一、利用抗猪瘟病毒单克隆抗体鉴定瘟病毒株的抗原性（论文文献综述）
徐晓婷[1]（2020）在《小鹅瘟病毒流行病学调查及夹心ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）感染又称为小鹅瘟,自1956年在江苏扬州被首次发现以来,该病对鹅、鸭等水禽养殖业造成严重危害。2015年,在我国北方地区的樱桃谷鸭首次分离到一种独特的GPV相关病毒,即新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV）,与早期分离的经典GPV相比,宿主被NGPV感染后具有发病率高、死亡率低的特点。近年来,GPV广泛流行且病毒不断发生变异,与番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）等水禽细小病毒混合感染后发生的基因重组,如番鸭小鹅瘟病毒（Muscovy duck goose parvovirus,MDGPV）、鸭源鹅细小病毒（Duck goose parvovirus,DGPV）等多个流行分支。因此,掌握GPV的流行情况并建立合适的检测方法,对于小鹅瘟的防控具有重要意义。1小鹅瘟病毒流行病学调查及VP基因遗传进化分析2017～2019年,在江苏、安徽、广东及山东等省采集疑似GPV感染的水禽组织病料50份。经鹅胚进行病毒分离并通过PCR鉴定,成功获得了 14株GPV,包括11株经典GPV、2株MDGPV及1株NGPV。从宿主分布上看,经典GPV均分离自雏鹅;MDGPV均为番鸭来源,NGPV分离自雏鸭。从季节分布上看,GPV在春季和冬季呈现较高的分离率。14株GPVVP基因扩增后进行测序分析,并对结构蛋白VP1、VP2、VP3进行了分子进化与系统发生分析。结果显示,14株分离株在VP1、VP2、VP3基因进化树中均属于GPV分支,但又均呈现按宿主、地域差异分布于不同的亚分支,具有一定的遗传多样性。其中,江苏扬州及安徽地区的分离株均属于经典GPV亚分支,而2株广东分离株X1和X2属于MDGPV亚分支,1株山东分离株X7则属于NGPV亚分支。通过RDP4重组分析软件,X1和X2 GPV分离株在VP基因检测到重组事件,均以GPV-Yan-2为主要亲本,以MDPV-89384为次要亲本,均在VP基因1-702bp和1833-2199bp存在重组现象,GPV-Yan-2为中国经典GPV毒株,MDPV-89384是法国经典MDPV毒株,证实VP基因簇内的基因重组,对中国大陆GPV和MDPV株系VP基因的遗传多样性了解提供依据。2小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立从经典GPV、MDGPV、NGPV进化分支中各选取1株代表性分离株,纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,筛选出7株抗GPV的杂交瘤细胞,分别命名为 1H3、1D4、2C8、3G10、2F11、6F12、6H3,抗体亚类依次为 IgG2α、IgG2α、IgG2α、IgG2b、IgG2b、IgG2b、IgG2b。将杆状病毒表达的VP3抗原免疫进行浓缩纯化经甲醛灭活后免疫小鼠,筛选出4株抗GPVVP3的杂交瘤细胞分别命名为 1A5、1H5、4H5 及 5C7,抗体亚类依次为 IgM、IgM、IgM、IgG1。1H3 和5C7与GPV尿囊液western-blot上有阳性条带。选取效价高、稳定性好的2F11株和5C7株单抗,经ProteinG亲和层析柱纯化后浓度分别为1.2mg/ml和6mg/ml。以2F11作为捕获抗体,用兔抗GPV阳性血清作为检测抗体,建立了用于检测GPV抗原的夹心ELISA方法。以5C7作为捕获抗体,加入定量抗原后,再加入待检血清,建立了检测GPV抗体的夹心ELISA方法,本研究所建立的夹心ELISA方法阴性对照样品的OD值更低,显示出了更好的特异性。综上,本研究成功分离获得14株GPV,分属于经典GPV、MDGPV和NGPV进化分支;制备了 11株针对GPV的单抗,并分别建立了检测GPV抗原和VP3抗体的夹心ELISA方法,灵敏度高。
陈文龙[2]（2020）在《抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定》文中提出牛病毒性腹泻/黏膜病是影响全世界养牛业的重要疾病,BVDV病毒亚型众多、宿主范围广。动物感染病毒后可引起机体免疫抑制,导致继发感染。BVDV是黄病毒科瘟病毒属RNA病毒;BVDV分为1种血清型,2种生物型和3种基因型。该病毒主要引起牛腹泻病、呼吸道疾病、生产性能下降等临床症状。BVDV还严重影响与牛相关的生物制品,如冻精、血清、抗体、疫苗等,对畜牧业国家造成严重的经济损失。我国自1980年在吉林省长春地区检测到BVDV病毒以来,全国感染动物阳性率逐年增加,最新数据显示我国BVDV阳性率已达到46.7%,持续性感染率达2.2%,严重阻碍畜牧业发展。因此探索BVDV阳性动物检测方法,消除BVDV传染源,对减少生产损失是有实际意义的。基于此本研究主要开展并完成了以下试验:1.BVDV Erns和E2全长基因克隆及序列生物信息学分析MDBK细胞增殖BVDV病毒,然后提取病毒RNA;设计Erns和E2基因全长引物,RT-PCR扩增目的基因;基因克隆载体后菌落PCR验证,最后测序,进行生物信息学分析。结果表明:试验成功扩增681 bp Erns全长基因片段;生物信息学预测Erns基因序列编码227个氨基酸,有信号肽,无跨膜区,并预测Erns蛋白为亲水性、分泌蛋白。成功扩增1122 bp E2全长基因片段;生物信息学预测E2基因序列编码374个氨基酸;有信号肽,无跨膜区且E2蛋白为亲水性、分泌蛋白。2.Erns、E2蛋白免疫小鼠多克隆抗体效价分析参考生物信息学分析结果,设计Erns和E2基因优化引物;PCR扩增基因,连接载体,菌液PCR及双酶切鉴定后生物公司测序,重组质粒转化大肠杆菌,IPTG法诱导其表达目的蛋白;SDS-PAGE验证蛋白表达形式及大小;弗氏佐剂联合重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体;间接ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot、IFA验证多克隆抗体反应原性,最后比较Erns和E2蛋白制备的多克隆抗体效价水平。结果证明:大肠杆菌表达的Erns和E2重组蛋白均为不可溶性;Erns蛋白大小17 kDa,E2蛋白大小32 kDa;Western blot,IFA结果证实多克隆抗体与重组蛋白、细胞中病毒均有良好的反应性,证明纯化的重组蛋白免疫原性良好;制备的Erns和E2多克隆抗体效价均高于1:400000,且Erns多克隆抗体效价水平高于E2。3.抗BVDV Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定选取Erns蛋白作抗原,联合弗氏佐剂免疫小鼠,5次免疫后取小鼠肿大脾脏,制备免疫淋巴细胞,使用聚乙二醇融合脾细胞和骨髓瘤细胞制备杂交瘤细胞。利用筛选培养液培养细胞;显微镜观察细胞形态;ELISA测定抗体效价,Western blot和IFA验证抗体活性;经3次亚克隆筛选,鉴定能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞孔,重复测定效价后将阳性孔细胞扩大培养;细胞计数后无菌注射昆明鼠腹腔,制备腹水抗体;20 d后收集并鉴定抗体生物学活性。结果表明:试验制备出3株稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,且试验证明腹水抗体反应性良好,ELISA结果鉴定抗体效价高于1:50000。
刘存[3]（2020）在《BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响》文中认为牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是一种可感染多种偶蹄动物的传染性病原,可引起牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD）,可造成严重的经济损失。天然免疫在抗病毒感染中发挥重要的作用,其与病毒间相互作用的分子机制,可以为疫病防控提供新的思路。干扰素（Interferon,IFN）系统是天然免疫的重要组成部分,而干扰素诱导蛋白是干扰素系统的效应分子,发挥直接抗病毒作用。黏病毒抵抗蛋白（Myxovirus-resistant protein,Mx）是IFN诱导抗病毒状态的关键成分,对其抗病毒作用机制的研究,有助于对病原与宿主间相互作用的认识。本文主要从BVDV与宿主相互作用的角度,围绕BVDV感染牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK）前后转录组学变化及牛Mx1蛋白对BVDV感染作用的影响进行了研究,获得了以下结果。1.分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒（1）通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光等方法由牛血清和胎牛血清中分离、鉴定2株BVDV毒株,命名为BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株。利用BVDV 5’UTR序列基因型分型分析,发现BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株分别属于1a和1b基因型。（2）通过氨基酸序列比对分析和同源性比较分析,发现BVDV BJ-2013株的NS2蛋白氨基酸序列中存在12个氨基酸（LGEGNWLVNADR）的插入,BVDV BJ-2013株与BVDV 08GB44-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高,而BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高。通过遗传演化分析,BVDV BJ-2013株与BVDV08GB44-1、Oregon株位于同一分支,亲缘关系较近;BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1、PJ、08GB45-2等分离毒株被分配于同一进化分支中,显示它们之间的亲缘关系较近。2.BVDV感染MDBK细胞前后转录组学的比较分析（1）通过转录组学测序技术,比较了BVDV BJ-2016株感染MDBK细胞前后不同时间的细胞转录组的变化。结果显示,共获得转录本53929条,注释到24616个基因,注释到新转录本26651条、新基因2359个。（2）通过基因差异表达分析,在Mock vs MBV 2h、Mock vs MBV 6h、Mock vs MBV12h、Mock vs MBV 24h比较组中分别筛选了1297、1732、3072、1877个差异表达基因。通过差异表达基因的GO富集分析、KEGG pathway富集分析等,发现BVDV感染细胞后引起脂质代谢相关基因的表达上调,表明BVDV感染后改变了细胞的代谢网络;发现BVDV感染细胞后引起补体和凝血级联反应信号通路中F3、C3、C1R等基因表达下调和部分具有抗病毒作用基因（如ISG15、IFITM1、Mx1等）的表达呈现显着变化,提示补体系统在BVDV感染过程中发挥重要作用,提示BVDV感染后对细胞内天然免疫的抑制有助于其感染形成。3.牛Mx1蛋白对BVDV的复制具有抑制作用（1）通过牛Mx1基因过表达慢病毒和sh RNA干扰慢病毒的感染,分别建立了Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的MDBK细胞系。鉴定结果显示,牛Mx1基因稳定过表达细胞系中Mx1基因的表达上调5.15倍,Mx1基因稳定敲低的细胞系中Mx1基因的敲低效率达93.03%。通过BVDV分别感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的细胞系,检测BVDV复制水平,结果显示,牛Mx1基因的过表达可显着抑制BVDV复制（P<0.01）,而Mx1基因的敲低显着促进BVDV复制（P<0.01）,表明牛Mx1蛋白对BVDV复制具有抑制作用。（2）通过在反转录过程引入非病毒序列对BVDV正负链RNA进行区分,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法。通过BVDV感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低细胞,检测细胞内BVDV正负链RNA的变化,结果显示,Mx1基因的过表达降低了细胞中BVDV正负链RNA的含量,在BVDV感染后12～24 h间显着降低细胞内BVDV正链RNA的含量（P<0.05或P<0.01）,在感染后6～36 h间,显着降低了BVDV负链RNA的含量（P<0.05或P<0.01）,显示Mx1基因过表达抑制BVDV正负链RNA的复制;Mx1基因的敲低提高了细胞中BVDV正负链RNA的含量,BVDV感染后6～36 h间显着提高了BVDV负链RNA的含量（P<0.01）,而BVDV正链RNA仅在BVDV感染后24～36 h呈显着提高（P<0.05）,显示Mx1基因的敲低促进正负链RNA复制。结果表明,Mx1蛋白对BVDV正负链RNA的复制具有抑制作用。综上所述,本研究分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒,明确了BVDV感染MDBK细胞前后转录组学变化及其部分差异基因的作用,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法,发现牛Mx1蛋白显着抑制BVDV复制及BVDV正负链RNA的复制。研究结果为解析BVDV与宿主间的相互作用和牛Mx1蛋白抗BVDV感染作用及机制提供了新的科学资料。
杨凯越[4]（2020）在《犬细小病毒胶体金试纸条的研制及初步应用》文中进行了进一步梳理由犬细小病毒（Canine parvovirus）引起的犬细小病毒病（Canine parvovirus disease,CPVD）是一种急性烈性传染病,该病的自然感染宿主主要是犬,尤其是幼犬更易感,临床症状主要表现为出血性肠炎型和心肌炎型两种。该病传播速度快、发病率和死亡率极高,给养犬业和经济动物养殖业的发展造成了巨大的经济损失。因此,建立一种快速、准确的诊断方法对CPVD的预防具有重要意义。本研究利用纯化的CPV与弗氏佐剂乳化免疫雌性BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,经三次亚克隆,共筛选到3株与CPV特异性反应的细胞株,分别命名为1D9、3G9和4F6。亚类鉴定结果显示1D9和3G9重链为IgG1,4F6重链为IgG2b,轻链均为kappa链。利用秋水仙素法对杂交瘤细胞染色体数目进行测定,结果显示三株单克隆抗体的染色体数分别为92、94、98。将1D9、3G9和4F6分别接种小鼠腹腔制备腹水,腹水间接ELISA检测效价为104-105。中和实验表明:4F6腹水完全中和病毒的中和效价为1:512。交叉试验表明,三株单克隆抗体均可与CPV特异性结合,与其他犬类常见病毒无交叉反应,特异性良好。进而利用获得的单克隆抗体制备胶体金免疫层析试纸条。以纯化的单克隆抗体3G9作为金标抗体,4F6（0.8mg/ml）作为检测线,羊抗鼠IgG（1mg/ml）作为质控线组装试纸条。该试纸条能够检测到CPV的最低浓度为0.0062mg/mL,且与犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）、犬腺病毒Ⅱ型（CAV）等无交叉反应。最后用组装的试纸条和PCR技术对30份疑似CPV感染的临床样品进行检测。结果显示,两者间的阳性符合率为92.3%（24/26）,阴性符合率为100%（4/4）,故总的符合率为93.3%[（24+4）/30]。该结果表明,本研究制备的胶体金免疫层析试纸条能够快速、特异地检测临床样本中的CPV,可初步应用于CPVD的诊断中。综上所述,本研究成功制备了三株效价高且特异性好的抗CPV的单克隆抗体,并利用单克隆抗体制备了胶体金免疫层析试纸条,该试纸条具有敏感、特异、快速、简便等特点,与PCR技术相比具有较高的符合率,为我国CPV的诊断及免疫预防提供技术手段。
马振乾[5]（2019）在《猪瘟免疫群抗体与病毒变异监测及病毒亚单位疫苗的免疫效果评价》文中研究表明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、败血性的高度接触性传染病,为国家法定的一类动物疫病和OIE通报性疫病之一,严重影响养猪业健康发展。近年来发现,母猪感染后呈现繁殖障碍、流产和产死胎和弱胎,有些早产仔猪呈持续性感染和先天性震颤。目前,国内应用猪瘟疫苗控制猪瘟虽然取得了很大成效,但是免疫猪群依然时常存有猪瘟的发生与流行。造成免疫猪群发生猪瘟的原因比较复杂,其中免疫程序不尽合理、疫苗质量存在问题,尤其是对免疫猪群免疫效果缺乏监测与追踪是导致猪瘟时常发生的主要原因。因此,及时跟踪与监测猪瘟免疫猪群的抗体水平,确定猪群的猪瘟疫苗免疫效果及猪瘟病毒的感染情况,发现猪瘟病毒流行毒株的遗传变异趋势,将为有效防控猪瘟的发生与流行提供有效的理论依据。本研究应用免疫学、分子生物学和病毒学等技术手段对我国2015-2017年部分地区猪瘟疫苗免疫猪群的抗体水平、猪瘟病毒的感染情况及猪瘟病毒的遗传变异进行了研究,并对猪瘟基因工程亚单位疫苗的免疫效果进行了监测与分析。同时对国内近年来新发的仔猪非典型瘟病毒感染进行了初步研究,取得了如下主要结果。一、应用ELISA方法对采自国内26个省、直辖市和自治区的2009个不同规模的养猪场共计48731份猪瘟疫苗免疫血清进行了抗体检测,结果发现在2015-2017年期间,各区域样品猪瘟抗体阳性率在68.30%82.94%之间,平均阻断率在55.60%65.60%之间;不同生长阶段猪群的猪瘟抗体监测结果显示,种猪群（后备母猪、公猪和母猪）抗体水平最好,其阳性率在79.92%88.93%之间,平均阻断率在62.48%71.55%之间;保育阶段的猪群抗体水平最差,猪瘟抗体阳性率在48.19%57.41%之间,平均阻断率在41.34%46.84%之间。在2015-2017年间,每年采集的样品猪瘟抗体平均阻断率在50.00%90.00%之间的数量所占比例都最高,在57.14%62.12%之间;采集于不同月份及年份的样品,其猪瘟抗体水平监测结果显示没有明显的变化规律。二、对采集的3069份病料应用RT-PCR方法进行猪瘟病毒核苷酸序列检测,结果表明,2016年猪瘟阳性率最高为16.40%,其次为2015年,猪瘟阳性率为13.30%,2017年猪瘟阳性率最低,为12.80%。比较采自各季度样品的猪瘟病毒检测结果,显示第二季度猪瘟病毒的检出率最高,为14.80%24.40%。对猪群猪瘟病毒及其他三种常见病毒混感进行了检测,结果显示混合感染的比例为0.98%9.24%,其中,与猪繁殖障碍与呼吸道综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）混感比例最高,在6.70%9.24%之间,与猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）混合感染比例最低,在0.98%1.20%之间。三、应用RT-PCR技术,对采自山东和河南的18株猪瘟流行毒株进行分子生物学分析,结果发现这18株毒株与国内外参考毒株E2核苷酸同源性在79.7%99.0%之间,与标准毒株Shimen株E2核苷酸同源性在81.0%94.7%之间,其中SD11株与疫苗毒株E2核苷酸同源性最低为79.9%,SD05株与疫苗毒株E2核苷酸同源性最高为99.2%。18株毒株E2基因推导的氨基酸与参考毒株氨基酸序列同源性在50.2%98.5%之间,与标准毒株Shimen株氨基酸序列同源性在52.1%86.9%之间,与疫苗毒株C株氨基酸序列同源性在52.1%97.7%之间,其中SD10株与疫苗毒株氨基酸序列同源性最低,HN02株与疫苗毒株氨基酸序列同源性最高。病毒序列与进化树分析发现,分离的18株流行毒株主要属于1.1亚群和2.1亚群,但以2.1亚群为主,且2.1b为优势流行毒株,占到72.22%,这表明我国猪瘟流行毒株存在遗传变异多样性。四、应用分子生物学等技术方法对河南省规模化猪场近年发生的临床上以新生仔猪震颤为主要特征的疫病进行了研究,结果从发病猪群检测出非典型瘟病毒的基因序列。扩增与测定的病毒基因序列与GenBank中的现有非典型瘟病毒进行比对分析,发现该非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus,APPV）毒株（Xuchang2018）与国外APPV分离株同源性在89.5%94.2%之间,其中与美国USA2013株同源性最高为94.2%;而与国内江西分离的七个APPV毒株的同源性最高,在90.2%97.6%之间;与国内广东三个分离株的同源性相对较低,在85.4%86.3%之间。苏木素伊红染色显示,发病猪小脑白质中有大量的空泡变性,小脑中的髓磷脂含量减少,感染动物的脑部血管周围的局部神经胶质细胞有显着的减少。本研究确定出河南省猪群存在APPV感染,该结果为本地区本病的防控打下了基础。五、对猪瘟基因工程亚单位疫苗与传统猪瘟弱毒活疫苗进行对比试验,确定了基因工程亚单位疫苗抗体维持时间。选择400头仔猪,随机分为试验组（猪瘟亚单位疫苗）与对照组（细胞苗）,每组200头仔猪,分别在免疫后0天、30天、60天、90天、125天,即30日龄、60日龄、90日龄、120日龄和155日龄进行采样,每组每次随机采血10份;试验组仔猪在30日龄颈部肌肉注射1头份猪瘟基因工程亚单位疫苗,对照组仔猪分别在30日龄和60日龄颈部肌肉注射各1头份高效猪瘟弱毒活疫苗。结果发现,试验组猪瘟抗体水平在免疫后90天达到最高,阻断率达到88.23%,随后开始下降,但155日龄仍处于较高水平,维持时间较长,并且受猪繁殖障碍与呼吸道综合征影响较小。
刘珊珊[6]（2019）在《抗牛PD-1抗体制备及PD-1多抗阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响》文中提出牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）可感染世界范围内的反刍动物,每年可造成约20亿美元的经济损失。BVDV主要在淋巴细胞群中复制,导致动物体内白细胞的数量严重减少,引起免疫抑制,并且淋巴细胞衰竭程度与BVDV毒株的毒力有关,具有可逆性。已知程序性细胞死亡蛋白-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）参与机体外周免疫耐受和抗原特异性免疫抑制,导致T细胞耗尽。PD-1在慢性病毒感染的T细胞上高度表达,并且阻断PD-1与PD-L1的结合,能够恢复T细胞功能。然而在BVDV急性感染期间,阻断PD-1/PD-L1途径是否可以恢复淋巴细胞的水平尚不明确。本研究通过克隆表达牛PD-1胞外区蛋白,制备多抗和单克隆抗体,确定抗体阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响。首先,本研究通过PCR技术克隆牛PD-1胞外区基因,插入pET-28a原核表达载体,构建重组质粒pET-28a-PD-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,SDS-PAGE和Western-blot检测IPTG诱导的蛋白表达情况。结果表明,序列比对发现与NCBI上发布的牛PD-1序列同源性为100%,成功构建了牛pET-28a-PD-1重组质粒。在37℃、0.8 mmol·L-1IPTG条件下诱导获得大量约19 kDa牛PD-1蛋白,能够与抗His标签的单克隆抗体反应,具有良好的反应原性。其次,纯化牛PD-1重组蛋白与等量弗氏佐剂乳化制备免疫原,免疫BALB/C小鼠制备抗牛PD-1多抗。分离牛PBL细胞,体外感染CP和NCP型BVDV,加入多抗阻断PD-1/PD-L1通路,检测BVDV病毒拷贝数、淋巴细胞增殖和凋亡情况。结果表明,牛PD-1多抗能够识别牛PD-1胞外区蛋白,PD-1多抗阻断恢复了淋巴细胞增殖,抑制细胞凋亡,降低了BVDV病毒拷贝数。多抗阻断对CP型BVDV感染诱导的细胞增殖比NCP型具有更显着的恢复作用。最后,应用杂交瘤细胞融合技术制备牛PD-1单克隆抗体,通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,使用SDS-PAGE、ELISA、蛋白印迹和间接免疫荧光检测抗牛PD-1单克隆抗体的效价和特异性。结果表明,单克隆抗体效价达到1:26,并且获得的单克隆抗体能够识别外源性牛PD-1蛋白。综上所述,成功获得了牛PD-1胞外区重组蛋白,研制了针对牛PD-1胞外区的多克隆抗体和单克隆抗体,证实了抗牛PD-1多抗阻断能够恢复BVDV体外感染淋巴细胞的增殖能力,减少了细胞凋亡,提高了淋巴细胞清除BVDV病毒的能力,为探索PD-1抗体在急性BVDV感染中的作用机制奠定了基础。
高斌[7]（2019）在《猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备》文中认为猪圆环病毒3型（porcine circovirus 3,PCV-3）是近些年发现的一种新型猪圆环病毒,在临床上能引起猪的多种疾病,给世界养猪业造成严重危害和巨大损失。现今,世界各国对PCV-3的研究尚处于起步阶段,检测方法还局限在分子生物学水平,尚无大规模诊断和预防PCV-3的方法,导致了商品化ELISA检测试剂盒和疫苗的缺口,因此各国研究学者正加紧针对PCV-3的进一步研究。目前报道表明,PCV-3 ORF2序列编码的重要结构蛋白Cap具有良好的免疫原性,能够诱导免疫反应,用其作为抗原研制ELISA检测试剂盒,有利于区分在临床症状上相似的PCV-3、PCV-2、PNDS等疾病,方便对规模化猪场进行PCV-3的大量检测和流行病学调查。为高效表达PCV-3 Cap蛋白,本研究以PCV-3 ORF2序列为模板,先对其序列上的稀有密码子进行简单优化（上海生工）,针对优化后序列设计引物,扩增出625bp大小的目的片段,与带有His标签的pET-28a载体质粒分别进行酶切后连接成为重组质粒,转化到大肠杆菌表达菌株中,挑取阳性菌落,经酶切鉴定和测序验证后诱导表达,经SDS-Page和Western Blot验证表明ORF2基因在大肠杆菌终得以表达,目的蛋白大小为27kD左右。但因其表达量低,于是通过对序列上的稀有密码子定点突变为最佳密码子并截掉前端重复氨基酸序列,重新诱导表达,目的蛋白表达量得以大幅提升,经包涵体蛋白处理、亲和层析纯化和切胶纯化步骤,获得高纯度、高浓度目的蛋白。对上述纯化后的蛋白进行复性,经胶体金免疫印记实验验证,通过负染后透射电镜下观察,可见有“透明”高亮的圆形物质存在,大小在17nm20nm左右,和PCV-3病毒粒子的大小形态相吻合,判断其为PCV-3病毒样粒子,表明通过透析法蛋白得以成功复性。以复性后蛋白为免疫原制备抗原,经3次免疫实验动物兔,得到含多克隆抗体的血清,以血清作为一抗,经Western Blot和ELISA方法鉴定,证实血清中的多克隆抗体具有良好特异性。本试验从分子生物学、形态学和血清学角度上研究证实了PCV-3 Cap蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,制备的多抗具有良好特异性,为制备PCV-3 ELISA检测试剂盒奠定基础。
邵雨[8]（2019）在《H9亚型禽流感病毒和鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制与初步应用》文中研究指明H9亚型禽流感（Avian influenza,AI）和鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）感染是危害养禽业的重要呼吸道传染病,鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等多种禽类均可感染。疫苗免疫是防控H9亚型禽流感发生与流行的主要手段,而鸡毒支原体病的防控,只有部分种鸡场使用疫苗。因此,血清学检测对于感染后的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平定量检测尤其重要。传统的血清学方法,一般需要专业人员操作,步骤繁琐,耗时长。胶体金检测操作简单,快速,成本低,无需专业的技术人员和昂贵的设备,可以在基层广泛应用。本实验室筛选获得了一株小鼠抗多种禽类IgY Fc片段的单抗,该单抗能与鸡、鸭、鹅等多种禽类血清反应,为建立一种能检测多种禽类血清抗体的胶体金试纸条方法奠定了基础。同时结合免疫定量速测仪的信号识别,建立了定量检测方法。本研究分别制备了一种适用于多种禽类H9亚型禽流感病毒抗体定量检测胶体金试纸条和一种适用于多种禽类鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条,既可定性检测,用于未免疫禽类鸡毒支原体感染后的快速诊断;也可定量检测,用于疫苗免疫后的抗体水平监测。主要研究结果如下:1.H9亚型禽流感病毒HA1蛋白、鸡毒支原体vlhA1.2蛋白的原核表达与纯化构建了H9亚型禽流感病毒HA1蛋白、鸡毒支原体vlhA1.2蛋白的重组原核表达质粒,分别在大肠杆菌中进行了诱导表达并纯化蛋白,其重组蛋白大小分别为61KDa和92KDa,Western Blot检测表明两种蛋白均具有良好的反应原性。2.抗多种禽类IgY Fc片段单克隆抗体的制备与纯化复苏抗多种禽类IgY Fc片段单克隆抗体生产杂交瘤细胞株10A1,注射小鼠,产生腹水,经辛酸-硫酸铵法纯化,获得了高纯度、高活性的鼠抗多种禽类IgY Fc片段单克隆抗体。3.H9亚型禽流感病毒抗体定量检测胶体金试纸条的研制与初步应用利用间接法制备了H9亚型AIV抗体定量检测胶体金试纸条。胶体金标记抗多种禽类IgY Fc片段单克隆抗体,确定最佳标记量为9μg McAb/mL胶体金,最佳标记pH为每毫升胶体金加入8μL 0.1mol/L K2CO3溶液。试纸条最佳反应体系为:吸水垫H5073,金标垫Fusion4,样品垫Ahlstrom8964,包被液PB缓冲液（pH7.2）+3%甲醇,样品垫封闭液四硼酸钠缓冲液（pH9.0）作为基础液,C线包被羊抗鼠IgG（0.5mg/mL）,T线包被AIV-HA19蛋白（0.8mg/mL）,金标抗体的喷量为6μL/cm。该试纸条与禽的其它重要病原阳性血清无交叉反应,特异性强;结合胶体金免疫定量速测仪,以HI效价为X轴,以（T/C）信号比值为Y轴,建立了标准曲线方程y=0.3784x-0.7239,相关系数R2为0.9877,检测限为3log2;批内和批间变异系数均小于10%;在4℃至少保存半年;与HI试验对比,对已免疫过的鸡、鸭、鹅临床血清样品,进行定量检测符合率为81.78%,表明本试纸条可用于多种禽类临床样品的定量检测。4.鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制与初步应用用于定性和定量检测的MG抗体检测胶体金试纸条,确立的最佳反应体系为:吸水垫H5073,金标垫Fusion4,样品垫Ahlstrom8964,包被液PBS缓冲液（pH7.4）+3%甲醇,样品垫封闭液PB缓冲液（pH6.0）作为基础液,C线包被羊抗鼠IgG（0.5mg/mL）,T线包被MG-vlhA1.2蛋白（0.6mg/mL）,金标抗体的喷量为7μL/cm。该试纸条与禽的其它重要病原阳性血清无交叉反应,特异性强;结合胶体金免疫定量速测仪,以SPA效价为X轴,以（T/C）信号比值为Y轴,建立了标准曲线方程y=0.3325x+1.0681,相关系数R2为0.9938,检测限为1:2-2,灵敏度比SPA法高8倍;批内和批间变异系数均小于10%;在4℃至少保存半年;与SPA检测对比,对未免疫的鸡、鸭、鹅临床血清样品进行定性检测符合率分别为80.58%、85.48%、83.72%;对已免疫的种鸡临床血清样品进行定量检测符合率为85.38%,表明本试纸条可用于禽类MG感染后的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平定量检测。
刘燕[9]（2019）在《交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究说明鸭甲型肝炎（Duck hepatitis A,DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,可引起雏鸭的急性、高度致死性的传染病。根据其基因序列的差异,分为三个基因型（DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C）,目前我国主要流行DHAV-A和DHAV-C,两种基因型病毒缺乏有效的交叉中和作用,严重影响本病的防控。研究表明,针对保守中和抗原表位的广谱中和抗体是应对这种情况的新策略。本研究拟针对DHAV-A和DHAV-C共同保护性抗原的保守序列研制单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,进而筛选出针对这两种基因型DHAV的广谱中和抗体,取得如下成果:1研制出与DHAV-A和DHAV-C具有交叉反应性的单克隆抗体根据DHAV-A和DHAV-C的VP1蛋白共有的氨基酸序列,利用生物信息学软件设计筛选出评分最高的12条长度为14肽的抗原表位,人工合成各肽段,分别与KLH载体蛋白偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb,获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA检测结果显示,其中6株McAb（C1、C4、C7、C12、C13、C16）同时与DHAV-A和DHAV-C发生交叉反应,而不与鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒（AIV）反应,为广谱中和McAb的筛选奠定了基础。2筛选出具有交叉中和活性的单克隆抗体2.1 McAb在鸭胚中的交叉中和活性为评价McAb的中和活性,将具有交叉反应性McAb分别与200ELD50DHAV-A和DHAV-C等体积混,接种12日龄SPF鸭胚绒毛尿囊腔,0.2mL/胚,进行中和试验,每个处理组5枚鸭胚,以鸭β-actin基因作为内参,采用Real-time PCR方法测定病毒荷载量,用2-△△CT法进行相对定量,评价6株具有交叉反应性的McAb对DHAV-A和DHAV-C的在鸭胚上的中和活性,并测定其中和效价。结果显示,6株McAb对DHAV-A和DHAV-C增殖的抑制率依次为:C1（84.4%&82.69%）、C4（90.79%&75.34%）、C7（86.23%&99.83%）、C12（14.74%&25.26%）、C13（38.87%&2.06%）和C16（99.61%&100%）。鸭胚中和试验结果中,6株McAb对DHAV-A、DHAV-C的中和效价分别为:C1（1:3&1:5）、C4（1:3&1:3）、C7（1:10&1:11）、C12（0&0）、C13（0&0）和C16（1:9&1:9）。据此筛选出4株（C1、C4、C7、C16）具有交叉中和活性的McAb。2.2 McAb对雏鸭的预防效果为了解4株对DHAV-A、DHAV-C具有交叉中和活性McAbs对雏鸭的交叉预防效果,1日龄雏鸭分组肌肉注射McAb,1mL/只,24 h后分别肌注DHAV-A、DHAV-C,100ELD50/只,每个处理组5只雏鸭。结果显示,4株McAb对DHAV-A、DHAV-C的保护率分别为:C1（30%&40%）、C4（40%&40%）、C7（70%&80%）、C16（100%&60%）。本研究结果显示,4株McAbs对两种不同基因型毒株均具有不同程度的交叉预防效果,其中C7、C16对DHAV-A和DHAV-C的攻击具良好的交叉预防作用,保护率达60%以上。
朱光[10]（2019）在《猪流感病毒（H3N2）NP蛋白纳米抗体的制备及阻断ELISA方法的建立与评价》文中进行了进一步梳理猪流感是一种由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的猪的急性呼吸道疾病,其主要临床特征是发热、嗜睡、厌食症和鼻塞,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪流感病毒主要包括H1N1,H1N2和H3N2三个亚型。猪一旦感染,会迅速发病,且常与其他呼吸道病原体混合感染。目前,猪流感血清学诊断方法主要包括血凝抑制试验和ELISA,虽然血凝抑制试验是猪流感血清学诊断的标准方法,但该方法结果的判定存在主观性,而且不适宜大规模样品的检测。传统ELISA方法主要是基于多克隆抗体和单克隆抗体而建立的,但单克隆抗体的制备费时费力,且生产成本高,多克隆抗体存在特异性低的问题。纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势,并且可通过不同的表达系统获得,是一种良好的诊断和治疗工具。本研究应用原核表达系统表达SIV高度保守的核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）,并通过噬菌体展示技术筛选NP蛋白特异性纳米抗体,纳米抗体与生物素受体肽融合表达和纯化后,通过生物素受体肽与生物素的结合标记生物素,用生物素化的纳米抗体作为阻断抗体,建立了一种特异的,敏感的和重复性好的检测猪血清中流感抗体的阻断ELISA方法,主要结果如下:1:SIV-NP蛋白的表达和纯化将pET-32a-NP重组质粒转化至Rosetta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,获得可溶性表达的NP蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化后,与弗氏佐剂混合用于双峰驼的免疫。2:SIV-NP蛋白特异性纳米抗体的筛选第5次免疫后一周,采集双峰驼外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,通过巢式PCR扩增VHH基因,将VHH基因克隆至噬菌体载体pCANTAB 5E,并通过噬菌体展示技术淘选NP蛋白特异性的纳米抗体,三轮淘选后得到6株纳米抗体,亲和力验证试验结果表明,Nb5具有较高的亲和力。3:纳米抗体的生物素化在Nb5氨基酸序列的C端连接生物素受体肽（biotin acceptor peptide,BAP）,将基因序列克隆至pET-21b原核表达载体,并转化至E.coli BL21（DE3）IPTG诱导表达后得到以包涵体形式表达的Nb5-BAP融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化后进行透析,通过生物素标记试剂盒在体外将生物素标记在Nb5的C端受体肽上,标记完成后通过间接ELISA测得效价可达1:100000以上。4:阻断ELISA方法的建立与评价通过棋盘滴定ELISA确定最佳的抗原包被量为1μg/mL,1 mg/mL纳米抗体的最佳稀释比例为1:30000,血清的最佳稀释比例为1:10,同时用109份猪的阴性血清确定Cut-off值为29.8%,建立的阻断ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,而且与商品化试剂盒和Western blot具有较高的一致性。综上所述,本研究筛选到了SIV-NP蛋白特异性纳米抗体,其中用纳米抗体生物素化的Nb5作为阻断抗体,建立了一种检测猪血清中流感抗体的阻断ELISA方法,可用于检测猪血清中流感病毒抗体水平和评价疫苗免疫效果。
二、利用抗猪瘟病毒单克隆抗体鉴定瘟病毒株的抗原性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用抗猪瘟病毒单克隆抗体鉴定瘟病毒株的抗原性（论文提纲范文）
（1）小鹅瘟病毒流行病学调查及夹心ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 水禽细小病毒的研究进展 |
| 1. 小鹅瘟病毒的研究进展 |
| 1.1 小鹅瘟病毒流行病学 |
| 1.2 小鹅瘟病毒病原学 |
| 1.3 VP基因遗传进化 |
| 2. 新型小鹅瘟病毒的研究概况 |
| 3. 番鸭细小病毒的研究概况 |
| 4. GPV和MDPV重组之间的的关系 |
| 5. 小鹅瘟病毒的血清学检测方法 |
| 6. 单克隆抗体的研究进展 |
| 7. 血清学检测方法 |
| 7.1 酶联免疫吸附实验 |
| 8. 小鹅瘟病毒的防治 |
| 9. 研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 小鹅瘟病毒流行病学调查及VP基因遗传进化分析 |
| 前言 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、种胚、抗原与血清 |
| 1.2 病料采集 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 病毒的鉴定 |
| 2.3. 小鹅瘟病毒VP基因遗传进化分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 病毒分离与鉴定 |
| 3.2 VP基因遗传进化分析 |
| 4. VP基因重组分析 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立 |
| 前言 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、实验动物、细胞株、抗体 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV单克隆抗体的制备 |
| 3.2 针对GPV抗原夹心ELISA方法的建立 |
| 3.3 GPV VP3抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附表1 小鹅瘟病毒分离株背景信息 |
| 附表2 水禽细小病毒参考株背景信息 |
| 致谢 |
（2）抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 牛病毒性腹泻及单克隆抗体研究进展 |
| 一、BVDV研究进展 |
| 1 病毒形态及理化特性 |
| 2 病毒分子生物学 |
| 2.1 非编辑区 |
| 2.2 结构蛋白 |
| 2.3 非结构蛋白 |
| 二、BVDV检测方法研究进展 |
| 2.1 BVDV病原鉴定 |
| 2.2 免疫学检测技术 |
| 2.2.1 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.2.2 血清中和试验(VNT) |
| 2.2.3 琼脂扩散试验(AGP) |
| 2.2.4 免疫组化(IHC) |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.3 RT-PCR |
| 三、BVDV疫苗研究进展 |
| 3.1 弱毒活疫苗 |
| 3.2 灭活疫苗 |
| 3.3 亚单位疫苗 |
| 3.4 DNA疫苗 |
| 3.5 重组活载体疫苗 |
| 四、单克隆抗体技术研究进展 |
| 4.1 杂交瘤细胞融合技术 |
| 4.2 噬菌体展示抗体文库技术 |
| 4.3 单个B细胞抗体技术 |
| 第二章 BVDV Erns、E2全长基因克隆及序列生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种、载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.1.4 培养基及化学试剂 |
| 1.1.4.1 基础培养基 |
| 1.1.4.2 化学试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 BVDV增殖、鉴定 |
| 1.2.1.1 BVDV总RNA提取 |
| 1.2.1.2 BVDV RT-PCR鉴定 |
| 1.2.2 BVDV Erns、E2全长基因克隆 |
| 1.2.2.1 Erns全长基因扩增 |
| 1.2.2.2 E2全长基因扩增 |
| 1.2.3 Erns全长基因序列及其编码蛋白序列的生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 BVDV增殖 |
| 2.1.1 BVDV半数细胞感染量测定 |
| 2.2 BVDV RT-PCR鉴定 |
| 2.3 Erns、E2全长基因PCR扩增 |
| 2.3.1 Erns基因PCR产物及克隆 |
| 2.3.2 E2基因PCR产物及克隆 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.4.1 Erns生物学信息分析 |
| 2.4.2 E2全长生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Erns、E2蛋白免疫小鼠多克隆抗体效价分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 菌种、载体 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Erns截短基因表达载体构建 |
| 1.2.1.1 Erns截短基因引物设计 |
| 1.2.1.2 Erns基因原核表达载体构建 |
| 1.2.2 E2截短基因表达载体构建 |
| 1.2.2.1 E2截短基因引物设计 |
| 1.2.3 Erns、E2重组蛋白表达及纯化 |
| 1.2.3.1 重组蛋白表达验证 |
| 1.2.3.2 重组蛋白表达形式验证 |
| 1.2.3.3 重组蛋白大量表达及纯化 |
| 1.2.3.4 重组蛋白免疫小鼠 |
| 1.2.4 多克隆抗体鉴定 |
| 1.2.4.1 ELISA法测定抗体效价 |
| 1.2.4.2 Western blot |
| 1.2.4.3 免疫荧光鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET-30a-Erns重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 pET-30a-E2重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 原核表达产物分析 |
| 2.4 多克隆抗体效价测定 |
| 2.4.1 Erns、E2效价测定 |
| 2.4.2 Erns、E2多克隆抗体效价比较 |
| 2.5 多克隆抗体鉴定 |
| 2.5.1 Western blot |
| 2.5.2 免疫荧光鉴定 |
| 2.5.2.1 Erns免疫荧光组 |
| 2.5.2.2 E2免疫荧光组 |
| 3 讨论 |
| 第四章 抗BVDV Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 细胞、菌种 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 试验试剂 |
| 1.1.4.1 商品试剂 |
| 1.1.4.2 配制试剂 |
| 1.1.5 手术器械及其他材料处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 单克隆抗体免疫细胞制备 |
| 1.2.2 细胞融合方法 |
| 1.2.2.1 SP2/0 细胞培养 |
| 1.2.2.2 饲养细胞制备 |
| 1.2.2.3 小鼠脾细胞制备 |
| 1.2.2.4 细胞融合 |
| 1.2.3 BVDV抗原最佳包被量测定 |
| 1.2.4 单克隆抗体鉴定方法 |
| 1.2.4.1 细胞筛选 |
| 1.2.4.2 亚克隆 |
| 1.2.4.3 单克隆抗体腹水制备 |
| 1.2.4.4 单克隆抗体生物学特性鉴定 |
| 1.2.4.4.1 抗体效价测定 |
| 1.2.4.4.2 抗体大小鉴定 |
| 1.2.4.4.3 抗体特异性鉴定 |
| 1.2.4.4.4 抗体结合能力 |
| 1.2.4.4.5 抗体亚型测定 |
| 2 结果 |
| 2.3.1 Erns重组蛋白免疫小鼠效价测定 |
| 2.3.1.1 试验小鼠血清多克隆抗体效价比较 |
| 2.3.2 病毒抗原最佳包被量测定 |
| 2.3.3 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 2.3.3.1 显微镜观察杂交瘤细胞生长 |
| 2.3.3.2 杂交瘤细胞上清效价测定 |
| 2.3.3.3 杂交瘤细胞孔效价重复测定 |
| 2.3.4 亚克隆筛选 |
| 2.3.4.1 纯化杂交瘤细胞簇生长状况 |
| 2.3.4.2 杂交瘤细胞扩大培养 |
| 2.3.5 单克隆抗体生物学特性鉴定 |
| 2.3.5.1 腹水单克隆抗体效价测定 |
| 2.3.5.2 腹水抗体大小鉴定 |
| 2.3.5.3 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 2.3.5.4 腹水抗体鉴定 |
| 2.3.5.4.1 间接免疫荧光检测 |
| 2.3.5.4.2 Western Blot 检测 |
| 2.3.5.4.3 腹水抗体特异性测定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻病毒研究进展 |
| 1.1 BVDV病原学概述 |
| 1.2 BVDV分子特征 |
| 1.3 BVDV生命周期 |
| 1.4 BVDV与宿主相互作用 |
| 1.4.1 宿主模式识别受体 |
| 1.4.2 BVDV感染对天然免疫细胞的影响 |
| 1.4.3 BVDV感染对细胞因子的影响 |
| 1.4.4 BVDV感染与细胞凋亡 |
| 1.4.5 BVDV感染与免疫逃逸 |
| 第二章 Mx蛋白及其抗病毒感染研究进展 |
| 2.1 Mx蛋白的结构 |
| 2.2 Mx蛋白抗病毒感染机制 |
| 2.2.1 Mx蛋白抗流感病毒感染机制 |
| 2.2.2 Mx蛋白抗弹状病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.3 Mx蛋白抗布尼亚病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.4 Mx蛋白抗副黏病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.5 Mx蛋白抗黄病毒科病毒感染机制 |
| 2.2.6 Mx蛋白抗其他病毒感染机制 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 细胞、菌毒种和主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 细胞的培养与传代 |
| 3.2.3 RNA提取及c DNA合成 |
| 3.2.4 PCR鉴定 |
| 3.2.5 病毒的分离 |
| 3.2.6 间接免疫荧光法鉴定BVDV |
| 3.2.7 病毒粒子的形态学观察 |
| 3.2.8 TCID50效价测定 |
| 3.2.9 病毒基因型的鉴定 |
| 3.2.10 全基因组序列测序及分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 血清样品RT-PCR检测 |
| 3.3.2 BVDV毒株的分离 |
| 3.3.3 间接免疫荧光法鉴定BVDV |
| 3.3.4 病毒粒子的形态学观察 |
| 3.3.5 TCID50效价测定 |
| 3.3.6 病毒基因型的鉴定 |
| 3.3.7 全基因组序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 BVDV感染MDBK细胞前后的转录组学测定及差异分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 BVDV BJ-2016株的增殖与特征 |
| 4.2.2 转录组测序 |
| 4.2.3 数据处理与评价 |
| 4.2.4 基因表达差异分析 |
| 4.2.5 差异表达基因富集分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BVDV BJ-2016株生长特征 |
| 4.3.2 RNA提取与质量评估 |
| 4.3.3 数据处理与评价 |
| 4.3.4 基因表达差异分析 |
| 4.3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 4.3.6 差异表达基因KEGG Pathway富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛Mx1蛋白对BVDV复制的抑制作用研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、菌毒种和主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 BVDV链特异性荧光定量PCR方法的建立 |
| 5.2.3 牛Mx1基因的克隆 |
| 5.2.4 牛Mx1基因稳定过表达细胞系的构建及鉴定 |
| 5.2.5 Mx1基因稳定敲低细胞系的构建及鉴定 |
| 5.2.6 Western blot |
| 5.2.7 Mx1基因过表达对BVDV复制的影响 |
| 5.2.8 Mx1基因敲低对BVDV复制的影响 |
| 5.2.9 牛Mx1蛋白与BVDV蛋白相互作用验证 |
| 5.2.10 数据统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BVDV链特异性RT-qPCR方法的建立 |
| 5.3.2 牛Mx1基因克隆及表达鉴定 |
| 5.3.3 Mx1基因稳定过表达细胞系的构建及鉴定 |
| 5.3.4 Mx1基因敲低细胞系的构建及鉴定 |
| 5.3.5 Mx1基因过表达对BVDV复制的影响 |
| 5.3.6 Mx1基因敲低对BVDV复制的影响 |
| 5.3.7 免疫共沉淀验证牛Mx蛋白与BVDV蛋白 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）犬细小病毒胶体金试纸条的研制及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 犬细小病毒概况 |
| 1.1.1 CPV的病原特性 |
| 1.1.2 CPV的基因组结构与功能 |
| 1.1.3 CPV的流行病学 |
| 1.1.4 CPV的致病机理 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 CPV的防治 |
| 1.2 胶体金免疫层析技术 |
| 1.2.1 胶体金免疫层析技术简介 |
| 1.2.2 胶体金技术的优缺点 |
| 1.2.3 胶体金技术的应用 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 第二章 犬细小病毒单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 动物、细胞及病毒株 |
| 2.1.2 主要材料与试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 抗原的制备 |
| 2.1.5 动物免疫 |
| 2.1.6 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.1.7 细胞融合 |
| 2.1.8 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.1.9 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.1.10 单克隆抗体腹水的制备及纯化 |
| 2.1.11 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.2.2 杂交瘤细胞株的获得 |
| 2.2.3 腹水纯化的鉴定 |
| 2.2.4 MAb效价测定 |
| 2.2.5 染色体计数结果 |
| 2.2.6 MAb的 IFA鉴定 |
| 2.2.7 MAb的中和活性鉴定 |
| 2.2.8 MAb的病毒蛋白识别分析 |
| 2.2.9 MAb的稳定性及交叉反应性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 犬细小病毒胶体金试纸条的研制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胶体金试纸条组装用材料 |
| 3.1.2 溶液配制 |
| 3.1.3 单克隆抗体的胶体金标记 |
| 3.1.4 金标单抗重悬液的选择 |
| 3.1.5 金标单抗稀释度的确定 |
| 3.1.6 检测线抗体蛋白包被浓度的确定 |
| 3.1.7 质控线抗体蛋白包被浓度的确定 |
| 3.1.8 封闭液的选择 |
| 3.1.9 试纸条的组装和结果判定 |
| 3.1.10 胶体金试纸条的性能评价试验 |
| 3.1.11 样品检测 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 胶体金标记抗体最低稳定量的测定 |
| 3.2.2 胶体金标记抗体的最适pH的测定 |
| 3.2.3 金标抗体重悬液的确定 |
| 3.2.4 金标单抗浓度的确定 |
| 3.2.5 检测线、质控线蛋白包被浓度的确定 |
| 3.2.6 封闭液的选择 |
| 3.2.7 试纸条的敏感性鉴定结果 |
| 3.2.8 试纸条的特异性鉴定结果 |
| 3.2.9 试纸条的稳定性鉴定结果 |
| 3.2.10 样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）猪瘟免疫群抗体与病毒变异监测及病毒亚单位疫苗的免疫效果评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟(CSFV)流行情况概述 |
| 1.1.1 国外猪瘟流行情况 |
| 1.1.2 国内猪瘟流行情况 |
| 1.2 CSFV特征与变异 |
| 1.2.1 CSFV生物学特性 |
| 1.2.2 CSFV基因组结构及功能 |
| 1.2.3 我国CSFV遗传变异多样性 |
| 1.3 猪非典型瘟病毒 |
| 1.3.1 CT类型 |
| 1.3.2 APPV流行情况 |
| 1.3.3 临床症状及病理变化 |
| 1.3.4 防治措施 |
| 1.4 猪瘟疫苗研究进展 |
| 1.4.1 核酸疫苗 |
| 1.4.2 基因缺失疫苗 |
| 1.4.3 活载体疫苗 |
| 1.4.4 基因工程亚单位技术 |
| 1.5 CSFV实验室检测方法研究进展 |
| 1.5.1 血清学检测 |
| 1.5.2 分子生物学检测 |
| 1.6 猪瘟防控技术与策略展望 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 第2章 2015-2017 年国内猪场猪瘟抗体监测与初步分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 调查猪场数量及区域分布 |
| 2.2.2 调查猪场不同规模数量 |
| 2.2.3 国内调查猪场各区域样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.2.4 调查猪场不同生产阶段样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.2.5 调查猪场样品猪瘟抗体平均阻断率各水平比例结果 |
| 2.2.6 调查猪场不同月份样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.2.7 调查猪场不同年份样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 调查猪场不同区域样品猪瘟抗体监测分析 |
| 2.3.2 调查猪场不同生产阶段样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.3.3 调查猪场不同月份样品猪瘟抗体监测结果 |
| 2.3.4 调查猪场不同年份样品猪瘟抗体水平及各水平比例监测结果分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 国内猪瘟病毒感染调查与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 2015 -2017 年猪瘟病毒感染率 |
| 3.2.3 猪瘟病毒感染季度阳性率 |
| 3.2.4 猪瘟病毒与常见病毒性疾病混感比例 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 猪瘟病毒感染情况 |
| 3.3.2 猪瘟病毒与其他病毒混合感染情况 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 山东和河南两地流行的猪瘟病毒E2基因遗传变异分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病料来源 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 病料核酸纯化 |
| 4.1.5 E2 基因RT-PCR扩增 |
| 4.1.6 E2 基因序列分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 E2 基因RT-PCR结果 |
| 4.2.2 E2 基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析 |
| 4.2.3 E2 基因遗传进化关系分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 猪瘟野毒E2 基因遗传变异分析 |
| 4.3.2 18 株流行毒株E2 基因遗传变异分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 非典型瘟病毒初步鉴定分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 临床症状及剖检症状 |
| 5.2.2 组织病理切片结果 |
| 5.2.3 RT-PCR结果 |
| 5.2.4 序列结果分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 猪瘟基因工程亚单位疫苗与猪瘟弱毒活疫苗的免疫效果评价 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 猪瘟抗体结果 |
| 6.2.2 猪繁殖与呼吸综合征抗体结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 猪瘟抗体变化 |
| 6.3.2 猪繁殖与呼吸综合征对猪瘟抗体的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及攻读学位期间发表的学术成果 |
| 致谢 |
（6）抗牛PD-1抗体制备及PD-1多抗阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 分布与危害 |
| 1.2.2 BVDV种属和分型 |
| 1.2.3 流行病学 |
| 1.2.4 临床症状 |
| 1.2.4.1 BVDV急性感染 |
| 1.2.4.2 BVDV持续性感染 |
| 1.2.5 BVDV与机体免疫应答 |
| 1.3 程序性细胞死亡蛋白-1的概述 |
| 1.3.1 PD-1/PD-L1 蛋白生物学特性 |
| 1.3.2 PD-1/PD-L1 通路研究进展 |
| 1.3.2.1 PD-1 在病毒感染中的作用 |
| 1.3.2.2 PD-1 在肿瘤免疫中的作用 |
| 1.3.3 抗PD-1/PD-L1 抗体的应用价值 |
| 1.3.3.1 抗PD-1/PD-L1 抗体产品的临床应用 |
| 1.3.3.2 抗PD-1/PD-L1 抗体的抗病毒感染治疗 |
| 1.3.4 兽用抗PD-1/PD-L1 抗体的研究与应用 |
| 1.4 展望 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 牛外周血淋巴细胞PD-1 胞外区蛋白的原核表达及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体和细胞 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因片段的扩增与纯化 |
| 2.2.2 牛PD-1 胞外区基因片段与PMD18-T克隆载体连接 |
| 2.2.3 构建牛PET-28A(+)-PD-1 原核表达载体 |
| 2.2.4 牛PD-1 胞外区蛋白的表达及可溶性分析 |
| 2.2.5 牛PD-1 胞外区蛋白WESTERN-BLOT鉴定 |
| 2.2.6 牛PD-1 胞外区蛋白纯化 |
| 2.2.7 牛PD-1 胞外区蛋白的复性和浓缩 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 牛PD-1 胞外区基因的PCR鉴定及序列分析 |
| 2.3.2 PMD18-T-PD-1 重组克隆质粒的构建 |
| 2.3.3 牛PD-1 胞外区的生物信息学分析 |
| 2.3.3.1 牛PD-1 胞外区的理化性质 |
| 2.3.3.2 氨基酸的组成和疏水性分析 |
| 2.3.3.3 氨基酸的磷酸化位点分析 |
| 2.3.3.4 牛PD-1 胞外区蛋白的高级结构预测 |
| 2.3.4 PET-28A(+)-PD-1 重组表达质粒的构建 |
| 2.3.5 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白的表达及可溶性分析 |
| 2.3.6 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白的纯化与WESTERN BLOT鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 抗PD-1 多抗阻断对BVDV感染的外周血淋巴细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 牛PD-1 胞外区重组蛋白多抗的制备和鉴定 |
| 3.2.2 Q-PCR检测病毒拷贝数 |
| 3.2.2.1 BVDV Q-PCR标准品的制备 |
| 3.2.2.2 BVDV标准曲线的建立 |
| 3.2.2.3 BVDV拷贝数检测 |
| 3.2.3 CCK-8 细胞增殖检测 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白多抗效价检测 |
| 3.3.2 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白多抗抗原性检测 |
| 3.3.3 BVDV标准曲线的建立及BVDV病毒量检测 |
| 3.3.4 CCK-8 细胞增殖检测淋巴细胞活性 |
| 3.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 抗牛PD-1 胞外区蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞和动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备和免疫动物 |
| 4.2.2 小鼠血清抗体效价检测 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞SP2/0 的扩增培养 |
| 4.2.4 饲细胞的制备 |
| 4.2.5 细胞融合 |
| 4.2.6 单抗的杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.2.7 杂交瘤上清单抗效价的测定 |
| 4.2.8 单克隆抗体鉴定 |
| 4.2.8.1 杂交瘤上清WESTERN-BLOT检测 |
| 4.2.8.2 牛PD-1 全长基因的克隆 |
| 4.2.8.3 牛PD-1-PCDNA-3.1(+)重组质粒构建 |
| 4.2.8.4 牛PD-1-PCDNA-3.1(+)重组质粒转染CHO细胞 |
| 4.2.8.5 细胞间接免疫荧光检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 小鼠血清抗体效价检测 |
| 4.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.3 杂交瘤细胞上清单抗SDS-PAGE检测 |
| 4.3.4 杂交瘤上清单抗WESTERN-BLOT检测 |
| 4.3.5 牛PD-1 全长基因的克隆 |
| 4.3.6 牛PD-1-PCDNA-3.1(+)重组质粒鉴定 |
| 4.3.7 细胞间接免疫荧光检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（7）猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪圆环病毒概述 |
| 1.1.1 猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV) |
| 1.1.2 猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease, PCVD) |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 历史背景 |
| 1.2.2 研究现状 |
| 1.3 猪圆环病毒3型的病原学 |
| 1.3.1 形态特征及理化学特性 |
| 1.3.2 基因组结构与功能 |
| 1.3.3 培养特性 |
| 1.4 猪圆环病毒3型的流行病学 |
| 1.5 猪圆环病毒3型的病理特征 |
| 1.5.1 临床症状 |
| 1.5.2 病理变化 |
| 1.6 猪圆环病毒3型的诊断方法 |
| 1.6.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.6.2 分子生物学检测方法 |
| 1.7 猪圆环病毒3型的防治措施 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PCV-3 Cap蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 猪圆环病毒3型的阳性病料 |
| 2.1.2 所用载体和菌株 |
| 2.1.3 主要的药品、试剂及其生产厂家 |
| 2.1.4 试剂配方 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 序列突变和引物的设计 |
| 2.2.2 目的基因的扩增 |
| 2.2.4 PCR产物的鉴定、回收和双酶切 |
| 2.2.5 原核表达载体的获取和双酶切 |
| 2.2.6 目的片段和载体质粒的连接 |
| 2.2.7 转化 |
| 2.2.8 重组蛋白的表达和鉴定 |
| 2.2.9 重组蛋白的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 序列突变和引物的设计 |
| 2.3.2 PCR扩增结果 |
| 2.3.3 重组质粒酶切鉴定和PCR鉴定 |
| 2.3.4 重组表达质粒菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.5 PCV-3 ORF2生工测序结果 |
| 2.3.6 重组蛋白表达后鉴定 |
| 2.3.7 包涵体蛋白的判断和处理 |
| 2.3.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物和实验所需抗原 |
| 3.1.2 主要药品、试剂及其生产厂家 |
| 3.1.3 试剂配方 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 蛋白的复性 |
| 3.2.2 胶体金免疫印记实验 |
| 3.2.3 病毒粒子观察-负染电镜观察(TEM) |
| 3.2.4 抗原的制备 |
| 3.2.5 动物免疫 |
| 3.2.6 血清收集 |
| 3.2.7 抗体鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金免疫印记实验 |
| 3.3.2 负染电镜观察 |
| 3.3.3 Western Blot鉴定 |
| 3.3.4 ELISA检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）H9亚型禽流感病毒和鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 低致病性禽流感的研究进展 |
| 2.1 低致病性禽流感概述 |
| 2.2 检测方法的研究进展 |
| 2.2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 血清学检测方法 |
| 2.2.3 分子生物学诊断方法 |
| 3 鸡毒支原体的研究进展 |
| 3.1 鸡毒支原体概述 |
| 3.2 鸡毒支原体的检测方法 |
| 3.2.1 病原的分离鉴定 |
| 3.2.2 血清学方法 |
| 3.2.3 分子生物学技术 |
| 4 胶体金免疫层析技术的研究进展 |
| 4.1 胶体金免疫层析技术概述 |
| 4.2 胶体金免疫层析技术在动物医学方面的应用 |
| 5 目的意义 |
| 第二章 H9亚型禽流感病毒抗体定量检测胶体金试纸条的研制与初步应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、细胞与试验动物 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因克隆与表达载体构建 |
| 2.2.2 重组原核表达质粒的诱导表达 |
| 2.2.3 表达产物的可溶性检测 |
| 2.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.5 单克隆抗体制备 |
| 2.2.6 H9 亚型禽流感病毒抗体定量检测胶体金试纸条的研制 |
| 2.2.7 血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HA1_9 基因的扩增 |
| 3.2 pGEX-KG-HA1_9 原核表达载体的构建 |
| 3.3 目的蛋白的表达与纯化 |
| 3.4 抗多种禽类IgY Fc片段单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.5 H9 亚型禽流感病毒抗体定量检测胶体金试纸条的研制 |
| 3.5.1 胶体金溶液的制备与鉴定 |
| 3.5.2 单克隆抗体的胶体金标记 |
| 3.5.3 试纸条组成材料的选择 |
| 3.5.4 溶液系统的选择 |
| 3.5.5 包被浓度和金标喷量的确定 |
| 3.5.6 试纸条性能检测 |
| 3.6 H9 亚型禽流感病毒抗体定量检测胶体金试纸条的初步应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 H9 亚型AIV抗体检测试纸条检测方法的建立 |
| 4.2 胶体金的制备 |
| 4.3 试纸条的初步临床应用分析 |
| 5 结论 |
| 第三章 鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制与初步应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料同第二章 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因的获取和表达载体构建 |
| 2.2.2 重组原核表达质粒的诱导表达 |
| 2.2.3 表达产物的可溶性检测同第二章 |
| 2.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.5 鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制 |
| 2.2.6 动物试验 |
| 2.2.7 血清平板凝集试验(SPA) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pGEX-KG-vlhA1.2 原核表达载体的构建 |
| 3.2 目的蛋白的表达与纯化 |
| 3.3 鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制 |
| 3.3.1 胶体金溶液的制备与鉴定同第二章 |
| 3.3.2 单克隆抗体的胶体金标记同第二章 |
| 3.3.3 试纸条组成材料的选择 |
| 3.3.4 溶液系统的选择 |
| 3.3.5 包被浓度和金标喷量的确定 |
| 3.3.6 试纸条性能检测 |
| 3.4 鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的初步应用 |
| 3.4.1 动物试验 |
| 3.4.2 临床样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胶体金标记过程的影响因素 |
| 4.2 试纸条的初步临床应用分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
（9）交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 鸭甲肝病毒及其单克隆抗体的研究进展 |
| 1 鸭甲肝病毒的分类及流行情况 |
| 1.1 鸭甲肝病毒的分类 |
| 1.2 鸭甲肝病毒的流行情况 |
| 2 鸭病毒性肝炎的临床症状及病理变化 |
| 3 鸭甲肝病毒单克隆抗体的研究进展 |
| 3.1 单克隆抗体的概念 |
| 3.2 McAb在 DHAV诊断中的应用 |
| 3.3 McAb用于DHAV感染机制的研究 |
| 3.4 McAb用于DHAV防治 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株及血清 |
| 1.2 实验动物与细胞株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原表位肽的设计 |
| 2.2 抗原表位肽的合成和偶联 |
| 2.3 免疫抗原制备及动物免疫 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的冻存 |
| 2.7 杂交瘤细胞株的复苏与传代培养 |
| 2.8 小鼠腹水的制备 |
| 2.9 腹水抗体效价的测定 |
| 2.10 腹水中Mc Ab活性的鉴定 |
| 2.11 McAb体亚型鉴定 |
| 2.12 McAb特异性鉴定 |
| 2.13 McAb杂交瘤细胞的稳定性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 设计合成的抗原肽 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的筛选结果 |
| 3.3 小鼠腹水中的抗体效价 |
| 3.4 McAb交叉反应性鉴定结果 |
| 3.5 McAb亚型鉴定结果 |
| 3.6 McAb的特异性 |
| 3.7 McAb杂交瘤细胞稳定性鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 交叉中和DHAV-A和DHAV-C单克隆抗体的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株和细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂和仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 DHAV半数致死量(ELD50)的测定 |
| 2.2 McAb的制备 |
| 2.3 McAb对 DHAV-A和 DHAV-C在鸭胚中增殖的影响 |
| 2.4 McAb中和效价的测定 |
| 2.5 McAb对 DHAV感染雏鸭的预防效果测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 DHAV半数致死量的计算 |
| 3.2 McAb对 DHAV在鸭胚中增殖的影响 |
| 3.3 McAb的中和效价 |
| 3.4 McAb预防效果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）猪流感病毒（H3N2）NP蛋白纳米抗体的制备及阻断ELISA方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪流感病毒的研究进展 |
| 1.1.1 猪流感病毒的分类及特性 |
| 1.1.2 猪流感临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 流感病毒传播及猪在传播中扮演的角色 |
| 1.1.4 猪流感的诊断方法 |
| 1.1.5 疫苗接种 |
| 1.2 纳米抗体研究内容概况 |
| 1.2.1 常规抗体及重链抗体的结构组成 |
| 1.2.2 纳米抗体的结构特征 |
| 1.2.3 纳米抗体的特性 |
| 1.2.4 纳米抗体的应用 |
| 第二章 猪流感病毒NP蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒以及菌株 |
| 2.1.2 主要设备和仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 NP蛋白原核表达和可溶性分析 |
| 2.2.1 pET-32a-NP重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.2 SDS-PAGE分析重组蛋白 |
| 2.2.3 Western印迹检测重组蛋白 |
| 2.2.4 NP重组蛋白的纯化 |
| 2.2.5 蛋白浓度测定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 SIV-NP重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2 SIV-NP重组蛋白的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SIV-NP蛋白特异性纳米抗体的筛选及生物素标记 |
| 3.1 试验材料与仪器设备 |
| 3.1.1 质粒、菌株及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂耗材2 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 实验动物免疫 |
| 3.2.2 构建VHH噬菌体文库 |
| 3.2.3 淘选NP特异性纳米抗体 |
| 3.2.4 NP特异性纳米抗体的鉴定 |
| 3.2.5 pET-21b-Nb5-BAP原核表达载体的构建 |
| 3.2.6 Nb5原核表达和可溶性分析 |
| 3.2.7 生物素标记纳米抗体 |
| 3.2.8 间接ELISA测定标记抗体效价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 SIV-NP重组蛋白特异性抗体效价的测定 |
| 3.3.2 噬菌体展示文库的构建及文库阳性率检测 |
| 3.3.3 SIV-NP重组蛋白特异性纳米抗体的淘选 |
| 3.3.4 SIV-NP特异性纳米抗体鉴定 |
| 3.3.5 SIV-NP蛋白纳米抗体的特异性及效价检测 |
| 3.3.6 Nb5-生物素受体肽融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.7 间接ELISA检测生物素化Nb5的效价 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SIV纳米抗体抗体阻断ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料与仪器设备 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 基于纳米抗体的阻断ELISA方法的建立 |
| 4.2.2 阻断ELISA方法的评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗原最佳包被浓度与抗体最佳工作浓度的确定 |
| 4.3.2 最佳血清稀释度的确定 |
| 4.3.3 阻断ELISA方法Cut-off值的确定 |
| 4.3.4 特异性评价 |
| 4.3.5 敏感性评价 |
| 4.3.6 阻断ELISA的重复性评价 |
| 4.3.7 阻断ELISA的一致性比较 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、利用抗猪瘟病毒单克隆抗体鉴定瘟病毒株的抗原性（论文参考文献）
- [1]小鹅瘟病毒流行病学调查及夹心ELISA检测方法的建立[D]. 徐晓婷. 扬州大学, 2020(01)
- [2]抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定[D]. 陈文龙. 甘肃农业大学, 2020(12)
- [3]BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响[D]. 刘存. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [4]犬细小病毒胶体金试纸条的研制及初步应用[D]. 杨凯越. 中国农业科学院, 2020
- [5]猪瘟免疫群抗体与病毒变异监测及病毒亚单位疫苗的免疫效果评价[D]. 马振乾. 吉林大学, 2019(02)
- [6]抗牛PD-1抗体制备及PD-1多抗阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响[D]. 刘珊珊. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [7]猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备[D]. 高斌. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [8]H9亚型禽流感病毒和鸡毒支原体抗体检测胶体金试纸条的研制与初步应用[D]. 邵雨. 华中农业大学, 2019(02)
- [9]交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 刘燕. 西南民族大学, 2019(03)
- [10]猪流感病毒（H3N2）NP蛋白纳米抗体的制备及阻断ELISA方法的建立与评价[D]. 朱光. 西北农林科技大学, 2019(09)