一、梅花鹿对卡介苗的免疫应答及最佳免疫方法的研究（论文文献综述）
张俊才,简子健,邓普辉,侯顺利,曾发贵,马正海,陈国利[1]（2003）在《不同佐剂对卡介苗的免疫增强作用》文中提出以牛型结核分枝杆菌敏感动物豚鼠为实验动物 ,分别以猪苓多糖 （PUP）、IL-2和 IL-3真核表达质粒为免疫佐剂 ,比较研究 3种佐剂对卡介苗 （BCG）免疫效果的调节作用和免疫器官的病理变化。在首免后第 50 d和二免后第 50 d,进行间接 EL ISA和 MTT比色检测及组织病理学检测 ,结果显示 ,PUP和 IL -2真核表达质粒、IL -3真核表达质粒均能增强豚鼠体液免疫和细胞免疫应答 （P <0 .0 5或 P <0 .0 1 ） ,而 PUP的佐剂作用则更为突出
张俊才[2]（2001）在《不同佐剂对卡介苗的特异性体液免疫与非特异性细胞免疫的免疫增强作用的研究》文中提出以牛型结核分枝杆菌敏感动物豚鼠为实验动物，以猪苓多糖、IL-2和IL-3真核表达质粒为免疫佐剂，从细胞免疫和体液免疫水平以及组织水平上比较研究了三种佐剂对卡介苗（BCG）免疫效果的调节作用和免疫器官的病理变化。实验组豚鼠用三种佐剂分别与BCG免疫接种，对照组分BCG对照和空白对照，BCG对照组只注射BCG，空白对照组只注射生理盐水。三种佐剂均采用肌内注射，BCG采用皮内注射。结果如下：⑴体液免疫检测结果：首免后第五十天和二免后第五十天，ELISA检测结果显示多糖（猪苓多糖）组OD值极显着高于BCG组和空白对照组（p<0.01），IL-2真核表达质粒组和IL-3真核表达质粒组的OD值均显着或极显着高于BCG组和空白对照组（p<0.05或p<0.01）。提示猪苓多糖、IL-2、IL-3真核表达质粒均能有效地增强BCG引起的豚鼠的体液免疫，而多糖的作用尤为明显。⑵细胞免疫检测结果：首免后第五十天和二免后第五十天，LTT检测结果显示多糖（猪苓多糖）组OD值极显着高于BCG组和空白对照组（p<0.01），IL-2真核表达质粒组和IL-3真核表达质粒组的OD值均显着或极显着高于BCG组和空白对照组（p<0.05 或p<0.01）。提示猪苓多糖、IL-2、IL-3真核表达质粒均能有效地增强BCG引起的细胞免疫应答，多糖的作用更为突出。⑶组织病理学结果：两次免疫后结果均显示，猪苓多糖（PUP）组和IL-2、IL-3真核表达质粒组的脾脏及淋巴结T细胞区增生的的淋巴滤泡数均显着高于BCG组和空白对照组，猪苓多糖组的淋巴滤泡增生数更为显着，进一步证实三种佐剂均能有效地促进机体的细胞免疫应答，猪苓多糖的佐剂作用则更为突出。
张云[3]（2014）在《牛病毒性腹泻—黏膜病病毒E0基因和E0-E2融合基因重组卡介苗的构建及免疫原性分析》文中研究表明牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一种可以感染牛、羊、鹿、猪等多种动物的传染病，是长期危害动物养殖业健康发展的严重疾病之一，被国际兽疫局（Office International des Epi-zooties，OIE）定为B类传染病。鉴于当前BVD的流行态势和防治现状，安全有效的BVDV疫苗亟待研发。E0、E2蛋白是BVDV的两个主要保护性抗原，均可用于基因工程疫苗的研究。近年来，国内外学者利用不同的基因、表达系统和疫苗形式，在BVDV新型疫苗的研发上做了很多有益的工作。本研究选择E0、E2基因构建重组卡介苗，开展BVD疫苗的免疫原性研究。本试验首先对C24V标准株的E0基因进行截短和密码子优化，用中心模板法人工合成优化后的E0截短基因，运用重叠延伸剪接术将其与changchun184特异株的E2截短基因进行融合后分别亚克隆至表达载体pMV261和pMV361中构建重组表达质粒；然后将构建的重组表达质粒分别电转化入卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）中，经抗酸染色和菌液PCR鉴定后，在45℃条件下热诱导各重组卡介苗（recombinant BCG，rBCG）总蛋白的表达，并进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测；最后将构建的各rBCG和本实验室已构建的rBCG-pMV361-E2免疫小鼠，运用间接ELISA法检测其血清中的特异性抗体水平，用CCK-8法分析其脾脏中淋巴细胞增殖情况，用生物素双抗体夹心ELISA法分别测定其血清中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12水平，用流式细胞术检测其脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群含量等指标，对各rBCG的免疫效力进行综合评价。结果成功扩增出了mE0基因和E0-E2融合基因，构建了pMV261-mE0、pMV261-E2、pMV261-E0-E2、pMV361-mE0和pMV361-E0-E2重组表达质粒；在卡介苗中成功表达了大小为18kDa、43.9kDa和66.5kDa的目的蛋白，且具有反应原性；各rBCG免疫小鼠后均能在不同程度上刺激小鼠产生抗BVDV的抗体，经抗原刺激后小鼠淋巴细胞数量均有所增加，免疫期间IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的含量变化表明各rBCG均能够刺激Th1和Th2型反应，且较倾向于Th2型反应，三免后CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的含量均有所变化，表明构建的rBCG均可以在一定程度上诱导小鼠机体产生体液和细胞免疫应答反应，且较侧重于体液免疫应答反应。总体而言，rBCG-pMV261-E0-E2的免疫效果较强于其余各组。本研究证实了E0-E2融合蛋白能提高单一抗原的免疫特性，可作为研发BVDV新型疫苗的候选。成功构建rBCG-pMV261-E0-E2菌株，为研制可同时预防牛病毒性腹泻-黏膜病和结核病的二价基因工程疫苗奠定基础。
刘菲[4]（2018）在《布鲁氏菌S2-BCSP31缺失疫苗株的构建及免疫效果初步评价》文中认为布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的一种严重的人畜共患传染病,在世界各地均有发生,发展中国家尤为严重。布鲁氏菌是典型的胞内寄生菌,其侵袭能力强,感染的宿主及途径广,现已知能够感染布鲁氏菌的动物多达60余种,猪、牛、羊均为易感动物,且各家畜之间存在交叉感染。近年来随着牛、羊布鲁氏菌疫情的回升,吉林省梅花鹿布鲁氏菌病时有发生,患病圈养的鹿已成为人类感染布鲁氏菌病的重要传染源之一,影响国民经济,同时给人类健康及畜牧业发展造成严重影响。预防和控制布鲁氏菌病的首要措施是减毒疫苗免疫,但疫苗免疫后持续产生抗体,常规的血清学检测方法不能区分自然感染和人工免疫动物,不利于布鲁氏菌病的防控与净化。BCSP31基因作为布鲁氏菌的保护性抗原,具有良好的免疫原性,有研究表明该基因的缺失不影响布鲁氏菌的生存,可以作为缺失株疫苗的靶基因。因此,本研究在对吉林省梅花鹿布鲁氏菌流行情况及相关风险分析的基础上,选定S2疫苗株为亲本株,构建布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株,以布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株感染巨噬细胞,分析BCSP31基因在布鲁氏菌逃避宿主免疫机制中的作用机制,并对构建的缺失株安全性及保护性进行评估;以BCSP31蛋白为包被抗原建立ELISA检测方法,对布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株作为候选疫苗株的可行性分析;以期对布鲁氏菌病的防控与致病机制提供理论基础。主要实验结果如下:1、通过虎红平板凝集试验和荧光定量PCR方法对采集的458份梅花鹿血液样本进行血清学及分子生物学检测,虎红平板凝集检测57份阳性血清,4份疑似血清;荧光定量PCR共检测59份阳性样本,总阳性率为12.9%（59/458）;其中猪种布鲁氏菌27份、羊种布鲁氏菌19份、牛种布鲁氏菌13份,分析季节为梅花鹿感染布鲁氏菌的风险因素。2、以S2为亲本株,利用同源重组技术构建布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株,生物学特性鉴定证明S2-BCSP31缺失株在形态学、生长特性、生化特性等方法与亲本株保持一致;连续传20代及保存12个月后的S2-BCSP31缺失株具有良好的遗传稳定性;Western Blot鉴定表明缺失株不与rBCSP31蛋白高免血清发生反应,BCSP31蛋白在缺失株中不表达,说明S2-BCSP31缺失株构建成功。3、建立S2-BCSP31缺失株和S2疫苗株巨噬细胞体外感染模型,分析BCSP31缺失对巨噬细胞分泌炎症因子及自噬互相作用的影响,结果表明S2-BCSP31缺失株上调IL-12、IL-β的表达,下调IL-6、TNF-α炎症因子的表达,有利于LC3B、Beclin、p62、Bcl2蛋白表达。对布鲁氏菌诱导的PI3K/Akt/mTOR和MER/ERK信号通路蛋白表达分析,证实S2-BCSP31缺失株有利于PI3K/Akt/mTOR自噬途径激活。抑制该通路后自噬相关基因LC3B、Beclin及ULK的mRNA表达水平和胞内菌落数下降,证明该通路激活有利于S2-BCSP31缺失株在巨噬细胞内存活。4、免疫小鼠后,毒力残留实验结果显示S2-BCSP31缺失株与S2亲本株免疫的小鼠脾脏重量及含菌量基本吻合,证明构建的缺失株与亲本株生物安全性无差别;抗体检测和细胞因子检测结果表明S2-BCSP31缺失株与S2亲本株诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫之间差异不显着。攻毒后结果显示:S2-BCSP31缺失株能够抵抗M28、2308、1330强毒攻击,小鼠的脾脏重量及含菌量S2-BCSP31缺失株组和S2疫苗株组之间差异不显着,但与阴性对照组差异极显着（p<0.01）,证明S2-BCSP31缺失株与S2疫苗株在短期内产生的免疫保护力一致,布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株具有良好的潜力。5、以rBCSP31蛋白为抗原建立ELISA检测方法,结果表明M28、1330、2308攻毒及S2疫苗株免疫小鼠血清呈阳性,S2-BCSP31缺失株免疫小鼠血清呈阴性,证明该方法能够区分S2-BCSP31缺失株免疫及其他自然感染的血清,为建立与标记疫苗配套的检测方法奠定理论和实践基础。综上所述,本研究构建的布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株具有良好安全性及保护性,具备从血清学角度区分布鲁氏菌S2-BCSP31及野毒感染的能力,作为疫苗有良好的应用前景,对布鲁氏菌病防制、监测、净化及致病机制研究具有重要的意义。
陈国利[5]（2002）在《白细胞介素-2（IL-2）作为卡介苗（BCG）免疫佐剂的免疫调节作用的研究》文中指出本实验以卡介苗（BCG）作为抗原，以白细胞介素2（IL-2）作为免疫佐剂注射敏感动物豚鼠。从体液免疫和细胞免疫水平以及组织细胞水平上比较研究了IL-2对卡介苗BCG免疫效果的调节作用和免疫器官的变化。 实验动物豚鼠分为三组，即IL-2+BCG组、BCG组、空白对照组。其中BCG采用皮内注射，IL-2采用肌肉注射。结果发现： （1）免疫第二周后，BCG+IL-2组特异性和非特异性淋巴细胞转化实验所测LTT-OD值与BCG组和空白组无明显差异（P＞0.05），第四周时检测数值开始出现升高，第六周时LTT检测结果显示IL-2+BCG组的特异性和非特异性的LTT-OD值极显着高于BCG组和空白对照组（P＜0.01）。第十六周时IL-2+BCG组第2次注射IL-2，结果在第十八周和二十周时非特异性和特异性淋巴细胞转化实验所测LTT-OD值极显着增强（P＜0.01）。提示IL-2能有效地增强非特异性细胞免疫应答和特异性细胞免疫应答。 （2）用酶联免疫吸附法（EILSA法）检测，结果显示BCG+IL-2组与BCG组都有抗体存在，但无明显差异（P＞0.05），提示IL-2在提高体液免疫应答方面无明显作用。 （3）组织病理学显示，IL-2+BCG组的脾脏及淋巴结T细胞区显着增生，有淋巴滤泡形成，其数量极显着（P＜0.01）高于BCG组和空白组。进一步证明了IL-2促进机体的细胞免疫应答的有效性和显着性。
张梦,时坤,刘晓,陈丽娟,于淼,刘东旭,杜锐[6]（2011）在《卡介苗预防动物结核病的研究进展》文中指出全球结核病疫情呈上升趋势,卡介苗是预防该病的有效制剂,对卡介苗进行更加深入的研究显得尤为重要。本文从BCG免疫时间的选择、剂量、接种方式、免疫次数及佐剂等方面介绍了目前BCG的研究进展。
刘清河,王全凯,胡桂学,王树志[7]（1995）在《梅花鹿对卡介苗的免疫应答及最佳免疫方法的研究》文中指出为确定ＢＣＧ对鹿结核病的免疫效果，应用冻干和湿ＢＣＧ分别对初生仔鹿进行不同免疫途径、不同免疫剂量的效果观察以及ＢＣＧ对鹿免疫程序的研究．研究结果表明：仔鹿出生后２４小时内皮下注射冻干ＢＣＧ０．７５ｍｇ／头为最佳免疫途径和剂量；免疫程序是：出生２４小时内第一次免疫、第二年５月份第二次免疫、第三年５月份第三次免疫。每次间隔１２个月，剂量为０．７５ｍｇ／头皮下注射。
李哲[8]（2018）在《结核分枝杆菌胞内存活相关PE/PPE蛋白的筛选及其致病特性研究》文中提出结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis,Mtb）是引起人结核病（Tuberculosis,TB）的病原菌。在人类的进化史中始终伴随着与此类病菌的抗争,并与人共同进化不被杀灭。该菌的出现最早可以追溯到5万年前的非洲人时期,并且到目前为止仍然不能被良好的控制和消灭,它可称之为微生物系统中的佼佼者,被世界卫生组织列为全球十大致死性病原之一。结核分枝杆菌之所以难以清除,关键在于其结构的复杂性、分泌系统的特殊性以及进化出的多种逃逸宿主免疫应答的机制。结核分枝杆菌的Ⅶ型分泌系统,是最晚发现的一类分泌系统,也是我们了解最少的一类分泌系统。尽管Ⅶ型分泌系统处理和转运底物的细节还未阐明,但有研究推测,致病性分枝杆菌特有的PE/PPE蛋白很可能由该系统分泌。分枝杆菌属成员众多,但PE/PPE家族仅存在于结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌等具有致病性的分枝杆菌中,推测该家族成员很可能与分枝杆菌的致病性密切相关。PE/PPE家族包含PE和PPE两个亚家族,是分枝杆菌特有的,占结核分枝杆菌基因组容量的10%。PE亚家族蛋白特征是N端具有保守的P（Pro）-E（Glu）氨基酸序列,C端长度不一,不具有统一特征;PPE亚家族蛋白特征是N端具有保守的P（Pro）-P（Pro）-E（Glu）氨基酸序列,大部分成员C端具有特征性基序,少部分成员C端序列同源性很低,无特征性基序。PE/PPE家族蛋白保守的特征性序列可能与蛋白在菌体内的定位和分泌有关,而可变区多样并且易发生变异,这可能与菌体适应宿主环境、感染机体致病相关。巨噬细胞遍布于全身各处,能够捕捉从各种途径入侵的病原体并将其清除,是机体天然免疫系统的一道重要防线。结核分枝杆菌为胞内寄生菌,感染机体后主要寄居在巨噬细胞内,并且能够在巨噬细胞内生存和繁殖并不被杀灭。结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中,与体外培养条件相比,PE/PPE家族蛋白显示出表达量的显着差异。多项研究证明,该家族成员参与构成分枝杆菌细胞壁的结构,作为细菌表面蛋白,通常都在与宿主细胞的互作中发挥关键作用。以上这些发现提示我们,PE/PPE蛋白很可能与分枝杆菌在巨噬细胞内的存活、分枝杆菌的免疫逃逸有相关性。本研究证实了结核分枝杆菌PE/PPE家族的PE17蛋白能够促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活,并增强了耻垢分枝杆菌对巨噬细胞毒性和对小鼠的致病性。首先,我们基于穿梭表达载体pMVTC-C构建了156个超表达结核分枝杆菌H37Rv PE/PPE家族蛋白的重组质粒,分别电转化耻垢分枝杆菌MC2155菌株（MS）,建立了包含144株重组耻垢分枝杆菌的菌株库,接着通过感染小鼠腹腔巨噬细胞的模型,筛选出6株（分别超表达以下6个蛋白:RS23（Rv0124）、RS48（Rv2853）、PE17（Rv1646）、PE30（Rv1651c）、PE35（Rv3872）和PPE8（Rv0355c））在小鼠腹腔巨噬细胞内存活力显着提高的重组耻垢分枝杆菌。之后,我们从中选取了PE17（Rv1646）这一个蛋白,进行后续深入的研究。为了确认PE17蛋白在耻垢分枝杆菌中的亚细胞定位情况,我们构建了超表达PE17蛋白的pAIC-PE17-MS重组耻垢分枝杆菌菌株,差速离心法分级分离菌体的培养滤液（CF）、菌体全细胞裂解产物（WCL）、菌体细胞壁（CW）、菌体细胞质（Cy）和菌体细胞膜（CM）,经由Western Blotting检测确定了PE17蛋白定位于耻垢分枝杆菌的胞壁（CW）和胞质（Cy）。为了研究PE17蛋白对耻垢分枝杆菌形态以及在增强耻垢分枝杆菌体内外感染中的作用,我们构建了pMV262-PE17-MS重组耻垢分枝杆菌,菌体特性观察证实,表达的PE17蛋白并不影响耻垢分枝杆菌的菌落和菌体形态以及胞壁的结构。体外感染小鼠腹腔巨噬细胞试验证实,PE17蛋白促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活作用很可能是微量高效的,它能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞促炎因子的释放,引起细胞坏死。静脉注射感染小鼠的体内试验进一步证实,PE17蛋白能够显着延长耻垢分枝杆菌在小鼠体内的存活时间,明显增强耻垢分枝杆菌对小鼠脏器的损伤。同时,感染小鼠体内IFN-γ和IL-1β的含量持续保持在较高水平,预示着菌体难以被机体清除,也部分解释了PE17蛋白的重组耻垢分枝杆菌对脏器损伤力增强这一现象的原因。本试验从144株耻垢分枝杆菌转化株中筛选出了6株能促进在巨噬细胞内存活的菌株,通过细胞感染和小鼠体内感染模型验证了结核分枝杆菌PE17蛋白对结核分枝杆菌致病力的贡献,本研究的开展鉴定了结核分枝杆菌新的毒力因子,为治疗结核的药物研发提供了新的候选靶标,也为结核病防控增添了新的理论依据。
孙凡婷[9]（2015）在《Ag85B和19kDa信号肽介导BVDV E0-E2融合基因在rBCG中的表达及其免疫原性分析》文中指出牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）为黄病毒科（Flaviviridae）,瘟病毒属（Pestivirus）成员,是牛病毒性腹泻-黏膜病的病原,其临床表现为,病畜发热、腹泻、怀孕母畜流产或产畸形胎、持续感染等。E0、E2蛋白为BVDV主要的保护性抗原,能够刺激机体产生中和BVDV的抗体,成为研究BVDV基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。信号肽在介导蛋白质分泌表达与抗原递呈途径方面具有重要的作用。目前,应用的结核分枝杆菌信号肽主要有Ag85B蛋白和19kDa脂蛋白。本研究中同时选择Ag85B蛋白和19kDa脂蛋白信号肽介导E0、E2在重组卡介苗中表达。本实验应用重叠延伸剪接技术将Ag85B蛋白和19kDa脂蛋白信号肽基因分别与C24V标准株的E0截短基因、changchun184株的E2截短基因、E0-E2融合基因进行拼接,将融合基因与穿梭表达载体pMV261连接,将重组表达质粒电转至卡介苗中构建重组卡介苗,将筛选的阳性重组卡介苗,在45℃条件下热诱导目的基因的表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测。将构建的重组卡介苗免疫小鼠,分别检测血清中BVDV和BCG抗体水平、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12水平,以及脾脏中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群含量、淋巴细胞增殖情况,进而对rBCG的免疫效果进行评价。研究成功构建了六个重组卡介苗,分别为rBCG-Ag85B-E0、rBCG-19kDa-E0、rBCG-Ag85B-E2、rBCG-19kDa-E2、rBCG-Ag85B-E0-E2和rBCG-19kDa-E0-E2。对构建的rBCG进行SDS-PAGE,结果显示信号肽诱导的rBCG产生的蛋白主要集中在沉淀中。将rBCG免疫小鼠后,免疫小鼠的血清中BVDV抗体水平均有不同程度的升高,在42d时,rBCG组中rBCG-19kDa-E2组血清中抗体水平要显着高于其他各组。IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12细胞因子的水平在免疫期间均呈现上升趋势,且IFN-γ的含量水平在所测得的细胞因子中具有显着的优势,因此表明所构建的rBCG主要诱导Th1型细胞免疫应答。在CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群含量测定中,CD4+细胞所占的比例约为%具有主导优势的,而19kD诱导的重组卡介苗产生的CD8+T淋巴细胞亚群含量水平较高。研究结果表明构建的重组卡介苗在一定程度上诱导机体产生体液免疫和Th1型细胞免疫应答反应,且引入19kDa信号肽序列提高可重组卡介苗的免疫效果。本研究证实了信号肽介导的重组卡介苗可增强其免疫效果,其中19kDa信号肽介导的表达E2基因的重组卡介苗免疫效果好于其他组别,可作为BVDV新型疫苗的候选疫苗。
匡有吉[10]（2008）在《梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用》文中指出牛结核病（Bovine Tuberculosis,bTB）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织（Office International DesEpizooties,OIE）定为B类动物传染病,我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现,牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出:除非消灭牛结核,否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治,目前普遍采用的是“检疫-捕杀”政策,即检疫出的阳性牛一律捕杀来控制牛结核病。因此,准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应（Tuberculin skin test,TST）,结核菌素又称为纯化蛋白衍生物（purified protein derivatives,PPD）,是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质,含有多种抗原成分,用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份,检测时容易出现假阳性;结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此,研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法,是控制牛结核病当务之急。梅花鹿是特种经济动物,在人工饲养条件下可以生产繁殖,其主要产品鹿茸,被称为“东北三宝”之一,具有很高的经济价值。一些学者中认为鹿是牛结核的次要宿主,近年来对鹿的牛结核流行病学调查表明,在人工饲养的鹿场中牛结核种内感染的危险系数增加。感染了牛结核的梅花鹿产茸量下降,身体消瘦,对经济和公共卫生产生不利影响。对于野生动物,使用皮内结核菌素检测结核病时受到许多的限制,野生动物难以捕捉,每一物种的使用剂量及阳性判定没有统一标准,同时,TST本身也存在很大的缺陷。因此,研究敏感特异的梅花鹿结核新型诊断抗原和诊断方法,是控制梅花鹿结核病的当务之急。牛分枝杆菌（M.bovis）是细胞内寄生菌,RV3872、CFP-10和ESAT-6是M.bovis感染机体后分泌的主要抗原,诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时,灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强,而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题也已凸显出来,鉴于以上原因,本研究之一是对三种牛分枝杆菌抗原蛋白（RV3872、CFP-10和ESAT-6）进行了融合表达,旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。CFP-10和ESAT-6已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原,仅存在于致病性结核杆菌中,而在BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。而且在结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌中同源性达到100%,许多研究已经证实是非常有前景的鉴别诊断抗原,可以区分结核分枝杆菌（Mycobacterial tuberculosis,MTB）自然感染还是接种了卡介苗（Bacillus Calmette Guerin,BCG）。其融合蛋白CE（cfp10-esat6）具有单个抗原的免疫学活性。胶体金免疫层析技术（Gold-Immunochromatographic Assay GICA）是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高,而且不需昂贵仪器设备,操作简单快速。本论文利用融合蛋白CE（cfp10-esat6）建立了一种胶体金免疫层析法,旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法;同时克隆了RV3872基因,表达了RV3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白。主要研究内容归纳如下:1.表达和纯化CFP-10-ESAT-6融合蛋白并对其相关特性进行分析诱导表达融合蛋白CE（cfp10-esat6）,提纯蛋白质,并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白CE（cfp10-esat6）的多抗反应,说明该融合蛋白具有两个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示,融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性,作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2.牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理,用融合蛋白CE（cfp10-esat6）作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果波长为524nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为7.5;抗原最适标记量为每毫升胶体金0.96μg;抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗CE（cfp10-esat6）蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL,抗体效价为1:210;交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。3.梅花鹿结核特异性抗体间接ELISA检测方法的建立建立了MPB83-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA和MPB70-83-CE-ELISA,抗原包被浓度分别为100ng/mL,500ng/mL,500ng/mL和血清稀释度分别为1:800,1:200,1:200。OD630临界值分别为0.4,0.5,0.5。重复试验表明建立的梅花鹿结核特异抗体ELISA检测具有良好的可重复性。4.牛分枝杆菌特异性抗体间接ELISA方法和胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病胶体金抗体检测试纸条检测637份梅花鹿血清,同时用间接ELISA方法检测相同样品。结果表明它们之间有很高的符合率,为92.15%,快速检测牛分枝杆菌抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,在牛分枝杆菌的检测方面,具有良好的应用前景。5.RV3872、CFP-10和ESAT-6的融合表达酶切回收pET28a-cfp-10-esat6和pMD19-RV3872 T载体目的片段,然后将回收的pET28aCFP-10-ESAT-6线性片段、RV3872基因片段和退火的双链adapter进行连接反应,连接产物转化DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET28aRV3872-CFP-10-ESAT-6,质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞后,经IPTG诱导获得以可溶形式表达的融合蛋白。
二、梅花鹿对卡介苗的免疫应答及最佳免疫方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、梅花鹿对卡介苗的免疫应答及最佳免疫方法的研究（论文提纲范文）
（1）不同佐剂对卡介苗的免疫增强作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药品试剂 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 动物分组与接种 |
| 1.3.2 免疫检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的鉴定及纯化[7] |
| 2.1.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.2 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.1.3 质粒DNA纯度和浓度的检测 |
| 2.2 血清抗体检测[8] |
| 2.3 淋巴细胞体外增殖反应的检测 |
| 2.4 组织病理学结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同佐剂对机体免疫应答的调节作用与机体免疫器官的变化 |
| 3.2 免疫次数对BCG免疫效果的影响 |
| 4 结论 |
（2）不同佐剂对卡介苗的特异性体液免疫与非特异性细胞免疫的免疫增强作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 综述 |
| 1.1. 卡介苗防治结核病免疫效果回顾 |
| 1.2. 免疫佐剂的研究进展 |
| 1.2.1. 铝佐剂及其应用 |
| 1.2.2. 乳化的水∕油佐剂和植物油佐剂以及Ribi型油∕水乳剂的发展 |
| 1.2.2.1. 矿物油乳剂 |
| 1.2.2.2. 植物油佐剂 |
| 1.2.2.3. Ribi型油∕水乳剂的发展 |
| 1.2.3. 生物活性多糖 |
| 1.2.3.1. 黄芪 |
| 1.2.3.2. 猪苓多糖 |
| 1.2.4. 其它的一些佐剂与载体及内源性介质的研究进展 |
| 1.2.4.1. 脂肪族含氮碱类 |
| 1.2.4.2. 非离子型编组聚合物表面活性剂 |
| 1.2.4.3. 聚微粒载体 |
| 1.2.4.4. 脂质体 |
| 1.2.4.5. 细胞因子佐剂 |
| 1.2.4.5.1. 白细胞介素1 |
| 1.2.4.5.2. 白细胞介素2 |
| 1.2.4.5.3. 白细胞介素3 |
| 1.2.4.5.4. 白细胞介素6 |
| 1.2.5. 佐剂的联合使用 |
| 1.2.6. 免疫佐剂的发展前景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 主要试剂 |
| 2.2. 主要设备与仪器 |
| 2.3. 实验动物 |
| 2.4. 实验方法 |
| 2.4.1. IL-2和IL-3基因真核表达质粒的制备 |
| 2.4.1.1. 小鼠IL-2、IL-3基因片段的回收 |
| 2.4.1.2. 小鼠IL-2和IL-3基因真核表达质粒的构建及酶切鉴定 |
| 2.4.1.3. 小鼠IL-2基因真核表达质粒的测序鉴定 |
| 2.4.1.4. 质粒的大量提取及纯化 |
| 2.4.2. 动物接种实验 |
| 2.4.3. 免疫后血清抗体的检测（间接ELISA法 |
| 2.4.3.1. 间接ELISA法最佳反应条件的选择 |
| 2.4.3.2. 实验豚鼠的检测 |
| 2.4.4. 淋巴细胞体外增殖反应的检测（LTT |
| 2.4.4.1. 淋巴细胞体外增殖反应的检测-MTT比色法的建立 |
| 2.4.4.1.1. 淋巴细胞的分离 |
| 2.4.4.1.2. 细胞培养 |
| 2.4.4.1.3. 样品处理和结果显示 |
| 2.4.4.1.4. 淋巴细胞体外增殖反应的最佳条件选择 |
| 2.4.4.1.5. 实验豚鼠淋巴细胞体外增殖反应的检测 |
| 2.4.5. 病理学实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1. IL-2和IL-3基因真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.1. 小鼠IL-2和IL-3基因真核表达质粒的构建 |
| 3.1.2. 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.3. 重组质粒pCDNA3IL-2、pCDNA3IL-3的测序鉴定 |
| 3.1.4. 质粒DNA纯度和浓度的检测 |
| 3.2. 免疫后血清抗体的间接ELISA检测结果 |
| 3.2.1. 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 3.2.1.1. 抗原PPD最佳稀释度的确定 |
| 3.2.1.2. 血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2.2. 免疫后血清抗体的间接ELISA检测结果 |
| 3.2.2.1. 首免后ELISA法检测结果 |
| 3.2.2.2. 二免后ELISA法检测结果 |
| 3.3. 实验豚鼠淋巴细胞体外增殖反应（MTT比色法）的检测结果 |
| 3.3.1. 淋巴细胞体外增殖反应的最佳条件的确定 |
| 3.3.2. 首免后MTT比色法结果 |
| 3.3.3. 二免后MTT比色法结果 |
| 3.4. 组织病理学结果-免疫器官淋巴滤泡增生 |
| 4. 讨论 |
| 4.1. 关于结核病的细胞免疫 |
| 4.2. 淋巴细胞的体外增殖反应 |
| 4.3. 间接ELISA法最佳反应条件的选择 |
| 4.4. 细胞因子对机体免疫应答的调节作用 |
| 4.5. 佐剂对机体免疫应答的调节作用与机体免疫器官的变化 |
| 4.6. 免疫次数对BCG免疫效果的影响 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
（3）牛病毒性腹泻—黏膜病病毒E0基因和E0-E2融合基因重组卡介苗的构建及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒概述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒病原学 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒流行病学 |
| 1.3 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒感染症状及剖检变化 |
| 1.4 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的诊断 |
| 1.5 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的防制 |
| 1.6 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E_0、E_2基因研究进展 |
| 第二章 重组卡介苗研究进展 |
| 2.1 重组卡介苗的载体研究进展 |
| 2.2 重组卡介苗的应用现状 |
| 2.3 重组卡介苗存在的问题和展望 |
| 第三章 密码子优化技术研究进展 |
| 3.1 密码子优化技术的原理 |
| 3.2 密码子优化技术的应用 |
| 第四章 研究的目的和意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 BVDV E_0、E_2和 E_0-E_2融合基因重组表达质粒的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 BVDV E_0、E_2和 E_0-E_2融合基因在卡介苗中的表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 BVDV E_0、E_2和 E_0-E_2融合基因 RBCG 的免疫原性分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）布鲁氏菌S2-BCSP31缺失疫苗株的构建及免疫效果初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1 布鲁氏菌病病原学 |
| 1.2 布鲁氏菌病流行情况 |
| 1.3 布鲁氏菌的致病机制 |
| 第二章 布鲁氏菌疫苗研究进展 |
| 2.1 布鲁氏菌减毒活疫苗 |
| 2.2 DNA疫苗 |
| 2.3 亚单位疫苗 |
| 2.4 基因缺失疫苗 |
| 第三章 布鲁氏菌检测方法研究进展 |
| 3.1 病原学检测 |
| 3.2 血清学检测 |
| 3.3 分子生物学检测方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 梅花鹿布鲁氏菌病流行病学调查 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株在巨噬细胞内生存机制研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株对小鼠的免疫效果初步评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达及ELISA检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）白细胞介素-2（IL-2）作为卡介苗（BCG）免疫佐剂的免疫调节作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 综述 |
| 1.1 BCG的历史及菌种 |
| 1.2 BCG的免疫机理 |
| 1.2.1 结核病的免疫机理 |
| 1.2.2 BCG的细胞免疫机理 |
| 1.2.3 BCG体液免疫机理 |
| 1.3 IL-2及其在BCG中的应用 |
| 1.3.1 IL-2的生物活性 |
| 1.3.2 IL-2的临床应用 |
| 1.3.3 IL-2作为免疫佐剂的应用 |
| 1.4 细胞因子免疫佐剂的研究进展 |
| 1.5 牛结核病的研究进展 |
| 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 淋巴细胞增殖反应实验方案的最佳条件选择 |
| 3.2 非特异性淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.3 特异性淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.4 结核抗体检测结果 |
| 3.5 脾脏、淋巴结组织切片ANAE+染色测定T淋巴细胞 |
| 3.6 变态反应 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 关于结核病的细胞免疫和体液免疫 |
| 4.2 白细胞介素2作为免疫佐剂的剂量问题 |
| 4.3 淋巴细胞增殖适宜条件的选择 |
| 4.4 IL-2作为免疫佐剂的免疫增强作用 |
| 4.5 结核菌对豚鼠淋巴细胞增殖反应的影响 |
| 5. 结论 |
（8）结核分枝杆菌胞内存活相关PE/PPE蛋白的筛选及其致病特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 结核分枝杆菌及结核病 |
| 1.1 结核分枝杆菌病原学 |
| 1.2 结核病的基本特征与防治 |
| 1.3 结核分枝杆菌与宿主相互作用 |
| 第二章 结核分枝杆菌分泌系统 |
| 2.1 SecA1 通用型分泌系统 |
| 2.2 SecA2 替代型分泌系统 |
| 2.3 Tat双精氨酸分泌系统 |
| 2.4 Ⅶ型分泌系统(T7S分泌系统或ESX分泌系统) |
| 第三章 结核分枝杆菌PE/PPE家族蛋白 |
| 3.1 PE/PPE家族基因组成 |
| 3.2 PE/PPE家族蛋白组成 |
| 3.3 PE/PPE家族蛋白的表达特点 |
| 3.4 PE/PPE家族蛋白的免疫调节特性及毒力作用 |
| 3.5 PE/PPE家族蛋白对宿主细胞死亡的影响 |
| 3.6 PE/PPE家族蛋白调节细胞因子应答的特性 |
| 3.7 PE/PPE家族蛋白在菌体中的定位 |
| 第四章 本研究的目的及意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 构建PE/PPE家族蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株库 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组耻垢分枝杆菌巨噬细胞内存活筛选试验 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PE17 重组耻垢分枝杆菌特性及其对小鼠腹腔巨噬细胞的毒性作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PE17 重组耻垢分枝杆菌对小鼠致病力的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）Ag85B和19kDa信号肽介导BVDV E0-E2融合基因在rBCG中的表达及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻黏膜病概述 |
| 第二章 rBCG研究情况 |
| 第三章 信号肽的研究现状 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 构建信号肽基因融合BVDV E0、E2、E0-E2基因的重组质粒 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 信号肽介导BVDV E0、E2、E0-E2基因在重组卡介苗中的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组卡介苗免疫原性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 牛结核病的流行现状及危害 |
| 1.2 牛结核病的发现及病原 |
| 1.3 牛结核病的流行病学 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 免疫与发病机理 |
| 1.6 机体抗牛分枝杆菌感染的免疫机理 |
| 1.7 牛结核病的诊断 |
| 1.7.1 牛结核病诊断抗原的研究 |
| 1.7.2 牛结核病诊断方法的研究 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 质粒及菌株 |
| 3.1.2 血清及抗原蛋白 |
| 3.1.3 主要试剂及材料 |
| 3.1.4 质粒抽提与鉴定试剂的配制 |
| 3.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制 |
| 3.1.6 克隆表达融合蛋白其它试剂的配制 |
| 3.1.7 ELISA相关溶液的配制 |
| 3.1.8 寡核苷酸引物 |
| 3.2 牛分枝杆菌抗原RV3872、RV3872-CFP-10-ESAT-6融合基因的克隆表达方法 |
| 3.2.1 PCR扩增RV3872基因 |
| 3.2.2 PCR产物的回收与纯化 |
| 3.2.3 连接pMD19-T Vector |
| 3.2.4 PCR鉴定pMD19-T Vector |
| 3.2.5 感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.6 质粒的转化 |
| 3.2.7 质粒的制备 |
| 3.2.8 重组质粒pET28aVR3872-CFP-10-ESAT-6的构建 |
| 3.2.9 重组质粒的诱导表达、SDS-PAGE分析和重组蛋白质的纯化 |
| 3.2.10 融合蛋白的性质分析 |
| 3.3 胶体金免疫层析方法的建立 |
| 3.3.1 CFP10-ESAT-6-胶体金复合物制备及纯化 |
| 3.3.2 质控线兔抗CE蛋白IgG的制备与提纯 |
| 3.3.4 免疫层析法的建立 |
| 3.3.5 试纸条稳定性试验制备 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 牛分枝杆菌抗原RV3872、和RV3872-CFP-10-ESAT-6的融合基因的克隆表达结果 |
| 4.1.1 RV3872的PCR产物和目的基因片段的酶切回收产物 |
| 4.1.2 重组质粒和pET28aRV3872-CFP-10-ESAT-6的鉴定 |
| 4.1.3 目的基因片段的序列分析 |
| 4.1.4 诱导表达重组蛋白及其纯化 |
| 4.1.5 融合蛋白的热稳定性分析 |
| 4.2 牛结核病胶体金免疫层析方法建立结果 |
| 4.2.1 胶体金的制备 |
| 4.2.2 最适标记胶体金pH值的确定 |
| 4.2.3 最适标记抗原量的确定 |
| 4.2.4 质控线兔抗CE蛋白IgG提纯 |
| 4.2.5 检测线抗原和质控线IgG最佳包被浓度的确定 |
| 4.2.6 试纸条结果 |
| 4.2.7 试纸条特异性试验 |
| 4.2.8 试纸条敏感性试验 |
| 4.2.9 与韩国进口试纸条比较试验 |
| 4.2.10 梅花鹿结核特异性抗体ELISA检测方法的建立 |
| 4.2.11 MPB70-83试纸条与MPB-83-ELISA的比较试验 |
| 4.2.12 CE试纸条与CE-ELISA的比较试验 |
| 4.2.13 CE试纸条与MPB70-83试纸条的比较试验 |
| 4.2.14 CE-ELISA与83-ELISA的比较试验 |
| 4.2.15 四种抗原试纸条与ELISA联合检测结果的比较分析 |
| 4.2.16 不同抗原ELISA的比较试验 |
| 4.2.17 83-ELISA联合CE-ELISA与70-83-CE-ELISA的比较试验 |
| 4.2.18 试纸条稳定性试验 |
| 5 讨论 |
| 5.1 融合蛋白的克隆表达及特性探讨 |
| 5.1.1 融合蛋白克隆表达 |
| 5.1.2 融合蛋白特性分析 |
| 5.2 胶体金免疫层析方法的建立与应用探讨 |
| 5.2.1 间接法和夹心法的选择 |
| 5.2.2 抗原蛋白的选择 |
| 5.2.3 材料和试剂的选择 |
| 5.2.4 胶体金免疫层析方法的建立 |
| 5.2.5 胶体金免疫层析方法的应用 |
| 5.2.6 检测结果分析 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、梅花鹿对卡介苗的免疫应答及最佳免疫方法的研究（论文参考文献）
- [1]不同佐剂对卡介苗的免疫增强作用[J]. 张俊才,简子健,邓普辉,侯顺利,曾发贵,马正海,陈国利. 动物医学进展, 2003(05)
- [2]不同佐剂对卡介苗的特异性体液免疫与非特异性细胞免疫的免疫增强作用的研究[D]. 张俊才. 新疆农业大学, 2001(01)
- [3]牛病毒性腹泻—黏膜病病毒E0基因和E0-E2融合基因重组卡介苗的构建及免疫原性分析[D]. 张云. 吉林农业大学, 2014(01)
- [4]布鲁氏菌S2-BCSP31缺失疫苗株的构建及免疫效果初步评价[D]. 刘菲. 吉林农业大学, 2018(02)
- [5]白细胞介素-2（IL-2）作为卡介苗（BCG）免疫佐剂的免疫调节作用的研究[D]. 陈国利. 新疆农业大学, 2002(02)
- [6]卡介苗预防动物结核病的研究进展[J]. 张梦,时坤,刘晓,陈丽娟,于淼,刘东旭,杜锐. 吉林畜牧兽医, 2011(03)
- [7]梅花鹿对卡介苗的免疫应答及最佳免疫方法的研究[J]. 刘清河,王全凯,胡桂学,王树志. 中国畜禽传染病, 1995(01)
- [8]结核分枝杆菌胞内存活相关PE/PPE蛋白的筛选及其致病特性研究[D]. 李哲. 吉林农业大学, 2018(03)
- [9]Ag85B和19kDa信号肽介导BVDV E0-E2融合基因在rBCG中的表达及其免疫原性分析[D]. 孙凡婷. 吉林农业大学, 2015(03)
- [10]梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用[D]. 匡有吉. 华中农业大学, 2008(02)