一、牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离（论文文献综述）
黄禹然[1]（2021）在《我国牛巴贝斯虫病传播媒介分布及适生区变动趋势研究》文中认为
袁利芹[2]（2014）在《巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆、表达及双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立》文中进行了进一步梳理巴贝斯虫病（Babesiosis）是由巴贝斯科、巴贝斯属的多种巴贝斯虫寄生于脊椎动物红细胞所引起的一类疾病的总称，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为临床特征，常可导致发病动物死亡，严重威胁着畜牧业的发展和人类健康。牛巴贝斯虫病是由牛的巴贝斯虫（Babesia spp）所引起的一类血液原虫病，其中牛巴贝斯虫（Babesia bovis）和双芽巴贝斯虫（Babesia bigemina）是分布最广、危害最为严重的两种病原，由于二者均以微小牛蜱（Boophilus microplus）为传播媒介，常呈混合感染，临床上较难区分，给该类疾病的诊断带来较大的困难。因此，开展该病的鉴别诊断研究具有重要的意义。本研究通过对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的棒状体相关蛋白1（Rhoptry-associated Protein-1，RAP-1）基因的羧基端进行克隆、表达，在对重组蛋白反应原性及特异性进行分析的基础上，初步建立了针对双芽巴贝斯虫感染的间接ELISA诊断方法，利用田间血清样品对本法进行了评价。本文的主要研究内容如下：1.双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C基因的序列分析、克隆与表达利用生物信息学软件对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1基因进行比对和抗原表位预测，发现二者羧基端相似度较低且均具有明显的抗原表位区。针对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1基因羧基端（分别为第313-484位和第317-537位氨基酸）设计特异性表达引物，克隆出双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C基因，构建了二者的重组表达质粒，最后成功进行了原核表达，分别表达出大小为26ku和31.9ku的重组蛋白。2.双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C重组蛋白的纯化与反应原性检测利用Ni-NTA试剂盒对重组蛋白进行了纯化，纯化后的双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫RAP-1C重组蛋白浓度分别为0.4mg/mL和0.8mg/mL。对两种融合蛋白进行Western-blot分析，结果显示二者均与相应牛阳性血清反应，但双芽巴贝斯虫RAP-1C蛋白与牛巴贝斯虫阳性血清之间无交叉反应，牛巴贝斯虫RAP-1C蛋白与双芽巴贝斯虫阳性血清之间无交叉反应。此外，两种融合蛋白与大巴贝斯虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清和环形泰勒虫阳性血清均无交叉反应。3.双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立利用纯化的双芽巴贝斯虫RAP-1C蛋白初步建立了间接ELISA方法，并对该方法进行了优化，经MedCalc软件分析20份阴性血清和90份阳性血清的检测结果，确定OD450值等于0.6363为该方法的阳性阈值，其敏感性和特异性分别为95.5%和100%，并且与牛其他主要梨形虫无交叉反应。
李安岩[3]（2013）在《牛巴贝斯虫病ELISA检测方法的建立》文中研究说明牛巴贝斯虫病（Bovine babesiosis），是由媒介蜱传播的巴贝斯属的多种病原引起的血液原虫病，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，严重感染时引起死亡。本病在世界范围内广泛流行，给家畜及畜产品国际贸易带来严重危害，直接影响经济的发展。在我国，业已报道的牛的巴贝斯虫病的病原有双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种以及东方巴贝斯虫共6种，其中牛巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫的发病率和致死率最高，危害严重，而两者均以牛蜱属的蜱种为媒介，临床上常常表现为混合感染，目前尚无有效可行的血清学诊断方法可特异性地检测牛巴贝斯虫的感染。本研究以牛巴贝斯虫为研究对象，采用原核表达系统克隆表达了牛巴贝斯虫RAP-1的C端蛋白，并以此蛋白为抗原建立了ELISA鉴别检测方法，并对我国13个省牛巴贝斯虫病的流行情况进行了血清学调查。现将研究内容总结如下：1.利用原核表达载体pGEX-4T-1构建重组质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中成功地表达获得了RAP-1基因的C端肽段即BORCT。融合蛋白以GST为标签，可溶性表达量为1.51mg/mL，Western-blot实验证实该蛋白具有良好的特异性与敏感性，与泰勒虫、其它巴贝斯虫、无浆体等病原无交叉反应。2.采用磁珠亲和纯化方法对原核表达的重组蛋白BORCT进行了纯化，并以此蛋白为抗原，摸索ELISA最佳反应条件，建立了ELISA诊断方法。经MedCalc软件分析86份阴性血清和69份阳性血清的检测结果，确定29.6%抗体比率为该方法的阳性阈值，对应的敏感性和特异性分别为94.2%和96.5%，并且与泰勒虫及其它巴贝斯虫（特别是双芽巴贝斯虫）无交叉反应，适用于开展牛巴贝斯虫病的血清学调查。3.用所建立的重组蛋白ELISA方法对采自我国13省的牦牛（551份）和黄牛血清样品（921份）进行了检测，抗体阳性率在6.40%—68.49%之间，结合媒介蜱的自然地理分布，对我国牛巴贝斯虫病的流行现状进行了推测。
苟惠天[4]（2012）在《梨形虫及硬蜱标识基因的分析与初步应用》文中进行了进一步梳理梨形虫（Piroplasma），包括巴贝斯虫（Babesia）和泰勒虫（Theileria），可寄生于宿主红细胞、淋巴细胞或巨噬细胞内，并引起宿主发热、贫血、黄疸等临床症状的一类原虫。其传播媒介为硬蜱（Hard tick），专性吸血的外寄生虫，可寄生于包括爬行动物、哺乳动物和鸟类在内的许多动物（除了鱼类），是全球公认的、继蚊子之后的第二大疾病传播媒介。但是，目前梨形虫和硬蜱的分类存在许多学术争议。本研究采用基因测序及系统进化分析方法，对本实验室分离、采集的梨形虫和硬蜱种类进行测序，并参考GenBank中的一些数据，对梨形虫和硬蜱的部分种的分子分类，系统发育以及两者之间的协同进化关系进行了系统研究。主要研究结果如下：一、使用大亚基核糖体RNA（28S rRNA）序列，以及联合序列（28S+18S）对分离自中国的11株巴贝斯虫进行系统进化分析。结果表明：巴贝斯虫28S rRNA序列长度在2,878bp-3,017bp之间，28S+18S片段的长度为4,531bp-4,732bp，28S比18S含有较多的序列信息，能够较好的阐明莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi），大巴贝斯虫（Babesia major）和牛巴贝斯虫（Babesia bovis）的系统发生关系，可以作为另一个候选基因用于巴贝斯虫的系统进化关系，而且联合序列为以后的分析提供一种新的研究方法。二、对国内牛和绵羊的13株泰勒虫的大亚基核糖体RNA序列（28SrRNA）进行扩增、测序。结果显示：泰勒虫28S rRNA序列长度在3,031bp-3,061bp之间，可作为泰勒虫分子分类及系统进化分析的一种新的分子标记基因；28S rRNA基因的D2–D3区的短片段（约为497bp），区分各种泰勒虫的能力与其全长相当，是一段很有潜力的条形码候选基因。三、本研究对包括18S rRNA、28S rRNA、ITS、COI的全长，以及它们的部分序列（18SD、28SD、ITS1、ITS2）在内的8段DNA区域的484条序列，按照国际条形码联盟推荐的方法进行了DNA条形码可行性分析。结果发现：ITS2具有100%的扩增效率，理想的序列长度，种间差异与种内差异之间的gap明显，在属一级水平上的正确鉴定率为98%，在种一级水平上的正确鉴定率为92%。在目前数据基础上，ITS2是梨形虫进行分类鉴定的最适条形码基因。四、收集了来自7属60种硬蜱的165个样品。按照DNA条形码的分析方法，基于样品COI基因的5’端586bp的序列，计算其种内、种间差异，并用NJ法构建系统发生树评价其聚类效果。结果表明：49个样品在种间差异和种内差异之间具有重叠区，85%的样品能够很好进行聚类。进一步分析表明，使用单一基因，存在隐藏种，Genbank中的部分序列信息有误可能是造成以上错误结果的原因。五、采用系统进化分析以及计算分子钟的方法，探讨了基于COI基因的硬蜱-梨形虫之间的协同进化关系。结果显示：梨形虫的分化时间约为56Mya，晚于其媒介硬蜱的分化时间（约为86Mya），这说明梨形虫的生物多样性并非由其宿主的分化所致；对梨形虫和硬蜱的进化谱系以及两者之间寄生关系进行的分析表明，梨形虫早期的多样性形成过程并非由硬蜱伴随而发生，宿主转移事件导致了主要梨形虫谱系的快速分化，梨形虫的宿主范围在属以上阶元有较高的特异性。此外，结果还显示，共物种作为因素之一，在二者长期的协同进化过程起着重要作用。
黄国明,薛书江,贾立军,李闯,张守发[5]（2012）在《牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCTη基因的克隆与生物信息学分析》文中研究表明对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列（AB367928.1）同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。
杜鹏飞[6]（2012）在《牛巴贝斯虫体外培养体系及ELISA检测方法的建立》文中指出巴贝斯虫病（babesiosis）是巴贝斯虫属（Babesia）的原虫寄生于宿主红细胞内而引起的一种血液原虫病的总称，是一类严重危害畜牧业发展的蜱传性寄生虫病。在我国，感染黄牛的巴贝斯虫病原主要有牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种等5种，其中以牛巴贝斯虫致病性最强。本研究以牛巴贝斯虫为研究对象，建立了体外连续培养体系，并用培养上清蛋白做抗原，初步建立了可用于巴贝斯虫病抗体检测的ELISA方法，同时克隆表达了棒状体相关蛋白1基因的C端，为建立新型诊断方法奠定了基础。现将主要研究内容总结如下：1.在37℃、50mL/L CO2培养条件下，通过连续更换培养液和补充健康供体红细胞，建立了起牛巴贝斯虫陕县分离株（B. bovis Shanxian）的体外培养体系，已连续培养9个月，虫体形态与自然感染时并无区别，最高染虫率为13.5%；测定了虫体生长特性和对不同种属动物红细胞的侵染性。结果表明：虫体生长周期介于33.66-38.51h之间；在体外牛巴贝斯虫陕县株可入侵牛、人、驴和绵羊的红细胞，但不能入侵山羊红细胞。本试验仅在牛红细胞中实现了牛巴贝斯虫继代培养。2.用虫体经扩大培养后的上清液制备裂殖子蛋白可溶性抗原，建立了用于抗体检测的间接ELISA诊断方法，特异性为98.1%，敏感性为96.2%。该抗原与双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种阳性血清存在交叉反应，与瑟氏泰勒虫无交叉反应，从而对检测感染黄牛的巴贝斯虫具有通用性。用此方法对我国12省（市）共计1692份血清进行检测，结果表明：所检测省份均有巴贝斯虫血清学阳性检出，平均阳性率为6.7%；其中河南、广东阳性率最高，分别为35.9%（28/78）和21.3%（23/108）；青海、西藏阳性率最低，分别为1.91%（4/209）和0.89%（2/225）。3.克隆了牛巴贝斯虫陕县株的棒状体相关蛋白1基因（rhoptry-associated protein1，rap-1），并对其编码蛋白的C端（BoRCT）进行了原核表达。Western blot结果表明，重组蛋白可与牛巴贝斯虫阳性血清反应，与双芽巴贝斯虫阳性血清无交叉反应，其可用作两种巴贝斯虫感染鉴别诊断抗原。
李建梅[7]（2011）在《四种鸡艾美球虫ITS区序列分析及毒害与巨型或柔嫩艾美球虫间在免疫上相互影响的研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病（Coccidiosis）是由寄生于肠消化道上皮细胞的艾美属（Eimeria）球虫引起的一种对养鸡业危害及其严重的寄生性原虫病。其病原有堆型艾美球虫（E. acervulina）、布氏艾美球虫（E. brunetti）、巨型艾美球虫（E. maxima）、和缓艾美球虫（E. mitis）、毒害艾美球虫（E. necatrix）、早熟艾美球虫（E. praecox）和柔嫩艾美球虫（E. tenella）等7个种,在临床上常为几种球虫混合感染,因此鸡球虫纯种的分离与鉴定是开展鸡球虫生物学与分子生物学、免疫学与疫苗学等研究的基础。为此,本研究采用单卵囊分离技术,分别建立了早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫纯种株,并对分离的3种球虫与本室保存的4株巨型艾美球虫的ITS全序列进行了克隆与测序,在分子水平上对其进行了进一步的鉴定,并探讨了不同种和同种不同株间球虫的系统进化关系,为鸡艾美球虫的鉴别诊断和分子流行病学调查奠定基础。同时,本研究还探讨了毒害艾美球虫与巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫间在免疫上的相互影响,旨在为今后鸡球虫病的免疫预防奠定基础。1、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫的分离与鉴定采用单卵囊分离技术,获得了2株纯种球虫,鉴定为和缓艾美球虫与早熟艾美球虫。主要鉴定指标：和缓艾美球虫：卵囊呈球形或亚球型,囊壁光滑无色,卵囊内有1极体,无内、外残余体；测100个卵囊的平均大小为（14.96±1.38）μm×（13.65±1.20）μm,测100个孢子囊的平均大小为（9.23±1.20）μmx（5.29±0.53）μm；潜在期96h,最短孢子化时间15.5h；虫体主要寄生于小肠下段。早熟艾美球虫：卵囊呈椭圆形或卵圆形,有极体,无内、外残余体；测100个卵囊的平均大小为（19.21±2.10）μm×（16.40±1.75）μm,测100个孢子囊的平均大小为（10.62±0.90）μm×（6.85±0.75）μm；潜在期84h,最短孢子化时间20h；虫体主要寄生于鸡十二指肠与空肠前段。分别用此2株纯种球虫的孢子化卵囊20×104、60×104个感染30日龄黄羽肉鸡各10只,另设1个不感染对照组,结果感染2株纯种球虫的鸡均未发生死亡,但平均增重与不感染对照组差异显着（P<0.05）,感染和缓艾美球虫的2组鸡肠道均出现可见病变,感染早熟艾美球虫的2组鸡肠道病变记分为零。2、毒害艾美球虫的分离与鉴定采用单卵囊分离技术从田间样本分离到一株纯种艾美球虫,经鉴定为毒害艾美球虫。该球虫卵囊呈长卵圆形,囊壁光滑,卵囊内有一极体,无卵膜孔和卵囊残体；测100个卵囊大小（12.25～25.00）μm×（12.50-30.00）μm,平均大小（16.53±3.12）μm×（18.76±3.44）μm,形状指数1.14；孢子囊呈长卵圆形,壁上含有一斯氏体,但无孢子囊残体；测100个孢子囊大小（4.00～7.10）μm×（9.00～14.00）μm,平均大小（5.91±0.68）μm×（10.91±0.91）μm；测50个第二代裂殖体大小（32.50～75.00）μm×（28.00～62.50）μm,平均大小（50.77±11.77）μm×（44.44±9.51）μm；测25个裂殖子大小（1.50～3.00）μm×（9.50～12.50）μm,平均大小（2.41±0.27）μm×（10.51±0.93）μm;潜在期为145h；最短孢子化时间19h；卵囊主要寄生于盲肠。用纯种球虫的孢子化卵囊,以0.5×104、1×104、5×104的剂量分别感染30日龄黄羽肉鸡各10只,并设置批内重复,另设一不感染对照组。结果显示感染1×104组和5×104组鸡出现死亡,其中5×104感染组死亡率为30%～40%,感染1×104组的死亡率为0%-10%；感染0.5×104组和1×104组平均增重与不感染对照组之间无显着差异,感染5×104组平均增重与不感染对照组相比差异极显着（P<0.05）。感染组鸡肠道均出现病变,以感染5×104组最高。3、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球及4株巨型艾美球虫虫ITS全序列克隆与序列分析为进一步从分子水平上确认单卵囊分离所得的早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫及本实验室分离保存的4株巨型艾美球虫为纯种艾美球虫,以及探讨这些球虫分离株间的亲缘关系,设计了1对种属特异性引物,对上述4种7株球虫的ITS全序列进行PCR扩增、克隆、测序,并与GenBank中所登录的相应虫种的ITS序列进行系统发育进化分析。结果显示：早熟艾美球虫扩增片段大小为1084bp、和缓艾美球虫扩增片段大小为1037bp、毒害艾美球虫扩增片段大小为1337bp、巨型艾美球虫扬州株扩增片段大小为980bp、巨型艾美球虫上海株扩增片段大小为875bp、巨型艾美球虫美国疫苗株扩增片段大小为876bp、巨型艾美球虫南通株扩增片段大小为1008bp。几种球虫之间的同源性在50.8%-99.1%之间,平均遗传距离为0.49。在构建的系统发育进化树中显示各种球虫分别与GenBank中下载的对应虫种处在同一分支上；在4株巨型艾美球虫间,上海株与美国疫苗株形成一个分支,序列间相似性为96.9%,扬州株和南通株处于另一大的分支上,序列间相似性为99.1%。和缓艾美球虫与序列号为FJ230365的和缓艾美球虫一起处于最小分支,毒害艾美球虫与各柔嫩艾美球虫参考株一起形成一个大的支系,早熟艾美球虫则单独形成一个分支与其它各大的分支并列。4、毒害艾美球虫与巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫间在免疫上的相互影响以黄羽肉鸡为试验动物,分别以死亡率、肠道病变记分、平均增重、相对增重率、相对卵囊产量、抗体水平等为评价指标,分别探讨了毒害艾美球虫与巨型艾美球虫（两者在裂殖生殖阶寄生部位相同）、毒害艾美球虫与柔嫩艾美球虫（两者在配子生殖阶段寄生部位相同）间在免疫上的相互影响。结果显示：巨型艾美球虫与毒害艾美球虫混合免疫,免疫保护效果较毒害艾美球虫单独免疫的要高,显示巨型艾美球虫对毒害艾美球虫的免疫有一定的协同效应；而毒害艾美球虫对巨型艾美球虫的免疫有一定的负面影响,但不显着。柔嫩艾美球虫与毒害艾美球虫混合免疫与毒害艾美球虫单独免疫相比,前者的免疫保护力大于后者,显示柔嫩艾美球虫对毒害艾美球虫的免疫有一定的协同效应；而毒害艾美球虫对柔嫩艾美球虫的免疫没有影响。
李群[8]（2010）在《巴贝斯虫病LAMP检测方法的建立》文中指出巴贝斯虫是一类经蜱传播,红细胞内寄生的原虫,属于复顶亚门,由该类寄生虫引起的牛的巴贝斯虫病（babesiosis）在世界上许多地区发生和流行,是引起热带和亚热带地区牛巴贝斯虫病的主要病原。我国已有14个省（区）报道有本病存在,主要病原为牛巴贝斯虫（Babesia bovis）和双芽巴贝斯虫（Babesia bigemina）,牛患该寄生虫病后,常出现贫血、精神沉郁、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状,严重时引起死亡,给畜牧业和国民经济造成巨大损失。所以对该病的研究就显得十分重要。目前,检测巴贝斯虫病的方法有血液样品的血涂片镜检技术,血清学检查,一般PCR检测技术等,但是这些方法存在低敏感性,交叉感染,假阳性率高的缺点,而且有的方法仪器设备要求比较高,价格昂贵,如实时定量PCR技术。环介导等温扩增技术（LAMP）是Notomi等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。作为一种灵敏的链置换技术,它可以在恒温条件下短时间内将目的DNA从几个拷贝扩增到109-1010拷贝。本研究以巴贝斯虫细胞色素b为靶基因,建立简单、高效、快速的巴贝斯虫属及牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫种的LAMP检测方法,该方法可用于动物巴贝斯虫病的诊断,尤其对该病的早期诊断具有重要的现实意义。从GenBank中获得巴贝斯虫属内各个种的细胞色素b基因序列,应用BLAST进行比对,找出保守区域,根据LAMP引物设计的原则,设计属的特异性引物,建立了针对巴贝斯虫属的细胞色素b基因的LAMP检测方法。以牛的巴贝斯虫的细胞色素b基因为模板,进行LAMP法扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为254 bp,与预期扩增大小一致。该LAMP检测体系的特异性强,不能在牛瑟氏泰勒虫DNA、马泰勒焦虫DNA、弓形虫DNA、羊泰勒焦虫DNA中扩增出条带；敏感性高,双芽巴贝斯虫最低检测的DNA含量为0.85 fg/μL,牛巴贝斯虫最低检测的DNA含量为0.14 fg/μL。为了进一步检测巴贝斯虫种的分类,本研究建立了牛双芽巴贝斯虫种的LAMP检测方法。根据公布的牛双芽巴贝斯虫细胞色素b的DNA序列设计特异性引物,构建牛巴贝斯虫病的LAMP检测体系。对巴贝斯虫样品进行LAMP扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段符合预期的设计。该LAMP检测体系的特异性强、敏感性高,牛双芽巴贝斯虫细胞色素b基因能够检测到的最低含量为0.085 fg/μL。该检测体系的成功构建为动物感染牛巴贝斯虫病的诊断和流行病学调查提供了技术支撑。针对牛巴贝斯虫病也是目前危害牛健康的主要常见病,本研究还建立了牛巴贝斯虫种的LAMP检测方法。根据公布的牛巴贝斯虫细胞色素b的DNA序列设计特异性引物,应用LAMP方法对巴贝斯虫样品进行扩增并进行敏感和特异性检测。结果表明,该LAMP检测体系的敏感性高,牛巴贝斯虫细胞色素b基因能够检测到的最低含量为0.014 fg/μL。特异性较强,除能扩增出牛巴贝斯虫的特异性片段外,双芽巴贝斯虫DNA、马泰勒焦虫DNA、羊泰勒焦虫DNA等为模板都不能扩增特异性条带。该方法可用于牛感染牛巴贝斯虫病的检测、鉴定和流行病学调查。综上所述,本研究建立了牛巴贝斯虫属LAMP检测方法及双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫种的LAMP检测方法,敏感性比PCR方法要高,特异性较强,能方便快捷地检测,可用于巴贝斯虫病现场检测和流行病学调查,应用前景广阔。
李海辉[9]（2008）在《湖南省牛无浆体病调查与分析》文中进行了进一步梳理1.湖南省部分地区Bovine Anaplasmosis感染及传播途径调查运用颈静脉采血、鲜血涂片、染色镜检观察和动物接种试验等方法共调查了湖南长沙永安和龙华、益阳安化、娄底涟源和常德石门等地区五个中小型奶牛和肉牛场牛无浆体病发病情况,并通过对养殖场环境中吸血昆虫（厩蝇）鲜血涂片、阳性厩蝇内容物感染小鼠试验及兔子临床同层感染等研究了临床中无浆体病原的实际传播途径。结果表明,上述五个不同的养牛场均存在无浆体病感染,其阳性染虫率分别为37.5%、54.5%、57.14%、33.33%和63.64%;养殖场中不同年龄段牛舍内及其场址周围厩蝇的阳性感染率达71.6%。,厩蝇体内携带着无浆体病原;同时,阳性厩蝇内容物与患牛抗凝血接种免疫抑制小鼠,以及兔子临床同层感染均能使无浆体成功获得感染;此次调查的五个牛场中,无浆体病原的实际传播途径是厩蝇等非蜱类吸血昆虫的机械性传播。2.Bovine Anaplasma实验动物感染模型的建立运用地塞米松注射液长期抑制试验动物免疫力的方法,通过实验动物腹腔、皮下接种含有无浆体病原的患牛血液和阳性感染动物脏器悬液,阳性动物接触感染等试验,研究牛无浆体的感染和传播及在试验动物体内的消长规律,建立起无浆体人工感染模型。结果表明,以上感染方法均获成功。无浆体在小鼠和兔子体内呈现一定的规律性。无浆体在感染后第6 d和第8 d分别在小鼠和兔子血液中可以查到;感染后第16～19 d和第17～20 d在两者体内达到感染高峰;感染后第20 d和第25 d均逐渐消失。因此,可以用小鼠或兔子建立无浆体动物感染模型。无浆体的感染方式有以下几种:腹腔、皮下接种、接触感染。3.Bovine Anaplasma虫株分子生物学检测方法的初步研究运用原虫16S rRNA基因序列通用引物（Fd1和Rp2）对5个地区无浆体感染的阳性血液样品进行PCR扩增,经测序和序列拼接,获得5个无浆体样品16SrRNA基因的部分序列,运用分子生物学软件进行初步分析;并根据所获得序列的保守区间设计特异性引物,进行PCR诊断方法的探讨性研究。结果表明,在通用引物（Fd1和Rp2）下,5个地区无浆体感染的阳性血液样品均获得1425 bp大小的虫体16S rRNA基因条带;测序后5个无浆体16S rRNA基因的部分序列与GeneBank中Anaplasma marginale多个分离株的16S rRNA序列同源性均在97%～98%。5个分离虫株初步鉴定为牛边缘无浆体（Anaplasma marginale）;根据5个样品序列保守区间（51～738bp）设计的引物（Fp:5’-GGCCCGAGTTGGACCCTTGAC-3’,109bp～129bp;Rp:5’-CCTGGCGACCGTTGTTTCCTATTC-3’,634bp～611bp）能初步从5个地区无浆体感染的阳性血液样品中扩增出526 bp的目的条带,为进一步研究该病的PCR诊断方法奠定了基础。
王贵强[10]（2007）在《牛无浆体病套式PCR及实时荧光PCR检测方法的建立》文中指出无浆体病（Anaplasmosis）主要由边缘无浆体（Anaplasma marginale）感染引起。中央无浆体（A.centrale）只引起轻微的无浆体病。绵羊无浆体（A.ovis）主要感染绵羊，但也感染山羊和其它一些野生动物。检测无浆体的PCR方法有多种，但是到目前为止，并未有一种可以检测和鉴别三种无浆体的PCR方法。根据无浆体msp4基因设计的套式PCR方法，扩增无浆体的片段长度为716bp，边缘无浆体的片段长度为431bp，中央无浆体的片段长度为310bp，绵羊无浆体的片段长度为584bp。该方法检测的最低DNA量为200fg。Msp4套式PCR对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫、伊氏锥虫DNA进行检测，无目的片段出现。检测1119份临床样品，阳性率为9.4％。用建立的msp4套式PCR与msp5套式PCR比较，结果表明两者的符合率为100％。自然感染条件下，三种无浆体可两两交叉感染。根据无浆体msp4的保守基因序列设计特异引物AMOC9／AMOC5，AMOC10／AMOC12和特异性探针MP，首次建立了牛边缘无浆体的实时荧光PCR检测方法，在特异性与敏感性方面，与建立的msp4套式PCR的符合率为100％。用建立的方法检测采自江苏、哈尔滨180份奶牛和肉牛抗凝血，阳性率为8.9％。结果表明，建立的实时荧光PCR检测牛边缘无浆体的方法具有较高的特异性和敏感性，可用于牛边缘无浆体病的流行病学调查、检疫和监测。
二、牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离（论文提纲范文）
（2）巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆、表达及双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病原生物学 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状及病理学 |
| 2 巴贝斯虫研究进展 |
| 2.1 虫体入侵过程及机体的免疫反应 |
| 2.2 巴贝斯虫棒状体与宿主细胞入侵 |
| 2.3 巴贝斯虫的体外培养 |
| 3 巴贝斯虫检测技术研究现状 |
| 3.1 显微镜检测技术 |
| 3.2 免疫学诊断方法 |
| 3.3 分子生物学诊断方法 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫 RAP-1C 基因的序列分析、克隆与表达 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料及软件 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 RAP-1 基因的生物信息学分析与基因筛选 |
| 2.2 RAP-1C 基因特异性引物的设计 |
| 2.3 RAP-1C 基因的 PCR 扩增 |
| 2.4 RAP-1C 基因与 pGEM -T Easy 载体的连接与转化 |
| 2.5 目的基因与空载体的双酶切 |
| 2.6 目的片段与表达载体的连接 |
| 2.7 重组质粒的诱导表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 RAP-1 基因的抗原表位预测 |
| 3.2 RAP-1 氨基酸序列比对 |
| 3.3 RAP-1C 基因的扩增 |
| 3.4 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.5 重组表达质粒的诱导表达 |
| 4 讨论 |
| 实验二 双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫 RAP-1C 重组蛋白的纯化与反应原性检测 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.2 重组蛋白的反应原性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.2 重组蛋白的反应原性检测 |
| 4 讨论 |
| 实验三 双芽巴贝斯虫病间接 ELISA 诊断方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 血清的采集 |
| 1.4 标准阴性血清、标准阳性血清和待检血清的处理 |
| 2 方法 |
| 2.1 间接 ELISA 反应程序 |
| 2.2 ELISA 最佳反应条件的筛选 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗原最佳稀释度的测定 |
| 3.2 血清最佳稀释度的测定 |
| 3.3 酶结合物最佳工作浓度的测定 |
| 3.4 ELISA 阈值的判定 |
| 3.5 特异性试验 |
| 3.6 抗体动态曲线的评价 |
| 3.7 ELISA 方法对田间样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在校期间参与的研究课题 |
| 论文发表情况 |
（3）牛巴贝斯虫病ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 病理学和致病机制 |
| 1.4 超微结构 |
| 1.5 牛巴贝斯虫的入侵机制 |
| 1.6 牛巴贝斯虫的血清学诊断进展 |
| 1.6.1 间接荧光抗体试验（INDIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST，IFAT） |
| 1.6.2 免疫印迹法（WESTERN BLOTTING） |
| 1.6.3 酶联免疫吸附试验（ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY，ELISA） |
| 1.7 研究内容 |
| 第二章 牛巴贝斯虫 RAP-1 C 端基因的克隆、表达与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 虫体与血清 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RAP-1 基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 |
| 2.2.3 RAP -1 基因的 PCR 扩增 |
| 2.2.4 RAP-1 基因与 pGEM-T Easy 载体的连接与转化 |
| 2.2.5 表达质粒 pBORCT 的构建 |
| 2.2.6 BORCT 的诱导表达 |
| 2.2.7 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.9 重组蛋白的反应原性的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 蛋白区段的生物信息学分析 |
| 2.3.2 目的基因的克隆 |
| 2.3.3 重组表达菌的诱导表达 |
| 2.3.4 重组蛋白的 Western blot 鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组蛋白 BORCT 的间接 ELISA 方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 抗原的制备 |
| 3.1.4 血清的采集 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 间接 ELISA 试验程序 |
| 3.2.2 ELISA 最佳反应条件的选择 |
| 3.2.3 ELISA 阳性阈值和特异性、敏感性的确定 |
| 3.2.4 特异性实验（交叉实验） |
| 3.2.5 抗体动态曲线的评价 |
| 3.2.6 野外样品 ELISA 方法的评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ELISA 最佳反应条件的选择 |
| 3.3.2 ELISA 阳性阈值和异性、敏感性的确定 |
| 3.3.3 特异性实验（交叉实验） |
| 3.3.4 抗体动态曲线的评价 |
| 3.3.5 野外样品对 ELISA 方法的评价 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 中国部分地区牛巴贝斯虫的血清流行病学调查 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要器材 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 抗原的制备 |
| 4.1.4 血清的采集 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）梨形虫及硬蜱标识基因的分析与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 梨形虫的分类现状 |
| 1.1.1 梨形虫的分类地位 |
| 1.1.2 梨形虫的分类方法 |
| 1.1.3 我国梨形虫的分类现状 |
| 1.1.4 梨形虫分类面临的问题 |
| 1.2 蜱的分类现状 |
| 1.2.1 硬蜱的分类方法 |
| 1.2.2 硬蜱分类系统的变更 |
| 1.2.3 我国蜱类分类现状 |
| 1.2.4 硬蜱分类面临的问题 |
| 1.3 条形码技术的研究进展 |
| 1.3.1 DNA 条形码的概念 |
| 1.3.2 DNA 条形码基因的筛选 |
| 1.3.3 DNA 条形码的优势 |
| 1.3.4 DNA 条形码的缺陷 |
| 1.3.5 DNA 条形码的分析方法 |
| 1.3.6 DNA 条形码在兽医寄生虫的应用 |
| 1.4 寄生虫-宿主协同进化的研究进展 |
| 1.4.1 协同进化的相关概念 |
| 1.4.2 协同进化的研究方法 |
| 1.4.3 协同进化模式研究 |
| 1.4.4 协同进化的意义 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于 28S rRNA 在我国巴贝斯虫上的进化分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 虫株和实验动物 |
| 2.1.2 DNA 提取、目的基因扩增及测序 |
| 2.1.3 序列比对和进化分析 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 28S rRNA 基因的扩增 |
| 2.2.2 序列比对 |
| 2.2.3 系统进化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 基于 28S rRNA 在我国泰勒虫上的进化分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 寄生虫和实验动物 |
| 3.1.2 DNA 提取、目的基因扩增及测序 |
| 3.1.3 序列比对及二级结构预测 |
| 3.1.4 系统发育的构建 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 28S rRNA 基因扩增及序列分析 |
| 3.2.2 针对 V 区的二级结构预测 |
| 3.2.3 泰勒虫的系统进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 梨形虫条形码基因的筛选 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 样品收集 |
| 4.1.2 候选基因的扩增 |
| 4.1.3 GenBank 中序列的收集 |
| 4.1.4 序列分析 |
| 4.1.5 条形码物种鉴定效率的评价 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 PCR 扩增效率比较 |
| 4.2.2 候选序列种间、种内距离的 gap 分析 |
| 4.2.3 物种鉴定率的评价 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 硬蜱 COI 基因的分析及在分类上的应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 标本采集及鉴定 |
| 5.1.2 基因组 DNA 抽提，目的基因 PCR 及测序 |
| 5.1.3 GenBank 中序列的收集 |
| 5.1.4 序列比对及数据分析 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 样品采集 |
| 5.2.2 COI 基因的扩增、测序 |
| 5.2.3 COI 序列组成分析 |
| 5.2.4 COI 序列遗传距离分析 |
| 5.2.5 种内距离和种间距离之间的 gap 分析 |
| 5.2.6 COI 对样品的鉴定成功率评估 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 梨形虫及其媒介蜱的协同进化分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 样品收集 |
| 6.1.2 DNA 提取、PCR 扩增及测序 |
| 6.1.3 序列比对及饱和性分析 |
| 6.1.4 校准点的确定 |
| 6.1.5 分化时间及系统发生分析 |
| 6.2 结果分析 |
| 6.2.1 数据特征 |
| 6.2.2 系统进化分析 |
| 6.2.3 分化时间的估算 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCTη基因的克隆与生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血液样本 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 DNA提取 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 目的基因的PCR扩增 |
| 1.6 产物的回收、克隆及测序 |
| 1.7 生物学信息分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCTη基因片段的扩增 |
| 2.2 CCTη/pMD-18T/DH5α重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3 生物信息学分析 |
| 2.3.1 牛B.ovata延边株CCTη基因核酸序列基本信息 |
| 2.3.2 牛B.ovata延边株CCTη基因编码蛋白质预测分析 |
| 2.3.3 牛B.ovata延边株CCTη基因与其他虫种 (株) 相应序列的进化树分析 |
| 3 讨论 |
（6）牛巴贝斯虫体外培养体系及ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 巴贝斯虫体外培养的研究进展 |
| 1.2.1 基本培养技术 |
| 1.2.2 影响体外培养的因素 |
| 1.2.3 体外培养技术的应用 |
| 1.2.4 几种巴贝斯虫的体外培养 |
| 1.2.5 研究展望 |
| 1.3 巴贝斯虫病诊断方法的研究进展 |
| 1.3.1 病原学检测技术 |
| 1.3.2 血清学检测技术 |
| 1.3.3 分子生物学检测技术 |
| 1.4 研究内容和方法 |
| 第二章 牛巴贝斯虫体外培养体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 虫体 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 配制培养液 |
| 2.1.6 红细胞悬液 |
| 2.1.7 起始培养与维持培养 |
| 2.1.8 筛选供体牛 |
| 2.1.9 虫种再鉴定 |
| 2.1.10 扩大培养 |
| 2.1.11 液氮保存 |
| 2.1.12 生长特性与生长周期的测定 |
| 2.1.13 测定牛巴贝斯虫体外对不同宿主红细胞的入侵能力 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 体外培养 |
| 2.2.2 生长特性与生长周期 |
| 2.2.3 对不同宿主红细胞的入侵能力 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 牛巴贝斯虫裂殖子蛋白间接 ELISA 检测方法的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 虫体 |
| 3.1.2 梨形虫阴性牛 |
| 3.1.3 血清 |
| 3.1.4 抗原的制备 |
| 3.1.5 Western blot 反应 |
| 3.1.6 间接 ELISA 反应程序 |
| 3.1.7 抗原-抗体最佳工作浓度的确定 |
| 3.1.8 ELISA 阳性阈值和特异性、敏感性的确定 |
| 3.1.9 交叉反应 |
| 3.1.10 田间样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 抗原-抗体最佳工作浓度 |
| 3.2.2 阳性阈值与特异性、敏感性 |
| 3.2.3 Western blot 反应 |
| 3.2.4 抗体动态与交叉反应 |
| 3.2.5 田间样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 牛巴贝斯虫 RAP-1 基因编码蛋白 C 端的克隆、表达与反应原性分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 虫种和血清 |
| 4.1.3 设计引物 |
| 4.1.4 BoRCT 的 PCR 扩增 |
| 4.1.5 重组质粒 pET-30a-BoRCT 的构建与鉴定 |
| 4.1.6 重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.1.7 反应原性分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 目的基因的克隆 |
| 4.2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.3 Western Blot 检测重组蛋白反应原性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）四种鸡艾美球虫ITS区序列分析及毒害与巨型或柔嫩艾美球虫间在免疫上相互影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 rDNA基因序列结构 |
| 2 rDNA基因序列的应用 |
| 3 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 早熟艾美球虫、和缓艾美球虫的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美球虫的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫及4株巨型艾美球虫ITS全序列克隆与序列分析 |
| 1 材料、试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美球虫与巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫间在免疫上的相互影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）巴贝斯虫病LAMP检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 巴贝斯虫和巴贝斯虫病 |
| 1 虫体形态 |
| 2 巴贝斯虫病的流行 |
| 3 巴贝斯虫病的危害 |
| 4 诊断 |
| 4.1 临床症状 |
| 4.2 血液的检查 |
| 4.3 解剖尸体 |
| 4.4 流行病学调查 |
| 5 治疗 |
| 5.1 药物治疗 |
| 5.2 阻断传播媒介,消灭蜱 |
| 5.3 病牛和带虫牛群集中饲养,彻底治疗 |
| 6 小结 |
| 第二章 巴贝斯虫检测研究进展 |
| 1 常规检测方法 |
| 2 血涂片镜检技术 |
| 3 蜱传播实验 |
| 4 分子生物学方法 |
| 5 小结 |
| 第三章 环介导等温扩增技术的原理及应用 |
| 1 LAMP方法的介绍 |
| 2 LAMP方法的原理 |
| 2.1 LAMP引物 |
| 2.2 LAMP反应过程 |
| 3 LAMP方法的特点 |
| 3.1 扩增反应鉴别方便、快捷 |
| 3.2 LAMP反应特异性强、灵敏度高 |
| 3.3 LAMP反应扩增效率高 |
| 3.4 实验装置简单 |
| 4 小结 |
| 研究内容 |
| 第一章 巴贝斯虫属LAMP方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 B.bovis DNA基因克隆 |
| 1.3 LAMP方法的建立 |
| 1.4 LAMP特异性试验 |
| 1.5 LAMP敏感性试验 |
| 1.6 重复性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 反应体系的优化 |
| 2.2 特异性试验结果 |
| 2.3 敏感性试验结果 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 快速检测双芽巴贝斯虫LAMP方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 B.bigemina LAMP方法的建立 |
| 1.3 B.bigemina cyt b基因PCR检测方法的建立 |
| 1.4 LAMP特异性试验 |
| 1.5 LAMP敏感性试验 |
| 1.6 重复性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 反应体系的优化 |
| 2.2 特异性试验结果 |
| 2.3 敏感性试验结果 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 快速检测牛巴贝斯虫LAMP方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 B.bovis LAMP方法的建立 |
| 1.3 B.BOVIS CYT B基因PCR检测方法的建立 |
| 1.4 LAMP特异性试验 |
| 1.5 LAMP敏感性试验 |
| 1.6 重复性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 反应体系的优化 |
| 2.2 特异性试验结果 |
| 2.3 敏感性试验结果 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录A 本研究被GenBank所收录的基因序列 |
| 附录B 英文缩写注释 |
| 攻读硕士期间发表或录用的学术论文 |
| 致谢 |
（9）湖南省牛无浆体病调查与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言(绪论) |
| 1 病原体 |
| 2 流行病学 |
| 3 致病及免疫 |
| 4 检测技术 |
| 5 立题依据及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 湖南省部分地区牛无浆体病感染及传播途径调查 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 牛无浆体实验动物感染模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 牛无浆体虫株分子生物学检测方法的探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 结论 |
| 符号说明 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）牛无浆体病套式PCR及实时荧光PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第1章 无浆体病的研究进展 |
| 1.1 病原体 |
| 1.1.1 分类学 |
| 1.1.2 形态学 |
| 1.2 地理分布 |
| 1.3 传播媒介 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 临床症状 |
| 1.6 发病机理 |
| 1.7 诊断技术 |
| 1.7.1 病原学诊断 |
| 1.7.2 血清学诊断 |
| 1.7.2.1 间接荧光抗体试验与显微荧光测定法 |
| 1.7.2.2 快速凝集试验与补体结合试验 |
| 1.7.2.3 间接荧光抗体试验 |
| 1.7.2.4 酶联免疫吸附试验 |
| 1.7.2.5 其它血清学方法 |
| 1.7.3 分子生物学检测 |
| 1.7.3.1 核酸探针检查 |
| 1.7.3.2 多聚酶链式反应技术 |
| 1.7.3.3 实时荧光定量PCR |
| 1.8 无浆体病的防治 |
| 1.8.1 蜱的控制 |
| 1.8.2 无浆体疫苗的研究 |
| 1.8.2.1 活疫苗的研究 |
| 1.8.2.2 弱毒疫苗的研究 |
| 1.8.2.3 灭活苗的研究 |
| 1.8.2.4 重组疫苗的研究进展 |
| 1.8.3 药物治疗 |
| 1.9 无浆体虫株的保存方法 |
| 1.10 无浆体的体外培养 |
| 第2章 套式PCR方法检测牛羊无浆体病 |
| 2.1 目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 模板 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.2.3 供试引物 |
| 2.2.4 主要化学试剂和药品 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.2.6 模板制备 |
| 2.2.7 模板制备方法的优化 |
| 2.2.8 LB培养基的制备 |
| 2.2.9 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 克隆 |
| 2.2.11 DNA浓度的测定 |
| 2.2.12 PCR扩增 |
| 2.2.13 PCR扩增条件的优化 |
| 2.2.13.1 引物退火温度优化 |
| 2.2.13.2 dNTP浓度的优化 |
| 2.2.13.3 Mg~(2+)浓度的优化 |
| 2.2.13.4 PCR扩增时的延伸时间的确定 |
| 2.2.13.5 PCR反应的变性时间和退火时间 |
| 2.2.14 常规PCR的灵敏度(以基因组DNA为模板) |
| 2.2.15 套式PCR的灵敏度(以质粒DNA为模板) |
| 2.2.16 套式PCR的特异性 |
| 2.2.17 PCR产物克隆测序 |
| 2.2.18 套式PCR循环数的确定 |
| 2.2.19 对照实验 |
| 2.2.20 样品检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同DNA抽提方法的比较 |
| 2.3.2 PCR反应条件优化结果 |
| 2.3.2.1 引物退火温度优化结果 |
| 2.3.2.2 dNTP浓度的优化结果 |
| 2.3.2.3 Mg~(2+)浓度的优化结果 |
| 2.3.2.4 PCR扩增时的延伸时间优化结果 |
| 2.3.2.5 变性时间和退火时间 |
| 2.3.3 常规PCR引物的灵敏度 |
| 2.3.4 套式PCR引物的灵敏度(以质粒DNA为模板) |
| 2.3.5 引物特异性 |
| 2.3.6 套式PCR循环数优化结果 |
| 2.3.7 样品检测及PCR产物克隆测序结果 |
| 2.3.8 不同检测方法比较结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 实时荧光PCR检测牛边缘无浆体病 |
| 3.1 目的和意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 模板的制备 |
| 3.2.2 样品的采集 |
| 3.2.3 引物和探针 |
| 3.2.4 实时荧光PCR |
| 3.2.5 灵敏度试验 |
| 3.2.6 特异性试验 |
| 3.2.7 样品的实时荧光PCR检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 实时荧光PCR特异性 |
| 3.3.2 实时荧光PCR扩增的灵敏度 |
| 3.3.3 样品DNA的实时荧光PCR扩增 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 试剂配制 |
| 附录2 测序结果比对 |
| 致谢 |
四、牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离（论文参考文献）
- [1]我国牛巴贝斯虫病传播媒介分布及适生区变动趋势研究[D]. 黄禹然. 东北农业大学, 2021
- [2]巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆、表达及双芽巴贝斯虫病间接ELISA诊断方法的建立[D]. 袁利芹. 石河子大学, 2014(03)
- [3]牛巴贝斯虫病ELISA检测方法的建立[D]. 李安岩. 中国农业科学院, 2013(02)
- [4]梨形虫及硬蜱标识基因的分析与初步应用[D]. 苟惠天. 中国农业科学院, 2012(08)
- [5]牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCTη基因的克隆与生物信息学分析[J]. 黄国明,薛书江,贾立军,李闯,张守发. 畜牧与兽医, 2012(10)
- [6]牛巴贝斯虫体外培养体系及ELISA检测方法的建立[D]. 杜鹏飞. 中国农业科学院, 2012(10)
- [7]四种鸡艾美球虫ITS区序列分析及毒害与巨型或柔嫩艾美球虫间在免疫上相互影响的研究[D]. 李建梅. 扬州大学, 2011(04)
- [8]巴贝斯虫病LAMP检测方法的建立[D]. 李群. 浙江大学, 2010(02)
- [9]湖南省牛无浆体病调查与分析[D]. 李海辉. 湖南农业大学, 2008(09)
- [10]牛无浆体病套式PCR及实时荧光PCR检测方法的建立[D]. 王贵强. 华中农业大学, 2007(04)