一、应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液获取高纯度基底细胞（论文文献综述）
王金阳[1]（2020）在《小鼠和人Leg1的结构和功能探究》文中进行了进一步梳理家畜的健康生长以及饲料营养的充分消化吸收和利用是提高家畜生产效率的关键之一。唾液腺可以分泌多种类型的生长因子、消化酶以及消化辅助因子,同时,利用转基因技术可以在唾液腺中表达有助于动物生长和营养消化的目的蛋白,因此,研究唾液腺蛋白的表达调控和功能有望应用于畜牧生产。Leg1（Liver-enriched gene 1）是一个在多种脊椎动物间保守存在的分泌蛋白。本实验室之前的研究率先对小鼠中的Leg1蛋白（MLEG1）展开研究。我们发现,在小鼠中的MLEG1可能是一种新的脂肪代谢调节因子,它在唾液腺表达并分泌到唾液中,能够耐受胃液和肠液等消化液的降解进入血液循环到达肝脏并对肝脏的功能进行调控,主要对一些脂肪合成转录因子的表达进行调节。然而,目前关于Leg1蛋白的转录后修饰、结构和功能域等研究甚少,对人体内的Leg1蛋白（HLEG1）研究尚处空白,这给我们对研究Leg1的功能研究和应用带来了极大挑战。本论文在小鼠中MLEG1的功能研究基础上对小鼠和人中Leg1蛋白开展进一步研究。首先我们对小鼠中MLEG1的化学修饰及修饰与功能的关系进行了研究,其次我们使用冷冻电镜手段对MLEG1的蛋白结构进行了探索,最后我们探究了人中HLEG1的表达,HLEG1的修饰及HLEG1蛋白与人类健康可能存在的关系。本论文研究发现MLEG1在第171、196和257三个天冬酰胺位点有N-糖基化修饰,在119、123两个丝氨酸位点有O糖基化修饰,两种糖基化修饰互相影响。我们还发现在第117位天冬酰胺上存在一种未知的化学修饰,这种化学修饰依赖于第119位丝氨酸而存在,且能被糖苷酶PNGaseF识别切割。此外,我们通过冷冻电镜手段初步分析了带有糖基化修饰的MLEG1蛋白结构,为确认结构与功能的关系奠定了基础。本论文也开展了人中HLEG1的修饰与功能研究,共收集了 621例人类唾液样品测定其中HLEG1丰度,分析唾液样品中HLEG1丰度与多种生理指标的关联性,试图从唾液中开发一种新的标记因子对人体健康进行监控。我们的研究结果有助于今后揭示人唾液蛋白HLEG1的功能及其潜在的信号传导途径。综上所述,本论文对Leg1在小鼠和人中的化学修饰和功能进行了深度扩展,确认了两者的糖基化修饰,展开了 MLEG1蛋白的冷冻电镜研究,开启了在人唾液中HLEG1丰度作为新标记因子的研究,为以后MLEG1与HLEG1功能的研究打下坚实基础。此外,鉴于leg1基因在唾液腺相对特异高表达的特性,在家畜育种过程中可以根据生产需求利用leg1基因的启动子构建唾液特异性表达目的基因的转基因动物,这可能有助于我们对农业动物进行种质改良,进而达到提高生产效率,降低环境污染等目的。
卢昂[2]（2020）在《SIPA1调控乳腺癌细胞EMT和自噬的机制研究及乳腺癌细胞AFAM成像》文中指出肿瘤细胞转移是造成乳腺癌病人死亡的主要原因。研究发现由于胞间连接分子E-Cadherin、vimentin等蛋白表达改变导致肿瘤细胞发生上皮细胞状态向间质细胞状态转化,即EMT（epithelial-mesenchymal transition）,进而导致肿瘤细胞转移。EMT相关蛋白表达的调控机制仍然是肿瘤转移研究的关键点。SIPA1分子（signal-induced proliferation-associated protein 1）是Rap GAP蛋白家族的主要成员,已有研究发现SIPA1分子能够调节乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、膀胱癌细胞粘附、浸润和转移。前期研究发现Sipa1基因启动子区域Cp G岛甲基化水平与其基因的转录和翻译在肿瘤细胞中存在负相关性。Sipa1基因的甲基化水平是否调控癌细胞的转移呢?是通过什么机制导致癌细胞转移呢?本论文使用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-Cd R处理SIPA1蛋白低表达的乳腺癌细胞MCF7发现Sipa1基因启动子区甲基化状态由高变低,Western Blotting检测发现SIPA1蛋白表达逐渐升高且对5-Aza-Cd R呈现浓度依赖性关系。进一步检测发现SIPA1蛋白表达被上调的同时,vimentin表达上升,E-cadherin表达下降,诱导MCF7细胞EMT发生,进而促进MCF7细胞迁移能力增强。在BT549中敲低SIPA1蛋白表达后,vimentin表达下降,E-Cadherin表达上升,抑制了BT549细胞EMT发生,迁移能力也显着降低。通过荧光定量PCR实验发现SIPA1蛋白可能通过上调EMT相关转录因子TGFB1（transforming growth factor beta 1）和ZEB1（zinc finger E-box binding homeobox 1）的转录,引发EMT发生,进而促进乳腺癌细胞发生迁移。为了研究乳腺癌细胞更多的迁移机制,本论文进一步研究发现在四种肿瘤细胞中发现自噬标志分子MAP1LC3B（microtubule associated protein 1 light chain 3β）蛋白的表达明显不同,且与SIPA1蛋白表达之间存在正相关性。在MDA-MB-231细胞中敲低SIPA1蛋白表达后,总MAP1LC3B蛋白表达水平降低;恢复SIPA1蛋白高表达,总MAP1LC3B蛋白表达水平随之增高。在MCF7细胞中过表达SIPA1蛋白后,总MAP1LC3B蛋白表达水平增加。进一步研究发现SIPA1蛋白可以调控乳腺癌细胞自噬小体的形成。通过蛋白质免疫共沉淀以及双荧光素酶基因报告实验,发现SIPA1蛋白可以结合MAP1LC3B基因启动子,并显着激活MAP1LC3B基因启动子活性;SIPA1蛋白被敲低可以抑制MAP1LC3B基因的启动子活性。自噬抑制剂CQ（Chloroquine）处理可以抑制MDA-MB-231细胞自噬,且在体外和斑马鱼体内的迁移能力明显减弱。细胞在迁移过程中伴随形态变化,本论文采用原子力超声扫描探针显微镜（atomic force acoustic microscopy,AFAM）对MDA-MB-231细胞和MCF7细胞形态及其亚细胞结构特征进行了成像和分析。首先优化了AFAM细胞成像样品的制备过程,解决了细胞在成像过程中表面结晶的问题;其次,在对MDA-MB-231细胞成像的过程中,优化了AFAM在细胞成像中的探针扫描频率、超声振幅和超声频率,获取了更加清晰的MDA-MB-231细胞图像;通过软件CSPM Imager对MDA-MB-231和MCF7细胞的形貌和超声相位图像进行三维重构,发现MDA-MB-231细胞和MCF7细胞表面存在凹陷凸起形态特征差异。本论文主要针对乳腺癌细胞迁移的分子调节机制及癌细胞形貌和亚结构特征进行研究。首先发现Sipa1基因低甲基化可以上调SIPA1蛋白表达,进而诱导EMT的发生,促进乳腺癌细胞发生迁移;其次发现SIPA1蛋白可以通过结合到MAP1LC3B基因启动子区域,促进其表达来增加细胞自噬进而诱导乳腺癌细胞迁移;最后通过AFAM对乳腺癌细胞超声显微成像及软件CSPM Imager的三维重构,发现MDA-MB-231细胞和MCF7细胞表面有很多凹陷凸起形貌特征。这些研究为深入揭示乳腺癌细胞转移机制,研发肿瘤转移抑制药物提供理论支撑,也为细胞成像提供了新方法。
王志利[3]（2019）在《基于抗粘附纳米界面的循环肿瘤细胞的高效捕获与纯化》文中研究表明循环肿瘤细胞（CTCs）检测被认为是一种极具发展前景的癌症液体活检技术。然而,血液中的CTCs数量非常稀少,并且存在异质性,使得从血液样品中高效捕获高纯度、高活性的CTCs成为一项极具挑战性的任务。纳米结构基底的引入提高了 CTCs的捕获效率,然而也增加了对血液中白细胞的捕获,白细胞对于CTCs的鉴定、分析和应用具有严重的干扰,因此对于CTCs的研究首先需要建立能够高效高纯度、高活性捕获CTCs的平台。基于上述目的,本论文的研究内容尝试从“材料选择、界面构筑、分子设计、释放策略”等方面进行设计,构建了包括纳米纤维@水凝胶基底、抗粘附纳米水凝胶基底、温敏纳米纤维基底、水凝胶@磁纳米颗粒基底及荧光双抗体磁纳米颗粒基底在内的几种CTCs捕获与纯化平台,并详细研究了其抗粘附、特异性、灵敏度等相关性能,主要内容包括以下五个部分:1.通过自由基聚合反应在玻璃片表面修饰一层聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯（PCBMA）水凝胶,该水凝胶层既可以起到抗粘附作用提高CTCs的捕获纯度,又提供了一个类似于细胞外基质的柔软界面。为提高捕获效率,通过静电纺丝技术在水凝胶表面电纺一层壳聚糖纳米纤维使捕获基底具有纳米结构,最后引入上皮粘附分子（EpCAM）抗体作为亲和捕获分子用于特异性捕获EpCAM高表达的CTCs。该基底通过亲和捕获分子、纳米结构和水凝胶抗粘附的协同作用完成了CTCs的高纯度高效捕获。2.上述捕获基底,虽然对CTCs捕获有较好的捕获效率和特异性,然而其基底制备过程复杂繁琐,因此在上一个工作的基础上,期望构建一种制备简单、经济的捕获基底。在该工作中,以甲基丙烯酸磺酸甜菜碱（SBMA）和甲基丙烯酸（MAA）为单体,N’N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）为交联剂,通过回流沉淀聚合方法制备水凝胶纳米球,将其修饰到玻片表面构建了水凝胶纳米结构基底,引入EpCAM抗体作为亲和捕获分子。该基底本身具有良好的抗粘附性能,无需进一步修饰抗粘附分子,简化了实验过程。最后进行了临床病人血样检测,4例癌症患者1 mL血液中检测到1-32个CTCs,而作为对照的5例健康血样中均未检测到CTCs。3.对于CTCs的纯度,可以通过其特异性释放进一步提高,且CTCs的释放对于CTCs的后续研究同样具有重要的意义,因此在该工作中,利用静电纺丝技术制备了壳聚糖纳米纤维基底,通过原子转移自由基聚合方法（ATRP）将N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和MAA修饰在纳米纤维表面,最后引入EpCAM适配体。利用PNIPAM的构象改变过程清除基底上的非特异性吸附的血细胞,使捕获的CTCs得到纯化。此外,通过互补序列（CS）高效的与适配体杂交实现捕获的CTCs无损释放,由于细胞释放过程是特异性作用,这使得释放的CTCs进一步得到纯化。4.由于纳米结构基底捕获方式的局限性,可能导致其在临床样本应用中捕获灵敏度的降低。不同于纳米结构基底的捕获方式,磁性纳米颗粒分离细胞属于均相溶液法,可以促进磁纳米颗粒与CTCs的接触,从而提高CTCs在血液样本中的检测灵敏度和捕获效率。基于上述研究结果,将甜菜碱类两性离子化合物引入磁纳米颗粒表面用于减少磁纳米颗粒对非特异性细胞的吸附。在该工作中,以SBMA和MAA作为单体,以含有双硫键的N,N-双（丙稀酰）胱胺（BACy）为交联剂,通过回流沉淀聚合方法在磁纳米颗粒表面形成水凝胶壳。通过利用水凝胶层和EpCAM抗体的协同作用,一方面降低血细胞的粘附提高靶细胞的捕获纯度,另一方面通过谷胱甘肽降解水凝胶层清除捕获细胞表面的磁珠,最终得到完整无损的CTCs。5.上述捕获基底使用的亲和分子是单一的EpCAM抗体,然而在CTCs的研究中发现CTCs会经历间充质转化,转化后的部分CTCs膜表面EpCAM表达降低或者消失,因此单一抗体的使用造成对这部分细胞检测的损失。而转化后的CTCs可能是肿瘤转移的关键,对于这部分细胞的捕获具有重要的意义。因此基于上述工作的基础和对转化后CTCs捕获的需求,在该工作中,利用Stober方法在磁珠表面包裹二氧化硅层,同时包埋DiI染料,使磁珠带有荧光,然后接枝线性聚合物分子PCBMA。PCBMA不仅为EpCAM和神经型钙粘附蛋白（N-cadherin）两种抗体的修饰提供多位点,而且能够有效降低血细胞的粘附。N-cadherin是转化后CTCs主要表达的一种蛋白。利用两种抗体的协同作用,不仅能高效捕获EpCAM表达的CTCs,也能高效捕获间充质转化后EpCAM低表达或者不表达的CTCs。
张林[4]（2018）在《SiO2诱导的巨噬细胞外泌体miRNAs在肺成纤维细胞转分化中的作用》文中研究表明背景和目的尘肺病的发生发展是粉尘引起多细胞藉由信号传递而相互作用的调控过程,与巨噬细胞诱导的肺组织微环境炎性改变、肺成纤维细胞表型转分化密不可分。以往主要研究活性分子为信号介导的巨噬细胞和肺成纤维细胞间调控效应,但此类分子来源广泛,无法完全解释尘肺病发生机制。外泌体在细胞间信号传递中的作用日益受到重视,而外泌体miRNAs作为细胞间通讯的信号媒介具有良好的标识性、特异性和稳定性,且在以肺组织纤维化为主要病理改变的特发性肺纤维化疾病中也证实了其作用的存在,推测尘肺病过程中很可能存在巨噬细胞外泌体miRNAs介导的肺成纤维细胞信号传递和调控效应。本课题拟从细胞培养提取、鉴定外泌体入手,构建染尘巨噬细胞外泌体刺激肺成纤维细胞模型,结合人群流行病学调查,采用荧光标记、高通量测序、流式细胞术、透射电子显微镜等技术,系统观察巨噬细胞来源外泌体miRNAs的生物学特性及其在尘肺病发生发展中对肺成纤维细胞通讯的参与程度、活性效应、调控路径,阐释其对肺成纤维细胞转分化及肺组织纤维化等过程的影响,扩展对尘肺病发生发展机制的认识,发现尘肺病新型潜在生物标志和靶点,为进一步研制尘肺病监测与早期发现的有效指标及干预措施提供了新的思路和参考依据。材料和方法1.染尘巨噬细胞外泌体提取、鉴定及其对肺成纤维细胞转分化影响观察采用系列浓度SiO2粉尘分别刺激巨噬细胞,观察细胞形态,检测细胞活性,确定染尘浓度。收集细胞培养上清,以试剂盒法、超速离心法等分别提取外泌体,比较不同方法外泌体获取率差异;以透射电子显微镜、纳米追踪分析（Nanosight tracking analysis,NTA）、Western Blot等技术观察并鉴定外泌体。提取BABL/c小鼠原代肺成纤维细胞,以胰酶消化法传至第四代,观察并记录细胞生长状况,检测各代肺成纤维细胞转分化。以红绿荧光探针分别标记肺成纤维细胞和巨噬细胞外泌体,共孵育后观察外泌体分布并检测肺成纤维细胞转分化。2.尘肺相关巨噬细胞外泌体miRNAs筛选和生物信息学功能预测以尘肺病患者54例为病例组,煤工尘作业岗前体检人员100例为对照组,记录基线资料,收集血清,提取外泌体。取人源、鼠源外泌体,提取总RNA,构建miRNAs文库,比对miRNAs序列,筛选差异表达miRNAs,并以≤2碱基误配标准确定保守序列。采用miRanda数据库预测miRNAs靶基因,GO、KEGG数据库对miRNAs及其靶基因进行功能注释,筛选肺成纤维细胞表型转分化相关基因及信号通路。3.miR-107-3p对肺成纤维细胞转分化的作用和机制以SiO2粉尘刺激巨噬细胞,收集细胞培养上清,提取外泌体,透射电子显微镜观察并鉴定外泌体形态。以染尘巨噬细胞外泌体、miR-107-3p mimic/inhibitor分别干预肺成纤维细胞,检测细胞活性,观察并定量α-SMA水平,流式细胞术检测肺成纤维细胞表型转分化,Western Blot检测TGF-β信号通路相关蛋白Chordin、BMP-2、Smad-1、Smad-5、Smad-9、Id-1表达水平。4.统计学分析采用Microsoft Excel 2016软件包汇总数据并构建数据库,SAS 9.4软件包对数据进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差表示,两组样本间差异的比较采用t检验（正态资料）或秩和检验（非正态）,三组及以上样本间差异的比较采用方差分析,计数资料的比较采用卡方检验,检验水准α=0.05。结果1.染尘巨噬细胞外泌体提取、鉴定及其对肺成纤维细胞转分化影响观察1.1 SiO2粉尘刺激对巨噬细胞活性及形态的影响SiO2染尘后,巨噬细胞聚团成簇生长,形态正常;100μg/ml SiO2染尘组细胞融合度90%,部分细胞肿胀变形甚至崩解。0～80μg/ml组活细胞比例100%、79%、82%、74%,组间差异无统计学意义（P>0.05）,但均较100μg/ml组（62%）高（P<0.05）。因此,该浓度可作为巨噬细胞活性下调临界浓度用于后续研究。1.2外泌体的提取、纯化、鉴定及SiO2染尘对其分泌水平的影响经外泌体表面特异性蛋白检测,试剂盒法、超速离心法及滤过超速离心法均可提取巨噬细胞外泌体;透射电子显微镜图像显示,试剂盒法及超速离心法外泌体形态结构不清,滤过超速离心法可见外泌体脂质双分子层结构。经Nanosight外泌体粒径分析及BCA总蛋白定量,SiO2粉尘刺激前后单细胞外泌体产量分别为1.58×102和8.27×102,呈上升趋势（P<0.05）。1.3原代肺成纤维细胞的提取及传代对其转分化的影响以改良法提取小鼠原代肺成纤维细胞,第一代、第二代细胞形态完好,梭形明显;第三代细胞表面颗粒物增多,细胞间隙均一性差;第四代细胞体积增大、梭形消失。免疫荧光显微镜提示随细胞传代次数增加,细胞α-SMA红染面积扩大;流式细胞术提示P0-P3肺成纤维细胞转分化比例均低于35%,P4代显着提升达80%（P<0.05）,不具备后续研究价值。1.4巨噬细胞外泌体对肺成纤维细胞转分化的影响染尘巨噬细胞外泌体与肺成纤维细胞共孵育后,激光共聚焦显微镜下可见典型的红染肺成纤维细胞梭形轮廓,绿染的外泌体散布于整个视野,点状分布,并于肺成纤维细胞周围聚集,部分外泌体与细胞膜融合,呈现黄色斑点。流式细胞术提示染尘巨噬细胞外泌体干预的肺成纤维细胞转分化比例,较正常巨噬细胞外泌体及PBS对照组高（50.19±3.71 vs.5.90±1.45,50.19±3.71 vs.5.46±1.32,P<0.05）;免疫组化提示不同干预处理的肺成纤维细胞α-SMA、Vinculin和PTEN等蛋白表达水平与流式细胞术趋势一致。2.尘肺相关巨噬细胞外泌体miRNAs筛选和生物信息学功能预测2.1染尘巨噬细胞外泌体差异表达miRNAs筛选经基因测序,小鼠巨噬细胞培养上清外泌体共检测出miRNAs 994种,其中155条miRNAs表达上调,143条miRNAs表达下调。2.2尘肺病患者血清外泌体差异表达miRNAs筛选本研究共纳入尘肺病患者和健康对照154例,其中矽肺25例（壹期17例,贰期6例,叁期2例）、煤工尘肺29例（壹期20例,贰期6例,叁期3例）、健康岗前体检男性100例。经基因测序,人血清外泌体共检测出miRNAs 604种,其中155条miRNAs表达上调,120条miRNAs表达下调。2.3人源、鼠源高保守miRNAs序列比对、靶基因预测及功能注释经比对,小鼠高保守差异表达miRNAs共计14条,对应人miRNAs 12条,其中两者表达趋势一致miRNAs 7条,miR-126a-5p、miR-335-5p、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-30c-2-3p和miR-107-3p高表达,miR-27b-5p低表达。经miRanda数据库注释,小鼠14条差异表达高保守miRNAs对应靶基因数总计1111个,小鼠与人表达趋势一致的7条miRNAs对应靶基因数总计760个。GO、KEGG数据库功能注释显示,此类miRNAs参与生物学过程功能项187个、分子功能项39个、构成细胞组分38个,涵盖细胞分化、心血管系统发育、酶结合、神经系统发育等生物学过程。选取TGF-β信号通路探索肺成纤维细胞表型转分化机制,该信号通路对应靶基因分别为Chordin,Inhbe,Rock1,Smurf1,Sp1和Tgif2,参与调控其表达的miRNAs为miR-107-3p、miR-125a-5p、miR-30c-2-3p和miR-335-5p。3.miR-107-3p对肺成纤维细胞转分化的作用和机制3.1 miR-107-3p对肺成纤维细胞表型转分化作用观察以miR-107-3p mimic/inhibitor、染尘巨噬细胞外泌体分别干预肺成纤维细胞,mimic组与外泌体组细胞体积增大、部分细胞梭形消失;inhibitor组细胞形态规则,数量增多,与正常对照组相似。细胞活性检测结果显示inhibitor组较正常对照组高（176.13±59.58 vs.97.88±8.08,P<0.05）,外泌体组和mimic组细胞活性均较对照组及inhibitor组低（P<0.05）,但前两组间差异无统计学意义（41.66±0.80 vs.38.45±4.12,P>0.05）。免疫荧光显微镜下可见inhibitor组肺成纤维细胞多以蓝染细胞核为主,而mimic组、外泌体组细胞细胞质红染;免疫组织化学显示mimic组及外泌体组高表达α-SMA,inhibitor组α-SMA表达水平与PBS对照组相似,差异无统计学意义（P>0.05）。3.2 miR-107-3p调控的TGF-β信号通路相关蛋白表达水平检测Chordin表达水平于inhibitor组最高,外泌体组及mimic组较PBS对照组下降（P<0.05）;Chordin下游基因BMP-2、Smad-1/5/9和Id检测结果显示,inhibitor组与对照组表达水平稍低,采用染尘巨噬细胞外泌体或mimic干预后其表达水平上调（P<0.05）。结论SiO2粉尘刺激能致巨噬细胞分泌外泌体数量增多且内含miRNAs谱发生改变,仅用提纯的外泌体即可诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。此调控作用可能与诱导的外泌体向肺成纤维细胞传递miR-107-3p,靶向抑制Chordin基因及其下游基因BMP-2、Smad-1/5/9、Id-1表达,进而激活TGF-β信号通路有关。
韦旭华[5]（2017）在《人毛囊神经嵴干细胞的分离、培养与初步鉴定》文中提出研究背景白癜风（Vitiligo）是色素障碍性疾病中最为常见的一种皮肤病,其发病机制不明,可能由于各种原因导致的基底层功能性黑素细胞破坏,使得皮肤、粘膜甚至毛发的色素减退和脱失。目前,全球约有0.5%1%的群体罹患此病。虽然白癜风的皮损无自觉症状,未给患者带来生理上的痛苦,但其心理健康和生活质量都备受影响。因此,探明白癜风的发病机制,寻求白癜风的治疗方法,具有重大的科学及社会意义。白癜风的发病机制主要包括脱色机制和复色机制两大方面,目前对白癜风发病机制的研究主要集中在脱色机制,对于同等重要的复色机制,却鲜见研究。因此,进一步探究白癜风的发病机制（包括脱色机制和复色机制）,寻找白癜风治疗的新方法将意义深远。通过临床疗效观察,发现白癜风在复色时,以毛囊周围复色的模式最为常见,因此,探究由毛囊周围引起复色及其机制更有意义。众所周知,毛囊（hair follicle,HF）是哺乳动物的重要皮肤附属器,其结构虽然微小,但作用巨大。毛囊不仅能够调节毛发的生长、脱落,而且是维持机体生物功能平衡的重要的动态微型器官。有研究发现,毛囊中存在不同发育来源的干细胞,包括毛囊干细胞（hair follicle-stem cell,HF-SC）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）、色素性干细胞、神经源性干细胞等等,且已有研究证实,毛囊干细胞在体外可高度增殖,并具有分化的潜能。毛囊中除了包含上述干细胞外,新近研究发现在毛囊隆突区还存在神经嵴干细胞（neuralcrest stem cells,NCSCs）,NCSCs是一种具有多能性分化潜能的祖细胞,其可以分化成为不同的细胞系。本课题将从干细胞生物学的角度,以人毛囊为研究对象,证实人毛囊中存在神经嵴干细胞,并通过原代培养,将神经嵴干细胞从毛囊中分离出来,为后续将其诱导分化成黑素细胞提供依据。目的1、本实验拟证实人毛囊中存在神经嵴干细胞。2、将人毛囊内的神经嵴干细胞分离出来,体外原代培养,并进行初步鉴定。材料及方法1、标本来源于郑州大学第一附属医院整形外科、皮肤科等手术中所获取的含毛囊的头皮组织,所取皮肤组织局部无器质性病变、无色素性疾病。2、标本采用PBS及Hank’s液进行冲洗,切成小组织块,浸入0.48 U/ml的中性蛋白酶在4℃中消化过夜,次日借助解剖显微,采用显微分离术获取单个毛囊。3、采用RT-PCR检测游离毛囊组织中SOX10、Nestin的m RNA的表达。4、将游离毛囊制成冰冻切片,连续横向切片,采用免疫荧光法检测毛囊组织中SOX10、Nestin的表达。5、在无菌环境下,消化分离含毛囊的皮肤组织,修剪多余的毛干部分,置于神经嵴干细胞培养基进行原代培养,观察细胞从毛囊隆突区游离的时间,随后取出毛囊组织,将游离出的细胞消化后采用免疫荧光法鉴定细胞中SOX10、Nestin的表达。结果1、RT-PCR结果显示,游离毛囊组织中SOX10、Nestin的m RNA呈阳性表达。2、免疫荧光染色显示,毛囊组织中段SOX10、Nestin呈阳性表达,SOX10在细胞核中表达,呈绿色荧光。Nestin在细胞浆中表达,呈红色荧光。3、毛囊在原代培养时,毛囊隆突区第23天有细胞成团迁出,第4天细胞增殖加快。迁出的细胞呈梭形、椭圆形,胞核饱满,类似于成纤维细胞,迁出的细胞免疫荧光染色SOX10和Nestin呈阳性表达。结论1、在m RNA和蛋白水平,人毛囊中存在SOX10和Nestin的阳性表达的神经嵴干细胞。2、体外原代培养时,人毛囊可迁出细胞,经初步鉴定迁出的细胞为神经嵴干细胞。
向萌娟[6]（2012）在《Wnt信号通路介导的基因调控毛囊干细胞定向分化的研究》文中提出背景和目的毛囊干细胞（Hair follicle stem cells，HFSCs）被选为种子细胞用于构建组织工程皮肤以修复临床烧伤、创伤、慢性溃疡等皮肤缺失已成为医学研究的热点。毛囊是皮肤的重要附属器官，从内向外依次由毛干、内根鞘和外根鞘组成。毛囊隆突部位于外根鞘近表皮端，皮脂腺下方竖毛肌附着处，此处的细胞体外培养时表现出干细胞的特性，即可自我复制、慢周期性和具有多向分化潜能。目前已经得到证实，隆突部的这一群特殊的细胞为毛囊干细胞。毛囊干细胞具有多向分化迁移能力，不仅能向上分化并迁移参与表皮更新和皮脂腺维持，而且能向下端毛球部分化并迁移参与形成毛囊。毛囊干细胞分化倾向的不同是由多种因素共同决定的，不仅有细胞内部分子及基因的调控，也有外来信号及微环境壁龛的协同作用，更有多条信号通路传导分化“命令”。在众多科研工作者的共同努力下发现，毛囊干细胞Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）在调控其增殖、分化中起到重要作用。Wnt/β-catenin信号通路在全身几乎所有的细胞中都存在，细胞受到刺激后释放Wnt蛋白，激活下游一系列大分子信号活性物质，最终导致基因表达改变，是诱导细胞分化和增殖的一条分子级联通路，在胚胎发育和肿瘤发生中，这条通路也起到关键性的作用。在HFSCs中，Wnt/β-catenin信号通路激活后会引起β-catenin在胞浆内的堆积，随之转入到细胞核中，与核内转录因子Tcf3/Lefl结合，激活下游靶基因c-myc、cyclin D1等的转录，促进毛囊干细胞定向分化。近年来有研究发现细胞外来干预因子氯化锂（LiCl）可抑制Wnt信号通路中β-catenin的降解，使之在细胞质中聚集，激活下游通路，影响毛囊干细胞分化的表型，但对于LiCl调节HFSCs分化的分子机制研究较少，且局限于在细胞质中作用的研究。本课题选用了氯化锂激活Wnt信号通路，探讨Wnt/β-catenin信号通路在人HFSCs向毛囊形成细胞或表皮细胞定向分化中的作用及与其他信号因子的相互关系，尤其是细胞核内的分子水平改变，以及药物控释系统的建立和在组织工程皮肤中的应用。方法1.头皮组织采用改进的毛囊隆突部获取方法及两步酶消化后，将带有隆突部的毛发剪成泥状，Ⅳ型胶原差速贴壁法获取毛囊干细胞。使用免疫荧光染色法对毛囊干细胞进行鉴定。以500个/孔（2.5×103/m1）、1000个/孔（5×103/m1）、2000个/孔（1×104/m1）、3000个/孔（1.5×104/m1）、5000个/孔（2.5×104/m1）接种于96孔培养板中，观察细胞生长情况，采用MTT法描绘其生长曲线，观察各密度培养的HFSCs在不同时间点的增殖效应，筛选出体外最佳的HFSCs传代培养密度。2.选用0、0.1、1、5、10、20、40、100mM/l的氯化锂诱导毛囊干细胞分化，观察毛囊干细胞的生存状态，确定氯化锂的毒性作用范围；选用0、5、10mM/l氯化锂作用于毛囊干细胞，MTT法对比分析各组对细胞增殖效应；LiCl终浓度分别为0、0.1、1、10、50、100、200、400μg/ml作用于毛囊干细胞，检测氯化锂的毒性，并探索促HFSCs分化的最佳LiCl浓度；采用real-time PCR技术定量检测0、5、10mmol/ml LiCl干预毛囊干细胞5d后Wnt信号通路中生物大分子：β-catenin、GSK-3β、Tcf3、c-myc和cyclin D1的mRNA水平，探讨LiCl诱导HFSCs分化过程中，LiCl的不同浓度对Wnt/β-catenin信号途径及其相关信号因子的表达的影响和相互作用。3.LiCl-PLGA纳米微球的制备：选用聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）作为微囊敷料，荷载适当浓度的氯化锂，采用复乳-溶剂挥发法制备载有氯化锂的纳米微囊。完全培养基培养人成纤维细胞，选用异体脱细胞真皮（ADM）为支架材料，以扩增培养的HFSCs为种子细胞接种于ADM表皮面，成纤维细胞接种于ADM真皮面，构建组织工程皮肤。采用5mM/l的LiCl干预构建的组织工程皮肤，培养5d后切片行HE染色、免疫荧光染色和免疫组织化学染色，观察种子细胞在ADM上的生长及分化情况，为动物实验奠定良好基础。结果1.从人头皮成功分离培养出HFSCs，在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能，当HFSCs接种密度为1x104ml时，细胞增殖速度最快，扩展能力强，其生长曲线呈典型的S型。2.随LiCl浓度升高，细胞增殖效应减弱。含有LiCl的K-SFM条件培养基中HFSCs形态改变明显，各组间有明显差别，LiCl>10mmol/L时分化比例高。LiCl诱导毛囊干细胞Wnt信号通路的同时还有其一定的细胞毒性，浓度大于200μg/ml（约5mmol/L）时明显抑制细胞生长。实验研究发现在HFSCs分化过程中，LiCl可激活Wnt/β-catenin信号通路，当浓度为5mM/l时促使β-catenin及其拮抗物GSK3β、核内转录因子Tcf3、下游基因c-myc、cyclin D1的转录上调，浓度为10mM/l时除cyclin D1转录仍上调外，其余基因转录下调。3.扫描电镜观察细胞在PLGA-ADM材料上生长良好，分泌的胞外基质丰富，并随时间进展，细胞逐渐融合，细胞外基质分泌逐渐增多。HE染色观察发现HFSCs生长状态良好，单层排列分布于ADM表皮面上，LiCl干预组表皮面有毛囊样小凹形成，成纤维细胞与ADM真皮面贴附紧密，能分泌胞外基质形成连续细胞层包绕ADM。结论1.我们改进的培养方法能简便快捷的获取人HFSCs，且得到的人HFSCs在体外有较强的增殖及传代能力，1×104/ml接种密度是促进HFSCs增殖的最佳密度。2.LiCl促HFSCs分化明显，对HFSCs的干预有临界毒性浓度，当浓度大于200μg/ml时，细胞生长增殖受到明显抑制，同时这一浓度也是促HFSCs分化的最佳浓度。LiCl促HFSCs分化作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路、通路下游各因子转录上调相关，Tcf3在维持细胞未分化状态中发挥了一定的作用，cyclinD1的转录与氯化锂浓度作用呈正相关，在HFSCs的分化中起到重要作用。3.复乳-溶剂挥发法能快速高效的制备出载有LiCl的纳米微囊，其PLGA材料具有良好的细胞相容性，人HFSCs能在其上较好的粘附和生长。构建载有人HFSCs的组织工程皮肤，在LiCl诱导下能够促使种子细胞发生分子学改变形成毛囊样小凹，使构建带有皮肤附属器的组织工程替代物成为可能。
杨任欢[7]（2011）在《利用硅胶扩张囊在体内构建自体复合皮的实验研究》文中研究说明目的观察利用皮肤扩张器在体内构建类似于皮肤结构的复合皮的可行性。方法新西兰大耳白兔10只,于其背部左右两侧皮下各埋植一有双注射壶的球形皮肤扩张器,经注射壶A将扩张囊扩张到10ml;埋置手术后1w在扩张囊周围即有完整的纤维包囊形成,此时将原代培养的自体皮肤表皮细胞悬液经注射壶B注入扩张囊和纤维包囊腔隙之间。设对照组,对照组注入同等量的生理盐水。表皮细胞注入后2w,取出扩张囊,肉眼及光镜观察纤维包囊表面是否有上皮形成,即纤维包囊与注入的表皮细胞是否结合形成类似于皮肤结构的自体复合皮。结果肉眼观:实验组和对照组均有完整的纤维包囊形成,容易完整剥离,两组比较,实验组包囊略厚于对照组,透明度稍低于对照组,其余未见明显区别。光镜下观:对照组纤维包囊未见有上皮细胞覆盖,而实验组可见类似于假复层鳞状上皮细胞层,覆盖整个纤维包囊,上皮层和纤维包囊之间结合紧密。结论利用硅胶扩张囊在体内构建类似于皮肤结构的自体复合皮是可行的,在理想的组织工程复合皮诞生之前,该方法构建的自体复合皮有望成为大面积烧创伤创面的修复材料。
钟晓红[8]（2010）在《骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠创面愈合的实验研究》文中研究指明目的实验通过对大鼠糖尿病创面模型的建立,将经过BrdU标记的骨髓间充质干细胞局部注射到创面组织周围,并设计对照组,对两组创面愈合率的差异进行统计学分析;同时观察标记的骨髓间充质干细胞在创面组织中的去向与分化,从而评价骨髓间充质干细胞对糖尿病创面愈合的影响。方法（1）糖尿病大鼠模型的建立:采用一次性腹腔内注射链脲佐菌素;（2）骨髓间充质干细胞的分离培养和纯化扩增:采用全骨髓培养法;（3）创面愈合率的计算:应用透明膜法,并对其差异进行统计学分析; （4）组织病理学观察:对创面组织进行苏木精-伊红染色;（5）骨髓间充质干细胞的分布与去向:对创面周围组织进行免疫组织化学染色,连续切片观察该细胞向皮肤组织细胞分化。结果（1）成功构建了糖尿病大鼠创面的模型;（2）成功分离培养了大鼠骨髓间充质干细胞且纯化扩增;（3）骨髓间充质干细胞明显提高了糖尿病大鼠创面愈合率,并具有统计学意义;（4）苏木精-伊红染色结果显示:实验组新生表皮较对照组厚,细胞层数较多且分层明显,基底细胞呈单层柱状排列,结合紧密,组织结构完整,较多的皮肤附属器分布于真皮层中;（5）免疫组织化学染色结果显示:表皮、真皮及皮下组织中均可见到BrdU阳性细胞,细胞核呈深棕色,尤以真皮层血管周围多见,部分细胞位于表皮层、皮脂腺及腺导管上皮中;连续切片中BrdU阳性细胞同时也表达角蛋白,细胞胞浆呈棕黄色,以腺导管上皮中多见。结论将标记的骨髓间充质干细胞移植到糖尿病大鼠创面组织中,该细胞在糖尿病创面微环境下,具有向表皮细胞和皮肤腺上皮细胞分化的能力,而且能够明显提高创面愈合率,促进了糖尿病大鼠创面的愈合。
陈列欢[9]（2007）在《组织工程人工角膜内皮载体膜片的制备、性质及对角膜内皮损伤修复的实验研究》文中指出甲壳素广泛存在于低等动物,特别是节肢动物的外壳、真菌及一些藻类细胞的细胞壁中,是一种天然的生物高分子多糖。甲壳素经过脱乙酰基反应成为壳聚糖,它是一种天然聚阳离子功能性生物多糖,具有优良的生物相容性,在体内可降解成为机体所需的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖,在生物医用材料和组织工程方面得到较广泛研究和应用。角膜内皮细胞是位于角膜后部的单层细胞,前面与后弹力层相连,后面与房水相接触。角膜内皮细胞在维持正常角膜脱水状态、角膜厚度、透明度方面起着关键作用。目前,穿透性角膜移植术是取代病变或受损的内皮细胞恢复角膜透明性的唯一方法。但是供体来源的短缺、老年化及术后免疫排斥反应的发生,直接影响着角膜移植手术的开展和成败。组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合,进行体外或体内构建组织或器官的新兴科学,利用组织工程方法体外构建人工角膜内皮是解决角膜内皮盲的有潜力的途径,而供内皮细胞生长的体外载体的研究成为组织工程角膜内皮研究的关键。目前供内皮细胞生长的体外载体报道最多的是同种异体或异种角膜的后弹力层（DM）,由于后弹力层上有层粘连蛋白（LN）存在,而层粘连蛋白（LN）在内皮细胞贴壁的过程中起着重要作用,因此后弹力层是内皮细胞的最佳底物。除了DM外,报道的载体尚有可生物降解的聚合物PLLA和PLGA、水凝胶膜、胶原膜、明胶薄膜以及羊膜等。但上述载体各有缺点,距离临床有较大距离,而且没有以多糖为主要材料的角膜内皮载体见到报道。本实验选择甲壳素及其衍生物为基本材料,通过与其他多糖的共混,制备出适合角膜内皮细胞生长的膜片,以期解决角膜内皮缺损的问题。本实验取得以下几个方面成果和进展:1、系统的研究了甲壳素、壳聚糖原料和不同脱乙酰度壳聚糖和产物的性质。研究了甲壳素、壳聚糖及其羧甲基衍生物的纯化方法,制备出符合体内应用的高纯度,无菌无热原医用材料。对壳聚糖的脱乙酰度与生物相容性和生物降解性之间的关系进行了初步研究,结果发现脱乙酰度越高降解速度越慢,而高脱酰度的壳聚糖生物相容性与低脱乙酰度的类似,但炎症反应发生的时机要晚一些,这与其炎症反应的机制有关。对羧甲基壳聚糖和羧甲基甲壳素的生物相容性进行了初步评价,MTT法测试不同浓度的材料对L929小鼠成纤维细胞相对增值率的影响,结果证明两种原料的毒性分级为0级,属于无毒性材料。2、制备出壳聚糖-硫酸软骨素（Ch-Cs）、壳聚糖-羧甲基壳聚糖（Ch-Cm）、壳聚糖-透明质酸（Ch-Ha）三种共混膜,研究了三种共混膜的透光性、亲水性、通透性、机械性能、表面结构、蛋白吸附能力、红外图谱以及生物相容性和生物降解性。结果表明三种共混膜都具有良好的透明性、亲水性和机械性能以及粗糙的表面结构,并且对蛋白有较好的吸附能力,但三种共混膜之间略有差异。综合对比三种共混膜,筛选出Ch-Cs物理化学性质最为合适。研究了兔角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的原代和传代培养技术,研究了猫角膜内皮细胞的原代和传代培养技术,能体外获得大量高纯度的角膜细胞。以不同类型的壳聚糖共混膜为支架进行体外培养角膜基质细胞、上皮细胞和内皮细胞实验研究。观察兔角膜基质细胞、上皮细胞和内皮细胞在不同共混膜上的生长情况,研究不同类型共混膜与角膜细胞的生物相容性,结果说明三种共混膜片与角膜上皮和基质细胞都具有较好的生物相容性,而Ch-Cs共混膜最适合角膜内皮细胞生长,被确定为本研究的角膜内皮载体材料。3、从体外酶解-体内肌肉植入-眼角膜基质层间植入三个层面评价了Ch-Cs共混膜的生物降解性和生物相容性,各实验结果表现出相同的特点:共混膜片能够逐步降解,肌肉植入和层间植入显示其具有良好的生物相容性和降解性。其中,溶菌酶降解实验证明共混膜能够在21天内被降解成碎片,而大鼠肌肉植入实验说明共混膜能够在60天内基本被降解吸收,组织反应比较温和。植入到猫角膜内的膜片在观察期内完全没有炎症反应,没有免疫排斥,动物角膜长时间保持透明,在植入第35天时膜片基本被吸收,该结果在同类实验中表现最好。4、首次对水溶性致孔剂进行了大量的筛选,包括麦芽糖、脲、柠檬酸、硫酸镁、硫酸铵、硫酸钾、醋酸钠、氯化镁、醋酸钾等多种化合物。通过光镜、电镜观察和通透性实验证明醋酸钾在对膜片表面结构和通透性改进方面具有较好的效果。实验结果表明,经不同醋酸钾致孔的Ch-Cs共混膜片的通透性都优于截留分子量为8000道尔顿的醋酸纤维素透析袋膜片,其中醋酸钾致孔剂质量为膜片固形物两倍时的膜片通透性最好,并且有着合适的表面结构。利用研制的两种特定曲率多糖膜片制膜设备,制备出特定曲率的、透明性和机械性能良好并且适合角膜内皮细胞贴附与生长的曲率膜片。5、以曲率膜片为载体,分别进行了兔、猫组织工程角膜内皮支架的构建,在曲率Ch-Cs共混膜上成功的培养了兔角膜内皮细胞和猫角膜内皮细胞,构建出组织工程化角膜内皮,细胞培养实验结果标表明:与培养板对照相比,Ch-Cs共混膜更适合角膜内皮细胞的贴附与生长,并且贴附牢固。进一步进行了新西兰兔和猫角膜内皮缺损动物模型的修复试验研究,结果表明角膜缺损模型新西兰兔的角膜短期（30天）透明率为80%,长期（250天）透明率为46%,表明植入的组织工程化角膜内皮对角膜缺损具有一定的修复作用。
伍津津,朱堂友,鲁元刚,杨宏珍[10]（2004）在《表皮真皮分离方法的探索》文中研究说明目的 探索一种适合细胞培养的分离真表皮的酶消化法。方法 将分离酶配成 0 1%、0 2 %、0 5 % 3个浓度 ,在 4℃或 3 7℃条件下消化头皮或包皮 ,摸索消化的时间 ,并与 0 2 5 %胰蛋白酶消化法进行对比。结果 0 5 %分离酶在 4℃条件下消化 16～ 18h ,或 3 7℃条件下消化 1h ,能够很好地分离表皮与真皮 ,再用胰蛋白酶将表皮游离成角质形成细胞 ,活细胞率高 ,培养后细胞融合时间短。结论 分离酶能够选择性消化基底膜成分而起到很好的分离表皮与真皮的作用 ,分离酶和胰蛋白酶联合消化法是一种非常理想的分离角质形成细胞的方法 ,同时又能够避免成纤维细胞的污染。
二、应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液获取高纯度基底细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液获取高纯度基底细胞（论文提纲范文）
（1）小鼠和人Leg1的结构和功能探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 唾液腺的结构与功能研究 |
| 1.1.1 唾液腺的结构 |
| 1.1.2 唾液腺的发育 |
| 1.1.3 唾液腺作为靶器官表达目的蛋白及其在畜牧业中的潜在应用 |
| 1.2 唾液的组成与功能 |
| 1.2.1 唾液的功能 |
| 1.2.2 唾液组学研究 |
| 1.2.3 唾液的临床诊断应用 |
| 1.3 肝脏与代谢 |
| 1.3.1 肝脏的结构 |
| 1.3.2 肝脏与脂肪合成代谢 |
| 1.4 Akt信号通路 |
| 1.5 Leg1的研究进展 |
| 1.5.1 Leg1在斑马鱼中的发现和研究 |
| 1.5.2 在小鼠中Leg1同源物的研究 |
| 1.5.3 在其他物种中Leg1的研究 |
| 1.6 单颗粒冷冻电镜技术 |
| 1.6.1 冷冻样品制备 |
| 1.6.2 透射电子显微镜及图像收集 |
| 1.6.3 图像数据处理和三维结构重构 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 小鼠 |
| 2.1.1 小鼠品系及饲养 |
| 2.1.2 小鼠唾液收集 |
| 2.2 细胞系实验 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.3 大肠杆菌实验 |
| 2.3.1 大肠杆菌菌株 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.3.3 菌液冻存 |
| 2.3.4 菌落PCR |
| 2.4 DNA相关实验方法 |
| 2.4.1 基因克隆实验 |
| 2.4.1.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.4.1.2 点突变或短片段插入与删除 |
| 2.4.1.3 PCR及DNA酶切产物的纯化 |
| 2.4.2 酶切与连接 |
| 2.4.3 同源重组 |
| 2.4.4 大肠杆菌质粒抽提 |
| 2.4.5 小鼠基因型鉴定 |
| 2.5 RNA相关实验方法 |
| 2.5.1 总RNA提取 |
| 2.5.2 RNA逆转录 |
| 2.5.3 荧光定量PCR |
| 2.6 蛋白质相关实验方法 |
| 2.6.1 细胞组分和唾液蛋白提取 |
| 2.6.1.1 细胞总蛋白的提取 |
| 2.6.1.2 唾液蛋白的提取 |
| 2.6.2 蛋白的检测:免疫印迹(Western Blot)和斑点杂交(Dot Blot) |
| 2.6.2.1 SDS-PAGE蛋白胶的配制 |
| 2.6.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳和转膜 |
| 2.6.2.3 抗体孵育及曝光 |
| 2.6.3 蛋白Dot Blot操作过程及检测 |
| 2.6.4 蛋白质的浓缩 |
| 2.6.5 抗体的制备与检测 |
| 2.6.5.1 抗原蛋白的原核表达 |
| 2.6.5.2 多抗血清的筛选与检测 |
| 2.6.5.3 单抗的筛选与检测 |
| 2.6.6 糖苷酶处理 |
| 2.7 昆虫细胞表达系统及蛋白纯化 |
| 2.7.1 载体的构建 |
| 2.7.2 杆状病毒的制备 |
| 2.7.2.1 蓝白斑筛选与Bacmid的提取 |
| 2.7.2.2 病毒的获取和扩增 |
| 2.7.3 SF9昆虫细胞蛋白的纯化 |
| 2.8 柱层析分离小鼠唾液腺蛋白 |
| 2.9 化学试剂及培养基配方 |
| 2.10 本课题相关引物序列 |
| 第三章 MLEG1存在N糖基化和O糖基化修饰 |
| 3.1 MLEG1存在糖基化修饰 |
| 3.2 MLEG1第171,196,257位的天冬酰胺为N-糖基化修饰位点 |
| 3.3 糖基化的缺失影响MLEG1功能 |
| 3.4 MLEG1第119,123位的丝氨酸为O-糖基化修饰位点 |
| 3.5 MLEG1的119位的丝氨酸影响第117位的N-糖基化修饰 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第四章 MLEG1蛋白结构分析 |
| 4.1 MLEG1的表达和纯化 |
| 4.2 MLEG1蛋白样品负染检查 |
| 4.3 MLEG1的冷冻电镜样品检查 |
| 4.4 Titan Krios 300kV电子显微镜数据处理 |
| 4.5 冷冻样品条件优化 |
| 4.6 小结与讨论 |
| 第五章 HLEG1在人唾液表达且有糖基化修饰 |
| 5.1 HLEG1 RNA表达数据库分析 |
| 5.2 HLEG1蛋白数据库分析 |
| 5.3 HLEG1结构分析 |
| 5.4 HLEG1蛋白抗体的制备 |
| 5.5 HLEG1蛋白抗体的检测 |
| 5.6 HLEG1存在N糖基化修饰 |
| 5.7 HLEG1第24位和69位的天冬酰胺为N-糖基化修饰位点 |
| 5.8 小结与讨论 |
| 第六章 HLEG1可上调HepG2细胞中Akt磷酸化 |
| 6.1 293T细胞表达的HLEG1能诱导Akt的磷酸化 |
| 6.2 293T细胞表达的HLEG1能够诱导EGFR的磷酸化 |
| 6.3 HLEG1与人BMI的关系 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 在leg1a突变体中进行基因补偿效应研究 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（2）SIPA1调控乳腺癌细胞EMT和自噬的机制研究及乳腺癌细胞AFAM成像（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 癌症特征的研究进展 |
| 1.1.1 癌症的基本特征 |
| 1.1.2 浸润-转移的形成 |
| 1.1.3 EMT的发生 |
| 1.2 乳腺癌治疗研究进展 |
| 1.3 基因甲基化研究进展 |
| 1.4 细胞自噬的过程及研究方法 |
| 1.5 肿瘤细胞迁移和自噬之间关系的研究进展 |
| 1.6 SIPA1蛋白研究进展 |
| 1.7 高分辨细胞显微成像技术研究进展 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 实验仪器和材料 |
| 2.1 实验仪器设备 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验细胞系 |
| 2.5 实验菌株 |
| 2.6 实验模式生物 |
| 2.7 实验质粒 |
| 2.8 实验试剂配制 |
| 2.8.1 分子生物学试剂及配制 |
| 2.8.2 蛋白质免疫印迹试剂配制 |
| 2.8.3 细胞培养试剂配制 |
| 2.8.4 其他试剂配制 |
| 3 实验原理和方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.1.1 细胞传代 |
| 3.1.2 细胞冻存 |
| 3.1.3 细胞复苏 |
| 3.2 荧光定量PCR |
| 3.3 蛋白质免疫印迹 |
| 3.4 双荧光素酶基因报告实验 |
| 3.5 蛋白质免疫荧光染色实验 |
| 3.6 划痕实验 |
| 3.7 细胞活性检测实验 |
| 3.8 Transwell实验 |
| 3.9 细胞体内转移实验 |
| 3.9.1 斑马鱼饲养 |
| 3.9.2 斑马鱼体内迁移实验 |
| 3.10 自噬小体检测实验 |
| 3.11 染色质免疫共沉淀(测序)实验 |
| 3.12 细胞转染 |
| 3.12.1 脂质体转化 |
| 3.12.2 电穿孔转化 |
| 3.13 质粒大量提取 |
| 3.14 细胞基因组DNA提取 |
| 3.15 原子力超声扫描探针显微镜样品制备 |
| 4 实验结果与讨论 |
| 4.1 Sipa1 基因低甲基化对乳腺癌细胞EMT的调控研究 |
| 4.1.1 Sipa1 基因转录水平与其Cp G岛的甲基化水平在人器官样本中呈负相关性 |
| 4.1.2 Sipa1 基因启动子区Cp G岛低甲基化诱导SIPA1 蛋白表达 |
| 4.1.3 下调SIPA1 蛋白表达可以抑制BT549 细胞EMT和迁移 |
| 4.1.4 SIPA1 蛋白通过EMT上游转录因子来促进EMT发生 |
| 4.2 SIPA1蛋白调控乳腺癌细胞自噬的研究 |
| 4.2.1 SIPA1 蛋白表达水平与自噬标志物MAP1LC3B表达呈正相关性 |
| 4.2.2 SIPA1 蛋白可以调节乳腺癌细胞MAP1LC3B蛋白表达 |
| 4.2.3 SIPA1蛋白调节乳腺癌细胞自噬小体形成 |
| 4.2.4 Rapamycin刺激可以强烈诱导MDA-MB-231 形成自噬小体 |
| 4.2.5 SIPA1 蛋白结合MAP1LC3B基因启动子激活MAP1LC3B基因转录 |
| 4.2.6 自噬抑制剂CQ可以显着抑制MDA-MB-231 细胞的迁移 |
| 4.3 原子力超声扫描探针显微镜对乳腺癌细胞成像的研究 |
| 4.3.1 原子力超声扫描探针显微镜细胞样品制备优化 |
| 4.3.2 原子力超声扫描探针显微镜对MDA-MB-231细胞成像 |
| 4.3.3 原子力超声扫描探针显微镜对乳腺癌细胞成像的三维分析 |
| 5 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 研究生期间参与的学术论文和基金 |
（3）基于抗粘附纳米界面的循环肿瘤细胞的高效捕获与纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 循环肿瘤细胞的应用和富集技术 |
| 1.1.1 循环肿瘤细胞的概述 |
| 1.1.2 循环肿瘤细胞的应用 |
| 1.1.3 循环肿瘤细胞富集技术概述 |
| 1.2 纳米结构基底检测循环肿瘤细胞 |
| 1.2.1 纳米结构基底概述 |
| 1.2.2 循环肿瘤细胞的检测 |
| 1.3 磁性粒子对循环肿瘤细胞的检测 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 循环肿瘤细胞的检测 |
| 1.4 水凝胶在循环肿瘤细胞检测的应用 |
| 1.5 课题的提出与研究内容 |
| 第2章 纳米纤维@水凝胶基底捕获和纯化CTCs |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验方案设计 |
| 2.2.3 纳米纤维@水凝胶界面的构建 |
| 2.2.4 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底最佳捕获时间的考察 |
| 2.2.5 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底捕获效率的考察 |
| 2.2.6 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底特异性的考察 |
| 2.2.7 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底捕获细胞活性的考察 |
| 2.2.8 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底灵敏度的考察 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CS@Hydrogel界面的制备和表征 |
| 2.3.2 细胞孵育时间对捕获效率的影响 |
| 2.3.3 细胞捕获效率的考察 |
| 2.3.4 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底特异性的考察 |
| 2.3.5 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底捕获细胞活性的考察 |
| 2.3.6 anti-EpCAM-CS@Hydrogel基底灵敏度的考察 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 抗粘附纳米水凝胶基底捕获和纯化CTCs |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方案设计 |
| 3.2.3 水凝胶纳米结构基底的构筑 |
| 3.2.4 孵育时间对捕获效率影响的考察 |
| 3.2.5 anti-EpCAM-SMHNPs捕获性能的考察 |
| 3.2.6 anti-EpCAM-SMHNPs基底捕获特异性和相容性的考察 |
| 3.2.7 anti-EpCAM-SMHNPs基底捕获灵敏度的考察 |
| 3.2.8 anti-EpCAM-SMHNPs基底对病人样的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 anti-EpCAM-SMHNPs基底的制备和表征 |
| 3.3.2 孵育时间对捕获效率的影响 |
| 3.3.3 anti-EpCAM-SMHNPs捕获性能的考察 |
| 3.3.4 anti-EpCAM-SMHNPs基底捕获特异性和生物相容性的考察 |
| 3.3.5 anti-EpCAM-SMHNPs基底捕获灵敏度的考察 |
| 3.3.6 anti-EpCAM-SMHNPs基底对病人样的检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 温敏纳米纤维特异性纯化和释放CTCs |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方案设计 |
| 4.2.3 壳聚糖纳米纤维的制备 |
| 4.2.4 壳聚糖温敏纳米纤维界面的修饰 |
| 4.2.5 细胞捕获效率的考察 |
| 4.2.6 纤维基底对混合细胞的捕获 |
| 4.2.7 纤维基底对少量MCF-7细胞的捕获考察 |
| 4.2.8 纤维基底对模拟病人样本的捕获 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 温敏纳米纤维界面的制备和表征 |
| 4.3.2 PNIPAM修饰时间对细胞捕获和纯化的影响 |
| 4.3.3 最佳细胞孵育时间的确定 |
| 4.3.4 不同修饰界面的捕获和纯化 |
| 4.3.5 释放细胞的活性考察 |
| 4.3.6 aptamer-P-CNFs对不同类型细胞的捕获和纯化 |
| 4.3.7 aptamer-P-CNFs纤维基底对混合细胞的捕获 |
| 4.3.8 aptamer-P-CNFs基底对少量MCF-7细胞的捕获 |
| 4.3.9 aptamer-P-CNFs基底对模拟病人样本的捕获 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 水凝胶@磁纳米颗粒捕获和释放CTCs |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 实验方案设计 |
| 5.2.3 磁性纳米颗粒的合成 |
| 5.2.4 水凝胶包裹磁纳米颗粒的合成 |
| 5.2.5 水凝胶包裹磁纳米颗粒的功能化 |
| 5.2.6 细胞孵育时间对捕获效率的影响 |
| 5.2.7 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM捕获特异性的考察 |
| 5.2.8 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM释放性能的考察 |
| 5.2.9 捕获和释放细胞活性的考察 |
| 5.2.10 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM灵敏度的考察 |
| 5.2.11 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM对病人样的检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM的制备和表征 |
| 5.3.2 孵育时间对捕获效率的影响 |
| 5.3.3 捕获特异性的考察 |
| 5.3.4 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM对细胞捕获和释放性能的考察 |
| 5.3.5 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM灵敏度的考察 |
| 5.3.6 MNPs@hydrogel-anti-EpCAM对病人样的检测 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 荧光磁性纳米颗粒捕获和鉴定CTCs |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 试剂与仪器 |
| 6.2.2 实验方案设计 |
| 6.2.3 双抗体功能化荧光磁纳米颗粒的合成 |
| 6.2.4 磁纳米颗粒捕获能力的考查 |
| 6.2.5 捕获特异性的考察 |
| 6.2.6 捕获灵敏度的考察 |
| 6.2.7 对病人样的检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 F-MNPs的制备和表征 |
| 6.3.2 F-MNPs最佳使用浓度和孵育时间的确定 |
| 6.3.3 不同修饰磁珠对细胞捕获的考察 |
| 6.3.4 F-MNPs对不同类型细胞的捕获和荧光鉴定的考察 |
| 6.3.5 F-MNPs-E+N灵敏性的考察 |
| 6.3.6 F-MNPs-E+N对模拟病人样本的捕获 |
| 6.3.7 F-MNPs-E+N对临床病人样本的捕获 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（4）SiO2诱导的巨噬细胞外泌体miRNAs在肺成纤维细胞转分化中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 染尘巨噬细胞外泌体提取、鉴定及其对肺成纤维细胞转分化影响观察 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验试剂 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 SiO_2粉尘刺激对巨噬细胞形态改变的光学显微镜观察 |
| 1.3.2 CCK8 试剂盒检测系列浓度SiO_2粉尘刺激的巨噬细胞活性 |
| 1.3.3 外泌体的提取和鉴定 |
| 1.3.4 原代肺成纤维细胞的提取与纯化 |
| 1.3.5 肺成纤维细胞的传代与形态学观察 |
| 1.3.6 流式细胞术检测肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化 |
| 1.3.7 各代肺成纤维细胞α-SMA表达水平免疫荧光显微镜观察 |
| 1.3.8 激光共聚焦显微镜观察原代肺成纤维细胞对外泌体的摄取 |
| 1.3.9 各代肺成纤维细胞转分化相关蛋白免疫组织化学检测 |
| 1.3.10 统计方法 |
| 2 本部分技术路线图 |
| 3 结果 |
| 3.1 SiO_2粉尘刺激对巨噬细胞活性及形态的影响 |
| 3.1.1 SiO_2粉尘刺激对巨噬细胞的毒性试验 |
| 3.1.2 SiO_2粉尘刺激对巨噬细胞形态的影响 |
| 3.2 外泌体的提取、纯化、鉴定及粉尘刺激对其分泌水平的影响 |
| 3.2.1 不同方法提取外泌体效果比较 |
| 3.2.2 透射电子显微镜成像 |
| 3.2.3 NTA外泌体粒径分析 |
| 3.2.4 外泌体表面标志蛋白检测 |
| 3.2.5 外泌体总蛋白水平检测 |
| 3.3 肺成纤维细胞的原代提取和细胞传代对其转分化的影响 |
| 3.3.1 肺成纤维细胞的原代提取与纯化 |
| 3.3.2 传代对肺成纤维细胞形态学的影响 |
| 3.3.3 P1-P4代肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化水平检测 |
| 3.3.4 P1-P4 代肺成纤维细胞α-SMA表达水平检测 |
| 3.4 染尘巨噬细胞外泌体对肺成纤维细胞转分化的影响 |
| 3.4.1 肺成纤维细胞摄取外泌体观察 |
| 3.4.2 巨噬细胞外泌体诱导肺成纤维细胞转分化能力探索 |
| 3.4.3 外泌体诱导肺成纤维细胞转分化相关蛋白表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 改良超滤离心法可获取高纯度外泌体 |
| 4.2 原代肺成纤维细胞转分化率随传代次数增加升高 |
| 4.3 摄取染尘巨噬细胞外泌体后肺成纤维细胞转分化率增加 |
| 5 小结 |
| 第二部分 尘肺相关巨噬细胞外泌体miRNAs筛选和生物信息学功能预测 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 调查现场 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 尘肺病患者和健康对照血清制备 |
| 1.3.2 人群血清外泌体分离、鉴定 |
| 1.3.3 外泌体RNA抽提 |
| 1.3.4 RNA定量 |
| 1.3.5 RNA质检 |
| 1.3.6 miRNAs文库构建 |
| 1.3.7 簇生成 |
| 1.3.8 Illumina Hiseq2500 测序 |
| 1.3.9 数据库序列比对 |
| 1.3.10 差异miRNAs筛选 |
| 1.3.11 保守miRNAs比对 |
| 1.3.12 miRNAs靶基因预测 |
| 1.3.13 miRNAs功能注释 |
| 1.3.14 统计学分析 |
| 2 本部分实验技术路线图 |
| 3 结果 |
| 3.1 尘肺病患者及健康对照一般情况 |
| 3.2 尘肺病相关巨噬细胞外泌体miRNAs质量控制 |
| 3.3 尘肺病相关巨噬细胞外泌体差异表达miRNAs筛选 |
| 3.4 人源、鼠源差异表达高保守miRNAs序列比对 |
| 3.5 尘肺病相关差异表达高保守miRNAs筛选 |
| 3.6 尘肺病相关巨噬细胞外泌体miRNAs靶基因预测 |
| 3.7 尘肺病相关巨噬细胞外泌体miRNAs功能注释 |
| 3.8 肺成纤维细胞分化相关miRNAs、靶基因及信号通路预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 miR-107-3p对肺成纤维细胞转分化的作用和机制 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验试剂 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 染尘巨噬细胞外泌体的提取 |
| 1.3.2 透射电子显微镜鉴定观察外泌体形态 |
| 1.3.3 原代肺成纤维细胞的提取与纯化 |
| 1.3.4 肺成纤维细胞的传代与干预 |
| 1.3.5 CCK8试剂盒检测不同干预组肺成纤维细胞活性 |
| 1.3.6 各干预组肺成纤维细胞α-SMA表达水平免疫荧光显微镜观察 |
| 1.3.7 各干预组肺成纤维细胞α-SMA表达水平免疫组织化学检测 |
| 1.3.8 流式细胞术检测肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化比例 |
| 1.3.9 免疫印迹法检测各干预组肺成纤维细胞转分化相关蛋白 |
| 1.3.10 统计方法 |
| 2 本部分实验技术线路图 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同干预处理对肺成纤维细胞形态的影响 |
| 3.2 不同干预处理对肺成纤维细胞活性的影响 |
| 3.3 肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化鉴定 |
| 3.3.1 免疫荧光法定性检测各干预组肺成纤维细胞α-SMA水平 |
| 3.3.2 免疫组织化学法定量检测各干预组α-SMA水平 |
| 3.3.3 流式细胞术检测各干预组肺成纤维细胞表型 |
| 3.4 miR-107-3p调控的TGF-β信号通路相关蛋白表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同干预处理对肺成纤维细胞活性及形态的影响 |
| 4.2 不同干预处理对肺成纤维细胞表型转分化的影响 |
| 4.3 染尘巨噬细胞外泌体诱导肺成纤维细胞表型转分化机制探索 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本研究的局限性 |
| 下一步的研究计划 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体miRNAs介导的细胞间通讯研究进展 |
| 1.外泌体研究现状 |
| 2.外泌体miRNAs的生物学功能及作用机制 |
| 3.外泌体miRNAs在不同疾病中的作用 |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）人毛囊神经嵴干细胞的分离、培养与初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 人毛囊隆突区神经嵴干细胞的鉴定 |
| 引言 |
| 第一节 人毛囊中SOX10和Nestin的mRNA检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 主要试剂、耗材和设备 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 人毛囊隆突区细胞SOX10和Nestin的检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 主要试剂、耗材和设备 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二章 人毛囊神经嵴干细胞的培养与初步鉴定 |
| 引言 |
| 第一节 人毛囊隆突区细胞的分离培养 |
| 1 实验材料及试剂 |
| 2 毛囊神经嵴干细胞分离培养方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二节 分离的人毛囊细胞中SOX10和Nestin的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 毛囊神经嵴干细胞免疫荧光结果判定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 毛囊神经嵴干细胞的研究进展及皮肤科应用前景 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）Wnt信号通路介导的基因调控毛囊干细胞定向分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写一览表 |
| 前言 |
| 第一部分 毛囊干细胞快速分离、培养及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 氯化锂诱导下Wnt信号通路介导毛囊干细胞分化的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 LiCl-PLGA 纳米微球的制作及组织工程皮肤的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）利用硅胶扩张囊在体内构建自体复合皮的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 论文图片资料 |
| 文献综述 兔表皮细胞原代培养方法 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间完成的论文 |
（8）骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠创面愈合的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 进一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 1. 综述 |
| 2. 参考文献 |
（9）组织工程人工角膜内皮载体膜片的制备、性质及对角膜内皮损伤修复的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 组织工程学研究进展 |
| 1.1.1 组织工程学的提出 |
| 1.1.2 组织工程学的定义和意义 |
| 1.1.3 组织工程学研究的核心问题 |
| 1.1.4 组织工程学的发展 |
| 1.2 甲壳素及其衍生物在组织工程学中的应用 |
| 1.2.1 甲壳素和壳聚糖 |
| 1.2.2 甲壳素和壳聚糖的衍生物 |
| 1.2.3 壳聚糖及其衍生物在组织工程学中的应用 |
| 1.3 组织工程化人工角膜研究进展 |
| 1.3.1 以人工合成材料为支架的组织工程化人工角膜 |
| 1.3.2 以羊膜为支架的组织工程化人工角膜 |
| 1.3.3 以天然可降解生物材料为支架的组织工程化人工角膜 |
| 1.3.4 摒弃支架材料的Cell Sheet Engineering（细胞片工程）技术重建角膜上皮和内皮 |
| 1.3.5 组织工程化角膜的特征 |
| 1.3.6 展望 |
| 1.4 角膜内皮细胞载体培养及移植的研究进展 |
| 1.4.1 角膜内皮细胞载体培养及移植方法 |
| 1.4.2 影响CEC载体培养及移植成功的因素 |
| 1.4.3 角膜内皮载体移植后形态学观察 |
| 1.4.4 术后排斥反应的研究 |
| 1.4.5 展望 |
| 第二章 不同医用级壳聚糖及其衍生物的制备及性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 不同脱乙酰度壳聚糖的制备的性质研究 |
| 2.2.1 实验材料和试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验内容 |
| 2.2.4 实验结果 |
| 2.2.5 讨论 |
| 2.3 羧甲基甲壳素和羧甲基壳聚糖的制备和性质研究 |
| 2.3.1 实验材料和试剂 |
| 2.3.2 主要仪器 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 实验结果 |
| 2.3.5 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 三种壳聚糖共混膜的制备、性质以及与角膜细胞的相容性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 三种壳聚糖共混膜的制备及物理化学性质研究 |
| 3.2.1 实验材料和试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验内容 |
| 3.2.4 实验结果 |
| 3.2.5 讨论 |
| 3.3 三种共混膜与角膜细胞相容性的研究 |
| 3.3.1 引言 |
| 3.3.2 实验材料和试剂 |
| 3.3.3 主要仪器 |
| 3.3.4 实验方法 |
| 3.3.5 实验结果 |
| 3.3.6 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 壳聚糖－硫酸软骨素共混膜作为角膜内皮载体膜片的生物降解性与组织相容性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 常用仪器 |
| 4.4 实验内容 |
| 4.4.1 溶菌酶对Ch-Cs 膜的降解作用 |
| 4.4.2 Ch-Cs 膜在大鼠肌肉内的降解性和生物相容性 |
| 4.4.3 Ch-Cs 膜在在猫眼板层内的生物相容性研究 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 体外降解结果 |
| 4.5.2 膜片植入大鼠肌肉内的结果 |
| 4.5.3 共混膜在家猫眼角膜基质内生物相容性 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 壳聚糖－硫酸软骨素共混膜的通透性与结构的改进 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和试剂 |
| 5.3 主要仪器 |
| 5.4 实验内容 |
| 5.4.1 以 NaCl 为致孔剂制备 Ch-Cs 膜片 |
| 5.4.2 致孔剂的进一步筛选 |
| 5.4.3 加不同比例的醋酸钾为致孔剂制备膜片及性质评价 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 以NaCl 为致孔剂制备Ch-Cs 膜片的实验结果 |
| 5.5.2 各种致孔剂筛选的实验结果 |
| 5.5.3 以醋酸钾为致孔剂进一步实验结果 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 第六章 组织工程人工角膜内皮的构建及对动物角膜内皮缺损的修复实验 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和试剂 |
| 6.3 主要仪器 |
| 6.4 组织工程兔角膜内皮的构建及对动物角膜内皮缺损的修复实验 |
| 6.4.1 实验内容 |
| 6.4.2 实验结果 |
| 6.5 组织工程猫角膜内皮的构建及对动物角膜内皮缺损的修复实验 |
| 6.5.1 实验内容 |
| 6.5.2 实验结果 |
| 6.6 讨论 |
| 6.7 本章小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 发表文章和专利情况 |
| 致谢 |
四、应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液获取高纯度基底细胞（论文参考文献）
- [1]小鼠和人Leg1的结构和功能探究[D]. 王金阳. 浙江大学, 2020(01)
- [2]SIPA1调控乳腺癌细胞EMT和自噬的机制研究及乳腺癌细胞AFAM成像[D]. 卢昂. 华中科技大学, 2020(01)
- [3]基于抗粘附纳米界面的循环肿瘤细胞的高效捕获与纯化[D]. 王志利. 中国科学技术大学, 2019(08)
- [4]SiO2诱导的巨噬细胞外泌体miRNAs在肺成纤维细胞转分化中的作用[D]. 张林. 郑州大学, 2018(01)
- [5]人毛囊神经嵴干细胞的分离、培养与初步鉴定[D]. 韦旭华. 郑州大学, 2017(02)
- [6]Wnt信号通路介导的基因调控毛囊干细胞定向分化的研究[D]. 向萌娟. 广州医学院, 2012(08)
- [7]利用硅胶扩张囊在体内构建自体复合皮的实验研究[D]. 杨任欢. 重庆医科大学, 2011(11)
- [8]骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠创面愈合的实验研究[D]. 钟晓红. 安徽医科大学, 2010(12)
- [9]组织工程人工角膜内皮载体膜片的制备、性质及对角膜内皮损伤修复的实验研究[D]. 陈列欢. 中国海洋大学, 2007(03)
- [10]表皮真皮分离方法的探索[J]. 伍津津,朱堂友,鲁元刚,杨宏珍. 第三军医大学学报, 2004(24)