一、人工感染新城疫病毒引起La Sota疫苗免疫雏鸡细胞免疫功能及血清IgG抗体的动态变化（论文文献综述）
秦卓明[1]（2006）在《新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性》文中研究表明鸡新城疫（Newcastle disease,ND）是由一种Ⅰ型副黏病毒-鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引发的一种急性传染病。未经免疫的鸡群,传播性极强,发病和死亡率都非常高。即使一些已经多次免疫的鸡群,由NDV引发的急性和亚急性死亡仍不断零星发生,而由新城疫引起的呼吸道感染、亚临床感染及产蛋下降则更为普遍。六十年来,NDV一直是对鸡群危害最大的疫病。近十年中,国内禽病界一直试图在分子遗传水平阐明NDV毒株的变异趋势,在分子流行病学上已积累了大量毒株的资料和信息。但是,这些研究对信息的比较分析的深度不够,缺乏系统的对病毒的生物学性状与基因变异相关性的研究,特别是还没有在疫病控制方面最为关心的对不同基因变异的相关性及其与抗原性变异的相关性方面开展深入的研究。本研究测定和比较了三十株NDV野毒株的融合蛋白（F）基因和血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的全基因序列,首次对大量NDV毒株的F基因、HN基因,从致病性和抗原性变异两个方面及其与基因变异的相互关系进行系统的比较研究,获得了以下进展:一、NDV的分离鉴定和蚀斑纯化所用30个毒株均是1996～2005年期间从山东、江苏等不同地区的鸡、鸭、鹅、鸽等不同家禽分离,经用已知对NDV、禽流感（H5和H9型）等单因子阳性血清作血凝抑制试验（HI）证明均为NDV。同时对其中20株在细胞培养上完成了蚀斑纯化。二、NDV的致病性比较研究经MDT（鸡胚平均死亡时间）、ICPI（1日龄鸡脑内接种致病指数）及IVPI（6周龄雏鸡静脉致病指数）测定试验,30株NDV野毒有28株为强毒,1株为中等毒力,另一株尚未确定。对20个已蚀斑克隆纯化的病毒株的致病性作了重复实验,各毒株克隆纯化前后的毒力水平基本一致,表明分离物中的病毒组成是同源的。但有2个未能适应细胞的毒株例外,在经鸡胚连续传代后,与原代毒相比,一株的致病指数显着降低（SBZ02）,而另一株（SY03）从第5代则显着升高。这表明,有一部分原始毒可能存在着致病性不同的病毒混合物。三、NDV流行毒株的抗原性变异选择了17个克隆化毒株和3个参考株（La Sota、Clone30和F48E9）,利用SPF鸡分别制备了单因子阳性血清,分别用HI和病毒中和反应比较了它们与我国最广泛应用的Ⅱ型疫苗毒La Sota株和中国经典强毒F48E9间的抗原性交叉反应。结果表明:在我国鸡群中已
程相朝[2]（2003）在《新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制》文中研究表明针对近年来新城疫（Newcastle Disease Virus，ND）流行日益复杂，免疫失败屡屡发生的现状，为更好地作好本地区新城疫的防制工作，本文从以下6个方面进行了新城疫病毒地方株分子流行病学调查及所致疫病控制的应用研究。 1、新城疫病毒地方株的分离鉴定与生物学特性 对1998～2002年间洛阳地区15个代表性新城疫发病禽群中的NDV进行了分离鉴定和生物学特性的研究。结果表明，所分离的15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制活性，对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制。通过MDT、ICPI和IVPI指数的测定证实，LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株，其余均为强毒株。弱毒株的血凝素热稳定性好，属慢速血凝解脱型；强毒株的血凝素热稳定性差，属快速或中速血凝解脱型。所有毒株均可较好地凝集鸡和人（O型血）的红细胞，但对其它动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log2的12日龄试验雏鸡攻毒表明，15个分离株中两个弱毒株可得到完全保护（100％）；13个强毒株中，LG-1-99、LR-1-98、LD-4-01和LD-3-00得到了基本保护（70—90％），而其它9个分离株（LD-1-98、LD-2-99、LD-5-01、LD-7-02、LR-3-02、LW-1-02、LG-2-00、LA-1-99和LE-1-01）则基本上得不到保护（0～20％）。但所有得不到保护的试验鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。 2、新城疫病毒地方株的分子流行病学调查 利用RT-PCR技术，对所分离到的15个新城疫代表性地方毒株的F基因主要功能区片断进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，15个地方毒株依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同可分为明显的三群，群内各毒株同源性较高，而群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同而引起的明显株间差异。其中第一群包括9株，涉及到各时间段分离的毒株和各分离禽种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚群区；第二群包括4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株，分散于进化树的基因Ⅵ型区；第三群包括2株，属古典基因Ⅱ型弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。综合说明本地区目前流行的NDV以新型的基因Ⅶ型最为普遍，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株来源相近，在本地区流行时间较短，株间差异不大。 3、新城疫病毒地方株不同基因型三价灭活油乳苗的研制 应用两株当地流行的新城疫病毒基因Ⅵ型和Ⅶ型代表株（LD-3-00和斯城改病毒地方株兮各流行病李们女践其改扁拉刊LD一7-02），配以传统的La sota株（基因11型）成功地研制了不同基因型三价新城疫灭活油乳苗.经实验室检验及大田试验证明，该三价苗安全可靠，在接种后第42天时Hl抗体效价仍保持在7.51092，攻毒试验保护率达100%;在大田试验中，与新城疫弱毒疫苗联合应用，整体保护率可达99%以上，能有效地控制当地新城疫的暴发和流行。 4、NDV地方株三价灭活油乳苗与La sota株灭活油乳苗免疫效果比较 将研制的地方株三价灭活油乳苗与La Sota株单价灭活油乳苗进行了免疫效果的比较.结果显示，三价苗免疚组在接种后各个时期所产生的HI杭体效价与La Sota株灭活苗免疫组无明显差异（P>0.05），至接种后第42天二者均具有7.31092。但在对具有相同HI杭体水平的试验鸡进行的不同毒株攻毒试验中，二者差异较大.对于F48E9标准强毒株的攻击，无论是La Sota株疫苗免疫鸡还是三价灭活苗免疫鸡，在Hl杭体效价为6109:以上时均能100%地被保护;而在La sota株疫苗免疫鸡HI效价为6109:左右时，对基因vn型野毒株的攻击，保护率却只有O%一20%;此时，三价疫苗免疫鸡则具有60%一70%的保护率;当HI效价达81092左右时，La Sota株疫苗免疚鸡对基因vII型野毒株的攻击也只有80%的保护率，而三价疚苗免疚鸡可100%地被保护;La sota株疫苗免疫鸡只有HI效价在9109:以上，方可100%地抵杭基因vn型野毒株的攻击.说明应用由地方分离株不同基因型野毒株配以传统的La Sota株所制备的三价灭活苗的免疫效果明显优于常规的单价La sota株灭活苗，是控制目前新形势下新城疫流行的有效措施. 5、NDVF基因DNA疫苗对地方株三价灭活油乳苗的免疫协同作用 为进一步探讨控制新城疫发生和流行的新途径，本文首次观察了F基因peDNA3真核表达质粒（DNA疫苗）对地方流行株三价灭活油乳苗的免疫协同作用.结果显示:在7日龄时应用三价灭活油乳苗和DNA疫苗联合免疫的鸡群，到56日龄整个观察期内，不但利用MTT法检测的T、B淋巴细胞增殖情况显示出联合免疫组鸡的胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯三价油乳苗免疚组（其中除在接种后第7天时两组鸡B淋巴细胞增殖的OD570值差异不显着外，其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01），特别是T淋巴细胞增殖情况在接种14天后均表现为差异极显着，p<0 .01.）;而且联合免疫组的HI杭体效价也持续性高于单纯三价油乳苗免疫鸡群，并在免疚接种后35一49天时差异显着（p<0 .05）.在56日龄（免疫接种后第49天）时进行的LD一7一02野毒株攻毒保护试验中，
唐娟[3]（2019）在《鸡细胞免疫应答检测方法的建立及其应用》文中指出细胞免疫应答在疾病控制过程中发挥重要作用,这在小鼠等模式动物中已经得到了确认,但由于缺少相关生物试剂、禽类免疫系统特殊性等因素,家禽中细胞免疫应答的研究受到较大的限制,严重制约了禽病相关疫苗的研发和应用。因此,建立禽类细胞免疫应答检测分析技术将进一步推动禽类相关生物制品的开发和疾病的有效控制。本研究以鸡为动物模型,利用现有的生物材料,建立一套评价鸡细胞免疫应答的分析技术体系,包括T细胞增殖检测方法、鸡T细胞亚群分析技术以及细胞毒性T细胞的杀伤能力测定方法等,为家禽细胞免疫应答的研究提供了新的手段和技术;分别以鸡白痢沙门菌候选疫苗株和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫雏鸡,利用所建立的细胞免疫技术平台评价上述疫苗诱导的细胞免疫应答特性,为禽病疫苗的研制和改进提供新的思路和指导。1.鸡细胞免疫应答检测方法的建立无菌采集鸡脾脏,制备脾脏单细胞悬液,分离淋巴细胞,以ConA刺激淋巴细胞,利用BrdU ELISA方法建立了鸡T细胞增殖检测技术;利用流式细胞术建立了鸡T细胞亚群分析、T细胞亚群分选和细胞凋亡检测技术;同时利用磁珠标记的抗体建立了鸡CD8+T细胞的磁分选技术。BrdU ELISA检测结果显示,与未刺激组相比,ConA刺激后能够明显地检测到T细胞增殖,且重复性较好。在流式细胞术分析和分选结果中,CD4+和CD8+T细胞亚群分群明显,分选后CD8+T细胞纯度达到97%以上,分选效果明显;通过磁珠分选技术获得的CD8+T细胞纯度可达94%以上,分选速度快,耗时短。此外,Annexin V-FITC/PI双标记法可有效地检测鸡细胞凋亡和死亡情况。以上建立的细胞免疫检测技术,为家禽细胞免疫应答的分析和评价提供了有效技术支撑。2.鸡白痢沙门菌疫苗候选株诱导细胞免疫应答的分析与评价将鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株S06004△spiC以肌肉注射的方式免疫3日龄雏鸡,同时以PBS注射组作为对照,以建立的鸡细胞免疫应答分析技术平台评价S06004AspiC诱导的免疫应答。细胞增殖检测结果显示,与PBS对照组相比,S06004△spiC免疫组淋巴细胞在鸡白痢沙门菌特异性抗原体外刺激后分别在免疫后14 d（P<0.001）和21 d（P<0.01）发生显着增殖。T细胞亚群分析结果显示,免疫后第14、28、35 d,CD8+T细胞亚群比例显着升高。在CTL杀伤实验中,以巨噬细胞为靶细胞,免疫组CTL细胞的杀伤能力明显高于未免疫组（P<0.05）。ELISA检测血清中细胞因子结果显示,血清中IFN-y含量在免疫后第5 d开始均高于对照组。血清抗体测定结果显示,S06004AspiC免疫后第7 d可以检测到IgG抗体,第21 dIgG抗体含量达到最高值。以上结果表明,本研究所建立的鸡细胞免疫应答分析技术平台可用于鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株S06004△spiC诱导细胞免疫应答的评价,S06004△spiC能够诱导较强的细胞免疫应答,为鸡白痢沙门菌疫苗的开发和研制提供了重要数据支撑。3.鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫应答的分析与评价将鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗通过滴鼻滴眼方式免疫3日龄雏鸡,同时设置PBS免疫组作为对照,检测疫苗所诱导的免疫应答特性。与PBS对照组相比,疫苗免疫组在第7、21、28 d时T细胞发生显着增殖;免疫后第28 d,T细胞亚群均发生了显着性变化;以肾细胞为靶细胞,免疫组CTL细胞具有较强的杀伤能力,且高于未免疫组;细胞因子转录水平检测结果表明,免疫组脾脏中各细胞因子的表达量均高于对照组,其中IL-2、IL-4、IL-10的表达量在第14d差异显着。气管灌洗物中IgA抗体水平于免疫后第7 d即可检测到,且在第28 d达到峰值;免疫后第21 d血清中IgG抗体水平显着高于对照组,且第28 d差异最为显着。综上表明,鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗能够诱导较强的鸡细胞免疫应答、体液免疫应答和黏膜免疫应答。本研究利用所建立的鸡细胞免疫应答分析技术对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫进行评价,为该疫苗的使用和改进提供了新的理论依据。
戴建华[4]（2018）在《新城疫病毒La Sota C5株反向遗传操作平台的优化及Class Ⅰ/Ⅱ嵌合弱毒株的构建与免疫原性评价》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的一种具有高度传染性的烈性传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为需报告疾病之一。NDV属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）,副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）,禽腮腺炎病毒属（Avuluvirus）的成员,是单股、负链、不分节段、有囊膜的RNA病毒。本研究对实验室前期构建的La Sota C5反向遗传平台进行了改造和优化,发现改造后的感染性克隆GLaSotaC5与LaSota序列完全一致;且其拯救效率有明显提高。在此基础上构建了 JS10 M/F/HN三个基因替换的重组病毒GLaSotaC5M/F/HN,并比较了其免疫原性。1.新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的改造与优化参照La Sota C5株的全基因序列,将基因组分成4段,经RT-PCR从La Sota C5株感染的尿囊液中扩增目的片段,分别连入克隆载体中;然后顺次克隆到pMD-20T载体中,构建含有La Sota C5基因组大部分片段的中间质粒T-ABCD。该质粒和前期构建的TVT-LT分别经BglⅡ酶切后回收大片段,最后连接为含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-G La Sota C5。将三个辅助质粒与全长转录载体共转染能稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞。转染后72 h收集细胞,反复冻融三次后接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。收集24 h后死亡鸡胚尿囊液,按OIE标准测其血凝（HA）效价,并用RT-PCR方法和基因测序鉴定是否为拯救病毒。结果显示第一代尿囊液HA效价为28,传代三次后,HA滴度上升为211。序列测定表明拯救病毒带有引入的遗传标记,证明成功拯救出了具有感染性的GLa Sota C5株新城疫病毒。La Sota C5株反向遗传操作平台的建立为后续研究新城疫弱毒各结构基因功能、开发新型新城疫病毒疫苗等的研究奠定了基础。2.嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的构建RT-PCR方法分别扩增出JS10株的M,F和HN基因,T-A克隆测序后经PCR定点诱变连续缺失两个酶切位点,再通过定向克隆构建成中间质粒至T-AB2中;使用两端的Pac Ⅰ和ASC Ⅰ单酶切位点将JS10株的M,F和HN基因整体与TVT-GLa Sota C5的相应片段替换,从而构建成三基因替换的重组转录载体TVT-GLa Sota C5M/F/HN。随后将TVT-GLa Sota C5M/F/HN 与 3 个辅助质粒pCI-L、pCI-NP 和 pCI-P共转染BSR-T7/5 细胞,成功拯救出致弱的病毒GLaSotaC5M/F/HN,其血凝价210、鸡胚半数感染量（EID50）为1010.2EID50/ml、鸡胚最小致死剂量平均死亡时间（MDT）大于120h、脑内接种致病指数（ICPI）为0.22、静脉接种致病指数（IVPI）为0。经SPF鸡胚连续传12代后未发现生物学特性改变。上述结果表明拯救的病毒毒力已明显致弱、血凝价明显升高、遗传稳定性良好,是一个较为理想的疫苗候选株。3.嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的免疫原性评价为了比较GLa Sota C5M/F/HN与常用疫苗株La Sota的免疫原性差异,我们首先制备了 GLa Sota C5M/F/HN和La Sota的高免血清并对不同基因型的NDV毒株对进行交叉血凝抑制试验。比较后发现,GLa Sota C5M/F/HN的抗血清对受试的强毒株的HI效价均高于LaSota的抗血清。随后选取了 5株强毒与两种血清分别进行细胞交叉中和试验、鸡胚交叉中和试验,结果显示GLa Sota C5M/F/HN的抗血清对所有强毒株的中和效价均比La Sota抗血清高3-5倍,对Class Ⅰ强毒9a5b的中和效价是La Sota的10倍。最后我们将GLa Sota C5M/F/HN和La Sota分别免疫SPF鸡,然后用Class Ⅱ基因Ⅶ型强毒株ZJ1攻毒,Ⅸ强毒F48和Class Ⅰ强毒9a5b攻毒比较两者的免疫效果。结果显示上述两者均能提供100%的保护,但GLa Sota C5M/F/HN能显着降低免疫鸡群攻毒后的排毒率。上述试验表明,GLa Sota C5M/F/HN有望成为新的弱毒疫苗候选株。4.嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的黏膜免疫水平评价选取60只SPF雏鸡,随机分为A、B、C 3组,每组20只。A组和B组分别于7日龄时以滴鼻点眼方式免疫GLa Sota C5M/F/H/和La和La Sota,免疫剂量均为106 EID50,C组为不接种病毒对照组。在免疫后第1d、4d、7d、14d,每组抽取5只鸡,处死后采集各种黏膜洗脱液,间接ELISA检测其IgM,IgG和SIgA抗体水平。研究结果表明:两株病毒免疫7日龄雏鸡后均可引起机体的局部黏膜免疫应答,且GLa Sota C5M/F/HN所诱导的黏膜免疫水平略高于La Sota。对免疫球蛋白亚类检测表明,系统性免疫应答主要以IgG抗体为主,而局部黏膜免疫应答则以SIgA抗体为主。
苏奇[5]（2019）在《新城疫弱毒疫苗中禽腺病毒和鸡传染性贫血病毒混合污染的鉴定及人工模拟致病性分析》文中提出19世纪50年代以来,新城疫弱毒疫苗在世界范围内广泛应用,为新城疫（Newcastle disease,ND）预防和控制取得了辉煌的成就。但研究显示弱毒疫苗中可能存在外源病毒的污染,进而导致多种疫病在被免疫鸡群中的发生。本研究在对禽用弱毒疫苗进行外源病毒检测时通过PCR结合斑点杂交方法也发现在同一批新城疫弱毒疫苗中存在4型禽腺病毒（fowl adenovirus type 4,FAdV-4）和鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus,CIAV）的混合污染,随后本研究通过血清中和及鸡胚培养的方式对上述两种病毒进行了分离纯化并测定了CIAV的全基因组以及FAdV的部分hexon基因。序列比较和遗传进化分析显示其与目前中国流行株具有较高的同源性。为评估NDV弱毒疫苗中FAdV-4和CIAV混合污染的致病性,本研究通过制备人工模拟污染疫苗并分别免疫SPF和FAdV母源抗体阳性鸡群进行了系统的动物实验。结果显示,使用单独污染CIAV或无污染的疫苗并不会引发SPF鸡死亡,而使用混合污染疫苗能引发明显的心包积液-包涵体肝炎综合征（inclusion body hepatitis-hydropericardium syndrome,IBH-HPS）并导致高达75.0%的死亡率,显着高于使用单独污染FAdV疫苗后所引发的死亡率（3.70%7.40%）。同时,通过疫苗污染而感染的外源病毒可在鸡体能持续增殖,引发生长迟缓和胸腺萎缩,进而造成免疫抑制并显着降低NDV抗体水平。另一方面,NDV弱毒疫苗本身在外源病毒致病过程中发挥重要作用,FAdV-4和CIAV通过疫苗污染方式感染鸡群的致病性要显着高于其直接感染,且同等剂量FAdV-4和CIAV经口服感染SPF鸡群后并不会导致死亡。同时,外源病毒与疫苗毒株LaSota的相互作用促进了彼此在多种器官中的增殖并能有效降低宿主免疫系统产生的中和抗体水平,而多种器官中过高的LaSota病毒载量以及外源病毒的存在激发了疫苗毒株的致病性导致被免疫鸡群发生典型的淋巴滤泡出血以及腺胃点状出血等ND示病症状,最终进一步加重病情。母源抗体是保护雏鸡早期免受病毒侵袭的重要屏障,但本研究显示雏鸡孵化后母源抗体水平于三日龄到达高峰,随后迅速下降,至7日龄疫苗接种时已降至较低水平,但其与免疫系统的双重作用仍能有效抑制通过人工模拟污染疫苗单独感染的FAdV-4,而混合污染疫苗中CIAV的存在能抑制免疫反应进而辅助FAdV突破母源抗体的保护,并最终引发明显的IBH-HPS以及15%左右的死亡率。临床数据显示,部分养殖场在使用了无外源病毒污染的NDV弱毒疫苗后同样爆发了IBH-HPS,而同批未免疫鸡群发病率较低。研究发现,免疫NDV弱毒疫苗能促进FAdV和CIAV在宿主体内的复制,进而显着提升其经垂直传播感染的致病性并加速病程,引发明显的贫血症状并导致IBH-HPS在低日龄雏鸡中发生。
钦琪[6]（2020）在《表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒rmNA-VP3免疫效果评价》文中提出新城疫（Newcastle disease,ND）和鹅细小病毒病（Golsing plague,GP）是分别由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）及鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）引起的严重危害我国养鹅业的两种疾病,均具有高死亡率。疫苗是防控ND和GP的有效手段,但随着病毒不断进化、流行趋势的改变及我国防控力度的加强,常用的传统ND及GP弱毒疫苗株已不能满足防疫需求。NDV只有一个血清型,但基因型众多,当前NDV流行主要以基因VII型毒株为主,但如今商品化ND疫苗株多为基因II型、III型,与基因VII型毒株同源性较低,遗传距离较远,当基因VII型NDV强毒攻击家禽时,传统疫苗并不能提供彻底的保护,且能够从免疫家禽体内分离出NDV强毒株,这不利于ND的防控及净化,因此,使用与流行毒株基因型匹配的疫苗是防控ND的必然趋势。GPV具有严格种属特异性,弱毒疫苗生产上只能使用鹅胚或番鸭胚,这导致疫苗在生产中有诸多不便且成本较高,且弱毒苗在使用中存在潜伏感染的危险,因此,GP新型疫苗的研发是势在必得。为了弥补传统疫苗的缺陷,也为了能够同时防控ND和GP,本实验室前期以鹅源基因VII型NDV NA-1株为研究对象,构建了NDV反向遗传操作平台,同时用此平台将NDV强毒株NA-1株F蛋白裂解位点氨基酸序列致弱突变为弱毒株LaSota F蛋白对应序列,构建了重组NDV rmNA-1,在此基础上,插入GPV主要保护性抗原VP3蛋白基因组,构建了表达GPV VP3基因的重组NDV rmNA-VP3。本研究对重组NDV rmNA-VP3的稳定性,安全性及临床免疫效果进行评价,以判断其是否具有作为新一代防控ND和GP疫苗候选株的潜力。一、重组NDV rmNA-VP3遗传稳定性检测为检测重组NDV rmNA-VP3遗传稳定性,将rmNA-VP3分别在鸡胚及鸡体内进行连续传代。将rmNA-VP3在SPF鸡胚内连续传代至第25代,经氨基酸序列分析后,rmNA-VP3 F蛋白裂解位点氨基酸序列未发生返强突变;将rmNA-VP3在鸡体内连续传代5次,经氨基酸序列分析,F蛋白裂解位点未发生返强突变,结果表明rmNA-VP3可在鸡胚内至少稳定遗传25代,在鸡体内可至少稳定遗传5代,表明重组NDV rmNA-VP3具有较好的稳定性。二、重组NDV rmNA-VP3实验室安全性试验安全性是考察疫苗品质的重要指标之一。本研究通过单剂量多次接种试验及单次超剂量接种试验对重组NDV rmNA-VP3进行安全性评价。将重组NDV rmNA-VP3以106EID50（0.2mL）/只的剂量,以颈部皮下注射的方式接种16日龄雏鹅,两周后以同等剂量同一接种方式再次进行接种,接种后临床观察雏鹅两周发现雏鹅表现正常,剖检组织器官无病理变化。使用常规接种剂量的10倍接种16日龄雏鹅,接种后临床观察雏鹅两周,雏鹅表现正常,剖检组织器官无病理变化。证实重组NDV rmNA-VP3安全性良好。三、重组NDV rmNA-VP3免疫效果评价为测评重组NDV rmNA-VP3临床保护效果,将重组NDV rmNA-VP3对16日龄、30日龄雏鹅两次免疫,两周后使用基因VII型NDV强毒株NA-株及GPV强毒株进行攻毒试验,同时设置ND商品疫苗LaSota组、GP商品疫苗SYG41-50组及PBS对照组,以便通过对比进一步测评rmNA-VP3临床保护效果。存活率观察显示rmNA-VP3能够对雏鹅产生100%的保护。ND抗体监测结果显示,rmNA-VP3组与LaSota疫苗组抗体水平相差无几,但攻毒后rmNA-VP3组ND抗体水平会先下降后再回升至最高,这是由于疫苗株与强毒株基因型匹配所致。GP抗体水平检测显示,rmNA-VP3组与SYG41-50组抗体水平相差无几。排毒检测发现,攻毒后,rmNA-VP3免疫组雏鹅排毒量少,终止排毒时间早于ND及GP商品疫苗组。检测除雏鹅体内病毒分布发现rmNA-VP3免疫组雏鹅体内病毒分布较少,体内病毒清除速度更快。这表明,当NDV疫苗株与流行毒株基因型匹配时,疫苗保护效果更为理想,同时VP3基因在雏鹅体内表达良好,能够诱导雏鹅机体免疫反应,帮助雏鹅抵御GPV强毒的攻击。
丁壮[7]（2001）在《新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究》文中指出从我国部分地区分离、鉴定了23株新城疫病毒（NDV），并对其部分生物学特性进行了研究。这23株NDV均能凝集鸡和人（O型血）的红细胞，对猪、山羊、绵羊、牛和马的红细胞凝集作用有差异。分离、鉴定的23株NDV，电镜下呈现圆形或椭圆形，直径100-500nm，囊膜上有长约8-10nm的纤突。NDV分离株及F48E8经鸡胚成纤维细胞培养，形成稳定的病毒蚀斑。血凝解脱及血凝素热稳定试验表明，四平株、昌黎株、青岛株和F48E8为快速解脱型，血凝素热稳定性差，而长春株为慢速解脱型，血凝素热稳定性好。鸡胚平均致死时间（Mean Death Time of chicken embryos，MDT）、脑内致病指数（Intracerebral Pathogenicity Index，ICPI）和静脉致病指数（IntravenousPathogenicity Index，IVPI）的检测结果表明，长春株是弱毒株（MDT大于168h、ICPI为0.25、IVPI为0），四平株（MDT为61.2h、ICPI为1.45、IVPI为1.96）、昌黎株（MDT为64.5h、ICPI为1.45、IVPI为2.48）是中强毒株，青岛株（MDT为57.9h、ICPI为1.65、IVPI为2.75）为强毒株。 参考有关文献，设计并合成了一对特异引物。应用RT-PCR，一次性扩增了NDV四平株、昌黎株、青岛株、长春株和F48E8（国家标准NDV强毒）的全长HN基因。扩出的四平株、昌黎株、青岛株和F48E8HN基因均为1713bp，编码571个氨基酸，其中四平株和F48E8HN基因有5个糖基化位点，青岛株和昌黎株HN基因有6个糖基化位点，四平株有12个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和F48E8HN基因含有13个半胱氨酸残基。从同源性分析和系统发育进化树结果来看，野生毒四平株、青岛株、昌黎株与F48E8相比较，氨基酸序列同源性分别为98.8％、89.7％、89.8％，而国外强毒株Tex.GB、Miyadera、Italien与标准强毒F48E8氨基酸序列同源性分别为87.6％、90.9％、91.1％，说明国外强毒株与国内标准强毒株在HN基因上同源性并不是很高，而国内分离毒四平株与F48E8在HN基因上有非常高的同源性，而青岛株、昌黎株与四平株比较，与F48E8相差近10个百分点，说明国内不同地区的NDV分离株HN基因的同源性相差是很大的，用一种或两种标准强毒制成的疫苗用于防制新城疫难免会出现免疫学上的偏差，而用国内不同地区分离的、同源性不一致的、以基因Ⅶ型为主、辅以Ⅷ型及老基因型（Ⅰ～Ⅵ）、加上我的特有的基因Ⅸ型 新城疫病毒HNffi白基因的克降、序列分析、表达及其免疫原件叭究 怕 NDV F。止卜 F。术。等)流行毒株制成的 NDV多价灭活苗代替国外进 L］的 灭活油苗来防制我国鸡新城疫的发生可能会更有针对性，防制效果会更好。 长春株HN基因为173fop，编码577个氨基酸，有5个糖基化位点，门 个半脱氨酸残基，NDV长春株与 Lasota、Queensland V4、D26厂6和 UlSter ％ 弱毒株的 HN基因的氨基酸同源性在 98．8％～93．4％，系统发育进化树也协J川＼ 非常近的亲缘关系。王兴龙等研究表明，＊＊V长春株F基因裂解位点区门门－ 117)的氨基酸组成为 Gly－Arg－Gin－GlyArg＊eu，与所有弱毒株在这一区域的序 列Gly，Arg／Lys－Gin－Gly／Ser－Afg－Leu十符。由此更进一步证实长春株为弱毒株。 我国目前还没有研究低毒力＊＊V弱毒株的报道，此弱毒株的发现将为我的研 制自己的弱毒疫苗提供疫苗候选株。 将 NDV四平株和长春株 IIN基因亚克隆进入 pFastBac，构建了重组转 座载体phst HN，通过转座得到了重组表达载体pBacmid HN，后者转染昆虫 细胞后产生重组杆状病毒。重组杆状病毒在昆虫细胞中成功地表达了u蛋 白。经SDS－PAGE和Western七＊检测，表达的HN蛋白分子量为74kDa川。昆 虫细胞内糖基化X 还有一个67kDa的小蛋白(未糖基化X 与国外报道结来 致。 NDV四平株，青岛株，昌黎株，长春株和NDV F化止；株重组 HN蛋白二 倍连续稀释后，按6一微量法测定血凝效价，结果HA值分别为2‘、2‘、2‘’、 2’、2‘，应用抗NDV HN单克隆抗体做血凝抑制试验，HI效价分别为2‘、2’、 2’、2’、2’。结果表明，表达的重组HN蛋白均具有良好的血凝活性，1｛这 种血凝活性能够被抗NDV单抗所中和。 用 NDV四平株和长春株表达的 HN重组蛋白分别免疫 15 H龄雏鸡，免 疫两次，间隔两周。免疫剂量为600U令只，第一次加弗氏亢全佐剂，第 欣 加弗氏不完全佐剂。同时设新城疫V4油苗对照组和 F。术s攻毒组。统计临床 发病与兔疫保护情况，用间接ELISA检测抗HN蛋白抗体效价，用HA爿 检 测血凝抑制抗体效价。结果表明，F。术s攻毒组20只鸡经过4天的潜伏期后， 全部发病，8天内全部死亡，油苗对照组20只鸡全部存活，四平株HN r
张赫[8]（2020）在《HP-PRRS重组NDV载体疫苗构建、免疫评价及其佐剂研究》文中认为高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS）,又称高致病性猪蓝耳病,被世界动物卫生组织（OIE）规定为必须报告的动物疫病,其致病因子为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）。自2006年我国首次爆发HP-PRRS后,十多年来该病已经给我国养猪业造成了巨大的经济损失。HP-PRRS主要是以各阶段猪群的呼吸系统疾病以及妊娠母猪早产、流产、死胎等繁殖障碍为特征,并且造成较高的死亡率。近年来,随着HP-PRRS防控手段的多元化,疫病态势趋于良好,但仍存在散毒范围较广、毒株变异等问题,防控形势依然严峻。《国家高致病性猪蓝耳病防治指导意见（2017—2020年）》中指出,坚持以预防为主仍是当前的防控原则。进一步开发研制安全有效的HP-PRRS疫苗将有利于从源头控制疫病发生,有助于最终实现净化目标。病毒载体疫苗因兼备载体病毒和外源蛋白的免疫优势已成为当前HP-PRRS疫苗研发的热点,具有广阔的应用前景和价值。为此,本文开展了HP-PRRS重组新城疫病毒载体疫苗的构建与免疫原性评价及其佐剂实验研究。1. HP-PRRS重组新城疫病毒候选疫苗的构建及鉴定新城疫病毒（Newcastle virus,NDV）是一种应用范围广泛的优质疫苗载体。本研究首先通过RT-PCR扩增HP-PRRSV GD株的主要结构蛋白基因ORF3和ORF5片段。基于NDV La Sota株反向遗传平台,通过同源重组技术分别将ORF3-double、IRES、ORF5-double和ORF5-single等外源片段克隆至NDV载体中,构建两种重组NDV感染性克隆。通过磷酸钙转染法,将重组质粒连同三种辅助质粒p BS-NP、p BS-P和p BS-L共同转染BSR细胞。将收获的细胞培养液接种9日龄SPF鸡胚进行病毒拯救,通过血凝实验判定病毒拯救效率。利用IFA和Western Blot判定重组病毒外源蛋白表达情况,测定NDV MDT、ICPI和IVPI等毒力学评价指标判定重组病毒的毒力水平。质粒鉴定结果显示成功构建得到重组质粒p BRN-FL-ORF5和p BRN-FL-ORF3-IRES-ORF5;血凝实验结果显示成功拯救出两株重组病毒r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5,且重组病毒在接种鸡胚后72 h时均可达到滴度峰值(8.7 log EID50/m L);RT-PCR结果显示外源片段均成功插入到NDV载体基因组内,且具有良好的鸡胚遗传稳定性;IFA和Western blot结果显示两株重组病毒均有效表达外源蛋白。根据OIE对NDV毒力的评价标准,两株重组病毒均属弱毒株,同母本毒一致。本实验结果表明成功构建并拯救得到两株重组病毒r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5,其可作为候选疫苗进行后续动物免疫原性及安全性评价实验研究。2. 重组NDV候选疫苗小鼠致病性及免疫效果评价本实验以小鼠作为动物模型评价两种重组候选疫苗r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5在小鼠体内的致病性和免疫效果。分别将两种重组候选疫苗以肌肉注射和颅内注射的方式接种小鼠,连续两周测定体重变化。在接种后第14天采集各组小鼠主要器官组织,利用RT-PCR方法检测病毒残留。以肌肉注射的方式免疫小鼠,分别在体液和细胞水平评价免疫效果。致病性实验结果显示重组病毒以肌肉和颅内注射方式接种小鼠后,小鼠体重变化趋势均与PBS对照组相近;RT-PCR结果显示小鼠各主要器官组织内均未检测到病毒残留。免疫原性评价结果显示与r La Sota-GP5（滴度:9.10±1.91）相比,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可刺激小鼠产生更高水平的特异性中和抗体（滴度:12.64±4.15）,可显着刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖。本实验结果表明两株重组病毒接种小鼠均未显着引起体重异常变化且无组织病毒残留,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可刺激小鼠产生更高水平的体液和细胞免疫反应。3. 重组NDV候选疫苗猪体内安全性评价本实验分别从基因水平、蛋白水平、病毒外排和临床状态等四个方面对所构建的两种重组NDV候选疫苗r La Sota-GP5与r La Sota-GP3-GP5进行猪体内免疫安全性评价。采集猪主要器官组织、血液、排泄物等样品,利用q RT-PCR检测重组疫苗在猪体内复制周期和病毒排出情况;通过免疫组化检测主要器官组织中的蛋白表达情况;观察免疫猪的生长活动状态,通过主要组织病理切片判定是否导致病变。结果显示重组候选疫苗免疫猪只后生长活动状况和饮食饮水状态均未出现异常情况,组织器官病理切片均未观察到明显的病变特征;q RT-PCR实验结果显示重组候选疫苗在猪体内复制能力有限,不超过10天,且不存在病毒外排的风险;免疫组化结果显示各主要器官组织NDV蛋白表达均为阴性。本实验结果表明两种重组候选疫苗免疫猪只后均具有良好的安全性。4. 重组NDV候选疫苗猪体免疫效果评价本实验分别从体液免疫水平（特异性中和抗体）、细胞免疫水平（细胞因子、淋巴细胞增殖、细胞亚群检测）和攻毒保护实验（体温监测、病毒残留检测）三个方面进行重组候选疫苗猪体免疫效果评价。结果显示重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5免疫原性较好,在加强免疫后第14天可刺激猪产生较高水平的特异性中和抗体（25.49±2.65）,诱导产生高浓度的IFN-γ（999.42 pg/m L）,总体明显优于r La Sota-GP5。与商品化疫苗相比（特异性中和抗体滴度:16.93±2.89;IFN-γ:450.49 pg/m L）,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5的体液和细胞免疫应答水平更为突出。攻毒保护实验结果显示,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可显着降低攻毒后猪只血液和部分器官组织中的病毒载量。本实验结果表明重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5具有较突出的免疫原性优势,可作为HP-PRRS防控的技术储备。5. 候选佐剂的制备、筛选及其免疫增强效果评价研究表明NDV抗原提呈水平呈现出负调控,而佐剂被认为具备相应的抗原提呈调节作用。为了进一步提升重组候选疫苗的免疫效果,本研究制备并筛选在NDV抗原提呈和小鼠免疫增强效果两方面均具有明显优势的配伍佐剂,并在猪体内评价配伍佐剂与重组候选疫苗的联合免疫增强效果。通过比较C57BL/6和BALB/c小鼠源DC的生长状态和抗原摄取提呈能力,筛选出适用于后续佐剂实验的DC来源。将四种中药配伍成分（TCM 1-4）均设置高、中、低三个剂量组别,分别基于商品佐剂（ISA 206）和中药佐剂（TCM-Main）制备两类配伍佐剂。评价商品配伍佐剂的均一稳定性和中药配伍佐剂的抗原摄取提呈水平,分别在小鼠体内检测两类配伍佐剂的免疫效果,筛选出优势佐剂,并在猪体内进行免疫增强效果验证。结果显示BALB/c小鼠源DC与同期的C57BL/6小鼠源DC具有相似的分化形态、NDV抗原摄取和提呈能力。商品配伍佐剂均具有良好的稳定性,粒径较为均一;B-4号中药配伍佐剂高剂量组可显着增强DC对NDV抗原的摄取和提呈能力。两类佐剂小鼠免疫评价结果显示,B-4号中药配伍佐剂高剂量组免疫小鼠后可刺激产生更高水平的特异性抗体和IFN-γ。猪体免疫评价结果显示,辅以高剂量B-4号佐剂的重组候选疫苗免疫增强效果更为突出,在攻毒后可降低猪器官组织中的病毒载量。本实验结果表明B-4号中药配伍佐剂可增强重组候选疫苗在猪体内的免疫效果,为今后猪体免疫中药佐剂的进一步研发优化奠定了基础。
刘蒙蒙[9]（2015）在《基因Ⅶ型NDV强毒株反向遗传系统的建立及其应用研究》文中研究表明新城疫（Newcastle Disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国农业部在动物疫病病种目录中将其列为一类动物疫病。疫苗免疫是防控该病的主要手段,但目前使用的疫苗株与流行株在同源性上存在一定差异,这使得一些免疫鸡群仍然存在ND的爆发。我国NDV的流行株以基因VIM型为主。本实验室多年来一直从事NDV的流行病学调查工作,在各类鸡群中分离的NDV强毒均属于基因Ⅶd型。这些毒株的主要免疫原性蛋白F和HN的同源性分别为96%～100%和93%～100%,相比之下这些毒株与疫苗株La Sota的F和HN蛋白的同源性仅为87.4%～88.8%和86.7%～88.8%。NDV SG10株属于基因Ⅶd型强毒株,是本实验室于2010年自爆发NDV的免疫鸡群中分离获得。前期的研究表明SG10具有较好的繁殖特性和免疫原性。其HN和F蛋白与其他基因Ⅶ型毒株的同源性分别在96.7%-99.7%和96.2%99.8%之间,与常用疫苗株La Sota的同源性分别为87.9%和88.3%。本研究首先构建了SG10株的感染性克隆,通过对拯救病毒rSG10的生物学特性分析表明,重组病毒rSG10保留了与亲本毒SGI0相似的生物学特性。随后,我们通过该反向遗传平台对SG10株NP基因的5’非编码区6nt进行了缺失,构建了突变株SG10-6bp。与原毒株SG10相比,突变株SG10-6bp的生物学特性和致病力均未发生明显变化,表明NP基因的5’非编码区的6nt并不影响NDV毒力。随后,我们对SG10的F蛋白裂解位点处的氨基酸进行了突变,使其在序列上与弱毒La Sota相同,构建了突变株aSG10。与亲本毒相比,aSG10的毒力明显下降,其毒力与疫苗株LaSota相似,这表明F蛋白裂解位点是决定NDV毒力的主要因素。在此基础上,我们将致弱毒aSG10改造成为了外源蛋白表达载体。我们选择将外源基因插入在P与M之间,分别以绿色荧光蛋白和传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因作为报告基因,构建了重组病毒aSG10-EGFP和aSG10-S1,结果表明外源基因EGFP和S1蛋白均获得了表达,这说明致弱株aSG10可以作为外源基因表达载体。为了验证致弱株aSG10作为疫苗株的可行性,我们对aSG10进行了1日龄雏鸡免疫试验,免疫鸡在观察期内无明显的临床症状,同时剖检观察和病理组织学检查也表明aSG10对雏鸡的各个组织和器官均未造成明显的损伤,这表明aSG10作为疫苗株具有良好的安全性。随后,我们对免疫3周的动物进行了强毒株SG10的攻毒试验,结果显示aSG10株免疫组未出现明显的临床症状,病理剖检观察和病理组织学检查也表明aSG10很好地保护了免疫动物。对免疫后的排毒情况进行检测也表明,aSG10能更有效地阻止攻毒后的动物向外界排毒。同时,使用SG1O作为抗原进行HI检测表明,aSG10免疫组的HI抗体水平较La Sota免疫组高一个滴度,表明aSG10能刺激机体产生与强毒株SG10更匹配的免疫反应。
吴芬芳[10]（2007）在《新城疫病毒样颗粒免疫效力的初步研究》文中提出本实验室采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,已经成功获得了共表达新城疫病毒（Newcastle Disease virus, NDV）F48E9株F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M,并证明其感染Sf9细胞后,可以在细胞表面形成并释放新城疫病毒样颗粒（Newcastle disease Virus-like particles,ND-VLPs）。为了研究ND-VLPs的免疫原性和免疫效力,本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,并对其生物学特性进行分析。通过Western blot检测到培养上清中HN,F,NP,M蛋白的共表达,同时在负染电镜下观察到表面有纤突的类似NDV的圆形粒子,证明4种蛋白在Sf9细胞内装配成了VLPs,并以出芽的方式释放到上清。HA试验测定VLPs具有很高的凝集鸡红细胞的能力（10μg纯化的VLPs的HA效价为128）,说明HN组装入ND-VLPs以后,仍然保持血凝素的正确空间构象。试验结果表明ND-VLPs的分泌高峰是在感染后96h,单位体积（100ml感染上清）产量为1.57mg,4种蛋白的浓度范围分别为,HN:0.76-1.14μg/10μg VLPs,F:0.38-0.76μg/10μg VLPs,NP:1.14-1.52μg/10μg VLP,M:0.67-0.95μg/10μg VLPs。我们分别通过肌肉注射（辅以弗氏佐剂）和滴鼻途径（不加佐剂）,以不同剂量的ND-VLPs （10、20、25μg）免疫18日龄SPF鸡,并在首免后2周加强免疫一次,同时设PBS、NDV疫苗组及NDV疫苗+VLPs联合免疫作对照。首免后,监测血清中NDV特异性抗体滴度的动态变化。于二免后两周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒。联合免疫组诱导产生的抗体水平显着高于其它组,提示VLPs具有良好的免疫原性,并可以提高常规疫苗的免疫效力。经肌肉注射途径免疫鸡可以诱导产生较高水平的HI、IgG及中和抗体。攻毒后,25μg VLPs实验组与NDV疫苗组、联合免疫组一样,能够100%抵抗致死剂量的NDV强毒攻击;经滴鼻途径,免疫鸡不仅可以产生较高水平的HI、中和抗体和局部粘膜抗体,还可以产生少量的循环抗体IgG。25μg ND-VLPs对致死剂量强毒的攻击也提供了90%的保护,说明ND-VLPs能够刺激机体产生粘膜免疫应答并具有一定的免疫保护力,但循环抗体IgG在抵抗强毒攻击过程中起着重要作用。ND-VLPs作为粘膜免疫抗原仍需要辅以合适的粘膜佐剂来增强其免疫效果。综上,ND-VLPs在昆虫细胞-杆状病毒表达系统上实现了高效组装,具有良好的免疫原性,并能有效的提高常规疫苗针对流行毒株的免疫效力,是一个很有前景的ND候选疫苗。
二、人工感染新城疫病毒引起La Sota疫苗免疫雏鸡细胞免疫功能及血清IgG抗体的动态变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人工感染新城疫病毒引起La Sota疫苗免疫雏鸡细胞免疫功能及血清IgG抗体的动态变化（论文提纲范文）
（1）新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性（论文提纲范文）
| 本研究克隆测序的新城疫毒株及其序列 |
| 本研究从GenBank 下载的NDV 的HN 和F 基因序列 |
| 英文缩写注释 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 新城疫文献综述 |
| 第一章 我国部分地区不同宿主NDV 的分离鉴定 |
| 第二章 NDV 分离株的蚀斑纯化及生物学毒力比较 |
| 第三章 新城疫病毒分离株抗原性的比较 |
| 第四章 新城疫病毒F 基因的克隆与序列分析 |
| 第五章 新城疫病毒HN 基因的克隆与分子特性分析 |
| 第六章 新城疫病毒 HN 和F 基因分型、遗传变异和时空分布相关性的比较 |
| 第七章 新城疫病毒抗原性与F 和HN 基因氨基酸的相关性 |
| 第八章 基因Ⅱ型NDV 强毒的分离鉴定和分子特性分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 致 谢 |
（2）新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒的分子生物学研究进展 |
| 1 NDV的一般生物学特性 |
| 2 NDV的基因组与结构蛋白特征 |
| 3 NDV致病的分子基础 |
| 4 NDV的分子生物学诊断技术 |
| 5 NDV的基因分型与分子流行病学 |
| 参考文献 |
| 第二章 DNA疫苗及其在家禽中的应用 |
| 1 DNA疫苗的意义和特点 |
| 2 DNA疫苗的构成和作用机制 |
| 3 DNA疫苗在家禽中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 应用研究 |
| 第三章 新城疫病毒地方株的分离鉴定与生物学特性 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 新城疫病毒地方株的分子流行病学调查 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 新城疫病毒地方分离株不同基因型三价灭活油乳苗的研制 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第六章 NDV地方株三价灭活油乳苗与La Sota株油乳苗免疫效果比较 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第七章 NDV F基因DNA疫苗对地方株三价油乳苗的免疫协同作用 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第八章 新城疫病毒地方株三价灭活油乳苗的推广应用与评价 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 2000 ～2003年间获得成果、出版着作和论文发表情况 |
（3）鸡细胞免疫应答检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 家禽抗沙门菌免疫应答的研究进展 |
| 1 家禽感染沙门菌的发病机制 |
| 2 沙门菌诱导的固有免疫应答 |
| 3 沙门菌诱导的适应性免疫应答 |
| 3.1 T细胞在免疫应答过程中的作用 |
| 3.2 B细胞在免疫应答过程中的作用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡细胞免疫应答检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备 |
| 2.2 BrdU ELISA法检测T淋巴细胞增殖 |
| 2.3 流式细胞术检测T细胞亚群 |
| 2.4 细胞分选 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 T淋巴细胞增殖检测结果 |
| 3.2 T细胞亚群检测结果 |
| 3.3 脾脏中CD8~+T淋巴细胞流式细胞术分选结果 |
| 3.4 脾脏中CD8~+T淋巴细胞磁珠分选结果 |
| 3.5 细胞凋亡检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌疫苗候选株诱导细胞免疫应答的分析与评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株及细胞株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌培养 |
| 2.2 鸡的免疫及采样 |
| 2.3 鸡脾脏淋巴细胞的制备 |
| 2.4 BrdU ELISA法分析脾脏T淋巴细胞增殖 |
| 2.5 流式细胞术分析T细胞亚群的变化 |
| 2.6 CTL活性分析 |
| 2.7 荧光定量PCR检测脾脏中细胞因子的表达 |
| 2.8 血清中IFN-γ含量分析 |
| 2.9 血清中IgG抗体的检测 |
| 2.10 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 T细胞增殖分析结果 |
| 3.2 T细胞亚群分析结果 |
| 3.3 CTL特异性杀伤巨噬细胞分析结果 |
| 3.4 荧光定量PCR检测脾脏中细胞因子分析结果 |
| 3.5 血清中IFN-γ含量分析结果 |
| 3.6 血清中IgG含量分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫应答的分析与评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡的免疫与样品采集 |
| 2.2 鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备 |
| 2.3 BrdU ELISA法分析脾脏T淋巴细胞的增殖 |
| 2.4 特异性CTL杀伤分析 |
| 2.5 荧光定量PCR检测脾脏细胞中细胞因子的表达 |
| 2.6 流式细胞术分析T细胞亚群 |
| 2.7 气管灌洗液中IgA含量分析 |
| 2.8 血清中IgG抗体分析 |
| 2.9 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 T细胞增殖分析结果 |
| 3.2 T细胞亚群分析结果 |
| 3.3 特异性CTL杀伤分析结果 |
| 3.4 脾脏中细胞因子分析结果 |
| 3.5 气管灌洗液中IgA含量分析结果 |
| 3.6 血清中IgG含量分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（4）新城疫病毒La Sota C5株反向遗传操作平台的优化及Class Ⅰ/Ⅱ嵌合弱毒株的构建与免疫原性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 新城疫病毒概述 |
| 2. NDV毒力的评价指标 |
| 3. 病毒的入侵机制与毒力 |
| 4. 病毒的复制与毒力 |
| 5. 病毒免疫逃避机制与毒力 |
| 6. 病毒非编码区基序与毒力 |
| 7. 新城疫病毒反向遗传操作技术概述 |
| 7.1 NDV全基因组cDNA的克隆构建 |
| 7.2 辅助质粒功能验证的必要性 |
| 7.3 反向遗传技术在NDV毒力机制解析方面的应用 |
| 7.4 反向遗传技术在NDV作为疫苗载体方面的应用 |
| 第二章 新城疫病毒La Sota C5株反向遗传平台的改造与优化 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、细胞株和鸡胚 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.3.1 主要分子生物学试剂 |
| 1.3.2 培养基和主要化学试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 毒株的扩增 |
| 2.2 病毒RNA的提取及反转录 |
| 2.3 目的片段的聚合酶链式反应(PCR扩增) |
| 2.4 T-A克隆及鉴定 |
| 2.5 全长基因组cDNA转录载体的构建 |
| 2.6 全长感染性克隆的鉴定 |
| 2.7 TVT-G La Sota C5的拯救 |
| 2.8 拯救病毒的HA测定 |
| 2.9 拯救病毒的RT-PCR验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 T-A克隆及测序分析结果 |
| 3.2 重构建转录载体TVT-GLa Sota C5的酶切鉴定 |
| 3.3 TVT-GLa Sota C5株的拯救及PT-PCR产物鉴定结果 |
| 3.4 TVT-GLa Sota C5株的生物学特性分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、细胞和鸡胚 |
| 1.2 菌株、质粒和载体 |
| 1.3 常用试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要化学试剂和细菌培养基 |
| 1.6 1%鸡红细胞悬液 |
| 1.7 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 三基因替换重组转录载体TVT-GLa Sota C5M/F/HN的构建 |
| 2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.1.2 M/F/HN基因的扩增和克隆测序 |
| 2.2 TVT-GLa Sota C5中引入Ⅰ酶切位点Pac Ⅰ和ASCⅡ |
| 2.3 重组转录载体TVT-GLa Sota C5M/F/HN的构建模式 |
| 2.4 重组质粒TVT-GLa Sota C5M/F/HN的的酶切鉴定 |
| 2.5 三基因替换的重组转录载体的转染及鉴定 |
| 2.6 重组病毒的部分生物学特性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 三基因替换重组转录载体TVT-GLa Sota C5M/F/HN的鉴定 |
| 3.2 TVT-GLa Sota C5M/F/HN的拯救与鉴定 |
| 3.3 拯救病毒与母本病毒的部分生物学特性比较 |
| 4 讨论 |
| 第四章 嵌合Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的免疫原性比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒扩增保存 |
| 1.2.2 病毒EID_(50)测定 |
| 1.2.3 病毒TCID_(50)测定 |
| 1.2.4 兔抗新城疫高免血清制备 |
| 1.2.5 交叉血凝抑制试验 |
| 1.2.6 交叉中和试验 |
| 1.2.7 交叉保护试验 |
| 1.2.8 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒扩增及特性鉴定 |
| 2.2 交叉血凝抑制结果 |
| 2.3 交叉中和结果 |
| 2.4 交叉保护结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 两种新城疫弱毒疫苗诱导黏膜免疫应答的比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增保存 |
| 2.2 病毒EID_(50)测定 |
| 2.3 两株弱毒感染鸡的组织病理检查 |
| 2.4 黏膜免疫试验设计 |
| 2.5 黏膜免疫样品采集方法 |
| 2.6 间接ELISA方法的建立 |
| 2.6.1 ELISA包被抗原的制备 |
| 2.6.2 最佳抗原包被浓度和最佳酶标抗体工作浓度的确定 |
| 2.6.3 样品最佳稀释度的确定 |
| 2.6.4 间接ELISA检测步骤 |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 两株弱毒的体内增殖比较 |
| 3.2 最佳抗原包被浓度和酶标抗体工作浓度确定 |
| 3.3 确定间接ELISA方法最佳反应条件 |
| 3.4 唾液中抗体水平 |
| 3.5 气管冲洗液中抗体水平 |
| 3.6 肺冲洗液中抗体水平 |
| 3.7 肠冲洗液中抗体水平 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（5）新城疫弱毒疫苗中禽腺病毒和鸡传染性贫血病毒混合污染的鉴定及人工模拟致病性分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫(Newcastle disease,ND) |
| 1.1.1 发现与命名 |
| 1.1.2 化学组成与结构学特点 |
| 1.1.3 生物学特性 |
| 1.1.4 病毒复制周期与培养特性 |
| 1.1.5 理化性质 |
| 1.1.6 毒株分类 |
| 1.1.7 流行病学 |
| 1.1.8 致病性 |
| 1.1.9 诊断 |
| 1.1.10 免疫与综合防治 |
| 1.2 鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus,CIAV) |
| 1.2.1 发现与命名 |
| 1.2.2 化学组成与结构特点 |
| 1.2.3 生物学特性 |
| 1.2.4 病毒复制周期与培养特性 |
| 1.2.5 理化性质 |
| 1.2.6 毒株分类 |
| 1.2.7 流行病学 |
| 1.2.8 致病性 |
| 1.2.9 诊断 |
| 1.2.10 免疫与综合防治 |
| 1.3 禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV) |
| 1.3.1 发现与命名 |
| 1.3.2 化学组成和结构特点 |
| 1.3.3 生物学特性 |
| 1.3.4 病毒复制周期和培养特性 |
| 1.3.5 理化性质 |
| 1.3.6 毒株分类 |
| 1.3.7 流行病学 |
| 1.3.8 致病性 |
| 1.3.9 诊断 |
| 1.3.10 免疫与综合防治 |
| 1.4 疫苗外源病毒污染研究现状 |
| 1.4.1 产生原因 |
| 1.4.2 研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗来源 |
| 2.1.2 单因子血清 |
| 2.1.3 实验动物与SPF动物饲养设备 |
| 2.1.4 主要试剂与仪器 |
| 2.1.5 其他试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 疫苗中外源病毒污染的检测 |
| 2.2.2 疫苗中外源病毒的分离和鉴定 |
| 2.2.3 疫苗中外源病毒部分基因扩增和测序分析 |
| 2.2.4 FAdV和 CIAV混合污染疫苗危害分析 |
| 2.2.5 NDV弱毒疫苗对外源病毒感染宿主过程的影响 |
| 2.2.6 混合污染疫苗突破母源抗体保护 |
| 2.2.7 新城疫弱毒疫苗免疫对先天感染FAdV和 CIAV致病性的影响 |
| 2.2.8 数据处理与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病场所用弱毒疫苗外源病毒检测及分析 |
| 3.1.1 新城疫弱毒疫苗中存在FAdV和 CIAV的混合污染 |
| 3.1.2 疫苗中污染的FAdV和 CIAV的分离和鉴定 |
| 3.1.3 疫苗中FAdV和 CIAV的分离鉴定与序列分析 |
| 3.2 FAdV和 CIAV混合污染疫苗危害分析 |
| 3.2.1 混合污染疫苗使用引发鸡群心包积液综合征及大幅死亡 |
| 3.2.2 混合污染疫苗使用引发严重的生长迟缓 |
| 3.2.3 混合污染疫苗使用影响免疫器官发育 |
| 3.2.4 混合污染疫苗使用后NDV抗体水平明显降低 |
| 3.2.5 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV复制动态 |
| 3.2.6 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV在不同器官中的分布 |
| 3.3 NDV弱毒疫苗对外源病毒感染宿主过程的影响 |
| 3.3.1 LaSota的存在是诱发鸡死亡的必要因素 |
| 3.3.2 LaSota加重了FAdV和 CIAV混合感染对体重增长的抑制作用 |
| 3.3.3 LaSota加剧了FAdV和 CIAV混合感染对免疫器官的损伤 |
| 3.3.4 LaSota明显影响FAdV和 CIAV在不同器官中的分布 |
| 3.3.5 LaSota能显着提升FAdV和 CIAV病毒血症水平 |
| 3.3.6 LaSota能显着降低FAdV和 CIAV抗体水平 |
| 3.3.7 FAdV和 CIAV混合感染激活增强了LaSota的致病性 |
| 3.4 母源抗体与污染疫苗中外源病毒的 |
| 3.4.1 混合感染能突破母源抗体保护引发心包积液综合征 |
| 3.4.2 混合污染疫苗造成海兰褐鸡体重降低 |
| 3.4.3 混合污染疫苗影响海兰褐鸡免疫器官发育 |
| 3.4.4 混合污染疫苗影响NDV抗体水平 |
| 3.4.5 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV抗体动态 |
| 3.4.6 混合污染疫苗使用后FAdV和 CIAV复制动态 |
| 3.5 NDV弱毒疫苗免疫对垂直感染FAdV和 CIAV致病性的影响 |
| 3.5.1 NDV弱毒疫苗免疫激发经垂直传播感染FAdV和 CIAV的致病性 |
| 3.5.2 LaSota影响了感染FAdV和 CIAV鸡多个血液指标 |
| 4 讨论 |
| 4.1 混合污染FAdV和 CIAV新城疫弱毒疫苗的使用是造成鸡群心包积液-包涵体肝炎爆发的重要原因 |
| 4.2 LaSota弱毒疫苗是外源病毒致病性的关键因素 |
| 4.3 母源抗体无法保护鸡群不受混合污染疫苗中外源病毒的影响 |
| 4.4 NDV弱毒疫苗免疫能激发FAdV和 CIAV感染的致病性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（6）表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒rmNA-VP3免疫效果评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫 |
| 1.1 新城疫概况 |
| 1.2 新城疫病毒形态结构及蛋白功能 |
| 1.3 新城疫病毒毒力及基因分型 |
| 1.4 新城疫在鹅群内流行现状 |
| 1.5 新城疫防控及疫苗研究进展 |
| 第二章 鹅细小病毒病 |
| 1.1 鹅细小病毒病概况 |
| 1.2 鹅细小病毒形态结构及蛋白功能 |
| 1.3 鹅细小病毒病流行特点及诊断 |
| 1.4 鹅细小病毒疫苗研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组NDV rmNA-VP3 遗传稳定性检测 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组NDV rmNA-VP3 实验室安全性试验 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组NDV rmNA-VP3 免疫效果评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 综述一 鸡新城疫免疫防制的新认识 |
| 综述二 鸡新城疫细胞免疫研究进展 |
| 综述三 新城疫病毒HN蛋白及其基因的分子生物学 |
| 综述四 新城疫病毒HN糖蛋白纤突结构的变化及对功能的影响 |
| 研究内容 |
| 实验一： 我国部分地区新城疫病毒分离株生物学特性的研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验二： 新城疫病毒（野毒株）HN蛋白基因的扩增、克隆和序列分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验三： 新城疫病毒HN基因在杆状病毒表达系统中的表达 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验四： 表达的新城疫病毒HN重组蛋白免疫原性研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果与讨论 |
| 3.小结 |
| 结 论 |
| 致 谢 |
| 英文摘要 |
| 个人简历 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（8）HP-PRRS重组NDV载体疫苗构建、免疫评价及其佐剂研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HP-PRRS重组新城疫病毒候选疫苗的构建及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂、细胞和毒株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 溶液配制 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验设计 |
| 1.2.2 引物设计及合成 |
| 1.2.3 19T-ORF3-ORF5 质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.4 重组候选疫苗的构建与鉴定 |
| 1.2.5 质粒转染与病毒拯救 |
| 1.2.6 重组病毒分子生物学实验鉴定 |
| 1.2.7 重组病毒生物学特性评价 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 19T-ORF3-ORF5 质粒鉴定结果 |
| 1.3.2 同源重组目的片段的获取 |
| 1.3.3 重组NDV质粒鉴定结果 |
| 1.3.4 重组病毒拯救结果 |
| 1.3.5 重组病毒外源蛋白表达鉴定结果 |
| 1.3.6 重组病毒生物学特性评价结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组NDV候选疫苗小鼠致病性及免疫效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫原的制备 |
| 2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.3 小鼠致病性实验分组与方案 |
| 2.2.4 小鼠免疫原性评价实验分组与方案 |
| 2.2.5 免疫后小鼠血清特异性抗体水平检测 |
| 2.2.6 免疫后小鼠血清中和抗体水平检测 |
| 2.2.7 小鼠脾脏淋巴细胞分离 |
| 2.2.8 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.2.9 淋巴细胞亚群数量检测分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 小鼠肌肉注射安全性评价实验结果 |
| 2.3.2 小鼠颅内注射安全性评价实验结果 |
| 2.3.3 免疫小鼠血清特异性抗体检测结果 |
| 2.3.4 免疫小鼠血清中和性抗体检测结果 |
| 2.3.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测结果 |
| 2.3.6 小鼠脾脏淋巴细胞流式亚群检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组NDV候选疫苗猪体内免疫安全性评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验分组与免疫计划 |
| 3.2.2 引物设计及合成 |
| 3.2.3 猪体免疫后生长状况评定 |
| 3.2.4 标准质粒的构建及标准曲线的建立 |
| 3.2.5 重组候选疫苗猪体内复制水平检测 |
| 3.2.6 猪主要器官组织免疫组化检测 |
| 3.2.7 免疫后病毒外排检测 |
| 3.2.8 病理切片观察 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 标准质粒的鉴定结果 |
| 3.3.2 标准曲线的建立及评价 |
| 3.3.3 免疫后猪生长状况评定结果 |
| 3.3.4 重组病毒猪体内复制周期检测结果 |
| 3.3.5 免疫组化检测结果 |
| 3.3.6 重组病毒外排风险鉴定 |
| 3.3.7 免疫后器官组织病理切片观察结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组NDV候选疫苗猪体免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 引物设计与标准质粒的构建 |
| 4.2.3 猪免疫原性评价实验分组与方案 |
| 4.2.4 红细胞凝集抑制实验检测 |
| 4.2.5 免疫后猪血清特异性抗体水平检测 |
| 4.2.6 免疫后猪血清中和抗体水平检测 |
| 4.2.7 免疫后猪血清细胞因子水平检测 |
| 4.2.8 猪外周血淋巴细胞分离 |
| 4.2.9 淋巴细胞增殖分析与细胞亚群数量检测 |
| 4.2.10 攻毒后生长状况及体温变化监测 |
| 4.2.11 主要组织器官病毒残留检测 |
| 4.2.12 组织病理切片观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 标准质粒鉴定结果 |
| 4.3.2 免疫猪血清特异性抗体检测结果 |
| 4.3.3 免疫猪血清中和性抗体检测结果 |
| 4.3.4 免疫猪血清细胞因子检测结果 |
| 4.3.5 猪外周血淋巴细胞增殖检测结果 |
| 4.3.6 猪外周血淋巴细胞流式亚群检测结果 |
| 4.3.7 攻毒后体温变化监测结果 |
| 4.3.8 主要器官组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.9 病理切片观察结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 候选佐剂的制备、筛选及其免疫增强效果评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 病毒与细胞 |
| 5.1.2 主要试剂耗材 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 小鼠骨髓源树突状细胞的分离与鉴定 |
| 5.2.2 重组NDV抗原提呈作用分析 |
| 5.2.3 重组候选疫苗配伍佐剂的制备与性能测定 |
| 5.2.4 中药配伍佐剂抗原摄取及提呈能力比较分析 |
| 5.2.5 小鼠体内佐剂免疫增强效果评价实验分组 |
| 5.2.6 联合免疫小鼠体内免疫增强效果评价 |
| 5.2.7 猪体内重组候选疫苗与佐剂联合免疫实验分组 |
| 5.2.8 联合免疫猪体内免疫增强效果评价 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC分化生长状态比较评价 |
| 5.3.2 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC表面分子表达检测 |
| 5.3.3 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC抗原摄取能力比较分析 |
| 5.3.4 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC抗原提呈能力比较分析 |
| 5.3.5 辅以商品配伍佐剂的重组候选疫苗乳化物性能评价结果 |
| 5.3.6 辅以商品配伍佐剂的重组候选疫苗小鼠免疫水平检测结果 |
| 5.3.7 中药配伍佐剂抗原摄取及提呈水平检测结果 |
| 5.3.8 辅以中药配伍佐剂的重组候选疫苗小鼠免疫水平检测结果 |
| 5.3.9 辅以佐剂的重组候选疫苗猪体免疫增强效果评价结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（9）基因Ⅶ型NDV强毒株反向遗传系统的建立及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 新城疫病毒的概述 |
| 1.2 新城疫病毒的分类和理化特性 |
| 1.3 新城疫病毒基因组的结构 |
| 1.4 NDV编码的蛋白及其功能 |
| 1.5 新城疫病毒的复制与致病性 |
| 1.6 新城疫病毒的分子流行病学 |
| 1.7 新城疫病毒疫苗学的概况 |
| 1.8 新城疫病病毒的反向遗传学及其应用 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 NDV SG10株反向遗传系统的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 病毒和细胞 |
| 2.2.2 质粒和菌株 |
| 2.2.3 SPF鸡胚和SPF鸡 |
| 2.2.4 主要试剂和仪器 |
| 2.2.5 病毒的纯化 |
| 2.2.6 病毒序列的测定 |
| 2.2.7 辅助质粒和微基因组的构建 |
| 2.2.8 辅助质粒和微基因组的功能鉴定 |
| 2.2.9 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 2.2.10 病毒的拯救 |
| 2.2.11 拯救病毒的鉴定 |
| 2.2.12 拯救病毒的致病性分析 |
| 2.2.13 拯救病毒的生长特性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDV SG10株序列的测定和分析 |
| 2.3.2 辅助质粒和微基因组的功能鉴定 |
| 2.3.3 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 2.3.4 NDV SG10株的拯救与鉴定 |
| 2.3.5 拯救病毒生物学特性的测定 |
| 2.3.6 拯救病毒的生长特性的分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 应用反向遗传系统对NDV SG10株进行改造 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 病毒、质粒和细胞 |
| 3.2.2 构建SG10株NP基因5’端缺失6bp的突变株 |
| 3.2.3 突变株rSG10-6bp的生物学特性分析 |
| 3.2.4 构建SG10株F蛋白裂解位点突变的病毒株 |
| 3.2.5 突变株aSG10生物学特性分析 |
| 3.2.6 表达绿色荧光蛋白的重组NDV的构建 |
| 3.2.7 突变株aSG10-EGFP生物学特性分析 |
| 3.2.8 表达IBV S1蛋白重组NDV的构建 |
| 3.2.9 突变株aSG10-S1生物学特性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SG10株NP基因5’端缺失6bp的突变株的构建 |
| 3.3.2 突变株rSG10-6bp生物学特性分析 |
| 3.3.3 拯救病毒的生长特性的测定 |
| 3.3.4 构建SG10株F蛋白裂解位点突变的病毒株 |
| 3.3.5 突变株aSG10生物学特性分析 |
| 3.3.6 拯救病毒的生长特性的测定 |
| 3.3.7 表达绿色荧光蛋白重组NDV的构建 |
| 3.3.8 突变株aSG10-EGFP生物学特性分析 |
| 3.3.9 拯救病毒的生长特性的测定 |
| 3.3.10 表达IBV S1蛋白重组NDV的构建 |
| 3.3.11 突变株aSG10-S1生物学特性分析 |
| 3.3.12 拯救病毒的生长特性的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组病毒aSG10株的免疫原性评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 病毒、质粒和细胞 |
| 4.2.2 致弱株aSG10的安全性和免疫原性鉴定 |
| 4.2.3 致弱株SG10的攻毒保护试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性检测 |
| 4.3.2 攻毒保护试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）新城疫病毒样颗粒免疫效力的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.3 拟解决的问题 |
| 第二章 试验研究 |
| 2.1 材料、试剂和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 第三章 试验结果 |
| 3.1 重组杆状病毒的PCR 鉴定 |
| 3.2 重组杆状病毒滴度(pfu/ml)的测定 |
| 3.3 VLPs的纯化和鉴定 |
| 3.4 动物试验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 构建VLPs所需表达系统的选择 |
| 4.2 ND-VLPs的纯化和鉴定 |
| 4.3 ND-VLPs的免疫原性及免疫效力研究 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、人工感染新城疫病毒引起La Sota疫苗免疫雏鸡细胞免疫功能及血清IgG抗体的动态变化（论文参考文献）
- [1]新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性[D]. 秦卓明. 山东农业大学, 2006(12)
- [2]新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制[D]. 程相朝. 南京农业大学, 2003(03)
- [3]鸡细胞免疫应答检测方法的建立及其应用[D]. 唐娟. 扬州大学, 2019(02)
- [4]新城疫病毒La Sota C5株反向遗传操作平台的优化及Class Ⅰ/Ⅱ嵌合弱毒株的构建与免疫原性评价[D]. 戴建华. 扬州大学, 2018(05)
- [5]新城疫弱毒疫苗中禽腺病毒和鸡传染性贫血病毒混合污染的鉴定及人工模拟致病性分析[D]. 苏奇. 山东农业大学, 2019(01)
- [6]表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒rmNA-VP3免疫效果评价[D]. 钦琪. 吉林大学, 2020(08)
- [7]新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究[D]. 丁壮. 中国人民解放军军需大学, 2001(01)
- [8]HP-PRRS重组NDV载体疫苗构建、免疫评价及其佐剂研究[D]. 张赫. 军事科学院, 2020(02)
- [9]基因Ⅶ型NDV强毒株反向遗传系统的建立及其应用研究[D]. 刘蒙蒙. 中国农业大学, 2015(08)
- [10]新城疫病毒样颗粒免疫效力的初步研究[D]. 吴芬芳. 新疆农业大学, 2007(02)