一、豚鼠耳蜗外毛细胞的一氧化氮定量分析（论文文献综述）
马婷婷[1]（2019）在《葛根素对顺铂诱导小鼠耳毒性的防护作用研究》文中认为目的研究葛根素对顺铂诱导小鼠耳毒性的防护作用及其机制,为临床防治顺铂所致耳聋提供新思路。方法1、在体实验100只成年BALB/c小鼠随机分为四组:对照组、顺铂组、顺铂+葛根素组和葛根素组（n=25只）。顺铂组腹腔注射顺铂4.5mg/kg/d,连续5d;葛根素组腹腔注射葛根素200mg/kg/d,连续14d;顺铂+葛根素组先提前腹腔注射葛根素200mg/kg/d,连续9d,在第10d同时腹腔注射顺铂4.5mg/kg/d,连续5d;对照组则腹腔注射等量生理盐水。应用听脑干反应（auditory brainstem response,ABR）测试和耳蜗毛细胞计数,观察小鼠用药前后的听力变化和毛细胞损伤情况;应用免疫荧光染色、蛋白免疫印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）等技术检测耳蜗内基质交感分子1（stromal interaction molecule 1,STIM1）、Orai1、瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid receptor 1,TRPV1）、钙蛋白酶2（calpain2）的表达。2、离体实验取新生3d BALB/c小鼠耳蜗基底膜,于无血清的新鲜培养基中常规培养24h后,弃去原培养基。将基底膜随机分为4组,对照组给予新鲜无血清培养基2ml;顺铂组给予含有顺铂（16μg/ml）的新鲜无血清培养基2ml;顺铂+葛根素组提前给予10-6M葛根素无血清新鲜培养基培养30min后,加入顺铂（16μg/ml）至2ml;葛根素组给予10-6M葛根素无血清新鲜培养基2ml;各组在同等条件下继续培养24h。利用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）和罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）标记的鬼笔环肽荧光染色方法,观察耳蜗毛细胞形态变化,并统计各组毛细胞数量。应用Western blot技术检测耳蜗毛细胞内STIM1和Orai1蛋白的表达;采用Ca2+荧光探针Fluo-4 AM负载入毛细胞,激光共聚焦显微镜来观察各组耳蜗毛细胞内游离Ca2+水平。结果1.连续给药后,顺铂组ABR阈移与对照组相比明显增大（P<0.01）;顺铂+葛根素组ABR阈移与顺铂组相比明显减小（P<0.01）;葛根素组ABR阈移与对照组相比无显着性差异（P>0.05）。2.在体小鼠耳蜗和离体培养基底膜的毛细胞计数结果均显示,顺铂组外毛细胞缺失率与对照组相比显着增大（P<0.01）;与顺铂组相比,在体实验中顺铂+葛根素组耳蜗基底膜的底回和中回的外毛细胞缺失率明显减少（P<0.01）;离体实验中顺铂+葛根素组与顺铂组相比,外毛细胞和内毛细胞缺失均显着减少（P<0.01）;对照组与葛根素组相比,差异不显着（P>0.05）。3.细胞内Ca2+水平检测结果显示,顺铂组耳蜗毛细胞内的Ca2+水平明显高于对照组（P<0.01）;而顺铂+葛根素组耳蜗毛细胞内Ca2+水平与顺铂组相比显着减弱（P<0.01）;对照组与葛根素组相比荧光强度无明显差异（P>0.05）。4.Real-time PCR结果显示,顺铂组STIM1和Orai1的mRNA水平明显高于对照组（P<0.01）;而顺铂+葛根素组STIM1和Orai1的mRNA水平与顺铂组相比明显降低（P<0.05,P<0.01）;葛根素组的STIM1和Orai1的mRNA表达与对照组相比无明显变化（P>0.05）。5.免疫荧光铺片结果表明,顺铂组STIM1、Orai1的阳性反应与对照组相比显着增强（P<0.01）;顺铂+葛根素组STIM1、Orai1的阳性反应与顺铂组相比明显减弱（P<0.01）;对照组与葛根素组相比无显着性差异（P>0.05）。6.在体与离体实验的Western blot检测结果均表明,顺铂组的STIM1、Orai1表达与对照组相比均明显增强（P<0.01）;顺铂+葛根素组的蛋白表达与顺铂组相比明显减弱（P<0.05）;葛根素组与对照组相比蛋白表达并无明显变化（P>0.05）。7.免疫荧光检测结果显示,顺铂组TRPV1和calpain2蛋白阳性表达明显强于对照组（P<0.01）;顺铂+葛根素组与顺铂组相比阳性表达明显减弱（P<0.01）;而对照组与葛根素组的荧光强度相比无明显变化（P>0.05）。结论葛根素可通过减少STIM1、Orai1、TRPV1和calpain2蛋白表达,抑制耳蜗细胞发生钙超载,从而有效防护顺铂所致小鼠听功能受损。
汪雪玲[2]（2018）在《A666多肽介导主动靶向隐形纳米粒对顺铂耳毒性预防作用研究》文中提出目的:耳蜗外毛细胞损伤是导致顺铂引起的听力下降甚至丧失的关键原因。迄今为止,未有被FDA或SFDA批准上市的预防或治疗顺铂耳毒性的药物。本研究着重探讨新型多肽A666修饰,主动靶向外毛细胞药物递送系统作为“靶向定位”、“持续缓释”递送药物的可能性;以地塞米松（dexamathsone,DEX）为模型药物,并进一步以HEI-OC1和顺铂耳毒性豚鼠为体外细胞和体内动物模型,深入研究该主动靶向药物递送系统对顺铂耳毒性的预防作用及潜在作用机制。方法:以马来酰亚胺和单甲氧基末端聚乙二醇-聚乳酸混合物（Mal-PEG-PLA,m PEG-PLA）为载体材料,以DEX为模型药物,采用乳化-溶剂挥发技术优化制备装载有DEX的PEG-PLA隐形纳米粒（DEX-NP）。利用巯基（-SH）与马来酰亚胺基团（-Mal）之间的反应,将末端用赖氨酸修饰的A666多肽与DEX-NP表面PEG末端的马来酰亚胺基团以共价键的方式连接得A666-DEX-NP。该技术新形成的共价键保证抗A666多肽在纳米粒表面修饰的稳定性（不易水解、脱落）。并且可最大限度降低对其构象和活性的影响,以尽可能保护A666与内耳外毛细胞表面高表达的Prestin的识别、结合的能力。采用X射线光电子能谱（XPS）对纳米粒表面进行硫元素分析（S）定性鉴别A666-NP表面A666多肽的成功连接。采用动态光散射测定A666-DEX-NP粒径、Zeta电位,并用透射电镜（TEM）观察其形态和粒径分布,同时采用已有方法测定A666-DEX-NP的包封率、载药量及其体外药物释放特性。用香豆素-6标记多肽A666修饰PEG-PLA纳米粒（A666-coumarin 6-NP）,研究经圆窗膜给药后A666-NP在耳蜗内的分布;测定A666-DEX-NP圆窗膜给药后不同时间点外淋巴液中的地塞米松浓度,明确A666-DEX-NP经圆窗膜给药后的耳蜗分布及释放特征;通过已构建顺铂耳毒性动物豚鼠模型,明确A666-DEX-NP经圆窗膜给药后拮抗顺铂耳毒性的效果;利用分子生物学实验手段对A666-DEX-NP抗顺铂耳毒性作用机制进行了初步研究。结果:通过经典的巯基-氨基化学反应将A666多肽连接到纳米粒表面,XPS分析A666-NP纳米粒表面有0.4%左右的S元素,而NP未检测到S元素,证实A666成功连接。最终获得A666-DEX-NP表面圆整光滑,平均粒径为157.80±14.33 nm,表面电位为-32.53±0.64 m V,包封率为1.20±0.33%,载药量为0.44±0.12%,体外人工淋巴液中缓释长达14 d。香豆素-6示踪A666-NP（A666-coumarin 6-NP）,呈现时间依赖性HEI-OC1细胞内摄取特性;与prestin免疫荧光染色叠合证实A666-prestin相互作用摄取进入细胞。A666-coumarin6-NP经圆窗膜给药1 h后,A666-NP“定位”聚集于外毛细胞;而无多肽修饰NP未观察到外毛细胞定位现象。细胞学实验表明,A666-DEX-NP在20,40,80 mg/ml浓度下显着拮抗顺铂（30μM,24 h）细胞毒性;80 mg/ml浓度下有效抑制顺铂引起细胞凋亡。然而,相同浓度下DEX和DEX-NP并未表现出顺铂细胞毒性抑制和细胞凋亡拮抗作用。A666-DEX-NP经圆窗膜给药后,在内耳淋巴液中持续释放约48 h;而相同剂量的DEX,给药6 h后即被完全清除。由此,A666-DEX-NP体现出优良的“持续”累积释放药物,长时间维持有效药物浓度特性,这为DEX拮抗顺铂引起的听力下降提供了有力保障。基于此,顺铂腹腔注射前1 h,圆窗膜给于A666-DEX-NP,3 d后观察到在4 k Hz,8 k Hz和16 k Hz频率下对豚鼠听力有显着的保护作用,进一步研究证实A666-DEX-NP对顺铂耳毒性保护作用可能是通过抑制caspase-3的活化,增加Bcl-2的表达实现。结论:本研究首次合成制备多肽A666修饰,外毛细胞主动靶向,载DEX的隐形纳米粒（A666-DEX-NP）,并对其体内外“靶向定位”、“持续缓释”特性进行了一系列深入研究。本研究证实是A666-DEX-NP具有良好的外毛细胞靶向特性,是内耳持续递送药物的理想载体,同时,A666-DEX-NP经圆窗膜给药能有效地拮抗顺铂在4 k Hz,8 k Hz和16 k Hz频率下引起的听力下降。该研究为探索顺铂耳毒性预防或治疗策略提供新的思路和策略。
朱丽军[3]（2018）在《补肾聪耳方对庆大霉素致聋大鼠耳蜗P38MAPK的影响》文中进行了进一步梳理目的本实验意在评估补肾聪耳方对药物性耳聋大鼠的治疗作用,同时研究该方剂对细胞凋亡信号通路P38MAPK的影响。通过对比三组大鼠的一般状态、体重变化、听力变化、血cAMP和cGMP的改变、耳蜗病理切片以及耳蜗P38蛋白的表达从而整体的评估补肾聪耳方的治疗作用,以期为临床使用补肾聪耳方防治药物性耳聋提供实验室依据。方法将通过ABR听力筛查的SD大鼠（45只）,按照随机数字表法分为3组（空白组、模型组、中药组）,中药组及模型组采用肌肉注射庆大霉素(100 mg·kg-1·d-1)连续14天的方法制造药物性耳聋大鼠模型,中药组在造模的基础上给予补肾聪耳方灌胃,空白组注射并灌胃等量生理盐水。观察三组大鼠一般情况,测量大鼠体重上升的差距,ABR测听力下降幅度。实验第15天取材,测量大鼠血浆cAMP和cGMP含量,使用HE染色法观察大鼠耳蜗病理改变,采用Western-Blot法和RT-PCR法检测大鼠耳蜗P38蛋白的含量。结果（1）一般状态评价模型组及中药组大鼠一般状态出现改变,空白组大鼠表现正常。中药组大鼠与模型组大鼠均出现了躁动不安,容易受到惊吓,怕人怕物,食量明显减少,但饮水增多,体重增长缓慢,大便干,尿量明显减少等一系列表现。但与模型组大鼠相比,中药组大鼠一般状态明显优于模型组。（2）体重增长幅度三组大鼠两周后体重评估,空白组、模型组和中药三组相比,空白组平均体重最高,增长速度最快。空白组与模型组相比,空白组体重增长快（P<0.01）,空白组与中药组相比,空白组体重增长快（P<0.01）,模型组与中药组相比,中药组体重增加较快（P<0.05）。（3）血浆cAMP和cGMP值比较模型组与空白组相比cAMP/cGMP值上升（P<0.05）,中药组与空白组相比cAMP/cGMP值上升（P<0.05）,模型组与中药组相比,模型组cAMP/cGMP值较高P<0.05)。（4）ABR测听比较三组大鼠ABR阈值相比空白组最低,其次是中药组,最后是模型组。空白组与模型组相比其ABR阈值最低（P<0.01）,空白组和中药组相比,其ABR阈值最低（P<0.01）;模型组与中药组相比,中药组ABR阈值较低（P<0.01）。（5）耳蜗病理切片比较空白组大鼠耳蜗切片正常。模型组大鼠和中药组大鼠耳蜗病理切片均出现毛细胞数量减少,排列不规则,螺旋神经节数量减少等情况。但整体上看,中药组病理切片相对模型组较好。（6）耳蜗P38蛋白含量Western-Blot与RT-PCR结果均显示:与模型组和中药组相比,空白组P38蛋白的表达偏低（P<0.05）,而中药组与模型组相比,中药组P38蛋白的表达相对较低（P<0.05）。结论三组大鼠ABR阈值的情况以及病理切片表明,药物性耳聋大鼠模型造模成功,结合大鼠一般状态、体重变化以及cAMP/cGMP值提示模型组与中药组两组大鼠整体状态与中医肾虚证型耳聋相似。中药组大鼠ABR阈值的改善以及耳蜗病理切片结果提示补肾聪耳方对药物性耳聋大鼠有一定的防治作用,因此采用补肾法治疗药物性耳聋方法可行。三组大鼠耳蜗P38蛋白表达提示庆大霉素所致药物性耳聋发病机制可能与开启MAPK细胞凋亡通道有关。而采用补肾聪耳方能有效抑制P38MAPK通道的开启从而对药物性耳聋起到防治作用。
韩明训[4]（2015）在《川芎嗪对防治庆大霉素致聋豚鼠耳蜗p38MAPK表达的影响》文中认为[目的]通过观察川芎嗪（TMP）、庆大霉素（GM）单独应用及联合使用对豚鼠内耳听功能、细胞形态及p38MAPK蛋白表达的影响,以此探讨p38MAPK信号传导通路在庆大霉素耳毒性中的作用及川芎嗪在庆大霉素致聋中的防治机制,为中医药在耳聋康复领域中的临床应用及相关实验提供一定的理论基础。[方法]1.筛选健康活泼、耳廓反射灵敏的白毛红目豚鼠48只,随机分成4组:庆大霉素造模组（GM组）、川芎嗪防治组（GM+TMP组）、川芎嗪组（TMP组）和生理盐水组。GM组:肌注硫酸庆大霉素120mg·kg-1·d1;GM+TMP组:肌注硫酸庆大霉素120 mg·kg-1·d-1及腹腔注射盐酸川芎嗪30mg-kg-1·d-1;TMP组:腹腔注射盐酸川芎嗪30mg·kg-1·d-1;生理盐水组:肌注与GM组等量的生理盐水,所有组连续给药13天。实验结束后所有豚鼠断头处死,收集耳蜗标本。2.各实验组豚鼠首次用药前及末次用药后第1天双耳均行客观听力检测。采用click ABR测试,以click ABR的阈值、80dB nHL给声强度下的III波潜伏期和幅值三个标准来判断各实验组豚鼠的听力情况。3.光镜下对不同组别豚鼠耳蜗HE染色切片进行观察,观察耳蜗Corti氏器和螺旋神经节内细胞的形态改变。4.应用Western blot法检测各实验组耳蜗组织内p38MAPK蛋白表达量。[结果]1.豚鼠客观听力检测结果click ABR检测结果显示,用药前各组听阈基本一致,听功能正常,无显着性的统计学差异（P>0.05）。用药后GM组和GM+TMP组的听阈显着性升高,与生理盐水组及用药前相比,听功能明显下降,且均具有统计学差异（P<0.01）,证明肌注120mg·kg-1·d-1庆大霉素连续13天后,豚鼠听功能下降,耳毒性造模成功;TMP组的ABR阈值与生理盐水组及用药前相比,听功能没有明显改变,ABR阈值无统计学差异（P>0.05）;GM+TMP组阈值虽也有升高,但较GM组明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,证明中药川芎嗪能有效改善庆大霉素致聋豚鼠的听功能（见表1-1）,具有较好的防治作用。2.实验组80dB nHL给声强度下Ⅲ波潜伏期及幅值结果80dBnHL给声强度下,GM组的III波潜伏期、幅值与生理盐水组、GM+TMP组、TMP组相比,潜伏期明显延长,幅值明显降低,具有明显的统计学差异（P<0.05）,进一步说明GM可致豚鼠听功能下降,而GM+TMP组潜伏期、幅值与生理盐水组、TMP组相比,潜伏期及幅值无明显改变,差异均无统计学意义（P>0.05）,见表 2-1。3.Western blot法测耳蜗组织内p38MAPK蛋白表达量从图3-1可看出,耳蜗内组织内p38MAPK蛋白表达分布程度依次为:GM组>生理盐水组≈TMP 组>GM+TMP组.给药后,GM组与生理盐水组、GM+TMP组、TMP组相比,p38MAPK蛋白表达量明显升高,组间具有明显的统计学差异（P<0.05）;而GM+TMP组与生理盐水组、TMP组相比,蛋白表达无明显改变,不具有统计学差异（P>0.05）:同时,生理盐水组、TMP组相比蛋白表达量亦无明显统计学差异（P>0.05）,见表3-2。4.p38MAPK蛋白表达量与ABR结果的相关性分析豚鼠耳蜗p38MAPK蛋白水平表达量与click ABR阈值具有明显的直线相关趋势（r=0.795,P=0.018<0.05）,同时p38MAPK蛋白水平表达量与80dBnHL给声强度下的III波潜伏期亦有明显的直线相关趋势（r=0.864,P=0.006<0.05）,但与幅值的相关性不明显,说明p38MAPK蛋白表达量越多,ABR阈值改变越大,80dBnHL给声强度下的Ⅲ波潜伏期越延长,即p38MAPK蛋白的表达程度决定了豚鼠的听力情况;见表4-1。5.耳蜗切片HE染色结果生理盐水组耳蜗组织形态正常;GM组Corti氏器严重变形,外毛细胞肿胀、变形,螺旋神经节内有大量细胞缺失,出现空泡样变;GM+TMP组Corti氏器毛细胞散在缺失,螺旋神经节形态结构均有不同程度病理改变、细胞数量有所减少,但均较GM组损伤轻;TMP组Corti氏器中的毛细胞和螺旋神经节上的细胞形态结构均基本完整、变化较轻,见附图2。[结论]1.庆大霉素可导致豚鼠听功能下降,内耳细胞形态改变,p38MAPK蛋表达增加,且p38MAPK蛋白表达与听功能,内耳细胞形态改变具有明显的相关性,证实p38MAPK信号通路很可能是庆大霉素致聋的重要因素之一。2.TMP可以有效抑制内耳组织p38MAPK蛋白表达,改善听功能,从而起到防治庆大霉素耳毒性的作用。
陈炜[5]（2013）在《基于耳蜗微循环变化的听器爆炸冲击波损伤效应评估及影响机制研究》文中提出在身体各器官中，听器由于其结构和功能，是对冲击波损伤最为敏感的器官[1,2]，在遭受冲击波暴露时极易受到损害，常导致长期的耳聋、耳鸣等后遗症。致伤初期对各种爆炸物的致伤效能的判断、伤情的准确评价和合理的处理措施往往对预后产生显着的影响。然而由于爆炸物种类的不同、爆炸环境的复杂性以及人体各个器官对冲击波的耐受程度的差异使爆炸冲击伤的伤情多样而复杂。听器虽是对冲击波损伤最为敏感的器官，但其伤情往往被其他症状所掩盖，在较为危重的情况下，治疗和处理措施主要集中于生命支持的器官和系统。因此早期如何准确快速地评价听器损伤的伤情，及时地采取合理有效的处理措施成为预防和治疗听器爆震伤的重点和难点[3-5]。在听器冲击波损伤的预防和处理中，早期对伤情的准确评估和处理十分重要。而对于各种爆炸物和爆炸环境的致伤效能和因素的判断可以对伤情评估提供重要参考。以往的评测标准中由于中耳伤情，尤其是鼓膜伤情较为敏感并易于检查，成为评测的重要指标。然而近年来许多学者对鼓膜穿孔在听器损伤评估中的有效性提出了质疑。究其原因在于鼓膜个体差异较大，人员在爆炸现场中的位置、面向以及防护设备及措施等均对鼓膜伤情产生影响。但由于缺乏更好的指标与方法，在爆炸现场的初步伤情评估中，鼓膜损伤依然是重要的评估指标。在此情况下，除了对伤者伤情的评测，对致伤武器的致伤效能评估显得非常重要，然而由于现代武器的发展，以及作战环境的变化，人员防护的进步，武器的致伤效能评估也趋于复杂。在各种损伤的生物效应评测中目前依然主要采用动物实验为主，但动物实验存在与人体结构差别大，个体差异性明显、结果不稳定、检测成本高、操作复杂费时等影响因素。因此如何找到更可靠、有效及简便的替代方法成为目前急需解决的问题。在听觉器官的爆炸冲击波损伤中，目前研究多集中于即时发生的中耳及内耳结构损毁，虽然对于距离爆炸点较近或者受到高强度爆炸物致伤的伤者来说，耳部的解剖结构破坏对于听觉器官的损伤是明显的，但这时往往伴随有全身其他部位、器官和系统的损伤，处理的重心也需要集中到重要的生命支持器官上，而此时听觉器官损伤的恢复程度相对也比较有限，并且对于整个爆炸环境来说受到中轻度冲击波致伤的患者相对更多，对于这些伤者听觉器官的损伤相对更加明显。因此对这些伤者的伤情评估和处理中听觉器官的损伤就显得比较重要。以往的研究中通过对听器爆炸伤的回顾性分析发现对伤者的初步伤情检测结果往往与后期的病情不一致，中耳结构的损伤也与听觉功能的损失不符，对于这些情况的出现许多研究者都提出了自己的假说，但都说明了在听觉器官的爆炸冲击波损伤中除了即时发生的结构破坏外同时也有其他的因素影响其病理过程。对这些影响因素的深入研究对于听觉器官的爆炸冲击波的致伤机理和病理过程的充分了解具有十分重要的意义。近年来在听觉器官的临床病理学研究的发展也促进了噪音性耳聋和听器冲击波损伤的研究，也有不少学者提出许多新的理论，其中代谢因素在内耳损伤中的作用也越来越受到重视，但对于耳蜗局部代谢十分重要的耳蜗循环功能由于受到检测核研究方法的限制，其在例如冲击波致伤条件下的耳蜗急性损伤中的作用依然没有一致看法。在以往的研究中认为耳蜗循环对于耳蜗的局部环境的稳定和生理功能的维持具有十分重要的意义，而耳蜗的微血管系统不仅给耳蜗的局部代谢提供能量，排除代谢废物，而且对于保持内外淋巴液的离子浓度差和局部张力等均具有十分重要的作用。同时由于耳蜗的局部血液循环系统与其他器官系统具有明显差异，无论在微血管的结构和调节特征等均有自身的独特之处。耳蜗局部的微血管缺少平滑肌细胞，也缺乏肾上腺素能神经的支配，因此交感神经系统的调节作用较微弱，同时由于缺乏有效的侧枝循环，代偿能力较差，耳听觉系统生理活动较为活跃，氧耗量较高，因此对于缺血、缺氧的耐受能力较低。这也是耳蜗循环障碍在许多耳蜗病损中成为主要的发病机制的原因之一。而在耳蜗局部的循环调节中，一氧化氮（NO）被认为是关键的调控因子，作为一种重要的血管舒张因子，NO通过NO/cGMP途径可以明显减弱由于ATP激活的细胞内钙离子浓度的升高。在各种刺激条件下，多种细胞均可合成NO以调节耳蜗生理和血液供应。NO对耳蜗血流的调节主要是通过耳蜗侧壁的血管（血管纹血管）进行调节，从局部血管的分布密度来看这种调节是较为快速和有效的。在爆炸冲击波致伤条件下各种细胞代谢活动的增加以及内环境的紊乱对于血液供应也比较高，而这时保持耳蜗局部血流的稳定也尤为重要，耳蜗由于较强的自我调节能力，此时的血流变化也将直接影响到耳蜗的病理变化过程。在听觉器官爆炸冲击波的损伤评估中，由于冲击波能量集中，作用时间短，爆炸环境往往较为复杂，因此伤情判断难以全面。以往的评估标准主要是鼓膜和中耳的结构性破坏，以及对听觉功能的简单检测结果。由于这些标准在实际应用中常常造成对伤情判断的遗漏和偏差，越来越多的研究者对其有效性提出了质疑。然而由于对听觉器官的爆炸冲击波损伤的病理过程和致伤机理研究目前多停留于局部组织的结构性损毁和功能性变化，在局部代谢等方面的了解仍然不够深入。而研究中所采用的动物模型虽然较为成熟，但针对性不强。而在致伤后的处理和治疗方法上多是凭经验，并且往往集中在创伤治疗的常规处理，不仅缺乏针对性，并且治疗效果也不能确定。细胞损伤在机体的生理过程和病理变化往往是重要环节，在听觉器官中，内耳各种细胞的损伤也是各种听觉系统病变的基础，其中感觉上皮细胞和初级神经元细胞由于承担着神经冲动的产生和传输的主要责任，其活性细胞数量和细胞正常功能的保持对于维持正常的听觉功能至关重要。其中内耳毛细胞在基底膜上的分布特点与感知声波的频率特性密切相关，而与之保持神经联系的耳蜗神经元担负着神经冲动传导中转站的作用。因此对于内耳毛细胞的损伤规律和分布特点的了解对于耳蜗病理研究十分重要。而在内耳的病理学研究中，耳蜗循环障碍与氧化损伤、钙稳态失衡等病理过程密切相关。以往研究表明在耳蜗组织结构中的各种细胞对缺血缺氧的耐受能力也有较大的差异，其中最为敏感的是内毛细胞，因此感觉细胞损伤也成为耳蜗循环障碍对其听觉功能的影响的重要机制。在听觉系统的损伤和疾病中细胞凋亡作为细胞损伤的重要机制越来越受到重视，其中感觉细胞和初级神经元细胞也成为研究的重点。以往研究表明在听觉系统的各种损伤和疾病中，虽然发病机制和病理过程各不相同，但均有细胞凋亡参与其中，因此对听觉细胞和神经细胞在病理过程中凋亡发生的机制和调控因素的了解在预防和治疗听觉器官损伤和疾病中的作用也成为了研究者的共识本课题针对目前听器爆震伤评估方法研究中存在的个体差异性大、评测方法复杂、成本较高等情况，采用室温固化型羟基硅胶制成各种力学参数与活体鼓膜较为接近的人工鼓膜，并研制了相应的检测装置，从而使对各种爆炸物和爆炸环境致伤效能的评测更加简便和准确。为检测耳蜗微循环变化及其对听觉功能的影响，本课题采用了小当量爆炸物（160mg黑索金，RDX）作为爆炸源，应用针式激光多普勒血流仪、听觉诱发电位仪等，观察了听器爆震伤后耳蜗微循环及其听觉功能的变化，并同时检测了冲击波峰压值及持续时间等参数。探讨了冲击波能量与耳蜗微循环变化和听觉功能损伤之间的关系。为对比不同致伤因素对耳蜗循环及功能的影响，本课题同时检测了强噪音条件下耳蜗循环和听觉功能的变化。为进一步探讨耳蜗微循环变化的调控机制与影响因素，本实验建立了耳蜗微循环的调控动物模型，采用小剂量NOS抑制剂：L-NAME耳蜗圆窗注射后观察微循环在爆震伤后变化趋势的改变，并以人工外淋巴液作为对照。同时观察了NOS在耳蜗中的分布及变化，并采用TUNEL法观察了不同情况下耳蜗毛细胞的凋亡情况，探讨耳蜗微循环变化在听觉功能损伤中的意义。实验结果表明在该冲击波强度范围内中耳及内耳的解剖结构均有轻度至中度的损伤，即使在最远的距离动物听觉功能也有较为明显的损害。在全省循环没有明显影响的情况下耳蜗局部血流呈现先增加后恢复的相对短暂变化，该变化与冲击波强度密切相关，引起耳蜗血流变化的阈值约35kPa，低于该强度的冲击波对耳蜗的血流没有明显影响。在局部应用相同剂量NOS抑制剂15min后暴露于中低能量爆炸冲击波（前面实验证明该范围的冲击波可引起耳蜗血流的增加）后，耳蜗血流的增加趋势受到抑制并较应用前的正常灌流水平减少，说明通过局部应用NOS抑制剂对耳蜗的局部血流血流具有明显的抑制效果，同时也可有效抑制冲击波引起的耳蜗血流增加，与此抑制相对应的是听觉损伤的明显加重，虽然在正常未致伤条件下局部小剂量NOS抑制剂的注射及产生的循环抑制对听觉功能没有明显影响，然而在冲击波致伤条件下L-NAME组的听觉损失却与人工外淋巴组相比更为明显，表明了耳蜗血流在致伤后的增加对听觉功能的保护作用，同时也提示除了中耳及内耳的结构性损伤，耳蜗循环变化在听器冲击波损伤病理过程中的作用。而免疫组织化学检测结果显示NOS在耳蜗局部的广泛表达，并在微血管系统和耳蜗神经节局部有相对集中的表达。实验中发现了与耳蜗血流变化相对应的NOS在冲击波致伤后耳蜗表达的增强，以耳蜗底回和顶回最为明显，这也与耳蜗血管分布结果相一致，同时图像分析结果表明爆炸冲击波致伤后耳蜗局部的NOS表达与CBF变化相一致。以上结果均提示了NO在耳蜗冲击波致伤后血流变化中的调控作用。耳蜗细胞凋亡检测结果表明了冲击波致伤内外毛细胞、支持细胞、血管纹缘细胞和耳蜗神经元均有不同程度的凋亡，以外毛细胞较为明显。在凋亡细胞的分布上，约靠近圆窗细胞的凋亡发生率越高，这也说明了在耳蜗冲击波损伤中，细胞的凋亡对听觉的影响更多的集中于高频听力水平。而NOS的局部应用更加重了耳蜗细胞的凋亡，在凋亡细胞的分布上，耳蜗底回和顶回增加明显，此结果与免疫组织化学显示的NOS分布情况相一致。该结果也进一步证实了耳蜗循环功能在听器冲击波致伤后的病理发展和损伤进程中的作用。本实验的结果表明在听觉器官的冲击波致伤效能致伤后的伤情评估中，除了中耳及内耳的结构性损伤外还应该结合循环功能的因素。由此也可以认为耳蜗局部循环的障碍将会加重爆炸冲击波对听器的损害，而由于耳蜗微血管解剖分布的特点，耳蜗循环调节功能的障碍更多的体现于耳蜗两端，及底回和顶回，对应于高频听力和低频听力，因此由循环障碍导致的听觉功能损伤也较多地表现为以上两部分听力，这也造成了这种损伤在平时难以发现。这也解释了在听器爆炸冲击波损伤中部分伤者的听觉损伤在很多年之后才被发现。而本实验中L-NAME组的毛细胞凋亡分布情况也与梅尼埃病、老年性聋等以循环障碍为主要发病原因的听觉损伤特点相一致，均表现为听阈的低频高频损失较多的M型听力曲线。该结果也提示我们在爆炸伤患者的伤情检测和评价中，除常规检查外还应特别注意伤者的循环功能，同时对于听力学检查，除常规的语言频率检查外，对于高频和低频听力也应该一并检查，以免对于由于循环造成的听器损害造成遗漏。而本实验中建立的耳蜗局部循环调控动物模型也为将来的耳蜗循环生理和病理研究提供有效的模版。本实验的结果也为冲击波损伤的评测方法和标准提供了新的参考，同时也为听器爆震伤的预防和治疗方法以及药物的选择提供新的思路。本课题研究的主要结果和结论如下：1.体外人工鼓膜检测装置各项物理参数和对冲击波的传导与耐受能力与人体鼓膜较为接近，具有较高的实用意义。2.爆炸冲击波致伤后耳蜗局部血流呈现先增加后恢复的相对短期的变化过程，该血流变化与冲击波强度具有明显的量效关系，引起耳蜗血流变化的冲击波强度阈值约35kPa。3.爆炸冲击波致伤后的耳蜗血流增加对听觉功能具有一定的保护作用，NOS抑制剂在耳蜗的局部应用对耳蜗血流在冲击波致伤致伤后的变化有明显的抑制作用，该抑制将会加重听觉功能在爆炸冲击波作用后的损伤。4. NOS在爆炸冲击波致伤后的耳蜗表达明显增强，与耳蜗血流变化相一致，结合NOS抑制剂的作用说明NO血流变化中具有重要的调控作用。本实验不仅为耳蜗循环病理研究提供了新的动物模型也为听觉器官临床防治的药物选择提供了新的思路。5.冲击波致伤后耳蜗细胞凋亡率明显增加，并与冲击波强度变化具有显着相关性。对耳蜗血流的抑制将会加重耳蜗感觉细胞和神经元的凋亡，其分布与NOS分布相一致，说明耳蜗血流变化对耳蜗细胞损伤的影响。
李永贺[6]（2013）在《盐酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蜗缺血—再灌注损伤作用及其机制》文中进行了进一步梳理听力障碍是影响公众身体健康和生活质量的重要因素,数以亿计的人受到威胁。世界卫生组织2013年2月27日在日内瓦表示,全世界有3.6亿人患有耳聋或听力障碍,占全球人口的5%,其中三分之二在发展中国家。中国是世界上最大的发展中国家,有13亿人口,听力障碍残疾人有2057万,占全国人口的16.79%o,绝大部分为感音神经性聋。感音神经性聋的病理改变主要是毛细胞损伤、螺旋神经节、支持细胞及神经末梢的器质性改变,发病原因公认有缺血、病毒感染、耳毒性药物中毒及老年性退行性变等,尤其缺血因素最为常见。而血流障碍中只有少数为单纯的缺血损伤,大部分是缺血后的再灌注损伤。例如突发性耳聋,目前多认为是内耳微循环障碍所致的感音神经性聋。有研究指出缺血后再灌注造成的损伤大于单纯缺血造成的损伤。所以探讨内耳缺血／再灌注损伤（I/RI）的机制将非常有利于内耳疾病的研究。盐酸椒苯酮胺（piperphentonamine hydrochloride,简称椒苯酮胺,PPTA）是由中国医学科学院药物研究所合成筛选出的化学创新药。相关研究表明椒苯酮胺对缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用,是钙增敏剂类强心药及心肌保护剂。另外有研究表明其对缺血再灌注损伤脑组织也有保护作用,但国内外尚无椒苯酮胺抗内耳缺血再灌注损伤作用的研究。本实验从听觉功能、细胞形态、炎性因子及细胞凋亡四个方面对豚鼠耳蜗的（I/RI）进行研究,旨在探讨椒苯酮胺对内耳（I/RI）的保护作用及可能机制,为椒苯酮胺用于缺血性内耳疾病的治疗提供药理学依据。本研究分为四个部分：第一部分耳蜗缺血/再灌注（I/R）豚鼠模型的建立目的建立豚鼠耳蜗缺血/再灌注损伤模型,探讨豚鼠耳蜗缺血/再灌注损伤后听功能改变。方法将24只健康、耳廓反射灵敏,体重200-250g豚鼠随机分成3组,分别为正常组、空白对照组、缺血再灌注组。缺血再灌注模型通过暂时性微动脉夹夹闭双侧椎动脉、结扎线活结结扎右侧颈总动脉,实验中激光多普勒检测耳蜗血流（CoBF）。各组动物分别于手术前、缺血再灌注6h、24h、48h行听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）测定,观察ABR各波潜伏期、Ⅰ—Ⅲ波间期和Ⅲ波阈值。结果正常组、假手术组术前、术后ABR阈值无显着变化;缺血再灌注组再灌注6小时、24小时后ABR闽值显着升高（P<0.05）,24小时达到高峰,48小时ABR阈值有所恢复,但未恢复正常。结论通过暂时性微动脉夹夹闭双侧椎动脉及右侧颈总动脉,夹闭1小时制造缺血模型,松开三条动脉制造再灌注模型。可致耳蜗损伤,表现为听功能下降,在再灌注后6h、24h、48h,以24h听阈最高,即耳蜗损伤最为严重。第二部分PPTA对耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用及耳蜗组织扫描电镜和透射电镜观察目的探讨盐酸椒苯酮胺（PPTA）对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后听功能及耳蜗形态的影响。方法采用前述的缺血再灌注模型,将32只豚鼠随机分为4组,每组8只,每组4只用于扫描电镜观察,剩余4只用于透射电镜观察。分为正常组,假手术组,缺血再灌注对照组,缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组。缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组再灌注后立即经股静脉注射盐酸椒苯酮胺,缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射。测量实验前后各组的听性脑干反应（ABR）波Ⅲ反应阈的变化。24小时迅速断头取听泡,,在扫描电镜、透射电镜下观察耳蜗结构。结果1、正常组、假手术组实验前后ABR波Ⅲ反应阈值无显着变化（P>0.05）,缺血再灌注对照组,造模成功后ABR波Ⅲ显着升高（P<0.05）,缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组,造模成功后ABR波Ⅲ升高,但低于缺血再灌注对照组（P<0.05）。2、扫描电镜下观察耳蜗组织的形态学变化：正常组及空白对照组豚鼠耳蜗基底膜居外侧3排外毛细胞,1排内毛细胞呈刷状,排列整齐,内、外毛细胞纤毛排列整齐,无缺失、倒伏。缺血再灌注对照组外毛细胞肿胀、缺失,纤毛排列紊乱、倒伏,部分缺失。缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组少量外毛细胞有纤毛倒伏。3、透射电镜下观察：正常组及空白对照组耳蜗毛细胞细胞核圆、核染色质分布均匀,线粒体形态正常,分布均匀,毛细胞突触结构清晰。螺旋神经节神经元未见明显脱髓鞘改变,血管纹内皮细胞核呈梭形；IR组耳蜗毛细胞核边界不清,可见固缩、边集现象,突触结构消失。螺旋神经节可见大量脱髓鞘改变。血管纹内皮细胞核可见固缩、边集现象,呈现充血改变；缺血再灌注+盐酸椒苯酮胺组毛细胞核边界清楚,核染色质分布均匀,线粒体形态分布均匀,无明显肿胀,突触结构尚清晰。螺旋神经节可见少量脱髓鞘变。血管纹内皮细胞核膜完整,无固缩、边集现象。结论PPTA对豚鼠耳蜗的缺血再灌注听力损伤有保护作用,并且可以防止耳蜗缺血再灌注损伤后毛细胞的损伤缺失。第三部分盐酸椒苯酮胺对缺血再灌注后IL-1β和TNF-α的mRNA表达的影响目的1.探讨耳蜗炎性反应与缺血再灌注损伤的关系。2.探讨缺血再灌注后豚鼠耳蜗IL-1β和TNF-α的mRNA的表达与炎性反应的关系。3.探讨PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法采用前述的缺血再灌注模型,将24只豚鼠随机分为4组,每组6只,分别为正常组、假手术组、缺血再灌注对照组和缺血再灌注PPTA组。缺血再灌注PPTA组于缺血1小时再灌注后立即经股静脉注射盐酸椒苯酮胺（10mg/kg）,缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射,24小时后取标本。用RT-PCR法检测IL-1β和TNF-α的mRNA的表达。用SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析,若满足方差齐性,用LSD检验比较组间差异,若不满足方差齐性,用Dunnett’sT3比较组间差异,P<0.05为有统计学意义。结果缺血再灌注对照组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量显着高于正常组和假手术组（P<0.001）；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量显着低于缺血再灌注对照组（P<0.001）；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织IL-1βmRNA表达量与正常组差异无统计学意义（P=0.056>0.05）。缺血再灌注对照组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量显着高于正常组和假手术组（P<0.001）；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量显着低于缺血再灌注对照组（P<0.001）；缺血再灌注PPTA保护组耳蜗组织TNF-α mRNA表达量高于正常组（P=0.009<0.05）。结论1. PPTA具有拮抗耳蜗组织缺血再灌注损伤作用2. PPTA可能通过抑制炎性反应实现对耳蜗缺血再灌注损伤的拮抗作用第四部分PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1的mRNA表达的影响目的：1.观察缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗细胞凋亡的情况。2.对缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗Fas蛋白、caspase-1的mRNA的表达与细胞凋亡间的关系进行分析。3.探讨PPTA对豚鼠缺血再灌注损伤后凋亡细胞的保护作用。方法：采用前述的缺血再灌注模型,将48只豚鼠随机分为4组,每组12只,分别为正常组、假手术组、缺血再灌注组对照组、缺血再灌注PPTA组（缺血60min行再灌注后立即经股静脉注射10mg/kg盐酸椒苯酮胺）,缺血再灌注对照组以等量生理盐水代替椒苯酮胺注射,24小时后取标本。用免疫组织化学法（SP）观察Fas蛋白的表达和分布,并用Motic图象分析系统分析单位面积下阳性细胞的积分光密度（IOD）；用TUNEL法观察细胞凋亡的情况；用RT-PCR法检测caspase-1的mRNA的表达,并比较PPTA干预前后的变化。运用SPSS13.0统计软件对实验数据进行方差分析,用LSD检验比较组间差异,P<0.05为有统计学意义。结果：免疫组织化学染色见正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组耳蜗血管纹、螺旋神经节、Corti器Fas表达为弱阳性,缺血再灌注组表达显着增强。IOD值显示正常组、假手术组、缺血再灌注PPTA组之间差异无统计学意义（P>0.05）,缺血再灌注组较其他三组显着增强（P<0.05）。TUNEL法显示正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组耳蜗各部位没有或仅有个别部位出现细胞凋亡,缺血及再灌注对照组耳蜗凋亡细胞明显增多,PPTA干预后凋亡细胞显着减少。缺血再灌注组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量显着高于正常组、假手术组和缺血再灌注PPTA组（P<0.001）；缺血再灌注PPTA组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量显着高于正常组（P<0.001）；正常组和假手术组耳蜗组织Caspase-1mRNA表达量差异无统计学意义（P=0.825）。结论：通过豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型PPTA及对照试验。正常组豚鼠耳蜗各部位Fas为弱阳性表达,无或罕有凋亡细胞。缺血再灌注组Fas表达增强,凋亡细胞增多,进行干预后使凋亡细胞显着减少。缺血再灌注耳蜗组织Caspase-1mRNA的表达显着增高,PPTA可部分但有效地降低Caspase-1mRNA的表达。提示细胞凋亡是耳蜗缺血再灌组损伤的一种细胞损伤形式,PPTA可能通过抑制Fas蛋白及Caspase-1mRNA的表达,通过减少细胞凋亡而对缺血再灌注损伤后的耳蜗起保护作用。
陈浩[7]（2013）在《盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制》文中指出听力障碍是一类常见疾病,严重影响着人类的身体健康和生活质量,据世界卫生组织（WHO）估计,全世界有轻度听力损失的人近6亿,2.5亿人患有中度以上听力损失,其中三分之二在发展中国家。而每出生700—1000个新生儿中,就有一个听障患儿。中国是世界上最大的发展中国家,13亿人口中听力障碍残疾人就有2780万,为各类残疾之首。能否找到有效的方法预防和治疗听力障碍,是我们共同面临的巨大挑战。听力障碍分传导性、感音神经性和混合性,绝大部分为感音神经性。感音神经性聋是耳鼻咽喉头颈外科学中常见病,是内耳及其神经传导通路一系列病变所致听力损失的总称,发病原因有遗传性、缺血性、耳毒性、感染性、老年性、噪声性、创伤性、代谢性、自身免疫、突发或特发性、中枢性、听神经病、肿瘤、功能性等,其中以缺血、病毒感染、耳毒性药物中毒及老年性退行性变等最常见。病理改变主要是耳蜗毛细胞损伤、螺旋神经节、支持细胞及神经末梢的器质性改变以及耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变或受损。耳蜗内包含两种类型感觉细胞：内毛细胞（IHC）和外毛细胞（OHC）,它们负责将声音转化为电信号进行传递,这些信号经过螺旋神经节神经元（SGC）换元传递到听觉脑干通路。而这些IHC、OHC和SGC都缺乏再生的能力,因此,耳蜗的任何损伤都会导致不可逆的听力损失。在耳蜗损伤所导致的听力障碍里,耳毒性药物所致损伤是当前临床治疗上的难题,众多研究围绕其发病机制及治疗展开,希望可以为临床治疗耳毒性药物损伤提供更好的方法。关于药物性损伤的机制,目前多认为与自由基损伤、钙离子超载等有关[2],其中氨基糖苷类所致的耳毒性感音神经性聋属于临床中常见的类型。氨基糖苷类抗生素（Aminglycosides, AmAn）具有抗菌谱广、杀菌抑菌作用强、价格便宜等许多适用于临床使用的优点,但因其具有耳毒性、肾毒性等严重的不良反应,限制了临床应用,在短期应用AmAn治疗的病例中,耳毒性发生率为20%,而在治疗结核及其他严重细菌（尤其是革兰阴性细菌）感染的长期应用中,耳毒性发生率可高达80%[3]。近年来由于结核和其他新的感染性疾病如抗艾滋病的发生率增高,使AmAn又有新的应用。有研究表明AmAn可与HIV中的RNA的逆转录病毒蛋白应答因子（RRE）结构域结合,使HIV的RRE. Rev（逆转录病毒蛋白）相互作用产生抑制,从而具有阻遏HIV复制的活性[4],使得AmAn的很多应用不可替代。属于氨基糖苷类抗生素的庆大霉素（gentamicin, GM）是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的一种杀菌力较强的广谱抗菌素,目前被广泛用于临床。GM由于廉价抗菌谱广,在临床广泛应用,以至出现了不少致感音神经性聋的病例。同时,因GM的肝肾毒性较其他AmAn小,使其成为是实验研究中制造感音神经性聋动物模型的理想药物。GM在机体内的药理学分布特点是不易进入胞内,不易透入关节腔,也不易透过血脑屏障,其主要集中在细胞外液,特别是内耳淋巴液。庆大霉素的内耳淋巴液的蓄积[7]构成了其耳毒性的生理基础,机制较为复杂,一直是国内外众多学者研究的热点。目前认为内耳毛细胞受损与氧有自由基、钙超载和启动凋亡等相关。氧自由基主要通过一系列的过氧化反应造成组织细胞的损伤,往往损害细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化,最终使生物膜受到严重损伤。郭玉芬等证实聚天冬氨酸酶对庆大霉素致耳蜗组织氧自由基的产生有抑制作用,从而拮抗了庆大霉素所致耳蜗毒性的发生。McFadden等已证实一种超氧化物歧化酶的类似物,可防止由庆大霉素引起的毛细胞损伤。氧自由基和钙超载除直接造成细胞损伤外还可导致细胞的凋亡[11]。也有学者证明,细胞凋亡是氨基糖苷类抗生素致聋的主要方式,细胞凋亡的“瀑布式”级联反应主要有两条途径：①细胞外途径,即死亡受体途径。②细胞内途径,研究比较多的是线粒体途径。但两种途径最终都依赖于Caspase-3的活化,caspase-3在凋亡级联反应中处于核心地位,是凋亡的最终执行者。Shimizu等通过研究发现凋亡抑制剂—钙蛋白酶和半胱天冬酶抑制剂可以阻止AmAn耳毒性的产生,促进前庭毛细胞的存活,表明凋亡与AmAn前庭耳毒性有着紧密关系。目前临床上仍然缺乏治愈感音神经性听力障碍和保护听觉功能的有效的方法。虽然近年来一些研究报道了哺乳动物甚至人的内耳前庭及耳蜗毛细胞在受伤后可能再生,但哺乳动物OHC、IHC和SGC再生的在体试验尚未取得成功。有研究提出耳聋基因概念,认为耳聋与线粒体DNA突变有关,发现tRNAIleA4317G同质性突变,确认A1555G和C1494T突变与感音神经性耳聋和氨基糖甙类耳聋有关。上述研究停留在实验阶段,尚未展开临床应用。感音神经性耳聋多数治疗效果不佳,大多数药物治疗无效的患者只能选择配戴助听器或行人工耳蜗植入术。当前人工耳蜗植入术可以赝复重度的感音神经性耳聋,但价格昂贵。所以,探索对各种因素导致内耳损伤的早期干预和有效治疗药物就显得尤为重要。由中国医学科学院药物研究所自主创新研制的化合物盐酸椒苯酮胺（peperphentonamine hydrochloride,PPTA）,3个发明专利已获授权,2个国内和1个国际PCT发明专利己申请。2008年获11类化学药品临床试验批件并已完成127例Ⅰ期临床试验。临床前研究提示其具有清除再灌注损伤时自由基,抑制脂质过氧化反应的作用。徐江平研究PPTA对脑细胞受损所产生的氧自由基具有清除作用,可增加SOD活力和GSH含量。也有实验表明PPTA有抗钙超载的作用,对心肌损伤线粒体有明显的保护作用。PPTA也可使线粒体膜流动性保持正常,明显减轻线粒体的超微结构损伤。而氧自由基和钙超载往往导致机体大多数组织和细胞损伤,而线粒体的损伤又可活化Caspase-3启动细胞凋亡。有研究表明PPTA具有显着降低Caspase-3mRNA的表达,表现出良好的抗调亡作用。这为PPTA用于感音神经性耳聋的干预和治疗奠定了基础。本研究以庆大霉素的耳毒性制造耳蜗损伤豚鼠作为实验动物,采用鼓阶开窗微孔注入技术和腹腔注射方法,观察PPTA对耳蜗的保护作用,通过听性脑干反应（ABR）、免疫组化（IHC）、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术（ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing, TUNEL）、蛋白质免疫印迹技术（Western blot）、扫描电镜（SEM）等方法,透射电镜（TEM）等方法检测ABR RT、PL、T-SOD、GSH、Caspase-3等指标及凋亡和坏死等形态学变化,探讨GM的耳毒性机理及PPTA对耳蜗损伤的保护机制,为感音神经性聋药物治疗提供新的实验依据。本研究分为以下三个部分：第一部分庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术的建立目的建立庆大霉素制造豚鼠的耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术,探讨在模型豚鼠上ABR的应用及听力学特征,并研究经鼓阶开窗手术对听力和耳蜗组织的影响。方法听力正常实验级豚鼠30只,随机分为三组：A组（Control group）:10只,生理盐水,等量,每日称重,按体重计算用量,肌注,28d；B组（GM group）:10只,硫酸庆大霉素注射液,120mg/（kg-d）,每日称重,按体重计算用量,肌注,28d。C组（Fenestration group）:10只,左耳行鼓阶开窗微孔注入手术,注入人工外淋巴液,正常饲养7d。A、B两组GM前1h及第28天测ABR;A、C两组术前及术后7d测ABR。数据以X±S表示,采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。对实验前后数据进行协方差分析,若实验前ABR反应阈对试验后ABR无影响,则用独立样本t-test检验两组前后差异,用配对样本t-test检验同一组前后差异。结束后将A,B,C组豚鼠断头取听泡,行扫描电镜（SEM）形态学观察、免疫组化（IHC）细胞染色观察。结果用药28天后,GM组比正常组ABR RT显着升高（t=18.108,P<0.001）；经鼓阶开窗微孔注入术7天后,C组和正常组ABR RT无显着差异（t=0.000, P=1.000）。IHC及SEM观察见GM组毛细胞纤毛倒伏、断裂、细胞缺失,细胞核出现固缩、棕染等,A组及C组未见这些现象。结论庆大霉素可以建立稳定的感音神经性聋动物模型；庆大霉素耳毒性体现在RT提高,耳蜗OHC、IHC、SGC、SV细胞坏死及凋亡；通过豚鼠耳蜗鼓阶钻孔开窗,微孔注入手术后对豚鼠听力及耳蜗组织没有产生明显影响。第二部分鼓阶微孔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤的保护作用及相关机制研究目的将PPTA经鼓阶开窗微孔注入技术注入豚鼠耳蜗,研究其对庆大霉素耳毒性的拮抗作用及氧自由基机制。方法听力正常豚鼠45只,分为三组：A组（Control group）15只,以等量生理盐水肌肉注射,连续3d；B组（GM group）15只,以GM160mg/kg.d,肌肉注射,连续3d；C组（PPTA+GM group）15只,以GM160mg/kg.,3d,每日GM1小时前,行双侧鼓阶开窗微孔技术注入PPTA （浓度2mg/ml）10μl。（注：每组都以10只做统计学分析,额外为扫描电镜做形态学观察用）。三组动物分别在用药前,第3天用药后测ABR。在最后一次测ABR每组取10只迅速断头取听泡取左侧耳蜗（n=10）行T-SOD活力检测,取右侧耳蜗（n=10）行GSH含量检测；各组ABR RT、T-SOD、GSH统计使用SPSS13.0分析软件,数据以X±S表示,用协方差分析处理数据,若实验前ABR反应阈对实验后无影响,对试验后数据进行单因素方差分析。每组剩余5只豚鼠耳蜗行扫描电镜（SEM）形态学观察。结果用药3d后,GM组ABR RT显着高于正常组（P<0.05）,GM组T-SOD活力、GSH含量显着显着低于GM+PPTA组（P<0.05）；经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA3d后,PPTA+GM组ABR RT明显高于Control组（P<0.05）,但显着低于GM组（P<0.05）。PPTA+GM组比GM组及正常组T-SOD活力、GSH含量显着低于正常组（P<0.05）,但显着高于GM组（P<0.05）。SEM观察见：GM后毛细胞纤毛倒伏、断裂、细胞缺失等,PPTA+GM组亦有此现象,但较GM组轻微,正常组未见这些现象。结论促耳蜗组织内产生过量OFR造成耳蜗组织细胞损伤,是GM耳毒性的一个重要原因。经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA可拮抗GM所致听力和耳蜗组织损伤；PPTA可以通过清除耳蜗组织内氧自由基和增强抗氧化能力从而发挥耳蜗保护作用。第三部分腹腔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳毒性拮抗作用及对耳蜗组织Caspase-3表达的影响目的研究PPTA全身给药对庆大霉素耳毒性的拮抗作用及相关机制。方法听力正常豚鼠45只,分为三组：A组（Control group）15只,以等量生理盐水肌肉注射,连续14d；B组（GM group）15只,GM120mg/kg.d,肌肉注射,连续14d；C组（PPTA+GM group）15只,PPTA10mg/kg.d腹腔注射+GM120mg/kg.d （1h后）,肌注,连续14d。三组动物在用药前1h,第14天用药后测ABR。在最后一次测ABR后所有动物迅速断头取听泡,以左侧耳蜗（n=10）行Western blot检测Caspase-3表达,统计使用SPSS13.0分析软件,数据以X±S表示,用协方差分析处理数据,若实验前ABR反应阈对实验后无影响,对试验后数据进行单因素方差分析。以右侧耳蜗行TUNEL染色,每组剩余5只一侧耳做扫描电镜另一侧耳做透射电镜观察。结果GM组、PPTA+GM组ABR RT显着高于Control组（P<0.05）, PPTA+GM组ABR RT显着低于GM组；Western blot结果表明用药后GM组豚鼠caspase-3表达显着增加（P<0.001）; PPTA+GM组caspase-3的表达显着高于Control组但显着低于GM组（P<0.001）。SEM/TEM和TUNEL观察见：GM组毛细胞损伤严重,耳蜗Corti器、侧壁的血管纹和螺旋神经节存在阳性细胞,出现了凋亡和坏死的形态学特征；而PPTA+GM组损伤较GM组明显减轻；Control组未见阳性细胞。而结论庆大霉素耳毒性所致耳蜗组织损伤中,凋亡与坏死并存,GM通过caspase-3途径参与了耳蜗细胞凋亡；PPTA具有拮抗GM耳毒性所致的耳蜗功能和结构损伤的作用；PPTA通过降低caspase-3蛋白表达,抑制凋亡,从而对豚鼠耳蜗组织起到保护作用。
冷辉[8]（2012）在《泻火化瘀通窍法改善豚鼠耳蜗微循环障碍的实验研究》文中提出目的：突发性耳聋是耳鼻咽喉科常见病、多发病，属中医“暴聋”范畴，目前发病率呈明显上升趋势。祖国医学在长期的耳聋诊治临床实践中摸索和积累了丰富的经验，许多复方制剂具有对耳蜗微循环障碍多靶点调控的作用，情志致病和心理因素已成为耳鸣耳聋的发病中和转归的重要因素之一。现代医学研究表明活血化瘀、改善微循环治疗有一定的疗效，因此将祖国医学清肝泻火法与活血化瘀法有机的结合起来形成泻火化瘀通窍法可能获得更好的疗效，大量的临床研究已经证实了这一点，其代表方剂为泻火治聋冲剂，经过大量的临床观察，有很好的疗效。本实验旨在（1）泻火化瘀通窍法对豚鼠耳蜗微循环障碍的影响。（2）泻火化瘀通窍法对光化学诱导法所致豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织VEGF及bFGFmRNA表达的影响。（3）泻火化瘀通窍法对光化学诱导法所致豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织iNOSmRNA、 MMP-2mRNA表达的影响。（4）泻火化瘀通窍法对光化学诱导法所致豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织Bcl-2mRNA、BaxmRNA及其蛋白表达的影响。通过以上实验来研究根据中医“火”、“瘀”致病理论创立的泻火化瘀通窍法对耳蜗微循环障碍的改善调控及分子生物学作用机制。材料与方法：动物造模与分组：采用光化学诱导法造模，造模成功后，将豚鼠分成5组，即正常组、模型组、行气组、活血化瘀组、泻火化瘀通窍组，每组10只。实验方法：正常组：予0.9%生理盐水4ml/只/天，每日分二次给药，共连续灌胃10天；模型组：术后12h，予0.9%生理盐水4ml/只/天灌胃，每日分二次给药，共连续灌胃10天；行气组：术后12h予行气中药4ml/只/天灌胃（含生药1g），每日分二次给药，共连续给药10天；活血化瘀组：术后12h，予活血化瘀药物4ml/只/天灌胃（含生药2g），每日分二次给药，共连续给药10天。泻火化瘀通窍组：术后12h，予泻火化瘀通窍药物4ml/只/天灌胃（含生药4g），每日分二次给药，共连续给药10天。实验指标：（1）各组豚鼠分别于造模后、用药前及停药后1天检测ABR阈值；（2）利用体式解剖显微镜进行螺旋韧带和耳蜗基底膜铺片，对血管纹和毛细胞进行观察；（3）利用TBA法和可见光法对耳蜗组织MDA及CAT进行检测；（4）采用实时荧光定量PCR方法检测耳蜗组织VEGF及bFGFmRNA表达；（5）)采用实时荧光定量PCR方法检测耳蜗组织iNOSmRNA、 MMP-2mRNA表达；（6）采用实时荧光定量PCR方法检测耳蜗组织Bcl-2及Bax mRNA表达；（7）采用Western blot蛋白免疫印迹法检测VEGF、Bcl-2及Bax蛋白的表达。统计学处理：采用SPSS11.5软件包进行统计分析，计量资料实验数据以平均值±标准差（x|-±S）表示，单因素方差分析（One-Way ANOVA）,组间比较采用最小显着差法（LSD）方法，以P﹤0.05，P﹤0.01作为显着性和极显着性差异的标准。结果：1、泻火化瘀通窍组治疗后ABR阈值明显低于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，且活血化瘀组治疗后ABR阈值明显低于行气组P﹤0.05；各组与正常组及模型组相比较均有显着性差异P＜0.01。2、正常组螺旋韧带血管纹显示基本正常；模型组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内大量微血栓形成，血管粗细明显不均，部分血管中断；行气组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内大量微血栓形成，血管粗细明显不均，部分血管中断；活血化瘀组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内微血栓，未见血管明显中断，较泻火化瘀通窍组微血栓多一些；泻火化瘀通窍组可见耳蜗螺旋韧带血管纹血管内少量微血栓，未见血管中断。3、耳蜗基底膜铺片显微结构显示：正常组外毛细胞分布呈三排，显示清晰，排列整齐，分布均匀，无明显缺失；模型组见外毛细胞大部分变形，排列严重紊乱，崩解破坏，大片缺损，细胞连接消失，纤毛倒伏严重；行气组见外毛细胞部分变形，出现较多片状缺损，部分细胞连接消失；活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐，部分变形，部分出现坏死；泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐，散在缺失，个别轮廓不清。模型组及行气组外毛细胞损伤较重，泻火化瘀通窍组及活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻，且活血化瘀组损伤较泻火化瘀通窍组明显。4、泻火化瘀通窍组MDA含量明显低于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，而CAT含量明显高于活血化瘀组及行气组P﹤0.05；与正常组及模型组相比较均有极显着性差异P＜0.01。5、各治疗组VEGFmRNA的表达均明显高于模型组p﹤0.01，且泻火化瘀通窍组高于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，活血化瘀组高于行气组P﹤0.05。泻火化瘀组VEGFmRNA的表达量约是活血化瘀组的2.4倍，约是行气组的6.8倍，约是模型组的8.8倍；VEGF蛋白表达为行气组与模型组VEGF/β-actin相比较无显着性差异P＞0.05；活血化瘀组与行气组VEGF/β-actin相比较有显着性差异P﹤0.05；泻火化瘀组与活血化瘀通窍组VEGF/β-actin相比较有显着性差异P﹤0.05。各治疗组bFGF mRNA的表达均明显高于模型组p﹤0.05，且泻火化瘀通窍组高于活血化瘀组及行气组p﹤0.05，活血化瘀组高于行气组p﹤0.05。泻火化瘀组bFGF mRNA的表达量约是活血化瘀组的1.4倍，约是行气组的4.2倍，约是模型组的6.3倍。6、正常组与各治疗组iNOSmRNA的表达均明显低于模型组p﹤0.05，且泻火化瘀通窍组iNOSmRNA的表达量与活血化瘀组接近p﹥0.05，模型组iNOSmRNA的表达约是行气组的1.3倍，约是活血化瘀组的4.7倍，约是泻火化瘀通窍组的4.6倍；各治疗组MMP-2mRNA的表达均明显低于模型组P﹤0.05，模型组MMP-2mRNA的表达是是行气组的1.5倍；是活血化瘀组的2.4倍；是泻火化瘀通窍组的7.3倍。7、各组Bax mRNA的表达均明显低于模型组P﹤0.05，且泻火化瘀通窍组低于活血化瘀组及行气组P﹤0.05，活血化瘀组低于行气组P﹤0.05。模型组Bax mRNA的表达量约是行气组的2.2倍；约是活血化瘀组的4.4倍；约是泻火化瘀通窍组的6.4倍；约是正常组的14.8倍。行气通组Bax mRNA的表达量约是活血化瘀组的2倍；约是泻火化瘀通窍组的3倍。活血化瘀组Bax mRNA的表达量约是泻火化瘀通窍组的1.5倍；各治疗组Bcl-2mRNA的表达均明显高于模型组P﹤0.05，且泻火化瘀通窍组高于活血化瘀组及行气通窍组P﹤0.05，活血化瘀组高于行气组P﹤0.05。泻火化瘀通窍组Bcl-2mRNA的表达量约是活血化瘀组的2.5倍，约是行气通窍组的6倍，约是模型组的17倍。8、蛋白表达：Bcl-2/Bax比值泻火化瘀通窍组﹥活血化瘀组﹥行气组﹥模型组，且各组比较均有显着性差异,p﹤0.05。结论：1、泻火化瘀通窍法具有加强改善微循环及加强抗脂质过氧化的作用。2、泻火化瘀通窍法可有效改善光化学法所致豚鼠耳蜗微循环障碍，且优于活血化瘀法3、单纯行气法对光化学法所致豚鼠耳蜗微循环障碍无明显效果。4、泻火化瘀通窍法能够明显提高豚鼠耳蜗微循环障碍耳蜗组织VEGF和bFGF的表达,优于活血化瘀法和行气法。5、泻火化瘀通窍法可能通过促进VEGF和bFGF的表达，来促进新生血管的形成，改善微循环障碍。6、泻火化瘀通窍法与活血化瘀法均能够抑制iNOS的表达，保护耳蜗组织的缺血损伤，明显优于行气法。7、泻火化瘀通窍法、活血化瘀法与行气法均能够抑制MMP-2的表达。8、Bcl-2和Bax基因和蛋白均参与豚鼠耳蜗微循环障碍损伤，而且损伤后Bcl-2/Bax比值下降是促进凋亡的重要因素。9、泻火化瘀通窍法和活血化瘀法均能通过显着提高Bcl-2/Bax比值，抑制细胞凋亡。10、泻火化瘀通窍法抑制细胞凋亡能力高于活血化瘀法。11、 iNOS与Bc1-2的表达关系密切，iNOS的表达与Bcl-2/Bax比值呈负相关。
曲雁,李云,丁大连[9]（2009）在《噪声性耳聋的研究进展》文中认为 噪声广泛存在于人类的生活和工作环境中,其引起的耳聋成为最常见的职业病之一。噪声对人体许多系统都能产生不良的影响,如神经系统、心血管系统、内分泌系统、消化系统等,都可因噪声刺激而受到不同程度的损害。但噪声最主要的危害还是损害人类的听觉系统,并造成永久性听觉障碍。本文
王斌[10]（2008）在《地塞米松拮抗声损伤及庆大霉素耳毒性的实验研究》文中进行了进一步梳理噪声性聋及药物性聋是常见的感音神经性聋,严重影响人们的生活质量。长期以来,对声损伤和庆大霉素耳毒性的防治一直是广大耳科工作者致力研究的课题。地塞米松作为合成的糖皮质激素,具有多种生理功能。已有研究发现,地塞米松能减小噪声及氨基甙类药物的耳毒性,但对这一现象机制的研究少有报道。地塞米松作为糖皮质激素,通过基因组途径及非基因组途径发挥作用。在基因组途径中,地塞米松通过与位于胞浆的糖皮质激素受体（Glucocorticoidreceptor,GR）结合,进而影响某些基因的转录与表达,因此了解GR在耳蜗的的分布很有必要。既往的研究应用酶联免疫吸附试验（ELISA）、原位杂交、免疫组织化学方法研究糖皮质激素在内耳的分布,而应用直观的免疫荧光技术分析GR在耳蜗的分布及声损伤对GR表达的影响还未见报道。Notch信号系统几乎涉及所有细胞的增殖、分化活动,Hes1（hairy andenhancer of split 1）为Notch的基本效应因子。Hes1 mRNA表达水平增高提示Notch信号活化,导致CDK（Cyclin-dependent kinases,周期性蛋白依赖激酶）抑制物p21Wafl/ Cip的聚集,而后者与细胞凋亡密切相关。噪声、地塞米松与hes1mRNA表达的关系可能是地塞米松拮抗声损伤的机制之一,对这一现象未见相关报道。地塞米松拮抗氨基甙类抗生素耳毒性的在体研究已有报道,离体实验避免了全身因素的干扰和影响,使研究途径更加便捷可靠。观察地塞米松是否拮抗庆大霉素对体外培养的Corti器的耳毒性,尚未见报道。抑制外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流可能是氨基甙类抗生素耳毒性的机制之一,地塞米松是否通过非基因组途径影响该电流,从而拮抗庆大霉素耳毒性,尚未见报道。因此,本研究的主要目的是探讨地塞米松对声损伤及庆大霉素耳毒性的影响及相关机制。以免疫荧光技术定位,荧光强度半定量分析为指标,探讨了糖皮质激素受体在豚鼠耳蜗的分布,声损伤后对其分布及各区域表达强度的影响。以听觉脑干诱发电位（ABR）,耳蜗形态学为指标探讨地塞米松减轻耳蜗声损伤的作用;用RT-PCR及荧光实时定量PCR技术,探讨噪声及地塞米松对豚鼠耳蜗hes1mRNA表达水平的影响。以免疫荧光技术定位,耳蜗形态学毛细胞计数为指标,探讨地塞米松减轻庆大霉素对离体培养的耳蜗Corti器的毒性作用。以听觉脑干诱发电位（ABR）为指标探讨地塞米松减轻庆大霉素耳毒性的作用;应用全细胞膜片钳记录技术探讨庆大霉素耳毒性及地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的离子通道机制。第一部分地塞米松拮抗内耳声损伤的实验研究一、糖皮质激素受体在豚鼠耳蜗的分布及声损伤对其表达的影响目的:研究GR在豚鼠耳蜗的分布及声损伤对豚鼠耳蜗GR表达的影响。方法:豚鼠随机分为二组:实验组予噪声暴露,噪声为白噪声,强度115dBSPL,暴露时间3h。暴露结束后2h断头剥取耳蜗。正常对照组不做处理,与实验组同时剥取耳蜗。制备耳蜗冰冻切片,免疫荧光技术观察豚鼠耳蜗GR表达情况,并进行荧光强度半定量分析。结果:（1）豚鼠耳蜗GR主要的阳性部位在螺旋韧带、血管纹、骨螺旋唇、Corti器以及螺旋神经节。螺旋韧带、血管纹、骨螺旋唇以及螺旋神经节等区域GR荧光强度无明显统计学意义（P＞0.05）,而上述各区域与Corti器的GR荧光强度相比,差异有显着意义（P＜0.05）。（2）声损伤后豚鼠耳蜗GR荧光强度在骨螺旋唇、corti器以及螺旋神经节较正常对照组无统计学意义（P＞0.05）,而螺旋韧带、血管纹区域荧光强度较正常对照组明显减低,有显着统计学意义（P＜0.01）。结论:GR在豚鼠耳蜗分布于螺旋韧带、血管纹、corti器和螺旋神经节,其中螺旋韧带、血管纹区域表达最强,corti器区域表达最弱;声损伤降低耳蜗各区域GR的表达,以血管纹、螺旋韧带最显着。二、地塞米松拮抗耳蜗声损伤及对豚鼠耳蜗hes1表达水平的影响目的:探讨地塞米松拮抗声损伤及与耳蜗hes1 mRNA的表达的关系。方法:在预实验的基础上,豚鼠随机分为5组,空白对照组,NS ip qd+植物油im qd;噪声组（N）,NS ip qd+植物油im qd+噪声暴露;地塞米松+噪声组（Dex+N）,Dex ip qd+植物油im qd+噪声暴露;RU486+噪声组（RU+N）,NS ip qd+RU486 im qd+噪声暴露;地塞米松+RU486+噪声组（Dex+RU+N）,Dex ip qd+RU486 im qd+噪声暴露。其中地塞米松剂量1mg/kg,浓度0.5mg/ml;RU486剂量20mg/kg,浓度25mg/ml。药物作用时间均为5d。噪声暴露于白噪声3小时,强度115dB SPL。噪声暴露结束即刻处死。取下颞骨,冰盒中取出耳蜗,用荧光实时定量PCR（real-time-PCR）检测耳蜗组织hes1 mRNA的表达。同样分组条件下,在噪声暴露前、噪声暴露结束后24小时测定Click和短纯音（2、4、6、8kHz）ABR反应阈值,空白对照组在实验开始和结束各测定一次ABR。各组动物进行耳蜗NBT染色及基底膜铺片。结果:（1）白噪声115dB SPL,暴露3h,促进豚鼠hes1 mRNA表达增加约3倍;地塞米松预处理5d,可以使hes1 mRNA表达水平接近于对照组。Dex-RU486-noise组hes1 mRNA表达水平接近于noise组,说明RU486基本上阻断了地塞米松下调豚鼠耳蜗hes1 mRNA表达水平的作用。（2）各组ABR平均阈移:空白对照组阈移为0.5～1.40dB;噪声组click阈移为29.56dB,短纯音（2、4、6、8kHz）阈移为32.75～34.78dB;地塞米松+噪声组click阈移为11.46dB,短纯音（2、4、6、8kHz）阈移为12.75～15.85dB;RU486+噪声组click阈移为26.93dB,短纯音（2、4、6、8kHz）阈移为30.15～33.26dB;地塞米松+RU486+噪声组click平均阈移为27.38dB,短纯音2、4、6、8kHz阈移为30.26～33.52dB。噪声组、地塞米松+RU486+噪声组分别与地塞米松+噪声组相比,全频的ABR阈移均有显着性差异（p＜0.05）。（3）耳蜗基底膜NBT染色显示噪声组底回损伤较重,地塞米松+噪声组损伤轻微。结论:地塞米松对耳蜗声损伤具有拮抗作用;下调耳蜗hes1 mRNA的表达水平,减少细胞凋亡,可能是地塞米松对声损伤发挥保护作用的机制之一。第二部分地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的实验研究一、地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的离体实验研究目的:采用Corti器体外培养的方法,观察地塞米松是否对庆大霉素的耳蜗毒性具有拮抗作用。方法:成功建立耳蜗Corti器体外培养系统后,选取出生3d的SD大鼠,随机分为3组,正常对照（Control）组,进行Corti器体外培养,72h后中止培养;庆大霉素（GM）组,培养48h后加入庆大霉素液（浓度0.5mmol/L）,作用24h后中止培养;地塞米松+庆大霉素（Dex+GM）组,培养24h后加入地塞米松溶液（浓度100ng/mL）,培养48h后加入庆大霉素液（浓度0.5mmol/L）,培养72h后中止培养。各组中止培养后,Rhodamine-phalloidin染色,免疫荧光技术观察Corti器毛细胞生长状况。结果:正常对照（Control）组毛细胞无明显缺失;庆大霉素（GM）组外毛细胞有明显缺失,而内毛细胞基本无明显改变,三排外毛细胞中以内两排损害较重;地塞米松+庆大霉素（Dex+GM）组可见外毛细胞的缺失程度明显减轻,内毛细胞基本无明显改变。结论:地塞米松预处理对离体耳蜗Corti器的庆大霉素耳毒性具有拮抗作用。二、地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的电生理学研究目的:探讨地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的离子通道机制。方法:（1）豚鼠随机分为6组,生理盐水（control）组,生理盐水0.5ml,ip;庆大霉素（GM）组,庆大霉素80mg/kg,im;地塞米松低浓度（Dex-1）组,地塞米松0.2mg/kg ip;地塞米松高浓度（Dex-h）组,地塞米松1mg/kg ip;地塞米松低浓度+庆大霉素（Dex-1+GM）组,地塞米松0.2mg/kg ip,庆大霉素80mg/kg,im;地塞米松高浓度+庆大霉素（Dex-h+GM）组,地塞米松1mg/kg ip,庆大霉素80mg/kg,im。给药前及给药结束后,测定ABR反应阈,计算ABR阈移。（2）全细胞膜片钳技术记录单离外毛细胞钙敏感外向钾电流。分别观察0.1、1、10、100、1000umol/L庆大霉素对钙敏感外向钾电流的影响;全细胞膜片钳技术记录单离外毛细胞钙敏感外向钾电流。分别观察0.1、1、10、100、1000umol/L地塞米松对钙敏感外向钾电流的影响。结果:（1）生理盐水（control）组、Dex-1组和Dex-h的ABR平均阈移很小,为1.0～1.6dB;GM组click平均阈移为10.6dB,短纯音在5.0～21.0dB之间,并以6kHz及8kHz的阈移最为明显;Dex-1+GM组Dex-h+GM组click平均阈移为5.8～7.2dB,短纯音在2.5～5.2dB之间,与GM组相比有显着性差异（p＜0.05）。（2）庆大霉素以浓度依赖性方式抑制外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流;地塞米松以浓度依赖方式增大外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流。结论:地塞米松能够显着降低庆大霉素对豚鼠的耳毒性,并且对豚鼠听功能没有明显影响;庆大霉素抑制外毛细胞Ca2+敏感的外向K+电流,可能是急性耳中毒的机制之一;地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的作用可能是通过激活外毛细胞Ca2+敏感的外向K+通道的非基因组效应实现的。
二、豚鼠耳蜗外毛细胞的一氧化氮定量分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、豚鼠耳蜗外毛细胞的一氧化氮定量分析（论文提纲范文）
（1）葛根素对顺铂诱导小鼠耳毒性的防护作用研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）A666多肽介导主动靶向隐形纳米粒对顺铂耳毒性预防作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 载地塞米松A666 多肽修饰隐形纳米粒的制备和表征 |
| 1.仪器和材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 A666 多肽修饰的载地塞米松的聚乙二醇聚乳酸纳米粒(DEX-NP)的构建 |
| 2.2 A666-DEX-NP的表征 |
| 2.3 A666-DEX-NP的体外释放特性 |
| 2.4 A666-DEX-NP的体内释放特性 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 A666-DEX-NP的表征及其理化性质的测定 |
| 3.2 A666-DEX-NP体外释放特性 |
| 3.3 A666-DEX-NP体内释放特性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 A666-DEX-NP靶向性及抗顺铂耳毒性活性研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 1.3 细胞和动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 A666-DEX-NP靶向性 |
| 2.2 A666 靶向纳米粒抗顺铂耳毒性活性研究 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 A666-DEX-NP的靶向性研究 |
| 3.2 A666 靶向纳米粒抗顺铂耳毒性活性研究 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 A666-DEX-NP抗顺铂耳毒性及作用机制研究 |
| 1.仪器与材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 1.3 动物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 顺铂耳毒性动物模型的建立 |
| 2.2 A666 靶向纳米粒抗顺铂耳毒性 |
| 2.3 细胞内ROS水平测试 |
| 2.4 Western blot测定HEI-OC1 细胞中Cleaved-caspase-3和Bcl-2 表达水平 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 听性脑干反应 |
| 3.2 毛细胞计数 |
| 3.3 细胞内ROS水平测试 |
| 3.4 Western blot测定HEI-OC1 细胞中Cleaved-caspase-3和Bcl-2 表达水平 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 顺铂耳毒性作用机制及抗氧化药物预防研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 攻读学位期间获得的专利、成果 |
（3）补肾聪耳方对庆大霉素致聋大鼠耳蜗P38MAPK的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要符号表 |
| 前言 |
| 实验一 补肾聪耳方对庆大霉素致聋大鼠听力及耳蜗形态学影响..3 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 观察指标及意义 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 实验二 补肾聪耳方对庆大霉素致聋大鼠耳蜗P38蛋白的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 观察指标及检验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）川芎嗪对防治庆大霉素致聋豚鼠耳蜗p38MAPK表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一. 实验材料与方法 |
| (一.) 实验材料 |
| (二.) 实验方法 |
| (三.) 观察指标 |
| (四.) 统计学方法 |
| 二. 结果 |
| (一.) 实验组豚鼠的一般表现观察 |
| (二) 实验组听功能click ABR测试结果 |
| 1. 听功能Click ABR阈值检测结果 |
| 2. 80dB nHL给声强度下click ABRⅢ波潜伏期及幅值结果 |
| (三.) 实验组豚鼠耳蜗组织内p38MAPK蛋白表达检测结果 |
| (四.) click ABR阈值、潜伏期、幅值与p38MAPK蛋白含量相关性结果 |
| (五.) 实验组豚鼠耳蜗HE染色结果(见附图2) |
| 三、分析与讨论 |
| (一.) 氨基糖苷类抗生素中毒性耳聋的发病机制 |
| 1. 中医中药防治GM耳中毒中的作用 |
| 2. 西医在防治GM耳中毒中的作用 |
| 3. 听觉设备在药物性耳聋中的应用 |
| (二.) p38MAPK可介导庆大霉素对豚鼠的耳蜗性损伤 |
| 1. p38MAPK信号通路上下游信号调节 |
| 2. p38MAPK在庆大霉素耳中毒损伤中作用 |
| (三.) 中药川芎嗪可通过抑制p38MAPK的表达以拮抗GM的耳毒性作用 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（5）基于耳蜗微循环变化的听器爆炸冲击波损伤效应评估及影响机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 体外人工鼓膜在爆炸冲击伤评测中的应用 |
| 2.1 实验设备、材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 耳蜗微循环在爆炸冲击波损伤中的变化及其与冲击波能量间的关系和对听觉功能的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 NO 在耳蜗微循环变化中的调控作用以及对听觉功能的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 爆炸冲击波致伤条件下听觉器官细胞损伤机制研究：听觉细胞及耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及影响影响因素 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章、专利 |
| 致谢 |
（6）盐酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蜗缺血—再灌注损伤作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 豚鼠耳蜗缺血再灌注模型的建立及ABR应用 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PPTA对耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用及耳蜗组织扫描电镜和透射电镜观察 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PPTA对耳蜗缺血再灌注后IL-1β和TNF-α mRNA表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 PPTA对缺血再灌注损伤后豚鼠耳蜗细胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1 mRNA表达的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 缩略词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间的论文发表 |
| 致谢 |
| 统计合格证明 |
（7）盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 参考文献 |
| 第一部分 庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术的建立 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二部分 鼓阶微孔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤的保护作用及相关机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三部分 腹腔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳毒性拮抗作用及耳蜗组织Caspase-3表达的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 统计学认证 |
（8）泻火化瘀通窍法改善豚鼠耳蜗微循环障碍的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照 |
| 文献综述 |
| 实验一 泻火化瘀通窍法对豚鼠耳蜗微循环障碍的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 实验二 泻火化瘀通窍法对豚鼠耳蜗微循环障碍组织 VEGF 及 bFGFmRNA 表达的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 实验三 泻火化瘀通窍法对豚鼠耳蜗微循环障碍组织 iNOSmRNA 和 MMP-2mRNA 表达的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 实验四 泻火化瘀通窍法对豚鼠耳蜗微循环障碍组织 Bcl-2mRNA、Bax mRNA 及其蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）地塞米松拮抗声损伤及庆大霉素耳毒性的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 地塞米松拮抗内耳声损伤的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 糖皮质激素受体在豚鼠耳蜗的分布及声损伤对其表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验二 地塞米松拮抗声损伤及对豚鼠耳蜗hesl表达水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的离体实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验二 地塞米松拮抗庆大霉素耳毒性作用的电生理学研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 附录 在读期间发表的论文及参加的会议 |
| 致谢 |
四、豚鼠耳蜗外毛细胞的一氧化氮定量分析（论文参考文献）
- [1]葛根素对顺铂诱导小鼠耳毒性的防护作用研究[D]. 马婷婷. 锦州医科大学, 2019(01)
- [2]A666多肽介导主动靶向隐形纳米粒对顺铂耳毒性预防作用研究[D]. 汪雪玲. 上海交通大学, 2018
- [3]补肾聪耳方对庆大霉素致聋大鼠耳蜗P38MAPK的影响[D]. 朱丽军. 山西中医药大学, 2018(01)
- [4]川芎嗪对防治庆大霉素致聋豚鼠耳蜗p38MAPK表达的影响[D]. 韩明训. 浙江中医药大学, 2015(01)
- [5]基于耳蜗微循环变化的听器爆炸冲击波损伤效应评估及影响机制研究[D]. 陈炜. 第三军医大学, 2013(11)
- [6]盐酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蜗缺血—再灌注损伤作用及其机制[D]. 李永贺. 南方医科大学, 2013(03)
- [7]盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制[D]. 陈浩. 南方医科大学, 2013(03)
- [8]泻火化瘀通窍法改善豚鼠耳蜗微循环障碍的实验研究[D]. 冷辉. 辽宁中医药大学, 2012(06)
- [9]噪声性耳聋的研究进展[J]. 曲雁,李云,丁大连. 河北医科大学学报, 2009(08)
- [10]地塞米松拮抗声损伤及庆大霉素耳毒性的实验研究[D]. 王斌. 复旦大学, 2008(05)