一、应用PPA—ELISA检测实验家兔弓形虫抗体的研究（论文文献综述）
张宁[1]（2021）在《猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸检测方法建立及初步应用》文中研究指明弓形虫是原生动物寄生虫的一种。据统计,全球已有三分之一的人口感染弓形虫。其中猫科动物是弓形虫的终末宿主。本研究通过对原核表达SAG1、GRA1-GRA7和GRA6-GRA2三种蛋白,利用ELISA方法选择敏感性高的蛋白,用于制备猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸。本研究通过分子生物学方法,根据大肠杆菌的偏爱性和方便蛋白纯化,优化合成了p ET28a-GRA1-GRA7、p ET28a-SAG1和p ET28a-GRA6-GRA2重组质粒。将其质粒分别转化至ER2566感受态细胞中进行表达,并优化表达条件以得到高表达量的蛋白,确定GRA1-GRA7蛋白大小约50 ku,在加入终浓度为1 mmol/L的IPTG和25℃时的条件下进行诱导表达可获得蛋白的高表达;SAG1蛋白大小约56 ku,在加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG和25℃时的条件下进行诱导表达可获得蛋白的高表达;GRA6-GRA2蛋白大小约64 ku,在加入终浓度为1 mmol/L的IPTG和25℃时的条件下进行诱导表达可获得蛋白的高表达。表达产物经纯化、Western Blot鉴定、ELISA法检测,最终确定GRA6-GRA2蛋白敏感性最高。猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸方法的建立本实验标记抗原为GRA6-GRA2蛋白、检测线为SPA蛋白、质控线为兔抗GRA6-GRA2,制备胶体金试纸主要用于检测猫弓形虫抗体。当1 m L的胶体金加入12μL 0.2 mol/L K2CO3为最适p H值;GRA6-GRA2蛋白标记量为3.75μg/m L。试纸条敏感性为1:256,并对已知的猫杯状病毒、猫细小病毒、猫疱疹病毒阳性血清进行检测,发现无交叉反应,进行重复试验时,重复性良好。此试纸对临床289份样本血清进行检测,结果并与间接血凝试剂盒进行对比,试纸条的阳性检出率为2.42%,间接血凝试剂盒的阳性检出率为2.07%,二者符合率为99.5%。猫弓形虫感染的荧光免疫层析试纸方法的建立本研究选用纯化后的GRA6-GRA2蛋白作为标记抗原。经优化后确定,100μL的荧光微球的GRA6-GRA2抗原最佳标记量为90μg;1 mg/m LSPA+1 mg/m L兔抗GRA6-GRA2抗体的包被比例为最佳包被比例;结果显示上样后5 min为最佳检测时间;此试纸条的敏感性达1:1024;并与已知的猫杯状病毒、猫细小病毒、猫疱疹病毒阳性血清进行检测,发现无交叉反应,进行重复试验时,重复性良好。荧光免疫层析试纸与弓形虫抗体间接血凝法对289份临床血清进行对比检测,阳性率分别为2.42%和2.07%,符合率为99.5%。
方旭[2]（2020）在《新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究》文中研究表明犬新孢子虫（Neospora caninum,N.caninum）是一种胞内寄生性原虫,属于顶复门原虫。新孢子虫病呈全球性分布,给养牛业造成巨大的经济损失,世界范围内针对新孢子虫病尚无特效药物或疫苗。新孢子虫入侵宿主细胞是虫体突破机体防线的关键节点,其入侵过程主要为识别并黏附宿主细胞形成滑动连接体MJ侵入细胞后定殖。入侵过程取决于多种蛋白质在寄生虫和宿主细胞之间的相互作用,因此,研究新孢子虫入侵机理有助于发现与入侵相关的基因和宿主靶标。近年来的研究表明弓形虫RON2/4/5/8与顶膜抗原-1（AMA1）组成的复合体是MJ的关键结构,新孢子虫顶膜抗原-1可与多种蛋白相互作用,但同RON2之间是否存在相互作用还尚未得到证实。因此本研究拟利用GST-Pull down和双分子荧光互补技术确定新孢子虫AMA1与RON2之间是否存在相互作用,利用免疫荧光技术（IFA）对新孢子虫AMA1与RON2进行亚细胞定位,并进行新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊的免疫保护性研究,为新型抗新孢子虫药物及疫苗靶标的开发提供参考。Nc AMA1与Nc RON2互作的GST-Pull down鉴定:GST-Pull down实验发现通过纯化后的p GEX-4T-Nc RON2载体蛋白与p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白共孵育后,Western blot实验确定洗脱液中发现存在含His标签的p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白条带,GST标签蛋白与p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中没有发现存在含His标签的p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白条带,证明了新孢子虫Nc AMA1与Nc RON2存在体外互作现象。Nc AMA1与Nc RON2互作的双分子荧光互补鉴定:构建双分子荧光互补载体p Nc AMA1-HA-KN151与p Nc RON2-Myc-LC151,激光共聚焦观察Nc AMA1和Nc RON2共转染试验组可以发出红色荧光,两个蛋白在细胞内的相互作用被进一步证明。Nc AMA1与Nc RON2蛋白的亚细胞定位:Nc AMA1蛋白在激光共聚焦显微镜下定位表达于虫体顶部显现绿色荧光,Nc RON2蛋白在激光共聚焦显微镜下定位于虫体与VERO细胞膜交界处显现橙红色荧光,且与Nc AMA1有共定位情况。证明了Nc AMA1与Nc RON2蛋白在新孢子虫黏附入侵阶段存在共定位情况和互作关系。通过免疫荧光亚细胞定位研究,新孢子虫AMA1与RON2蛋白作为新孢子虫入侵的指示抗原,研究新孢子虫AMA1与RON2蛋白在新孢子虫入侵时蛋白互作的位置,这有助于了解其生物学功能及相互之间存在的作用关系。Nc AMA1与Nc RON2黏附入侵阻断试验:利用抗体中和阻断技术进行试验,发现了新孢子虫AMA1与RON2蛋白多抗有效的降低了新孢子虫速殖子的入侵率,在多抗稀释比例为1:50时效果最佳,分别为AMA1多抗组降低36%、RON2多抗组降低39%和AMA1+RON2多抗组降低41%（p<0.001）,其中AMA1+RON2混合组阻断效果最好。但对新孢子虫速殖子的胞内增殖速度影响不大。Nc AMA1与Nc RON2对小鼠的免疫保护性研究:通过对小鼠免疫攻虫后发现,Nc AMA1和Nc RON2蛋白免疫小鼠后,小鼠的血清抗体效价和细胞因子水平显着提升（p<0.001）,且AMA1+RON2蛋白免疫组免疫效果最好;AMA1+RON2蛋白免疫攻虫组的小鼠生存率最高为25%,其他组小鼠均为0,同时AMA1+RON2蛋白免疫攻虫组的小鼠的脑组织荷虫量和组织损伤程度最低,说明了混合免疫效果优于单独免疫。显示了新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠具有较好的免疫保护性。Nc AMA1与Nc RON2混合免疫对山羊的保护性研究:通过对山羊免疫攻虫后发现Nc AMA1和Nc RON2蛋白免疫山羊后,山羊的血清抗体效价和细胞因子水平显着提升（p<0.001）,山羊的脑组织荷虫量显着降低其减虫率为56%（p<0.01）,心、肝、脾、肺、肾、脑组织病理变化有明显的减轻,说明Nc AMA1+Nc RON2蛋白混合免疫后对于山羊具有一定免疫保护作用。综上所述,本研究利用GST-Pull down技术、双分子荧光互补技术和亚细胞定位技术鉴定了新孢子虫AMA1与RON2蛋白之间存在相互作用,且通过黏附入侵阻断试验证明了新孢子虫AMA1和RON2蛋白参与了新孢子虫入侵细胞过程,最后通过小鼠和山羊的免疫保护性研究试验证明了新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊具有较好的免疫保护性,为防控新孢子虫感染提供了理论依据。
王立群[3]（2020）在《豆状囊尾蚴外泌体的特征及其对巨噬细胞极化的调节机制》文中认为豆状囊尾蚴病是家兔最常见和重要的寄生虫病之一,给家兔养殖业造成了严重经济损失。外泌体（exosomes）作为寄生虫和宿主信息交流的新模式,可通过其携带的活性物质调控受体细胞的功能。脊椎动物let-7c可通过调节转录因子C/EBPδ的表达,调节巨噬细胞（Mφ）向M2型极化。而且,绦虫蚴感染能诱导宿主产生Th2型抑制性免疫应答,那么这种免疫抑制是否与绦虫蚴分泌的外泌体或其let-7有关,let-7是否也通过抑制C/EBPδ的表达而调节Mφ的极化呢?为此,本论文开展了以下研究:1.通过差速离心法分离纯化了豆状囊尾蚴外泌体,电镜观察和纳米粒径追踪分析表明,获得的囊泡为豆状囊尾蚴外泌体。用豆状囊尾蚴外泌体处理RAW264.7 Mφ,结果显示,外泌体可显着抑制NO产生,促进Mφ的增殖,且IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和Arg-1等Th2型免疫相关分子的表达显着上调（P<0.05）,而Th1型免疫相关分子IL-12、IFN-γ和iNOS表达水平明显下调（P<0.05）。表明豆状囊尾蚴外泌体可促进Mφ分泌Th2型免疫相关因子。用纯化的豆状囊尾蚴外泌体和ESP分别免疫家兔,ELISA检测血清抗体和细胞因子水平,并通过人工感染豆状带绦虫评价其免疫保护效果。结果显示,外泌体组家兔血清抗体、IL-4和IL-10的水平显着升高（P<0.05）,而IFN-γ和TNF-α显着降低（P<0.05）或差异不明显。家兔剖检表明,外泌体组的减虫率（24.88%）较ESP组（65.71%）明显降低。推测外泌体诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答。2.为明确外泌体携带的主要蛋白质和miRNAs,用蛋白质谱和小RNA测序分析外泌体组分,并进行western blot和qPCR验证。结果表明,豆状囊尾蚴外泌体携带包括14-3-3和烯醇化酶在内的87种蛋白质、41种已知miRNAs和18种新miRNAs,且5种miRNAs在外泌体中明显富集。靶基因预测显示,已知miRNAs的靶基因多与信号转导和免疫系统相关。3.鉴于外泌体含有相对富集的let-7-5p,且哺乳动物let-7c可调节巨噬细胞极化。本研究用外泌体来源的let-7-5p模拟物转染Mφ,qPCR、ELISA和western blot等分析其M1/M2型标志分子的表达。结果显示,过表达let-7-5p显着下调iNOS、IL-12和NO的表达（P<0.05）,上调Arg-1和IL-10的表达（P<0.05）,而敲低let-7-5p则呈相反的变化。表明let-7-5p可诱导Mφ向M2表型极化。利用软件预测和种子序列分析初步确定C/EBPδ为let-7-5p的靶基因,qPCR和western blot分析显示,过表达let-7-5p显着下调C/EBPδ的转录和表达,而敲低let-7-5p则显着上调C/EBPδ的表达。双荧光素酶报告基因检测显示,let-7-5p可与野生型C/EBPδ的3′UTR结合。敲低C/EBPδ显着下调IL-12和iNOS的表达（P<0.05）,上调IL-10和Arg-1的表达（P<0.05）。说明C/EBPδ为let-7-5p的靶基因,let-7-5p通过调控C/EBPδ的表达,实现对Mφ极化的调节。综上所述,本研究分离鉴定了豆状囊尾蚴外泌体,无论体外刺激Mφ还是免疫家兔,外泌体都能诱导宿主产生Th2型炎症因子。外泌体中相对富集的let-7-5p可通过调控其靶基因C/EBPδ的表达,调节Mφ向M2型极化,产生抑制性免疫应答。说明外泌体及其let-7-5p在豆状囊尾蚴感染诱导的免疫抑制中发挥重要作用,这为揭示绦虫蚴抑制和逃避宿主免疫应答的分子机制奠定了基础。
刘维建[4]（2017）在《猫弓形虫感染ELISA和胶体金试纸检测方法建立与初步应用》文中研究表明弓形虫是一种全球性分布的人畜共患寄生虫,全世界每年约有190,100人感染弓形虫病。该病的宿主较为广泛,可感染所有温血动物及部分变温动物。健康人群呈隐性感染,一般不出现症状,但艾滋病人及一些患有免疫缺陷类疾病的患者症状较明显。猫既是弓形虫的终末宿主又是中间宿主。人类主要通过摄入被污染的或未煮熟的含有包囊的食物感染。处于妊娠期的人类及动物感染后常表现为妊娠终止,出现流产、产死胎、木乃伊胎、弱子等症状。目前弓形虫的诊断方法主要包括:病原学诊断、分子生物学诊断、免疫学诊断等。弓形虫表面抗原（SAG）基因家族成员较多。主要包括SAG1、SAG2、SAG3三种。SAG3存在于弓形虫侵入宿主细胞的所有阶段,大小在43KDa。家族成员中与SAG3最为相似的是SAG1。SAG1是速殖子的特异性抗原,其免疫原性较好,广泛的应用于核酸疫苗的研究,被认为是弓形虫疫苗制备的首选。SAG3和SAG1具有相同结构和功能,目前对于SAG1的报道有很多,但是关于SAG3的报道较少,因此,本研究选择SAG3进行猫弓形虫感染检测方法的建立。猫弓形虫感染间接ELISA检测方法的建立本研究选用纯化后的弓形虫表面抗原SAG3作为包被抗原,优化条件后进行ELISA检测方法的建立。最后确定抗原的最佳包被量为0.75μg/孔;待检血清的最佳稀释比例为1:800;HRP标记山羊抗猫Ig G最适稀释比例为1:5000;敏感度可达到1:12800;选取猫杯状病毒标准血清和猫传染性胃肠炎病毒标准血清进行特异性试验,结果未有交叉反应出现,本试验方法特异性较好;选取不同生产日期的96孔检测板进行批间和批内试验,结果显示:批间试验和批内试验的变异系数均小于6%。对临床中96份猫血清样品进行检测,结果与商品化间接血凝试剂盒进行对比,结果显示:间接ELISA阳性率为61.46%（59/96）,间接血凝试剂盒的阳性率为56.25%（54/96）。猫弓形虫感染Dot-ELISA检测方法的建立本研究利用纯化后的弓形虫SAG3蛋白来进行包被,选取硝酸纤维素膜（NC）膜作为固相载体来进行试验。最终确定本研究方法中待检血清的稀释倍数达到1:1600时为最佳;HRP标记山羊抗猫Ig G最佳稀释度为1:5000;抗原的最佳包被量0.125μg/片;敏感性可达到1:12800;特异性试验证实,本方法与猫杯状病毒标准血清和猫传染性胃肠炎病毒标准血清均无交叉反应。对临床中96份猫血清样品进行检测并与商品化的间接血凝试剂盒进行对比。结果显示,Dot-ELISA试验的阳性率为62.5%（52/96）,间接血凝试剂盒的阳性率为56.25%（54/96）。猫弓形虫感染免疫胶体金试纸条的研制本研究选取柠檬酸三钠还原氯金酸来制备胶体金溶液。以金颗粒标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）和抗SPA的二抗来组建猫弓形虫病胶体金试纸条。当每毫升胶体金溶液中加入3μL K2CO3（0.2mol/L）混匀后的p H值为最佳;金标SPA的最佳标记量为6μg/m L,检测线（T）质控线（C）最佳包被量分别为0.5mg/m L和1mg/m L。对试纸条进行性能试验,敏感性可达1:640,通过检测猫杯状病毒标准血清和猫传染性胃肠炎病毒标准血清均未出现交叉反应,选取不同批次的试纸进行重复性试验后,重复性较好。对不同储存条件下（室温、4℃、37℃）及不同保存期（1d、7d、30d、60d、90d、120d）的试纸条进行检测,结果显示4℃保存的效果较好,可达到120d。室温加有干燥剂的试纸条保存相对较好,保存期可达到90d（可见轻微条带）。37℃保存的试纸条效果相对较差,保存期在90d时已经失效。对临床中96份猫血清样品进行检测并与商品化的间接血凝试剂盒进行对比。结果显示:免疫胶体金检测方法的阳性率为57.29%（52/96）,间接血凝试剂盒的阳性率为56.25%（54/96）。
韩登阁[5]（2017）在《弓形虫抗体sGRA8-ELISA检测方法的标准化及其应用》文中研究表明弓形虫又名刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）,是一种机会致病性原虫,可广泛寄生于人和多种动物除红细胞以外的所有有核细胞内。近年来,弓形虫与其他病原混合感染使弓形虫危害加大,严重损害畜牧业经济效益和威胁人类健康。因此,重视对弓形虫免疫学检测方面的研究,对于弓形虫病的诊断防控有着重要意义。ELISA是目前最常用的弓形虫免疫学检测方法,研制稳定可靠的间接ELISA检测试剂盒,必须选用合适的包被抗原。弓形虫致密颗粒蛋白与虫体在细胞内寄生、发育密切,是免疫原性较强的靶标抗原。本实验室对弓形虫致密颗粒蛋白GRA8全基因进行了克隆表达,并进行了 Western blot和ELISA验证,表明GRA8是一种具有很好诊断价值的弓形虫病诊断抗原。但GRA8基因在原核表达质粒中表达水平低,本实验室通过使用相关分子生物学手段切除了 GRA8的信号肽及疏水区,构建了截短型基因sGRA8的原核表达载体,Western blot验证表明sGRA8原核重组表达蛋白具有很好的抗原性。基于本实验室使用sGRA8蛋白建立的鸡弓形虫抗体ELISA检测方法,敏感性高、特异性强,可在鸡感染130时仍检测到弓形虫抗体。本研究将sGRA8-ELISA方法应用于大鼠、猪、牛、羊以及人,进行弓形虫抗体检测的标准化探索和初步应用。实验中ELISA反应条件在参照鸡弓形虫sGRA8-ELISA诊断方法的基础上,重新对一抗和酶标二抗的稀释比例等反应条件进行摸索与优化,最终确定各项试验条件。本实验首先通过BL21-pCold TF-sGRA8原核表达载体对sGRA8蛋白的诱导表达,以及His亲和层析法过柱纯化,获得了可用于弓形虫抗体ELISA检测方法的可溶性包被抗原。再使用人工感染方式对10只清洁级SD大鼠腹腔注射弓形虫Rh株速殖子,另在清洁环境中饲养10只的未作任何感染SD大鼠,于感染后3-109天分11个批次采集这20只大鼠的血清,如上20只大鼠皆经过PCR诊断验证;通过构建完成的sGRA8-ELISA方法对大鼠待测血清进行检测应用,并与购自BioTSZ公司的进口商品化试剂盒进行比较检测,结果显示:两种检测方法均能够在109天内的大鼠弓形虫感染进行一定程度的识别诊断,在感染第3天时sGRA8-ELISA方法与BioTSZ试剂盒检出阳性份数分别为4份和6份;在感染7-75天时sGRA8-ELISA的阳性血清检出率达到75%-100%,而购自BioTSZ公司的商品化试剂盒阳性率最高达到67%;BioTSZ的试剂盒在大鼠感染75天时检出率开始明显下降,在109天时无法检出,而sGRA8-ELISA方法在109天时的阳性血清的检出率仍可达到67%（4/6）;合计sGRA8-ELISA方法敏感性为80%（74/92）,BioTSZ公司的试剂盒敏感性为51%（47/92）,前者比后者敏感性高出29%;两种检测方法在阴性血清的检测结果上并无差异,特异性均为100%（60/60）;表明sGRA8-ELISA检测方法明显优于BioTSZ公司试剂盒的检测效果。通过sGRA8蛋白多克隆抗体检测,效价达到1012。通过针对猪、牛、羊弓形虫抗体sGRA8-ELISA实验条件的优化以及重复性验证,显示出sGRA8-ELISA试剂盒检测猪、牛、羊弓形虫抗体效果良好,与南京奥青公司的ELISA试剂盒有着较高的符合率。用本法对来自16家养猪场809份猪血清进行检测,测得总体阳性率为6.43%（52/809）;人的阴阳性血清由珠海海泰生物公司的弓形虫抗体ELISA试剂盒检测筛选,经sGRA8-ELISA实验条件优化以及重复性试验,重新检测38份阳性血清和52份阴性血清并测定OD450值,结果显示与海泰公司试剂盒阳性样本符合率达到:84%（32/38）、阴性样本符合率达到:94%（49/52）。综上所述,sGRA8-ELISA方法在对大鼠、猪、牛、羊及人类弓形虫抗体的检测中表现出良好的综合水平,为下一步开发商品化试剂盒打下基础。
宋慧琦[6]（2016）在《检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立》文中认为弓形虫属于细胞内寄生原虫。弓形虫病是一类由弓形虫引起的对绝大多数脊椎动物包括人在内的具有严重危害的人兽共患疾病。弓形虫可以自然感染人、犬等是数百种动物。由于犬数量庞大,且与人的关系最为密切,所以犬弓形虫感染率与人的感染率息息相关。针对弓形虫病的研究技术众多,但因免疫学诊断方法敏感性高、特异性强、简便实用,所以应用广泛。本研究以犬作为研究对象,利用免疫学诊断技术建立检测犬弓形虫感染的方法。本试验成功建立了以SAG3重组蛋白为抗原用以检测犬血清弓形虫SAG3抗体的间接ELISA方法;和用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体的检测犬弓形虫CAg的双抗体夹心ELISA的方法;以及用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体用以检测犬弓形虫CAg的胶体金试纸条方法。3个试验得到的结果如下:1.犬弓形虫感染的间接ELISA检测方法的建立。借助于棋盘滴定法确定抗原的包被浓度和阳性血清稀释度;再对该方法的封闭剂以及封闭时间、犬弓形虫阳性血清孵育的时间、二抗的工作浓度以及显色液的孵育时间等各项条件进行优化;并采用优化后ELISA方法检验其敏感性;借助于犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该ELISA方法的特异性;同时检验该ELISA方法的重复性;运用所建立的间接ELISA方法对87份样品血清进行检测。结果如下,该间接ELISA最佳优化条件分别是:抗原的包被浓度和阳性血清稀释度分别为0.82μg/孔,阳性血清稀释度1:20;封闭剂为10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封闭时间和阳性血清作用时间分别为2 h和1.5 h;兔抗犬酶标二抗稀释度1:8000;底物最佳显色孵育时间为10 min。优化的ELISA敏感性为1:1280;与犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内批间重复性试验的变异系数均于15%以下。经该ELISA方法对所有样品血清检测可得血清阳性率为18.39%（16/87）。2.检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立。利用HRP标记试剂盒标记29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体即检测抗体并检测标记结果;借助于棋盘滴定法确定42#抗弓形虫SAG3单抗即捕获抗体的包被浓度和参考阳性血清的稀释度;再对该方法的封闭剂以及封闭剂的作用时间、犬弓形虫参考阳性血清孵育的时间、检测抗体的工作浓度以及显色液的孵育时间等各项条件进行优化;随后采用优化后ELISA方法检验其敏感性;采用犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该ELISA方法的特异性;同时检验该ELISA方法的重复性,ELISA包被板保存4oC中,分别于15d、30d、60d以及90d后取出检测其稳定性;用所建立的双抗体夹心ELISA方法对76份样品血清进行检测。结果如下,本试验成功标记检测抗体;该方法最佳优化条件分别是:捕获抗体的包被浓度和参考阳性血清的稀释度分别为1∶800稀释（0.34μg/孔）和1∶12;封闭剂为10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封闭时间和CAg血清作用时间均为2 h;检测抗体稀释度1∶3000。优化的ELISA敏感性为1∶48;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内批间重复性试验的变异系数均于15%以下;保存于4oC中的ELISA包被板稳定性至少可达到90 d以上;经该双抗体夹心ELISA方法对76样品血清检测可得检出率为5.26%（4/76）。3.犬弓形虫感染胶体金试纸条的研制。该试验主要对金标蛋白pH值、硝酸纤维膜的选择、弓形虫参考阳性血清稀释度以及试纸条检测线T线和质控线C线条件的等条件进行优化;并采用优化的胶体金试纸条方法检验其敏感性;采用犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该胶体金试纸条方法的特异性;同时检验该方法的重复性;再用所建立的胶体金试纸条方法对76份样品血清进行检测,并与建立的双抗体夹心ELISA所检测样品结果进行比较。结果如下,该胶体金试纸条方法最佳优化条件分别为:0.02 M K2CO3 4μL;密理博135 NC膜为最佳选择且流速大约为40 mm/7 min;参考阳性血清工作浓度为1∶8;T线、C线抗体稀释度均为0.5μg/μL;优化的胶体金试纸条方法的敏感性为1∶64;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清与弓形虫参考阳性血清均无特异性反应;批内批间重复性较好。用胶体金试纸条方法检测76份样品血清样本,结果显示检出率为5.26%（4/76）。通过与双抗体夹心ELISA检测的检出率5.26%（4/76）相比较,结果显示两种试验方法对犬弓形虫血清CAg诊断相符率100%,说明该胶体金试纸条方法可靠性强,兼备简便、快速的优点,更适于在基层推广使用。
寇金华[7]（2016）在《猪弓形虫感染ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立与初步应用》文中研究指明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）简称弓形虫是专性细胞内寄生虫。它可引起严重的人畜寄生虫病并呈全球性分布及流行。弓形虫的终末宿主是猫及猫科动物,但是其中间宿主包括的动物种属却较多,其中猪就是其中间宿主之一,并且猪弓形虫的感染率及死亡率也较高。在我国猪弓形虫病的分布地区也较广,猪肉在我国的消费比例较高,已经成为人感染弓形虫的重要来源。这就给养猪业和人类健康造成严重的危害。但目前对弓形虫病还没有特效的治疗药物和有效疫苗。因此,建立一种方便、快捷的猪弓形虫病诊断方法尤为重要。目前用于弓形虫病诊断的方法有很多,如病原学诊断（检测结果确实、可靠,但是耗时、检出率低）、分子生物学诊断（敏感性高,但对仪器、人员要求较高）和免疫学诊断（操作简单、敏感特异、结果判定直观）。本研究应用免疫学诊断方法对弓形虫病进行检测其主要研究内容及结果如下:1.弓形虫SAG3成熟肽基因的克隆、原核表达及鉴定根据Gen Bank AF340227已经发表的弓形虫表面抗原SAG3基因序列设计一对特异性引物,PCR扩增SAG3基因片段。经Eco R?、Hind???双酶切后克隆到原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒p ET-28a-SAG3并将其转化至BL21中,经IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE显示p ET-28a-SAG3主要以包涵体的形式存在。Western blotting分析该重组蛋白能被猪弓形虫阳性血清识别,反应原性较好。2.猪弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用利用纯化的SAG3蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,并对反应条件进行优化,优化结果显示:最佳蛋白包被浓度为31.25ng/孔,以5%脱脂奶粉为最佳封闭剂,被检血清稀释度为1:320,酶标二抗最佳工作浓度为1:3000。该方法的灵敏性试验中,血清稀释度在1:6400时仍判为阳性;该方法批内、批间重复的变异系数分别小于3%,12%重复性较好;采用该方法对8份阳性血清进行检测均为阳性,对吉林地区某猪场94份猪的待检血清以及广东地区某猪场54猪血清进行检测,阳性率分别为8.51%（8/94）、46.29%（25/54）。3.猪弓形虫感染双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步应用利用实验室已制备的抗弓形虫重组蛋白SAG3单克隆抗体（Anti-A-SAG3-7和Anti-A-SAG3-23）建立双抗夹心ELISA方法并对各个反应条件进行优化。结果显示:Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体包被的最佳稀释度为1:3200,猪弓形虫循环抗原（CAg）阳性参照血清的最佳稀释度为1:80,最佳封闭液为1%BSA,HRP-Anti-A-SAG3-23的最佳稀释倍数为1:3200。该方法敏感性达1:640,并且此方法与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,计算批内、批间变异系数均小于11%,表明所建立的双抗夹心ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。检测广东、吉林某地各94份待检血清,结果阳性率分别为20.2%（19/94）、11.7%（11/94）。4.猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条的研制及初步应用利用柠檬酸三钠还原法制备40nm粒径的胶体金溶液,标记抗弓形虫重组蛋白SAG3的单克隆抗体（Anti-A-SAG3-7）并对其标记条件进行优化,用另一株抗SAG3的单克隆抗体（Anti-A-SAG3-23）和羊抗小鼠Ig G抗体分别包被硝酸纤维素膜上的检测线（T线）与质控线（C线）。组装试纸条并优化其检测条件。对试纸条的性能进行测试并检测待检样品。结果如下:每毫升胶体金溶液的最适PH值是加入4μl 0.2M/L K2CO3,抗体的最佳标记量为12μg。T线与C线的最佳包被浓度均为0.25mg/m L,最佳包被体积均为0.8μl。该方法的敏感性达1:160;与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应;稳定性试验结果表明,试纸条置于4℃和室温分别可保存3个月、1个月有效。分别对广东、吉林地区某猪场各94份猪待检血清进行检测,阳性率分别为18.08%（17/94）、10.63%（10/94）。利用胶体金试纸条与双抗夹心ELISA法做对比检测同一批样品,两者的符合率分别为89.47%,90.90%,两种方法的符合率较高。结果表明,胶体金免疫层析法具有敏感、特异,操作简单等优点。因而,本研究更适用于广大基层单位对时间紧、样品数量大的检测,为猪弓形虫病的早期诊断提供了一种快捷、实用的方法。
王雪[8]（2016）在《新孢子虫病检测方法的建立及三种动物新孢子虫病流行病学调查》文中指出犬新孢子虫（Neospora caninum）宿主范围非常广泛,终末宿主是犬,牛、羊、犬、马、猪、兔等家畜及一些野生动物和小型动物可作为中间宿主,新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生在犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内所引起的一种原虫病。该病对牛、羊的危害尤为严重,是造成世界性牛流产的主要原因之一,给畜牧养殖业造成巨大的经济损失。目前还没有有效的预防方法,只能对患病家畜采取淘汰等处理方法来防治新孢子虫病,本研究旨在建立一系列灵敏、快速、准确的新孢子虫检测方法,并对多种动物进行新孢子虫病流行病学调查,为新孢子虫病防治提供依据。本研究根据新孢子虫NcSRS2序列,设计合成一对PCR引物,建立新孢子虫PCR检测方法。通过对PCR反应条件及反应体系的优化,确定其最佳反应条件。然后进行敏感性及特异性检测,构建重组质粒pMD18-T-NcSRS2,将重组质粒进行10倍的梯度稀释,以稀释后的质粒为模板,进行PCR扩增,可以扩增出103copies/μL,具有较好的敏感性;对新孢子虫、弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫、牛伊氏锥虫等阳性核酸进行扩增,只能扩增出新孢子虫,其他阳性核酸均未扩出,证明该方法具有很好的特异性。根据新孢子虫NcSRS2序列,设计合成一对荧光PCR引物及一条探针,以重组质粒为模板,建立荧光PCR检测方法,然后对荧光PCR反应条件及反应体系进行优化,确定最佳反应条件,然后对其敏感性,特异性及重复性进行检测,以稀释后的质粒为模板,进行荧光PCR扩增,可以扩增到102copies/μL,并且只能扩增出新孢子虫的阳性基因,其它阳性基因均未扩出,证明其具有很好的敏感性及特异性,对重组质粒108copies/μL106copies/μL进行三次扩增,其扩增时间及扩增量相似,可以证明其具有很好的重复性。根据Nc5基因设计4条特异性引物,建立新孢子虫LAMP（环介导等温扩增）快速检测方法。通过对LAMP扩增体系、反应温度进行优化,及敏感性重复性及特异性试验,结果表明,LAMP的反应温度为63℃,其敏感度可以检测出的最低浓度是102copies/μL,并且只能扩增出新孢子虫的基因,证明LAMP检测法具有很高的敏感性及特异性。对重组质粒106copies/μL104copies/μL进行3次重复性扩增,每次扩增的时间基本一样,均能扩增出阳性曲线,说明LAMP检测方法具有很好的稳定性。应用建立的新孢子虫PCR检测方法对200份兔脑组织进行检测,其中有14份扩增出NcSRS2基因片段,其阳性率为7%。将新分离的14株新孢子虫基因与已经发表的13株新孢子虫的SRS2基因进行比对分析发现,所有的基因之间的亲缘性都比较近,与最早分离的NC1株的SRS2基因同源性为99%,而JL Rabbit（1/3/6/7/8/10/12/14）SRS2与strain Nc-Liv SRS2的同源性为100%。其他的基因与Nc-Liv SRS2株的基因相比,有个别的碱基发生突变,其中JL Rabbit 2/5/9/13的碱基突变影响了氨基酸翻译,其他的基因也有碱基突变,但是不影响翻译成氨基酸。采用新孢子虫VMRD竞争性ELISA检测试剂盒对吉林、山西、山东、河南、新疆、内蒙、青海共1630份牛血清,578份羊血清、200份兔血清进行检测,其中吉林的牛感染新孢子虫阳性率为18.09%,山东15.39%,山西35.94%,河南15.57%,内蒙6.87%,新疆8.75%,青海10.92%;其中羊感染新孢子虫的阳性率分别为吉林为20.71%,山西23.81%,新疆16.31%,青海7.98%;家兔的阳性率为24.5%。
田来明[9]（2015）在《梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用》文中研究说明犬新孢子虫（Neospora caninum, N. caninum）于1984年在欧洲被首次发现，为细胞内寄生虫。新孢子虫的终末宿主为犬，中间宿主为奶牛、绵羊、山羊、牛、马、鹿等动物；虫体的寄生部位是宿主的中枢神经系统、肌肉、肝、脑及其他内脏组织；临床上可引起奶牛等孕畜流产及新生幼畜神经系统疾病等，给畜牧业造成严重的经济损失。然而目前尚无效果显着的药物来治疗该病，所以灵敏特异的临床诊断方法成为了防治该病的重点。据报道新孢子虫可感染特种经济动物—鹿，对鹿的健康和相关产品造成影响，目前没有针对鹿感染犬新孢子虫的诊断方法。因此，本研究利用新孢子虫MIC6蛋白制备单克隆抗体，建立检测梅花鹿感染犬新孢子虫的双抗夹心Dot-ELISA诊断方法；从而为深入研究梅花鹿感染犬新孢子虫防治奠定基础。1、新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备：本研究的免疫抗原为新孢子虫的pGEX-MIC6重组蛋白，利用该抗原对BALB/c小鼠进行免疫，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经克隆筛选获得两株杂交瘤细胞株，分别命名为1A1和1H11，染色体数目分别为90条和94条，经亚类鉴定1A1为IgG1，1H11为IgG2b。先后采用辛酸－饱和硫酸铵法和亲和层析法纯化抗体，腹水效价测定结果发现1A1和1H11效价分别为5.12×104和1.024×105，浓度分别为0.974mg/mL和2.01mg/mL。特异性试验发现这两株单抗不仅能特异性识别新孢子虫，还与弓形虫无交叉反应。2、新孢子虫MIC6蛋白抗原定位：利用免疫荧光技术，通过共聚焦激光扫描荧光显微镜对新孢子虫MIC6蛋白抗原进行了定位，发现该蛋白定位于新孢子虫速殖子前端。3、梅花鹿人工感染犬新孢子虫的试验：本研究利用人工感染试验使梅花鹿感染犬新孢子虫，观察其临床症状、病理组织变化并进行免疫组织化学检测，结果发现接种新孢子虫体后鹿出现体温升高，精神沉郁，厌食；剖检观察发现肝脏淤血肿大，表面有白斑；肺脏有局灶性暗红色病灶；脑膜淤血、水肿。对组织器官进行HE染色和免疫组织化学试验后发现，肝细胞发生变性坏死；肾小球系膜细胞增生；心肌细胞颗粒变性等，脑组织内发现有包囊，但其它组织中未观察到包囊样结构。检测接种新孢子虫后鹿血清中循环抗原，结果发现循环抗原的量呈先上升后下降趋势。4、梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用：利用抗新孢子虫MIC6单克隆抗体，建立了检测梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA的方法，建立了其结果判定标准，经过一系列试验测定确定最佳反应条件为： HRP标记抗体稀释比例为1:100，包被抗体最适浓度为0.3μg/片，被检血清最合适的稀释比例为1:8。特异性、敏感性、重复性、灵敏度试验结果表明建立的方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和灵敏度。同时利用该方法和双抗夹心ELISA方法对长春地区某鹿场鹿79份血清样品同时进行检测，结果表明阳性率均为15.2%（12/79）。从而为梅花鹿感染犬新孢子虫的检测提供了新方法。
潘严,李彩云,陈啸天,张超,潘学营[10]（2014）在《酶联免疫法与间接血凝法检测实验动物家兔弓形虫抗体的结果比较》文中指出目的分析比较酶联免疫法（ELISA）和间接血凝法（IHA）在本实验室检测实验用家兔弓形虫特异性抗体的可行性。方法应用ELISA和IHA两种方法平行检测实验感染弓形虫的12只家兔阳性血清和未感染过弓形虫的30只正常家兔阴性血清中的弓形虫特异性抗体。比较两种方法敏感性、特异性、检测效率及Youden指数并运用kappa值进行一致性的评价。结果 IHA法的敏感性41.67%,特异性93.33%,ELISA法的敏感性100%,特异性100%。ELISA方法的敏感性、特异性、检测效率及Youden指数都在IHA方法之上。两种方法的总符合率是78.57%。kappa值=0.3998。结论 ELISA法与IHA法在本次平行检测中的一致性较差。ELISA方法敏感性、特异性明显优于IHA方法,更适用于实验动物家兔的弓形虫特异性抗体的检测。
二、应用PPA—ELISA检测实验家兔弓形虫抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用PPA—ELISA检测实验家兔弓形虫抗体的研究（论文提纲范文）
（1）猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸检测方法建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1 弓形虫诊断研究进展 |
| 2 弓形虫病诊断方法的研究进展 |
| 2.1 病原学诊断 |
| 2.2 免疫学诊断 |
| 2.3 分子生物学诊断 |
| 3 免疫层析试纸技术的研究进展 |
| 4 本实验研究的意义 |
| 第2章 弓形虫SAG1、GRA1-GRA7及GRA6-GRA2 基因的原核表达与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液的配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的表达 |
| 2.2.3 蛋白的纯化 |
| 2.2.4 ELISA检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组载体的鉴定 |
| 2.3.2 IPTG诱导剂的最佳使用量的确定 |
| 2.3.3 诱导温度的确定 |
| 2.3.4 GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2 蛋白纯化 |
| 2.3.5 ELISA检测蛋白敏感性结果 |
| 第3章 胶体金免疫层析试纸检测猫弓形虫抗体方法的建立及初步应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液的配制方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胶体金的制备 |
| 3.2.2 金标GRA6-GRA2 蛋白的制备 |
| 3.2.3 兔抗GRA6-GRA2 多克隆抗体的制备及其抗体的提纯 |
| 3.2.4 胶体金试纸条的制备 |
| 3.2.5 胶体金试纸条的评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金透射电镜检测结果 |
| 3.3.2 兔抗GRA6-GRA2 多克隆抗体的提纯 |
| 3.3.3 胶体金最适p H的确定 |
| 3.3.4 胶体金最适蛋白标记量的确定 |
| 3.3.5 敏感性检测 |
| 3.3.6 特异性检测 |
| 3.3.7 临床样本检测结果 |
| 第4章 荧光免疫层析试纸检测猫弓形虫抗体方法的建立及初步应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要溶液的配制方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 微球垫的制备 |
| 4.2.2 NC膜的制备 |
| 4.2.3 荧光免疫层析试纸条的组装及结果判定 |
| 4.2.4 荧光免疫层析试纸方法的优化 |
| 4.2.5 荧光免疫层析试纸的评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗原标记量的确定 |
| 4.3.2 抗体包被量的确定 |
| 4.3.3 最佳检测时间的确定 |
| 4.3.4 试纸条线性标准曲线的建立 |
| 4.3.5 荧光免疫层析试纸的敏感性 |
| 4.3.6 荧光免疫层析试纸的特异性 |
| 4.3.7 荧光免疫层析试纸的重复性 |
| 4.3.8 临床样本检测结果 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 论文中提出的新方法和新思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（2）新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新孢子虫病研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状和病理变化 |
| 4 诊断 |
| 5 防治 |
| 第二章 新孢子虫入侵机制 |
| 1 入侵过程 |
| 2 入侵相关蛋白 |
| 2.1 微线蛋白 |
| 2.2 棒状体蛋白 |
| 2.3 致密颗粒蛋白 |
| 2.4 顶膜抗原-1 |
| 2.5 棒状体颈部蛋白-2 |
| 3 入侵机制的验证 |
| 3.1 黏附入侵阻断的应用 |
| 3.2 入侵相关蛋白的免疫保护作用 |
| 第三章 蛋白质相互作用研究技术进展 |
| 1 GST-Pull down |
| 2 双分子荧光互补 |
| 3 亚细胞共定位 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新孢子虫NcAMA1与NcRON2 相互作用的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 NcAMA1与NcRON2 相互作用的GST-Pull down鉴定 |
| 1.2 NcAMA1与NcRON2 相互作用的双分子荧光互补鉴定 |
| 1.3 新孢子虫AMA1与RON2 蛋白的亚细胞定位 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nc AMA1与Nc RON2 相互作用的GST-Pull down鉴定 |
| 2.2 Nc AMA1与Nc RON2 相互作用的双分子荧光互补鉴定 |
| 2.3 新孢子虫AMA1与RON2 蛋白的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 Nc AMA1与Nc RON2 黏附入侵阻断试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株与细胞 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 入侵试验 |
| 1.5 胞内增殖试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 入侵试验 |
| 2.2 增殖试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Nc AMA1与Nc RON2 对小鼠的免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株与细胞 |
| 1.2 实验动物与实验动物伦理 |
| 1.3 主要试剂和材料 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 小鼠的抗体和细胞因子水平分析 |
| 1.6 小鼠存活率分析 |
| 1.7 小鼠组织病理变化分析 |
| 1.8 荧光定量检测 |
| 1.9 ELISA检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠的抗体和细胞因子水平 |
| 2.2 小鼠存活率试验 |
| 2.3 小鼠病理组织变化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 NcAMA1与NcRON2 混合免疫对山羊的保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株与细胞 |
| 1.2 实验动物与实验动物伦理 |
| 1.3 主要试剂和材料 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 山羊的抗体和细胞因子水平分析 |
| 1.6 山羊组织病理变化分析 |
| 1.7 荧光定量检测 |
| 1.8 ELISA检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 山羊的抗体和细胞因子水平 |
| 2.2 山羊病理组织变化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）豆状囊尾蚴外泌体的特征及其对巨噬细胞极化的调节机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 豆状囊尾蚴及豆状囊尾蚴病概述 |
| 1.1.1 豆状囊尾蚴 |
| 1.1.2 豆状囊尾蚴病 |
| 1.2 外泌体的生物学特征 |
| 1.2.1 外泌体组成 |
| 1.2.2 外泌体的发现 |
| 1.2.3 外泌体的形成 |
| 1.2.4 外泌体的纯化与鉴定 |
| 1.2.5 外泌体的功能 |
| 1.3 寄生虫外泌体及其免疫调节作用研究进展 |
| 1.3.1 原虫外泌体 |
| 1.3.2 寄生性蠕虫的外泌体 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 豆状囊尾蚴外泌体的分离鉴定及其对巨噬细胞的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、虫种与实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.1.3 动物模型的建立及囊尾蚴的收集 |
| 2.1.4 囊尾蚴分泌排泄产物的收集及外泌体的分离 |
| 2.1.5 外泌体的透射电镜观察 |
| 2.1.6 外泌体的纳米粒径追踪分析 |
| 2.1.7 细胞增殖实验 |
| 2.1.8 总NO检测 |
| 2.1.9 细胞因子检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 外泌体的鉴定 |
| 2.2.2 外泌体对RAW264.7细胞增殖的影响 |
| 2.2.3 外泌体对RAW264.7细胞NO生成的影响 |
| 2.2.4 外泌体对RAW264.7细胞表性相关分子转录的影响 |
| 2.2.5 外泌体对RAW264.7细胞细胞因子表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 豆状囊尾蚴外泌体对家兔免疫应答的调节作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 3.1.3 家兔的免疫 |
| 3.1.4 家兔血清抗体(IgG)水平检测 |
| 3.1.5 家兔血清细胞因子水平的检测 |
| 3.1.6 家兔的攻虫感染和减虫率分析 |
| 3.1.7 数据处理与分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 免疫家兔血清特异性抗体水平检测 |
| 3.2.2 免疫家兔血清细胞因子水平的检测 |
| 3.2.3 免疫家兔的减虫率 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 豆状囊尾蚴外泌体蛋白及miRNAs的分析与鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.1.3 豆状囊尾蚴外泌体的蛋白质谱分析 |
| 4.1.4 Western blot分析外泌体中的蛋白质 |
| 4.1.5 豆状囊尾蚴外泌体小RNA高通量测序 |
| 4.1.6 q PCR分析miRNAs测序结果 |
| 4.1.7 外泌体miRNAs的靶基因及其功能预测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 豆状囊尾蚴外泌体蛋白质分析 |
| 4.2.2 外泌体蛋白的Western blot验证 |
| 4.2.3 小RNA测序数据分析 |
| 4.2.4 mi RNA测序数据的q PCR验证 |
| 4.2.5 外泌体miRNA靶基因的功能预测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 豆状囊尾蚴外泌体let-7-5p对巨噬细胞极化的调节机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 let-7-5p表达对RAW264.7 表型的影响 |
| 5.1.4 let-7-5p靶基因的确定 |
| 5.1.5 双荧光素酶报告系统验证let-7-5p的靶基因 |
| 5.1.6 C/EBPδ的敲低对巨噬细胞表型的影响 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 let-7-5p的过表达和敲低对巨噬细胞极化的调节 |
| 5.2.2 let-7-5p的序列保守性分析 |
| 5.2.3 let-7-5p的靶基因预测 |
| 5.2.4 let-7-5p的过表达和敲低对转录因子C/EBPδ 的影响 |
| 5.2.5 let-7-5p靶基因C/EBPδ的3′UTR扩增 |
| 5.2.6 重组质粒pmir GLO-C/EBPδ-WT/Mut的构建 |
| 5.2.7 荧光素酶活性检测 |
| 5.2.8 C/EBPδ敲低对巨噬细胞表型的调节 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）猫弓形虫感染ELISA和胶体金试纸检测方法建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 弓形虫病诊断方法研究进展 |
| 1.1 病原学诊断 |
| 1.2 免疫学诊断方法 |
| 1.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.4 防治措施 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 弓形虫SAG3抗原的制备及纯化 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 重组蛋白SAG3诱导表达 |
| 1.2.2 SAG3重组蛋白的纯化 |
| 1.2.3 SAG3重组蛋白的透析与复性 |
| 1.2.4 SAG3重组蛋白浓缩 |
| 1.2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 SAG3重组蛋白的纯化 |
| 1.3.2 SAG3重组蛋白的透析与复性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 猫弓形虫感染间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 间接ELISA反应步骤 |
| 2.1.4 猫弓形虫SAG3蛋白间接ELISA方法条件的建立 |
| 2.1.5 间接ELISA阴性和阳性判断标准确定 |
| 2.1.6 敏感性试验 |
| 2.1.7 特异性试验 |
| 2.1.8 重复性试验 |
| 2.1.9 样品检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 抗原及血清稀释度 |
| 2.2.2 最佳封闭剂 |
| 2.2.3 HRP标记的山羊抗猫IgG工作浓度确定 |
| 2.2.4 HRP标记的山羊抗猫IgG最佳孵育时间的确定 |
| 2.2.5 底物反应时间的确定 |
| 2.2.6 临界值的判断 |
| 2.2.7 敏感性试验 |
| 2.2.8 特异性试验 |
| 2.2.9 重复性试验 |
| 2.2.10 样品检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 猫弓形虫病感染Dot-ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 血清最佳稀释倍数的确定 |
| 3.2.3 HRP标记的山羊抗猫IgG最佳工作浓度的确定 |
| 3.2.4 包被抗原最佳工作浓度的确定 |
| 3.2.5 敏感性试验 |
| 3.2.6 特异性试验 |
| 3.2.7 重复性试验 |
| 3.2.8 样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 猫弓形虫感染免疫胶体金试纸条的研制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 胶体金溶液的烧制 |
| 4.2.2 胶体金颗粒的鉴定 |
| 4.2.3 胶体金最佳PH的确定 |
| 4.2.4 最佳抗体标记量的确定 |
| 4.2.5 金标抗体的制备 |
| 4.2.6 标记后胶体金颗粒鉴定 |
| 4.2.7 样品垫的处理 |
| 4.2.8 试纸条的组装 |
| 4.2.9 试纸条最佳反应条件的确定 |
| 4.2.10 试纸条性能试验 |
| 4.2.11 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 胶体金溶液的烧制 |
| 4.3.2 透射电镜鉴定 |
| 4.3.3 胶体金最佳pH的确定 |
| 4.3.4 最佳抗体标记量的确定 |
| 4.3.5 硝酸纤维素（NC）膜的选择 |
| 4.3.6 检测线(T)包被浓度的确定 |
| 4.3.7 质控线(C)包被浓度的确定 |
| 4.3.8 特异性试验 |
| 4.3.9 敏感性试验 |
| 4.3.10 重复性试验 |
| 4.3.11 保存期试验 |
| 4.3.12 临床样品检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）弓形虫抗体sGRA8-ELISA检测方法的标准化及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 弓形虫及弓形虫病 |
| 1 弓形虫简介 |
| 1.1 弓形虫病原学与生活史 |
| 1.2 弓形虫对环境的抵抗力 |
| 2 弓形虫病 |
| 2.1 毒力及致病性 |
| 2.2 感染途径及防治 |
| 2.3 动物的弓形虫病 |
| 参考文献 |
| 第二章 弓形虫病免疫及其诊断技术 |
| 1 弓形虫免疫 |
| 1.1 先天性免疫 |
| 1.2 获得性免疫 |
| 1.3 弓形虫的抗原性 |
| 2 弓形虫病诊断技术 |
| 2.1 染色试验 |
| 2.2 凝集试验 |
| 2.3 免疫胶体金技术 |
| 2.4 酶免疫技术 |
| 2.5 免疫印迹技术 |
| 2.6 放射免疫标记技术 |
| 2.7 免疫荧光技术 |
| 2.8 抗体亲和力试验 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 大鼠弓形虫抗体sGRA8-ELISA检测方法的标准化与应用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 虫株及菌种 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要酶及溶液、试剂 |
| 1.5 主要耗材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 sGRA8可溶性抗原的制备 |
| 2.2 血清的采集 |
| 2.3 PCR验证大鼠感染 |
| 2.4 大鼠弓形虫病sGRA8-ELISA方法建立 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 保存期试验 |
| 2.7 多克隆抗体效价检测 |
| 2.8 敏感性试验 |
| 2.9 与商品化试剂盒检测结果比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 sGRA8重组抗原的表达与纯化 |
| 3.2 PCR验证大鼠感染 |
| 3.3 大鼠弓形虫病sGRA8-ELISA方法建立 |
| 3.4 重复性试验 |
| 3.5 保存期试验 |
| 3.6 多克隆抗体效价检测 |
| 3.7 敏感性试验 |
| 3.8 与商品化试剂盒检测结果比较 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 sGRA8-ELISA检测方法在猪、牛、羊弓形虫感染检测中的应用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 动物血清 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要酶及溶液、试剂 |
| 1.4 主要耗材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 sGRA8抗原的制备与纯化 |
| 2.2 sGRA8-ELISA方法对猪弓形虫感染的检测 |
| 2.3 sGRA8-ELISA方法对牛弓形虫感染的检测 |
| 2.4 sGRA8-ELISA方法对羊弓形虫感染的检测 |
| 2.5 与商品化试剂盒检测结果比较 |
| 2.6 多个地区猪弓形虫感染情况调查 |
| 3 结果 |
| 3.1 sGRA8-ELISA方法对猪弓形虫感染的检测 |
| 3.2 sGRA8-ELISA方法对牛弓形虫感染的检测 |
| 3.3 sGRA8-ELISA方法对羊弓形虫感染的检测 |
| 3.4 与商品化试剂盒检测结果比较 |
| 3.5 多个地区猪弓形虫感染情况调查 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 sGRA8-ELISA检测方法在人弓形虫感染检测中的应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 sGRA8-ELISA方法对人弓形虫感染的检测 |
| 2.2 与商品化试剂盒检测结果比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫病的研究进展 |
| 1.2 弓形虫相关蛋白质的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 犬弓形虫感染间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 犬弓形虫感染胶体金试纸条的研制 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 常用缩略语中英文对照表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（7）猪弓形虫感染ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 弓形虫诊断研究进展 |
| 1 弓形虫病诊断方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 弓形虫表面抗原SAG3基因的原核表达与鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 弓形虫SAG3蛋白抗体检测ELISA方法的建立与初步应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 双抗夹心ELISA检测猪弓形虫血清循环抗原方法的建立与初步应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 猪弓形虫病免疫胶体金快速检测试纸条的研制及初步应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）新孢子虫病检测方法的建立及三种动物新孢子虫病流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 新孢子虫研究进展 |
| 1 新孢子虫的形态 |
| 2 新孢子虫的感染机制 |
| 3 新孢子虫的传播方式 |
| 4 新孢子虫的宿主 |
| 5 新孢子虫的种类及虫株 |
| 6 新孢子虫病的临床症状 |
| 7 流行情况 |
| 7.1 国内流行情况调查 |
| 7.2 国外流行情况 |
| 8 新孢子虫检测方法研究进展 |
| 8.1 病原学检测 |
| 8.2 血清学诊断 |
| 8.3 分子生物学诊断 |
| 9 新孢子虫疫苗研究进展 |
| 第一章 新孢子虫PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 新孢子虫培养 |
| 2.2 新孢子虫DNA提取的结果 |
| 2.3 重组质粒PCR鉴定 |
| 2.4 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.5 重组质粒测序鉴定 |
| 2.6 PCR反应条件优化 |
| 2.7 PCR敏感性检测 |
| 2.8 PCR特异性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 新孢子虫荧光PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 荧光PCR退火温度优化 |
| 2.2 荧光PCR反应体系的优化 |
| 2.3 荧光PCR敏感性检测 |
| 2.4 荧光PCR特异性检测 |
| 2.5 荧光PCR稳定性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 新孢子虫LAMP检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.2 重组质粒测序鉴定 |
| 2.3 LAMP反应温度优化 |
| 2.4 LAMP方法特异性检测 |
| 2.5 LAMP方法敏感性检测 |
| 2.6 LAMP方法重复性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 动物新孢子虫流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 新孢子虫ELISA检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 吉林地区新孢子虫分离株NcSRS2基因序列同源性比较 |
| 2.2 NcSRS2基因遗产进化分析 |
| 2.3 新孢子虫cELISA检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新孢子虫病研究进展 |
| 1.1 分类地位 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 新孢子虫病的传播 |
| 1.4 临床症状及病理变化 |
| 1.5 新孢子虫病的诊断 |
| 1.6 新孢子虫病的流行病学 |
| 1.7 新孢子虫病的防治 |
| 第2章 几种主要原虫诊断抗原及相关检测方法的研究进展 |
| 2.1. 虫体相关抗原 |
| 2.2. 分泌类抗原 |
| 2.3. 重组多表位抗原 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 新孢子虫MIC6蛋白抗原定位 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 梅花鹿人工感染犬新孢子虫的试验 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心DoT-ELISA检测方法的建立及应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）酶联免疫法与间接血凝法检测实验动物家兔弓形虫抗体的结果比较（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 阳性血清 |
| 1.2 阴性血清 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.5.1 IHA试验操作步骤 |
| 1.5.2 ELISA试验操作步骤 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 IHA检测结果 |
| 2.2 ELISA检测结果 |
| 2.3 两种方法的检测结果的比较 |
| 2.3.1 ELISA和IHA平行检测的结果 |
| 2.3.2 两种检测方法的敏感性、特异性、检测效率及Youden指数 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
四、应用PPA—ELISA检测实验家兔弓形虫抗体的研究（论文参考文献）
- [1]猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸检测方法建立及初步应用[D]. 张宁. 长春工业大学, 2021(01)
- [2]新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究[D]. 方旭. 吉林大学, 2020
- [3]豆状囊尾蚴外泌体的特征及其对巨噬细胞极化的调节机制[D]. 王立群. 中国农业科学院, 2020
- [4]猫弓形虫感染ELISA和胶体金试纸检测方法建立与初步应用[D]. 刘维建. 吉林大学, 2017(10)
- [5]弓形虫抗体sGRA8-ELISA检测方法的标准化及其应用[D]. 韩登阁. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立[D]. 宋慧琦. 天津农学院, 2016(10)
- [7]猪弓形虫感染ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立与初步应用[D]. 寇金华. 吉林大学, 2016(09)
- [8]新孢子虫病检测方法的建立及三种动物新孢子虫病流行病学调查[D]. 王雪. 吉林农业大学, 2016(03)
- [9]梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用[D]. 田来明. 吉林大学, 2015(08)
- [10]酶联免疫法与间接血凝法检测实验动物家兔弓形虫抗体的结果比较[J]. 潘严,李彩云,陈啸天,张超,潘学营. 中国医药科学, 2014(17)