一、猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究（论文文献综述）
代先进[1]（2016）在《shRNA抑制猪传染性胃肠炎病毒在PK-15细胞中增殖的研究》文中提出猪传染性胃肠炎（Porcine transmissible gastroenteritis,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起猪的一种急性、高度接触性传染病,以脱水、腹泻和呕吐为临床症状。任何年龄和品种的猪都可感染,尤其是2周龄以内仔猪,给世界各地养猪业造成了巨大损失。常规药物针对TGE没有明显的治疗效果,虽然通过疫苗接种和屠宰感染猪在一定程度上能控制TGE的流行,但免疫失败时有发生。因此有必要探索新的抗病毒方法来对该病进行防控。RNA干扰是一种由双链小RNA介导的以序列特异性方式诱导同源m RNA降解的基因沉默机制。由于RNAi技术能够特异性阻断特定基因的表达,所以该技术被认为是抗病毒感染的最有效方法之一。TGEV属冠状病毒科冠状病毒属、基因组为不分节段的单股正链RNA,长约2.86×104bp,主要包括4种结构蛋白。M基因在TGEV形态发生过程中具有关键作用,本文根据TGEV M基因的结构序列和短发卡RNA（shRNA）序列设计原则,设计并合成了3对shRNA序列,构建成RNA干扰载体。将重组质粒在转染剂的介导下导入猪肾细胞（PK-15）,接种TGEV后,分别从病毒感染滴度、基因表达产物和病毒基因组RNA复制水平三个方面研究特异性shRNA对TGEV在PK-15中增殖的影响。主要结果如下:1.从TGEV CQ毒株中扩增M基因并获得核苷酸序列,生物信息学分析结果表明不同分离株的M基因高度保守,与南京SHXB株亲缘关系最近,属于同一分支,M蛋白存在信号肽,剪切位点在16-17位氨基酸之间,存在3个跨膜区,是以β-折叠和β-转角为主的蛋白。2.分别设计了靶向TGEV CQ株M基因103121位、358376位和625643位m RNA的编码shRNA的单链核苷酸,经退火后形成编码shRNA的双链DNA,将其分别与表达载体pRNAT-U6.1/Neo连接,成功获得重组干扰质粒载体pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3。PK-15细胞培养到50-70%融合时,对细胞分别转染不同的干扰质粒载体,转染24h后进行荧光观察确认表达载体成功转入细胞。3.PK-15细胞转染干扰质粒载体后培养24h,接种1×103 TCID50 TGEV继续培养48h后,通过CPE、TCID50、IFA和Real time RT-PCR分析TGEV在PK-15细胞中的增殖情况。CPE分析发现,对照孔在接种TGEV 48h后,大部分细胞出现典型的细胞病变,pRNAT-1细胞的病变程度也较重,相比之下,干扰质粒pRNAT-2和pRNAT-3能减轻TGEV在PK-15细胞上引起的特异性病变。IFA和TCID50结果进一步表明,pRNAT-2和pRNAT-3干扰质粒能在蛋白水平上有效抑制病毒的增殖。此外,Real time RT-PCR结果显示3个干扰质粒pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3在m RNA水平上抑制效率分别为13%,68%和70%,表明3个干扰质粒在不同程度上能抑制病毒基因组的复制,其中完全靶向M基因保守结构域的pRNAT-2和pRNAT-3干扰质粒抑制效果好于干扰质粒pRNAT-1。总之,通过RNAi途径在细胞水平上研究TGEV M基因功能和复制的关系,发现靶向TGEV M基因358376位和625643位的si RNA能在m RNA和蛋白水平有效抑制TGEV的复制,保护PK-15细胞抵御TGEV CQ株引起的细胞病变。这能为后期筛选特定分子抑制剂提供靶标位点以及为新型药物的研制提供理论依据。
寇亚楠[2]（2014）在《纳米硅佐剂对猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗免疫效果影响研究》文中提出猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）引起的高度接触性传染病之一,该病显着的临床症状为严重腹泻、呕吐和脱水等。不同年龄的猪均易感,尤其对新生仔猪具有高度致死性,其中两周龄以内的仔猪致死率最高,可达100%。5周龄以上仔猪死亡率开始降低,成年猪几乎没有死亡,但有很多不良后果,如饲料报酬率和生产性能下降等,给养猪业造成了巨大的经济损失。该病尚无有效的治疗措施,因此,科学的疫苗免疫在临床防控中被证明是最为有效的措施。目前弱毒苗存在毒力返强等风险;灭活疫苗虽然安全性好,却存在产生抗体速度较慢、诱导机体产生细胞免疫较弱的缺点。因此本试验针对灭活疫苗的佐剂展开了相关的研究。本试验主要研究了不同佐剂TGEV灭活疫苗接种小鼠后的免疫效果,并初步探讨了免疫相关的miRNA的表达情况,不仅为安全、高效疫苗佐剂的筛选提供更大的可能性,而且为临床上对该病的防治提供一定的试验依据。具体研究内容如下:1、首先将猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株用0.2%的甲醛灭活24 h,分别制备了 3种不同佐剂灭活疫苗。纳米硅佐剂灭活疫苗,按照火活的病毒液与纳米硅佐剂1:2的比例分别制备粒径为70 nm和150 nm的纳米硅佐剂灭活疫苗。油乳剂疫苗,将灭活的病毒液与白油佐剂同样按照1:2的比例制成。经检验,制备的上述3种灭活疫苗的理化性状和无菌性均合格,且对乳鼠安全性良好。2、将制备的3种灭活疫苗免疫小鼠,并分别与TGEV无佐剂对照和市售 TGEV铝胶佐剂灭活疫苗的免疫效果作对比。在免疫后0、1、2、3、4、5、6、8、10周,分别用EL1SA方法和流式细胞仪检测免疫小鼠的体液免疫及细胞免疫水平;用MTT比色法检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示:这5种疫苗均能诱导小鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,70 nm组、150 nm组和TGEV油乳剂组均能诱导小鼠产生较高的体液免疫水平:70 nm组较其它试验组更能诱导小鼠产生较高的细胞免疫水平;各组的T淋巴细胞增殖除了150 nm组和油乳剂组与生理盐水组差异显着,其余各组差异均不显着;各组的B淋巴细胞增殖也无显着性差异。3、对于不同佐剂灭活疫苗组,分别对小鼠免疫相关的miR-21、miR-27、miR-30、miR-146、miR-150、miR-155和miR-181的表达水平进行了初步探讨。在分别免疫0 h、12 h、72 h后,应用荧光定量PCR方法检测与小鼠免疫相关的miRNA的相对表达量。结果显示,在12 h、72 h后,各免疫相关基因的相对表达量均有下调情况,但下调情况不尽一致,其中miRNA 相对表达量均较低的是 miR-181。在 12h 时,70 nm 组的 miR-27、miR-146、miR-155基因的相对表达量均高于其它组:而150 nm组的miR-30、miR-150、miR-181基因的相对表达量均高于其它试验组。在72 h时,TGEV油乳剂组的miRNA的相对表达量较高,且均高于其它佐剂灭活疫苗组。
金修哲,何雷,程相朝,张春杰,余祖华,韩海锋,杨丹芳,梅京京,李银聚[3]（2016）在《6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用》文中研究指明【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变（CPE）观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ST）的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID50,用细胞维持液配成100·TCID50病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6种中药成分与病毒作用后,测定TGEV的病毒滴度并进行比较分析、RT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200μmol·L-1;抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为:160、100、20、62.5、25、100μmol·L-1。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID50为10-6.25/0.1 m L;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5μmol·L-1时与100·TCID50病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72 h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID50为10-3.75/0.1 m L,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10-6.45/0.1 m L差异极显着（P<0.01）;通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显着。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为:10-4.75、10-5.55、10-5.55、10-5.65、10-5.75/0.1 m L,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显着,抑制率大多在50%以下。另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显着;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显着,有望被开发成抗病毒药物。
袁广富[4]（2020）在《猪传染性胃肠炎病毒HB-FP株的分离鉴定及自噬对其增殖的影响》文中研究表明猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属成员猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病的主要临床特征为严重腹泻、脱水及迅速消瘦,2周龄以下仔猪死亡率可达100%,给养猪业带来了严重的经济损失。目前,TGE主要通过接种疫苗来进行预防控制,但是近年来流行的病毒处在一个毒力和生物学特性不断变异的动态过程中,传统疫苗已经达不到抵抗自然流行毒株的效果。本研究对我国河北地区的TGEV流行毒株进行了分离鉴定,并获得一株稳定的细胞传代毒株;对该分离毒株S、M基因进行了遗传进化分析,并探究了细胞自噬对该TGEV流行株复制的影响。本研究成果不仅为TGEV流行毒株致病机理等提供重要的理论基础而且对新型疫苗的研发上具有重要意义。本研究从河北某地采集临床表现为腹泻的仔猪粪便及小肠内容物,RT-PCR检测为TGEV阳性的病料处理后接种到PK-15细胞上进行传代,在盲传至第5代时出现典型的细胞病变。经RT-PCR检测,细胞培养物为TGEV 阳性,PEDV、PRoV、PDCoV检测结果均为阴性。根据Reed-Muench法计算得到第10代毒TCID50为10-5.5/0.1mL。间接免疫荧光实验进一步证实该病毒感染细胞后可以与TGEV兔源全病毒多抗发生特异性结合,出现特异性免疫荧光。证实该分离毒株为猪传染性胃肠炎病毒并命名为HB-FP 株。本研究对HB-FP分离株病毒S、M基因进行RT-PCR扩增,将获得的分离株S、M全基因与国内外TGEV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,M基因未发生碱基的缺失或插入,分离株与参考株M基因之间核苷酸同源性都高于95%,与TGEV H16（FJ755618）核苷酸同源性最高为99.9%,氨基酸同源性为99.2%。HB-FP株S基因与其他参考毒株的核苷酸同源性为94.9%～98.8%,编码氨基酸同源性为65%～98%。进化树分析表明,HB-FP株除与英国TGEV株（AF104420）不在一个分支上外,与其他参考毒株都在同一分支上,其中中国的TGEVJS2012（KT696544）株、美国的TOY56-165（M94103）株、韩国的TGEV（AF298211）株与分离株HB-FP株亲缘关系最近。氨基酸变异分析表明,分离株与常用的疫苗株存在21处氨基酸点突变,其中有7处点突变在S蛋白的抗原表位区,这种抗原位点的突变对TGEV生物学特性的影响还有待进一步研究。本研究将不同病毒量的TGEV HB-FP株感染PK-15细胞,通过免疫印迹试验检测自噬相关蛋白的表达水平,证实了 TGEV感染可引起PK-15细胞自噬现象。紫外线灭活后的病毒可以引起细胞自噬,虽然与对照组相比LC3-Ⅱ/β-actin表达量有提升,但是其诱导自噬的能力较正常病毒组下降明显,表明经紫外线灭活的TGEV未完全失去诱导PK-15细胞自噬的能力,但是病毒的复制过程可以促进宿主细胞自噬程度。探究细胞自噬对TGEV病毒增殖的影响,结果显示自噬促进剂雷帕霉素预处理PK-15细胞后可以增加TGEV的病毒滴度,而经自噬抑制剂3-MA处理PK-15细胞后抑制了 TGEV的复制,结果证实自噬可以促进TGEV在PK-15细胞上的复制。经TGEV HB-FP株感染PK-15细胞后自噬关键因子Beclin-1、ATG5基因mRNA转录量在分离株病毒感染细胞后都得到显着提升,结合病毒的增殖曲线印证了 TGEVHB-FP株在感染PK-15细胞后,病毒增殖与细胞自噬程度呈正向作用。研究结果为进一步探索TGEV HB-FP株与宿主细胞相互作用及TGEV的发病机制提供了新的视角。
王仙[5]（2018）在《猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析及间接ELISA方法的建立》文中提出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）可引起一种急性、高度接触性传染病。该病流行范围广、死亡率高,严重危害养猪业,是引起仔猪腹泻的重要病原之一。本研究利用RT-PCR及电镜观察法对分离病毒进行鉴定,确认分离到一株猪传染性胃肠炎病毒,通过细胞培养进一步增殖病毒,进行全基因序列分析;同时针对Sa基因设计引物,构建His-Sa表达载体,获得可溶性重组蛋白,将纯化后的表达产物作为包被抗原,建立了 TGEV抗体检测的ELISA方法。1 TGEV-TZ-10-2016的分离及鉴定对江苏地区某养猪场腹泻病料进行病毒的分离,获得一株疑似猪传染性胃肠炎病毒,并将其命名为TGEV-TZ-10-2016。参照文献针对TGEV-Sa基因设计一段特异性引物,用RT-PCR方法进行扩增,获得与预期结果相符的约507 bp目的片段,测序结果显示:TGEV-TZ-10-2016株与已知的TGEV毒株核苷酸同源性在94.6%以上,与中国毒株（PURDUE P115、TGEV-HX、TGEV-SHXB、WH-1、AYU、SC-Y）及美国毒株（PUR46-MAD）同源性均很高,结合电镜观察结果确定该分离病毒为猪传染性胃肠炎病毒。2 TGEV-TZ-10-2016全基因序列分析本研究为获得TGEV-TZ-10-2016病毒的全基因序列的相关信息,将分离得到的TZ-10-2016临床样品在猪睾丸细胞上盲传18代后细胞出现稳定病变,参考GenBank中已发表的TGEV序列,设计合成18对特异性引物,对TGEV-TZ-10-2016进行全基因扩增,再将cDNA序列完成拼接,借助软件进行遗传变异和生物信息学分析。结果显示:TGEV-TZ-10-2016 的完整基因型为 5’-ORF1 a-ORF 1 b-S-ORF3a-ORF3b-sM-M-N-ORF7-3’,TGEV-TZ-10-2016 与 TGEV-SHXB、WH-1、AYU、PUR46-MAD 同源性达到 99.5%;生物信息学分析显示4个结构蛋白中S、sM、M蛋白均为稳定蛋白且有跨膜区,N蛋白有一定的疏水性,四个蛋白都具有良好的抗原性,本研究为猪传染性胃肠炎病毒的基因组学研究提供参考。3间接ELISA方法的建立本研究利用设计的TGEV-Sa基因特异性引物,通过RT-PCR方法,扩增出目的片段,将目的片段克隆进原核表达载体pColdTF,经过双酶切、测序鉴定后,再将正确的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用终浓度0.5 mM IPTG诱导,表达产物多为可溶性蛋白。超声波裂解菌体后,再用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化。经Western-blot鉴定结果正确,重组蛋白的成功表达为下一步病毒抗体检测ELISA方法的建立奠定了基础。利用纯化后的His-Sa重组蛋白作为包被抗原,建立TGEV抗体检测的ELISA方法。通过实验条件的优化,最终确定抗原最佳包被量0.0625 μg/mL,待检血清最佳稀释度1:100,最佳孵育时间45 min,酶标二抗的孵育时间45 min,底物显色时间15 min,用建立的ELISA方法检测40份阴性血清,以确定阳性临界值。当OD450>0.331时,判为阳性。交叉反应性试验发现,本研究建立的间接ELISA方法对TGEV阳性血清反应,对猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）、猪腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的阳性血清不反应,特异性良好。该方法的批内批间实验的变异系数均小于10%,说明该方法重复性良好,用建立好的方法检测282份猪血清样品结果同间接免疫荧光方法比较,结果该方法同间接免疫荧光的检测阳性符合率达100%,阴性符合率达88.3%。本研究建立的间接ELISA方法可用于临床检测。
朱蕴暖[6]（2017）在《猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析》文中研究说明猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV）是猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）的病原体。TGE是猪的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪具有高度致死率（通常为100%）为特征。该病于1946年在美国首次报道,目前已呈世界性分布。TGE常在每年的冬季和早春季节呈暴发性流行,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究以检测为TGEV阳性的猪小肠内容物为材料进行病毒分离;在添加0.3%胰酶的条件下分离到1株能在PK15细胞上稳定增殖并能产生明显的细胞病变（CPE）的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV-AHHF毒株）。为了确定新分离的TGEV-AHHF毒株对仔猪的致病性,用第五代分离毒（TCID50为10-4.12/0.1m L）对仔猪进行攻毒实验,本研究选取了TGEV、PEDV、PORV和SDCV抗原阴性,且TGEV抗体阴性的健康3日龄仔猪12头,随机分成2组,命名为攻毒组（T组）和阴性对照组（N组）,每组6头。攻毒组每头口服1×106.12TCID50病毒液。阴性对照组口服10 m L DMEM,攻毒后每3 h观察记录临床症状。结果显示,攻毒后48 h,攻毒组出现呕吐、腹泻症状;阴性对照组未出现任何临床症状。病理剖检,攻毒组小肠壁变薄、变透明,肠内充满黄色液体,阴性对照组没有明显病理变化。病理切片结果显示,攻毒组仔猪的肠道粘膜上皮细胞发生变性、坏死和溶解,十二指肠和空肠的肠绒毛显着萎缩,阴性对照组没有明显病理变化。荧光定量PCR检测各组织脏器中的病毒含量结果显示,攻毒组的空肠中的TGEV含量最高,其次是回肠、盲肠、结肠、直肠、胃和十二指肠,其他组织和阴性对照组均未检测到TGEV。结果证实分离的TGEV-AHHF毒株能够引起仔猪典型的TGE临床症状、病理和组织学变化,具有致病性。通过RT-PCR,5′RACE和3′RACE扩增方法,获得了该毒株的全基因序列,序列全长为28614 nt,包括5′非编码区（nt 1-314）,ORF1ab基因（nt 315-20368）,S基因（nt 20365-24711）,3a基因（nt 24830-25045）,3b基因（nt 25139-25873）,E基因（nt 25860-26108）,M基因（nt26119-26907）,N基因（nt 26920-28068）,ORF7基因（nt 28074-28310）和3′非编码区（nt28311-28614）,全基因组序列分析显示,TGEV-AHHF毒株核苷酸序列与猪传染性胃肠炎病毒WH-1和SHXB毒株同源性最高（99.6%）;进化树分析表明,由全基因构建的进化树显示TGEV-AHHF毒株与purdue群亲缘关系较近,而与Miller群亲缘关系较远;重组性分析显示,TGEV-AHHF毒株基因组中存在两个潜在的重组区域,分别在ORF1a和S基因中,可能是purdue群与Miller群毒株之间重组的结果。本研究对TGEV现地流行毒株进行分离鉴定、致病性及基因组结构特性分析,不仅对于TGEV的遗传进化、致病机理等基础性研究提供重要的理论基础,也在疾病的诊断、生物制品研制和防治工作方面具有重要意义。
李明月[7]（2020）在《猪传染性胃肠炎病毒HQ2016毒株全基因组测序及半巢式RT-PCR检测方法建立》文中研究指明猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）作为猪传染性胃肠炎病原,是一种急性、高度接触性传染病,该病以呕吐、水样腹泻、脱水和对两周龄内死亡率较高（通常为100%）为特征。TGEV常在每年冬季和春季呈暴发流行,给养猪业造成较大的经济损失。为了获得临床分离毒株TGEV HQ2016全基因组序列,本研究利用Illumina二代测序法对TGEV HQ2016毒株进行全基因组测序,该毒株全序列长度为28 585 nt,全序列由5’端到3’端符合ORF（1a/1b）-S-3a-3b-sM-M-N-ORF7’的顺序。全序列分析显示TGEV HQ2016毒株核苷酸序列与AYU、HX、WH-1、PUR46-MAD、Purdue毒株同源性最高（100%）。全基因组进化树显示TGEV HQ2016毒株与Purdue普系毒株亲缘关系较近,与Miller谱系毒株的亲缘关系较远。重组性分析结果显示,TGEV HQ2016毒株中不存在重组区域。为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒的半巢式RT-PCR方法,本研究利用TGEV HQ2016与已发表于GenBank其TGEV毒株序列N基因等序列设计3条特异性引物,建立并优化反应体系。试验结果显示,该方法能够成功扩增483 bp和338 bp两条目的条带。对TGEV具有良好特异性,与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒均无交叉反应;敏感性最低可检测到1.86×10-11 pg/μL的TGEV cDNA。本试验所建立的半巢式RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性良好,利用建立的半巢式RT-PCR对临床50份猪腹泻样品检测结果显示,阳性率为36%,可准确地对TGEV感染做出诊断,为TGEV的临床检测、流行病学调查提供了有效手段。本研究对TGEV HQ2016毒株基因组结构进行特性分析,并且建立半巢式RT-PCR检测方法,不仅为TGEV的遗传进化等基础性研究提供重要的理论基础,也为猪传染性胃肠炎的诊断、相关生物制品研制以及疾病防控具有重要参考价值。
黄小波[8]（2006）在《猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究》文中提出猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritisenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病，临床症状主要表现为发病仔猪严重腹泻、呕吐和脱水，该病给我国养猪业造成了巨大的损失。本研究从病原学上证实了该病在四川的流行，建立了TGEV基因芯片检测新方法，进行了重要功能基因的分子生物学研究，对TGE的诊断、预防和控制具有重要意义。 1 猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离鉴定 将腹泻病料接种到到ST细胞（猪睾丸传代细胞）上，连续盲传5代后开始出现典型的细胞病变，病变在接毒后30h开始出现，表现为：细胞肿胀、变圆、有散在堆积、最后细胞皱缩、崩解破碎，脱落。该病毒的TCID50为10-3.92／0.04ml、病毒能被猪传染性胃肠炎病毒阳性血清所中和，中和指数为242；透射电镜观察细胞中聚集大量的病毒粒子，病毒粒子呈球形，大小约75-90nm，病毒以胞外分泌的方式释放到细胞外；病毒对5溴脱氧尿核苷不敏感，为RNA病毒，对乙醚、氯仿敏感，对胰蛋白酶有抵抗力，pH4.0-pH8.0稳定。将分离鉴定的病毒命名为SC-H株。SC-H株的分离为该病的病原学研究、诊断和防制积累了材料。 2 TGEV SC-H株主要基因的克隆与分析 用RT-PCR技术扩增了猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的S（分为S1、S2、S3、S4四段）、sM、M、N、ORF7、S′及POL基因，将扩增片段插入pMD18-T载体构建了重组质粒pMD-S1、pMD-S2、pMD-S3、pMD-S4、pMD-sM、pMD-M、pMD-N、pMD-ORF7、pMD-S′及pMD-POL，核苷酸测序结果显示S1、S2、S3、S4长度分别为1260bp、1280bp、1062bp、1217bp，序列拼接后S基因片段长4542bp；sM、M、N，ORF7、S′和POL扩增片段长度分别为378bp、852bp、1188bp、436bp、886bp及303bp。S、sM、M、N和ORF7扩增片段分别包括TGEV完整的ORF2、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7，长度分别为4344bp、249bp、789bp、1149bp和237bp，分别编码1147、82、262、382、78个氨基酸。S、sM、M、N、ORF7编码区的核苷酸序列和其他参考毒株的核苷酸序列同源性分别在98.1-99.8％、98.1-99.7％、94.2-99.7％、98.1-99.9％及93.6-99.5％之间，氨基酸同源性在94.1-99.7％、92.7-98.8％、92.0-99.2％、95.3-99.5％及84.8-96.2％之间。进化分析显示SC-H株与Purdue株有相对较近的遗传距离。TGEV主要基因的克隆与分析为后续构建检测基因芯片和研究功能基因奠定了基础。
佟玲[9]（2013）在《猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）种毒的特性研究与制备》文中提出猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种高度传染性猪病。TGEV是冠状病毒属成员之一，该病毒感染可导致仔猪严重腹泻，死亡率极高，是危害养猪业的重要病毒。免疫接种是预防TGEV感染的有效手段，TGEV疫苗开发对防治TGEV感染具有重要的价值。而制备纯净的种毒是疫苗株的基础。在本研究中，我们在以往实验基础上根据兽用生物制品注册分类及注册资料要求，对实验室保存的TGEV HR/DN1毒株进行连续传代培养，传代培养数十代后，病毒滴度已经基本上稳定在106.0-107.0/0.1mL。进一步我们还对种毒进行了一系列理化特性试验:1.通过核酸类型试验、脂溶剂敏感性试验证实该种毒为有囊膜的RNA病毒；2.pH3.0酸性实验证实该病毒在低温条件下比较稳定，高温则发生灭活；3.热敏感实验说明TGEV并不耐热，在50℃条件以下较为稳定，但随着温度的升高病毒滴度也会有所下降。用间接免疫荧光、RT-PCR等技术对病毒进行鉴定。最后参照《中国兽药典》对种毒和细胞分别进行纯净试验即细菌、霉菌、支原体以及外源病毒污染检测，证明细胞和种毒均无污染。以上实验结果表明该病毒具有繁殖滴度高、传代稳定、病毒纯净等特点，符合种毒制备的基本条件。建立原始种子批、基础种子批，大量繁毒后，按要求分装，建立工作毒种库，为下一步进行猪体实验和疫苗开发奠定了基础。
王树成,赵祥平,刘宏,董志珍[10]（1998）在《猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究》文中研究说明从组织细胞制备、不同试验细胞（ｐｋ１５，ＳＴ）及不同维持液组成成份三个方面对ＴＧＥＶ在组织细胞上增殖情况进行了比较。结果表明，用含１５％ＦＢＳ培养液进行ＳＴ或ｐｋ１５细胞传代并制备悬液，操作方便，能形成良好单层，利用ＴＧＥＶＣＰＥ判定；ＳＴ细胞在病毒增殖和检测毒价两方面均较ｐｋ１５细胞分别高２个滴度和１个滴度以上；维护液中提高血清含量（８％ＦＢＳ）或含一定量胰酶对ＴＧＥＶ增殖效果影响不大。
二、猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究（论文提纲范文）
（1）shRNA抑制猪传染性胃肠炎病毒在PK-15细胞中增殖的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒研究概况 |
| 1.2 RNAi技术概况 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 第3章 TGEV M基因的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 干扰TGEV M基因shRNA表达载体的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 shRNA抑制TGEV增殖的研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 全文总结 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间发表的论文及参与课题 |
（2）纳米硅佐剂对猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗免疫效果影响研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 纳米硅佐剂和油乳佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒滴度TCID_(50)的测定结果 |
| 2.2 病毒灭活效果检验 |
| 2.3 灭活病毒液的无菌检测 |
| 2.4 纳米二氧化硅的制备 |
| 2.5 油乳剂灭活疫苗的鉴定 |
| 2.6 不同体剂灭活疫苗的无菌性检验 |
| 2.7 不同佐剂灭活疫苗的安全性检验 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 猪传染性胃肠炎病毒的增殖情况 |
| 3.2 灭活剂的选择 |
| 3.3 佐剂的选择 |
| 3.4 疫苗安全性检验 |
| 试验二 纳米硅佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗小鼠免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠免疫后诱导的体液免疫应答效果观察 |
| 2.2 免疫小鼠外周血中不同亚型T淋巴细胞动态变化 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 TGEV灭活疫苗免疫小鼠后抗体水平的检测 |
| 3.2 淋巴细胞的增殖情况 |
| 3.3 TGEV灭活疫苗诱导的细胞免疫应答 |
| 试验三 不同佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗小鼠免疫相关MIRNA表达的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2 引物特异性分析 |
| 2.3 不同佐剂灭活疫苗对小鼠免疫相关MIRNA的表达的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（3）6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 病毒与细胞 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒TCID50的测定 |
| 1.3.2 中药成分对ST细胞最大安全浓度的测定 |
| 1.3.3 6种中药成分不同给药方式对TGEV增殖抑制作用 |
| 1.3.4 6种中药成分对TGEV直接杀灭作用不同时间形态学的影响 |
| 1.3.5 3种不同作用方式对TGEV病毒滴度的影响 |
| 1.3.6 6种中药成分组分别与TGEV组对ST细胞形态学的影响 |
| 1.3.7 RT-PCR对6种中药成分与TGEV作用后病毒的鉴定 |
| 1.3.8 数据分析处理。 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒TCID50的测定 |
| 2.2 中药成分对ST细胞最大安全浓度测定 |
| 2.3 中药成分对TGEV体外抑制作用 |
| 2.4 6种中药成分最佳药效浓度结果 |
| 2.5 6种中药成分对TGEV直接杀灭作用不同时间形态学的观察 |
| 2.6 3种不同作用方式对TGEV病毒滴度的影响 |
| 2.7 6种中药成分分别与TGEV作用对ST细胞形态学的观察 |
| 2.8 RT-PCR鉴定TGEV |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（4）猪传染性胃肠炎病毒HB-FP株的分离鉴定及自噬对其增殖的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 TGEV概述 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 形态特征 |
| 1.1.3 培养特性 |
| 1.1.4 理化作用 |
| 1.1.5 基因组结构 |
| 1.1.6 结构蛋白 |
| 1.1.7 流行特点 |
| 1.1.8 临床症状和剖检症状 |
| 1.2 TGEV的实验室检测方法 |
| 1.2.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.2.2 电镜观察 |
| 1.2.3 免疫荧光检测 |
| 1.2.4 酶联免疫吸附试验 |
| 1.2.5 常规PCR检测技术 |
| 1.2.6 荧光定量PCR检测技术 |
| 1.2.7 环介导等温扩增技术 |
| 1.3 细胞自噬的研究进展 |
| 1.3.1 自噬的分类及生物学意义 |
| 1.3.2 细胞自噬的发生过程 |
| 1.3.3 参与细胞自噬调控的关键基因 |
| 1.3.4 自噬与病毒增殖的作用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 细胞和病毒 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 其他相关实验材料 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TGEV HB-FP株的分离与鉴定 |
| 2.2.2 TGEV HB-FP株S、M基因序列分析 |
| 2.2.3 细胞自噬对TGEV增殖的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病料的检测结果 |
| 3.2 病毒的分离鉴定 |
| 3.2.1 细胞病变鉴定 |
| 3.2.2 细胞毒RT-PCR鉴定 |
| 3.2.3 TGEV分离株的间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.4 TCID_(50)的测定 |
| 3.2.5 病毒增殖动态 |
| 3.3 TGEV HB-FP株S、M基因序列分析 |
| 3.3.1 TGEV HB-FP株S基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 TGEV HB-FP株M基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.3 S基因遗传进化树分析 |
| 3.3.4 TGEV HB-FP株S基因序列与氨基酸变异情况分析 |
| 3.3.5 M基因遗传进化树分析 |
| 3.3.6 TGEV HB-FP株M基因序列分析 |
| 3.4 细胞自噬对TGEV增殖的影响 |
| 3.4.1 荧光定量PCR检测方法标准曲线的建立 |
| 3.4.2 TGEV感染细胞对自噬相关蛋白的影响 |
| 3.4.3 紫外线灭活病毒感染细胞对自噬的影响 |
| 3.4.4 药物处理对PK-15细胞活性的影响 |
| 3.4.5 药物处理对细胞自噬的影响 |
| 3.4.6 自噬激活剂预处理细胞后对TGEV增殖的影响 |
| 3.4.7 自噬抑制剂预处理细胞后对TGEV增殖的影响 |
| 3.4.8 TGEV感染PK-15细胞对自噬关键基因的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGEV HB-FP株的分离与鉴定 |
| 4.2 TGEV HB-FP株S、M基因序列分析 |
| 4.3 细胞自噬对TGEV增殖的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析及间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 猪传染性胃肠炎病毒的病原学特征 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒的形态结构和理化性质 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒细胞培养特性 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎病毒的抗原性和变异性 |
| 2 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特性 |
| 2.1 基因组结构特性 |
| 2.2 TGEV蛋白的结构及其功能 |
| 3 猪传染胃肠炎病毒的流行病学 |
| 3.1 传染源、传播途经和易感动物 |
| 3.2 流行特点 |
| 4 猪传染性胃肠炎病毒检测方法的研究进展 |
| 4.1 猪传染性胃肠炎病毒病原学检测方法 |
| 4.2 猪传染性胃肠炎病毒免疫学检测方法 |
| 4.3 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测方法 |
| 5 预防与治疗 |
| 5.1 预防为主,加强管理 |
| 5.2 药物治疗及相关应急措施 |
| 6 研究目的及意义 |
| 研究内容一 猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂和生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离与增殖 |
| 2.2 病毒全基因组测序 |
| 2.3 病毒全基因测序结果分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的片段特异性鉴定 |
| 3.2 目的片段扩增 |
| 3.3 病毒感染ST细胞及小肠上皮细胞 |
| 3.4 全基因组扩增结果 |
| 3.5 TGEV-TZ-10-2016的遗传进化分析 |
| 3.6 TGEV-TZ-10-2016结构蛋白的生物信息学分析 |
| 3.7 ORF预测 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 猪传染性胃肠炎病毒Sa蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂和生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2. 猪传染性胃肠炎病毒Sa蛋白的原核表达 |
| 2.1 引物设计和目的片段的扩增 |
| 2.2 目的片段的克隆 |
| 2.3 TGEV-Sa原核表达载体的构建 |
| 2.4 TGEV抗鼠多抗血清的制备 |
| 2.5 间接免疫荧光常规方法 |
| 3 检测TGEV抗体间接ELISA方法的初步建立 |
| 3.1 间接ELISA方法常规步骤 |
| 3.2 间接ELISA方法反应条件的优化 |
| 4 结果 |
| 4.1 pCold-TF-Sa原核表达载体构建 |
| 4.2 His-Sa重组蛋白的诱导表达 |
| 4.3 His-Sa重组蛋白的Western-blot鉴定 |
| 4.4 His-Sa重组蛋白的纯化 |
| 4.5 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的优化 |
| 4.6 待检血清最佳孵育时间的优化 |
| 4.7 酶标二抗最佳孵育时间的优化 |
| 4.8 底物最佳显色时间的优化 |
| 4.9 间接ELISA方法阳性临界值的确定 |
| 4.10 间接ELISA方法交叉反应性检验 |
| 4.11 间接ELISA方法的批内和批间重复性检验 |
| 4.12 间接ELISA方法结果验证 |
| 5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究进展 |
| 1.2 TGEV的生物学特性 |
| 1.2.1 TGEV的分类地位 |
| 1.2.2 形态特征 |
| 1.2.3 培养特性 |
| 1.2.4 病毒基因组结构与其编码产物 |
| 1.3 TGEV流行病学 |
| 1.4 TGE临床症状 |
| 1.5 TGE病理特征 |
| 1.6 TGE发病机理 |
| 1.7 TGEV的遗传变异 |
| 1.8 TGEV的诊断方法 |
| 1.8.1 病毒的分离和鉴定 |
| 1.8.2 血清学诊断 |
| 1.8.3 核酸探针杂交技术检测 |
| 1.8.4 聚合酶链式反应技术 |
| 1.8.5 环介导等温扩增技术 |
| 1.9 治疗与预防 |
| 1.10 目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、样品来源与实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品病原检测 |
| 2.2.2 病毒分离 |
| 2.2.3 病毒的鉴定 |
| 2.2.4 动物实验 |
| 2.2.5 病毒全基因组片段的RT-PCR分段扩增 |
| 2.2.6 RACE法获取 5′末端和 3′末端非编码区片段 |
| 2.2.7 目的基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.8 TGEV-AHHF毒株全基因组序列分析比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 样品检测结果 |
| 3.2 病毒分离结果 |
| 3.3 TGEV分离病毒的特异性鉴定 |
| 3.3.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.3.2 IFA和IPMA方法鉴定 |
| 3.3.3 电镜观察结果 |
| 3.3.4 TCID_(50)测定结果 |
| 3.4 动物实验结果 |
| 3.4.1 临床症状 |
| 3.4.2 剖检病变 |
| 3.4.3 组织病理学变化 |
| 3.4.4 免疫组化结果 |
| 3.4.5 各组织脏器中TGEV检测 |
| 3.5 全基因组分段扩增结果 |
| 3.6 全基因组序列分析比较结果 |
| 3.6.1 基因组结构分析 |
| 3.6.2 同源性分析 |
| 3.6.3 系统进化树分析 |
| 3.6.4 重组分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒分离与鉴定 |
| 4.2 TGEV-AHHF毒株致病性分析 |
| 4.3 TGEV-AHHF毒株全基因组测序与序列分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（7）猪传染性胃肠炎病毒HQ2016毒株全基因组测序及半巢式RT-PCR检测方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 TGEV研究进展 |
| 1.2 TGEV生物学特性 |
| 1.2.1 TGEV分类 |
| 1.2.2 形态特征 |
| 1.2.3 病毒基因组结构与其编码产物 |
| 1.3 TGEV流行病学 |
| 1.4 TGE临床症状 |
| 1.5 TGEV病理特征 |
| 1.6 TGEV发病机理 |
| 1.7 TGEV遗传特性 |
| 1.8 TGEV的生物学检测方法 |
| 1.8.1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.8.2 核酸探针杂交技术 |
| 1.8.3 免疫胶体金技术 |
| 1.9 预防 |
| 1.10 目的与意义 |
| 2 TGEV HQ2016 的全基因组分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 TGEV HQ2016 全基因组测序 |
| 2.2.4 生物学信息分析软件 |
| 2.2.5 核苷酸与氨基酸同源性分析 |
| 2.2.6 系统进化树构建 |
| 2.2.7 基因重组分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因结构分析 |
| 2.3.2 结构基因分析 |
| 2.3.3 非结构基因分析 |
| 2.3.4 同源性分析 |
| 2.3.5 系统进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 TGEV半巢式RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 病毒RNA的提取 |
| 3.2.3 合成cDNA |
| 3.3 半巢式RT-PCR检测方法条件优化 |
| 3.3.1 最适引物使用量的优化 |
| 3.3.2 最适退火温度的确定 |
| 3.3.3 PCR扩增体系与循环参数 |
| 3.3.4 PCR特异性试验 |
| 3.3.5 PCR敏感性试验 |
| 3.3.6 PCR重复性试验 |
| 3.3.7 半巢式PCR检测方法的应用 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 最佳PCR反应条件 |
| 3.4.2 PCR特异性试验 |
| 3.4.3 PCR敏感性试验 |
| 3.4.4 PCR重复性试验 |
| 3.4.5 临床样品检测 |
| 3.4.6 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（8）猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 一 猪传染性胃肠炎研究进展 |
| 二 基因芯片技术及其在疫病检测中的应用 |
| 前言 |
| 第一章 猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离鉴定 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二章 TGEV SC-H株主要基因的克隆与分析 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三章 猪传染性胃肠炎检测基因芯片的初步构建 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四章 猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）种毒的特性研究与制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒研究概况 |
| 1.1.1 猪传染性胃肠炎病毒形态学特征 |
| 1.1.2 猪传染性胃肠炎的培养特性 |
| 1.1.3 猪传染性胃肠炎病毒理化特性 |
| 1.1.4 猪传染性胃肠炎病毒的分子生物学特征 |
| 1.1.5 猪传染性胃肠炎病毒感染的致病机理 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎的流行病学特点 |
| 1.2.1 传染源、传播途经和易感动物 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎临床症状 |
| 1.4 猪传染性胃肠炎疫苗研究现状 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 弱毒疫苗 |
| 1.4.3 联合疫苗 |
| 1.4.4 亚单位疫苗 |
| 1.4.5 核酸疫苗 |
| 1.4.6 重组活载体疫苗 |
| 1.4.7 基因缺失疫苗 |
| 1.4.8 转基因植物疫苗 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒种与细胞 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞和种毒的培养与纯净检测 |
| 2.2.2 原始种毒的鉴定 |
| 2.2.3 病毒理化特性试验 |
| 2.2.4 种子批病毒的建立 |
| 2.2.5 种毒保存期试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细胞和种毒的培养与纯净检测结果 |
| 3.1.1 细胞的培养 |
| 3.1.2 TGEV 在 ST 细胞上的增殖培养与鉴定 |
| 3.1.3 细胞的纯净检测 |
| 3.1.4 种毒的纯净检测 |
| 3.2 病毒理化试验结果 |
| 3.2.1 病毒核酸类型鉴定 |
| 3.2.2 乙醚敏感试验 |
| 3.2.3 氯仿敏感试验 |
| 3.2.4 pH 稳定性试验 |
| 3.2.5 热敏感试验 |
| 3.3 基础种毒的传代培养与滴度测定结果 |
| 3.4 不同代次 TGEV 种毒滴度监测结果 |
| 3.5 种毒保存期试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGEV 种毒的培养 |
| 4.2 种毒的理化特性 |
| 5. 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究（论文参考文献）
- [1]shRNA抑制猪传染性胃肠炎病毒在PK-15细胞中增殖的研究[D]. 代先进. 西南大学, 2016(02)
- [2]纳米硅佐剂对猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗免疫效果影响研究[D]. 寇亚楠. 河南农业大学, 2014(04)
- [3]6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用[J]. 金修哲,何雷,程相朝,张春杰,余祖华,韩海锋,杨丹芳,梅京京,李银聚. 中国农业科学, 2016(11)
- [4]猪传染性胃肠炎病毒HB-FP株的分离鉴定及自噬对其增殖的影响[D]. 袁广富. 河北农业大学, 2020(01)
- [5]猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析及间接ELISA方法的建立[D]. 王仙. 扬州大学, 2018(01)
- [6]猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析[D]. 朱蕴暖. 黑龙江八一农垦大学, 2017(08)
- [7]猪传染性胃肠炎病毒HQ2016毒株全基因组测序及半巢式RT-PCR检测方法建立[D]. 李明月. 黑龙江八一农垦大学, 2020(10)
- [8]猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究[D]. 黄小波. 四川农业大学, 2006(12)
- [9]猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）种毒的特性研究与制备[D]. 佟玲. 东北农业大学, 2013(10)
- [10]猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究[J]. 王树成,赵祥平,刘宏,董志珍. 中国畜禽传染病, 1998(01)