一、Ⅱ型猪链球菌S_2株在兔中免疫原性的研究（论文文献综述）
陈图梅[1]（2021）在《猪链球菌-肠外致病性大肠杆菌二联多价亚单位候选疫苗免疫保护效果的评估》文中指出猪链球菌病是一种重要的人畜共患传染病,感染猪主要引起败血症、脑膜炎、关节炎等疾病。以前,我国猪链球菌以血清型2型最为多发,近些年研究发现猪链球菌9型的感染趋势正在逐渐上升。肠外致病性大肠杆菌（Ex PEC）血清型复杂,能够定殖和感染肠外各组织器官,导致败血症、脑膜炎、肺炎、心内膜炎等。在养猪业猪链球菌病和大肠杆菌病混合感染的情况严重,目前没有商品化的疫苗可以同时用于这两种细菌性疾病的预防。亚单位疫苗具有良好的安全性及免疫原性,具有对多种血清型产生交叉保护等优点,所以本研究在实验室先前的研究基础上开展了二联多价亚单位候选疫苗免疫保护效果的评估。（1）候选蛋白分别免疫对每种菌的保护效果用猪链球菌IF-2、1022蛋白分别免疫以及混合后免疫小鼠,发现蛋白混合后的免疫组要比单个蛋白免疫组产生更高水平的抗体,这些免疫组产生的抗体水平均显着高于对照组（p<0.001）。抗体及其亚类测定结果表明,免疫蛋白可诱导高滴度的Ig G 1和Ig G2a。用5LD50剂量的菌株攻毒小鼠,实验结果表明,IF-2和1022蛋白分别为感染SS2型猪链球菌SC19菌株的小鼠提供80%和60%的保护,而IF-2和1022蛋白则为感染SS9型猪链球菌S29菌株的小鼠提供70%和80%的保护。当将这两种蛋白质混合并用于免疫时,混合后的蛋白分别可以为SC19和S29菌株提供90%和90%的保护率。再者,尝试将大肠杆菌外膜蛋白Omp C、Omo F以及分子伴侣蛋白Groe L蛋白混合免疫小鼠,用5LD50剂量的菌株攻毒小鼠,发现其对感染肠外致病性大肠杆菌PCN033菌株的小鼠提供80%的保护。且经过免疫后小鼠体内的抗体滴度有了极其显着的改变（p<0.001）。（2）候选蛋白混合免疫的保护效果将上述五种蛋白混合后免疫小鼠,观察其对猪链球菌以及猪肠外致病性大肠杆菌的混合免疫效果。结果显示,免疫组和空白对照组相比小鼠产生强烈的体液免疫应答,同时对猪链球菌SS2、SS9和猪肠外致病性大肠杆菌PCN033和E49菌株的感染具有良好的保护作用,可以分别为感染致死剂量的PCN033、E49、SC19、S29菌株的小鼠提供90%、90%、90%和80%的保护。免疫组小鼠的特异性抗体的滴度明显高于对照组小鼠（p<0.001）血清中干扰素（IFN）-γ,IL-2和IL-4的水平显着升高（p<0.001）。组织病理学观察表明,对照组病变程度明显高于免疫组。组织载菌量发现免疫组的组织载菌量和对照组相比显着性降低。
王希玉[2]（2021）在《表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的构建及其免疫效力评价》文中认为猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV）所引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,主要侵害仔猪,病死率高,危害巨大。PED灭活疫苗和弱毒活疫苗的使用,在一定程度控制了PED的流行和传播,但由于灭活疫苗难以提供黏膜免疫,弱毒活疫苗存在毒力返强且易受母源抗体干扰的问题,迫切需要研制新型疫苗来预防和控制PED。减毒沙门菌活疫苗可诱导产生良好的体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫,可作为口服疫苗载体,以此菌为载体表达异源抗原研制疫苗是防控肠道入侵型病毒的理想疫苗设计策略。本研究将筛选合适的沙门菌作为载体,构建aroA和asd双基因缺失的减毒株,表达PEDV毒株的S1片段,为PED的口服疫苗研发奠定基础。1.猪霍乱沙门菌及孔成道夫生物型菌株生物学特性比较研究选择一株猪霍乱沙门菌（Salmonella Choleraesuis）WG分离株、两株猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型（Salmonella Choleraesuis pore Kunzendorf biotype）CZ-C 和 HY-13 分离株和猪霍乱沙门菌C500疫苗株,开展生长曲线、药物敏感性、抗体效价、定植能力和致病力等方面的评估。生长曲线测定结果显示,HY-13、CZ-C和WG的生长速度显着高于C500,HY-13优势更为明显。药物敏感性结果显示,与C500相比,分离株耐药谱更广。用108 CFU剂量的C500和HY-13灌胃接种免疫小鼠,ELISA检测免疫血清中抗体滴度,免疫后14天到达峰值,21天略有下降,HY-13、CZ-C和WG组均显着高于C500组。定植能力检测结果显示,HY-13的定植量高于其他细菌,且在空肠中的定植量最多,其次是盲肠,肝脏最少。小鼠半数致死量（LD50）的测定结果显示,HY-13 的致病力高于其他菌株。通过对生长性能、定植优势等的综合分析,HY-13 株可作为沙门菌减毒疫苗的候选载体菌。2.表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的构建及生物学特性测定首先利用λ-Red同源重组法构建aroA和asd双基因缺失的减毒株HY-1 3ΔaroAΔasd;其次,运用平衡致死系统,将携带asd基因的原核表达载体pYA3334与PEDV截短S1片段重组后电转至HY-13ΔaroAΔasd,构建出重组株HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）。最后,对重组株截短S1蛋白表达水平、生长曲线、致病性、遗传稳定性及体内定植水平等生物学特性进行了测定。PCR及测序结果显示,HY-1 3ΔaroAΔasd与HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）构建成功。Western blot 结果显示,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）成功表达了 PEDV截短S1蛋白。生长曲线结果显示,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）与野生株HY-13均可在不含DAP的LB平板上生长,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）的生长速度略慢于野生株HY-13,但显着快于疫苗株C500。LD50结果显示,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）较野生株HY-13的毒力下降了 100倍左右。遗传稳定性试验结果表明,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）传代50代后仍能够稳定缺失aroA和asd基因且稳定表达截短S1蛋白。体内定植结果显示HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）较野生株HY-13的定植能力有所降低,但仍强于猪霍乱疫苗株C500。3.表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的免疫效力评价将 HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）以 108 CFU 剂量灌胃途径免疫 6 周龄 BALB/c小鼠,对其免疫效力进行初步评价。运用ELISA法测定免疫小鼠血清与小肠冲洗液中的抗体水平变化,结果显示,与PBS免疫组和空载体组HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334）相比,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）组可以显着诱导小鼠体内产生针对PEDV的血清IgG和肠黏膜sIgA特异性抗体水平,并在二次免疫后14天达到峰值。PEDV微中和试验结果进一步显示,血清与小肠冲洗液中的抗体均具有PEDV中和特性;在小鼠血清与小肠冲洗液中,与C500组相比,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）均显着产生针对HY-13和C500菌株的特异性血清IgG和肠黏膜sIgA抗体。脏器组织细胞因子表达量测定结果显示,与PBS组相比,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）能够显着增强肠黏膜及脾脏的IFN-γ和IL-4转录表达水平;沙门菌的攻毒保护试验结果显示,一次免疫后14天腹腔注射100倍LD50的WG或HY-13野生株进行攻击,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）和C500免疫组分别可以针对猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型和猪霍乱沙门菌产生70%、55.6%和40%、55.6%的保护力。综上结果表明,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）可作为同时预防PED和沙门菌病的疫苗候选株。
龚俊[3]（2021）在《猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗的研究》文中提出猪链球菌病是由猪链球菌（Streptococcus suis,SS）引起的细菌性传染病,主要导致猪的败血症、脑膜炎和关节炎,副猪嗜血杆菌病和猪传染性胸膜肺炎是分别由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）和猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的主要的猪呼吸道传染病,这三种疾病给养猪业造成了巨大的损失。本研究将SS的保护性抗原EF和APP的保护性抗原OMP、Apx I、Apx II完整序列或截短序列分别克隆至pET-28a和pCold-sumo载体上,再转化至E.coli BL21（DE3）中构建了重组菌株,经过诱导、表达、纯化获得重组蛋白rEF、rOMP、rApx I和rApx II。再利用本研究室前期构建的pET-28a-sly/BL21、pET-28a-mrp/BL21、pET-28a-oppa/BL21、pET-28a-oppa2/BL21、pET-28a-afua/BL21和pET-22b-cdtb/BL21 6株重组表达菌株,表达、纯化SS的rSLY、rMRP和HPS的rOPPA、rOPPA2、rAfu A、rCdt B。将上述10种重组蛋白等量混匀,再与ISA 201佐剂乳化制成三联苗,使每一剂疫苗中各蛋白的含量为20μg。将血清2型SS（SS2）464株和血清9型SS（SS9）GZ2株按照不同比例稀释后感染C57小鼠;将血清5型HPS（HPS5）HN10株、血清13型HPS（HPS13）ZD12株、血清5型APP（APP5）MD株和血清7型APP（APP7）S-8株按照不同比例稀释后感染BALB/c小鼠,统计上述6个菌株对小鼠的最小致死剂量（MLD）。将20只C57小鼠和40只BALB/c小鼠随机分成2组（每组含10只C57和20只BALB/c）,间隔14d分别皮下免疫2次300μL PBS+ISA 201佐剂和三联苗。二免后14d采集小鼠血清,通过间接ELISA检测各组小鼠的EF、MRP、SLY、OPPA、OPPA2、Cdt B、Afu A、OMP、Apx I和Apx II的抗体水平。首免后28d,将C57小鼠再按照免疫组别平均分为2组,分别以SS2和SS9的MLD攻毒;同理,将BALB/c小鼠再平均分为4组,分别以HPS5、HPS13、APP5和APP7的MLD攻毒。结果显示:SS2和SS9对C57小鼠的MLD为5×107CFU/只,HPS5、HPS13、APP5和APP7对BALB/c小鼠的MLD分别为1.5×108CFU/只、5×107CFU/只、1.5×108CFU/只和7.5×108CFU/只。与免疫前相比,二免后14d实验组小鼠体内EF、SLY、MRP、OPPA、OPPA2、Cdt B、Afu A、OMP、Apx I和Apx II的抗体平显着升高（p<0.0001）,对照组小鼠体内对10种抗原的抗体水平无差异;实验组与对照组二免后抗体水平差异显着（p<0.0001）。攻毒实验中,对照组小鼠在观察期内全部死亡,攻毒SS2、SS9、HPS5、HPS13、APP5和APP7的实验组小鼠存活率分别为100%（5/5）、80%（4/5）、60%（3/5）、80%（4/5）、80%（4/5）、100%（5/5）,对照组和实验组的存活率有显着差异（p<0.05）。结论:该三联苗免疫攻毒保护结果较好,对SS2、SS9、HPS5、HPS13、APP5和APP7毒株攻毒小鼠具有良好的交叉保护性,为进一步研究及应用提供了实验基础。
王超[4]（2020）在《基于锰佐剂的肠炎沙门菌亚单位疫苗的研制与评价》文中研究说明沙门菌病是一种重要的人兽共患细菌病,可以引起畜禽腹泻、流产等,给我国养殖业造成巨大经济损失;同时污染的畜禽产品是人类沙门菌污染的主要原因之一,严重影响动物源性食品安全,是被高度关注的重大公共卫生问题。疫苗接种是用于降低沙门菌污染的重要措施,亚单位疫苗具有安全性好、副作用少等优点;并且在佐剂的辅助下,可以激发更全面的免疫应答。SseB蛋白是沙门菌Ⅲ型分泌系统尖端蛋白,具有较强的免疫原性,在多种沙门菌血清型中具有高度保守性。本研究通过大肠杆菌表达系统对rHis-SseB和rGST-SseB蛋白进行表达;然后以rHis-SseB蛋白作为免疫原,联合新型锰佐剂,以小鼠为动物模型,进行基于SseB蛋白的亚单位候选疫苗的免疫特性分析与免疫效果评价;再以rHis-SseB蛋白和鞭毛蛋白作为免疫原,联合锰佐剂构建多组分亚单位疫苗,以小鼠为动物模型,进行免疫特性分析与免疫效力评价。以期为国家畜禽养殖“减抗替抗”行动提供新型亚单位疫苗候选株储备,提高我国沙门菌防控水平。1肠炎沙门菌SseB蛋白的表达与鉴定以C50041菌株基因组为模板,克隆sseB基因。分别构建重组原核表达质粒pCold-sseB和pGEX-6P-1-sseB,并转化至BL21（DE3）感受态细胞,获得重组表达菌BL21（DE3）（pCold-sseB）和 BL21（DE3）（pGEX-6P-1-sseB）。对 rHis-SseB 和 rGST-SseB 蛋白进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot（anti-His和anti-GST单抗为一抗）鉴定结果表明重组蛋白rHis-SseB和rGST-SseB表达成功。蛋白大量诱导表达后,分别使用His标签和GST标签纯化柱对蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳结果显示纯化获得纯度较高的rHis-SseB和rGST-SseB蛋白,纯度分别为97%和84%。以抗肠炎沙门菌的多抗血清进行Western blot分析,结果显示rHis-SseB和rGST-SseB均具有良好的免疫反应性。以rHis-SseB刺激小鼠巨噬细胞,可以明显诱导IL-1β、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的分泌。以上结果表明本研究获得了具有良好生物活性的rHis-SseB,为沙门菌候选亚单位疫苗的研制提供了重要的生物材料。2肠炎沙门菌SseB候选亚单位疫苗免疫效果的评价以小鼠腹腔巨噬细胞为模型,评价Mn增强rHis-SseB诱导细胞应答的能力,结果显示与单独蛋白刺激组相比,SseB与Mn混合后诱导细胞分泌IL-4、IL-12、IFN-γ的能力明显增强。以BALB/c小鼠为动物模型,将rHis-SseB蛋白与锰佐剂（SseB+Mn）混合后以肌肉注射方式免疫小鼠,同时设立PBS组、rHis-SseB蛋白组、rHis-SseB蛋白与铝佐剂混合免疫组（SseB+Al）作为对照,每只免疫剂量为30μg rHis-SseB,第14天进行加强免疫。在免疫后第12、21、26天对小鼠进行眼眶取血,以rGST-SseB进行包被,检测血清中SseB特异性抗体,结果显示SseB+Mn组中SseB特异性抗体水平在免疫后 12 d（P<0.05）、21 d（P<0.001）、26 d（P<0.001）均显着高于单独 SseB 组,表明Mn可作为佐剂增强rHis-SseB诱导的抗体应答。IgG亚类的检测结果表明,SseB+Mn组可以诱导不同IgG亚类（IgG1、IgG2a）抗体产生。二免后第7天分离小鼠的脾脏淋巴细胞,进行细胞免疫特性测定。SseB+Mn免疫组淋巴细胞的增殖能力高于单独蛋白免疫组（P<0.001）,表明SseB+Mn可诱导一定水平的细胞免疫应答。在免疫后第28 d,以肠炎沙门菌C50041菌株对免疫小鼠进行攻毒,结果显示SseB+Al组和SseB组小鼠全部死亡,而SseB+Mn组免疫保护效力为40%。以上结果表明rHis-SseB蛋白联合锰佐剂使用能诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,并使小鼠获得一定的免疫保护效力。3肠炎沙门菌多组分候选亚单位疫苗免疫效果的评价通过酸裂解法提取肠炎沙门菌C50041菌株的鞭毛蛋白,使用anti-FliC单抗对FliC进行Western blot分析,结果表明该蛋白具有良好的免疫反应性。以小鼠腹腔巨噬细胞为模型,评价Mn增强rHis-SseB和FliC混合诱导细胞应答的能力,结果显示与SseB和FliC混合刺激组相比,SseB和FliC与Mn混合后诱导细胞分泌IL-4、IL-12、IFN-γ的能力明显增强。以BALB/c小鼠为动物模型,将rHis-SseB蛋白和鞭毛蛋白与锰佐剂混合免疫小鼠（SseB+FliC+Mn）,以 PBS 组、SseB+FliC 组、SseB+FliC+A1 组作为对照,每只小鼠免疫剂量为15 μg rHis-SseB蛋白和15 μg FliC,第14天进行加强免疫。在免疫后第12、22天进行眼眶取血,分别以rGST-SseB和鞭毛蛋白进行包被,检测血清中SseB和FliC特异性抗体。结果显示SseB+FliC+Mn组SseB特异性IgG抗体水平在 12 d（P<0.001）、22 d（P<0.05）均显着高于 SseB+FliC 免疫组;SseB+FliC+Mn免疫组FliC特异性IgG抗体水平在12 d（P<0.05）、22 d（P<0.01）均显着高于SseB+FliC免疫组。免疫后第28天使用肠炎沙门菌C50041菌株对免疫小鼠进行攻毒,结果显示SseB+FliC+Mn组免疫保护效力为70%,SseB+FliC+Al组保护效力为40%,SseB+FliC组保护效力为30%。以上结果表明rHis-SseB蛋白和鞭毛蛋白与锰佐剂混合使用能使小鼠获得较高的免疫保护效力,且保护效力显着高于SseB单组分候选亚单位疫苗组。
哈卓[5]（2020）在《PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究》文中研究说明猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）分为4种,猪圆环病毒1型（PCV1）,猪圆环病毒2型（PCV2）,猪圆环病毒3型（PCV3）和猪圆环病毒4型（PCV4）。PCV1对猪无致病性;PCV2是威胁世界养猪业重要病原之一,给养猪业造成了巨大经济损失;PCV3作为一种新发病毒,2016年在美国首次报道,被认为与猪的多种临床疾病相关,呈世界范围内流行;2019年PCV4首次在中国发现,其流行情况和致病性目前还不确定。我国是世界养猪业和猪肉消耗量最大的国家,比例占世界一半以上。而我国猪群PCV2和PCV3感染广泛,且已造成危害。本研究旨在对我国猪群中PCV2和PCV3的分子流行病学进行调查,明确目前PCV2和PCV3在猪群中的感染状况,遗传变异和进化规律,对流行毒株进行分离鉴定和致病性研究。同时,针对当前流行毒株开展PCV2和PCV3二联重组腺病毒疫苗研究,通过动物试验对疫苗的免疫效果和对流行毒株的保护效果进行了评估,为防控PCV2和PCV3的感染奠定基础。本研究具体结果如下:（1）为明确PCV2在我国的分子流行病学特征,针对2016-2019年间,我国9省份206个猪场的3201份猪临床样本进行PCV2检测。PCV2在猪群中总阳性率为39.6%（1269/3201）,不同省份阳性率为18.6%-44.7%;在猪场水平阳性率为84.5%（174/206）,表明PCV2在我国猪群中感染率很高。为进一步研究PCV2的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组和ORF2基因的扩增,共获得了64个PCV2的全基因序列和178个ORF2基因序列。全基因组序列、ORF1和ORF2基因的同源性分别为93.9%-99.9%、96.6%-100%和86.8%-100%;氨基酸比对表明Rep蛋白主要存在12个氨基酸变异位点,Cap蛋白主要存在55个氨基酸变异位点,表明Cap蛋白具有很高的遗传变异特性。重组分析表明,不同的PCV2毒株在猪体内可以发生重组,产生新的毒株。遗传进化分析表明,获得的PCV2毒株序列中,15个为PCV2a基因型,58个为PCV2b基因型,169个为PCV2d基因型,表明目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。（2）通过全球毒株序列分析,确定了PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律和氨基酸变异规律,并分析了导致氨基酸变异可能的原因和影响。PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律表明,世界范围内,2001年前,PCV2a为主要基因型,2001-2011年,PCV2b为主要基因型,2011年后,PCV2d为主要基因型;2006年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2a和PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2001年,PCV2a漂移至PCV2b,2012年,PCV2b漂移至PCV2d。在中国,2002年前,PCV2a为主要基因型,2002-2008年,PCV2b为主要基因型,2008年后,PCV2d为主要基因型;2004年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2002年,PCV2a漂移至PCV2b,2009年,PCV2b漂移至PCV2d。在PCV2毒株的进化过程中,Cap蛋白上14个氨基酸位点发生了明显的变异,发生时间在2007年左右,PCV2商品化疫苗在世界范围内使用时间为2006年,表明疫苗使用和免疫压力可能导致了氨基酸变异。由于2015年前使用的疫苗全部为PCV2a基因型,进一步分析PCV2a、PCV2b和PCV2d基因型的氨基酸组成,发现Cap蛋白氨基酸变异前主要由PCV2a和PCV2b基因型决定,变异后由PCV2d基因型决定,进一步说明疫苗的使用可能导致PCV2在进化过程发生氨基酸变异,而氨基酸变异则导致PCV2d基因型的出现和流行。（3）PCV2的分子流行病学调查结果表明,目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。为进一步确定PCV2的流行株,对PCV2d Cap蛋白氨基酸进行比对,发现PCV2/JL/JL19毒株Cap蛋白序列保守,与其它毒株比较没有氨基酸变异,所以将其确定为PCV2优势流行株。为明确PCV2/JL/JL19流行株的致病性,对病毒进行分离,病毒滴度可达106.0 TCID50/m L。猪体攻毒试验中,临床症状主要表现为食欲下降和背毛粗糙,攻毒后28天体重明显下降;临床剖检主要表现为淋巴结肿大和出血,各组织器官中均可检测到高拷贝数PCV2 DNA,产生明显的病毒血症;组织病理学观察腹股沟淋巴结和肺脏产生明显病理变化,这些结果表明目前PCV2流行毒株对猪体有明显的致病性。（4）为了解PCV3在我国的分子流行病学特征,对2016-2019年间,我国10省份278个猪场的4199份猪临床样本进行PCV3检测。PCV3在猪群中总阳性率为29.4%（1235/4199）,不同省份间阳性率为7.3%-37.3%;在猪场水平阳性率为74.8%（208/278）,表明PCV3在我国猪群中普遍存在。统计学分析表明PCV3可能增加PCV2和PRRSV感染率,并与猪的临床疾病相关。为进一步研究PCV3的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组序列扩增,共获得了70个PCV3全基因序列。同源性分析表明PCV3毒株具有很高的遗传稳定性,与其他圆环病毒有很大区别。通过对NCBI数据库中全部673个PCV3毒株序列分析表明,Cap蛋白主要氨基酸变异位点全部在预测的抗原表位上,并且在PCV3毒株进化过程中发生变异。遗传进化分析表明,PCV3毒株主要分为两个基因型,PCV3a和PCV3b;在PCV3的进化过程中PCV3a逐渐减少,PCV3b逐渐增多。上述结果为理解PCV3的流行,发病机制,进化规律和将来的防控提供理论基础。（5）流行病学调查结果表明,PCV3在猪群中具有很高的阳性率,除了猪之间的传播外,是否还存在其他潜在的传播途径,比如通过蚊等媒介生物传播。为了解PCV3在蚊子中的感染和基因组特征,对黑龙江,吉林和云南省的7个猪场的269份蚊子和80份猪血清样本进行PCV3检测。蚊子中PCV3的总阳性率为32.0%（86/269）,同一猪场的蚊子中PCV3阳性率和猪中PCV3阳性率呈正相关性,表明蚊子可能作为PCV3的传播载体。为了解蚊子中PCV3的起源和基因组特性,从蚊子中获得了6个PCV3全基因组序列,从猪中获得了2个PCV3全基因序列。序列分析表明,同一猪场的蚊子和猪中PCV3同源性为100%,表明蚊子中PCV3起源于猪。遗传进化分析表明,蚊子中PCV3分别属于PCV3a和PCV3b基因型。上述结果表明蚊子可能作为PCV3传播链中潜在的传播媒介。（6）对PCV2疫苗新兽药注册和临床试验分析表明,PCV2基因工程疫苗和以PCV2为基础的多联疫苗是PCV2疫苗的发展趋势。PCV3作为猪新发传染病,与PCV2同为圆环病毒科圆环病毒属成员,与猪的多种临床症状相关,给养猪业带来危害。以分子流行病学研究中获得的PCV2流行株PCV2/JL/JL19和PCV3流行株PCV3/JL/JL32的Cap氨基酸为参考,针对猪物种进行密码子优化,以腺病毒为载体,获得了单独表达PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap;和同时表达PCV2 Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap。经过测序表明,基因正确,Western Blot和IFA鉴定蛋白获得表达,稳定性实验表明3株重组腺病毒具有很好的稳定性,表明重组腺病毒构建成功。（7）小鼠免疫试验表明,重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫后35天,PCV2特异性抗体效价可达1:2700和1:2100;中和抗体分别为1:43和1:52;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.37倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。重组腺病毒r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达1:2100和1:1600;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.3倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。上述结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫小鼠后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答;重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫小鼠后能够同时产生较好的针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答。（8）猪体免疫试验表明,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫后35天,PCV2特异性抗体效价均可达1:1300;中和抗体分别为1:85和1:81;淋巴细胞增殖水平分别为对照组PBS的1.46倍和1.4倍;均能够产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV2流行株PCV2/JL/JL19攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比无明显临床症状,能够减少病毒血症猪数量,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达分别为1:1600和1:1300;淋巴细胞增殖水平均分别为对照组PBS的1.35倍和1.32倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV3组织毒攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比,能够减少PCV3病毒血症,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。这些结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫猪体后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,分别抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果;重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后能够同时产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,同时抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果。
张帆帆[6]（2020）在《PEDV、PDCoV与SADS-CoV共感染IPEC-J2细胞的转录组学及基于TLR3、INSIG1介导的信号通路抗病毒研究》文中指出病毒性腹泻一直是困扰生猪养殖的重要疾病之一,疾病主要引起一周龄以内的仔猪呕吐、水样腹泻和脱水死亡。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是致仔猪死亡的头号杀手,感染率高达60%,死亡率可达100%;猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）为仅次PEDV的猪肠道致病原,其感染率高达30%,死亡率高达50%以上。猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）又名猪肠道阿尔法冠状病毒（porcine enteric alphacoronavirus,PEAV）/猪肠道α冠状病毒（Se A-CoV）,是2017年初新发现的一种新型致病性肠道冠状病毒,临床发病时间比PEDV稍晚2-3天,临床症状也相较于PEDV要轻。中国是生猪养殖大国,年出栏生猪达7亿头,然后却未见对于南方地区PEDV、PDCoV、SADS-CoV流行病学和基因的遗传变异的长期观察,且临床上存在大量PEDV和PDCoV混合感染的病例,其致病机制尚未明晰。为此本研究主要针对以下几个方面进行研究:1、南方地区PEDV、PDCoV和SADS-CoV的流行情况调查及S1基因的遗传变异情况从江西、浙江、福建、广东、湖南五省份采集了2012-2019年间3051份粪便、小肠组织及母乳样品,使用本实验建立的RT-PCR方法对样品中PEDV、PDCoV、SADS-CoV进行流行病学调查,结果表明:PEDV阳性率最高,阳性率为57.06%;其次为PDCoV,阳性率为27.14%;SADS-CoV的阳性率最低,仅为0.23%,且仅福建地区的样品中检测出了SADS-CoV阳性样品的存在。在2012-2019年间,PEDV的阳性率一直维持在较高水平,2013年PEDV的阳性率最高,达62.13%,而2019年的PEDV阳性率最低,为45.31%;PDCoV的阳性率在2018年最高,2012年最低;而SADS-CoV仅在2017年福建采集的68份样品有检出,总阳性率为0.23%。在混合感染的样品中,PEDV和PDCoV混合感染样品数最多,最高可占17.33%;而在PDCoV阳性样品中,PEDV和PDCoV混合感染率最高为70.97%,最低为2014年的样品,为30.57%。挑选11株不同年份PEDV阳性样品进行的S1基因进行核苷酸与氨基酸进化树分析,结果表明:所扩增的PEDV S1基因均属于G IIa分支,证明华中地区主要流行G IIa毒株;且具有A518S、G521D、L522H/Y、S524G、V528I、T550S、S563F、G594S、A605E、L612F、F617L、K630T、E633V和I635V的突变为位点。挑选的8株PDCoV氨基酸进化树分析发现:扩增的PDCoV毒株以及所有中国毒株（AN-2004除外）和泰国毒株（TT＿1115）在N52处均具有氨基酸缺失。扩增的SADS-CoV-CH-NDFJ-2018S1基因与Gen Bank中41株参考株的核苷酸同源性均在97.2%-100%之间,氨基酸同源性在98%-100%;其中与SADS-CoV-CH-FJWT-2018（MH615810）毒株的同源性最低,与SADS-CoV＿GDLX/2019（MK651076）同源性最高。2、PEDV、PDCoV与SADS-CoV感染IPEC-J2细胞的生物学特性研究以IPEC-J2细胞为感染模型,使用PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2细胞,通过数据统计发现,PEDV单一感染IPEC-J2病毒拷贝数比PEDV+PDCoV及PEDV+SADS-CoV共感染中PEDV的拷贝数显着增加,说明共感染抑制/影响PEDV病毒的增殖。在PEDV+PDCoV共感染中PEDV的病毒拷贝数比PEDV+SADS-CoV共感染中PEDV的拷贝数显着降低,说明在共感染中PDCoV比SADS-CoV对PEDV增殖的影响要更为强烈。而PDCoV与PEDV或SADS-CoV共同感染时PDCoV的病毒拷贝数显着高于PDCoV单一感染时拷贝数,类似的现象在SADS-CoV病毒单一及与PEDV或PDCoV共感染中观察到。通过细胞免疫荧光还发现,不同病毒可以感染同一细胞,不存在排斥现象。3、PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染转录组学比较研究通过转录组学分析PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染IPEC-J2细胞后宿主基因差异性表达情况,进一步揭示PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染的病毒致病机制和宿主的抗病毒机制的差异。在与PEDV的共感染与单一感染对比中,PEDV+SADS-CoV共感染在前期比PEDV+PDCoV共感染会引起细胞更加强烈的免疫反应,而PEDV+PDCoV共感染在后期诱导的炎症免疫反应强于PEDV+SADS-CoV;对表达差异基因进行生物信息分析发现,PEDV+SADS-CoV差异基因主要富集在细胞进中的氨基化合物的生物合成进程（amide biosynthetic process）、ATP生物合成进程（ATP biosynthetic process）和ATP代谢进程（ATP metabolic process）均显着升高,而在PEDV+PDCoV差异基因主要富集在固有免疫应答（innate immune response）、固有系统应答（immune system process）和免疫应答（immune response）中。在与PDCoV的共感染与单一感染对比中,PDCoV+SADS-CoV和PDCoV+PEDV共感染均随着感染时长的增加,差异基因数均不断上升;对表达差异基因进行生物信息分析发现,PDCoV+SADS-CoV比PDCoV+PEDV引起的细胞信号通路的变化更为显着,且聚类的通路有所差异。在24h时,PDCoV+SADS-CoV差异基因富集中固有免疫应答（innate immune response）、细胞因子应答（response to cytokine）、肿瘤坏死因子应答（response to tumor necrosis factor）等最显着,而PDCoV+PEDV差异基因富集中免疫系统进程、免疫应答、固有免疫应答等最显着。在与SADS-CoV的共感染与单一感染对比中,SADS-CoV+PDCoV共感染均随着感染时长的增加,差异基因数不断上升,而SADS-CoV+PEDV共感染组在48h时差异基因数有所下降。对表达差异基因进行生物信息分析发现,通过对不同时间点,对比SADS-CoV单一感染组与SADS-CoV和PDCoV共感染组GO富集分析:在6 h和24 h时,均无显着差异性通路富集;在48h时,有281个差异基因显着富集到细胞组分,仅微管细胞骨架（microtubule cytoskeleton）、细胞核（nucleus）、微管形成中心（microtubule organizing center）和中心体（centrosome）通路差异显着。对比SADS-CoV单一感染组与SADS-CoV和PEDV共感染组GO富集分析:在6 h时,有38个富集通路显着差异,其中病毒免疫应答相关通路差异显着,涉及的相关差异基因为RSAD2、MX1、DDX58、MX2、STAT1、OAS1、STAT2、CD40、IRF1、CCL5、ISG20等;在24 h和48 h没有发现显着差异富集通路。我们首次对通过转录组学分析PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染IPEC-J2细胞后宿主基因差异性表达情况,研究结果为深入了解单一感染和共感染对宿主免疫应答机制的改变提供基础。4、TLR3通路对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响TLR3是一种病原的模式识别受体,识别病毒感染产生的双链RNA结构后,通过诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的生成,抑制病毒的复制。在进行转录组富集分析发现TLR3通路在单一感染和共感染组均出现显着上调。本实验在病毒感染前后使用poly（I:C）刺激IPEC-J2细胞发现,病毒感染前12h刺激对病毒复制的抑制效果更为显着;而使用BX795抑制TLR3通路的激活,可以促进病毒的复制。为了进一步确定是由于病毒感染激活TLR3引起宿主的免疫应答反应,使用pCAGGS-TLR3过表达质粒和pCDNA3.1-U6-TLR3干扰质粒分别转染IPEC-J2细胞,发现TLR3的过表达抑制了病毒的复制,并且引起了更加强烈的干扰素的产生,反之则降低了TLR3通路的激活促进了病毒的复制。5、PEDV、SADS-CoV和PDCoV结构蛋白与INSIG1相互作用机制在病毒感染宿主细胞的过程中,除了利用病毒自身的蛋白在一定程度上抑制宿主的免疫应答,还能在病毒感染期间调节固醇的合成作为促进脂质筏中病毒复制和病毒出芽的策略。胰岛素诱导基因（Insulin-induced genes,INSIGs）是近年来新发现的调控细胞固醇类物质合成与代谢的主要因子,病毒依靠其细胞宿主为成功复制提供能量和组成元件。为了探究PEDV、PDCoV、SADS-CoV影响胆固醇代谢机制,本实验利用病毒蛋白的过表达重组质粒转染IPEC-J2细胞,研究INSIG1与PEDV、PDCoV、SADS-CoV之间的相互关系。通过实验发现,INSIG1 mRNA水平和蛋白水平在PDCoV感染后期出现显着下调,而PEDV、SADS-CoV则出现显着上调,这促使我们对其感染机制的不同做出更深入研究。在本实验中,INSIG1过表达可以降低腹泻相关病毒的病毒拷贝数;INSIG1敲低可以显着促进病毒的表达。通过共感染的研究发现,与PDCoV的可以在一定程度上促进PEDV和SADS-CoV的增殖。因此,PEDV、PDCoV、SADS-CoV产生的蛋白可能会对INSIG1基因产生抑制作用。过表达三种病毒的结构蛋白和非结构蛋白的研究发现,病毒S蛋白可以显着抑制INSIG1的表达,而其他非结构基因ORF3、NS3、NS6、NS7、NS7a、NS7b可在一定程度上引起INSIG1的上调,存在一定的中和调节作用。这与病毒感染前期,INSIG1出现一定程度的上调有一定关系。为了进一步了解在感染的后期PEDV、SADS-CoV和PDCoV感染的IPEC-J2细胞INSIG1出现显着差异的原因,使用不同浓度的葡糖糖培养基培养三种病毒发现,INSIG1基因的表达水平的变化,依赖于葡糖糖浓度的影响。通过测定胆固醇代谢相关的INSIG1、AMFR、SCAP、SREBF1、INSIG2、DHCR24、LSS、MSMO1、OSBPL8变化水平发现,PDCoV感染组胆固醇合成相关的INSIG1、AMFR、SCAP、SREBF1出现显着下调,氧化固醇结合蛋白样蛋白8（Oxysterol Binding Protein Like Protein,OSBPL8）则显着上调。该研究为PEDV、PDCoV和SADS-CoV的相互作用及病毒和胆固醇代谢建立了新的联系,为将来研究PEDV、PDCoV和SADS-CoV共感染机制提供新的依据。
魏珍珍[7]（2020）在《利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白》文中提出“古典猪瘟”（Classical swine fever,CSF）,也被称为猪瘟（Swine fever）,是一种猪之间的高度接触性传染病,对养猪业是一个非常大的威胁。近几年来,该病不仅发病率明显增高,而且流行趋势和流行特点也越发复杂,其持续感染的情况在全世界普遍存在,这使得防控猪瘟的爆发遇到了新的瓶颈期。现有疫苗的预防效果有明显减弱的趋势,如传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒（减毒）猪瘟疫苗存在免疫保护期短,毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决这些问题。本研究选取具有强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2作为新型猪瘟疫苗的研究选材。随着交叉学科的发展,生物学与纳米材料技术的交叉渗透正日益增强,其中铁蛋白（Ferritin）自组装纳米颗粒技术引起了人们的关注。铁蛋白可自发组装形成均一、稳定的具有良好生物相容性的蛋白纳米颗粒,也因其独特的24亚基的空间结构,可成为理想的抗原呈递的多聚体纳米颗粒载体。大肠杆菌细胞E.coli（Escherichia coli,E.coli）的p ET表达系统是最常用来表达外源蛋白的,其具有清晰的遗传背景、生产成本低廉、繁殖速度快、表达产物易纯化、可高效表达外源蛋白及应用范围广等特点,但是因为是原核表达系统,所以会缺乏复杂的磷酸化、糖基化以及形成复杂二硫键等的翻译后修饰过程,对某些外源蛋白的正确折叠以及生物活性存在一定影响。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将该基因克隆到p ET28a原核表达载体中,转化到E.coli BL21（DE3）中进行诱导条件的探索及其高效表达,将表达的融合蛋白进行Western-blotting验证、镍柱纯化、质谱及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到p ET-28a载体上,0.15%乳糖诱导6 h为融合蛋白表达的最优条件,Western-blotting与质谱图均显示融合蛋白的大小约51 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在E.coli中大量表达,电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm也与理论值相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在大肠杆菌中得到高效表达。将大肠杆菌中表达的融合蛋白E2-Fe经纯化后制样腹腔注射小鼠,两次免疫后,其可诱导机体产生特异性抗体,效价可达1:6400,表明E2-Fe融合蛋白具有良好的免疫原性。杆状病毒-昆虫表达系统是重组蛋白生产的普遍选择。昆虫细胞中的蛋白表达包含翻译后修饰过程,此系统生产的蛋白质复合物以及高蛋白质产量是该真核表达系统的有利特征。后期随着研究的深入与生物技术的不断发展,杆状病毒开始在表面展示系统、基因治疗、疫苗研发等方面应用。在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达外源蛋白时,其糖基化修饰位点是一致的,但两者在修饰时所选用的寡糖种类却不尽相同。相对于哺乳动物细胞,昆虫细胞中相关的糖链加工酶表达量不足或者缺乏,在糖基修饰加工结束后无法合成复合型唾液酸结构,而是终止于寡甘露糖结构。这种寡糖修饰差异导致在昆虫细胞中表达的亚单位疫苗在理论上是不利于生产的,但是不完全加工的N-糖链修饰反而会增强禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）病毒样粒子与免疫细胞的亲和力。因此本研究也选择杆状病毒-昆虫表达系统来融合表达目的蛋白以期研制新型猪瘟疫苗。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将融合基因克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多克隆位点中,获得重组载体p VL1393-E2-Fe,将重组转移载体p VL1393-E2-Fe与失活拯救型家蚕杆状病毒（re Bm Bac）共转染家蚕Bm5细胞,获得重组病毒,收集病毒液并感染五龄起家蚕,待家蚕有明显杆状病毒发病迹象后收集蚕血淋巴,随后进行Western-blotting、电镜观察验证。结果显示,重组转移载体p VL1393-E2-Fe测序结果正确,融合基因E2-Fe已成功克隆到p VL1393,且与re Bm Bac共转染家蚕Bm5细胞后获得有感染活性的重组杆状病毒re Bm Bac-E2-Fe;蚕血的Western-blotting图显示融合蛋白的大小约46 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在家蚕中表达,而后通过电镜观察到大量直径约为20 nm且分布较为均匀纳米颗粒,也与理论相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在家蚕中得到了高效表达。将含有E2-Fe融合蛋白的蚕血淋巴制样后腹腔注射小鼠,经两次免疫后,可诱导机体产生高滴度的特异性抗体,其效价可高至1:25600,即本研究所得E2-Fe融合蛋白具有较好的免疫原性。以上研究结果均说明融合蛋白在大肠杆菌及家蚕中都可进行高效表达,获得数量可观的纳米颗粒抗原,这为研究新的猪瘟疫苗拓宽了思路。
卞晓萍[8]（2020）在《减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌蛋白抗原的构建和评估》文中提出猪霍乱沙门菌（Salmonella enterica serovar Choleraesuis,S.Choleraesuis）是一种非伤寒沙门菌,是诱发仔猪副伤寒的主要病原体,给中国的养猪业造成了巨大的经济损失。中国预防S.Choleraesuis最有效的疫苗是C500,C500是通过化学诱变获得的一株遗传稳定、免疫性较好的弱毒株。虽然C500弱毒活疫苗使用以来,我国的仔猪副伤寒得到有效控制,但是该弱毒株仍有较高的残余毒力,且遗传背景不清楚,因此需要对C500进行优化,以获得更安全的减毒活疫苗。通过对C500株测序发现,C500有多个基因缺失或失活,包括asr、ydgF、ydgD、ydgE、rpoS和ptsG;对这些基因进行分析及动物实验发现,rpoS基因的失活是C500主要的减毒方式,这为开发更加安全的猪霍乱疫苗提供了研究基础。本文以C500疫苗株为背景菌株,回复其rpoS基因的活性,使其具备像野生株侵袭细胞的能力;然后再以回复了rpoS基因活性的减毒株为背景株,分别缺失crp、fur、phop、aroA等基因,再从这四株重组减毒株中筛选一株免疫原性较好,副作用小的疫苗株。将该疫苗株作为载体,用于递呈猪链球菌（Streptococcus suis,SS）的蛋白抗原,达到既能预防猪霍乱沙门菌病,又能预防猪链球菌病的目的。1.猪霍乱沙门菌重组减毒株的构建目的:构建免疫效果好,同时副作用小的重组猪霍乱沙门菌疫苗株。方法:首先以猪霍乱沙门菌疫苗株C500为亲本株,通过自杀质粒pRE112介导的同源重组技术,先回复rpoS基因,使其具备像野生型菌株侵入机体并定植体内的能力。通过对C500的全基因组序列分析,我们发现rpoS基因并未完全突变,而是保留了该基因起始的103bp。因此在构建回复rpoS基因的自杀质粒时,我们先以野生型猪霍乱沙门菌C3545为模板,扩增完整的993bp rpoS基因;然后再以C500基因为模板扩增该基因上游的293bp同源臂基因,将二者融合作为回复该基因的上游同源臂。下游同源臂则选取rpoS基因下游350bp序列,最后将上下游同源臂融合,从而构建自杀质粒。在回复rpoS基因突变株的基础上,同样应用自杀质粒介导的同源重组技术,分别引入crp,fur,phop以及aroA等突变。结论:应用自杀质粒介导的同源重组方法成功回复了rpoS基因,并构建了C5001、C5002、C5003、C5004四个重组减毒株。2.突变株生物学特性的研究目的:将本研究构建的猪霍乱沙门菌重组减毒株C5001、C5002、C5003、C5004与疫苗株C500进行多方面的比较,从而筛选出一株在入侵动物机体时能具备像野生型菌株定居宿主淋巴组织的能力,以保持高度的免疫原性,同时副作用较小的疫苗株。方法:首先检测各减毒株在LB液体培养基中的生长曲线,然后检测各减毒株在半固体培养基中的运动型,检测减毒株在小鼠体内的定植以及对小鼠的免疫保护效果。结论:通过对各减毒株的比较,最终筛选出较优疫苗株C5001。3.减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌STK、GDH、ccpA蛋白的构建及其免疫原性初探目的:构建C5001载体,然后分别递呈猪链球菌的STK,GDH,ccpA等蛋白抗原,并初步评估二联苗的免疫原性。方法:应用自杀质粒介导的同源重组技术,缺失C5001的asd基因,从而构建平衡致死系统,用于递呈STK,GDH,ccpA等蛋白抗原。将stk、gdh、ccpA基因分别通过酶切连接的方法与表达质粒pYA3493连接,构建pYA3493-stk、pYA3493-gdh、pYA3493-ccpA表达质粒。将各表达质粒分别转入载体C5001,然后检测重组株对于小鼠的保护率。结论:成功构建了重组疫苗株,将疫苗株免疫小鼠,然后用猪链球菌SC19毒株攻毒,小鼠在24小时内全部死亡。
李俊琴[9]（2020）在《藏羚羊粪便和高原鼠兔肠内容物可培养菌群结构与新种发现》文中认为目的:藏羚羊和高原鼠兔是青藏高原的特有动物,生活在寒冷、低氧和高海拔地区,携带的微生物多是未知的。本课题旨在系统分析藏羚羊粪便和鼠兔肠内容物的可培养菌群,分离疑似新种,发现新的细菌,并探讨其可能的生物学意义。方法:1.在28℃和37℃两种温度下,普通和5%CO2气体环境下,采用脑心浸液含羊血培养基、TSA培养基、NA培养基等,根据菌落形态的多样性进行可培养菌群的分离培养与纯化。提取细菌分离株的基因组核酸,PCR扩增和Sanger测序获得16S rRNA基因序列。通过GenBank和EzTaxon数据库在线比对获得16S rRNA基因序列与已知菌种的相似性,完成菌株的初步鉴定。2.对鉴定结果为疑似新种的菌株,采用革兰氏染色、透射电镜、孔雀蓝染色、动力实验等进行细菌基本特征检测,基于16S rRNA和基因组序列进行系统进化树分析,采用糖发酵、酶活性、药敏实验等检测菌株的生理生化特征,采用反相高压液相色谱法、二维薄层色谱法、HITACHI L-8900高速氨基酸分析仪等检测菌株的菌体成分,采用基因注释和基因组杂交完成基因组分析。综合分析菌株表型、基因型和生化特征,确定菌株的分类学位置,并完成新种的命名和模式菌株的保藏工作。对分离的已知菌,进行多样性和医学意义分析。结果:1.本课题采用2种相同的培养条件,从鼠兔肠内容物成功鉴定到525株菌,隶属于3个细菌门、6个细菌纲、12个细菌目、20个细菌科、23个属、52个种;从藏羚羊粪便中,成功鉴定到734株菌,隶属于3个细菌门、4个细菌纲、9个细菌目、20个细菌科、28个属、73个种。采用22种培养条件,从青藏高原藏羚羊粪便中成功鉴定1977株菌,分布于4个细菌门、7个细菌纲、15个细菌目、30个细菌科、44个属、123个种。报道从临床患者中分离到的条件致病菌有23个种,包括中华不动杆菌、约翰逊放线菌、圆形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、脂黄素棒杆菌、海迪茨氏菌、Dietzia natronolimnaea、杜兰肠球菌、粪肠球菌、孟氏肠球菌、鹑鸡肠球菌、玫瑰考克氏菌、骚动厄氏菌、栖稻假单胞菌、科尼葡萄球菌、马胃葡萄球菌、华氏葡萄球菌、人葡萄球菌新霉素败血症亚种。从藏羚羊粪便中分离获得的优势种为柠檬节杆菌、木聚糖芽孢杆菌、屎肠球菌。2.从藏羚羊粪便中分离鉴定细菌新种7个,分别为菌株449T、194 T、2129 T、2251T、2183T、2184T、592T。经鉴定:（1）菌株449T为栖霉菌属的新种,命名为朱既明栖霉菌（Mycetocola zhujimingii）,是一种以anteiso-C15:0为主要脂肪酸,以MK-10和MK-11为主要呼吸醌,以二磷脂酰甘油和磷脂酰甘油为主要极性脂,以赖氨酸为诊断性氨基酸,与M.zhadangensis进化关系较近;（2）菌株194T为盐地杆菌属的新种,命名为洪涛盐地杆菌（Salinibacterium hongtaonis）,对NaCl呈高耐受性,以anteiso-C15:0和anteiso-C17:0为主要脂肪酸,以赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸为细胞壁主要氨基酸,以MK-11和MK-10为主要呼吸醌,以二磷脂酰甘油和磷脂酰甘油为主要极性脂,不能发酵D-甘露糖,且萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性阴性;（3）菌株2129T命名为李兰娟放线菌（Actinomyces lilanjuaniae）,以C18:1ω9c和C16:0为主要脂肪酸,以二磷脂酰甘油、糖脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇甘露糖苷和磷酸糖脂为主要极性脂,可以发酵D-己糖醇和D-木糖,但是不能发酵D-甘露糖和D-蜜二糖、酯酶（C4）和脯氨酸芳酰胺酶活性阴性,与A.dentalis和A.slackii进化关系较近;（4）菌株2251T命名为廖万清副球菌（Paracoccus liaowanqingii）,以C18:1ω7c为主要脂肪酸,以泛醌10为主要呼吸醌,以磷脂酰乙醇胺、二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂、糖脂为主要极性脂,以meso-2,6-二氨基庚二酸、丙氨酸和谷氨酸为细胞壁肽聚糖氨基酸,分类学地位与P.gahaiensis进化关系较近;（5）菌株2183T和2184T分别命名为俞东征棒杆菌（Corynebacterium yudongzhengii）和梁国栋棒杆菌（Corynebacterium liangguodongii）,是两个硝酸盐还原反应阴性、α-胰凝乳蛋白酶和过氧化氢酶活性阳性、D-果糖和5-钾酮葡萄糖酸酵解阳性、D-乳糖酵解阴性的菌种,两株菌均以二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇甘露糖苷为主要极性脂,以MK-8（H2）和MK-9（H2）为主要呼吸醌,肽聚糖中含有meso-2,6-二氨基庚二酸。进化关系上,俞东征棒杆菌与C.doosanense和C.tapiri近,梁国栋棒杆菌与C.lipophiloflavum和C.mycetoides近;（6）菌株592T命名为陈薇气微菌（Aeromicrobium chenweiae）,菌株可以发酵L-鼠李糖、D-木糖和D-纤维二糖,但无法还原硝酸盐,主要脂肪酸为C18:1ω9c和C18:010-methyl,主要极性脂为二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇,主要呼吸醌为MK-9（H4）和MK-8（H4）,且细胞壁肽聚糖含有LL-二氨基庚二酸。3.从高原鼠兔肠内容物中分离鉴定细菌新种2个,分别为MF30-AT和MF47 T。经鉴定:（1）菌株MF-30AT命名为巴德年壤霉菌（Agromyces badenianii）,为需氧、革兰氏阳性菌,菌株在28℃、有氧、pH 7.0的TSA培养基上生长最佳,不能发酵熊果苷、D-果糖、D-蔗糖、糖原、水杨素和淀粉,β-葡萄糖苷酶活性为阴性;（2）菌株MF-30AT与陈薇气微菌不属于同一个种,被命名为严杰气微菌（Aeromicrobium yanjiei）,菌株可以发酵L-鼠李糖、D-木糖和D-纤维二糖,但无法还原硝酸盐,主要脂肪酸为C18:1ω9c和C18:08:0 10-methyl,主要极性脂为二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇,主要呼吸醌为MK-9（H4）和MK-8（H4）,且细胞壁肽聚糖含有LL-二氨基庚二酸。结论:1.采用2种相同的培养条件,从鼠兔肠内容物成功鉴定到525株菌,隶属于3个细菌门、6个细菌纲、12个细菌目、20个细菌科、23个属、52个种;从藏羚羊粪便中,成功鉴定到734株菌,隶属于3个细菌门、4个细菌纲、9个细菌目、20个细菌科、28个属、73个种。采用22种培养条件,从藏羚羊粪便中成功分离到1977株菌,鉴定为4个门、7个纲、15个目、30个科、44个属和123个种,报道从临床患者样本中分离到的细菌种有23个。2我们发现和命名了九个细菌新种,分别是朱既明栖霉菌（Mycetocola zhujimingii）、洪涛盐地杆菌（Salinibacterium hongtaonis）、李兰娟放线菌（Actinomyces lilanjuaniae）、廖万清副球菌（Paracoccus liaowanqingii）、巴德年壤霉菌（Agromyces badenianii）、俞东征棒杆菌（Corynebacterium yudongzhengii）、梁国栋棒杆菌（Corynebacterium liangguodongii）、陈薇气微菌（Aeromicrobium chenweiae）和严杰气微菌（Aeromicrobium yanjiei）。已经发表新种5个,正在投稿新种4个。
龚婷[10]（2019）在《口蹄疫病毒O型突变株的构建及其生物学特性分析》文中指出口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引发的一种侵害猪、牛、羊等偶蹄动物的重大烈性传染病。该病的暴发和流行严重危害家畜的生产力和畜产品质量,影响发病地区的经济发展、国际贸易和社会稳定。因此,该病一直是100多年来全世界兽医学家研究的焦点。FMDV是小RNA病毒,极易发生变异,尤其是其结构蛋白VP1。VP1蛋白氨基酸的变化常会改变FMDV的稳定性、致病性、复制特性和免疫原性等,因此分析FMDV VP1氨基酸的变化,对FMD新型疫苗的研制具有重要的指导意义。本研究以FMDV O型Cathay和ME-SA/Pan-Asia谱系不同时期疫苗株为参照,比对不同谱系毒株、不同时期经典疫苗株和我国当前流行株（SEA-Mya98谱系）VP1蛋白氨基酸序列,选择参照毒株保守或相对保守的几个氨基酸,采用反向遗传学操作技术,替换嵌合感染性cDNA中Mya/98 VP1的氨基酸,研究这些氨基酸对FMDV抗原性、稳定性、复制特性和免疫原性的影响。1.在已构建含当前流行毒株VP1（SEA-Mya98谱系）基因嵌合全长克隆中分别引入了3个（VP1:H28Q+S47Q+V194I）、6个（VP1:H28Q+S47Q+S58A+V194I+A198Q+S212L）和7个（VP1:H28Q+S47Q+S58A+V194I+S197D+A198Q+S212L）氨基酸的替换,构建了三个重组全长质粒pQFA、pQFE和pQFC。线化的重组质粒转染BSR/T7细胞,获得的基因工程病毒经RT-PCR、核苷酸序列测定、间接免疫荧光和电镜观察,结果说明成功拯救出三株含目标突变氨基酸的FMDV,表明在嵌合F MDV VP1结构蛋白中引入3、6和7个氨基酸的替换并未影响活的FMDV的拯救。2.三株基因工程病毒与亲本病毒具有相似的噬斑大小和生长动力学,在37℃处理3h、6h、9h和42℃处理0.5h、1h后的热稳定性明显低于亲本病毒（P<0.05）,但对乳鼠的致病力(LD50)可提高4倍以上。说明在嵌合FMDV VP1结构蛋白中引入3、6和7个氨基酸的替换并未明显影响基因工程病毒的噬斑表型和复制能力,但热稳定性在一定程度上有所下降,并明显增强了对乳鼠的致病力。3.将对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV O/HN-7/2010（SEA-Mya98）、O/HK/CHA/99（ME-SA/PanAsia）、O/GX/CHA/2009（Cathay）的细胞适应毒分别在乳鼠上连续传4代,获得了对C57BL/6小鼠敏感的FMDV O/GX/CHA/2009MF4和O/HN-7/2010MF4株,它们对C57BL/6小鼠的LD50分别为104.2和104.5。将乳鼠上传代4次仍对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV O/HK/CHA/99MF4经C57BL/6小鼠（1次）和胎猪肾细胞（FPK）（2次）循环适应传代9轮,在传至第5轮时,该病毒能够致C57BL/6小鼠发病和死亡,且随着传代次数的增加对C57BL/6小鼠的致病力增强,其中第5轮和第9轮传代病毒对C57BL/6小鼠的LD50分别为102.8和105.1。这些对C57BL/6小鼠敏感FMDV株的获得为未来FMDV致病性以及以C57BL/6小鼠为实验模型的效力评估奠定了基础。4.三株基因工程病毒（r-FMDV/MyVP1-A、r-FMDV/MyVP1-C、r-FMDV/MyVP1-E）和亲本病毒（r-FMDV/MyVP1）大量增殖,制备FMD灭活疫苗,并用不同剂量（1μg和2μg146S抗原）分别免疫豚鼠,14d、21d、28d和35d后收集血清,测定中和抗体。结果表明:不同剂量抗原免疫豚鼠诱导产生的中和抗体水平,均随免疫时间的延长而逐渐升高,在免疫28d或35d时抗体水平达到最高。基因工程病毒（r-FMDV/MyVP1-A、r-FMDV/MyVP1-C）疫苗不同剂量免疫豚鼠后,中和对应病毒的抗体滴度均明显高于亲本病毒免疫豚鼠产生的中和抗体滴度（P<0.05）。三株基因工程病毒不同剂量免疫豚鼠后中和亲本病毒的抗体滴毒均明显低于亲本病毒免疫豚鼠中和自身产生的抗体滴毒（P<0.05）。用四种灭活疫苗免疫豚鼠制备的血清分别中和FMDV O/HN-7/2010、O/HK/CHA/99,O/GX/CHA/2009,并计算制疫苗病毒与三个谱系流行毒株的抗原匹配性（r值）,结果表明相比亲本病毒,基因工程病毒与流行毒株的抗原匹配性降低了。综上结果表明,在嵌合FMDV VP1结构蛋白中引入3、6和7个氨基酸的替换疏远了基因工程FMDV与亲本病毒的抗原关系,变窄了与流行毒株的抗原谱,但突变3、7个氨基酸后可明显增强其免疫原性。5、四种FMD灭活疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,28d后用100 LD50的FMDV三个谱系流行毒株攻击,结果表明四种疫苗免疫的C57BL/6小鼠均能有效抵抗三个谱系FMDV流行株的攻击,获得100%的保护,这一结果与免疫豚鼠血清测得的抗原关系结果不一致,推测可能与高剂量抗原（0.8μg）免疫小鼠所致,这与先前报道的高剂量抗原免疫导致异源攻毒获完全保护的结果一致。攻毒前的小鼠血清抗体检测结果也表明所有免疫小鼠均获得较高的保护性特异性抗体水平（均大于1:32）,亲本病毒疫苗免疫小鼠诱导产生的抗体水平均高于基因工程病毒疫苗免疫小鼠诱导产生的抗体水平,这与免疫豚鼠产生的中和抗体结果一致。本研究首次报道了在FMDV VP1结构蛋白引入多个氨基酸的（6个和7个）替换对FMDV稳定性、致病性、复制特性和免疫原性等的影响,为未来通过修饰改造研制优良FMD疫苗候选毒株提供了理论依据。
二、Ⅱ型猪链球菌S_2株在兔中免疫原性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Ⅱ型猪链球菌S_2株在兔中免疫原性的研究（论文提纲范文）
（1）猪链球菌-肠外致病性大肠杆菌二联多价亚单位候选疫苗免疫保护效果的评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表（Abbreviation） |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪链球菌病的研究进展 |
| 1.1.1 前言 |
| 1.1.2 病原学及流行病学 |
| 1.1.3 猪链球菌病的临床症状 |
| 1.1.4 猪链球菌的毒力相关因子 |
| 1.1.5 猪链球菌致病机理 |
| 1.1.6 猪链球菌疫苗的研究进展 |
| 1.2 肠外致病性大肠杆菌病的研究进展 |
| 1.2.1 前言 |
| 1.2.2 病原学及流行病学 |
| 1.2.3 肠外致病性大肠杆菌病的临床症状 |
| 1.2.4 肠外致病性大肠杆菌的毒力相关因子 |
| 1.2.5 肠外致病性大肠杆菌致病机制 |
| 1.2.6 肠外致病性大肠杆菌疫苗研究进展 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 试验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 工具酶和主要试剂 |
| 3.1.3 培养基和缓冲液 |
| 3.1.4 琼脂糖凝胶电脉缓冲液 |
| 3.1.5 蛋白表达和提取相关试剂 |
| 3.1.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂 |
| 3.1.7 ELISA相关试剂 |
| 3.1.8 主要仪器 |
| 3.1.9 试验动物 |
| 3.1.10 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 融合蛋白的诱导表达和纯化 |
| 3.2.2 动物免疫试验 |
| 3.2.3 免疫后小鼠体内抗体检测 |
| 3.2.4 免疫后小鼠体内细胞因子的测定 |
| 3.2.5 组织载菌量试验 |
| 3.2.6 淋巴细胞增殖试验 |
| 3.2.7 免疫小鼠攻毒后组织病理学变化 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 猪链球菌候选亚单位疫苗实验结果与分析 |
| 4.1.1 蛋白的表达和纯化 |
| 4.1.2 免疫小鼠后血清中抗体滴度的检测 |
| 4.1.3 免疫小鼠后血清中细胞因子的检测 |
| 4.1.4 细菌在小鼠体内半数致死量的测定 |
| 4.1.5 小鼠攻毒保护试验 |
| 4.1.6 淋巴细胞增殖试验 |
| 4.1.7 小鼠攻毒后组织病理学变化 |
| 4.2 猪源肠外致病性大肠杆菌候选亚单位疫苗实验结果与分析 |
| 4.2.1 蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.2 免疫小鼠后血清中抗体滴度的检测 |
| 4.2.3 免疫小鼠后血清中细胞因子的检测 |
| 4.2.4 细菌在小鼠体内LD_(50)的测定 |
| 4.2.5 小鼠的攻毒保护试验 |
| 4.3 猪链球菌-肠外致病性大肠杆菌二联亚单位疫苗实验结果分析 |
| 4.3.1 免疫小鼠后血清中抗体滴度的检测 |
| 4.3.2 免疫小鼠后血清中细胞因子的检测 |
| 4.3.3 细菌在小鼠体内LD_(50)的测定 |
| 4.3.4 小鼠的攻毒保护试验 |
| 4.3.5 小鼠攻毒后组织载菌量变化 |
| 4.3.6 小鼠攻毒后组织病理学变化 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
（2）表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的构建及其免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 猪流行性腹泻病毒及沙门菌减毒活载体疫苗研究进展 |
| 1 PEDV研究概述 |
| 2. PEDV疫苗研究进展 |
| 3. 减毒沙门菌活载体疫苗研究进展及构建策略 |
| 4. 研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 猪霍乱沙门菌及孔成道夫生物型菌株生物学特性比较研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的构建及生物学特性测定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的免疫效力评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪链球菌病 |
| 1.1.1 猪链球菌病概述 |
| 1.1.2 猪链球菌病的病原学与流行病学 |
| 1.1.3 猪链球菌病的临床症状及病理变化 |
| 1.1.4 猪链球菌病的毒力相关因子 |
| 1.1.5 猪链球菌病疫苗的研究进展 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌病 |
| 1.2.1 副猪嗜血杆菌病概述 |
| 1.2.2 副猪嗜血杆菌的病原学与流行病学 |
| 1.2.3 副猪嗜血杆菌病的临床症状及病理变化 |
| 1.2.4 副猪嗜血杆菌的毒力相关因子 |
| 1.2.5 副猪嗜血杆菌病疫苗的研究进展 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.3.1 猪传染性胸膜肺炎概述 |
| 1.3.2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的病原学与流行病学 |
| 1.3.3 猪传染性胸膜肺炎的临床症状及病理变化 |
| 1.3.4 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子 |
| 1.3.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌疫苗的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 重组表达菌株的构建及目的蛋白的纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因的获取和克隆 |
| 2.2.2 pET-28a-ef、pET-28a-omp、pCold-sumo-apxⅠ和 pCold-sumo-apxⅡ质粒的构建 |
| 2.2.3 rEF、rOMP、rApx I和 rApx II的表达和纯化 |
| 2.2.4 rSLY、rMRP、rAfuA、rOPPA、rOPPA2和rCdtB的表达和纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 四个重组质粒的鉴定结果 |
| 2.3.2 重组蛋白rEF、rOMP、rApxⅠ和rApxⅡ的表达、纯化结果 |
| 2.3.3 重组蛋白rSLY、rMRP、rAfuA、rCdtB、rOPPA和rOPPA2的表达、纯化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小鼠感染实验及各毒株MLD的确定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株和动物 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株的复苏及培养 |
| 3.2.2 小鼠感染实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 各血清型毒株对小鼠的最小致死量(MLD)的统计结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小鼠免疫及攻毒试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株和动物 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 疫苗的乳化 |
| 4.2.2 小鼠免疫试验 |
| 4.2.3 小鼠血清中抗体水平检测 |
| 4.2.4 小鼠攻毒试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 疫苗的乳化 |
| 4.3.2 小鼠血清中各抗体间接ELISA检测结果 |
| 4.3.3 免疫后攻毒试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）基于锰佐剂的肠炎沙门菌亚单位疫苗的研制与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 沙门菌亚单位疫苗的研究进展 |
| 1 沙门菌减毒活疫苗 |
| 2 沙门菌灭活疫苗 |
| 3 沙门菌亚单位疫苗 |
| 3.1 鞭毛蛋白 |
| 3.2 外膜蛋白 |
| 3.3 T3SS效应蛋白及结构蛋白 |
| 3.4 多组分亚单位疫苗 |
| 4 佐剂 |
| 5 小结 |
| 第一章 肠炎沙门菌SseB蛋白的表达与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株与试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 沙门菌sseB基因的序列分析 |
| 2.2 重组原核表达质粒pCold-sseB和pGEX-6P-1-sseB的构建及鉴定 |
| 2.3 重组蛋白rHis-SseB和rGST-SseB的表达与纯化 |
| 2.4 重组蛋白rHis-SseB和rGST-SseB的Western blot鉴定 |
| 2.5 重组蛋白rHis-SseB和rGST-SseB的免疫反应性分析 |
| 2.6 重组蛋白rHis-SseB诱导细胞应答能力的测定 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 沙门菌sseB基因序列分析 |
| 3.2 目的基因sseB的克隆及载体pCold和pGEX-6P-1的酶切 |
| 3.3 重组菌BL21(DE3)(pCold-sseB)和BL21(DE3)(pGEX-6P-1-sseB)的构建及鉴定 |
| 3.4 重组蛋白rHis-SseB和rGST-SseB的鉴定 |
| 3.5 蛋白免疫反应性分析 |
| 3.6 重组蛋白诱导细胞应答能力的测定 |
| 4 讨论 |
| 第二章 肠炎沙门菌SseB候选亚单位疫苗免疫效果的评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株与试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组蛋白rHis-SseB与锰佐剂混合诱导细胞应答能力的测定 |
| 2.2 小鼠的免疫及血清采集 |
| 2.3 SseB特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的测定 |
| 2.4 SseB亚单位疫苗诱导细胞免疫应答特性的测定 |
| 2.5 SseB候选亚单位疫苗免疫保护效力实验 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白rHis-SseB与锰佐剂混合诱导细胞应答能力的测定 |
| 3.2 血清中特异性抗体及其亚型检测结果 |
| 3.3 SseB候选亚单位疫苗诱导细胞免疫应答特性 |
| 3.4 SseB候选亚单位疫苗免疫保护效力 |
| 4 讨论 |
| 第三章 肠炎沙门菌多组分候选亚单位疫苗免疫效果的评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要菌株和试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鞭毛蛋白的提取及鉴定 |
| 2.2 SseB和FliC与锰佐剂混合诱导细胞应答能力的测定 |
| 2.3 沙门菌多组分候选亚单位疫苗免疫效果评价 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 鞭毛蛋白的鉴定 |
| 3.2 SseB和FliC与锰佐剂混合诱导细胞应答能力的测定 |
| 3.3 沙门菌多组分候选亚单位疫苗免疫效果评价 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果目录 |
| 致谢 |
（5）PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒特性 |
| 1.1.1 猪圆环病毒2型 |
| 1.1.2 猪圆环病毒3型 |
| 1.2 猪圆环病毒的流行病学 |
| 1.2.1 猪圆环病毒2型的流行病学 |
| 1.2.2 猪圆环病毒3型的流行病学 |
| 1.3 猪圆环病毒的致病机制 |
| 1.3.1 猪圆环病毒2型的致病机制 |
| 1.3.2 猪圆环病毒3型的致病机制 |
| 1.4 猪圆环病毒疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 PCV2疫苗的种类 |
| 1.4.2 PCV2疫苗临床试验 |
| 1.4.3 PCV2疫苗的展望 |
| 1.4.4 PCV3疫苗的研究进展 |
| 1.5 腺病毒载体疫苗 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 细胞和毒株 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪圆环病毒2型的分子流行病学调查 |
| 2.2.2 PCV2全球毒株的进化规律分析 |
| 2.2.3 PCV2流行株的分离及致病性研究 |
| 2.2.4 猪圆环病毒3型的分子流行病学调查 |
| 2.2.5 PCV3潜在的传播途径监测 |
| 2.2.6 PCV3 Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.7 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗构建及鉴定 |
| 2.2.8 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗免疫小鼠试验 |
| 2.2.9 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗猪体免疫试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪圆环病毒2型的分子流行病学调查 |
| 3.1.1 PCV2在中国9省份的流行状况 |
| 3.1.2 PCV2 全基因组序列和ORF2 基因的扩增 |
| 3.1.3 同源性分析 |
| 3.1.4 氨基酸比对 |
| 3.1.5 重组分析 |
| 3.1.6 遗传进化分析 |
| 3.1.7 PCV2流行毒株的选择 |
| 3.2 全球PCV2毒株的进化规律分析 |
| 3.2.1 PCV2毒株进化过程中世界范围内的基因型漂移 |
| 3.2.2 PCV2毒株进化过程中在中国的基因型漂移 |
| 3.2.3 全球PCV2毒株进化过程中氨基酸变异 |
| 3.2.4 中国的PCV2毒株进化过程中氨基酸变异 |
| 3.2.5 PCV2毒株进化过程中氨基酸变异产生的可能原因 |
| 3.3 PCV2流行株的分离及致病性研究 |
| 3.3.1 PCV2的分离与鉴定 |
| 3.3.2 PCV2分离株的纯净性检测和全基因组测序 |
| 3.3.3 PCV2分离株的滴度测定 |
| 3.3.4 PCV2流行株攻毒试验 |
| 3.4 猪圆环病毒3型的分子流行病学调查 |
| 3.4.1 PCV3在中国10个省份的流行状况 |
| 3.4.2 PCV3与猪临床疾病潜在的相关性 |
| 3.4.3 PCV3全基因组序列扩增 |
| 3.4.4 同源性分析 |
| 3.4.5 PCV3的遗传变异 |
| 3.4.6 全基因组序列的比对 |
| 3.4.7 遗传进化分析 |
| 3.4.8 PCV3基因型的进化规律 |
| 3.4.9 PCV3流行毒株的选择 |
| 3.5 PCV3潜在的传播途径 |
| 3.5.1 PCV3在蚊子和猪场中的检测 |
| 3.5.2 PCV3可能的传播圈 |
| 3.5.3 蚊子中PCV3全基因组序列扩增 |
| 3.5.4 氨基酸比对 |
| 3.5.5 蚊子中PCV3的起源 |
| 3.5.6 蚊PCV3遗传进化分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.6.1 PCV3 Cap原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.6.2 PCV3 Cap蛋白原核表达与鉴定 |
| 3.6.3 PCV3 Cap蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.6.4 PCV3 Cap蛋白多克隆抗体制备与鉴定 |
| 3.7 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒疫苗构建及鉴定 |
| 3.7.1 PCV2 ORF2和PCV3 ORF2 基因的优化 |
| 3.7.2 PCV2 Cap和 PCV3 Cap二联重组腺病毒穿梭质粒的构建 |
| 3.7.3 包装重组腺病毒 |
| 3.7.4 重组腺病毒IFA鉴定 |
| 3.7.5 重组腺病毒Western Blot鉴定目的蛋白 |
| 3.7.6 稳定性鉴定 |
| 3.8 PCV2 Cap和 PCV3 Cap单独及二联重组腺病毒疫苗免疫小鼠试验结果 |
| 3.8.1 特异性抗体检测 |
| 3.8.2 PCV2中和抗体检测 |
| 3.8.3 淋巴细胞增殖反应 |
| 3.8.4 细胞因子检测 |
| 3.8.5 PCV2攻毒保护试验 |
| 3.9 PCV2 Cap和 PCV3 Cap单独及二联重组腺病毒疫苗免疫猪体试验 |
| 3.9.1 特异性抗体检测 |
| 3.9.2 PCV2中和抗体检测 |
| 3.9.3 淋巴细胞增殖反应 |
| 3.9.4 细胞因子检测 |
| 3.9.5 PCV2攻毒保护试验 |
| 3.9.6 PCV3攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCV2的分子流行病学特征 |
| 4.2 通过全球毒株序列分析PCV2的进化规律 |
| 4.3 PCV3在中国的分子流行病学特征 |
| 4.4 PCV3潜在的传播途径 |
| 4.5 重组腺病毒疫苗的设计和构建 |
| 4.6 重组腺病毒疫苗的免疫效果的评价 |
| 4.7 重组腺病毒疫苗免疫后攻毒保护试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）PEDV、PDCoV与SADS-CoV共感染IPEC-J2细胞的转录组学及基于TLR3、INSIG1介导的信号通路抗病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒(PEDV) |
| 1.1.2 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) |
| 1.1.3 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) |
| 1.2 猪腹泻病毒的诊断与防治 |
| 1.2.1 猪腹泻病毒的诊断 |
| 1.2.2 猪腹泻病毒的防治 |
| 1.3 共感染病原的相互作用与致病机制 |
| 1.3.1 PEDV、PDCoV、SAD-CoV共感染研究现状 |
| 1.3.2 病毒共感染的致病机制 |
| 1.3.3 冠状病毒的抗天然免疫研究进展 |
| 1.4 IPEC-J2细胞系 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 第二章 江西及周边地区PEDV、PDCoV、SADS-CoV三种主要猪肠道致病性病毒的流行病学调查及基于S1基因遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料与主要仪器和试剂 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.1.3 病毒核酸的提取 |
| 2.1.4 PEDV、PDCoV、SADS-CoV三种病毒的检测及S1 基因的扩增及测序 |
| 2.1.5 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因的序列测定及分析 |
| 2.1.6 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因序列进化树构建和同源性分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PEDV、PDCoV、SAD-CoV三种腹泻病毒电泳结果 |
| 2.2.2 PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和混合感染情况 |
| 2.2.3 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因的扩增、克隆、测序结果 |
| 2.2.4 PEDVS1基因的进化树分析 |
| 2.2.5 PDCoV S1 基因进化树分析 |
| 2.2.6 SADS-CoV S1 基因的进化树分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 PEDV、PDCoV、SADS-CoV流行情况及共感染情况 |
| 2.3.2 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因的遗传变异分析 |
| 第三章 PEDV、PDCoV与 SADS-CoV感染IPEC-J2 细胞的生物学特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、载体与样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试剂和溶液的配制 |
| 3.1.5 引物设计与合成 |
| 3.1.6 SADS-CoV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1.7 细胞的复苏与培养 |
| 3.1.8 病毒的增殖与TCID50的测定 |
| 3.1.9 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2 细胞的生长曲线 |
| 3.1.10 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2 细胞的免疫荧光 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SADS-CoV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 PEDV、PDCoV 和 SADS-CoV 单一/共感染 IPEC-J2 细胞的一步生长曲线 |
| 3.2.3 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2 细胞的免疫荧光 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV共感染IPEC-J2 细胞转录组分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 引物的设计与合成 |
| 4.1.5 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一感染和混合感染实验及样品制备 |
| 4.1.6 细胞总RNA的提取、纯度和完整性分析 |
| 4.1.7 文库的构建与测序 |
| 4.1.8 转录组测序数据的处理与分析 |
| 4.1.9 荧光定量RT-PCR验证差异表达基因 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞总RNA纯度和完整性分析 |
| 4.2.2 转录组测序数据的处理与分析 |
| 4.2.3 荧光定量RT-PCR验证差异表达基因 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 细胞的免疫应答 |
| 4.3.2 细胞周期相关因子 |
| 4.3.3 胆固醇代谢 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 poly(I:C)抑制猪腹泻冠状病毒感染的机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞与病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 引物设计与合成 |
| 5.1.5 shRNA的设计与合成 |
| 5.1.6 干扰重组载体的构建 |
| 5.1.7 过表达重组载体的构建 |
| 5.1.8 poly(I:C)对病毒复制的影响 |
| 5.1.9 TLR3通路抑制剂对病毒复制的影响 |
| 5.1.10 TLR3 的激活和抑制对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响 |
| 5.1.11 统计学分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pCAGGS-TLR3和pcDNA3.1-U6-TLR重组载体的构建 |
| 5.2.2 pcDNA3.1-U6-TLR3和pCAGGS-TLR3 抑制和过表达效果验证 |
| 5.2.3 Poly(I:C)对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的抑制 |
| 5.2.4 Ploy(I:C)处理对TLR3 通路信号分子的表达情况 |
| 5.2.5 不同药物浓度Resveratrol、BX795 对细胞活度的测定 |
| 5.2.6 TLR3 的激活和抑制对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响 |
| 5.2.7 pcDNA3.1-U6-TLR3和p CAGGS-TLR3 对病毒的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 PEDV、SADS-CoV和 PDCoV结构蛋白与INSIG1 相互作用机制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 病毒、细胞与质粒 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 引物设计与合成 |
| 6.1.5 INSIG1 过表达和sh RNA的设计与合成 |
| 6.1.6 干扰重组载体的构建 |
| 6.1.7 过表达重组载体的构建 |
| 6.1.8 PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染/共感染对胆固醇代谢的影响 |
| 6.1.9 NSIG1 过表达和sh RNA重组质粒效果鉴定 |
| 6.1.10 INSIG1 过表达和sh RNA重组质粒转染IPEC-J2 细胞对病毒复制的影响 |
| 6.1.11 PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组过表达质粒转染IPEC-J2 细胞 |
| 6.1.12 不同葡萄糖浓度对INSIG1的影响 |
| 6.1.13 统计学分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 过表达载体的构建 |
| 6.2.2 INSIG1重组质粒的构建 |
| 6.2.3 PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染/共感染对胆固醇代谢的影响 |
| 6.2.4 INSIG1 过表达和sh RNA重组质粒效果鉴定 |
| 6.2.5 INSIG1 过表达和sh RNA重组质粒转染IPEC-J2 细胞对病毒复制的影响 |
| 6.2.6 PEDV、PDCoV、SADS-CoV结构和非机构基因对INSIG1 表达的影响 |
| 6.2.7 葡萄糖浓度对病毒影响INSIG1的关系 |
| 6.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 溶液、试剂配制及试剂盒操作步骤 |
| 附录 Ⅱ 附图与附表 |
| 攻读博士学位期间发表论文及获奖情况 |
| 致谢 |
（7）利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟疫苗的研究现况 |
| 1.1.1 猪瘟病毒 |
| 1.1.2 猪瘟病毒的致病机理 |
| 1.1.3 猪瘟疫苗的现况 |
| 1.2 铁蛋白 |
| 1.2.1 铁蛋白的结构及其修饰 |
| 1.2.2 重组铁蛋白的人工制备 |
| 1.2.3 铁蛋白纳米颗粒的应用 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌的遗传背景 |
| 1.3.2 优化大肠杆菌表达系统的方法 |
| 1.4 杆状病毒表达系统 |
| 1.4.1 杆状病毒 |
| 1.4.2 杆状病毒表达系统 |
| 1.4.3 杆状病毒表达系统研究现状 |
| 1.4.4 杆状病毒表达系统的应用 |
| 1.5 研究内容和意义 |
| 1.5.1 研究的主要内容 |
| 1.5.2 研究目的及意义 |
| 第2章 E2-Fe融合蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟囊膜蛋白E2基因及铁基因的获取 |
| 2.2.2 重组表达质粒p ET28a-E2-Fe及基因工程菌的构建 |
| 2.2.3 核酸快速抽提法粗筛阳性克隆 |
| 2.2.4 蛋白E2及融合蛋白E2-Fe在大肠杆菌中的表达及纯化 |
| 2.2.5 制备小鼠多克隆抗体 |
| 2.2.6 ELISA法检测小鼠血清抗体效力 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 构建原核表达质粒p ET28a-E2-Fe及基因工程菌的构建 |
| 2.3.2 E2-Fe融合蛋白在E.coli BL21 中的表达鉴定及其表达量的条件优化 |
| 2.3.3 E2-Fe融合蛋白的纯化及电镜观察 |
| 2.3.4 小鼠血清抗体效价检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 总结 |
| 第3章 重组融合蛋白E2-Fe在家蚕中表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 猪瘟囊膜蛋白E2基因及铁蛋白基因的获取及合成融合基因E2-Fe |
| 3.2.2 构建重组杆状病毒转移载体p VL1393-E2-Fe |
| 3.2.3 构建重组杆状病毒r Bm Bac-E2-Fe及在家蚕中表达 |
| 3.2.4 制备小鼠多克隆抗体 |
| 3.2.5 ELISA法小鼠血清抗体效力检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 鉴定重组转移载体的构建 |
| 3.3.2 构建重组杆状病毒 |
| 3.3.3 在家蚕生物反应器中表达融合蛋白 |
| 3.3.4 重组杆状病毒侵染家蚕后融合蛋白E2-Fe表达的鉴定 |
| 3.3.5 E2-Fe融合蛋白的纯化及电镜观察 |
| 3.3.6 小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌蛋白抗原的构建和评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪链球菌的研究概况 |
| 1.1 病原学和流行病学 |
| 1.2 临床症状和病理变化 |
| 1.3 诊断和防治 |
| 2 猪霍乱沙门菌C500作为载体的研究概况 |
| 2.1 荷载异源抗原的减毒沙门菌诱发免疫的机制 |
| 2.2 C500载体系统的研究概况 |
| 2.3 C500载体系统存在的优势与局限 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 猪霍乱沙门菌重组减毒株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 相关主要培养基、试剂的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 构建猪霍乱沙门菌重组减毒株的策略 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 自杀质粒的构建 |
| 2.4 回复rpoS基因同源重组供体菌的制备 |
| 2.5 同源重组 |
| 2.6 rpoS基因的回复的验证 |
| 2.7 C5001、C5002、C5003、C5004突变株的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 自杀质粒的构建 |
| 3.2 突变株的鉴定 |
| 3.3 rpoS基因回复的验证 |
| 3.4 C5001、C5002、C5003、C5004减毒株的构建 |
| 4 讨论 |
| 第四章 重组减毒株的生物学特性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株、动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 相关主要培养基、试剂的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 各菌株生长曲线的测定 |
| 2.2 运行性检测 |
| 2.3 菌株的定植实验 |
| 2.4 攻毒保护实验 |
| 2.5 抗体水平的检测 |
| 3 结果 |
| 3.0 各减毒株生长曲线的测定 |
| 3.1 运动型检测 |
| 3.2 定植 |
| 3.3 LPS和外膜蛋白提取检测 |
| 3.4 抗体水平检测 |
| 3.5 免疫保护 |
| 4 讨论 |
| 第五章 减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌STK、GDH、ccp A蛋白的构建及其免疫原性初探 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、质粒和动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 相关主要溶液的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验引物 |
| 2.2 猪链球菌2型stk、gdh、ccp A基因的克隆 |
| 2.3 相关蛋白在BL21中的表达及可溶性蛋白的纯化 |
| 2.4 针对相关蛋白的兔抗血清的制备,纯化及其效价的测定 |
| 2.5 猪链球菌SC19菌株LD50的测定 |
| 2.6 C5001(stk、gdh、ccp A)菌株的构建及其表达 |
| 2.7 C5001(p YA3494-stk)、C5001(p YA3494-gdh)、C5001(p YA3494-ccp A)菌株的生物学特性 |
| 3 结果 |
| 3.0 猪链球菌2型stk、gdh、ccp A基因的克隆 |
| 3.1 p ET28a-stk、p ET30a-gdh、p ET28a-ccp A质粒的构建 |
| 3.2 相关蛋白在BL21中的表达及可溶性蛋白的纯化 |
| 3.3 针对相关蛋白的兔抗血清的制备及其效价的测定 |
| 3.4 猪链球菌SC19菌株LD50的测定 |
| 3.5 重组沙门菌C5001载体的构建及基因的克隆 |
| 3.6 stk,gdh,ccp A蛋白在C5001 中的表达 |
| 3.7 抗体水平检测结果 |
| 3.8 动物保护性试验 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文和申请专利 |
（9）藏羚羊粪便和高原鼠兔肠内容物可培养菌群结构与新种发现（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 藏羚羊粪便与鼠兔肠内容物菌群培养分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 藏羚羊粪便与鼠兔肠内容物可培养菌群相似性分析 |
| 2.2 藏羚羊粪便可培养菌群多样性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 藏羚羊粪便与鼠兔肠内容物细菌新种的分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 朱既明栖霉菌(Mycetocola zhujimingii)的发现与命名 |
| 2.2 洪涛盐地杆菌的发现与命名(Salinibacterium hongtaonis) |
| 2.3 李兰娟放线菌的发现与命名(Actinomyces lilanjuaniae) |
| 2.4 廖万清副球菌的发现与命名(Paracoccus liaowanqingii) |
| 2.5 巴德年壤霉菌的发现与命名(Agromyces badenianii) |
| 2.6 俞东征棒杆菌(Corynebacteriumyudongzhengii)和梁国栋棒杆菌(Corynebacterium liangguodongii)的发现与命名 |
| 2.7 陈薇气微菌(Aeromicrobium chenweiae)和严杰气微菌(Aeromicrobiumyanjiei)的发现与命名 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）口蹄疫病毒O型突变株的构建及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.FMD |
| 1.1 FMD的发展历史和危害 |
| 1.2 FMD的流行现状 |
| 1.2.1 O型FMDV的流行特点 |
| 2.FMDV |
| 2.1 结构与功能 |
| 2.2 蛋白质组成与功能 |
| 2.2.1 结构蛋白 |
| 2.2.2 非结构蛋白 |
| 2.3 血清型 |
| 2.4 FMDV特点 |
| 3.FMD疫苗的研究进展 |
| 3.1 传统疫苗 |
| 3.1.1 灭活疫苗 |
| 3.1.2 弱毒疫苗 |
| 3.2 新型疫苗 |
| 3.2.1 病毒活载体疫苗 |
| 3.2.2 表位蛋白疫苗 |
| 3.2.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 3.2.4 标记疫苗 |
| 4.反向遗传学技术在FMD疫苗研究中的应用 |
| 4.1 反向遗传技术及反向疫苗 |
| 4.2 FMDV改造的技术要求 |
| 4.3 FMD新型疫苗 |
| 4.3.1 缺失疫苗 |
| 4.3.2 嵌合疫苗 |
| 4.3.3 RNA疫苗 |
| 4.3.4 定点诱变疫苗 |
| 5.研究的目的及意义 |
| 第二章 口蹄疫病毒O型突变株的构建与鉴定 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、质粒、病毒、抗体及试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 FMDV不同谱系疫苗毒株和流行毒株VP1 蛋白氨基酸序列比对分析 |
| 2.2 含突变氨基酸特定基因的合成 |
| 2.3 含目标突变氨基酸半长质粒的构建 |
| 2.3.1 酶切和回收 |
| 2.3.2 连接、转化、挑菌和摇菌 |
| 2.3.3 提取质粒 |
| 2.3.4 重组半长质粒的鉴定 |
| 2.4 含目标突变氨基酸全长质粒的构建 |
| 2.4.1 酶切和回收 |
| 2.4.2 连接、转化、挑菌和摇菌 |
| 2.4.3 提取质粒 |
| 2.4.4 重组全长质粒的鉴定 |
| 2.5 基因工程病毒的拯救 |
| 2.5.1 全长质粒的线化 |
| 2.5.2 转染BSR/T7细胞 |
| 2.6 基因工程病毒的鉴定 |
| 2.6.1 RT-PCR及序列测定 |
| 2.6.1.1 提取RNA |
| 2.6.1.2 RT-PCR |
| 2.6.1.3 序列分析 |
| 2.6.2 间接免疫荧光 |
| 2.6.3 电镜观察 |
| 2.6.3.1 病毒的灭活 |
| 2.6.3.2 病毒的灭活检验 |
| 2.6.3.3 病毒的浓缩与纯化 |
| 3.结果 |
| 3.1 FMDV VP1 氨基酸序列比对 |
| 3.2 重组半长质粒的鉴定 |
| 3.3 重组全长质粒的鉴定 |
| 3.4 基因工程病毒的拯救 |
| 3.5 基因工程病毒的鉴定 |
| 3.5.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.5.2 间接免疫荧光 |
| 3.5.3 电镜观察病毒粒子结果 |
| 4.讨论 |
| 第三章 口蹄疫病毒O型突变株的生物学特性分析 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、病毒与试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 拯救病毒的增殖培养和遗传稳定性检测 |
| 2.2 噬斑表型分析 |
| 2.3 一步生长曲线 |
| 2.4 热失活试验 |
| 2.5 基因工程病毒对乳鼠致病力检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 拯救病毒的增殖培养和遗传稳定性分析 |
| 3.2 噬斑表型 |
| 3.3 一步生长曲线 |
| 3.4 热失活结果 |
| 3.5 基因工程病毒对乳鼠致病力检测结果 |
| 4.讨论 |
| 第四章 O型不同FMDV对 C57BL/6 小鼠致病性的研究 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、病毒与试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 O型不同FMDV对8 周龄C57BL/6 小鼠致病力的检测 |
| 2.1.1 细胞适应毒对8周龄C57BL/6小鼠致病力的检测 |
| 2.1.2 细胞适应毒在乳鼠上的复壮 |
| 2.1.3 乳鼠组织毒对8周龄C57BL/6小鼠的致病力的检测 |
| 2.2 O型不同FMDV对8 周龄C57BL/6 小鼠病毒血症的检测 |
| 2.2.1 细胞适应毒对8周龄C57BL/6小鼠病毒血症的检测 |
| 2.2.2 乳鼠组织毒对8周龄C57BL/6小鼠病毒血症的检测 |
| 2.3 RT-PCR鉴定 |
| 3.结果 |
| 3.1 O型不同FMDV对8 周龄C57BL/6 小鼠致病力检测结果 |
| 3.1.1 细胞适应毒对8周龄C57BL/6小鼠的致病力检测结果 |
| 3.1.2 乳鼠组织毒对8周龄C57BL/6小鼠的致病力检测结果 |
| 3.2 O型不同FMDV对8 周龄C57BL/6 小鼠病毒血症的检测结果 |
| 3.2.1 细胞适应毒对8周龄C57BL/6小鼠病毒血症的检测结果 |
| 3.2.2 乳鼠组织毒对8周龄C57BL/6小鼠病毒血症的检测结果 |
| 3.3 RT-PCR检测结果 |
| 4.讨论 |
| 第五章 FMDV O/HK/CHA/99在C57BL/6 小鼠体内的适应及全序的测定 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、病毒与试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 FMDV在体内和体外的传代 |
| 2.2 FMDV噬斑形态和一步生长曲线 |
| 2.3 FMDV对乳鼠致病性试验 |
| 2.4 FMDV对 C57BL/6 小鼠的致病性 |
| 2.5 全序的测定和编码氨基酸的比对分析 |
| 2.6 FMDV在 C57BL/6 小鼠体内病毒血症的测定 |
| 3.结果 |
| 3.1 FMDV O/HK/CHA/99MF4 体内和体外的传代 |
| 3.2 噬斑表型和一步生长曲线 |
| 3.3 乳鼠致病性试验 |
| 3.4 FMDV对 C57BL/6 小鼠的致病性 |
| 3.5 全序的测定和编码氨基酸的比对分析 |
| 3.6 FMDV在 C57BL/6 小鼠体内病毒血症结果 |
| 4.讨论 |
| 第六章 口蹄疫O型突变株的免疫原性及灭活疫苗的效力研究 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、病毒与试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 制苗病毒的大量增殖培养 |
| 2.2 病毒灭活与检验 |
| 2.2.1 病毒灭活 |
| 2.2.2 病毒的灭活检验 |
| 2.2.3 病毒的浓缩与纯化 |
| 2.3 疫苗的配制与检验 |
| 2.3.1 疫苗的配制 |
| 2.3.2 无菌检验 |
| 2.4 免疫豚鼠 |
| 2.4.1 FMDV的定量 |
| 2.4.2 不同免疫剂量对抗体产生的影响 |
| 2.4.3 基因工程病毒的免疫原性分析 |
| 2.4.4 基因工程病毒与亲本毒抗原关系分析 |
| 2.4.5 交叉中和试验 |
| 2.5 C57BL/6小鼠免疫攻毒试验 |
| 2.5.1 免疫C57BL/6小鼠 |
| 2.5.2 血清抗体的检测 |
| 2.5.3 C57BL/6小鼠LD_(50)的测定 |
| 2.5.4 攻毒试验 |
| 3.结果 |
| 3.1 FMDV的 TCID50 定量结果 |
| 3.2 不同免疫剂量对抗体产生的影响 |
| 3.3 基因工程病毒的免疫原性分析 |
| 3.4 基因工程病毒与亲本毒抗原关系分析 |
| 3.5 交叉中和试验结果 |
| 3.6 免疫攻毒结果 |
| 3.6.1 血清抗体检测结果 |
| 3.6.2 不同FMDV对 C57BL/6 小鼠LD_(50) 检测结果 |
| 3.6.3 攻毒试验 |
| 4.讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
四、Ⅱ型猪链球菌S_2株在兔中免疫原性的研究（论文参考文献）
- [1]猪链球菌-肠外致病性大肠杆菌二联多价亚单位候选疫苗免疫保护效果的评估[D]. 陈图梅. 华中农业大学, 2021
- [2]表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的构建及其免疫效力评价[D]. 王希玉. 扬州大学, 2021
- [3]猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗的研究[D]. 龚俊. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]基于锰佐剂的肠炎沙门菌亚单位疫苗的研制与评价[D]. 王超. 扬州大学, 2020(01)
- [5]PCV2和PCV3分子流行病学及二联重组腺病毒候选疫苗研究[D]. 哈卓. 东北农业大学, 2020(04)
- [6]PEDV、PDCoV与SADS-CoV共感染IPEC-J2细胞的转录组学及基于TLR3、INSIG1介导的信号通路抗病毒研究[D]. 张帆帆. 江西农业大学, 2020
- [7]利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白[D]. 魏珍珍. 江苏科技大学, 2020(03)
- [8]减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌蛋白抗原的构建和评估[D]. 卞晓萍. 西南大学, 2020(01)
- [9]藏羚羊粪便和高原鼠兔肠内容物可培养菌群结构与新种发现[D]. 李俊琴. 山西医科大学, 2020
- [10]口蹄疫病毒O型突变株的构建及其生物学特性分析[D]. 龚婷. 甘肃农业大学, 2019