疫原性。4. Bac-to-Bac系统表达的VP1蛋白其生物活性更接近天然产物,可用作抗原检测人感染B19病毒后的血清抗体,且与进口试剂盒进行平行比较,初步达到同类试剂盒水平。
赵培蓓[4]（2019）在《风疹病毒E1结构蛋白在杆状病毒表达系统中的表达和纯化》文中提出目的1、杆状病毒表达系统的方法及蛋白表达优化条件的建立;2、通过杆状病毒系统表达风疹病毒E1全长重组蛋白,成功获得相对纯度的风疹E1重组蛋白;3、为高灵敏度、高特异性血清学方法检测抗原筛选奠定了基础,用于建立高灵敏度和高特异性血清学的检测方法。方法通过将风疹病毒E1蛋白与供体质粒pFastBacHTA用限制性内切酶消化连接后转化到DH10Bac TME.colic中,在其感受态内部进行同源重组,用蓝白斑和抗性进行筛选,经鉴定正确后提取含有RV-E1基因组的重组穿梭质粒Bacmid-RV-E1转染到Sf9细胞,收获病毒培养上清,即为P1代重组杆状病毒AcMNPV-RV-E1,使用P1代接种Sf9细胞扩增病毒库,收获细胞上清,即为P2代AcMNPV-RV-E1,经CPE、IFA和PCR鉴定后表明含有RV-E1基因成功转染细胞,并在细胞中进行组装、复制和表达。同上方法接种细胞,收获AcMNPV-RV-E1病毒库。终点稀释法稀释病毒接种细胞,按不同MOI值接种细胞,进行空斑实验,测得病毒滴度。对重组杆状病毒扩增条件进行优化,找出最适宜收获目的蛋白的天数。进而通过镍柱亲和层析法对含有RV-E1目的蛋白进行纯化,并对目的蛋白的表达进行鉴定。结果通过PCR扩增技术,成功获得风疹E1的目的基因,同时与供体质粒pFastBacHTA相连,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞内进行同源重组,提取含有RV-E1的Bacmid重组穿梭质粒,转染于Sf9细胞中,经杆状病毒表达系统表达后鉴定正确,能够表达出目的蛋白,并对表达条件进行优化后,接种收获蛋白,进行纯化。经鉴定得出,目的蛋白不仅可以被风疹特异性兔多克隆抗体和6*His单克隆鼠抗体识别,还可以与风疹阳性人血清发生结合,表明该蛋白具有免疫反应性。结论1、通过PCR扩增,成功获得RV-E1目的基因,与pGEM-T载体连接克隆,经鉴定后与供体质粒pFastBacHTA双酶切连接,转化到DH10Bac TME.coli感受态细胞克隆,提取重组穿梭质粒,感染Sf9细胞,经鉴定后,表明重组杆状病毒能够在细胞内进行组装、复制,成功获得含有目的基因的重组杆状病毒;2、经WB、DB鉴定后,能够与抗体（特异性兔抗、6*His抗体）及RV阳性血清产生反应,表明RV-E1均能与不同种属的抗体进行反应,具有良好的免疫反应性。优化表达条件后成功表达风疹E1蛋白,为建立应用于血清学的检测方法及抗体筛选奠定了基础,可用于血清学应用。
梁冬莹[5]（2007）在《ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用》文中研究说明水貂阿留申病（Aleutian Disease，AD）是由细小病毒亚科（Parvovirinae）阿留申水貂病毒属（Amdovirus）水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus，ADV）引起的免疫系统病理性失调，是一种主要侵染水貂、病程缓慢的传染性疾病。该病以垂直和水平传播两种形式在世界各国的貂群中广泛流行，导致没有抗体的新出生幼貂的急性间质性肺炎甚至死亡，成年水貂的繁殖能力、皮张质量、健康状况下降以及死亡率增加，对水貂养殖业造成不可低估的经济损失。近年来，我国水貂养殖区阿留申病的流行情况在国内时有报道，高水平的AD感染一直是严重影响我国水貂养殖业高效、健康发展的一个非常重要的因素之一。由于目前针对该病缺少有效的防治方法，普遍采用的是通过定期检测，淘汰患病貂群，从而达到净化种群的目的。因此，在国内进行分离鉴定病毒株及进行分子生物学特性研究，建立国内适用的血清学诊断方法，将会对今后国内开展水貂阿留申病的临床诊断、有效防制及进一步的深入研究，提供更多的科学依据。在本研究中，首先通过CIEP以及本实验室建立的ADV PCR检测方法，对黑龙江某水貂养殖场发病送检貂以及辽宁某水貂养殖区疑似阿留申病貂进行检测，将经两种方法检测均为阳性结果的毒株进行PCR扩增产物的序列测定，从中抽取序列较为保守的四株病毒与标准对照毒株进行序列比对和同源性分析，与ADV-G相应片段的核酸同源率分别为92.8％、93.9％、93.2％和93.5％，与参考株ADV-Utah的同源率分别为94.5％、98％、94.6％和95.5％，确定为ADV特异性核苷酸片段。依据鉴定的结果，成功鉴定了四株病毒，分别命名为MS-1、DL-1、DL-2和DL-3。将MS-1、DL-1、DL-2和DL-3株病毒经组织病料提取总DNA，采用依据标准毒株ADV-G的DNA序列设计并合成的四对引物，经PCR扩增后分别构建重组质粒并测序，将测序结果用DNA Star软件中的SeqMan程序进行拼接，获得四株病毒的近全长DNA序列。用DNA Star软件MegAlign程序中的Jotun Hein method将实验测得的毒株与国外病毒参考株的对应核苷酸序列进行同源性比较和进化树分析。结果表明，ADV-Utah与四个实验毒株的序列同源性较高，同源率为92.9-93.4％，ADV-G、ADV-SL3与实验毒株的同源性较低；四个实验毒株和三个参考毒株被分别划归为两个组，分属于两个进化分支；实验毒株中ADV-DL1与DL2和DL3虽然同为大连分离株，却表现出较远的亲缘关系。用DNA Star软件MegAlign程序中的Clustal W method将实验测得的ADV毒株核苷酸序列、ADV参考株序列以及细小病毒其它四个属的代表毒株全序列进行进化树分析，发现14株病毒共划归为五个相对独立的进化分支，ADV与牛犬细小病毒作为细小病毒亚科中新增的属，与其它属的成员分属于不同的进化分支，分析结果验证了ICTV8公布的新分类体系的合理性。选择VP2蛋白主要抗原表位区相对保守的ADV MS-1毒株作为种毒，分别设计合成两对引物，用PCR方法扩增其VP2基因中主要抗原表位区的两个片段，分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中，构建重组表达质粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b，经PCR扩增、酶切和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框正确，成功地构建了原核表达载体。阳性重组质粒转化宿主菌TB1，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段融合蛋白均以包涵体形式获得了有效表达，表达产物分别占总菌体蛋白的32.7％和37.41％；表达产物的分子质量分别约为63kD和65kD，与理论推测的分子质量一致；在终浓度为1mM的IPTG诱导下，4h时其表达量达到高峰：Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别。将分离和初步纯化的表达包涵体蛋白作为抗原，对阳性血清进行CIEP检测，验证其免疫活性，并与标准抗原的CIEP检测结果相比较，二者的符合率达到94.3％。以本实验获得的重组蛋白作为诊断抗原的特异性、重复性、敏感性均较好，初步建立了临床诊断方法。总之，本研究对ADV国内分离毒株进行分离鉴定和全序列测定，为研究国内ADV病毒株的进化特点和规律提供基础性资料；在国内首次利用原核表达载体成功地对VP2主要抗原表位区进行表达，并以其为抗原，初步建立了ADV抗体的CIEP检测方法，将为国内养貂场有效开展阿留申病血清学调查提供有效的技术手段，在貂群的净化中发挥巨大的作用。
陈彩平[6]（2004）在《人细小病毒B19XA株VP1蛋白的表达、纯化和免疫原性研究》文中指出B19病毒属细小病毒属，是动物病毒中结构最简单的一种单链、线状DNA病毒，于1975年被发现，随后被证实是已知的细小病毒属中唯一致人类疾病的病毒，可引起传染性红斑、关节炎、粒细胞减少症等，甚至引起严重的血液系统疾病。其主要经呼吸道、血液途径和母婴垂直传播，可引起社区局部流行、院内感染和暴发性流行，并在全球普遍存在。1990年首次证实我国存在该病毒感染，随后的研究发现该病毒是我国儿童急性再障危象、急性血小板减少性紫癜及孕妇非免疫性流产等疾病的重要病因之一，并与先天性心脏病、类风湿关节炎（RA）发病相关。同时，我国妇女和儿童血清中保护性抗体水平低，易发生该病毒感染。尤其免疫功能低下或缺陷患者可发生持续感染、重症血液病和慢性贫血，危及生命。 B19病毒基因约5.6kb，由一个内含子和位于两端的重复序列组成。在B19病毒基因组内有两个大的开放读框，编码非结构蛋白（NS）和两个衣壳蛋白（VP1和VP2）。B19病毒序列存在变异。NS基因最为保守，在病毒的复制中起重要的作用，VP1和VP2表现出较大的变异性，约为2～3％。根据酶切图谱的不同，将病毒分为4型。中国西安的 第四军医大学博士学位论文3株B19病毒（XA株）与其它国家的病毒株相比，在核昔酸水平和氨基酸水平上均有着显着的差异。 VPI和VPZ蛋白组成衣壳包裹在B 19病毒DNA表面，构成B19病毒的抗原性。病毒的主要中和抗原表位位于VPI独特区和VPI一VPZ连接区，v尸1独特区是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。非结构蛋白NS和B19病毒毒力有关。VPI和VPZ蛋白，特别是VPI独特区，对B19病毒的诊断和保护性疫苗的制备非常有意义。 但是，由于B19病毒不能在传统的培养基上生长繁殖，抗原来源十分困难，加之XA株B19病毒VPI独特区在核昔酸水平和氨基酸水平上与标准株相比存在着显着的差异，需要大量制备中国株B19病毒VPI蛋白作为抗原，为制备特异性诊断试剂和疫苗创造条件。 研究目的:本项实验主要是构建XA株B19病毒VPI基因原核表达载体，大量表达VPI蛋白，进一步对、甲1蛋白进行纯化，并以聚丙烯酞胺为佐剂免疫动物，检测VPI蛋白的免疫原性，制备具有一定敏感性和特异性的抗VPI蛋白多克隆抗血清，为进一步B19病毒XA株的检测和疫苗的制备准备条件;同时构建B19病毒VPI基因真核表达载体，为进一步研究VPI蛋白的生物学功能，探讨B19病毒的致病机制奠定基础。 实验方法:1.利用酶切、回收等分子生物学方法，从我所已构建的pUC19一vPI质粒中，获得我国B19病毒流行株（XA株）的vPI基因。将所获得的片段克隆至原核表达载体pQE 30的相应位点中，通过酶切进行鉴定。为了选择高效稳定表达vPI蛋白的载体，对己构建的vPI一pQE 30质粒以不同的酶进行酶切，并利用回收、连接、酶切等分子生物学方法，构建并鉴定另一个原核表达载体VPI一pRSET 第四军医大学博士学位论文A。两种重组体VPI一pQE 30和VP一pRSETA的阳性克隆均进行了测序分析。 2.分别诱导含有构建成功的两种重组体的菌株表达vPI融合蛋白，利用SDS一PAGE分析蛋白表达情况，利用Western Blot鉴定表达的融合蛋白。 3.在不同的温度、诱导剂浓度、诱导时间下，分别诱导含有两种重组体的菌株表达VPI融合蛋白，比较不同条件下VPI融合蛋白的表达率，并对两种质粒的表达率进行比较，选择最佳的表达条件，同时对诱导后的细菌进行裂解，通过SDSPAGE分析裂解上清和沉淀中蛋白组成和含量，了解融合蛋白的表达形式。 4.大量诱导表达VPI融合蛋白，洗涤和纯化主要由VPI融合蛋白构成的包涵体，通过SDS一PAGE进一步纯化VPI蛋白，将含有VPI蛋白的聚丙烯酞胺凝胶制备成为抗原。 5.利用上述抗原免疫兔，获得抗VPI的多克隆抗血清。应用ELISA法鉴定该抗血清的效价，Western B10t法鉴定其特异性。 6.构建VPI基因的真核表达载体VP卜pEGFP一CI，利用脂质体介导的基因导入法将重组体VPIpEGFP一Cl和空载体pEGFP一CI导入人宫颈癌Hela细胞，经G418筛选获得稳定转染的细胞系;利用荧光显微镜、免疫细胞化学和Western B10t法观察细胞转染后VPI蛋白的表达情况。 实验结果:l.vPI一pQE 30质粒经BamHI和Sall，vPI一pRSETA质粒经BamHI和pstl双酶切，均可切出分子量约480bp的片段，与预期结果相符。两种重组体测序结果证实序列完全正确。 2.分别含有两种重组体的菌株经诱导剂工PTG诱导，均可表达分子量约为22KD的蛋白，经western Blot鉴定， 第四军医大学博士学位论文均可与6一His抗体结合，为VPI融合蛋白。 3.对诱导表达条件分析发现:①vPI一pQE 30在37℃下无表达，25℃下有表达，表达率为16%，vPI一pRSETA在37℃下表达率（17.8%）最高，30℃下有表达，25℃下几乎无表达;②vPI一pQE 30在诱导剂浓度为0.05一lmm。1/L时均有表达，表达率相近，为’（16土1）%，VPI一pRSETA在诱导剂浓度为0.5mm01/L时表达率最高，为19.6%;③vPI一pRSETA在诱导表达5小时
邵惠训[7]（2011）在《人类微小病毒B19感染的最新进展》文中进行了进一步梳理人类微小病毒B19主要侵袭人体骨髓造血系统,损害人体多种脏器,是儿科出疹性疾病——传染性红斑的病原。还可使慢性溶血患者发生再障危象、关节病、血管性紫癜和雷诺肢端综合征等。在免疫缺陷患者,可造成持续感染。妊娠期受到病毒侵害,引发宫内感染,可导致流产、胎儿水肿和死胎。此外,还与多种造血系统异常（中性粒细胞减少症和血小板减少症等）有关。
张倩[8]（2014）在《羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒的构建及初步评价》文中研究表明羊传染性脓疱病是由羊传染性脓疱病毒引起的绵羊、山羊等反刍动物以及人类的一种急性、高度嗜上皮性、接触性传染病。该病在世界养羊业发达的国家和地区广泛流行，危害较大，造成严重的经济损失，目前尚无有效的治疗药物；接种疫苗被认为是控制该病可靠而有效的手段。当前常规弱毒苗和灭活苗存在毒力返强、不安全、免疫保护率不高等缺点，急需开发一种新型的候选疫苗株以便更好的预防该病的发生和流行。羊痘病毒作为载体表达外源基因的有效性已经被大量研究所证实。因此，本研究选取商品化的山羊痘弱毒疫苗作为载体，构建表达羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组山羊痘病毒，并对其遗传稳定性、理化特性和免疫原性进行检测和初步评价，旨在获得能同时预防山羊痘和羊传染性脓疱病的双价基因工程疫苗。为此，本研究主要开展以下研究工作：1.分离鉴定羊传染性脓疱病毒。对新疆地区疑似羊传染性脓疱病的羔羊唇部结痂进行采集，研磨过滤后接种Vero细胞，分离培养病毒，待出现明显细胞病变时，收集细胞进行电镜观察；通过PCR技术扩增羊传染性脓疱病毒B2L基因，进行测序分析。同时对该分离株和Genbank上公布的中国其他省市区的30个分离株的B2L基因序列进行生物信息学分析并构建系统进化树。实验结果显示：羊传染性脓疱病毒接种细胞后出现明显的细胞病变，通过电镜观察到200nm左右的病毒粒子；PCR技术检测出了大小为1137bp的特异性目的片段。该分离株与其他分离株的核苷酸序列同源性为96.0%-99.1%，氨基酸的同源性为88.7%-99.2%；系统进化树分析显示该分离株与NX/YC-2010分离株遗传距离最近。2.构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒并研究其生物学特性。本研究利用同源重组技术构建含有良好免疫原性的ORFV011（B2L）基因的重组山羊痘病毒。采用PCR技术扩增B2L基因，通过分子克隆技术构建重组载体，并利用脂质体法将其转染已接种山羊痘弱毒株病毒的BHK-21细胞，进行同源重组。利用X-gal蓝白斑筛选重组山羊痘病毒rGPV-B2L。应用PCR、间接免疫荧光和Western免疫印迹等方法对重组病毒进行检测与鉴定。通过TCID50对该重组病毒的理化特性进行评价。实验结果显示：本研究成功构建了重组病毒转移载体。通过蓝白斑筛选纯化获得了重组山羊痘病毒rGPV-B2L，并且连续传代20次后重组病毒B2L基因能够在BHK细胞中稳定的复制、转录及表达。理化特性检测显示该重组病毒经55℃30min或紫外照射60min即可被灭活，且对强酸、强碱、有机溶剂等较敏感。3.初步评价重组山羊痘病毒的毒力及免疫效果。为了评价该重组病毒作为候选疫苗的免疫效果，本文采用初免-加强免疫的策略对6-8周龄的雌性小鼠进行皮下注射，通过间接ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体水平，通过双夹心ELISA评估其细胞免疫和体液免疫水平，同时通过攻毒实验对该重组病毒的免疫保护力进行评价。结果显示：重组病毒候选疫苗首免后1周，血清中即可检测到B2L特异性抗体；加强免疫后，血清中的抗体水平显着升高，表明该重组病毒可激发较高的体液免疫。对IFN-γ和TNF-α等细胞因子的检测结果显示，该重组病毒也可强烈地激活机体细胞免疫应答。因此，本研究证实该重组病毒候选疫苗能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答。此外，我们通过攻毒实验对重组病毒的保护力进行评价发现，本研究构建的重组病毒候选疫苗能够提供有效地免疫保护作用。该研究结果为今后进行本体动物的免疫试验及临床的初步应用提供理论依据，同时也为ORFV免疫特性的阐明奠定基础。本研究结果表明我们成功分离到羊传染性脓疱病毒，并且获得了可稳定表达羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组山羊痘病毒疫苗候选株，其具有一定的免疫原性，对ORFV具有一定的抵抗能力，为今后制备羊传染性脓疱-羊痘基因工程活载体疫苗奠定基础，使同时预防山羊痘和羊传染性脓疱病成为可能。
丛培中,谷淑燕[9]（1996）在《基因重组B19病毒结构蛋白作为诊断抗原的研究进展》文中研究说明 B19病毒即人类细小病毒（Human parvovirus）,是细小病毒属中唯一对人类有致病性的病原体。该属病毒还包括一些以动物为宿主的病毒,如牛细小病毒和猫细小病毒,是目前动物病毒中最小最简单的一类单链DNA病毒,无包膜,有2～3个衣壳蛋白(Vp1-
李呈军[10]（2005）在《中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究》文中提出我国在1994年从广东省分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,此后,该亚型病毒在全国范围内广泛流行。本研究对1996-2002年中国大陆分离到的27株H9N2亚型AIV进行了系统的进化分析,其目的是为如下问题提供答案:1)中国大陆H9N2亚型AIV的遗传演化关系如何? 2)是否具备感染哺乳动物的能力? 3)它们的抗原性关系如何,是否出现了抗原变异株? 27株病毒以106EID50的剂量鼻腔感染SPF鸡,表明所有病毒均为低致病性毒株。抗原性分析表明,这些病毒的抗原性比较复杂,出现了多株抗原变异株。CK/GX/10/99,CK/HLJ/35/00和CK/SH/10/01三株病毒的灭活疫苗免疫保护实验结果表明,只有CK/SH/10/01疫苗可以对同源病毒攻击产生完全的免疫保护,而且灭活疫苗对异源的CK/SH/10/01和CK/GX/10/99病毒的交叉免疫保护效果很差,攻毒后有多只鸡排毒。 进一步利用BALB/c小鼠模型评价H9N2亚型AIV对哺乳动物的感染能力,根据感染后小鼠的体重变化和病毒在小鼠肺脏中的生长滴度,将27株病毒分为3组。第一组5株病毒感染小鼠后在肺脏中未分离到病毒,小鼠不致病,体重不下降。第二组包括14株病毒,其中11株病毒感染后3天肺脏病毒滴度在2.8-5.8log10EID50/ml之间,另外3株病毒感染后3天未从小鼠肺脏中分离到,感染后5天则可以检测到较低水平的病毒复制,该组病毒感染后小鼠体重持续增长或仅引起低于5%的体重下降。第三组8株病毒感染小鼠后3天肺脏病毒滴度在6.0-7.3log10EID50/ml之间,其中7株病毒可导致小鼠出现明显的发病症状,体重下降10-20%。 遗传演化分析表明,所有病毒都是起源于CK/BJ/1/94-like病毒,并且在进化过程中发生了复杂的基因重组,由QA/HK/G1/97,TY/WI/66,CK/HK/G9/97或CK/SH/F/98病毒获得了某些基因片段,形成了9个不同的基因型。发现3株病毒的M2蛋白的31位由S突变为N,经过试验证实这些病毒获得了对金刚烷胺的抗药性。 本研究系统的阐明了我国H9N2亚型AIV的生物学及遗传多样性。这些病毒对家禽呈低致病性,这就使得其更易于传播扩散;多数病毒获得了感染哺乳动物并在其体内有效复制的能力,因此有可能演变成引起人类流感流行的病毒;这些病毒之间存在显着的抗原性差异,而且出现了抗药性毒株,这就为有效防制带来了极大的困难。因此,必须对H9N2亚型禽流感的防制给予足够的重视。 H5N1亚型禽流感的暴发给世界养禽业造成毁灭性打击。疫苗免疫是防制高致病性H5N1亚型禽流感的重要手段,能与自然感染相区别的免疫措施对禽流感的控制和根除非常重要。本研究利用反向遗传操作技术人工救获了H5N1亚型重组流感病毒疫苗株H5N1/PR8-5819,其6个内部基因来源于高滴度鸡胚适应株PR8,HA和NA基因来源于我国分离的第一株H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96。通过分子修饰去除了HA基因裂解位点的多个连续碱性氨基酸,使其具备了低致病
二、基因重组B19病毒结构蛋白作为诊断抗原的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因重组B19病毒结构蛋白作为诊断抗原的研究进展（论文提纲范文）
（1）貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重组杆状病毒免疫特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 貂阿留申病病毒及其检测方法研究进展 |
| 1 ADV病原学 |
| 1.1 ADV的分类地位 |
| 1.2 ADV的形态及理化性质 |
| 1.3 ADV的培养 |
| 1.4 ADV株间差异与致病性 |
| 1.5 ADV的毒株分型 |
| 2 ADV的分子生物学特性 |
| 2.1 ADV的基因组结构和复制特点 |
| 2.2 ADV的转录和复制 |
| 2.3 ADV基因组编码蛋白及功能 |
| 2.4 ADV基因的表达调控 |
| 3 貂阿留申病概述 |
| 3.1 AD流行病学 |
| 3.2 ADV致病机理 |
| 3.3 临床症状及病理变化 |
| 3.4 实验室诊断 |
| 3.5 AD的防制 |
| 4 本研究背景及意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第二章 中国貂阿留申病病毒的分离与鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 细胞与培养基 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 其他材料 |
| 1.6 对流免疫电泳(CIEP)检测ADV |
| 1.7 透射电镜观察 |
| 1.8 CRFK细胞培养与病毒分离 |
| 1.9 PCR检测ADV |
| 1.10 动物试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状与病理变化 |
| 2.2 清ADV抗体检测 |
| 2.3 电镜观察 |
| 2.4 病毒分离与PCR鉴定 |
| 2.5 水貂攻毒发病试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 貂阿留申病病毒中国毒株基因序列测定与遗传进化分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 编码区基因测序结果 |
| 2.3 结构基因的序列分析 |
| 2.4 VP1基因鉴定分析 |
| 2.5 ADV分离株VP1蛋白生物信息学分析 |
| 2.6 ADV分离株非结构基因的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 貂阿留申病病毒TAQMAN实时PCR检测方法的建立与应用 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 反应条件优化结果 |
| 2.2 标准曲线的建立 |
| 2.3 敏感性试验结果 |
| 2.4 特异性试验结果 |
| 2.5 重复性试验结果 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 貂阿留申病病毒VP2主要功能区基因原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒pMD18T-VP2的酶切 |
| 2.3 重组质粒VP2基因测序 |
| 2.4 重组质粒PET-28a-VP2的鉴定 |
| 2.5 表达条件优化 |
| 2.6 重组蛋白纯化 |
| 2.7 重组蛋白复性 |
| 2.8 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 2.9 间接ELISA的最佳反应条件 |
| 2.10 特异性试验 |
| 2.11 阻断试验 |
| 2.12 与对流免疫电泳比较试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第六章 貂阿留申病病毒VP2基因重组杆状病毒的构建与免疫特性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP2基因扩增 |
| 2.2 阳性质粒pMD18-T-VP2的酶切鉴定 |
| 2.3 重组转座载体的鉴定 |
| 2.4 细胞病变观察与病毒PCR鉴定 |
| 2.5 间接免疫荧光试验鉴定结果 |
| 2.6 SDS-PAGE和Western-blot检测VP2蛋白 |
| 2.7 免疫小鼠血清ELISA检测结果 |
| 2.8 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 A型流感病毒简介 |
| 1.2 禽流感病毒病原学特征 |
| 1.2.1 病毒形态结构 |
| 1.2.2 禽流感基因编码的蛋白及其功能 |
| 1.2.3 禽流感病毒的抗原漂移和抗原转变 |
| 1.3 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 1.3.1 H9N2亚型禽流感病毒在中国的爆发和流行 |
| 1.3.2 H9N2亚型禽流感病毒诊断技术 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增检测技术(LAMP)研究进展 |
| 1.4.1 LAMP技术基本原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 与其它技术相结合的LAMP技术 |
| 1.5 本课题研究的意义 |
| 第二章 广西野鸟源H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 鸡胚与标准血清 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.3 分离株生物学特性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定 |
| 2.3.2 分离株HA和NA基因型鉴定及标准命名 |
| 2.3.3 分离株生物学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 15株广西野鸟源H9N2亚型禽流感病毒分离株全基因组序列测定及遗传进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分离株RT-PCR全基因组扩增 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增产物胶回收与连接转化 |
| 3.2.3 阳性菌液的鉴定与测序 |
| 3.2.4 测序结果分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扩增及序列测定结果 |
| 3.3.2 遗传进化分析结果 |
| 3.3.3 15株野鸟源H9N2亚型AIV分离株基因分型 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 H9和N2 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 标准品的制备 |
| 4.2.3 反应体系的优化 |
| 4.2.4 特异性试验 |
| 4.2.5 干扰性试验 |
| 4.2.6 敏感性试验 |
| 4.2.7 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 反应体系 |
| 4.3.2 结果观察 |
| 4.3.3 特异性试验 |
| 4.3.4 干扰性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 临床样品检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 H9和H5 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 标准品的制备 |
| 5.2.3 反应体系的优化 |
| 5.2.4 特异性试验 |
| 5.2.5 干扰性试验 |
| 5.2.6 敏感性试验 |
| 5.2.7 临床样品检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 反应体系 |
| 5.3.2 结果观察 |
| 5.3.3 特异性试验 |
| 5.3.4 干扰性试验 |
| 5.3.5 敏感性试验 |
| 5.3.6 临床样品检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（3）人细小病毒B19-XA2株VP1蛋白Bac-to-Bac系统表达及免疫学特性分析（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. B19 病毒基因组结构及其变异 |
| 2. B19 病毒基因变异的生物学意义 |
| 3. 研究病毒基因及蛋白结构变异的表达系统的选择 |
| 4. B19病毒重组蛋白的应用展望 |
| 正文 人细小病毒B19-XA_2 株VP1 蛋白BAC-TO-BAC系统表达及免疫学特性分析 |
| 实验一人细小病毒B19-XA_2 株VP1 基因原核表达载体的构建、重组蛋白表达及初步鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料与试剂 |
| 1.3 主要工作液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 人细小病毒B19-XA_2株VP1 基因原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 人细小病毒B19-XA_2株VP1 蛋白原核表达及初步鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 巢式及常规PCR扩增结果 |
| 3.2 构建原核表达载体VP1-PET28(a) |
| 3.3 重组转化子鉴定 |
| 3.4 重组体阳性克隆序列测定结果 |
| 3.5 表达产物鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 B19 病毒VP1 蛋白的研究意义 |
| 4.2 表达系统的选择 |
| 实验二 人细小病毒B19-XA_2株VP1 蛋白在BAC-TO-BAC系统中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料与试剂 |
| 1.3 主要工作液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 VP1-pFastBac1 供体质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 VP1-Bacmid穿梭载体的构建与鉴定 |
| 2.3 细胞复苏与培养 |
| 2.4 冻存细胞 |
| 2.5 VP1-Bacmid转染Sf9 细胞 |
| 2.6 杆状病毒的扩增 |
| 2.7 细胞的裂解及蛋白表达的分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒VP1-pFastBac1 的构建及鉴定 |
| 3.2 重组穿梭载体VP1-Bacmid的构建及鉴定 |
| 3.3 重组VP1-Bacmid转染Sf9 细胞 |
| 3.4 重组杆状病毒的扩增及重组蛋白表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 选用BEVS的优点 |
| 4.2 本实验的改进 |
| 实验三 两种表达系统表达的B19-XA_2株VP1 重组蛋白免疫原性及反应原性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料与试剂 |
| 1.3 主要工作液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔抗多克隆抗体的制备 |
| 2.2 抗血清效价的测定 |
| 2.3 德国ELISA试剂盒测定临床标本 |
| 2.4 不同系统表达产物VP1 蛋白的反应原性 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗血清效价检测 |
| 3.2 不同系统表达产物VP1 蛋白的反应原性分析 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）风疹病毒E1结构蛋白在杆状病毒表达系统中的表达和纯化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RV-E1 基因片段的扩增 |
| 2.2 RV-E1基因全长T-A克隆重组质粒的构建 |
| 2.3 RV-E1基因重组供体质粒pFastBac TMHTA的鉴定 |
| 2.4 含RV-E1目的基因重组穿梭质粒的鉴定 |
| 2.5 RV-E1重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.6 转染细胞中目的蛋白表达的鉴定 |
| 2.7 RV-E1表达条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 风疹病毒在消除阶段实验室检测中的研究策略 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 ADV概述 |
| 1.2.2 ADV的分子生物学研究进展 |
| 1.2.3 水貂阿留申病概述 |
| 1.3 本课题的来源及主要内容 |
| 2 ADV的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 工具酶和试剂 |
| 2.1.2 CIEP检测用抗原及对照血清与PCR检测用对照毒株 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 PCR引物序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料采集及处理 |
| 2.2.2 流行病学及症状调查 |
| 2.2.3 CIEP检测 |
| 2.2.4 PCR检测 |
| 2.2.5 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.6 目的片段的克隆 |
| 2.2.7 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 目的基因序列的测定和序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 流行病学和症状 |
| 2.3.2 CIEP检测结果 |
| 2.3.3 PCR检测结果 |
| 2.3.4 序列分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 四株ADV近全长序列测定及遗传变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验毒株与参考毒株 |
| 3.1.2 质粒与菌种 |
| 3.1.3 工具酶和试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.1.5 PCR引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PCR扩增目的片段 |
| 3.2.2 PCR产物的胶回收 |
| 3.2.3 目的片段的克隆 |
| 3.2.4 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 3.2.5 目的基因序列的测定 |
| 3.2.6 序列分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PCR扩增 |
| 3.3.2 PCR扩增产物的克隆、鉴定 |
| 3.3.3 本实验测得毒株与ADV参考毒株的序列比对分析 |
| 3.3.4 ADV毒株与细小病毒亚科其它属代表毒株的序列比对分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 参考毒株的选择 |
| 3.4.2 实验毒株与参考毒株之间的进化关系 |
| 3.4.3 ADV与其它各属成员的进化关系分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 VP2主要抗原表位的表达及表达产物的抗原性检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒株 |
| 4.1.2 菌种和质粒 |
| 4.1.3 工具酶 |
| 4.1.4 CIEP检测用抗原与血清 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 SDS-PAGE使用试剂配置 |
| 4.1.7 Western-blot试剂配置 |
| 4.1.8 仪器 |
| 4.1.9 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 VP2a及VP2b的PCR反应 |
| 4.2.2 PCR扩增目的片段的纯化 |
| 4.2.3 VP2a及VP2b片段与pMD18-T simple载体的连接和转化 |
| 4.2.4 pMD18-T阳性重组子的鉴定 |
| 4.2.5 pMD18-T阳性重组子序列的测定 |
| 4.2.6 原核表达载体pMAL-VP2a及pMAL-VP2b的构建 |
| 4.2.7 重组pMAL-VP2a及pMAL-VP2b表达质粒的转化和鉴定 |
| 4.2.8 重组质粒pMAL-VP2a及pMAL-VP2b的序列测定及抗原表位分析 |
| 4.2.9 阳性重组质粒转化TB1感受态细胞 |
| 4.2.10 pMAL-VP2a及pMAL-VP2b重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 4.2.11 菌体裂解物的SDS-PAGE电泳及表达位置的确定 |
| 4.2.12 诱导表达条件的优化 |
| 4.2.13 表达产物Western blot分析 |
| 4.2.14 包涵体蛋白的提取与纯化 |
| 4.2.15 CIEP检测 |
| 4.2.16 表达蛋白与标准抗原CIEP检测结果的比较 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 VP2a及VP2b的PCR扩增结果 |
| 4.3.2 重组质粒PMD18-T-VP2a及PMD18-T-VP2b的PCR与酶切鉴定 |
| 4.3.3 重组质粒PMD18-T-VP2a及PMD18-T-VP2b的测序 |
| 4.3.4 重组原核表达载体pMAL-VP2a和pMAL-VP2b的鉴定 |
| 4.3.5 重组质粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b的序列测定 |
| 4.3.6 SDS-PAGE鉴定结果及重组蛋白最佳诱导条件的确定 |
| 4.3.7 Western blot分析 |
| 4.3.8 纯化回收后蛋白的浓度测定结果 |
| 4.3.9 CIEP检测结果 |
| 4.3.10 表达蛋白和标准抗原CIEP方法的比较试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 引物的设计 |
| 4.4.2 目的片段的选择 |
| 4.4.3 实验毒株的选择 |
| 4.4.4 表达系统的选择 |
| 4.4.5 重组表达载体的快速PCR鉴定 |
| 4.4.6 目的片段与表达载体的连接 |
| 4.4.7 表达产物的Western blot检测 |
| 4.4.8 包涵体的形成与纯化 |
| 4.4.9 本实验所建立的CIEP诊断方法的特点 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）人细小病毒B19XA株VP1蛋白的表达、纯化和免疫原性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 人细小病毒B19XA株VP1基因原核表达载体的构建与鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 人细小病毒B19XA株VP1蛋白的表达与鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 B19病毒VP1蛋白的纯化和体液免疫反应的观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 人细小病毒B19XA株VP1基因的真核表达和鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）人类微小病毒B19感染的最新进展（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 2 发病机制 |
| 3 临床学 |
| 3.1 传染性红斑 |
| 3.2 红细胞再生障碍性贫血危象 |
| 3.3 血管性紫癜 |
| 3.4 肢端淤斑综合征 |
| 3.5 雷诺肢端综合征 |
| 3.6 特发性血小板减少性紫癜 |
| 3.7 急性肝损害 |
| 3.8 急性心肌炎和心肌心包炎 |
| 3.9 关节病 |
| 3.10 系统性红斑狼疮 |
| 3.11 小儿风湿性疾病 |
| 3.12 宫内感染 |
| 3.13 其他疾病 HPV B19还能引起下列疾病: |
| 4 流行病学 |
| 4.1 传染源 |
| 4.2 传播途径 |
| 4.3 人群易患性 |
| 4.4 流行特征 |
| 5 病毒实验室诊断技术 |
| 5.1 病毒基因重组抗原和单克隆抗体的制备 |
| 5.2 免疫电镜 |
| 5.3 酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) |
| 5.3.1 ELISA捕捉法检测IgM抗体 |
| 5.3.2 ELISA检测IgG抗体 |
| 5.3.3 ELISA检测IgA抗体 |
| 5.4 固相放射免疫试验 |
| 5.5 免疫荧光技术 |
| 5.6 核酸扩增技术 |
| 5.6.1 聚合酶链反应 |
| 5.6.2 荧光实时定量聚合酶链反应 |
| 5.6.3 Southern 斑点杂交技术 |
| 6 治 疗 |
| 6.1 抗病毒治疗 |
| 6.2 对症治疗 |
| 6.3 输血 |
| 6.4 免疫调节剂 |
| 7 预 防 |
| 8 结 语 |
（8）羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒的构建及初步评价（论文提纲范文）
| 导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 羊传染性脓疱病毒的研究进展 |
| 1 羊传染性脓疱病毒概况 |
| 2 ORFV 的分子生物学研究现状 |
| 3 ORFV 疫苗研究进展 |
| 综述二 山羊痘病毒载体研究进展 |
| 1 山羊痘病毒概述 |
| 2 山羊痘病毒基因组结构 |
| 3 山羊痘病毒载体研究现状 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 ORFV 的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 羊传染性脓疱病毒 B2L 基因重组山羊痘病毒的构建及生物学特性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 重组山羊痘病毒 rGPV-B2L 毒力及免疫效果的初步评价 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究（论文提纲范文）
| 第一章 引言 |
| 1 流感病毒致病力、宿主范围和种间传播的决定因素 |
| 1.1 流感病毒的复制 |
| 1.2 流感病毒表面蛋白HA和NA对致病力的影响 |
| 1.3 流感病毒在宿主细胞内的复制能力 |
| 1.4 流感病毒与细胞凋亡 |
| 1.5 流感病毒与宿主的免疫反应 |
| 1.6 流感病毒在宿主体内的适应，进化，持续感染和种间传播 |
| 2 禽流感流行现状 |
| 2.1 H5和H7亚型禽流感 |
| 2.2 H9N2亚型禽流感 |
| 3 禽流感疫苗 |
| 3.1 灭活全病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗 |
| 3.3 重组活载体疫苗 |
| 3.4 DNA疫苗 |
| 3.5 标记疫苗 |
| 4 A型流感病毒的反向遗传技术 |
| 4.1 流感病毒反向遗传技术的发展过程 |
| 4.2 流感病毒反向遗传技术的应用 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分析及部分毒株的免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒分离株 |
| 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 1.3 分型、鉴定用血清 |
| 1.4 病毒分离及有限稀释克隆纯化 |
| 1.5 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定 |
| 1.6 病毒的抗原性分析 |
| 1.7 三株H9N2亚型禽流感病毒的鼻腔感染试验和灭活疫苗免疫原性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定结果 |
| 2.2 抗原性分析 |
| 2.3 三株H9N2亚型病毒的感染试验和交叉免疫分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒对小鼠的致病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 27株病毒对小鼠的致病性试验 |
| 1.4 小鼠脏器的病毒滴定 |
| 1.5 8株首次感染试验对小鼠无感染性病毒验证试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠体重变化结果 |
| 2.2 27株H9N2禽流感病毒鼻腔感染BALB／c小鼠脏器病毒分离结果 |
| 2.3 8株病毒对小鼠感染性验证试验 |
| 2.4 27株病毒对小鼠感染性划分 |
| 3 讨论 |
| 第四章 H9N2亚型禽流感病毒进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 遗化演化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 序列测定结果 |
| 2.2 HA基因 |
| 2.3 NA基因 |
| 2.4 PB2基因 |
| 2.5 PB1基因 |
| 2.6 PA基因 |
| 2.7 NP基因 |
| 2.8 M基因 |
| 2.9 NS基因 |
| 2.10 27株H9N2亚型禽流感病毒基因型划分结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于遗传演化分析 |
| 3.2 关于HA基因氨基酸序列分析 |
| 3.3 关于NA基因的氨基酸序列 |
| 第五章 部分H9N2亚型禽流感病毒对金刚烷胺抗药性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 七株H9N2亚型禽流感病毒细胞半数感染量(TCID_(50))的测定 |
| 1.3 七株H9N2亚型禽流感病毒对金刚烷胺类药物1-adamantylamine的敏感性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 组织半数感染量(TCID_(50))测定结果 |
| 2.2 对1-adamantylamine抗药性分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒株 |
| 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 1.3 质粒载体及转染质粒 |
| 1.4 主要试剂和仪器 |
| 1.5 病毒RNA提取、反转录和PCR |
| 1.6 序列测定 |
| 1.7 引物 |
| 1.8 HA和NA转染质粒pBD-MutHA和pBD-NA-5B19的构建 |
| 1.9 分子致弱的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1／PR8-5B19的救获 |
| 1.10 H5N1／PR8-5B19疫苗株的生物学特性 |
| 1.11 一种能够区分H5N1／PR8-5B19标记疫苗免疫血清和非标记疫苗免疫血清或自然感染鸡血清的ELISA检测方法的初步建立 |
| 1.12 H5N1／PR8-5B19疫苗免疫试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 pBD-MutHA质粒构建 |
| 2.2 pBD-NA-5B19质粒构建 |
| 2.3 H5N1／PR8-5B19的救获和病毒鉴定 |
| 2.4 H5N1／PR8-5B19疫苗株的生物学特性 |
| 2.5 多肽ELISA方法的初步建立 |
| 2.6 标记疫苗免疫后HI抗体和5B19表位ELISA抗体的检测 |
| 2.7 标记疫苗免疫保护试验 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 27株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列 |
| 附录2 H5N1／PR8-5B19病毒分子修饰的HA和NA基因 |
| 致谢 |
| 简历 |
四、基因重组B19病毒结构蛋白作为诊断抗原的研究进展（论文参考文献）
- [1]貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重组杆状病毒免疫特性研究[D]. 李艳伍. 南京农业大学, 2012(12)
- [2]广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李云燕. 广西大学, 2020(02)
- [3]人细小病毒B19-XA2株VP1蛋白Bac-to-Bac系统表达及免疫学特性分析[D]. 李小青. 第四军医大学, 2008(01)
- [4]风疹病毒E1结构蛋白在杆状病毒表达系统中的表达和纯化[D]. 赵培蓓. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [5]ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用[D]. 梁冬莹. 东北林业大学, 2007(02)
- [6]人细小病毒B19XA株VP1蛋白的表达、纯化和免疫原性研究[D]. 陈彩平. 第四军医大学, 2004(04)
- [7]人类微小病毒B19感染的最新进展[J]. 邵惠训. 医学综述, 2011(20)
- [8]羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒的构建及初步评价[D]. 张倩. 石河子大学, 2014(03)
- [9]基因重组B19病毒结构蛋白作为诊断抗原的研究进展[J]. 丛培中,谷淑燕. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [10]中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究[D]. 李呈军. 中国农业科学院, 2005(07)