一、Activation of p53 in gastric cancer cells by tripchlorolide specifically induces apoptosis（论文文献综述）
毕然[1]（2021）在《上调死亡受体4增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀伤肾癌细胞》文中研究表明研究背景:肾透明细胞癌（RCC）发病率高,严重地威胁人类的生命健康。对于晚期和转移的肾癌患者,安全有效的治疗方法仍然需要进一步研究。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）可以高度选择性地诱导癌细胞凋亡,对正常组织的毒害性很小,因此可以作为安全的抗癌药物。但是在越来越多的研究中发现,癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡具有明显的抗性。死亡受体是TRAIL诱导癌细胞凋亡的靶点,死亡受体的蛋白表达水平被认为和TRAIL的敏感性正相关。提高肾癌细胞的死亡受体表达水平可以恢复肾癌细胞对TRAIL的敏感性。目的:（1）证明上调死亡受体的蛋白表达水平可以恢复肾癌对TRAIL的敏感性;（2）寻找安全有效的TRAIL的增敏剂,为TRAIL的临床应用提供可能;（3）深入探索穿心莲内酯和PFT-β与TRAIL联合应用抑制肾癌细胞增殖和迁移,诱导肾癌细胞程序性凋亡的机制;（4）探索肾癌细胞对TRAIL产生耐药性的分子机制,并寻找治疗策略。方法:通过数据库中DR4和DR5的mRNA表达数据,分析死亡受体在肾癌细胞和正常肾组织中的表达差异;通过MTS法检测肿瘤细胞活力;通过细胞增殖实验,Edu染色增殖实验和成克隆实验检测肿瘤细胞的增殖能力;通过平板划痕愈合实验检测肿瘤细胞的迁移能力。通过流式细胞学技术检测细胞周期和细胞凋亡;通过蛋白免疫印迹检测各相关蛋白表达水平;通过小分子RNA干扰和慢病毒包装感染方法制备目的基因沉默的细胞系;通过荧光实时定量PCR技术检测细胞转录水平的变化。结果:（1）死亡受体蛋白表达水平在肾癌中高于正常组织,因此TRAIL可以作为潜在治疗剂靶向治疗肾癌。肾癌细胞中DR5的蛋白表达水平明显高于正常组织,但是DR4的蛋白表达水平,相较于DR5,增高不明显;（2）DR4蛋白表达水增高可以增强肾癌对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性;（3）穿心莲内酯或PFT-β与TRAIL联合应用可以显着抑制肾癌的细胞活力,增殖能力和迁移能力,诱导肾癌细胞周期阻滞和细胞衰老,诱导肾癌细胞Caspase依赖的程序性凋亡;（4）敲低突变体p53诱导肾癌细胞DR4蛋白表达水平升高,恢复肾癌对TRAIL的敏感性。结论:可以通过上调DR4恢复肾癌对TRAIL的敏感性;穿心莲内酯和PFT-β是安全有效的潜在的TRAIL增敏剂,联合应用成为潜在的肾癌治疗药物;突变体p53诱导肾癌细胞DR4表达下降,是肾癌对TRAIL抵抗的机制之一。
崔秀杰[2]（2021）在《致瘤微生物HPV和H.pylori调控mTOR信号通路介导恶性转化的机制》文中研究指明研究背景致瘤微生物（包括病毒或细菌）诱发的慢性感染是导致细胞增殖失控继而诱导恶性转化的重要因素。2012年世界卫生组织/国际癌症研究中心（WHO/IARC）的一项报告指出,世界上约17%癌症发生与某些肿瘤相关病毒或细菌的感染直接有关。研究已证实,高危型人乳头瘤病毒（High-risk Human papillomavirus,HPV）和幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,H.pylori）是引发人类癌症的Ⅰ级致癌病原体（HPV和H.pylori占可以引发人类癌症的病原体比例分别为31.5%和22.0%）。宫颈鳞状上皮和胃粘膜上皮细胞的增殖紊乱和恶性转化是环境因子（外因）与宿主调控应答（内因）交互作用的结果。因此,解析HPV和H.pylori感染相关的炎癌转化机制是重要的科学问题,对于有效降低宫颈和胃相关恶性转化的发生具有重要意义。高危型HPV的持续性感染是宫颈癌的主要始动因素。HPV转化基因E6和E7在组织中持续表达,介导宿主肿瘤抑癌蛋白p53和退化视网膜母细胞瘤蛋白pRb的降解。此外,HPV感染可通过导致宿主基因的不稳定性增高、宿主基因甲基化模式改变、非编码RNA的失调等参与推进宫颈细胞恶性转化的过程。H.pylori定植于胃粘膜上皮细胞,可通过调控RUNX3、P53、E-cadherin和β-catenin等致瘤相关分子促进恶性转化,增加胃癌发生的风险。此外,H.pylori感染后其毒力因子CagA通过Ⅳ型分泌系统将肽聚糖注入胃粘膜上皮细胞,引发胃区域感染炎症微环境、刺激宿主遗传物质发生突变,是介导恶性转化的早期趋动力。探究HPV和H.pylori致病机制是早期识别和干预肿瘤的基础性研究工作。HPV和H.pylori感染可通过与宿主细胞中不同的模式识别受体以及信号通路相互作用诱导炎癌转化。HPV除了可以抑制p53和pRb基因表达外,还与主要的上游通路:生长因子受体、Notch受体、Ras和PI3KCA等相互作用激活和改变mTOR信号通路,刺激宿主细胞的存活和增殖,诱导感染细胞的恶性转化。H.pylori感染除了可通过刺激胃粘膜上皮释放细胞因子,还可通过识别NOD样受体、Notch受体和Toll样受体等多种模式识别受体活化NF-κB、Wnt、JNK和mTOR等信号通路,形成H.pylori促进炎性因子表达的正反馈环路,参与调节病原微生物感染的宿主免疫应答和炎症响应,介导非可控性炎症增加炎癌转化的风险。研究证据表明,HPV/H.p感染通过影响mTOR信号通路中的基因突变以及上游信号分子的激活导致mTOR通路活化,而该通路的激活可进一步导致遗传不稳定、增殖失控、凋亡抵抗和代谢特性改变,最终导致感染细胞的恶性转化。mTOR信号通路可能在HPV和H.pylori感染所诱导的恶性转化中发挥重要作用。因此,进一步探究HPV和H.pylori感染激活mTOR信号通路的分子机制以及该通路在HPV和H.pylori诱导恶性转化中的生物学作用,将有助于提高疾病的监测防控,为靶向治疗提供新思路。本研究目的在于:（一）解析HPV-16转化基因E7通过调控miR-106a激活mTOR介导宫颈癌发生发展的功能与机制。（二）解析H.pylori通过调控髓系分化标志基因MYADM激活mTOR介导胃恶性转化的机制。第一部分:HPV-16 E7上调miR-106a靶向LKB1激活mTOR信号通路调控宫颈鳞癌细胞的异常增殖与自噬高危型HPV-16感染与宫颈鳞癌关系最为密切,其转化基因E6和E7的持续表达是导致子宫颈恶性转化的主要病因。E6和E7分别通过降解抑癌因子p53和pRb,导致细胞增殖紊乱、诱导细胞转化。E6和E7还可通过上调转录因子调控宿主microRNAs（miRNAs）影响宿主基因表达,进而破坏细胞生长和生存机制的稳定,导致宫颈恶性转化甚至宫颈癌。miR-106a是miR-17家族的一员,在癌症发生发展中的作用似乎具有组织或细胞特异性。目前有关miR-106a在HPV相关宫颈癌,尤其HPV及其转化基因是否可以调控宿主miR-106a的表达尚不清楚。因此,研究miR-106a在HPV阳性宫颈癌中的作用及机制,对于揭示HPV致癌的分子调控机制,选择有效治疗靶点具有重要的价值。有文献报道mTOR（Mammaliantargetofrapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）的激活可能与HPV病毒感染相关。研究表明,宫颈癌中HPV-16 E7能够降低抑癌基因LKB1的表达,而LKB1是mTOR上游关键的节分子。多项研究包括我们课题组以往的研究已报道,LKB1/AMPK/mTOR信号通路在宫颈癌中的作用至关重要,抑癌因子LKB1通过激活其下游AMPK,负向调控mTOR,抑制细胞增殖、转化及迁移等。LKB1也能够通过调控PTEN影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制肿瘤进展。然而,在HPV阳性宫颈癌中miR-106a的作用如何,其分子机制是否与LKB1/AMPK/mTOR通路有关?高危HPV-16感染能否对宿主细胞miR-106a表达发挥调控作用?目前尚不清楚。研究目的1.探究miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达以及临床意义。2.揭示miR-106a对宫颈癌细胞增殖与自噬的影响及其分子调控机制。3.探究HPV-16转化基因E7对miR-106a的调控作用及机制。方法与结果1.miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织高表达且与恶性临床病理特征相关。RT-qPCR结果显示,miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织样本中表达显着升高。ROC曲线显示,miR-106a可以较好地区分宫颈鳞癌组织与非肿瘤组织。miR-106a高表达与宫颈鳞癌的肿瘤直径、高级别FIGO分期、淋巴结转移等呈显着正相关,而与患者年龄和脉管入侵等参数没有明显的相关性;logistic多因素分析显示miR-106a高表达与肿瘤大小、淋巴结转移、淋巴管入侵等因素有关。提示miR-106a可能参与了宫颈癌的发生和发展。2.LKB1是miR-106a在HPV-16阳性宫颈癌中的新靶点。生物信息学网站预测交叉结果获得98个miR-106a的潜在靶基因,其中LKB1引起我们的关注。荧光素酶报告基因实验显示LKB1是miR-106a的直接靶点;RT-qPCR结果显示,与对照细胞HaCaT相比,宫颈癌细胞系（CaSki、SiHa和HeLa）中miR-106a表达升高,尤其在HPV-16阳性CaSki中升高最显着。RT-qPCR和Western blot结果表明,miR-106a可负向调控LKB1表达。RT-qPCR结果显示,LKB1在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织样本中表达显着降低。Spearman相关性分析显示,LKB1与miR-106a表达高度负相关。临床病理学参数相关性分析显示,LKB1低表达与宫颈癌患者恶性病理学特征相关。以上结果显示,LKB1是miR-106a的直接靶点。3.miR-106a通过靶向LKB1促进宫颈癌CaSki细胞增殖。CCK-8、平板克隆和EdU实验结果显示,miR-106a显着促进宫颈癌CaSki细胞的增殖,而LKB1抑制宫颈癌细胞增殖;但在宫颈癌SiHa和HeLa细胞（两者均LKB1表达缺失）中miR-106a促进增殖作用较弱。在CaSki细胞中采用LKB1的rescue实验进一步验证,平板克隆和EdU结果均显示,LKB1可逆转miR-106a对宫颈癌细胞CaSki的促进增殖作用。以上实验证实miR-106a通过靶向LKB1促进宫颈癌CaSki细胞的增殖。4.miR-106a通过靶向LKB1负性调控HPV-16阳性宫颈癌细胞自噬。Western blot结果显示,miR-106a抑制宫颈癌细胞自噬,而LKB1促进宫颈癌细胞自噬;并且miR-106a可以抑制雷帕霉素、饥饿诱导的细胞自噬。但与CaSki细胞相比,在LKB1缺失的SiHa和HeLa细胞中,miR-106a对自噬相关蛋白的影响不明显。进一步LKB1的rescue实验证明,LKB1可以逆转miR-106a对细胞自噬的抑制作用。以上结果说明,miR-106a通过靶向LKB1抑制HPV-16相关宫颈癌的自噬。自噬流检测结果显示,miR-106a可以抑制CaSki细胞中自噬小体（黄色斑点）和自溶溶酶体（红色斑点）的数量,且miR-106a明显抑制了雷帕霉素和饥饿所诱发的自噬流,而LKB1促进宫颈癌细胞的自噬流。以上结果说明miR-106a抑制CaSki细胞自噬是通过靶向LKB1实现的。5.miR-106a通过靶向LKB1激活AMPK-mTOR信号通路。在HPV-16阳性CaSki细胞中,Western blot检测结果显示,miR-106a可以激活mTOR信号通路。LKB1的rescue实验显示,LKB1过表达减弱miR-106a对mTOR表达促进的作用;此外,敲低LKB1可部分逆转敲低miR-106a对mTOR水平的影响。说明在HPV-16阳性CaSki细胞中miR-106a通过靶向LKB1激活AMPK-mTOR信号通路。6.HPV-16 E7激活miR-106a的表达并调控其功能。RT-qPCR结果显示,在HPV-16 E7稳定表达细胞系RPE1-E7和HaCaT-E7中,miR-106a表达显着增加;使用干扰组合（siRNA198和siRNA209）分别选择性地敲低CaSki细胞中HPV-16E6E7和HPV-16E6,观察干扰E7对miR-106a的表达影响。结果显示,与CaSki-siE6细胞相比,miR-106a在CaSki-siE6E7细胞中的表达显着降低。说明敲低E7部分抑制了 miR-106a的表达。此外,RT-qPCR显示,在HPV-16 E7阳性的宫颈鳞癌组织中,miR-106a表达与E7表达呈正相关。RT-qPCR和Western blot结果显示,与空白载体（Vector）相比,上述两种E7-表达细胞中LKB1表达降低;然而,当E7细胞转染miR-106a抑制剂时,LKB1可部分恢复表达,说明E7通过激活miR-106a抑制LKB1表达。在E7表达细胞中,CCK-8细胞增殖活性明显高于空载体细胞。而转染miR-106a抑制剂后,E7细胞的细胞增殖率降低。说明HPV-16E7可以激活miR-106a的表达并调控其增殖功能。7.HPV-16 E7通过激活转录因子c-Jun上调miR-106a表达。RT-qPCR和Western blot结果显示,c-Jun在E7-表达的RPE1和HaCaT细胞中表达显着升高;CaSki敲低E7（采用的干扰组合策略同前）,c-Jun表达降低,敲低c-Jun后,miR-106a表达随之降低。c-Jun的rescue实验显示,c-Jun可以部分逆转E7敲低后引起的miR-106a表达降低。CHIP-PCR实验结果显示,c-Jun可以直接结合到miR-106a的启动子区调控miR-106a转录。以上实验结果证明,HPV-16 E7通过上调转录因子c-Jun表达促进宫颈癌中miR-106a的转录。结论和意义在本研究中,我们系统地讨论了 miR-106a在HPV-16阳性宫颈癌中的作用及其分子机制。miR-106a在HPV-16阳性宫颈鳞癌组织和细胞中高表达,而且与患者恶性病理学特征相关。研究发现抑癌基因LKB1是miR-106a的新靶点,miR-106a通过靶向抑制LKB1激活AMPK-mTOR信号通路促进宫颈癌细胞增殖抑制自噬进而发挥致癌作用。此外,HPV-16E7通过转录因子c-Jun可上调miR-106a的表达并促进细胞增殖功能。本研究为进一步阐明HPV-16致癌的分子机制,寻找HPV相关宫颈癌的治疗新靶点提供了新的实验依据。第二部分:H.pylori通过NF-κB上调MYADM激活mTOR信号通路介导胃恶性转化幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染引发的炎症是介导恶性转化的重要基础。H.pylori定植于胃粘膜上皮细胞通过上调NF-κB、AP-1和IRFs等转录因子,进一步诱导IL-1β、IL-8和TNF-α等炎癌跨越细胞因子产生,激活下游NF-κB、Wnt/β-Catenin、EGFR、FAK和mTOR等信号通路,形成H.pylori促进炎性因子表达的正反馈环路,增加炎癌转化风险。MYADM（Myeloid-associated differentiation marker,髓系相关分化标记基因）是近年来鉴定得到的一种在多能祖细胞中表达、并在髓系分化过程中上调的造血相关标记基因。相关研究显示,MYADM可编码蛋白酪氨酸激酶FAK亚家族,在多种炎症以及肿瘤中表达异常。例如,在非酒精性脂肪肝病从单纯性脂肪肝到脂肪变性、炎症和坏死再到肝硬化的演变过程中,MYADM的表达逐渐升高。MYADM在黑色素瘤、激素抵抗型前列腺癌以及结直肠癌等肿瘤中高表达且与肿瘤转移以及不良预后有关。然而,MYADM在胃部恶性转化中的表达变化和生物学功能,以及是否与H.p感染相关尚未有报道。研究表明,H.pylori感染可激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进胃上皮细胞增殖。然而,在H.pylori感染的胃粘膜上皮组织、细胞中MYADM的表达以及功能如何?H.pylori感染能否调控宿主细胞MYADM表达以及调控机制如何?下游分子机制是否与PI3K/Akt/mTOR通路有关?目前尚不清楚。研究目的1.探究MYADM在H.pylori感染相关恶性转化中的表达变化及其临床意义。2.探究H.pylori是否可以调控MYADM的表达以及其分子机制。3.揭示MYADM在胃恶性转化中的作用和分子机制。方法与结果1.MYADM在胃癌组织和细胞中表达上调。Oncomine、GEO、TCGA生物信息学分析发现,与正常组织相比,MYADM在胃癌中表达显着上调。RT-qPCR结果显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中MYADM表达显着升高;与人慢性萎缩性胃炎组织相比,胃癌组织中MYADM表达明显升高;MYADM在胃癌细胞系中表达高于人永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1;Western blot结果显示,与相对应癌旁组织样本相比,胃癌组织中MYADM蛋白表达明显升高。以上结果表明MYADM在胃癌组织和细胞中高表达。2.MYADM高表达与胃癌进展以及胃癌病人预后不良相关。IHC结果显示,MYADM表达随胃炎到胃癌进展过程呈现表达逐渐升高的趋势;与癌旁组织相比,MYADM在胃癌组织中表达明显升高。TCGA和GEO数据库（GSE15459、GSE62254、GSE15459,GSE62254 和 GSE22377）生存曲线分析结果表明,MYADM高表达的胃癌患者总生存期（OS）、无进展生存期（RFS）再次进展生存期（PPS）显着低于MYADM低表达患者。以上结果显示,MYADM高表达与胃炎到胃部恶性转化以及胃癌患者不良预后之间具有潜在关系。3.MYADM促进体内外胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及局部浸润能力。平板克隆、CCK-8和EdU结果显示,MYADM促进胃癌细胞增殖能力;Transwell小室和划痕实验表明,MYADM促进胃癌细胞体外的迁移、侵袭能力;Western blot结果显示,MYADM抑制胃癌细胞EMT过程。裸鼠皮下成瘤实验显示,与对照组Lv-shNC相比,Lv-shMYADM组裸鼠皮下成瘤生长速度明显慢于Lv-shNC组,瘤体较小、重量较轻;RT-qPCR结果显示MYADM在Lv-shMYADM组裸鼠瘤体表达显着低于Lv-shNC组。裸鼠尾静脉注射实验显示,与Lv-shNC组相比,Lv-shMYADM组裸鼠肺转移灶较少,荧光信号明显减弱;HE染色显示,在Lv-shNC组出现瘤体包膜破坏和局部浸润现象,部分肿瘤侵犯到瘤体周围肌肉组织。而Lv-shMYADM组裸鼠瘤体包膜完整,没有明显浸润情况;并且IHC结果显示MYADM和ki67蛋白在Lv-shMYADM组表达阳性率低于对照组。以上数据提示,MYADM与胃癌的异常增殖、迁移、侵袭相关,MYADM在体内可以促进胃癌细胞成瘤以及发生局部浸润、转移的能力。4.MYADM 激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路。Western blot 实验结果发现,敲低 MYADM 后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K 和 p-4E-BP1 蛋白表达水平降低,PI3K、AKT、mTOR、p70S6K 和 4E-BP1总蛋白表达变化不明显;相反,过表达MYADM后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K 和 p-4E-BP1 蛋白表达水平升高,PI3K、AKT、mTOR、p70S6K和4E-BP1总蛋白表达变化不明显。以上结果显示,MYADM可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路影响胃癌细胞功能。5.幽门螺杆菌感染上调MYADM表达。RT-qPCR和Western blot检测发现,以不同浓度幽门螺杆菌（Hp11637和26695）分别感染GES-1、AGS和MKN-45细胞不同时间,结果显示MYADM在H.pylori感染后表达升高,并且具有感染的浓度和剂量依赖性。RT-qPCR、IHC检测发现,H.pylori阳性临床胃炎组织中MYADM表达显着高于H.pylori阴性胃炎组织。在幽门螺杆菌SS1单独/联合MNU灌胃小鼠模型中,发现H.pylori SS1单独/联合MNU感染组小鼠MYADM表达高于未感染组。以上结果显示,MYADM可能在H.pylori感染可以上调MYADM表达。6.幽门螺杆菌通过NF-κB信号通路激活转录因子c-Jun诱导MYADM表达。PROMO和JASPAR预测调控MYADM的转录因子c-Jun;双荧光素酶报告基因、CHIP-PCR结果表明,c-Jun可以结合到靶基因MYADM启动子区,MYADM是c-Jun直接靶点;RT-qPCR和Western blot结果证明,c-Jun可以正向调控MYADM表达。H.pylori感染GES-1、AGS和MKN-45细胞诱导的MYADM表达上调,而敲低c-Jun可以部分抑制H.pylori感染诱导的MYADM表达上调。以上实验证明,c-Jun在H.pylori感染所介导的MYADM表达上调中起到不可或缺的作用。探究H.pylori上调c-Jun激活MYADM的分子机制,Western blot检测GES-1、AGS和MKN-45细胞中H.pylori相关信号通路抑制剂对MYADM表达的影响,结果显示NF-κB抑制剂Bay11-7082显着抑制H.pylori感染诱导的MYADM表达;RT-qPCR结果显示,Bay1 1-7082可以抑制H.pylori感染GES-1、AGS和MKN-45细胞诱导的MYADM表达上调;Western blot结果显示,加入Bayl1-7082后基本解除了H.pylori感染诱导的c-Jun和MYADM表达上调。以上结果证明,NF-κB信号通路是H.pylori感染后通过激活转录因子c-Jun诱导MYADM表达上调的重要途径。结论与意义在本研究中,我们系统地研究了 MYADM在H.pylori感染相关的恶性转化中的作用及分子机制。MYADM与H.pylori感染相关的胃恶性转化的演进过程相关,且MYADM在H.pylori阳性胃炎以及胃癌组织和细胞中高表达,与胃癌病人预后不良有关。研究发现,H.pylori通过激活NF-κB信号通路上调转录因子c-Jun表达促进MYADM转录,进而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进胃癌细胞在体内外增殖、侵袭和转移的能力。说明MYADM可能是H.pylori相关胃恶性转化的潜在靶点。以上研究有助于阐明H.pylori致胃恶性转化的新机制,为制定有效的H.pylori相关胃疾病的早期诊断、治疗及发现新靶点提供实验依据。
张亮[3]（2021）在《线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究》文中认为胃癌是一种致命的肿瘤疾病,在全世界范围内的总体生存率都较低,严重威胁着人类的健康。目前,胃癌是世界第五大癌症类型,已被确定为全球癌症死亡相关的主要原因之一。胃癌的发生是由宿主遗传、环境因素（如吸烟、饮酒、高盐等）和微生物因素（如幽门螺杆菌）等复杂相互作用的结果。这些现状表明,深入研究胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的临床改善和预后具有重要意义。蛋白泛素化修饰参与调节多种细胞功能,包括靶向蛋白的降解、蛋白的膜转运、DNA损伤修复、信号转导等。线性泛素链作为近年来新发现的一种泛素链接方式,主要由泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）催化合成和去泛素化酶OTULIN特异性水解,处于两者共同调节的动态过程中。LUBAC复合体是目前已知的唯一能够催化合成线性泛素链的泛素连接酶。它主要由HOIP（HOIL1-interacting protein）,SHARPIN（SHANK associated RH domain-interacting protein）和HOIL1L（haem-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1L）三个分子组成。HOIP是LUBAC复合体的酶催化核心,SHARPIN和HOIL1对于HOIP的激活具有关键作用。已有研究表明,线性泛素化修饰可发生在NEMO、TNFR1和RIPK1等底物中,通过调节NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路,对固有免疫、炎症反应和血管生成等具有重要的作用。但是在肿瘤的发生发展中,线性泛素化修饰对胃癌生物学行为的影响目前尚不清楚。因此,从线性泛素化相关的蛋白入手,研究线性泛素化修饰如何调节胃癌的生物学行为,有助于揭示胃癌发生发展的新机制,具有重要的理论意义及潜在临床价值。有鉴于此,本文主要分两部分,分别研究了线性泛素化相关蛋白OTULIN及SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响和机制。本文的研究内容和主要结果结论如下:第一部分去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中呈高表达1.去泛素化酶OTULIN在多个数据库的胃癌中表达增高;2.去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织;二、去泛素化酶OTULIN对胃癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力的影响1.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的增殖和成瘤;2.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的侵袭和迁移;3.OTULIN促胃癌细胞迁移侵袭依赖于其去泛素酶活性;三、识别与鉴定线性泛素化修饰的底物蛋白RACK11.Pull-down实验结合质谱分析,筛选出底物蛋白RACK1;2.免疫共沉淀实验证明RACK1蛋白存在线性泛素化修饰;四、OTULIN与RACK1相互作用,并与黏着斑激酶FAK形成复合体1.免疫荧光实验证实OTULIN和RACK1存在共定位;2.免疫共沉淀实验证明OTULIN、RACK1和FAK形成复合体;五、OTULIN调节RACK1对FAK的招募,影响胃癌细胞的粘附运动1.敲除OTULIN能够抑制FAK的磷酸化水平;2.OTLUIN能够促进RACK1对FAK的招募;3.OTULIN敲除的胃癌细胞粘附运动能力下降;第二部分SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、SHARPIN通过不依赖于线性泛素化的方式调节Wnt/β-catenin信号通路1.LUBAC和OTULIN参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;2.SHARPIN与β-catenin相互作用参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;二、SHARPIN促进胃癌的恶性生物学行为1.SHARPIN促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭;2.SHARPIN促进胃癌细胞皮下移植瘤的生长;三、SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin,而抑制β-catenin的泛素蛋白酶体降解1.SHARPIN抑制β-catenin的泛素化降解;2.SHARPIN与β-Trcp1竞争性结合β-catenin;3.SHARPIN与β-Trcp1可能竞争性结合β-catenin上的相同位点;四、过表达β-catenin回复SHARPIN敲低引起的胃癌细胞增殖抑制1.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭表型;2.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的皮下移植瘤的增殖抑制;五、SHARPIN在胃癌组织中高表达且提示预后不良,并与β-catenin表达呈正相关1.SHARPIN在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织;2.SHARPIN高表达的胃癌患者总生存期短,预后较差;3.胃癌组织中SHARPIN表达与β-catenin表达呈显着正相关;本研究的主要结论为:1.去线性泛素化酶OTULIN能够通过去除RACK1蛋白的线性泛素化修饰,增强RACK1与黏着斑激酶FAK的相互作用,进而促进胃癌的增殖和转移播散。2.线性泛素化相关蛋白SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin上的相同位点,从而抑制了β-Trcp1泛素化降解β-catenin,稳定其表达和向细胞核转位,促进下游癌基因c-myc、CD44等基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本研究首次报道了线性泛素相关蛋白OTULIN和SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响。我们发现了线性泛素化修饰的新底物蛋白RACK1,并初步阐明了去泛素化酶OTULIN通过调节RACK1影响胃癌细胞增殖和转移播散的分子机制,为研究线性泛素化修饰在肿瘤中的作用提供了新的理论基础。另外,我们也发现SHARPIN通过不依赖于线性泛素化修饰的方式调节Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进胃癌的发生发展,揭示了SHARPIN的一种新功能和调节β-catenin的新方式。这些研究为探索胃癌发生发展的分子机制提供了新的研究方向,并可能成为潜在的改善胃癌患者治疗和预后的策略。
杨小进[4]（2020）在《长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究》文中研究指明目的:结直肠癌是世界范围内最常见的第三种肿瘤类型,也是全球癌症相关致死的第四大因素。结直肠癌对人类健康构成了极大的威胁。结直肠癌的发病机制仍不明确,普遍认为是环境因素和基因遗传共同长期作用的结果。研究显示KRAS等多种肿瘤致病基因的突变、P53等抑癌基因突变和表观遗传学修饰、信号通路调节异常、非编码RNA对基因表达的多层面调控等多种因素均与结直肠癌的发生发展相关。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是非编码RNA的主要类型,是一种至少包含200个核苷酸且不编码蛋白的RNA,通过基因表达调控在结直肠癌的许多生物学过程中发挥着重要作用。LncRNA-DANCR被证明在多种肿瘤中扮演原癌基因的作用,但其在结直肠癌中的生物学功能和机理不清楚。方法:我们依托所在医院收集了 20对结直肠癌旁正常组织和癌组织,以及84个包含病人5年生存期的结直肠癌组织,然后利用RNA-FISH对结直肠癌组织和癌旁组织中DANCR的表达情况进行了检测。在此基础上,我们依据DANCR的表达情况对DANCR与病人预后的相关性进行了统计分析。我们利用定量PCR对正常人结直肠上皮细胞和多株结直肠癌肿瘤细胞中DANCR的表达情况进行了检测,并利用RNA-FISH对DANCR在结直肠癌细胞中的分布情况进行了检测。为研究DANCR对结直肠癌细胞生长的调控作用,我们利用慢病毒介导的shRNA特异性的敲除SW480和HCT15细胞中DANCR的表达,然后在细胞水平利用CCK-8实验、克隆形成实验、流式凋亡检测和Hoechst染色对细胞的增殖能力、克隆形成和凋亡情况进行了检测。在动物水平的研究中,我们利用稳定敲除DANCR的SW480和HCT15细胞分别建立了皮下移植瘤模型,然后绘制肿瘤生长曲线,统计肿瘤重量。在明确DANCR促进结直肠癌生长的作用的基础上,我们利用western blotting对稳定敲除DANCR的SW480和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、p53、cyto C、Bcl-2 和 Bcl-xL 的表达情况进行了检测;并利用免疫组化染色对SW480和HCT15皮下移植瘤组织中Caspase 3、p53和cyto C的表达情况进行了检测。结果:1)DANCR在结直肠癌组织中高表达,且与病人预后负相关:在对20对结直肠癌组织和癌旁正常组织的RNA-FISH染色结果表明DANCR在结直肠癌组织中显着高表达;DANCR在结直肠癌肿瘤细胞中高表达,且主要表达在细胞浆中;进一步的生存期分析表明DANCR高表达的结直肠癌病人常伴随更差的5年生存期。2)敲除DANCR通过促进细胞凋亡发生抑制结直肠癌细胞生长:利用慢病毒介导的shDANCR稳定感染SW480和HCT15细胞能显着抑制SW480和HCT15细胞中DANCR的表达;稳定敲除DANCR的表达在细胞水平上能显着抑制结直肠癌增殖和克隆形成,促进结直肠癌细胞凋亡发生;稳定敲除DANCR的表达在动物水平能通过促进结直肠癌皮下移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的发生抑制结直肠癌细胞皮下移植瘤的生长。3)敲除DANCR促进线粒体相关凋亡蛋白和p53蛋白的表达:敲除DANCR促进 SW480 和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9 蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Caspase 3阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中p53蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多p53阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中Cyto C蛋白的表达,同时抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Cyto C 阳性的细胞。结论:DANCR在结直肠癌组织中高表达,其表达情况与结直肠癌病人的良好预后呈显着负相关。DANCR主要定位于结直肠癌细胞的胞浆中,敲除DANCR的表达能通过促进线粒体相关凋亡的发生来抑制结直肠癌细胞的生长。以上研究表明DANCR是一个结直肠癌治疗和预后的潜在靶点。
张玺[5]（2020）在《苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究》文中研究表明背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于早期无明显症状,缺乏有效的早期检测筛查手段,约70%患者在诊断时已是晚期。目前,手术联合化疗是卵巢恶性肿瘤的主要治疗手段,但化疗对患者身体毒副作用大,且容易复发并产生耐药性。磷酸化是目前研究最广泛的翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）,能够调节细胞生长、分化、凋亡等多种细胞功能。磷酸化信号通路的改变与癌症密切相关,同时它们也可作为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质组学研究表明,由磷酸化等蛋白翻译后修饰介导的信号通路在卵巢癌的发生和耐药过程中起着关键作用。苦参碱是从中药苦参中提取的有效生物活性成分,具有广泛的生物学活性,比如抗炎、抗病毒、抗癌、镇痛、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化等。大量研究表明,苦参碱在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种类型的癌症中具有明确的抗癌效果。然而,苦参碱对卵巢癌的影响及其潜在的分子机制尚未见报道。目的:本研究旨在探究苦参碱对卵巢癌的作用及其分子机理,为苦参碱作为新型抗癌药物的深入研究提供线索和依据。方法:1.MTT法和平板克隆形成实验检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP增殖能力的影响。2.流式细胞术检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞周期和凋亡的影响。3.透射电子显微镜和荧光显微镜观察苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP自噬的影响。4.划痕实验、Transwell侵袭实验和免疫荧光技术评估苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞迁移和侵袭的影响。5.体外血管生成试验探讨苦参碱对肿瘤血管生成的影响。6.酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3分泌血管内皮生成因子VEGFA的影响。7.逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测苦参碱对血管内皮生成因子VEGFA和血管生成素ANG-1m RNA水平的影响。8.Western blot检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关蛋白的表达及肿瘤相关磷酸化信号通路的影响。9.分别建立卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP裸鼠皮下移植瘤和尾静脉小鼠模型,定期腹腔注射苦参碱,观察苦参碱对体内卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响。10.苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织坏死、肿瘤转移及肝脏损伤的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织凋亡的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780和小鼠肿瘤组织总的蛋白质磷酸化水平的影响以及肿瘤组织中增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。12.免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）进一步验证苦参碱对小鼠肿瘤组织中信号通路蛋白磷酸化水平的影响。13.全自动生化分析仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartic aminotransferase,AST）含量,评估苦参碱对小鼠肝功能的影响。结果:1.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱阻滞卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞周期在G0/G1期,上调p21蛋白表达,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达;同时降低ERK1/2和MEK1/2蛋白磷酸化水平。3.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3发生凋亡,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达;同时降低PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。4.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3自噬,上调LC3-II蛋白表达,下调SQSTM1蛋白表达;同时降低Akt和m TOR蛋白磷酸化水平。5.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3迁移和侵袭,降低FAK和Rho A蛋白活性及磷酸化水平。6.苦参碱抑制卵巢癌细胞对血管生成的促进作用,降低卵巢癌细胞A2780和SKOV3分泌VEGFA水平,同时降低卵巢癌A2780和SKOV3细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平。7.苦参碱降低HUVEC/A2780和HUVEC/SKOV3共培养体系中内皮细胞HUVECs中ANG-1 m RNA和蛋白表达水平,同时下调VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。8.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780体内肿瘤增殖和转移能力,降低卵巢癌细胞和肿瘤组织中总的蛋白质磷酸化水平。9.Western blot和IHC结果表明,苦参碱下调肿瘤组织中信号通路相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2、Tie2蛋白磷酸化水平。10.苦参碱对肝脏组织无损伤作用,对小鼠血清中ALT和AST含量变化无显着影响。11.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,抑制细胞迁移和肿瘤血管生成。12.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP体内肿瘤增殖和转移能力。结论:苦参碱能够抑制卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成,同时降低ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。苦参碱通过抑制肿瘤相关磷酸化信号通路调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成,从而抑制卵巢癌的发生发展。背景:近几十年来,分子靶向治疗已在许多癌症类型的临床治疗中取得了良好的疗效,如乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等。确定理想的靶点是肿瘤分子靶向治疗成功的关键。分子靶向治疗的靶点可作用于细胞表面抗原、受体和生长因子,能够调控细胞增殖和转移、细胞周期和血管生成相关信号转导通路。靶向治疗可与过表达的分子结合,调节该分子调控的信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖,最终导致细胞死亡。原癌基因c-Src（Src）是一种非受体酪氨酸激酶,与多种人类癌症的发生、维持、进展和转移扩散密切相关。Src通过与多种蛋白和蛋白复合物相互作用并使其磷酸化,在细胞信号传导过程中起关键作用。苦参碱是从传统中药苦参中提取的生物碱之一,具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等广泛的药理学活性。研究表明,苦参碱对多种癌症类型包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病等均具有抗肿瘤活性。苦参碱发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭、抑制血管生成等途径实现的。目前,有关苦参碱抗肿瘤作用的研究颇为广泛,然而其发挥抗癌活性的直接作用靶点尚未见报道。目的:本研究旨在寻找苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点并探讨其作用机制,为开发肿瘤靶向药物提供实验依据。方法:1.选取人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF7、人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3、人宫颈癌细胞He La六种癌细胞为研究对象,MTT法检测苦参碱对癌细胞增殖能力的影响。2.分别建立人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3皮下移植瘤模型,定期腹腔注射苦参碱或生理盐水,观察苦参碱对体内肿瘤增殖能力的影响。3.以槐果碱和乙醇胺为原料进行化学反应,合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱。红外光谱和质谱对13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱进行结构表征。4.13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱与氨基偶联树脂进行偶联反应,制备苦参碱偶联树脂。紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度变化,间接反映偶联反应效率。5.提取卵巢癌细胞SKOV3总蛋白,利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色寻找苦参碱特异性结合蛋白。液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）鉴定苦参碱特异性结合蛋白。6.细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）实验验证苦参碱作用靶点;构建GST-Src重组蛋白,Pull down实验进一步验证苦参碱作用靶点。7.构建Src分段质粒,转染HEK293T细胞,Pull down实验验证苦参碱结合区域。8.构建GST-Kinase重组蛋白,Western blot进一步验证苦参碱结合区域。9.采用Discovery Studio 4.5软件,分子对接苦参碱与Src激酶结构域,探究苦参碱结合Src激酶结构域的氨基酸。10.选取苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞,测定苦参碱对癌细胞中Src激酶活性的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:1.苦参碱抑制癌细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱抑制体内癌细胞增殖能力。3.化学合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱,产率为65%,红外光谱与质谱结构表征结果与13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱结构一致。4.制备苦参碱偶联树脂,紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度,偶联反应效率为54%。5.利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色结果显示,分子量55-70 k Da之间有明显蛋白条带;且加入苦参碱后,此蛋白条带明显减弱,猜测此蛋白可能为苦参碱特异性结合蛋白。LC-MS/MS质谱定性分析发现,Src为苦参碱特异性结合蛋白。6.CETSA实验结果表明,与对照组相比,苦参碱处理组Src蛋白的热稳定性明显增强。同时,GST-Src重组蛋白进行Pull down实验,结果显示,苦参碱偶联树脂组检测到Src蛋白,且加入苦参碱后,Src蛋白明显减少,进一步证实Src为苦参碱作用靶点。7.分别构建Src分段质粒USH3、SH4-UD、SH3、SH2、Kinase,转染HEK293T细胞过表达后,提取总蛋白进行Pull down实验,Western blot结果分析显示,苦参碱结合Src激酶结构域。8.GST-Kinase重组蛋白进行Pull down实验,Western blot结果表明,苦参碱偶联树脂组检测到目的蛋白,且加入苦参碱后,目的蛋白明显减少,进一步证实Src激酶结构域为苦参碱结合区域。9.Discovery Studio 4.5软件预测苦参碱与Src激酶结构域3D分子对接情况,结果显示,苦参碱结合Src激酶结构域,主要作用可能是因为苦参碱与Ala392形成较强的氢键作用力;同时,苦参碱与周围氨基酸形成范德华力等其他作用力。10.苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞后,细胞中Src激酶活性均显着降低。11.Western blot结果表明,苦参碱显着下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。结论:苦参碱抑制癌细胞增殖。苦参碱作用靶点为Src,Src激酶结构域为苦参碱结合区域。同时,苦参碱能够下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。因此,苦参碱通过靶向Src激酶结构域下调磷酸化信号通路进而抑制癌细胞增殖。
李莹雪[6]（2020）在《丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素协同抗肿瘤作用》文中指出丹参酮ⅡA（TanⅡA）是中药丹参的主要成分之一,具有多种生物活性和抗肿瘤功效,且毒性较低。但其受制于水溶性差,抗肿瘤功效不足等缺陷而难以应用到临床。本文以Tan ⅡA为目标化合物,以抑制肿瘤细胞增殖为指标,在细胞水平筛选出与Tan ⅡA具有协同抗肿瘤作用的天然化合物穿心莲内酯（Andro）和芹菜素（Api）。通过组合物之间的协同作用,增强Tan ⅡA的抗肿瘤活性,为开发天然低毒复方抗肿瘤药物及功能食品提供新的候选药物组合。本文重点进行Tan ⅡA与Andro以及Tan ⅡA与Api两组化合物协同作用机制研究,同时进行体内抗肿瘤功效评价。研究方法、结果与结论如下:（1）与丹参酮ⅡA联用具有协同抗肿瘤作用的中药化合物筛选采用MTT法,以抑制肿瘤细胞增殖为指标,通过筛选实验发现Tan ⅡA与Andro以及Tan ⅡA与Api联合给药对MCF7、BGC823和SMMC7721等肿瘤细胞株的增殖具有协同抑制作用。Tan ⅡA（25 μM）与Andro（100μM）对MCF7细胞的联用指数（CI）为 0.26±0.02;Andro 单用对 MCF7 细胞的 IC50为 183.23 μM,Tan ⅡA 单用对 MCF7 细胞的IC50为51.46 μM;两化合物联用时对MCF7细胞的IC50为Andro 38.45μM和TanⅡA9.61 μM。TanⅡA（25μM）与 Api（50μM）对 BGC823 细胞联用指数 CI 为 0.28±0.01;单用于 BGC823 细胞时,Api 的 IC50为 131.28μM,Tan ⅡA 的 IC50为 61.46μM,两化合物联用时的 IC50 值为 Api 22.30μM 和 Tan ⅡA 11.15 μM。（2）丹参酮ⅡA与穿心莲内酯联用协同抑制人乳腺癌MCF7细胞通过AV-PI双染实验,证实Tan ⅡA与Andro联用对MCF7细胞具有显着协同促凋亡作用。研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）能够拮抗Andro对MCF7细胞的毒性以及两种化合物的协同作用,但无法拮抗Tan ⅡA对MCF7细胞的毒性,初步探明ROS积累是TanⅡA与Andro联用对MCF7细胞协同作用的关键因素之一。进一步实验发现两种氧化剂L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO）和砷试剂（DETC）与Tan ⅡA联用均具有协同抗肿瘤效果,并且能够被NAC拮抗,进一步证实ROS是两化合物发挥协同效用的关键因子。利用液相色谱和质谱方法,证实Andro与还原型谷胱甘肽（GSH）类似物NAC能够发生共价结合。采用5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）氧化法测定GSH活性,进一步证实该反应封闭了 GSH上的-SH,在胞内降低了 GSH的还原力。采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和二氢乙啶（DHE）染料探针检测细胞内H2O2和超氧化物阴离子水平,结果发现与单独给药比较,TanⅡIA与Andro联用显着提高胞内ROS水平。上述结果证实ROS是Andro与TanⅡA协同抗肿瘤的关键因子。采用蛋白印迹法检测Tan ⅡA和Andro作用后,MCF7细胞内p53及其下游蛋白Bax和PUMA的含量变化。结果显示,Andro与Tan ⅡA联用时,细胞内p53,Bax和PUMA的表达显着提高;使用p53抑制剂Pifithrin-α（Pft-α）预处理MCF7细胞后,TanⅡA与Andro联用对MCF7细胞毒性减低一倍左右,联用指数从0.26±0.02提高到1.18±0.15,两者之间的协同作用消失。说明p53是Andro与TanⅡA协同抗肿瘤的另一关键因子。综上所述,Tan ⅡA与Andro联用于MCF7细胞,p53和ROS信号被显着增强,ROS与p53两个信号通路相互激活是Tan ⅡA与Andro协同抗肿瘤作用的核心机制。（3）丹参酮ⅡA与芹菜素联用协同抑制人胃癌BGC823细胞采用AV-PI双染和蛋白印迹方法,证实TanⅡA与Api联用使细胞内p53表达水平显着上调,胞内Bcl-2/Bax 比值显着降低,细胞凋亡显着增强。研究证实NAC不能够拮抗Api和Tan ⅡA单用及联用对BGC823细胞的毒性。说明ROS不是两化合物对BGC823细胞协同作用的关键因子。采用PI染色法和蛋白印迹实验考察TanⅡA与Api单用和联用,对BGC823细胞周期及胞内细胞周期蛋白（Cyclin）B1和D1含量的影响。结果表明当两种化合物联用时,细胞周期随时间推移依次阻滞在G2/M期（24h）,G1及G2/M期（48 h）和S期（72 h）,表现出多个细胞检查点上的周期阻滞,且周期阻滞更加严重。细胞周期蛋白含量也随细胞周期发生相应改变。采用圆二色和DNA热变性曲线法研究TanⅡA和Api与DNA的相互作用,结果表明:Api与DNA产生沟槽结合和外部堆积,Tan ⅡA改变DNA骨架的碱基堆积结构。DNA热变性实验发现:Tan ⅡA及Api与DNA结合,热变性曲线发生较大变化,说明Tan ⅡA及Api与DNA结合后对DNA的稳定性产生显着影响。上述实验结果证实TanⅡA以改变DNA碱基堆积的方式与DNA结合,Api与DNA沟槽外部结合,两者共同作用于DNA,加剧细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,是二者产生协同作用的核心机制。S180荷瘤鼠体内实验结果表明:Api（60mg/kg）和TanⅡA（30mg/kg）单用口服无显着的抑瘤效果,联合使用的抑瘤效果显着,抑瘤率为37.6%。两化合物联用抑瘤效果与阳性药物环磷酰胺（30mg/kg）抑瘤效果相当,且毒性低于环磷酰胺（30mg/kg）。综上所述,本研究首次发现TanⅡA与Andro具有显着协同抗肿瘤作用,TanⅡA与Andro分别作用于p53与ROS两个信号通路,两个信号通路相互激活是协同作用产生的核心机制。本研究首次发现Tan ⅡA与Api具有显着协同抗肿瘤作用,TanⅡA与Api分别以改变DNA骨架碱基堆积以及外部沟槽结合方式与DNA结合,加剧细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,是二者产生协同作用的核心机制。
李亚[7]（2020）在《新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究》文中进行了进一步梳理我国是胃癌大国,中西医结合治疗是我国胃癌综合治疗的独特模式。临床实践证实采用新加良附方（高良姜、香附、穿山龙）联合化疗针对进展期胃癌较单纯化疗具有更高的临床缓解率和更优的生活质量。机制研究发现新加良附方抗胃癌作用与调控凋亡相关基因表达有关,但其上游调控机制尚未明确。基于前期基础,本研究拟从microRNA角度,深入探讨新加良附方及穿山龙主要成分薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路及miR-34a凋亡相关靶基因的调控作用和对凋亡信号通路的激活作用,明确新加良附方及薯蓣皂苷元的作用机制,为新加良附方治疗胃癌提供基础研究依据。目的通过体内外实验明确新加良附方及成分薯蓣皂苷元对人胃癌细胞功能的抑制作用,基于miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路,明确新加良附方及薯蓣皂苷元抗胃癌作用机制。方法1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究①新加良附方及薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:CCK-8实验检测新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞增殖的作用,流式细胞术检测新加良附方及薯蓣皂苷元对胃癌细胞周期及凋亡的调控作用,划痕实验检测新加良附方抑制胃癌细胞迁移作用;②新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:qPCR检测正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞miR-34a表达,慢病毒感染构建过表达mi R-34a的胃癌HGC-27细胞,CCK-8方法检测过表达miR-34a胃癌HGC-27细胞增殖功能,划痕实验检测过表达mi R-34a胃癌细胞迁移能力,并通过qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a基因水平影响;③新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:qPCR方法检测过表达miR-34a后HGC-27细胞miR-34a/SIRTl/p53通路及miR-34a靶基因表达水平,qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a靶基因及Caspase凋亡通路的作用,Western blot检测新加良附方、薯蓣皂苷元对Caspase凋亡通路作用。2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究BSP方法检测胃癌细胞miR-34a甲基化水平,并构建HGC-27胃癌细胞荷瘤小鼠模型,设正常对照组、模型组、新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、5-Aza-CdR组、中剂量联合组及高剂量联合组,药物干预18天,观察裸鼠一般状态;测量移植瘤长短径,计算瘤体积和抑瘤率,观察裸鼠生存期;qPCR方法检测miR-34a表达情况;Western blot方法检测miR-34a/SIRT1/p53相关蛋白表达及Caspase凋亡通路情况。结果1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验:新加良附方呈浓度及时间依赖性地抑制HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖;新加良附方提高G1期HGC-27细胞,降低G2期细胞;新加良附方可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;与对照组比较,新加良附方组除24h 4mg/mL浓度外,其余各组均可抑制胃癌HGC-27细胞迁移功能,作用呈时间及浓度依赖性;新加良附方可显着抑制MGC80-3细胞迁移功能,作用呈时间依赖性,差异有统计学意义;各浓度新加良附方24h及48h均可抑制AGS细胞迁移;薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:薯蓣皂苷元呈时间及浓度依赖性地抑制胃癌HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖作用,差异有统计学意义;薯蓣皂苷元干预后胃癌细胞周期无明显改变;薯蓣皂苷元可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:HGC-27、MGC80-3及AGS细胞中miR-34a相对表达量显着低于正常细胞GES-1,p<0.05;与阴性对照组相比较,过表达miR-34a后,HGC-27细胞增殖能力受到显着抑制,并可显着抑制其迁移能力;新加良附方及薯蓣皂苷元干预后,HGC-27及AGS细胞miR-34a表达水平升高,p<0.01;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:过表达miR-34a显着上调p53并下调SIRT1表达水平,可提高Bax及Caspase-3 mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平;新加良附方及薯蓣皂苷元干预可提高p53表达,降低SIRT1表达水平,并可上调Bax及Caspase-3的mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平,p<0.01,差异有统计学意义;Z-VAD-FMK可降低新加良附方及薯蓣皂苷元诱导的HGC-27细胞凋亡;新加良附方作用后可降低Caspase-9、Caspase-3前体水平,升高活化Caspase-3的表达水平;2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究胃癌细胞HGC-27在miR-34a各位点甲基化水平均较高,选取HGC-27细胞构建胃癌荷瘤小鼠模型,药物干预后观察到新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及中剂量联合组、高剂量联合组裸鼠状态较好,反应灵敏,活动及饮食、饮水量正常,5-Aza-CdR组裸鼠一般状态较差。5-Aza-CdR组裸鼠体重于实验给药第8天后逐渐下降,第11天其体重低于新加良附方高剂量组,差异有统计学意义,第15天,其体重低于模型组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及高剂量联合组,p<0.05,第18天,其体重低于其余各组,p<0.05,差异有统计学意义。5-Aza-CdR组抑瘤率为32.08%,与模型组比较,p>0.05,差异无统计学意义,中剂量联合组抑瘤率为35.00%,高剂量联合组抑瘤率为37.18%,与模型组相比较,p<0.05,差异有统计学意义。模型组平均生存时间为46.33±10.50天,新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、中剂量联合组及高剂量联合组裸鼠均未出现死亡现象,平均生存时间为57.00±0.00天,具有延长荷瘤裸鼠生存时间的趋势,5-Aza-CdR组裸鼠平均生存时间为40.33±7.37天,生存时间较模型组短。除新加良附方中剂量组外,其余各治疗组均可提高胃癌miR-34a表达,以联合组作用最为显着;新加良附方中剂量、高剂量、薯蓣皂苷元及高剂量联合组均可显着增加p53蛋白的表达,且药物干预各组均可显着抑制SIRT1 蛋白的表达,可降低 Bcl-2、Survivin 表达,并提高 Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 及 Caspase-3 底物 Cleaved PARP 蛋白的表达。结论1.miR-34a表达水平异常与胃癌发生密切相关;2.新加良附方可抑制胃癌细胞增殖及迁移、调节细胞周期、诱导凋亡,其成分薯蓣皂苷元可抑制胃癌细胞增殖,并诱导胃癌细胞凋亡,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶基因及激活Caspase凋亡通路相关;3.新加良附方联合5-Aza-CdR可抑制胃癌裸鼠移植瘤生长,并可改善裸鼠一般状态,有维持体重、延长其生存时间的趋势,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶蛋白及Caspase凋亡信号通路相关。
张翼[8]（2020）在《紫云英苷诱导人胃癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制作用的分子机制研究》文中进行了进一步梳理胃癌作为一种发病于胃窦部位上皮腺体细胞的恶性肿瘤,在世界范围内胃癌的流行病学特征主要表现为较高的发病率以及死亡率,早期病例确诊困难以及患者预后不良,对人们健康产生巨大威胁。而我国更是胃癌发病和死亡人数双高的中心区域,每年新增胃癌患者占全世界比例高达47.13%。目前临床上胃癌的治疗主要仍是沿用传统对胃部癌变部位进行手术切除,化放疗结合法以及针对酪氨酸或生长因子为靶标的靶向药物治疗,这些治疗方法普遍存在副作用大、靶向性差、价格高昂、易对患者造成二次创伤等缺点;此外临床应用的一线胃癌治疗药物由于具有较强的毒副作用,极大程度上限制了相关药物在临床方面的使用。所以,开发新型高疗效、低毒副作用的抗胃癌药物仍然是目前亟待解决的问题之一。针对胃癌治疗药物的开发其主体思路仍为抑制胃癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡及抑制癌细胞的转移。因此本项目旨在探讨紫云英苷对胃癌AGS细胞的生长增殖、诱导凋亡、细胞迁移的影响,并对紫云英苷作用的相关信号转导通路及ROS的内在关联进行深入研究。利用CCK-8比色法测定10种胃癌细胞及4种正常细胞在不同浓度及时间梯度下的细胞存活率。利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法检测胃癌AGS细胞周期分布和细胞周期相关蛋白表达情况。利用Hoechst/PI双荧光染色法观察细胞凋亡形态,流式细胞术及蛋白质免疫印迹法检测线粒体途径引发凋亡的蛋白变化情况。利用细胞划痕实验对胃癌细胞的迁移情况进行观察并计算相应的细胞迁移率。利用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关信号通路（p38、JNK、ERK、NF-κB）,细胞周期信号通路（Akt、p53、STAT3）以及细胞迁移信号通路（TGF-β/Smad）的蛋白表达情况,并且进一步对核转录因子NF-κB、STAT3的核内及胞质含量进行测定。通过ROS特异性荧光探针进行染色,测定其胞内含量;然后利用流式细胞术检测ROS与紫云英苷诱发的生物学活性的内在关联,并在基因及蛋白水平上说明ROS与凋亡及周期的关联性。紫云英苷对10种胃癌细胞均具有良好的杀伤作用,对正常肺部IMR-90、肾脏293T、肝脏L-02及胃GES-1细胞具有较低的毒性作用,并且与阳性对照药5-FU相比,紫云英苷对胃癌细胞具有更强的增殖抑制能力以及更低的毒副作用。紫云英苷通过上调CKI（p21及p27）的表达,使得Cyclin B1与CDK1/2的表达以及CDK/Cyclin的结合被显着抑制,导致胃癌AGS细胞发生G2/M期周期阻滞。紫云英苷通过上调线粒体膜蛋白Bad/Bcl-2比率,使线粒体膜的通透性上升,内容物渗出,线粒体膜的稳态平衡被破坏,从而使得下游的Caspase-3及其作用底物PARP受到剪切,从而导致胃癌AGS细胞通过线粒体途径发生凋亡。紫云英苷能够促进p-p53蛋白质的表达,抑制p-Akt和p-STAT3蛋白质的表达,此外受到抑制的Akt信号通路能够进一步抑制STAT3转录活性,使胃癌细胞发生周期阻滞。紫云英苷能够通过磷酸化抑制了 ERK信号通路,并激活了 p38和JNK信号通路,引起细胞质内κB-α（NF-κB结合蛋白）表达量上升,导致胞质及核内NF-κB的活性被抑制,从而引起胃癌细胞发生凋亡。紫云英苷通过促进抑制TGF-β1、Smad2/3、N-cadherin 和 Vinmentin 的表达,促进 E-cadherin 的表达抑制了胃癌细胞的迁移。紫云英苷通过其氧化还原活性,引起细胞内活性氧的蓄积,进而调控MAPK、Akt、p53、STAT3和NF-κB信号通路,从而参与调控细胞凋亡及周期。综上所述,紫云英苷通过上调细胞内ROS水平,激活了 MAPK信号通路进而抑制了下游NF-κB信号通路,使胃癌细胞通过线粒体途径发生凋亡;ROS的升高抑制了 Akt信号通路,激活了 p53信号通路,进而使其下游的STAT3转录因子活性受到抑制,使胃癌细胞发生G2/M期周期阻滞。此外紫云英苷通过下调TGF-β/Smad信号通路,阻滞了 EMT途径,从而使胃癌细胞的迁移受到抑制。
王凤杰[9]（2020）在《基于MAPK通路调控GRASP65探讨二氢杨梅素抗卵巢癌的作用及机制研究》文中研究指明目的:1.检测高尔基体堆叠蛋白65（GRASP65）在卵巢浆液性和粘液性肿瘤组织中的表达水平,探讨GRASP65蛋白表达与临床病理指标之间的关系。2.探讨二氢杨梅素（DHM）对卵巢癌SKOV3和A2780细胞的侵袭及迁移能力、细胞凋亡、细胞自噬及超微结构等方面的影响,明确DHM通过JNK和ERK通路调控GRASP65发挥抗卵巢癌作用的机制。3.探讨DHM干预处理对卵巢癌裸鼠的体内移植瘤生长的抑制作用及机制。方法:1.收集湖北民族大学附属民大医院收治确诊后进行手术切除、经病理诊断为卵巢肿瘤的患者118例,取患者术后肿瘤组织的石蜡标本,及6例卵巢浆液性癌患者术后的新鲜癌组织及癌旁组织为研究对象,采用免疫组织化学染色（IHC）和蛋白免疫印迹技术（Western blot,WB）检测GRASP65蛋白在组织细胞内的阳性定位及表达水平,并分析GRASP65表达与肿瘤患者的临床病理各指标之间的关系。2.不同浓度的DHM分别处理卵巢癌SKOV3和A2780细胞至既定时间后,采用CCK8法检测各组细胞的活力;划痕（Wound healing）实验和Transwell分析癌细胞迁移及侵袭能力的变化;流式细胞术（FCM）分析各组细胞的凋亡率;免疫荧光染色（IF）检测DHM处理后各组细胞内GRASP65蛋白和促凋亡蛋白Caspase-3的定位表达情况;WB检测促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,及MAPK通路蛋白的表达;采用si RNA转染下调GRASP65的表达,及GRASP65过表达质粒上调其表达,再分别用DHM干预处理,检测细胞活力、迁移能力及凋亡的改变;JNK和ERK通路抑制剂分别预处理后,再用DHM干预,WB检测细胞内p-JNK/ERK、JNK/ERK蛋白、GRASP65蛋白及Caspase-3的表达水平;透射电子显微镜（TEM）观察DHM处理后细胞内高尔基体等的结构改变及自噬水平的变化。3.构建SKOV3和A2780两种裸鼠皮下移植瘤的模型,分别用DHM混悬液及生理盐水对照进行腹腔注射来干预处理,检测裸鼠皮下瘤的体积大小、肿瘤重量、及裸鼠肝肾功能等指标;并取瘤组织,采用IHC和WB检测分析促凋亡蛋白Caspase-3及自噬相关蛋白LC3的表达,及检测GRASP65蛋白的表达水平;TEM观察DHM处理对瘤组织细胞内的高尔基体结构及自噬体的影响。结果:1.118例卵巢肿瘤患者中包括良性肿瘤82例、交界性肿瘤14例、及恶性肿瘤22例;从组织学的类型来分,浆液来源的肿瘤65例、粘液来源的48例、及特殊类型的5例。石蜡组织标本的IHC结果显示GRASP65表达呈棕黄或棕褐色、细颗粒样,分散于胞浆内。统计分析结果显示,与良性肿瘤组织相比,GRASP65蛋白在卵巢交界性、恶性肿瘤中高表达（χ2=12.57,P<0.01）;且在粘液性瘤内的表达高于浆液性瘤（χ2=5.23,P<0.05）。六例卵巢浆液性癌患者手术后切除的新鲜组织标本中,WB检测同一个体来源的癌及癌旁组织中GRASP65表达的情况,结果显示与癌旁组织相比,癌组织内GRASP65蛋白的表达明显增加（P<0.01）。上述结果表明GRASP65表达的异常可能与卵巢肿瘤的性质及组织学类型有关。2.DHM（0,10,20,40,80,120,160,240,320μM）处理两种卵巢癌细胞（SKOV3和A2780）,发现DHM处理可降低癌细胞的活力、抑制细胞迁移和侵袭的能力、及诱导细胞凋亡,且有一定的剂量性关系。根据计算所得DHM对SKOV3和A2780细胞的IC50值,后续实验中选择干预两种细胞48h时,DHM作用浓度分别为120μM和80μM。3.DHM分别处理SKOV3和A2780细胞后,检测其对细胞内GRASP65蛋白水平的影响,WB结果显示DHM可降低两种细胞内GRASP65的表达（P<0.05及0.01）;IF结果显示DHM处理后细胞内GRASP65的荧光染色强度减弱、且分散,形态上与高尔基体碎裂相似。Caspase-3特异性抑制剂预处理细胞30min后,再用DHM干预,WB分析结果显示在两种癌细胞中,与单独DHM处理相比,预处理后均可降低DHM诱导的Caspase-3的活化（P<0.01）,伴GRASP65表达水平增加（P<0.05及0.01）;FCM结果亦显示,与单独DHM处理相比,Caspase-3抑制剂预处理可降低细胞凋亡率（P<0.01）,表明DHM可能通过激活Caspase-3、进而引起GRASP65蛋白的裂解和下调,且Caspase-3的活化对DHM引起的GRASP65下调有重要作用。4.si RNA转染下调A2780细胞内GRASP65的表达,发现癌细胞的活力下降、迁移能力降低、及细胞凋亡率增加。WB及FCM结果显示,与单独DHM处理相比,DHM与si GRASP65转染共处理对细胞活力和迁移能力的抑制、及细胞凋亡的诱导均有相加作用。相反的是,过表达GRASP65质粒转染与DHM共处理可减弱DHM对细胞活力和迁移能力的抑制、及细胞凋亡的诱导作用。5.40,80及120μM DHM处理A2780细胞可呈剂量依赖性增加p-JNK和p-ERK的水平（P<0.05及0.01）,而对p-p38水平无明显影响（P>0.05）,提示ERK和JNK信号通路可能参与了DHM的抗卵巢癌作用。与空白对照组相比,si GRASP65组内p-JNK和p-ERK水平无显着性变化;而且DHM组与DHM+si GRASP65共处理组之间的p-JNK和p-ERK水平亦无明显差异,表明下调GRASP65表达对各组细胞内的p-JNK和p-ERK水平没有明显影响。采用JNK和ERK通路的抑制剂SP600125和U0126,分别预处理A2780细胞2 h后,再用DHM干预,WB结果发现与单独DHM处理组相比,两种抑制剂与DHM共处理均可抑制DHM诱导的Caspase-3的激活（P<0.05）,伴GRASP65水平的增加（P均<0.01）,及p-JNK和p-ERK水平的下降（P均<0.01）。上述结果表明DHM处理可能通过JNK和ERK通路激活Caspase-3,进而下调GRASP65的水平,来促进卵巢癌细胞凋亡,而且GRASP65可能处在DHM诱导JNK和ERK通路活化的下游。6.TEM观察DHM处理A2780后细胞内高尔基体等形态结构的变化,发现DHM处理组、si GRASP65组、及共处理组的细胞内均可见到高尔基体水肿、碎裂样改变,另有较多自噬体形成,表明DHM处理可能通过下调GRASP65引起高尔基体碎裂、诱导细胞凋亡,同时提高了癌细胞内的自噬水平。7.SKOV3和A2780细胞分别种植至裸鼠皮下,构建卵巢癌移植瘤的模型,再用DHM混悬液腹腔注射处理,分别设立生理盐水为对照组,结果发现DHM处理对各组裸鼠肝肾功能无明显影响。与对照组相比,DHM处理可抑制两种模型鼠体内肿瘤的生长（P均<0.01）;IHC及WB分析结果显示DHM处理后可下调瘤组织内的GRASP65表达水平（P均<0.05）、上调促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的水平及自噬相关蛋白LC3II的水平（P均<0.05）;TEM结果发现DHM处理裸鼠后,瘤组织内可见高尔基体肿胀及自噬体数量明显增多,伴有内质网明显水肿、扩张等现象。结论:1.GRASP65蛋白在卵巢交界性、恶性肿瘤组织中表达增加,且GRASP65的高表达与卵巢肿瘤的性质及组织学类型有关。2.DHM通过激活JNK和ERK通路下调GRASP65表达,引起卵巢癌细胞内的高尔基体水肿、碎裂改变及细胞凋亡,从而发挥抗卵巢癌作用。
刘东颖[10]（2020）在《miR-15a/16/195靶向HGF抑制胃癌迁移及增殖的机制研究》文中指出研究背景:胃癌是一个全球性的健康问题,目前是世界第五大最常诊断的肿瘤,位列肿瘤死因第三位。它是我国第二常见的肿瘤,位列肿瘤死因第二位。临床上,晚期胃癌预后差,5年总生存率仅15%。分子靶向治疗是近年来胃癌治疗研究的热点。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）是一种具有多效性的细胞因子,在促进血管生成、免疫应答、细胞运动和细胞分化方面具有重要作用。HGF在多种肿瘤中表达上调,与肿瘤的发生发展密切相关。微小核糖核酸（micro RNAs,miRNAs）是长约22个核苷酸、高度保守、非编码的RNA分子,通过关闭基因或者在转录后水平抑制m RNA翻译或介导m RNA的降解来调节基因表达。miRNAs可以靶向与癌症生理、病理特征几乎所有方面密切相关的靶点,在肿瘤的发生和进展中扮演重要角色。我们的前期研究结果显示,与健康人群相比,miR-15a/16/195在胃癌患者的血清中表达降低,且表达量与胃癌分期具有相关性,分期越晚,降低越明显。提示miR-15a/16/195在胃癌中发挥抑癌作用,但其潜在机制有待明确。研究目的:本研究目的在于明确miR-15a/16/195在胃癌中的表达水平,并验证其对胃癌细胞增殖、迁移功能的影响;明确HGF在胃癌中的表达水平,探索miR-15a/16/195对HGF的靶向调控作用并验证miR-15a/16/195-HGF轴对于胃癌细胞迁移、增殖功能的影响,为胃癌靶向治疗提供新的理论依据。研究方法:1.胃癌患者术后组织:收集天津医科大学肿瘤医院胃癌患者术后癌组织及配对癌旁组织,使用免疫组化（IHC）和免疫印迹（WB）方法检测HGF蛋白表达水平,利用高通量测序筛选胃癌特异的miRNA,并使用q RT-PCR检测HGF m RNA及miR-15a/16/195表达水平。2.靶点预测:使用三种生物信息学软件Pic Tar、miRanda和Target Scan预测靶向HGF m RNA的潜在miRNA,并取交集。3.荧光素酶报告基因实验:验证miR-15a/16/195与HGF m RNA的直接结合。4.胃癌细胞系:研究miR-15a/16/195-HGF通路对胃癌细胞迁移及增殖的作用。使用WB检测HGF蛋白表达。使用q RT-PCR方法检测HGF m RNA及miR-15a/16/195表达水平。使用细胞划痕实验和Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力,使用Ed U实验检测胃癌细胞的增殖能力。5.胃癌裸鼠移植瘤模型:进一步验证miR-15a/16/195-HGF通路对胃癌细胞迁移及增殖的作用。将对照组SGC7901、分别过表达miR-15a/16/195和HGF的SGC7901植入裸鼠皮下,4周后处死,剥离肿瘤。测量肿瘤直径、重量,检测瘤组织中miR-15a/16/195及HGF表达水平。研究结果:1.胃癌患者术后组织:与邻近正常组织相比,胃癌组织中miR-15a/16/195表达水平明显降低,HGF表达水平明显升高。HGF m RNA在癌组织和邻近正常组织中表达水平无明显差异。2.靶点预测:使用生物信息学软件预测miR-15a/16/195是可能靶向HGF m RNA的潜在miRNA,miR-15a/16/195可与HGF的3’-UTR区域特异结合。3.荧光素酶报告基因实验验证:在野生型HGF中,miR-15a/16/195 mimics处理组荧光值显着降低,而miR-15a/16/195 inhibitors处理组中,荧光值显着升高。在突变型HGF中,miR-15a/16/195 mimics、NC mimics、miR-15a/16/195inhibitors、NC inhibitors四种处理组,荧光均都无明显变化。结果证实miR-15a/16/195可以靶向抑制HGF表达,二者呈负向调控的关系。4.胃癌细胞系:转染miR-15a/16/195 mimics和miR-15a/16/195 inhibitors后,可以过表达或者沉默miR-15a/16/195的表达。细胞功能实验证实过表达miR-15a/16/195后,可以抑制胃癌细胞系SGC7901的迁移、增殖能力;相反,沉默miR-15a/16/195后,可以促进胃癌细胞的迁移、增殖。过表达/沉默miR-15a/16/195后,可以下调/上调HGF的表达,而HGF m RNA的表达水平没有变化。转染pc DNA.HGF（OE.HGF）和si RNA.HGF（si.HGF）,可以过表达或者沉默HGF的表达。过表达HGF后,可以促进胃癌细胞系SGC7901的迁移、增殖能力;相反,沉默HGF后,可以抑制胃癌细胞的迁移、增殖。回复实验:同时高表达miR-15a/16/195和HGF,与仅miR-15a/16/195高表达的细胞相比,HGF蛋白表达升高,但是低于OE.NC对照组,即可以部分拯救HGF蛋白表达。同时高表达组由于转染OE.HGF,HGF m RNA水平增高,而miR-15a/16/195高表达组和对照组,HGF m RNA水平无变化。回复实验也可以部分挽救SGC7901的迁移、增殖能力。5.胃癌裸鼠移植瘤模型:与未经干预的对照组相比,过表达miR-15a/16/195细胞成瘤组织中,miR-15a/16/195水平上调,HGF蛋白表达降低,肿瘤最小;过表达HGF细胞成瘤组织组,miR-15a/16/195水平无变化,HGF蛋白表达升高,肿瘤最大,生长最快。与细胞实验的结果一致。研究结论:miR-15a/16/195通过靶向HGF抑制胃癌细胞的迁移及增殖。
二、Activation of p53 in gastric cancer cells by tripchlorolide specifically induces apoptosis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Activation of p53 in gastric cancer cells by tripchlorolide specifically induces apoptosis（论文提纲范文）
（1）上调死亡受体4增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀伤肾癌细胞（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肾癌背景知识 |
| 1.1.1 肾癌概况 |
| 1.1.2 肾癌治疗方法简介 |
| 1.2 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的背景知识 |
| 1.2.1 TRAIL及其受体 |
| 1.2.2 TRAIL的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 TRAIL耐药性的机制 |
| 1.2.4 恢复TRAIL敏感性的策略 |
| 1.3 穿心莲内酯的背景知识 |
| 1.4 PFTβ 的背景知识 |
| 1.5 结语与前景展望 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 死亡受体基因的mRNA表达差异分析 |
| 2.5 细胞体外实验 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 细胞计数法检测细胞增殖能力 |
| 2.5.3 Edu检测试剂盒检测细胞增殖能力 |
| 2.5.4 MTS法测定药物IC50(半数抑制浓度)值 |
| 2.5.5 MTS法检测细胞活力 |
| 2.5.6 细胞划痕实验 |
| 2.5.7 细胞克隆形成实验 |
| 2.5.8 细胞衰老染色实验 |
| 2.5.9 BCA法标定蛋白样品浓度 |
| 2.5.10 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.5.11 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.5.12 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.5.13 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.5.14 细胞转染 |
| 2.5.15 利用sh-RNA构建稳定的基因敲低细胞系 |
| 2.6 统计学检测方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 肾癌和邻近正常肾组织中的DR4和DR5的mRNA表达差异分析 |
| 3.2 通过MTS方法检测TRAIL对肾癌细胞系的细胞活力的影响 |
| 3.3 穿心莲内酯对肾癌786-0细胞DR4和DR5表达水平的影响 |
| 3.4 通过MTS方法检测穿心莲内酯对肾癌786-0细胞的细胞活力的影响并测定其IC50值 |
| 3.5 MTS方法检测联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞活力的影响 |
| 3.6 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.6.1 应用细胞计数实验检测肾癌细胞的增殖能力 |
| 3.6.2 应用Edu检测试剂盒检测肾癌细胞的增殖能力 |
| 3.6.3 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.7 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.8 联合应用穿心莲内酯和TRAIL对肾癌细胞细胞周期和细胞衰老的影响 |
| 3.9 应用穿心莲内酯可以增强TRAIL诱导的肾癌细胞凋亡 |
| 3.10 穿心莲内酯增强TRAIL诱导的细胞死亡依赖于半胱天冬酶(Caspase)家族 |
| 3.11 穿心莲内酯通过上调DR4增强TRAIL的抗肿瘤作用 |
| 3.12 穿心莲内酯抑制肾癌786-0细胞突变体p53的蛋白表达水平 |
| 3.13 突变体p53的抑制剂可以上调肾癌786-0细胞DR4的蛋白表达水平 |
| 3.14 p53抑制剂增强TRAIL的抗肿瘤作用 |
| 3.15 p53突变诱导肾癌786-0细胞DR4低表达水平 |
| 3.16 p53突变诱导肾癌786-0细胞TRAIL的抗性 |
| 第4章 结果讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介以及攻读博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）致瘤微生物HPV和H.pylori调控mTOR信号通路介导恶性转化的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 HPV-16 E7上调miR-106a靶向LKB1激活mTOR信号通路调控宫颈鳞癌细胞的异常增殖与自噬 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 补充附图 |
| 第一部分小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 H.pylori通过NF-κB上调MYADM激活mTOR信号通路介导胃恶性转化 |
| 前目 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分小结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Western blot原始数据 |
（3）线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（4）长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 慢病毒制备及感染细胞 |
| 2.3.3 RNA提取 |
| 2.3.4 RNA的质量检测 |
| 2.3.5 定量PCR实验 |
| 2.3.6 蛋白提取 |
| 2.3.7 BCA蛋白定量 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.3.9 细胞增殖活性检测 |
| 2.3.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.3.11 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.12 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 2.3.13 皮下移植瘤实验 |
| 2.3.14 TUNEL实验 |
| 2.3.15 免疫组化实验 |
| 2.3.16 FISH染色(细胞爬片) |
| 2.3.17 FISH染色(结直肠癌组织) |
| 2.3.18 siRNA瞬时转染 |
| 2.3.19 质粒瞬时转染 |
| 2.3.20 统计分析 |
| 实验结果 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌中高表达 |
| lncRNA-DANCR表达情况与结直肠癌进展相关 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌细胞中高表达,定位于胞浆中 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞凋亡的发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌皮下移植瘤生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤中细胞凋亡发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制调控结直肠癌细胞中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达调控结直肠癌皮下移植瘤组织中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结直肠癌相关长链非编码RNA研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
（5）苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 苦参碱通过调控肿瘤相关磷酸化信号通路抑制卵巢癌的发生发展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点与作用机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 苦参碱抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（6）丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素协同抗肿瘤作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号(缩写词)表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 丹参酮ⅡA抗肿瘤机制研究现状 |
| 1.1.1 丹参酮ⅡA抗肿瘤作用的主要靶点 |
| 1.1.2 丹参酮ⅡA与其他化合物合用的抗肿瘤作用及机制 |
| 1.2 穿心莲内酯抗肿瘤机制研究现状 |
| 1.2.1 穿心莲内酯抗肿瘤作用的主要靶点 |
| 1.2.2 穿心莲内酯与其他化合物合用的抗肿瘤作用及机制 |
| 1.3 芹菜素抗肿瘤机制研究现状 |
| 1.3.1 芹菜素抗肿瘤机制研究的主要靶点 |
| 1.3.2 芹菜素与其他化合物合用的抗肿瘤作用及机制 |
| 1.4 天然产物协同作用的发生机制 |
| 1.4.1 多靶点相互作用 |
| 1.4.2 提高口服生物利用度 |
| 1.4.3 逆转耐药性 |
| 1.4.4 消除不良反应 |
| 1.5 复方药物的设计策略 |
| 1.5.1 多组分药物组合 |
| 1.5.2 天然化合物之间的协同作用 |
| 1.5.3 靶向多因素疾病的不同信号通路 |
| 1.6 相关信号通路简介 |
| 1.6.1 ROS信号通路与胞内抗氧化防御机制 |
| 1.6.2 ROS与p53信号通路的相互作用 |
| 1.7 立题依据和研究内容 |
| 1.7.1 立题依据 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 2 与丹参酮ⅡA联用具有协同抗肿瘤作用的中药化合物筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 小鼠脾细胞制备 |
| 2.3.3 MTT与MTS法检测细胞增殖 |
| 2.3.4 联用指数CI的计算 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 丹参酮ⅡA与38种中药单体化合物抗肿瘤协同作用筛选 |
| 2.4.2 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素配比优化 |
| 2.4.3 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯联用对不同肿瘤细胞协同抗肿瘤作用 |
| 2.4.4 丹参酮ⅡA与芹菜素联用对不同肿瘤细胞协同抗肿瘤作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯对人乳腺癌MCF7细胞的协同作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.3.3 细胞形态学观察 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3.5 液相色谱法检测Andro与NAC之间的化学反应 |
| 3.3.6 液质联用表征反应产物 |
| 3.3.7 胞内和无细胞体系内GSH的活性测定 |
| 3.3.8 DCFH-DA测定细胞内的H2O2水平 |
| 3.3.9 DHE测定细胞内超氧化物阴离子水平 |
| 3.3.10 Western blot检测信号蛋白表达 |
| 3.3.11 联用指数CI的计算 |
| 3.3.12 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯的联合作用 |
| 3.4.2 抗氧化物拮抗Andro与TanⅡA的协同作用 |
| 3.4.3 DETC和BSO与丹参酮ⅡA的联合作用 |
| 3.4.4 Tan ⅡA与Andro、BSO和DETC联用对胞内ROS积累的影响 |
| 3.4.5 Tan ⅡA与Andro联用对p53信号通路的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 丹参酮ⅡA与芹菜素对人胃癌BGC823细胞的协同作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MTT实验 |
| 4.3.2 细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 细胞周期检测 |
| 4.3.4 DNA结合实验 |
| 4.3.5 DNA热变性曲线 |
| 4.3.6 Westen Blot检测信号蛋白表达 |
| 4.3.7 S180肿瘤模型抑瘤实验 |
| 4.3.8 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 丹参酮ⅡA与芹菜素的联合作用 |
| 4.4.2 NAC对Tan ⅡA与Api细胞毒的影响 |
| 4.4.3 Tan ⅡA与Api联用对BGC823细胞周期阻滞作用 |
| 4.4.4 Tan ⅡA与Api与DNA的相互作用 |
| 4.4.5 Tan ⅡA与Api联用对荷瘤鼠的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（7）新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药抗胃癌基础研究现状与进展 |
| 1 中药有效成分基础研究 |
| 2 单味中药基础研究 |
| 3 复方基础研究 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌相关miRNA研究现状与展望 |
| 1 miRNA在胃癌发生发展中的作用研究 |
| 2 miRNA在胃癌诊断治疗中的作用研究 |
| 3 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究 |
| (一) 新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (二) 薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (三) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (四) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）紫云英苷诱导人胃癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 胃癌概述 |
| 1.1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.2 胃癌的致病因素 |
| 1.1.2.1 幽门螺旋杆菌 |
| 1.1.2.2 高盐摄入 |
| 1.1.2.3 吸烟 |
| 1.1.2.4 酒精 |
| 1.1.2.5 胃癌家族遗传病史 |
| 1.1.3 胃癌的诊断手段 |
| 1.1.3.1 内窥镜评估 |
| 1.1.3.2 病理评估 |
| 1.1.3.3 血清胃蛋白酶原测试 |
| 1.1.3.4 血清幽门螺杆菌检测 |
| 1.1.3.5 三叶因子3 |
| 1.1.4 胃癌的临床治疗 |
| 1.1.4.1 手术治疗 |
| 1.1.4.2 化学治疗 |
| 1.1.4.3 放射治疗 |
| 1.1.4.4 分子靶向治疗 |
| 1.2 紫云英苷的研究进展 |
| 1.2.1 抗菌作用 |
| 1.2.2 抗炎作用 |
| 1.2.3 抗病毒作用 |
| 1.2.4 抗肿瘤作用 |
| 1.3 细胞凋亡及相关途径 |
| 1.3.1 细胞凋亡 |
| 1.3.2 相关信号通路 |
| 1.3.2.1 活性氧 |
| 1.3.2.2 MAPK信号通路 |
| 1.3.2.3 NF-κB信号通路 |
| 1.4 细胞周期及相关途径 |
| 1.4.1 细胞周期 |
| 1.4.2 相关信号通路 |
| 1.4.2.1 Akt信号通路 |
| 1.4.2.2 p53信号通路 |
| 1.4.2.3 STAT3信号通路 |
| 1.5 细胞迁移及相关途径 |
| 1.5.1 细胞迁移 |
| 1.5.2 相关信号通路 |
| 1.5.2.1 TGF-β信号通路 |
| 1.5.2.2 上皮-间质转化 |
| 1.6 目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胃癌细胞的复苏 |
| 2.2.2 胃癌细胞培养和扩增 |
| 2.2.3 CCK-8法检测细胞存活率 |
| 2.2.4 Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞术检测线粒体膜电位 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.2.8 流式细胞术检测细胞内活性氧的水平 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹法检测蛋白质表达量变化 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 紫云英苷对胃癌细胞的杀伤作用及正常细胞的毒副作用 |
| 3.2 紫云英苷诱导胃癌细胞发生线粒体依赖性凋亡 |
| 3.2.1 荧光显微镜观察胃癌AGS细胞荧光强度及形态学变化 |
| 3.2.2 流式细胞术检测胃癌AGS细胞的凋亡率 |
| 3.2.3 流式细胞术检测胃癌AGS细胞线粒体膜电位 |
| 3.2.4 蛋白质免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平 |
| 3.3 紫云英苷调控MAPK及NF-κB信号通路诱导胃癌细胞凋亡 |
| 3.4 紫云英苷诱导胃癌AGS细胞发生G2/M期周期阻滞 |
| 3.4.1 流式细胞术检测胃癌AGS细胞周期分布 |
| 3.4.2 蛋白质免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白表达水平 |
| 3.5 紫云英苷调控Akt、p53及STAT3信号通路诱导胃癌细胞的周期阻滞 |
| 3.6 紫云英苷对胃癌AGS细胞的迁移抑制作用 |
| 3.6.1 细胞划痕实验检测胃癌AGS细胞的迁移率 |
| 3.6.2 蛋白质免疫印迹法检测细胞迁移相关蛋白表达水平 |
| 3.7 紫云英苷对胃癌AGS细胞内活性氧水平的调控作用 |
| 3.8 紫云英苷通过调控ROS介导胃癌AGS细胞的凋亡 |
| 3.9 紫云英苷通过调控ROS介导胃癌AGS细胞的周期阻滞 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于MAPK通路调控GRASP65探讨二氢杨梅素抗卵巢癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 高尔基体蛋白GRASP65在人卵巢肿瘤组织中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 二氢杨梅素通过MAPK通路下调GRASP65 抗卵巢癌的作用及机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 二氢杨梅素抑制卵巢癌裸鼠体内肿瘤生长的作用及机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文 |
（10）miR-15a/16/195靶向HGF抑制胃癌迁移及增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-15a/16/195抑制胃癌细胞迁移、增殖的实验研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 胃癌组织 |
| 1.1.2 人胃癌细胞系 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要仪器和设备 |
| 1.1.5 主要试剂 |
| 1.1.6 试剂制备 |
| 1.1.7 实验主要方法 |
| 1.1.7.1 培养细胞 |
| 1.1.7.2 提取组织总RNA |
| 1.1.7.3 RNA 逆转录 |
| 1.1.7.4 实时荧光定量 PCR （quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR） |
| 1.1.7.5 细胞划痕实验（Wound Healing） |
| 1.1.7.6 Transwell实验 |
| 1.1.7.7 EdU细胞增殖实验 |
| 1.1.8 统计分析方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 miR-15a/16/195在胃癌患者血清及术后肿瘤组织中低表达 |
| 1.2.2 细胞实验中,miR-15a/16/195对胃癌细胞迁移、增殖的影响 |
| 1.2.2.1 稳定沉默/过表达miR-15a/16/195 的胃癌细胞系的筛选和构建 |
| 1.2.2.2 miR-15a/16/195抑制胃癌细胞迁移 |
| 1.2.2.3 miR-15a/16/195抑制胃癌细胞增殖 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、证实miR-15a/16/195 在胃癌中直接靶向抑制HGF的机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 胃癌术后组织 |
| 2.1.2 胃癌细胞系 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 实验仪器和设备 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 实验主要试剂和溶液制备方法 |
| 2.1.6.1 细胞培养主要试剂制备方法 |
| 2.1.6.2 Western Blot 试剂制备方法 |
| 2.1.6.3 荧光素酶报告实验试剂制备方法 |
| 2.1.7 实验主要方法 |
| 2.1.7.1 培养胃癌细胞 |
| 2.1.7.2 胃癌和癌旁标本石蜡包埋 |
| 2.1.7.3 胃癌组织切片免疫组化 |
| 2.1.7.4 胃癌组织蛋白提取 |
| 2.1.7.5 胃癌细胞蛋白提取 |
| 2.1.7.6 Western blot |
| 2.1.7.7 提取胃癌组织总RNA |
| 2.1.7.8 提取胃癌细胞总RNA |
| 2.1.7.9 RNA逆转录 |
| 2.1.7.10 实时荧光定量 PCR （quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR） |
| 2.1.7.11 生物信息学预测 |
| 2.1.7.12 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.1.7.13 细胞划痕实验 |
| 2.1.7.14 Transwell 小室实验 |
| 2.1.7.15 EdU细胞增殖实验 |
| 2.1.7.16 裸鼠成瘤实验 |
| 2.1.8 统计分析方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 胃癌术后组织HGF表达水平增高 |
| 2.2.1.1 胃癌术后组织HGF表达水平升高 |
| 2.2.1.2 胃癌术后组织HGFm RNA水平无改变 |
| 2.2.2 miRNA miR-15a/16/195 的作用靶点为 HGF |
| 2.2.2.1 使用生物信息学软件预测靶点 |
| 2.2.2.2 荧光素酶报告基因实验证实 miR-15a/16/195 的作用靶点为HGF |
| 2.2.3 细胞实验验证miR-15a/16/195 在转录后抑制HGF的表达 |
| 2.2.4 细胞实验证明HGF对胃癌迁移、增殖的影响 |
| 2.2.4.1 稳定沉默/过表达HGF胃癌细胞系的构建 |
| 2.2.4.2 HGF促进胃癌细胞系的迁移 |
| 2.2.4.3 HGF促进胃癌细胞系的增殖 |
| 2.2.5 在细胞实验中,验证miR-15a/16/195-HGF通路的影响 |
| 2.2.6 在裸鼠移植瘤模型中，验证 miR-15a/16/195-HGF 通路的影响 |
| 2.2.6.1 miR-15a/16/195过表达抑制胃癌生长 |
| 2.2.6.2 证实miR-15a/16/195 抑制胃癌生长的靶点是HGF |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 microRNA-15a/16/195 在恶性肿瘤中的作用及机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Activation of p53 in gastric cancer cells by tripchlorolide specifically induces apoptosis（论文参考文献）
- [1]上调死亡受体4增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体杀伤肾癌细胞[D]. 毕然. 吉林大学, 2021(01)
- [2]致瘤微生物HPV和H.pylori调控mTOR信号通路介导恶性转化的机制[D]. 崔秀杰. 山东大学, 2021(10)
- [3]线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究[D]. 张亮. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究[D]. 杨小进. 苏州大学, 2020(06)
- [5]苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究[D]. 张玺. 华中科技大学, 2020(01)
- [6]丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素协同抗肿瘤作用[D]. 李莹雪. 大连理工大学, 2020(07)
- [7]新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究[D]. 李亚. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]紫云英苷诱导人胃癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制作用的分子机制研究[D]. 张翼. 黑龙江八一农垦大学, 2020(01)
- [9]基于MAPK通路调控GRASP65探讨二氢杨梅素抗卵巢癌的作用及机制研究[D]. 王凤杰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [10]miR-15a/16/195靶向HGF抑制胃癌迁移及增殖的机制研究[D]. 刘东颖. 天津医科大学, 2020(06)