一、重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究（论文文献综述）
张宏鹏[1]（2016）在《新型慢病毒包装方法及转基因鸡生物反应器研究》文中指出近十几年来,转基因鸡的制备在人们的不懈努力下,取得了长足的进步。这一领域之所以能被人们广为关注,不仅仅因为鸡是一种理想的模式动物,更为重要的是转基因鸡可以改造成为高效生产人源药用蛋白的生物反应器。禽输卵管生物反应器比传统工业反应器和哺乳动物细胞生物反应器更加高效而廉价已经成为业界的共识。这也使转基因鸡的研究成为科研领域的一大热点和生物制药行业发展的新方向。由于鸡胚胎发育的特殊性,在转基因鸡生物反应器的制备中必需使用有别于哺乳类动物生物反应器的特殊手段。目前看来,使用慢病毒载体制备转基因鸡是最可靠的实验方法。但是由于传统慢病毒包装方法的巨大缺陷,以及鸡胚注射和后续筛选中存在的诸多问题,使得成功制备转基因鸡生物反应器的案例仍然较少被报道。在本实验的第一部分中,我们使用了以聚乙烯亚胺（PEI）为转染介质,以聚乙二醇6000（PEG6000）为离心浓缩介质的慢病毒生产方法,并对浓缩后的慢病毒进行滴度测定。此外也对可能影响慢病毒滴度的几个关键因素如转染初始细胞数、N/P、转染质粒DNA量、佐剂的选择等的作用进行了分析。实验结果说明在使用15cm培养皿生产慢病毒的条件下,转染质粒DNA总量10.5μg,N/P=20,PEI浓储液pH7.0-9.0,转染时293T细胞数0.5-2×107时,可以获得较好的慢病毒滴度。PEI作为一种新的转染试剂,可以替代磷酸钙和脂质体用于高滴度慢病毒的生产。在第二和第三部分中,我们通过对现有鸡胚开窗注射方法诸多细节的不断优化,以及后续的一系列检测手段,最终成功获得生殖腺嵌合型转基因鸡。实验结果说明,通过封口方式、封口膜种类、胚胎穿刺位置、开窗操作时间、开窗后的液封处理、防止污染的措施等方面的改进,我们将开窗注射孵化率提高到了 55%。在出雏个体中,转基因嵌合型个体所占比例提高到了 41.8%。在对所获得的31只嵌合体鸡进一步筛选后,我们最终获得了 4公4母共8只生殖腺嵌合型转基因鸡。综上所述,本实验研究表明,PEI作为一种新的转染试剂,可以替代磷酸钙和脂质体用于高滴度慢病毒的生产。与二者相比,PEI具有更低的操作门槛和更高的性价比,从而具有很高的使用价值,在未来一定具有广阔的使用前景。同时本实验也详细介绍了一套完整的制备转基因鸡输卵管生物反应器的方法,希望对广大科研人员有所帮助。
郭小娟[2]（2015）在《疫苗载体人腺病毒41型和5型在小鼠的免疫效果评价和体内分布研究》文中进行了进一步梳理腺病毒载体在基因治疗和重组疫苗研究中有着广泛的应用。腺病毒是无包膜的双链DNA病毒,人腺病毒（human adenovirus, HAdV）共有50多个血清型,分为A-G共7个组（种）,它们对机体的感染部位和引发的疾病类型各不相同。最常用的腺病毒载体是基于HAdV5构建的,HAdV5属于HAdV-C,主要感染上呼吸道,靶细胞是呼吸道上皮细胞,细胞表面的病毒受体是CAR。本实验室建立了HAdV41载体系统。HAdV41属于HAdV-F,被称为肠腺病毒,能引起腹泻,是天然的肠道病原；HAdV41的靶细胞可能是肠道上皮细胞,它的细胞受体还没有完全阐明。HAdV5与HAdV41的生物学特性存在较大差异,以它们为载体的重组疫苗在宿主引发的免疫反应可能不同。中东呼吸道综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）初次发现于2012年,是一种可引起类似于急性呼吸道综合征（SARS）疾病并有高致死率的新发人类冠状病毒。MERS-CoV已成为巨大的公共健康威胁,但目前还没有有效的疫苗或治疗方案来应对可能的MERS-CoV爆发。冠状病毒的刺突（spike, S）糖蛋白是病毒粒子外膜的特征性结构组分,在病毒吸附和进入靶细胞时发挥重要作用,是冠状病毒的主要中和抗原。本研究设计并构建了表达MERS-CoV S蛋白的重组HAdV41 （rHAdV41）和重组HAdV5 （rHAdV5）,采用灌胃和肌肉注射的免疫方式,在小鼠模型观察了细胞免疫和体液免疫效果。并构建了共表达绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）报告基因的重组腺病毒,利用活体成像技术和体外组织荧光素酶（luciferase）活力检测两种方法,检测了不同感染途径,在不同时间点,外源基因在小鼠体内各种组织的表达情况。1.疫苗载体在小鼠模型的免疫效果评价目的构建MERS-CoV重组腺病毒疫苗,并观察其在小鼠模型的免疫效果,为控制MERS-CoV的感染和传播探索可能的疫苗方案。方法在课题组已有研究基础上,将MERS-CoV S基因插入腺病毒E1缺失区,构建可以表达MERS-CoVS蛋白的rHAdV41和rHAdV5（HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S）,分别利用已有的包装细胞系293TE32细胞和293细胞进行拯救并扩增。同时构建了携带GFP基因的2种对照病毒HAdV41-GFP和HAdV5-GFP。Hirt法提取重组腺病毒基因组,通过酶切、PCR进行鉴定；Western blot和间接免疫荧光法（IFA）鉴定重组腺病毒感染细胞后外源蛋白MERS-CoV S蛋白的表达。扩增重组腺病毒,采用CsCl密度梯度超速离心纯化,采用消化法测定病毒颗粒数滴度,再通过有限稀释法测定其感染滴度。HAdV41-MERS-S以5×10.vp（viral particle）每只为免疫剂量,HAdV5-MERS-S以1×109Vp每只为免疫剂量,采用肌肉注射（i.m.）100μl每只、灌胃（i.g.）500μl每只两种给药途径免疫小鼠,4周后,处死半数小鼠,取血清测定IgG.IgA和中和抗体,血清、肺灌洗液、小肠、大肠测定IgA,脾和肺淋巴细胞测定细胞因子；16周后处死余下半数小鼠,同样对体液免疫和细胞免疫效果进行评价。结果成功进行了腺病毒质粒的构建和重组病毒的拯救。Hirt法提取重组腺病毒基因组后,酶切鉴定和PCR扩增目标序列的结果与预期一致;Western blot和间接免疫荧光检测结果显示,所得到的重组腺病毒可以表达MERS-CoV S蛋白。扩增纯化后得到2.3 ml HAdV41-MERS-S,其颗粒滴度为5.71×1011vp/ml,感染滴度为2.7×10.IU/ml（infectious unit per milliliter）；得到2.3 ml HAdV5-MERS-S,其颗粒滴度为3.57×1012 vp/ml感染滴度为1.3×1011IU/ml.同时成功制备纯化了对照病毒。经肌肉注射免疫小鼠,免疫4周后,实验组每组（n=5）100%小鼠体内都产生了MERS-S特异性的IgG抗体；用HAdV41-MERS-S免疫鼠有20%体内产生了MERS-S特异性的中和抗体,用HAdV5-MERS-S免疫,小鼠体内中和抗体检出率为100%；各组小鼠体内IgA抗体均未检测到；但脾细胞和肺淋巴结都可检测到抗原特异性T细胞应答。肌注免疫16周后,实验组抗原特异的IgG抗体、中和抗体和T细胞应答仍可检测到。经灌胃途径免疫,4周后,2种病毒载体实验组均有60%小鼠体内产生了MERS-S特异性的IgG抗体（n=5）；HAdV41-MERS-S免疫组,有40%小鼠体内产生了MERS-S特异性的中和抗体,HAdV5-MERS-S免疫组小鼠体内中和抗体检出率为60%；实验组血清、肺灌洗液、小肠和大肠都可以检测到抗原特异的IgA抗体,但抗原特异的T细胞应答未检出；16周后,实验组抗原特异的IgG、IgA和中和抗体仍可检测到。结论采用肌肉注射免疫途径,HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S单次免疫即可激发脾细胞和肺淋巴结的抗原特异性T细胞应答,且可持续数月,但IgA抗体并未检测到。采用灌胃免疫途径,HAdV41-MERS-S和HAdV5-MERS-S都可产生抗原特异的IgA抗体,在血清和多种粘膜表面均有检出；但抗原特异的T细胞应答未检测到。肌注和灌胃两种免疫途径均可有效激发小鼠产生IgG抗体和中和抗体。2.疫苗载体在小鼠模型的体内分布目的观察重组腺病毒HAdV41和HAdV5在小鼠模型的体内分布,为疫苗载体的安全性评价提供参考。方法分别以pLEGFP-C1和pGL4.17质粒为模板,用PCR扩增绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）报告基因,酶切后与空穿梭质粒的酶切产物连接,构建携带目的基因的穿梭质粒psh41GFP-T2A-Luc和psh5GFP-T2A-Luc。含目的基因的穿梭质粒经酶切、PCR和测序鉴定后,与骨架质粒共转化BJ5183感受态细胞,构建共表达GFP和firefly luciferase报告基因的重组腺病毒质粒pAdV41GFP-T2A-Luc和pAdV5GFP-T2A-Luc。用lipofectamine 2000分别转染包装细胞系293TE32细胞和293细胞,进行拯救和扩增,得到重组腺病毒HAdV41GFP-T2A-Luc和HAdV5GFP-T2A-Luc。Hirt法提取重组腺病毒基因组,限制性酶切和PCR进行鉴定；蛋白水平上,用重组腺病毒感染A549细胞,通过观察荧光和luciferase assay检测GFP和荧光素酶的表达。扩增的重组腺病毒采用CsCl密度梯度进行纯化,消化法测定病毒颗粒数滴度,有限稀释法测定感染滴度。HAdV41GFP-T2A-Luc和HAdV5 GFP-T2A-Luc分别以5×109Vp和1x109vp每只的感染剂量,采用肌肉注射（100μl每只）或灌胃（500μl每只）两种给药途径感染小鼠。在感染后4h、18 h、48 h、7d,利用活体成像技术进行活体观察荧光素酶的表达；在对应时间点每组处死2只小鼠,取17种共19样组织,提取活性蛋白后,用luciferase assay试剂盒检测荧光素酶在不同组织的分布。结果成功构建了重组腺病毒质粒并拯救出相应的重组病毒,在病毒基因组水平,限制性酶切和PCR鉴定结果与预期一致。感染A549后,荧光观察和luciferase活力测定结果显示重组病毒表达GFP和荧光素酶。扩增纯化后,得到1.65ml HAdV41GFP-T2A-Luc,颗粒滴度为7.6×1010vp/ml,感染滴度为2.9×108 IU/ml;得到2.11ml HAdV5GFP-T2A-Luc,颗粒滴度为4.2×1011vp/ml,感染滴度为3.1×1010 IU/ml。2种病毒经肌肉注射途径感染,活体成像和体外酶活测定的结果均表明病毒主要分布在注射部位,目的基因表达强,在肝和脾报告基因表达较弱检出,随着时间延长逐渐减弱。HAdV41GFP-T2A-Luc经灌胃途径感染小鼠,活体成像结果表明,仅在感染后18h,小鼠口鼻部可见较弱荧光,其他时间点或在其他部位未检测到；体外组织检测结果表明,在感染后4h和18h,在消化道（派氏结、小肠下段、大肠）可以检测到较弱的luciferase表达。HAdV5GFP-T2A-Luc经灌胃途径感染小鼠,活体成像结果表明,在感染后18h和48h,小鼠口鼻部可见较弱荧光；体外组织检测结果表明,在消化道（派氏结、小肠下段、大肠）、气管和肺可以检测到较弱的luciferase表达。结论在小鼠体内,HAdV41和HAdV5经肌注途径感染,主要分布在注射部位,少量分布在肝和脾；经灌胃途径感染,目的基因表达较弱,主要分布在消化道。总之,我们成功构建了携带MERS-CoV S基因的重组HAdV41和HAdV5,单次免疫小鼠,能够激发小鼠产生相应的体液免疫和细胞免疫；利用报告基因系统,观察了重组病毒感染后在小鼠体内的分布情况,部分解释了重组疫苗灌胃给药后机体产生免疫反应较弱的原因。本研究为MERS-CoV疫苗研发进行了有益的探索；首次观察了重组HAdV41灌胃后目的基因在小鼠体内的表达分布,丰富了HAdV41病毒学的内容,为HAdV41载体进一步开发利用打下了基础。研究结果同时提示小鼠不是理想的研究HAdV41口服感染的动物模型。
王玉梅[3]（2011）在《人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒载体的构建及其功能的相关性研究》文中研究说明与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene, PTEN）是迄今发现的磷酸酶家族中首个抑癌基因,PTEN蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性,其脂质磷酸酶活性可以去掉3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）3位上的磷酸基团,使其转化为4,5二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）,从而调控细胞的增殖与凋亡。其蛋白磷酸酶活性可以抑制黏着斑激酶（FAK）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化,调节细胞的黏附及迁移。研究发现多种实体瘤中存在有PTEN基因的突变、等位基因的缺失或低表达,急性白血病（acute leukemia, AL）中也存在有PTEN基因不同程度的缺失、低表达、甲基化。但是PTEN基因及其蛋白的异常如何在AL的发生发展、血管新生及髓外浸润过程中发挥作用仍有待于进一步探讨。儿童AL是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。它是由于不成熟的淋巴系或髓系祖细胞在发育成熟过程中失去调控,从而呈克隆性扩张,使得细胞被阻滞于一定的分化期而发生的。AL的发病机制目前多认为是环境因素、遗传因素以及癌基因和抑癌基因等多种致病因素综合作用的结果。近年来由于分子生物学技术的迅速发展,多种抑癌基因在AL发病中的作用越来越明确。PTEN在AL发病机制中的作用越来月受到重视。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术可高效、特异地下调目标基因的表达,是研究内源性基因功能和信号转导途径的强有力工具。但是在RNAi过程中常有“脱靶效应”的发生,造成对试验结果的误判。为研究PTEN基因在儿童AL发病机制中的作用,本实验构建了PTEN基因的RNAi及其逃避RNAi策略结构（RNA interference escape strategy construct,RESC）救援的慢病毒载体质粒。应用人T淋巴细胞（T Lymphocytes,T-LC）建立其阴性对照（T-LC-GFP）、PTEN基因敲减（T-LC-shPTEN）和RESC救援（T-LC-rrshPTEN）细胞模型,通过对PTEN基因的敲减及RESC救援,观察人T-LC中PTEN蛋白的表达及AKT通路的活化情况、细胞增殖和细胞周期的变化。应用人主动脉内皮细胞永生化细胞（HAEC-hT）建立其阴性对照（HAEC-hT -GFP）、PTEN基因敲减rHAEC-hT-shPTEN)和RESC救援（HAEC-hT-rrshPTEN）细胞模型,观察人HAEC-hT迁移、损伤修复变化,并检测相关信号通路分子表达情况。本实验旨在探讨PTEN基因的生物学特性,及其下游信号分子与儿童AL发生、发展的相关性。探讨所构建的RNAi及其RESC救援慢病毒载体系统在基因操作中的功能,及避免RNAi过程中脱靶效应对实验结果造成误判的作用。第一部分PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定实验目的：构建人PTEN基因RNAi及其RESC救援的慢病毒载体并进行鉴定,为能有效的避免“脱靶效应”所引起的假阳性结果对实验的干扰、为研究PTEN基因功能提供稳定的转染载体。方法：1.构建策略设计并合成1对已筛选确定的能表达PTEN基因RNAi的发夹式RNA结构（small or short hairpin RNA,shRNA）的单链寡核苷酸,中间添加loop环（TTCAAGAGA）,每对寡核苷酸两端分别带有酶切位点以方便基因操作。该有效靶序列的特点是：GC含量在35%-55%,以碱基“G”开始,连续5个碱基“T”结束。oligo DNA经退火形成双链DNA后,将其定向克隆到载体pFLRu-GFP质粒的XbaI/XhoI酶切位点处,构建成PTEN的RNAi慢病毒载体pFLRu-U6-shPTEN。在此基础上根据密码子简并性引入RESC机制：在PTEN基因shRNA对应的位置引入4个同义点突变,在核苷酸水平上改变基因,而其所表达的PTEN天然蛋白编码不变,又使shRNA不能作用于这种“外源设计的rnRNA",从而允许救援。“外源设计的mRNA"两端分别带有酶切位点以方便基因操作。把这个基因片段与GFP报告基因融合后,定向克隆到载体pFLRu-U6-shPTEN质粒的EcoRI/BamHI酶切位点处,从而获得人PTEN基因RNAi的RESC救援慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN。把这2个载体引入RNAi实验中,如果能恢复由RNAi引起的变化,则可以排除因shRNA的脱靶效应所引起的假阳性结果,从而避免对基因功能的误判。2.PTEN基因RNAi慢病毒载体pFLRu-U6-shPTEN的构建通过3个PCR反应步骤分别扩增出：含hU6启动子（含XbaI酶切位点）的寡核苷酸片段（f1）、能使PTEN基因沉默的shRNA（含XhoI酶切位点）片段（f2）及U6-shPTEN片段（f3）。之后把f3作为插入片段,亚克隆到载体pFLRu-GFP质粒的XbaI/XhoI酶切位点。经细菌转化,氨苄抗性筛选。阳性克隆提取质粒；酶切及U6前引物测序验证。在Genbank数据库BLAST分析与其他基因的同源性。3. PTEN基因RNAi的RESC救援慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN的构建通过3个PCR反应分别扩增出对应shRNA位置有同义突变（含EcoRI酶切位点）大小为650bp的1nRNA片段（F1）、大小为560bp（含BamHI酶切位点）的mRNA片段（F2）及含有4个同义突变的PTEN基因mRNA的全长片段（F3）。之后把与报告基因GFP融合的F3亚克隆到载体pFLRu-U6-shPTEN质粒的EcoRI/BamHI酶切位点。经细菌转化、氨苄抗性筛选。阳性克隆提取质粒；酶切及测序鉴定。并与GenBank数据库中的基因进行比较。4.慢病毒的包装和滴度测定293T细胞会合度达75%时,在TRANSIT介导下,使用慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2△R和pCMV-VSV-G的混合物（按8：1混合）,分别与慢病毒质粒pFLRu-U6-shPTEN, pFLRu-U6-rrshPTEN共转染293T细胞；转染后48 h,收获上述2种慢病毒贮液。用NIH3T3细胞,采用逐孔梯度稀释法（10-1～10-6）测定病毒滴度。倒置荧光显微镜下检测GFP表达量。结果：1. pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN基因片段扩增产物经1%TAE琼脂糖凝胶电泳,紫外线透射仪下观察,在约420bp及1200bp处可见清晰条带,与RNAi实验要求的shRNA及目的基因PTEN的cDNA长度一致。2. pFLRu-U6-shPTEN经3酶切,电泳后获得预期大小的条带。证实f3片段已插入pFLRu-GFP载体中。经DNA测序鉴定pFLRu-U6-shPTEN基因序列和预期基因序列完全一致。3. pFLRu-U6-rrshPTEN经4酶切,电泳后获得预期大小的条带。证实F3片段已插入pFLRu-U6-shPTEN载体中。经DNA测序鉴定pFLRu-U6-rrshPTEN目的基因序列在氨基酸水平上与基因库的基因序列完全同源。4.用倒置荧光显微镜观察已转染的293T细胞,可见大部分包装细胞发出绿色荧光。提示PTEN基因RNAi慢病毒载体pFLRu-U6-shPTEN及其RESC救援慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN已成功构建。经过293T细胞扩增后,最终分别获得6.0×105pfu/mL、5.0×105pfμ/mL的病毒,能够满足后期的体内外实验。结论：成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体。为研究PTEN基因的功能提供了稳定的转染细胞载体。第二部分PTEN基因敲减及RESC救援后T淋巴细胞增殖和信号通路的变化实验目的应用已成功构建的人PTEN基因RNAi慢病毒载体及其RESC救援慢病毒载体感染人类正常T淋巴细胞（T-LC）,建立PTEN基因敲减及其RESC救援的细胞模型；观察PTEN基因敲减前后及RESC救援后人T-LC信号通路、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化,为进一步研究淋巴细胞性白血病的发病机制提供基础。方法1.T-LC培养及纯化健康人外周血由健康志愿者提供（所有志愿者均签署知情同意书）。先制备外周血单个核细胞（PMNC）,再用免疫磁珠法纯化出T-LC。应用含10%FBS的RPMI1640培养基培养。2.PTEN基因敲减及其RESC救援T-LC细胞模型的建立用pFLRu-GFP质粒、shPTEN和rrshPTEN转染T-LC,建立T-LC的阴性对照模型（T-LC-GFP）、PTEN基因敲减模型（T-LC-shPTEN）及其RESC救援模型（T-LC-rrshPTEN）等细胞模型。3. Western blot检测PTEN和pAKT蛋白的表达收获、裂解细胞获取总蛋白,取各组等量蛋白于聚丙烯酰胺凝胶中电泳,用PVDF膜转膜、封膜、再加入PTEN、pAKT、AKT和β-actin抗体孵育、二抗孵育、化学发光、摄片。应用ImageJ公共图像处理软件对Western blot结果进行量化分析。4.MTT法检测PTEN基因敲减及RESC救援对T-LC生长的影响取T-LCT-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等4组的对数期细胞,细胞浓度为1×106/mL时,按200μL/孔接种于96孔板中,每组设3个复孔,在培养第1、2、3、4、5 d时,分别取出一板,加MTT溶液后继续培养4 h,酶标仪上测定各孔OD 570nm值。5.流式细胞术检测PTEN敲减及RESC救援对细胞周期及凋亡的影响将T-LC、T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等4组细胞调整到5×105/50μL, 10mg/mL RNaseA 20μL,37℃作用30 min,加入碘化丙锭（PI）用流式细胞仪检测细胞周期。Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率6.统计学分析应用SSPS 13.0统计软件进行数据统计分析,数据用均数±标准差（X+s）表示,采用方差分析及q检验,a=0.05为检验水准。结果1.用慢病毒载体pFLRu-GFP、pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN感染染T-LC后,用倒置荧光显微镜观察GFP表达情况,可见大部分T-LC在荧光激发下发出绿色荧光,提示T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN等细胞模型构建成功。2. Western blot方法显示：T-LC-GFP组PTEN基因的表达与T-LC组相比无明显变化（P>0.05）,T-LC-shPTEN组PTEN基因表达较T-LC组、T-LC-GFP组减弱（P<0.01）, T-LC-rrshPTEN组,PTEN基因（与GFP基因一起）又出现了表达,与T-LC-GFP组、T-LC-shPTEN组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。T-LC细胞的阴性对照、PTEN基因敲减模型及RESC救援细胞模型T-LC-GFP、T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN构建成功。3. Western blot检测pAKT蛋白的表达：与T-LC组和T-LC-GFP组细胞比较,T-LC-shPTEN组细胞pAKT的表达明显增多（P<0.01）,而T-LC-rrshPTEN组细胞的pAKT则与前两者相似（P>0.05）,表明PTEN敲减后激活了T-LC中的PI3K/AKT信号通路,而RESC救援则又使PTEN基因敲减所引起的pAKT表达恢复到敲减之前的状态。4.MTT法测量细胞生长曲线显示：T-LC-shPTEN组细胞生长增快,与T-LC组和阴性对照细胞T-LC-GFP组相比,于第2天开始即有明显差异（P<0.05）。而T-LC-rrshPTEN组细胞生长速度与T-LC组和T-LC-GFP组相似（P>0.05）,提示RESC救援能恢复PTEN基因抑制细胞生长的功能。5.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化显示：PTEN基因敲减后（T-LC-shPTEN组）G0/G1期细胞明显减少,S期细胞明显增加,G2/M期细胞增加,细胞凋亡减少。与其他3组细胞相比,差别均有统计学意义（P<0.01）。RESC救援后（T-LC-rrshPTEN组）,G0/G1期细胞、S期细胞和G2/M期细胞及细胞凋亡情况又分别恢复。与T-LC组和T-LC-GFP组相比,差别无统计学意义（P>0.05）。结论1.PTEN基因敲减后,T淋巴细胞在增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、信号传导通路等方面的生物学特性都有改变,PTEN基因在分子水平参与了儿童AL的发病机制。2.RESC救援慢病毒载体仅在核苷酸水平上改变基因,其所表达的PTEN天然蛋白编码不变,实现真正意义的救援,避免了RNAi过程中脱靶效应副作用对实验造成的影响,弥补了同类研究的遗漏与不足。第三部分SIP、VEGF作用下PTEN基因敲减后内皮细胞损伤修复的变化实验目的应用已成功构建的人PTEN基因RNAi及其RESC救援慢病毒载体感染人主动脉内皮细胞的永生化细胞（HAEC-hT）,建立其阴性对照（HAEC-hT-GFP）、PTEN基因敲减（HAEC-hT-shPTEN）和RESC救援（HAEC-hT-rrshPTEN）细胞模型,观察人HAEC-hT迁移、损伤修复变化,并检测相关信号通路分子表达情况。方法1.HAEC永生化及验证HAEC购自Clonetics公司,由美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液学实验中心Mr. Longmore实验室进行永生化（命名为HAEC-hT）处理并验证后,用EGM完全培养基传代培养。2.PTEN基因敲减及其RESC救援HAEC-hT细胞模型的建立用pFLRu-GFP质粒、pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN转染HAEC-hT,建立HAEC-hT的阴性对照模型（HAEC-hT-GFP）、PTEN基因敲减模型（HAEC-hT-shPTEN）和PTEN基因RESC救援模型（HAEC-hT-rrshPTEN）等细胞模型。3. PTEN敲减及其RESC救援后HAEC-hT单个细胞迁移分析观察在整个过程中未分裂、未与其他细胞接触、未迁移到视野外的细胞,用Olympus X81倒置显微镜每4 min拍照1次,连续12 h。ImageJ软件追踪每个细胞的运动路径。比较4组及加入S1P、VEGF刺激后细胞不同时间迁移方向与速度。4.PTEN敲减及其RESC救援后HAEC-hT细胞创伤愈合试验分析各组细胞乏血清培养2 h后,制作大约230±32μm宽伤口（约移除49±7%的培养细胞）。用Olympus X71定时显微镜（10×）每隔5 min拍照创伤愈合情况。创伤愈合率用ImageJ做定量分析。5. Western blot检测pAKT蛋白的表达取PTEN敲减及其RESC救援后HAEC-hT细胞乏血清培养2 h,随后进行损伤,加或不加1μM/mL的S1P、50ng/mL的VEGF,分别在0、15、30min时间点收获细胞,用Western blot检测pAKT蛋白的表达。结果：1.永生化的血管内皮细胞形态和生长速度同原代培养细胞无差异,两者对S1P、VEGF刺激具有相同反应。2.2个对照组细胞形态均为梭形,细胞核具有明显的两极,细胞迁移是细胞板状突起伸展、收缩引起外形不断变化,但朝向一极运动。PTEN敲减后的内皮细胞体积变大,细胞形态趋向圆形,胞核形态改变不明显。细胞运动速度增快（P<0.05）,而且运动明显缺乏方向性。RESC救援后的细胞不论从形态,还是运动速度及运动的极向性均和对照组细胞无明显差异（P>0.05）。3. S1P、VEGF能够明显促进内皮细胞的迁移及损伤修复（P<0.05）。但在PTEN敲减细胞中,S1P、VEGF刺激仅使得损伤修复速度少量增加（P>0.05）。4.添加S1P、VEGF刺激后,对照组细胞中pAKT表达量随着时间的延长均有所增加（P<0.05）。PTEN敲减组3个时间点pAKT表达量无明显差异（P>0.05）,但与对照组相比其表达量增加。在伤口修复过程中,S1P、VEGF的加入增加了pAKT蛋白的活性。RESCU救援后pAKT表达量与对照组相似。结论：1.PTEN的缺失使血管内皮细胞失去极性运动的能力；由于缺乏趋向损伤部位方向性的运动,从而影响内皮细胞对损伤的修复。2. SIP、VEGF能够通过激活PI3K/AKT信号通路而明显促进内皮细胞的迁移及损伤修复。PTEN基因敲减后,SIP、VEGF的加入使内皮细胞的损伤修复速度减慢。
吕长荣[4]（2011）在《诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究》文中认为本研究建立了牛诱导性多能干细胞系（induced pluripotent stem cells, iPS cells）。本研究克隆牛Nanog与Lin28两个转录因子基因,以逆转录病毒载体pMSCVneo携带牛Oct4, Sox2, Nanog与Lin28四个转录因子,诱导成年奶牛皮肤成纤维细胞重编程为牛iPS细胞。为研究牛多能性干细胞生物学特性和牛体细胞重编程机理,提供了理论依据和试验基础。本研究获得以下主要结果：1.克隆得到牛Nanog与Lin28两个转录因子开放性阅读框（ORF）全序列。从50-60日龄牛胎儿体内分离原始生殖嵴组织（PGR）,经RT-PCR扩增,获得牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列。经过鉴定与测序,并与GenBank中参考序列进行变异分析,证明所克隆牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列与参考序列同源性均为100%,没有发生碱基突变。2.牛Nanog基因与Lin28基因逆转录病毒表达载体的构建及其包装。（1）经过酶切、连接、转化与鉴定,成功构建了包含牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列的逆转录病毒表达载体：pMSCV-Nanog （MN）与pMSCV-Lin28 （ML）.（2）重组逆转录病毒质粒MN与ML,经过PT67包装细胞包装,产生具有感染性的病毒颗粒；以NIH3T3细胞作为指示细胞,测定MN与ML的最高感染滴度分别为9.19×107cfu/mL与7.5×107cfu/mL。病毒颗粒在透射电镜下呈现球形与椭球形,直径约为50-100 nm。病毒上清经过二次感染NIH3T3细胞,RT-PCR在NIH3T3细胞上清中,没有检测出野生型病毒颗粒存在。说明逆转录病毒在包装细胞系以外其他细胞内,不能复制包装。3.特定转录因子诱导成年牛皮肤成纤维细胞为iPS细胞并鉴定其生物学特性。（1）以成年雌性Holstein奶牛皮肤组织为材料,通过组织块培养与差速贴壁法,分离纯化得到牛皮肤成纤维细胞（bovine dermal fibroblasts, BDFs）。测定BDFs生长曲线、群体倍增时间与细胞周期等生物学特征；BDFs表达波形蛋白（Vimentin）与纤维连接蛋白（Fibronectin）等成纤维细胞的特异性标志蛋白。（2）以逆转录病毒pMSCVneo为载体,携带牛源性Oct4, Sox2, Nanog与Lin28四个转录因子转染BDFs,成功获得牛iPS细胞系。诱导后平均20.75 d完成重编程,平均重编程效率为0.034%。用脱细胞人羊膜（cell-free HAM）作牛iPS细胞培养支架,代替小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,建立牛iPS细胞无饲养层细胞的培养体系,其效果良好。（3）牛iPS细胞生物学特性鉴定：牛iPS细胞与ES细胞生长行为类似,呈集落样生长,AKP染色为阳性。牛iPS细胞强表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60与TRA-1-81等多能性干细胞表面标志；同时表达Oct4, Sox2, Nanog与TERT多能性干细胞特异性蛋白；但不表达SSEA-1与CD117标志蛋白。牛iPS细胞核型为60条XX二倍体核型,符合雌性奶牛细胞的染色体形态与数目标准。牛iPS细胞冻存液以70%牛iPS细胞培养液+20%FBS+10%DMSO效果较好,解冻后其平均存活率为90.9%。4.牛iPS细胞的多能性鉴定。（1） RT-PCR检测牛iPS细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc、Klf4与Lin28等多能性相关基因；转染的外源性基因在牛iPS细胞中表达微弱或发生沉默。qPCR测定牛iPS细胞中Oct4、Nanog、Sox2、Lin28与TERT基因的表达量显着增加,超出BDFs的103-104倍,c-Myc与Klf4表达量比BDFs增加5-10倍。牛iPS细胞不同代次之间的基因表达量没有显着差异。牛iPS细胞Oct4基因与Nanog基因启动子区域表现为高度去甲基化状态,与多能干细胞甲基化模式类似。Western blotting检测牛iPS细胞能够表达Oct4、Nanog、Sox2、Lin28与Klf4蛋白质。（2）将牛iPS细胞体外悬浮培养7 d,能够形成圆球状与囊腔状类胚体（EBs）结构。EBs贴壁培养后,能够自由分化为纤维样细胞、多突起的神经样细胞与铺路石状的上皮样细胞。免疫细胞化学染色表明,EBs能自由分化为表达AFP,CK7与PDX-1阳性的内胚层细胞；表达a-Actin与Vimentin阳性的中胚层细胞；表达βⅢ-tubulin, Nestin与GFAP阳性的外胚层细胞。通过EBs介导,牛iPS细胞在分别添加全反式维甲酸（RA）和p巯基乙醇（p-Me）两种诱导条件下,均可定向分化为Nestin、GFAP与NSE表达阳性的神经细胞。证明牛iPS细胞在体外具有多分化潜能。（3）将1.3×106个牛iPS细胞,注射到裸鼠皮下形成畸胎瘤。组织切片观察,畸胎瘤组织内包含有横纹肌、腺体、脂肪组织与神经节样组织结构。从畸胎瘤中,RT-PCR扩增出代表三个胚层分化细胞的特异性基因。证明牛iPS细胞在裸鼠体内具有发育多能性。（4）将1.1×106个牛iPS细胞,注射入两只妊娠55天的萨能奶山羊胎儿腹腔,妊娠足月后分娩,其中一只受体母山羊产下1只具有明显的皮毛嵌合体羔羊。经PCR方法对嵌合体羔羊各组织中牛细胞线粒体DNA序列检测,证明嵌合体羔羊体内多数组织中包含有牛细胞。证明牛iPS细胞参与嵌合体动物形成。
闫玉芬[5]（2010）在《ADC病人HIV-1gp120基因多样性分析及对U87细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响》文中提出目的影响ADC发病的主要因素有HIV-1病毒的致病性、机体的神经易感性及免疫抑制的水平。研究表明大脑及脑脊液中HIV病毒载量与ADC的发生并非总是有关,这说明ADC的发生可能与HIV本身的基因及生物学活性有关。鉴于HIV-1gp120在病毒与宿主细胞结合和融合中发挥不可替代的作用,本研究的第一部分拟通过对来源于2例ADC病人各6个组织的共60株HIV-1gp120序列进行基因多样性与生物学活性位点分析,对HIV-1gp120基因多样性和生物学活性与ADC发病的关系作出初步判断。HIV-1致ADC发病的机制尚不清楚,但可以肯定的是它可以通过刺激胶质细胞或巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β引起神经元细胞损伤。鉴于HIV-1病毒载量与ADC的发生并非总是有关,本研究的第二部分拟通过分析不同病人不同组织来源基因不完全相同的HIV-1gp120诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力,来探讨HIV-1gp120基因差异是否与其刺激细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力有关,从而为ADC阐述发病机制提出新观点,为ADC的预防与控制提供新思路。方法1.以HIV-1B标准株HXB2 gp120基因序列基因组DNA序列作为模板,应用Primer 5.0软件设计引物,巢式PCR法扩增源自两例ADC病人共12个不同组织的HIV-1gp120序列,PCR产物经TA克隆后,转化至大肠杆菌DH5α,经蓝白斑、氨苄青霉素筛选及测序后,每个部位选取5个HIV-1gp120阳性克隆进行序列分析。通过对来自于两例ADC病人不同组织的HIV-1gp120序列分别进行系统发育树、ds／dn比值、糖基化位点、V3环关键位点氨基酸等分析,以探讨HIV-1gp120与ADC发病的关系。2.随机选取源自两例ADC病人外周组织、中枢神经组织的HIV-1gp120克隆各一个（共4个克隆）,PCR扩增gp120基因,经TA克隆、蓝白斑及氨苄青霉素筛选,提取阳性质粒,双酶切后的gp120片段与经过同样双酶切的逆转录病毒表达载体MSCV-IRES-GFP连接,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选HIV-1gp120阳性表达载体,经双酶切和测序证实。然后将逆转录病毒表达载体与pUMVC、pCMV-VSV-G共转染293T细胞,免疫荧光显微镜观察逆转录病毒载体的表达、免疫组化实验检测HIV-1gp120的表达。收获免疫荧光检测阳性的重组逆转录病毒悬液,经逐孔稀释法测定其感染滴度,然后感染U87细胞,荧光显微镜检测重组逆转录病毒蛋白的表达,免疫组化实验检测HIV-1gp120的表达,ELISA法测定细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS软件分析测定结果。结果1.获得了来源于两例ADC病人各6个组织共60个HIV-1gp120阳性克隆,并经测序证实,BLAST分析均为HIV-1Bgp120序列。2.构建了每例ADC病人来源的各6个组织共30个HIV-1gp120基因克隆的系统发育树,由系统发育树可见,不同组织来源的HIV-1gp120基因位于不同的系统发育树进化枝上,不同组织来源的HIV-1gp120基因克隆也可以存在交叉现象。3.与HIV-1B标准株HXB2 gp120相比,第一例ADC病人来源的HIV-1gp120其各自的ds／dn=1.1744±0.0348（p＜0.001）；第二例病人体内来源的所有HIV-1gp120基因序列的ds／dn=0.8222±0.2086（p＜0.001）；两个病例来源的HIV-1gp120基因序列的ds／dn具有显着性差别（p＜0.001）。4.以HIV-1B标准株HXB2gp120的糖基化位点为标准,第一例ADC病人来源HIV-1gp120序列糖基化位点相对比较保守,第二例ADC病人来源的HIV-1gp120序列糖基化位点变异较大。5.根据现有的资料,可以预测感染两例ADC病人大脑组织的HIV-1病毒均为CCR5受体使用型、巨噬细胞嗜性、非合胞体诱导型毒株。6.构建了4个HIV-1包膜糖蛋白gp120的逆转录表达载体A1/MIG、B1/ MIG.A2/MIG.B2/MIG,双酶切鉴定目的片段和载体分别为1.44kb和6.8kb,并经测序证实。对四个表达载体中的HIV-1gp120进行分析,发现四株HIV-1gp120序列存在基因差异,其中A1／MIG的V3环序列与其他三株序列差异较大。7.荧光显微镜观察结果显示共转染MSCV-IRES-GFP.pUMVC及pCMV-VSV-G的293T细胞及感染重组逆转录病毒的U87细胞中均有绿色荧光信号产生。逐孔稀释法测定重组逆转录病毒的滴度约为106／ml。8免疫组化实验显示转染A1/MIG、B1/MIG、A2/MIG、B2/MIG表达载体的293T细胞及感染HIV-1gp120阳性重组逆转录病毒的U87细胞中均有HIV-1gp120阳性细胞出现。9.ELISA测定重组逆转录病毒感染细胞上清中TNF-α、IL-1β含量,发现HIV-1gpl20阳性重组逆转录病毒诱导细胞分泌的TNF-α、IL-1β量高于HIV-1 gpl20阴性重组逆转录病毒（p＜0.001）；第一例ADC病人外周组织来源的HIV-1gpl20诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β的量高于其它3个组织来源的HIV-1gpl20（p<0.001）,而其他3个组织来源的HIV-1gp120诱导分泌的TNF-α、IL-1β的量差别无统计学意义（p＞0.10）。结论1.HIV-1 gp120的基因多样性和生物学活性位点改变与ADC的发病机制可能存在一定关系。2.HIV.1gp120能增强胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力。3.HIV-1gp120基因序列尤其是V3环序列能影响其刺激胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力,CCR5受体使用型的HIV-1gp120诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力高于非CCR5受体使用型的HIV-1gp120。
崔淑娟[6]（2009）在《甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化》文中研究指明甲型流感病毒严重危害人类健康,由于其变异引发的大流行对人类造成严重威胁,近年来人感染禽流感病毒（H5N1）和甲型H1N1流感的流行,进一步提示加强甲型流感病毒的研究和控制的重要性。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型流感病毒编码的糖蛋白,变异性强,根据抗原性不同可进一步分为16个HA亚型（H1-H16）和9个NA亚型（N1-N9）。尽管HA和NA是流感病毒主要的免疫原,但由于HA和NA的变异性强,亚型众多,而目前甲型流感病毒16个HA和9个NA不同亚型之间的免疫交叉关系尚未系统研究,对流感病毒亚型特异性免疫检测技术的建立和疫苗的研发提出了严峻的考验。为此,本研究对甲型流感病毒16个亚型的HAl和9个亚型NA的交叉反应性进行了研究,以期阐明其免疫反应特征,为甲型流感病毒免疫检测技术和通用疫苗的研制提供可行性的理论依据。另一方面,近年来反向遗传系统的发明为人工改造甲型流感病毒和研发疫苗提供了关键技术平台,但现有系统的拯救效率有待提高,本研究拟通过对甲型流流感病毒反向遗传系统的转录／表达载体的改建提高其拯救效率。一、甲型流感病毒HA和NA血清学交叉反应特征研究对本实验选取的甲型流感病毒16个亚型的HA基因和9个亚型的NA基因的序列进行了分析,结果表明,16个HA和9个NA的核苷酸与氨基酸序列的进化树都主要向两个趋势进化,16个HA核苷酸序列之间的同源率在28%-76.7%之间,其氨基酸序列之间的同源率在36.2%-78.5%之间,9个NA亚型核苷酸序列之间的同源率在43.1%-70.4%之间,其氨基酸序列之间的同源率在37.9%66.6%之间。尽管16个HA和9个NA基因的预测B细胞线性表位分布区域一致,但其具体表位组成却存在差异,这些信息为进行各亚型之间的血清学交叉反应以及确定亚型特异性表位序列提供研究方向,进而为研究HA和NA的结构与功能、免疫识别、构建HA和NA的突变体以及选择表达新型HA和NA分子、研发诊断和基因工程疫苗奠定了基础。随后将PCR扩增的经密码子优化的16个HA1和9个NA基因克隆到改建的gp67-pFastBac1载体中,获得了25个重组杆状病毒。将重组杆状病毒分别感染Sf9细胞,分别收取上清和细胞用抗6×His抗体进行Western blot分析。结果表明,16个HA1和9个NA基因的表达产物分子质量分别约为52.5kD与71.6kD,与预期相符,并且16个HA1和9个NA基因还呈分泌性表达。其中H5-HA1和H9-HA1经Ni柱纯化后的纯度达90%左右,回收率分别为0.5%和0.9%。同时,将16个亚型的HA和9个亚型的NA基因克隆到5型重组腺病毒载体中,得到了25个重组腺病毒。分别将25个重组腺病毒通过滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,制备了相应亚型的抗体,三次免疫后ELISA检测阳转率为100%,ELISA检测的抗体效价约为1：6400左右。利用杆状病毒系统表达的各个亚型的目的蛋白作为抗原,利用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠制备的血清作为抗体,通过ELISA方法确定16个HA亚型及9个NA亚型之间的血清学交叉反应关系。结果表明,HAl和NA各亚型之间的交叉反应关系错综复杂,H2、H5、H7亚型与其他亚型之间的交叉反应弱,而H6、H12、H16与其他亚型之间的交叉反应强。N1、N2亚型与其他亚型之间的交叉反应强,HA1和NA各亚型之间的交叉反应结果与其序列分析的结果存在一定的差异。二、甲型流感病毒反向遗传系统的优化利用RT-PCR的方法扩增了甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）毒株8个基因片断,克隆入pIVVII载体中,其中在PB1片段中引入了3个沉默突变标签。将8个功能质粒共转染293T和MDCK混合培养细胞,利用细胞病变、RT-PCR、电镜技术等证明该系统可成功拯救甲型流感病毒。为提高甲型流感病毒的拯救效率,用人工合成的SCPI启动子[1]插入PIVVII载体,构建出pIVVS质粒,再将A/PR/8/34（H1N1）的8个基因片断克隆入pIVVS载体中,把优化后的8个功能质粒共转染293T和MDCK混合细胞,在共转染后的24h、48h、72h及96h分别收获转染细胞的上清和细胞,通过EGFP表达量、NP表达的时相变化以及血凝试验鉴定两个包装系统的拯救效率。结果表明,优化后系统不同时间点的EGFP表达量、NP表达量及血凝效价均高于未优化系统,说明利用高强度的SCPI启动子可有效提高甲型流感病毒的包装效率,为改进甲型流感病毒疫苗的研发系统奠定了基础。
李江南,郭焕成,史子学,涂长春[7]（2008）在《逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒增殖的研究》文中提出本研究在实验室前期研究的基础上,选取4个有效抑制猪瘟病毒增殖的干扰基因N1、N2、S10和S11,其中N1和N2针对Npro基因,S10针对NS3基因,S11针对NS4A基因,进行逆转录病毒载体介导的抑制猪瘟病毒增殖的研究.首先包装出重组逆转录病毒,感染PK-15细胞获得稳定表达干扰基因的细胞克隆,然后采用间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒滴度三种方法测定了细胞表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖水平.结果:成功包装出携带干扰基因的重组逆转录病毒,并筛选获得稳定表达干扰基因的PK-15细胞克隆,间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒滴度三种方法测定结果表明接毒后12-60h,与对照细胞相比,荧光比例、病毒基因组的拷贝数和病毒滴度保持较低的水平,比对照细胞低1-2个数量级,48h病毒基因拷贝数抑制倍数分别为149.3,病毒感染滴度抑制倍数分别为143.54.随着时间的延长,抑制作用降低,但是仍有一定的抑制作用.
马建军[8]（2008）在《NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究》文中研究说明目的意义:NDRG2基因是1999年从正常人全脑cDNA文库中克隆到的新基因[GenBank登录号AF159092.],染色体定位于14q12.1,基因组中由15个内含子,16个外显子构成。NDRG2基因的cDNA全长为2024 bp,编码357个氨基酸的蛋白质,分子量约41kD。目前研究表明,NDRG2基因在多种肿瘤组织或细胞系如结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达,相反在上述肿瘤相应的正常组织细胞中有较高水平的表达。另外在中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核,唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中高表达。同时基因转染实验表明,NDRG2可抑制胶质瘤BT325细胞由G1期向S期的过渡,因此,推测NDRG2可能是一种新的抑癌基因。本研究的目的意义是探讨NDRG2基因在肾癌发病机制中的作用,确定NDRG2基因的功能,为肾癌的防治提供理论依据。实验方法:采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法确定NDRG2在肾癌细胞系、肾脏细胞系及正常组织和肾癌组织的表达;构建NDRG2的腺病毒表达载体并进行腺病毒的包装及滴度测定,获得高滴度的重组NDRG2腺病毒用于后续的细胞功能实验研究;用NDRG2重组腺病毒转染经证实低表达NDRG2的肾透明细胞癌细胞系A-498中,提高该细胞中NDRG2表达水平,通过流式细胞术分析细胞周期并检测凋亡,并运用蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白的变化;通过p53重组腺病毒转染肾癌A-498细胞,观察p53基因对NDRG2基因表达的影响。实验结果:1、通过免疫组织化学、RT-PCR、蛋白印迹等检测了人肾癌组织和人肾小管上皮细胞系、肾癌细胞系中NDRG2蛋白和mRNA的表达,结果显示:人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系、人胚肾上皮细胞HKC细胞系中NDRG2的mRNA表达水平较高;而在肾癌细胞系786-O、A-498中NDRG2的mRNA表达水平较低;NDRG2 mRNA在18例肾癌患者肿瘤组织中的表达水平较其相应癌旁组织低,且该表达与其病理分级呈正相关趋势;仅有6例患者的肾肿瘤组织中NDRG2的mRNA表达水平高于相对应的自身肿瘤瘤旁组织;另外有14例患者两者NDRG2 mRNA的表达无差异。2、采用美国Novagen公司成熟的pAdTrack-CMV腺病毒表达系统首先构建了含有NDRG2基因的重组穿梭载体,通过脂质体转染法将线性化的重组穿梭载体与骨架蛋白载体转染293细胞获得了原始病毒种,通过挑选单蚀斑进一步感染293细胞获得了单蚀斑病毒裂解液,在此基础上我们建立了原始种子批、主种子批及工作种子批,最后用工作种子批完成了pAd-GFP-NDRG2重组腺病毒的生产、病毒的纯化及病毒滴度的测定,最终获得的重组腺病毒滴度为1.1×1011pfu /ml。3、通过蛋白印迹实验证实重组腺病毒pAd-GFP-NDRG2转染可增加A-498细胞内源性NDRG2的表达水平;随后的MTT检测结果表明:A-498细胞病毒转染组,各检测时间点MTT OD值均低于未转染和空质粒转染组,48h差异具有显着性,说明NDRG2表达对A-498细胞生长具有抑制作用;进一步的细胞周期分析显示:A-498细胞质粒转染组出现G1期阻滞（G1期捕获）,提示NDRG2通过细胞周期阻滞来抑制A-498细胞增殖;凋亡检测实验结果显示:与未转染的A-498细胞（1.0%）和不含插段的重组腺病毒感染的A-498细胞（2.0%）相比,含NDRG2插段的重组腺病毒组感染的A-498细胞中凋亡细胞明显增多,感染48h后达12.0%;最后通过蛋白印迹实验检测发现:人NDRG2基因转染A-498细胞后,周期素蛋白cyclinD1、cyclinE表达减少,cyclinD2、cyclinD3和cdk2表达无明显变化,由此推测NDRG2基因抑制细胞增殖可能是通过影响周期素蛋白D1和E起作用的。4、通过蛋白印迹和RT-PCR发现A-498细胞表达没有活性的p53,但是基本检测不到NDRG2的表达;通过转染活化型p53基因到A-498细胞后观察到了NDRG2表达水平的升高,且呈剂量依赖关系,该结果说明NDRG2可受到p53基因的调控,提示NDRG2也是p53的一个下游基因。实验结论:NDRG2在正常肾组织中高表达,而在肾癌组织中出现低表达或无表达;NDRG2能够抑制肾癌A-498细胞的增殖,并能产生G1期阻滞,抑制细胞周期素D1、E的表达;p53的表达能够上调NDRG2的表达,本研究的结果进一步证实NDRG2基因是一种新的抑癌基因,以其为靶点的基因治疗策略可为肾癌的基因治疗提供新思路。
陈淼[9]（2008）在《小鼠胚胎胰腺干细胞的体外培养与鉴定》文中提出世界上约有一亿五千万人患有糖尿病,其中有近三千万在中国,而且近来糖尿病的发病率越来越高。升高的血糖以及各种综合症使糖尿病成为人类健康的最大凶手之一。胰岛移植的成功为世界上众多的糖尿病患者带来了美好的希望。但是,可用于移植的胰岛远远满足不了需求。我们实验室利用小鼠作为动物模型,建立了一个独特的胚胎胰腺细胞与op9-DL1饲养层细胞的共培养系统,op9-DL1可以激活Notch1信号通路并抑制胰腺干细胞的分化。因此,用这种方法培养起来的胚胎胰腺细胞在分裂的同时还有可能保持了干细胞的特性。实验结果表明,共培养系统成功地培养了E13.5-18.5天的胚胎胰腺干细胞。这些细胞成鹅卵石形,表达转录因子PDX-1,但不表达胰岛素原和转录因子ngn3（neurogenin）。更重要的是,新型生物聚脂材料PHBHHx可以刺激胚胎胰腺干细胞形成球状胰岛类似体,并增加胰岛素原、PDX-1、及ngn3转录物的表达水平。因此,我们的研究不仅具有重要的理论意义,还有可能为糖尿病的治疗作出贡献。
李江南[10]（2008）在《逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的研究》文中研究表明本研究用逆转录病毒载体成功介导了特异性shRNA在PK-15细胞中抑制猪瘟病毒shimen株的增殖,干扰基因N1和N2针对猪瘟病毒Npro基因,S10和S11分别针对猪瘟病毒NS3基因和NS4A基因。首先构建了含H1启动子表达猪瘟病毒特异性shRNA的重组质粒pLN-N1、pLN-N2、pLN-S10、pLN-S11。构建的重组质粒分别与pVSV-G共转染GP2-293细胞,包装出复制缺陷型重组逆转录病毒rMLV-N1、rMLV-N2、rMLV-S10和rMLV-S11,电镜观察和病毒滴度测定证明了复制缺陷型重组逆转录病毒包装成功。利用所构建的重组逆转录病毒分别感染PK-15细胞,IFA筛选出稳定表达猪瘟病毒特异shRNA抑制猪瘟病毒增殖的细胞克隆PK-15-N1、PK-15-N2、PK-15-S10和PK-15-S11。然后采用间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒感染滴度测定三种方法进行了细胞表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖的动态检测,三种方法得到的结果相互吻合,稳定表达猪瘟病毒特异shRNA的细胞接毒后12-60h,猪瘟病毒增殖保持较低的水平,接毒后48h病毒基因拷贝数抑制倍数达149.3倍、病毒感染滴度抑制倍数达143.54倍,72h以后抑制效率降低,直到接毒后120h病毒基因仍然保持4-16倍的抑制作用,结果表明稳定表达猪瘟病毒特异干扰基因的PK-15细胞对猪瘟病毒增殖有高效的抑制作用。最后进行了表达猪瘟病毒特异shRNA细胞遗传稳定性检测,表明干扰基因稳定整合到细胞的基因组中,并表达猪瘟病毒特异性shRNA,能抑制猪瘟病毒的增殖。
二、重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究（论文提纲范文）
（1）新型慢病毒包装方法及转基因鸡生物反应器研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照表 |
| 文献综述部分 |
| 第一章 动物生物反应器 |
| 1 转基因动物生物反应器优势 |
| 2 转基因生物反应器平台的建立 |
| 2.1 乳腺生物反应器 |
| 2.2 血液和禽蛋动物生物反应器 |
| 2.3 尿液和精液动物生物反应器 |
| 2.4 蚕茧生物反应器 |
| 2.5 其它 |
| 3 各种动物生物反应器获得的成就 |
| 4 结论 |
| 第二章 转基因鸡生物反应器 |
| 1 转基因鸡生物反应器的发展 |
| 2 转基因鸡生物反应器的价值 |
| 2.1 鸡蛋中的主要蛋白成分 |
| 2.2 蛋白的糖基化修饰 |
| 2.3 转基因鸡生物反应器的其他优势 |
| 3 建立一个转基因鸡反应器需要的步骤 |
| 3.1 生产转基因鸡的方法 |
| 3.2 逆转录病毒载体法 |
| 3.3 转基因鸡中重组蛋白的表达 |
| 4 结论 |
| 第三章 慢病毒转基因技术 |
| 1 慢病毒的组成 |
| 2 慢病毒载体构建的发展 |
| 2.1 第一代慢病毒载体的设计 |
| 2.2 慢病毒载体技术的进一步优化 |
| 3 慢病毒的包装生产 |
| 3.1 构建能长期稳定表达慢病毒载体所用的细胞系 |
| 3.2 质粒瞬时转染法生产慢病毒载体 |
| 3.3 有助于病毒生产的添加物 |
| 4 病毒载体体内特异性打靶 |
| 5 结论 |
| 实验研究部分 |
| 第四章 生产慢病毒新方法的研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验材料与试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒DNA的转化 |
| 2.2 质粒的小量制备提取 |
| 2.3 质粒的酶切鉴定 |
| 2.4 质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.5 慢病毒核心载体质粒的构建 |
| 2.6 无内毒素质粒小量制备提取 |
| 2.7 293T细胞的培养 |
| 2.8 使用脂质体作为转染试剂生产慢病毒 |
| 2.9 使用PEI作为转染试剂细胞生产慢病毒 |
| 2.10 慢病毒的浓缩 |
| 2.11 慢病毒物理颗粒滴度的测定 |
| 2.12 慢病毒效价滴度的测定 |
| 2.13 测定N/P和转染DNA总量的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.14 测定293T细胞培养基中FBS,氯喹,GlutaMax的存在对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.15 测定转染时细胞数目的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.16 测定转染16h后是否换液对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.17 测定PEI工作液pH值的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 2.18 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 慢病毒质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 脂质体法与PEI法生产慢病毒所获滴度的比较 |
| 3.3 N/P值和转染DNA总量对获得慢病毒滴度的影响 |
| 3.4 培养基中FBS,氯喹,GlutaMax对慢病毒滴度的影响 |
| 3.5 转染时细胞数目的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 3.6 转染16h后是否换液对获得慢病毒滴度的影响 |
| 3.7 PEI工作液pH值的不同对获得慢病毒滴度的影响 |
| 4 讨论与结论 |
| 第五章 慢病毒载体法生产转基因鸡的研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验材料与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 种蛋的开窗注射与孵化 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论与结论 |
| 第六章 外源基因嵌合型转基因鸡个体的筛选 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验材料与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鸡尿囊绒毛膜提基因组DNA的提取 |
| 2.2 鸡血液基因组DNA的提取 |
| 2.3 鸡胚转基因个体的PCR检测 |
| 2.4 嵌合型转基因鸡阳性个体ELISA检测 |
| 2.5 嵌合型转基因鸡阳性个体所产鸡蛋中外源重组蛋白Western Blot检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 对嵌合体小鸡进行PCR初步筛选 |
| 3.2 转基因鸡阳性率统计 |
| 3.3 转基因鸡的进一步筛选 |
| 4 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）疫苗载体人腺病毒41型和5型在小鼠的免疫效果评价和体内分布研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 表达中东呼吸道综合征冠状病毒S蛋白的重组腺病毒在小鼠模型的免疫效果评价 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 重组腺病毒在小鼠体内的分布 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒载体的构建及其功能的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 中英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PTEN基因敲减及RESC救援后T淋巴细胞增殖和信号通路的变化 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 S1P及VEGF作用下PTEN基因敲减后内皮细胞损伤修复的变化 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 综述:慢病毒载体结构优化策略及研究进展 |
| 1. 慢病毒载体的构建 |
| 2. 慢病毒载体的结构优化策略 |
| 3. 慢病毒载体在转基因动物和基因治疗中的应用前景 |
| 4. 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（4）诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 多能性干细胞研究进展 |
| 1.1 产生多能性干细胞的基本策略 |
| 1.1.1 核移植获得多能性干细胞 |
| 1.1.2 体细胞与ES细胞融合重编程为ES细胞 |
| 1.1.3 细胞培养自发性重编程为多能性干细胞 |
| 1.1.4 转染多能性转录因子诱导体细胞为多能性干细胞 |
| 1.2 多能性相关转录因子在维持细胞多能性中的作用 |
| 1.2.1 Oct-3/4的功能 |
| 1.2.2 Sox2的功能 |
| 1.2.3 Nanog的功能 |
| 1.2.4 c-Myc的功能 |
| 1.2.5 Klf4的功能 |
| 1.2.6 Lin28的功能 |
| 1.3 多能性相关转录因子诱导细胞多能性的分子机理 |
| 第二章 转染特定转录因子产生iPS细胞研究进展 |
| 引言 |
| 2.1 转录因子与小分子化合物的选择应用 |
| 2.1.1 转录因子的选择与应用 |
| 2.1.2 小分子化合物的选择与应用 |
| 2.2 重编程中转录因子导入方法 |
| 2.2.1 逆转录病毒转染系统 |
| 2.2.2 慢病毒转染系统 |
| 2.2.3 腺病毒转染系统 |
| 2.2.4 质粒瞬时转染系统 |
| 2.3 靶细胞的种类与选用 |
| 2.4 影响转录因子表达的主要因素 |
| 2.5 iPS细胞培养条件的建立及其应用 |
| 2.6 iPS细胞克隆鉴别方法 |
| 2.7 iPS细胞传代培养方法及其生物学特性的鉴定方法 |
| 2.7.1 形态学鉴定 |
| 2.7.2 分子水平鉴定 |
| 2.7.3 iPS细胞功能方面的鉴定标准 |
| 2.7.4 iPS细胞生物学特性最低鉴定标准 |
| 2.8 iPS细胞重编程效率的评估方法 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛Nanog与Lin28基因ORF全序列克隆及变异分析 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 奶牛胎儿原始生殖嵴获得与总RNA提取 |
| 3.2.3 RT反应 |
| 3.2.4 PCR反应 |
| 3.2.5 PCR产物回收与pMD18-T载体的连接 |
| 3.2.6 感受态细胞制备与转化 |
| 3.2.7 重组质粒鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 奶牛Nanog基因与Lin28基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 含有重组质粒菌落初步鉴定结果 |
| 3.3.3 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3.4 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3.5 Nanog基因与Lin28基因核苷酸序列测定与变异分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Nanog在维持多能性中的作用 |
| 3.4.2 Lin28在维持多能性中的作用 |
| 3.4.3 转录因子在体细胞重编程中应用 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛Nanog与Lin28基因逆转录病毒载体的构建与包装 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 基因、质粒载体与细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 质粒TN与TL的酶切与回收 |
| 4.2.2 基因片段与逆转录病毒载体的连接 |
| 4.2.3 重组逆转录病毒质粒的转化与克隆扩增 |
| 4.2.4 重组逆转录病毒质粒的鉴定 |
| 4.2.5 G418对PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量的测定 |
| 4.2.6 重组逆转录病毒质粒的包装与转染效率的测定 |
| 4.2.7 重组逆转录病毒感染滴度的测定 |
| 4.2.8 重组逆转录病毒颗粒形态电镜观察 |
| 4.2.9 包装细胞中重组逆转录病毒的表达与鉴定 |
| 4.2.10 重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组逆转录病毒质粒MN与ML构建与鉴定 |
| 4.3.2 G418对PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量的测定结果 |
| 4.3.3 产毒细胞株筛选与病毒滴度测定 |
| 4.3.4 重组逆转录病毒质粒在PT67包装细胞中转染效率测定结果 |
| 4.3.5 重组逆转录病毒颗粒的形态 |
| 4.3.6 逆转录病毒质粒MN与ML在包装细胞中的表达与鉴定 |
| 4.3.7 重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛诱导性多能干细胞系的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要溶液的配制 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 原代牛皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 5.2.2 BDFs的生物学特性鉴定 |
| 5.2.3 脱细胞人羊膜支架的制备 |
| 5.2.4 逆转录病毒转染BDFs |
| 5.2.5 牛诱导性多能干细胞的产生 |
| 5.2.6 牛iPSCs细胞生物学特性的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 原代牛皮肤成纤维细胞的获得、纯化与传代培养 |
| 5.3.2 牛皮肤成纤维细胞形态及免疫细胞化学染色 |
| 5.3.3 牛皮肤成纤维细胞生长曲线与群体倍增时间 |
| 5.3.4 牛皮肤成纤维细胞细胞周期测定结果 |
| 5.3.5 脱细胞人羊膜支架结构 |
| 5.3.6 牛诱导性多能够干细胞的获得与传代培养 |
| 5.3.7 牛iPS细胞集落形成时间与重编程效率 |
| 5.3.8 不同冻存液对牛iPS细胞冻存效果的影响 |
| 5.3.9 牛iPS细胞集落形态与AKP染色结果 |
| 5.3.10 牛iPS细胞生物学特性 |
| 5.3.11 牛iPS细胞核型表现 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 牛皮肤成纤维细胞的分离与纯化 |
| 5.4.2 体细胞重编程与牛iPS细胞的产生 |
| 5.4.3 牛iPS细胞培养体系的建立 |
| 5.4.4 牛iPS细胞的重编程效率 |
| 5.4.5 牛iPS细胞生物学特征 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 牛iPS细胞分化潜能的鉴定 |
| 引言 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 牛iPS细胞株 |
| 6.1.2 试剂与试验动物 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 牛iPS细胞基因表达谱检测 |
| 6.2.2 牛iPS细胞多能性基因表达水平分析 |
| 6.2.3 牛iPS细胞多能性蛋白质表达分析 |
| 6.2.4 牛iPS细胞表观遗传特征分析 |
| 6.2.5 牛iPS细胞形成类胚体与体外分化能力测定 |
| 6.2.6 牛iPS细胞形成畸胎瘤与体内分化能力测定 |
| 6.2.7 牛iPS细胞生产牛羊嵌合体动物及其鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 牛iPS细胞基因表达谱分析 |
| 6.3.2 牛iPS细胞多能性相关蛋白表达 |
| 6.3.3 牛iPS细胞多能性基因表达水平 |
| 6.3.4 牛iPS细胞Nanog与Oct4基因启动子序列甲基化特征 |
| 6.3.5 形成类胚体与体外自由分化能力 |
| 6.3.6 类胚体介导牛iPS细胞定向分化为神经细胞 |
| 6.3.7 形成畸胎瘤与体内分化能力 |
| 6.3.8 牛羊嵌合体动物的产生及其鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 iPS细胞基因及蛋白质表达特征 |
| 6.4.2 牛iPS细胞中Nanog与Oct4基因启动子序列甲基化模式 |
| 6.4.3 牛iPS细胞体外分化能力 |
| 6.4.4 牛iPS细胞体内分化能力 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）ADC病人HIV-1gp120基因多样性分析及对U87细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 附录、附图 |
| 参考文献 |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 甲型流感病毒各亚型HA和NA之间的血清学交叉反应特征研究 |
| 第一章 甲型流感病毒各亚型HA和NA基因序列分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 甲型流感病毒各亚型HA1基因和NA基因的杆状病毒表达载体构建、表达以及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 甲型流感病毒各亚型HA基因和NA基因的重组腺病毒载体构建、包装、以及抗体制备 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 甲型流感病毒HA和NA的血清学交叉反应特征的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第二部分 甲型流感病毒反向遗传系统的建立及优化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| References |
| 致谢 |
（8）NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 NDRG2 基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498 细胞增殖的实验研究 |
| 实验一 NDRG2 基因在肾癌细胞系及肾癌组织中的表达 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验二 NDRG2 重组腺病毒表达体系的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验三 过表达NDRG2 对A-498 细胞的影响及机理研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验四 P53 对肾癌细胞A-498 NDRG2 表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简介和研究成果 |
| 致谢 |
（9）小鼠胚胎胰腺干细胞的体外培养与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状及分析 |
| 1.2.1 小鼠胰腺发育研究现状 |
| 1.2.2 生物科学与材料科学的结合容易产生新的重大突破 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要实验试剂和材料 |
| 2.2.1 免疫组化试剂 |
| 2.2.2 主要抗体 |
| 2.2.3 生长因子 |
| 2.2.4 细胞培养试剂 |
| 2.2.5 RT-PCR相关试剂 |
| 2.3 仪器与设备 |
| 2.4 技术路线 |
| 2.4.1 小鼠胚胎胰腺干细胞的体外培养与鉴定 |
| 2.4.2 小鼠胚胎胰腺干细胞的分化 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 实验动物 |
| 2.5.2 共培养系统建立 |
| 2.5.3 小鼠胚胎胰腺干细胞的鉴定 |
| 2.5.4 小鼠胚胎胰腺干细胞的体外分化 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2：T7 RNA聚合酶正反馈表达系统在慢病毒载体制备中的应用 |
| 致谢 |
| 在校期间科研情况 |
| 个人简历 |
（10）逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪瘟病毒复制相关基因结构和功能研究进展 |
| 第二章 逆转录病毒载体介导的RNAi 在动物病毒学中的应用 |
| 第二篇 实验研究 |
| 逆转录病毒载体介导ShRNA 抑制猪瘟病毒在PK-15 细胞中增殖的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 表达CSFV 特异shRNA 逆转录病毒载体骨架质粒的构建 |
| 2.2 复制缺陷型重组逆转录病毒的包装 |
| 2.3 重组病毒感染PK-15 细胞及阳性细胞克隆筛选 |
| 2.4 shRNA 抑制猪瘟病毒增殖过程的动态检测 |
| 2.5 单克隆细胞稳定表达shRNA 的持续性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达CSFV 特异shRNA 骨架质粒的构建结果 |
| 3.2 复制缺陷型重组逆转录病毒的包装结果 |
| 3.3 重组病毒感染PK-15 细胞及阳性细胞克隆筛选结果 |
| 3.4 shRNA 抑制猪瘟病毒增殖过程动态检测结果 |
| 3.5 单克隆细胞稳定表达shRNA 的持续性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
四、重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究（论文参考文献）
- [1]新型慢病毒包装方法及转基因鸡生物反应器研究[D]. 张宏鹏. 南京农业大学, 2016(04)
- [2]疫苗载体人腺病毒41型和5型在小鼠的免疫效果评价和体内分布研究[D]. 郭小娟. 中国疾病预防控制中心, 2015(12)
- [3]人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒载体的构建及其功能的相关性研究[D]. 王玉梅. 郑州大学, 2011(12)
- [4]诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D]. 吕长荣. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [5]ADC病人HIV-1gp120基因多样性分析及对U87细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响[D]. 闫玉芬. 山东大学, 2010(09)
- [6]甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化[D]. 崔淑娟. 北京协和医学院, 2009(01)
- [7]逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒增殖的研究[A]. 李江南,郭焕成,史子学,涂长春. 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集, 2008
- [8]NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究[D]. 马建军. 第四军医大学, 2008(04)
- [9]小鼠胚胎胰腺干细胞的体外培养与鉴定[D]. 陈淼. 汕头大学, 2008(02)
- [10]逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的研究[D]. 李江南. 吉林大学, 2008(10)