一、Epstein-Barr病毒基因工程亚单位疫苗膜抗原gp340/220的纯化及其免疫学特性（论文文献综述）
项树林,肖瑶,李燕,朱秋屏,谷淑燕[1]（1996）在《Epstein-Barr病毒基因工程亚单位疫苗膜抗原gp340/220的纯化及其免疫学特性》文中研究说明利用病毒学研究所免疫研究室重组的表达Epstein-Barr病毒膜抗原（MA）gp340/220重组痘苗病毒感染143细胞,24小时后裂解细胞,获得的上清液经DEAE-Sepharose FF及Sephadex G200层析纯化,经免疫打点分析后收集阳性蛋白,经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250染色,显示为单一的蛋白带,从而获得纯化的亚单位疫苗MA gp340/220。将纯化的MA与A1（OH）3佐剂或rIL-2+完全福氏佐剂免疫小鼠,对其免疫学特性进行测定。结果表明,MA免疫的小鼠能产生较高滴度的特异性抗体和中和抗体,诱导产生抗体依赖细胞介导的细胞毒反应（ADCC）,并能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,但未发现对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤作用有何影响。
谢秋玲,陈小佳,戴云,汪炬,洪岸,林剑[2]（2004）在《中国仓鼠卵巢细胞表达系统在疫苗研制中的应用》文中认为
王曼[3]（2014）在《人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究》文中研究说明甲基营养型毕赤酵母是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一,该表达系统具有产量高,操作简单,表达稳定及成本低等优点。毕赤酵母还具有蛋白翻译后修饰加工系统,非常适合作为真核生物蛋白的大规模生产平台。本论文主要采用毕赤酵母系统表达人肠道病毒EV71和EB病毒（Epstein-Barr virus）疫苗候选抗原,并进一步研究候选抗原的免疫原性。EV71是手足口病的主要致病原之一,能引起儿童患者严重神经系统疾病甚至死亡。由于EV71感染性强且致病率高,EV71病毒已导致手足口病疫情多次爆发。然而目前仍缺乏有效的抗病毒药物与预防疫苗。研究表明EV71衣壳蛋白VP1具有较强的免疫原性：重组VP1能够有效诱导中和抗体产生,并保护新生小鼠免于病毒致死性感染。因此VP1蛋白是具有潜力的EV71疫苗候选抗原。EBV是常见的感染人类B细胞的γ疱疹病毒,能在95%以上人群中进行慢性潜伏感染。EBV是感染性单核细胞增多症的致病原,能够诱发淋巴及上皮肿瘤。EBV的致癌性使得EBV疫苗的研制工作尤为紧迫与必要。目前EBV治疗型疫苗研究主要集中于EBV核抗原1（EBNA1）上,而预防型疫苗则主要以EBV包膜蛋白gp350为研究重点。EBNA1是在所有EBV相关恶性肿瘤中唯一表达的病毒蛋白,并在EBV潜伏感染过程中具有重要作用。研究表明EBNA1特异T细胞能够有效杀伤EBV阳性肿瘤细胞,因此EBNA1被认为是EBV相关恶性肿瘤免疫治疗的候选抗原。gp350在病毒感染过程中具有重要作用,gp350与B淋巴细胞表面2型补体受体（CR2）结合介导病毒进入和感染靶细胞。大量研究表明gp350是中和抗体的首要靶标,为EBV预防型疫苗的首要候选抗原。本论文在毕赤酵母中成功表达了VP1, EBNA1和gp350,并取得了创新性成果,研究结果主要分为以下三个部分：1.将密码子优化EV71衣壳蛋白VP1序列插入到真核表达载体中,然后将重组表达载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达；成功获得分泌表达的重组VP1蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析法,从培养上清中分离得到纯化VP1蛋白。以小鼠为研究对象,检测重组VP1蛋白的免疫原性及抗病毒效果。实验结果显示重组VP1能够诱导小鼠产生高水平VP1特异抗体,体外中和实验证明这些抗体具有中和EV71病毒活性。新生小鼠被动保护实验进一步证实VP1疫苗的预防保护效果。此外,VP1还能刺激淋巴细胞增殖与Th1型免疫应答反应。综上所述,毕赤酵母表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,能够有效诱导抗病毒抗体产生并激活免疫系统,因此重组VP1具有开发为EV71亚单位疫苗的潜力。2.通过生物信息学分析发现EBNA1抗原表位主要位于蛋白C端结构域,因此选定EBNA1截短体（ElΔGA,390-641位氨基酸）作为EBV治疗型疫苗候选抗原。通过对ElΔGA序列密码子进行优化,构建真核表达载体,并将重组载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western杂交结果显示在毕赤酵母系统中成功表达重组ElΔGA,采用Ni-NTA亲和层析法从酵母培养上清中高效纯化ElΔGA蛋白。将纯化的ElΔGA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠以获得多克隆抗体,Western杂交结果显示小鼠多克隆抗体能够特异识别B95-8细胞裂解液中EBNA1蛋白。重组ElΔGA能够刺激T淋巴细胞增殖和Thl型免疫应答反应,同时诱导免疫小鼠脾脏和外周血中CD4+T和CD8+T细胞显着增多。这些实验结果表明毕赤酵母表达的ElΔGA具有较强免疫原性,具有开发为EBV相关恶性肿瘤候选疫苗的潜力。3.抗原表位分析发现,gp350蛋白N端结构域含有关键中和表位,具有开发为EBV候选疫苗的潜力。在毕赤酵母系统中成功表达密码子优化的gp350蛋白N端1-443位氨基酸肽段,重组蛋白可通过一步亲和层析法得到有效纯化。本研究为重组gp350蛋白大规模生产及其抗病毒活性深入研究奠定基础。在本论文中,使用毕赤酵母系统成功表达EV71和EBV疫苗候选抗原,研究结果显示重组VP1和ElΔGA能够诱导特异抗体产生,活化免疫系统,并能够刺激细胞因子分泌及淋巴细胞增殖。这些结果表明酵母表达的候选抗原具有较强的免疫原性,并具有开发为抗病毒疫苗的潜力。
刘展,周为民,谷淑燕[4]（1996）在《Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性》文中认为将Epstein-Barr（EB）病毒膜抗原基因（EBV-MA）称MA1和截去穿膜区的MA基因称MA2分别插入杆状病毒表达载体pVL-941。将两种重组质粒分别与杆状病毒DNA共转染sf9细胞后获得Baculo-MA1和Baculo-MA2两种重组病毒,表达产物分别位于重组病毒感染的细胞表面或释放到细胞培养液中。免疫荧光方法检查,在感染的细胞表面表达产物与抗MA的单克隆抗体特异性地结合,SDS-PAGE显示其分子量约220kD和150kD两条带,在Baculo-MA2感染的细胞培养液中仅含220kD的蛋白。薄层扫描表明MA表达量至少占细胞总蛋白量的30%。经DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S300 HR纯化,SDS-PAGE检测其纯度可达90%以上。经纯化的MA1和MA2分别免疫小鼠,免疫血清与B95-8细胞膜上存在的EB病毒特异的膜抗原反应,并证明具有中和抗体活性。检测某些细胞免疫指标结果表明,经MA免疫的小鼠产生特异性的ADCC活性,提高NK活性。经纯化的MA在体外能促进T细胞增殖。
刘栋[5]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中研究指明在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
陈云[6]（2007）在《EB病毒潜伏膜蛋白2A蛋白负载树突状细胞激发特异性CTL的研究》文中研究说明EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）属于疱疹病毒γ亚科嗜淋巴细胞病毒成员，在世界各地广泛分布，为95％以上的成人所携带，是较早认识的与人类肿瘤相关的病毒。自1966年Old在鼻咽癌（nasopharyngeall careinoma，NPC）组织中首先发现存在有EB病毒DNA以来，大量的血清流行病学研究已证明EB病毒与鼻咽癌有关。鼻咽癌是上皮来源的恶性肿瘤，高发于东南亚及我国华南地区。临床上鼻咽癌通常不宜手术治疗，放疗、化疗后也不能完全有效清除肿瘤细胞，部分患者易复发和转移，并且治疗产生的副作用又影响了自身的免疫系统。因此目前，在倡导鼻咽癌综合治疗的同时更加注重免疫治疗。对鼻咽癌的免疫机制研究显示，针对EB病毒特异性细胞毒性T细胞（CTL）细胞在清除肿瘤细胞中起着关键作用。CTL亚群能直接识别并杀伤肿瘤细胞，在杀伤肿瘤细胞中CD4+和CD8+T细胞相互协调共同发挥作用。以CTL为基础的免疫治疗需选择合适的靶抗原。鼻咽癌肿瘤细胞中EB病毒蛋白呈潜伏Ⅱ型表达，即仅表达低免疫原性抗原EBNA1、LMP1、LMP2。EBNA1在诱导特异性T细胞的同时，也能诱导CD4+调节性Treg细胞，抑制机体的免疫应答，且EBNA1记忆性CTL反应主要受HLA B3501，B7等限制。LMP1已被确认为能够使正常细胞发生转化癌基因蛋白，CTL识别的靶位易突变，免疫原性也弱于LMP2。目前认为，LMP2A是免疫治疗理想的靶抗原，序列相对保守，具有潜在性的T细胞表位。在NPC病人血液中能检出针对EB病毒LMP2的CTL前体细胞，但其数目及反应性明显低于健康携带者，导致机体对肿瘤的免疫耐受。所以纠正这种CTL的低应答状态对于机体有效清除肿瘤细胞至关重要，诱导EBV特异性CTL是鼻咽癌免疫治疗的关键。T细胞只能识别由抗原递呈细胞（APC）递呈的抗原肽-MHC分子复合物。树突状细胞（DC）是目前发现功能最强的APC，能激发初始型和记忆型T细胞，产生有效的CTL应答。以DC为基础的免疫治疗已在许多肿瘤的治疗中取得了良好的效果，是当前抗肿瘤免疫治疗研究的热点之一。本课题用DC作为鼻咽癌免疫治疗的APC，选用EB病毒LMP2A作为免疫治疗的靶抗原，以分子生物学和细胞生物学方法构建LMP2A稳定表达细胞株，纯化LMP2A蛋白，并对EBV相关的NPC病人的血清进行了检测；蛋白负载经体外扩增的EB病毒阳性健康携带者的DC；负载的DC分别与自体外周血CD4+和CD8+T混合培养，激发出LMP2A特异性CD4+和CD8+T，并对其功能进行研究。主要研究内容和结果如下：一、EB病毒LMP2A基因重组逆转录病毒和稳定表达LMP2A细胞株的构建用PCR从质粒pPICZ-α／LMP2A扩增EBV的LMP2A基因片断，经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后定向插入含同样酶切位点的逆转录病毒表达载体pSIV-1的LTR启动子下游，构建重组逆转录病毒载体pSIV-1／LMP2A，重组质粒经PCR、EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切及序列分析鉴定。获得的重组质粒与两个辅助病毒载体pHIT456和pHIT60用脂质体共转染包装细胞293T，转化后的细胞用G418筛选，经1周筛选培养后获得抗性细胞克隆，将抗性细胞扩大培养，收集含有重组逆转录病毒颗粒抗性细胞克隆培养上清。PCR结果显示在抗性细胞克隆基因组中存在LMP2A基因。用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞，计算病毒滴度，并于感染后48小时用PCR、间接免疫荧光、Westem blot检测目的基因的整合和表达。结果显示，扩增到的病毒效价为5×105CFU／ml，PCR阳性结果提示LMP2A能整合于MH3T3细胞中，间接免疫荧光显示NIH3T3细胞有LMP2A的表达，Western blot显示在54KDa处出现特异的蛋白条带。表明重组逆转录病毒能有效地介导LMP2A基因在真核细胞中表达。用重组逆转录病毒颗粒重复3次感染L929细胞，72小时后置于含G418选择性培养基中，筛选培养2周后，获得抗性细胞克隆。PCR阳性结果提示LMP2A能整合于L929细胞中，RT-PCR结果表明LMP2A基因能转录成相应的mRNA。流式细胞仪显示91.3％的细胞能表达LMP2A，Western blot出现特异的蛋白条带。提取细胞蛋白，经His Bind Ni-NTA亲和层析柱纯化，得到纯度达90％以上的LMP2A蛋白。采用纯化的LMP2A蛋白作为抗原，用ELISA法检测EB病毒相关鼻咽癌患者血清中的抗体，结果显示鼻咽癌患者血清中存在着高滴度的抗LMP2A的抗体，检出率为72.29％。比较NPC病人LMP2A血清学检测结果与临床上VCA、EA法结果，三者检出率相当，大部分病例呈正相关，但一些病例中VCA、EA检出率低的LMP2A检出率高，而一些病例VCA、EA检出率高的LMP2A检出率低。因此，如将三者结合有助于提高鼻咽癌患者的检出率，LMP2A对鼻咽癌的检测具有辅助诊断意义。二、人外周血树突状细胞的培养鉴定及EB病毒LMP2A蛋白的负载分离EBV阳性的健康人外周血单核细胞，在含重组hGM-CSF和hIL-4的培养液中培养，用hTNF-a诱导DC成熟。共聚焦显微镜观察其形态，流式细胞仪检测细胞的表面分子。结果显示，从健康人外周血分离得到的单核细胞，体外经重组hGM-CSF、hIL-4的培养可获得未成熟的DC，流式细胞仪检测DC相对特异性标记CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR等表达较低，而单核细胞特异性标志CD14相对较高；当加入hTNF-α继续培养2天后，得到大量成熟DC，DC特异性标记CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR表达显着升高，CD14表达下调。光学显微镜下观察诱导成熟的DC具有典型树突状特征。用不同浓度的LMP2A蛋白负载未成熟的DC，诱导成熟后激光共聚焦检测DC俘获抗原的能力，FACS选择最佳蛋白负载浓度；用最佳LMP2A蛋白浓度负载未成熟的DC，FACS检测负载前后诱导成熟DC表面分子CD1a、CD83、CD14、CD80、HLA-DR变化及LMP2A表达情况；并用3H-TdR掺入法检测负载前后诱导成熟DC刺激同种淋巴细胞增殖能力。结果显示，40μg／ml为LMP2A蛋白转染DC的最佳浓度，共聚焦和FACS结果显示约80％的DC表达LMP2A蛋白；LMP2A负载后诱导的成熟DC对细胞表面共刺激分子及特征性表面标志无影响；负载后诱导成熟DC仍具有较强的刺激同种淋巴细胞增殖能力。研究结果为蛋白负载DC免疫治疗NPC提供可能。三、EB病毒LMP2A蛋白负载树突状细胞激发特异性CTL及体外杀伤活性的研究免疫微磁珠分离获得自体CD4+和CD8+T细胞，FACS鉴定分选细胞纯度均大于95％。3HTdR掺入法细胞增殖实验检测CD4和CD8T细胞经LMP2A蛋白负载自体DC或未负载DC刺激后的增殖水平。ELISA法检测CD4T细胞经抗原负载后的DC刺激分泌IFN-γ和IL-10的水平。3H-TdR掺入法结果显示，CD4+和CD8+T细胞经LMP2A蛋白负载自体DC刺激后的增殖水平明显高于未负载组（P＜0.001，P＜0.001），表明DC能够俘获抗原并将抗原提呈给自体的T淋巴细胞，同时LMP2A蛋白含有MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子限制性的靶位。ELISA法检测结果显示，CD4+T细胞经负载后的DC刺激分泌IFN-γ明显高于未负载DC组（P=0.034），而IL-10在各组中的分泌水平均很低。构建含有绿色荧光蛋白报告基因（GFP）荧光标记的重组逆转录病毒载体pPGEz-Term／LMP2A，与辅助病毒载体PHT 456和PHI 60共转染包装细胞293T，收集含有Zeocine的抗性细胞培养上清。用此重组逆转录病毒感染第1天诱导的未成熟DC，感染后继续在含hGM-CSF、hIL-4的培养液中培养，重复感染3次，用hTNF-α诱导DC成熟。荧光显微镜观察重组逆转录病毒转染293T细胞情况及FACS检测LMP2A在DC上的表达，并以此作为靶细胞。结果显示，荧光显微镜下观察293细胞可见绿色荧光，FACS检测出56.4％的DC能表达LMP2A。采用重复刺激技术获得LMP2A特异性CD8+T细胞，分别以转染重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A或空载体的自体成熟DC、LCL、K562细胞作为靶细胞，用LDH释放法检测CTL的杀伤活性。FACS检测CTL杀伤靶细胞（重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A转染的自体成熟DC）后CD4+和CD8+T细胞胞内分泌细胞因子IFN-γ水平。LDH检测结果显示，LMP2A蛋白负载DC可以诱导出针对EBV-LMP2A特异的CTL，能够特异性的杀伤重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A转染自体的成熟DC（P=0.023）。FACS结果显示，经LMP2A负载的DC诱导的特异性CD4+和CD8+T与靶细胞孵育后，胞内分泌细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组（P＜0.01）。我们研究结果表明：EB病毒潜伏膜蛋白2A在L929细胞上稳定的表达，鼻咽癌患者血清中存在着高滴度的抗LMP2A的抗体；LMP2A蛋白负载的DC在体外能激发针对LMP2A特异性CTL，对重组逆转录病毒pPGEZ-Term／LMP2A转染自体的成熟DC具有杀伤效应。本研究为进一步开展EB病毒相关鼻咽癌的临床免疫治疗奠定基础，也为其它病毒相关性肿瘤的免疫治疗研究提供实验和理论依据。
阮力[7]（2013）在《痘苗病毒天坛株载体研究与应用概述》文中认为1982年,文献首次报道外源基因成功在痘苗病毒WR株（小鼠嗜神经毒株）中获得表达,引起了中国科学家的极大关注。1984年,中国医学科学院病毒学研究所在朱既明院士的组织下成立了痘苗病毒基因表达载体研究协作组,提出使用痘苗病毒天坛株开发可用于人体的痘苗病毒基因表达载体的新思路。该研究历时10余年,成功构建了痘苗病毒天坛株高效表达载体,并广泛用于外源基因表达、基因工程疫苗研究、单克隆抗体研制和诊断试剂开发。本文简单介绍了该载体的研究及应用,并对载体疫苗存在的问题及发展前景进行了讨论。
孙学强[8]（2010）在《马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建》文中认为马疱疹病毒1型（Equine herpesvirus type1, EHV-1）是马科动物的重要病原之一,临床上多引起呼吸道、流产及神经系统疾病。疱疹病毒拥有庞大的双股DNA基因组,由于其基因组中存在大量非必需基因,有大约30kbp的序列可以被外源基因取代,并且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖,EHV-1可作为表达外源蛋白活疫苗载体,不但可以用于马病的预防,而且最近的研究显示EHV-1有发展为通用载体或者基因治疗载体的潜力。本实验以ATCC标准株438/77株基础,分别克隆其ORF19和20,与含有绿色荧光蛋白和氯霉素抗性报告基因的pHA2相连构建转移载体后,与母本病毒共转染以传统的同源重组方法在ORF19和20之间插入mini-F序列,构建了含有GFP和氯霉素基因的重组病毒,提取重组病毒基因组环状中间体电转至大肠杆菌DH10B感受态细胞,经过PGR和RFLP筛选到多株阳性细菌人工染色体（BAC）克隆,以磷酸钙法转染RK13细胞,结果均拯救出病毒。拯救病毒与转移载体p1920XM通过同源重组进一步删除含有报告基因mini-F序列构建了无痕迹有标记的恢复病毒。野生株、拯救株和恢复株经过噬斑测定和一步生长曲线测定证明各毒株体外培养特性差异不显着,说明本实验所构建的BAC具有感染性,而且mini-F的插入和删除均没有改变病毒的体外培养特性。猪链球菌2型作为一种人畜共患病病原日益受到关注,而溶血素又是其分泌到细胞外的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。通过对其基因序列的分析发现5’约81bp编码的27个氨基酸残基为信号肽序列。本试验通过PCR及融合PCR方法构建载体在大肠杆菌中成功的表达了带有信号肽和无信号肽的SLY,以及将463和464位色氨酸突变为丙氨酸的带有信号肽和无信号肽的溶血素突变体-SLYm。经过蛋白杂交试验证明,表达的重组SLY和SLYm与提取的SS2分泌的SLY分子量完全一致,而且带有的信号肽的SLY和SLYm均能在细菌上清中检测到杂交条带,说明SS2sly基因的信号肽序列同样能够引导在大肠杆菌中成熟的SLY或者SLYm进行跨膜转运,而且转运至细胞外的SLY和SLYm的分子量与SS2的分子量一致,说明其信号肽序列已被切除,而无信号肽的SLY和SLYm的上清中均未检测到。同时通过血平板和96孔板溶血试验证明溶血素突变体失去溶血活性,而野生型SLY不仅能够溶解红细胞而且对PK15.RK13.SUVEC细胞具有毒性,突变体则不能引起任何细胞发生病变。小鼠毒力实验证明所表达的SLY通过腹腔注射和静脉注射均能致死小鼠,而SLYm在同样条件下对小鼠安全。用SLY和SLYm免疫小鼠制备的抗血清均能抑制SS2SLY的溶血活性,提示了463和464为氨基酸的突变虽然灭活其溶血活性,但是仍具备免疫原性其抗血清能够封闭SLY的膜结合结构域阻止其细胞膜的结合。瞬时表达及免疫转印试验证明未经优化的SS2溶血素突变体全基因在PK15细胞中不能被Pcmv启动子启动表达,而优化合成的slyom则能够表达,所表达的溶血素蛋白在PK15细胞中不需要信号肽序列也能实现跨膜转运。MRP被认为是猪链球菌的重要的毒力因子,从病猪体内分离的菌株常常含这种分子。对链球菌致病菌株的MRP进行了克隆、测序,显示N端前47个氨基酸是典型的信号肽,游离于细菌表面,N端有7个带电荷的残基,后面是一个21个氨基酸的疏水孔和一个公认的信号肽酶切位点。剪切掉信号肽得到一个分子量为131094的成熟蛋白,它与136kD的MRP接近。C端有一类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列,本试验通过构建含有mrp片段的真核表达质粒转染细胞后瞬时表达MRP并经免疫转印确定能够在Pcmv启动子启动下表达。应用疫苗预防目前仍旧是防控猪链球菌病有效措施,传统的灭活疫苗仍旧具有需多次注射的局限,新型高效的猪链球菌2型疫苗仍有待于进一步的研究。本试验在所构建的p438/77的基础上,以两步法无痕迹的将mrp基因片段和溶血素突变体分别插入EHV-1基因组内构建了重组病毒,经过免疫转印鉴定能够表达MRP和SLY。重组病毒通过传统的同源重组方法删除了含有氯霉素抗性基因以及gfp的mini-F序列获得4M和4S株。免疫小鼠后以间接ELISA方法检测到4M能够诱导小鼠产生抗MRP特异性抗体,4M株免疫小鼠后能够抵抗致死量的SLY静脉注射的攻击。
宋天喜[9]（2011）在《gp350基因与gp350-C3d3融合基因真核表达质粒的构建表达及其功能的初步研究》文中认为EB病毒是全世界流行的γ型人类疱疹病毒,具有嗜B淋巴细胞性,病因学上与中国南方地区及东南亚的未分化型鼻咽癌（uNPC）、非洲赤道地区的Burkitt淋巴瘤关系密切,这两种疾病在其他地区却比较少见。目前EB病毒及其相关肿瘤的治疗方法依然有限,鉴于病毒在这些疾病的发病机制中所扮演的重要角色,采用EB病毒蛋白抗原的分子干预措施可能是预防治疗EB病毒相关疾病的有效措施。在这些方案中,疫苗接种免疫应该是研究中的首要选择,在本课题中,我们通过基因工程技术构建了gp350和C3d3的融合质粒,希望表达的融合蛋白在进一步研究中具有特异的免疫原性。目的构建EB病毒包膜糖蛋白gp350全长序列及其与三个补体片段C3d串联基因在人体真核细胞中表达的载体,并进行其免疫功能的初步研究。方法以pcDNA3.1+gp350为模板PCR扩增出gp350 cDNA全长片段,将PCR产物经BglⅡ和BamHⅠ酶切消化后与经同样两个限制性内切酶消化的真核表达载体pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d3.YL连接,转化后挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定并测序;然后将纯化的重组载体用脂质体法分别转染人类Hela细胞培养24h,分别用Western blot及细胞免疫化学染色检测gp350蛋白和gp350-C3d3融合蛋白的表达。结果成功构建含gp350全长基因序列的载体pSG.SS.gp350.YL和pSG.SS. gp350.C3d3.YL;转染人类Hela细胞后,经细胞免疫化学染色及Western blot检测显示:转染组均能常规水平表达,对照组则无该蛋白表达,但两转染组的表达量无明显差异。结论成功构建gp350的两个真核表达质粒,并能够在人体Hela细胞中表达相应蛋白,为下一步进行在体内免疫环境下检测其生物学活性奠定基础。
李德良[10]（2006）在《HIV的噬菌体核酸疫苗的制备及其初步应用研究》文中研究表明人类免疫缺陷病毒是引起艾滋病的病原体，分为两型，HIV-1和HIV-2，HIV-1在全球范围传播广泛，是艾滋病流行的主要病原体。目前，人类免疫缺陷病毒感染的流行尚处于早期阶段，在未来的二十年内，全世界HIV感染率会明显升高。当前，没有一种预防性疫苗，也没有一种抗逆转录病毒药物对艾滋病流行产生显着的影响。对于发展中国家来说抗逆转录病毒药物价格昂贵，又出于病人对抗逆转录病毒药物的依从性不好，耐药性以及药物的毒性等因素，限制了抗逆转录病毒药物的广泛使用和疗效。因此，迫切需要一种价格低廉、依从性好、无明显毒性、耐药性小的治疗措施。 用于治疗的疫苗也许能够符合这种标准，近年来对亚单位疫苗、多肽疫苗、减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组病毒载体疫苗及核酸疫苗等多种不同的HIV候选疫苗进行了大量的研究。减毒活疫苗虽能诱发一定的体液免疫和细胞免疫，但安全性始终是个大问题。而灭活疫苗和亚单位疫苗在临床人体试验中的效果并不理想。活载体疫苗具有很好的免疫原性，但也存在安全隐患。因此，人们对核酸疫苗寄予厚望，其最大的优点是疫苗抗原在靶细胞内以天然的方式合成、加工并呈递给免疫系统，可以诱发机体产生强大的体液和细胞免疫应答包括Th应答和CTL应答，并且其保护性免疫应答对不同亚型的病
二、Epstein-Barr病毒基因工程亚单位疫苗膜抗原gp340/220的纯化及其免疫学特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Epstein-Barr病毒基因工程亚单位疫苗膜抗原gp340/220的纯化及其免疫学特性（论文提纲范文）
（2）中国仓鼠卵巢细胞表达系统在疫苗研制中的应用（论文提纲范文）
| 1 CHO细胞表达体系及其特点 |
| 2 CHO细胞表达疫苗 |
| 2.1 乙肝疫苗 |
| 2.2 Epstein-Barr病毒 (EBV) 疫苗 |
| 2.3 艾滋病病毒 (HIV) 疫苗 |
| 3 小结 |
（3）人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 疫苗抗原表达系统 |
| 1.1 疫苗抗原表达系统比较 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 2 EV71病毒研究现状 |
| 2.1 EV71病毒 |
| 2.2 EV71与手足口病 |
| 2.3 EV71病毒预防策略 |
| 3 EBV病毒研究现状 |
| 3.1 EBV病毒 |
| 3.2 EBV与肿瘤发生 |
| 3.3 EBV及其相关疾病的防治方法 |
| 第二章 重组VP1蛋白诱导抗病毒免疫反应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 VP1真核表达载体的构建 |
| 1.4 重组VP1表达菌株的构建与筛选 |
| 1.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.6 BCA蛋白质定量分析 |
| 1.7 SDS-PAGE与Western blot检测 |
| 1.8 动物实验 |
| 1.9 小鼠免疫血清中IgG和IgM水平检测 |
| 1.10 小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应检测 |
| 1.11 小鼠脾脏细胞因子检测 |
| 1.12 外周血单核细胞的分离 |
| 1.13 细胞计数 |
| 1.14 流式细胞仪检测 |
| 1.15 EV71病毒培养 |
| 1.16 蔗糖密度梯度离心法分离纯化EV71病毒 |
| 1.17 病毒中和实验 |
| 1.18 小鼠被动保护实验 |
| 1.19 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 VP1密码子优化 |
| 2.2 重组VP1的真核表达及纯化 |
| 2.3 VP1诱导小鼠体液免疫反应 |
| 2.4 病毒中和实验 |
| 2.5 被动保护实验 |
| 2.6 VP1刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖 |
| 2.7 VP1刺激细胞因子水平的变化 |
| 2.8 VP1促进小鼠脾脏和外周血T细胞的增多 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组VP1在毕赤酵母系统中高效表达 |
| 3.2 重组VP1诱导小鼠体液与细胞免疫应答 |
| 3.3 重组VP1作为EV71候选疫苗的应用前景 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 毕赤酵母表达的EBV核抗原EBNA1的免疫原性研究 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 序列优化与合成 |
| 1.2 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.3 重组表达菌株的构建与筛选 |
| 1.4 重组E1△GA的真核表达和纯化 |
| 1.5 BCA蛋白定量法 |
| 1.6 细胞培养 |
| 1.7 小鼠免疫实验 |
| 1.8 ELISA检测小鼠免疫血清中IgG和IgM水平 |
| 1.9 小鼠脾脏淋巴细胞的分离与培养 |
| 1.10 淋巴细胞增殖实验 |
| 1.11 免疫小鼠脾脏细胞因子检测 |
| 1.12 外周血单核细胞的分离 |
| 1.13 细胞计数 |
| 1.14 流式细胞仪检测淋巴细胞亚群比例 |
| 1.15 统计学分析 |
| 1.16 序列提交 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 E1AGA序列优化 |
| 2.2 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3 重组E1△GA的真核表达 |
| 2.4 重组E1△GA的大量表达及纯化 |
| 2.5 重组E1△GA诱导小鼠体液免疫反应 |
| 2.6 E1△GA刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖 |
| 2.7 E1△GA对脾脏细胞因子水平的影响 |
| 2.8 E1△GA促进小鼠脾脏和外周血中T细胞的增多 |
| 3 讨论 |
| 3.1 在真核系统中成功大量表达E1△GA蛋白 |
| 3.2 密码子优化能够提高外源蛋白表达水平 |
| 3.3 重组E1△GA蛋白的免疫原性研究 |
| 3.4 重组E1△GA作为EBV疫苗的应用价值 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 EBV包膜糖蛋白gp350在毕赤酵母中的表达 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 EBV包膜糖蛋白gp350序列合成 |
| 1.2 真核表达载体pPICZαA-gp350的构建 |
| 1.3 重组表达载体的鉴定 |
| 1.4 重组gp350表达菌株的构建及鉴定 |
| 1.5 真核重组载体的诱导表达 |
| 1.6 SDS-PAGE与Western blot检测 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 gp350晶体结构与序列优化 |
| 2.2 重组表达载体的构建 |
| 2.3 重组gp350的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（5）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（6）EB病毒潜伏膜蛋白2A蛋白负载树突状细胞激发特异性CTL的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 创新点 |
| 研究背景 |
| 一、EBV感染的特点 |
| 二、EBV感染与宿主免疫 |
| 三、鼻咽癌研究现状 |
| 四、以EB病毒LMP2为靶抗原的弃咽癌特异性免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 第一节:EB病毒LMP2A基因重组逆转录病毒和稳定表达LMP2A细胞株的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 第二节:人外周血树突状细胞的培养鉴定及EB病毒LMP2A蛋白的负载 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节:EB病毒潜伏膜蛋白2A蛋白负载树突状细胞激发特异性CTL的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 附录二 |
| 博士在读期间已发表和待发表的学术论文及获得奖励 |
（8）马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 马疱疹病毒1型病原学及其作为活病毒载体应用 |
| 1.EHV-1病毒学特性 |
| 1.1 病毒分类及形态 |
| 1.2 病毒复制 |
| 1.3 部分糖蛋白及毒力基因 |
| 1.4 流行 |
| 2.临床症状 |
| 3.动物模型 |
| 4.感染性细菌人工染色体 |
| 5.EHV-1作为活病毒载体的应用 |
| 5.1 抗载体免疫及安全性 |
| 5.2 外源基因包装能力 |
| 参考文献 |
| 第二章 SS2重要的保护性抗原及疫苗研究 |
| 1.病原学 |
| 2.流行病学 |
| 3.毒力因子及保护性抗原 |
| 3.1.荚膜多糖(Capsular polysaccharide) |
| 3.2.MPR(Muramidase-released protein)和EF(Extra-cellular protein factor) |
| 3.3.溶血素(Suilysin,SLY) |
| 3.4.38-kDaprotein |
| 3.5.GDH |
| 3.6.次黄嘌呤核苷酸脱氢酶 |
| 3.7.TRAG |
| 4.SS2的诊断及防制 |
| 4.1 SS2的诊断 |
| 4.2 疫苗的研究、应用及展望 |
| 参考文献 |
| 实验部分 |
| 第三章 EHV-1细菌人工染色体构建及鉴定 |
| 摘要 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 转移载体p19_20/HA的构建 |
| 1.2 转移载体线性化及转染鉴定 |
| 1.3 重组病毒的构建及纯化 |
| 1.4 提取病毒基因组环状中间体 |
| 1.5 电转化及p438/77的鉴定 |
| 1.6 p438/77的传代稳定性及病毒的拯救 |
| 1.7 转移载体p1920XM和r_4XM恢复株的构建 |
| 1.8 病毒体外培养特性的鉴定 |
| 2.结果 |
| 2.1 转移载体的构建及鉴定 |
| 2.2 线性化转移载体转染RK13细胞 |
| 2.3 重组病毒4/G株的构建和纯化 |
| 2.4 病毒基因组环状中间体的提取及电转化大肠杆菌 |
| 2.5 p438/77转染RK13拯救病毒 |
| 2.6 无痕有标记r_4XM恢复株的构建 |
| 2.7 体外培养特性的鉴定 |
| 3.结论和讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 SS2溶血素突变体在原核和真核细胞中表达、活性及抗原性鉴定 |
| 摘要 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 基因克隆及质粒构建 |
| 1.2 SS2溶血素的提取及单抗特异性鉴定 |
| 1.3 溶血素及突变体的诱导表达及鉴定 |
| 1.4 转染PK15细胞瞬时表达溶血素突变体 |
| 1.5 溶血活性试验 |
| 1.6 SLY和SLYm的细胞毒性 |
| 1.7 小鼠毒力试验 |
| 1.8 小鼠免疫试验 |
| 2.结果 |
| 2.1 基因克隆及表达载体的构建 |
| 2.2 抗链球菌2型溶血素单抗的特异性鉴定 |
| 2.3 诱导表达及免疫转印鉴定 |
| 2.4 真核细胞瞬时表达溶血素突变体 |
| 2.5 溶血活性及抑制试验 |
| 2.6 细胞毒性 |
| 2.7 小鼠的毒力试验 |
| 2.8 小鼠免疫试验 |
| 3.结论和讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 表达SS2溶血素突变体及mrp基因片段EHV-1重组病毒的构建 |
| 摘要 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 质粒、细菌、细胞和病毒 |
| 1.2 DNA聚合酶N752缺失 |
| 1.3 4△N多中Pcmv启动子的改造 |
| 1.4 mrp基因片段瞬时表达及鉴定 |
| 1.5 表达SS2mrp重组病毒的构建及鉴定 |
| 1.6 表达SS2slyom重组病毒的构建及鉴定 |
| 1.7 删除重组病毒的Mini-F序列 |
| 1.8 小鼠免疫试验 |
| 2.结果 |
| 2.1 DNA聚合酶N752缺失 |
| 2.2 4△N株中Pcmv启动子的改造 |
| 2.3 mrp基因片段瞬时表达及鉴定 |
| 2.4 表达SS2MRP片段重组病毒的构建及鉴定 |
| 2.5 表达SS2溶血素重组病毒的构建及鉴定 |
| 2.6 删除重组病毒中mini-F序列 |
| 2.7 小鼠免疫试验 |
| 3.结论和讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录引物及说明 |
| 致谢 |
（9）gp350基因与gp350-C3d3融合基因真核表达质粒的构建表达及其功能的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 真核表达载体pSG.SS.gp350.YL 和pSG.SS.gp350-C3d3.YL 构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 重组质粒在真核细胞Hela 中的表达及检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 EB病毒的主要抗原在鼻咽癌疫苗研究中的进展 |
| 参考文献 |
| 硕士阶段发表的论文 |
（10）HIV的噬菌体核酸疫苗的制备及其初步应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 HIV-1B亚型候选基因及gfp基因在原核细胞中的表达及其多克隆抗体的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HIV-1B亚型候选基因及gfp基因真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 HIV-1噬菌体疫苗的制备及其免疫学特性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 原创性声明及版权使用授权说明 |
四、Epstein-Barr病毒基因工程亚单位疫苗膜抗原gp340/220的纯化及其免疫学特性（论文参考文献）
- [1]Epstein-Barr病毒基因工程亚单位疫苗膜抗原gp340/220的纯化及其免疫学特性[J]. 项树林,肖瑶,李燕,朱秋屏,谷淑燕. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [2]中国仓鼠卵巢细胞表达系统在疫苗研制中的应用[J]. 谢秋玲,陈小佳,戴云,汪炬,洪岸,林剑. 中国公共卫生, 2004(07)
- [3]人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究[D]. 王曼. 武汉大学, 2014(01)
- [4]Epstein-Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达、纯化及其免疫原性[J]. 刘展,周为民,谷淑燕. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [5]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [6]EB病毒潜伏膜蛋白2A蛋白负载树突状细胞激发特异性CTL的研究[D]. 陈云. 南京医科大学, 2007(04)
- [7]痘苗病毒天坛株载体研究与应用概述[J]. 阮力. 微生物与感染, 2013(01)
- [8]马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建[D]. 孙学强. 南京农业大学, 2010(06)
- [9]gp350基因与gp350-C3d3融合基因真核表达质粒的构建表达及其功能的初步研究[D]. 宋天喜. 第三军医大学, 2011(12)
- [10]HIV的噬菌体核酸疫苗的制备及其初步应用研究[D]. 李德良. 第一军医大学, 2006(01)