一、恶性肿瘤与癌基因（论文文献综述）
程英[1]（2020）在《MicroRNA-222介导PI3K/Akt/MMP-9信号通路参与调控HMGA1对葡萄膜黑色素瘤生物学功能的影响》文中提出研究背景葡萄膜黑色素瘤（uvealmelanoma,UM）好发于眼球后极部,是成年人眼内最常见的原发性恶性肿瘤。UM极易发生血行转移,大约50%的UM患者在首次就诊时被检查发现远处转移病灶,近一半转移性UM患者的肝脏均有不同程度受累。UM一旦发生转移,患者死亡率极高,据临床研究数据统计发现,转移性UM患者的中位生存期仅为5-8个月。UM传统治疗方法为眼球摘除术,但是由于该方法创伤大,导致患者日常生活质量受到严重的影响。近年来,逐渐出现了多种保留眼球的新型治疗策略,包括局部肿瘤切除术、局部放射治疗和激光光凝等。尽管这些新兴的治疗手段保留了UM患者眼球、维持了患者部分视功能,但是流行病学统计发现,近年来UM患者总生存率并未能得到有效的改善。近年来,特异性分子靶点在多种人类恶性肿瘤中的潜在应用前景逐渐引起学者们的关注,主要包括肿瘤早期诊断、临床治疗及预后评估等方面,分子生物靶点可能作为一种新型且疗效显着的肿瘤临床治疗新模式。研究发现,高迁移率族蛋白家族分子是调控肿瘤恶性表型的重要蛋白家族,其中高迁移率族蛋白A1（high-mobility group A,HMGA1）能够启动多个肿瘤发生并促进肿瘤进展,HMGA1的作用机制涉及与非编码RNA、信号通路之间的关系。HMGA1在人类正常或高分化的肿瘤组织内呈低表达甚至缺如,而在低分化肿瘤中常为高表达。由此推测,干预HMGA1表达即有可抑制UM肿瘤细胞生长、转移、侵袭等细胞生物学功能,而且这种干预对宿主正常细胞的影响较小,从而有效提高抗肿瘤效应对人体的安全性。课题组前期研究发现,HMGA1在UM患者肿瘤组织中呈高表达,并且与UM肿瘤远处转移率升高和UM患者中位生存期缩短呈正向相关。故阻断HMGA1相应的信号通路,即有可能阻断HMGA1所控制的相应肿瘤活动。MicroRNA（miRNA）又称为微小RNA,是一类具有调控功能的非编码RNA。近年来,miRNAs的调控机制逐渐成为抗肿瘤及抗肿瘤远处转移的研究热点。已有多项研究报道了 miR-222在不同类型恶性肿瘤中的异常表达,例如肺癌、宫颈癌及肾透明细胞癌等,但是miR-222与HMGA1在UM肿瘤中的作用机制目前尚未有相关文献报道。故本课题拟从HMGA1对UM细胞的调控机制和miR-222与HMGA1在UM中的作用机制入手,探讨HMGA1与miR-222对UM细胞增殖和迁移等重要生物学功能的调控机制,为临床治疗提供数据及潜在的分子治疗靶点。已有研究证实,PI3K/Akt/MMP-9是HMGA1的下游信号通路。其中,基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）可通过降解肿瘤细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,使肿瘤细胞摆脱ECM的束缚而产生浸润和转移。若能实现靶向下调PI3K/Akt/MMP-9通路或其上游的HMGA1,抑制肿瘤组织中MMP-9过表达所诱导的肿瘤细胞浸润效应,阻断其下游迁移和侵袭信号可能是最有希望取得良好抗肿瘤及抗肿瘤转移疗效的策略。目前尚未有文献报道过,在UM中HMGA1与miR-222对肿瘤细胞的调控机制。故我们拟从HMGA1与miR-222在UM中的相互作用关系,及其是否通过PI3K/Akt/MMP-9通路实现对UM细胞的生物功能调控等方面来验证,为临床早期诊断、临床治疗及患者预后评估提供真实有效的实验数据及潜在的生物靶点。第一部分HMGA1在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达目的:HMGA1属于高迁移率族蛋白家族,是调控肿瘤恶性表型的重要蛋白,可以启动人类多种恶性肿瘤的发生并促进肿瘤进展。HMGA1的主要作用机制为参与下游基因及信号通路的调控,对肿瘤发生进展中的肿瘤血管新生、细胞增殖、凋亡异常、微环境改变、炎症反应及远处转移等一系列病理过程均有调节作用。设想若能人为阻断HMGA1对应的相关信号通路,即有希望阻断HMGA1所控制的相应肿瘤活动。课题组前期通过分析89例UM患者肿瘤组织中的HMGA1表达,发现HMGA1在UM组织中呈现过表达状态,且与UM远处转移的发生率及患者中位生存期缩短相关。课题的第一部分旨在检测UM细胞C918和MUM-2B中HMGA1的表达情况,为探究HMGA1在UM中的调控机制奠定基础。方法:收集UM细胞C918和MUM-2B,实时荧光定量PCR反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,RT-PCR）检测细胞样本中 HMGA1 表达。结果:相比于正常对照组细胞,HMGA1表达在C918及MUM-2B细胞中显着升高（P<0.05）。结论:HMGA1表达在UM细胞C918和MUM-2B中升高明显,提示HMGA1可能在UM进展过程中发挥着重要作用。第二部分葡萄膜黑色素瘤中HMGA1对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用目的:在第一部分研究结果中,我们发现了 UM细胞及组织中存在着HMGA1的过表达现象,且HMGA1的过表达状态与UM肿瘤细胞高转移率及患者中位生存期缩短相关。然而,HMGA1在UM中的调控机制如何?目前尚未解决。在本部分内容中,我们旨在研究分析HMGA1对UM细胞功能调控的具体作用机制;验证HMGA1作为上游分子信号,对下游通路PI3K/Akt/MMP-9的调控作用。方法:利用慢病毒包装的lentivirus（LV）-HMGA1-RNAi下调C918与MUM-2B两种人UM细胞的HMGA1基因表达。细胞转染后48h,荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）标记的UM细胞数量,评估转染效率,有荧光标记的细胞表示病毒已经转入细胞并成功表达。更换新鲜细胞培养液,加入嘌呤霉素进行两周左右的细胞筛选,从而得到慢病毒成功转染的UM细胞C918和MUM-2B。提取UM细胞总RNA及总蛋白质,采用RT-PCR及Western blot技术检测LV-HMGA1转染组及LV-NC组中HMGA1及PI3K/Akt/MMP-9通路信号的表达差异。结果:荧光显微镜检测结果显示,C918细胞的病毒转染率达90%以上,MUM-2B转染率为80%左右。慢病毒转染72h后,提取细胞总RNA及总蛋白,RT-PCR结果显示在C918与MUM-2B细胞中,与NC组相比,HMGA1及MMP-9表达水平在LV-HMGA1转染组中明显下调（P<0.05）;Western blot结果显示,在C918与MUM-2B细胞中,HMGA1、p-PI3K、p-Akt与MMP-9的表达在LV-HMGA1转染组中显着下降,与 RT-PCR结果一致（P<0.05）。结论:HMGA1过表达状态是UM肿瘤进展的高危因素。通过应用慢病毒下调HMGA1表达后,RT-PCR及Western blot结果均显示,HMGA1表达的抑制可有效下调PI3K/Akt/MMP-9通路信号,从而达到抑制UM肿瘤生长的目的。由此可见,HMGA1可能通过调控PI3K/Akt/MMP-9通路,参与了 UM细胞增殖、迁移及侵袭等恶性表型,揭示HMGA1表达调控机制可为有效抑制UM病程进展和远处转移提供新的临床诊疗思路。第三部分MicroRNA-222对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学功能的影响目的:探讨MicroRNA-222（miR-222）表达水平改变对UM细胞活性、凋亡及迁移等细胞生物学功能的影响。方法:成功构建 miR-222-3pmimics,miR-222-3p inhibitor和其分别对应的 miRNA-222-3p negative control（miRNA-222-3p NC）,与 EndoFectinrM Max 转染试剂混合后分别转入C918与MUM-2B两种UM细胞中,改变细胞内miRNA-222-3p的表达水平,从而观察分析UM细胞增殖活性（CCK-8实验）、迁移能力（Transwell小室和细胞划痕实验）及凋亡状态（Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒）。通过以上实验,综合分析miR-222对UM细胞的调控作用。结果:将miR-222-3p mimics,miR-222-3p inhibitor和其对应的NC组分别利用转染试剂转入C918与MUM-2B细胞后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测UM细胞中miR-222-3p表达水平变化,以评估转染效果。RT-PCR结果显示,通过miR-222 mimics或miR-222 inhibitor转染UM细胞,miR-222表达水平在C918与MUM-2B细胞中出现显着的上调或下调,提示表达干扰效果较好（P<0.05）。通过分析CCK-8结果发现,miR-222 mimics能够显着提高UM细胞的增殖活力,相反,在miR-222 inhibitor转染组中,C918与MUM-2B细胞的增殖能力受到了明显抑制（P<0.05）。Annexin V-FITC凋亡检测结果显示,C918与MUM-2B细胞在miR-222-3pmimics转染组中,Annexin V阳性染色细胞较少;而在miR-222 inhibitor转染组中,Annexin V阳性染色细胞数量显着增多（P<0.05）。分析细胞划痕与Transwell实验结果后均提示,miR-222 mimics转染组中的UM细胞迁移能力较miR-222 inhibitor转染组中的细胞明显增强（P<0.05）。综上所述,miR-222在UM细胞中发挥着促进肿瘤细胞增殖和迁移的作用。结论:MiR-222对UM细胞C918与MUM-2B有着促进细胞增殖和迁移、抑制细胞凋亡的作用,可见在UM中miR-222发挥着癌基因的效应。第四部分葡萄膜黑色素瘤中HMGA1靶向miR-222对PI3K/Akt/MMP-9通路调控的机制研究目的:在第三部分研究内容中,我们发现了 miR-222对两种UM细胞C918与MUM-2B有着抑制细胞凋亡、促进细胞增殖及迁移的能力,可见miR-222发挥着促进UM肿瘤生长及进展的作用。在这一部分研究中,我们将深入分析UM肿瘤中miR-222与HMGA1的作用关系,及miR-222对下游PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用。方法:利用慢病毒LV-HMGA1-RNAi下调C918与MUM-2B细胞中HMGA1表达后,RT-PCR检测HMGA1表达下调组和LV-NC组中miR-222表达水平改变。构建miR-222-3p mimics,miR-222-3p inhibitor 和其对应的 miR-222-3p NC,在转染试剂的辅助下进入C918与MUM-2B细胞中,上调或下调UM细胞内miR-222-3p表达水平;转染48h后,Western blot检测不同转染组中PI3K/Akt/MMP-9通路信号表达情况;并利用生物学网站进行miR-222与HMGA1的作用靶点预测。结果:通过RT-PCR检测C918与MUM-2B细胞中miR-222水平,结果发现在HMGA1表达下调组中,C918与MUM-2B细胞中miR-222表达水平显着降低（P<0.05）。在miR-222-3p mimics 转染组中,Western blot 检测发现,C918 与 MUM-2B 细胞中的 p-PI3K,p-Akt与MMP-9蛋白表达均显着上调;相反,在miR-222-3p inhibitor转染组中,p-PI3K,p-Akt与MMP-9蛋白表达下降（P<0.05）,但PI3K与Akt总蛋白水平在miR-222-3p mimics和inhibitor组中并无明显差异。我们推测,出现此结果的原因可能为磷酸化的PI3K与Akt（即p-PI3K,p-Akt）分别是PI3K与Akt的活化形式,所以p-PI3K和p-Akt的表达水平在不同转染组中发生了明显变化,而总PI3K与总Akt蛋白表达则较为稳定。结论:在UM肿瘤中,HMGA1与miR-222之间可能存在着作用靶点;miR-222发挥着促进UM肿瘤细胞增殖、迁移等作用,且miR-222对UM细胞的调控作用可能是通过PI3K/Akt/MMP-9通路介导的。第五部分HMGA1对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的:通过慢病毒LV-HMGA1-RNAi构建HMGA1表达稳定下调的C918细胞,并使C918细胞悬液通过皮下注射方式进入裸鼠体内成瘤,观察HMGA1对UM肿瘤生物学行为影响;通过分子蛋白水平检测分析动物瘤体组织中HMGA1表达对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用。方法:将成功构建的HMGA1表达稳定下调的C918细胞皮下注射入裸鼠体内成瘤后,观察HMGA1表达下调组和NC组中裸鼠体内UM肿瘤形成过程。注射后一周后,每两天记录裸鼠体重和瘤体体积。28天时处死裸鼠,测量瘤体重量和体积;收集部分瘤体组织提取总蛋白质,行Western blot检测HMGA1表达及PI3K/Akt/MMP-9信号通路表达水平在不同实验动物组的差异;另保留部分瘤体组织行免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）分析 HMGA1 表达。结果:裸鼠皮下成瘤实验证实,HMGA1表达下调组的裸鼠瘤体体积和重量显着小于NC组裸鼠,且其生长速度减缓（P<0.05）。保留部分瘤体组织,采用Western blot及IHC实验检测HMGA1和PI3K/Akt/MMP-9表达。结果显示,HMGA1表达水平在慢病毒LV-HMGA1-RNAi转染组中明显降低,证实了 HMGA1表达下调的C918裸鼠成瘤模型构建成功;与NC组相比,PI3K,p-PI3K,p-Akt及MMP-9表达水平在慢病毒转染组中均显着下降（P<0.05）。结论:裸鼠体内实验证实,HMGA1发挥着促进UM肿瘤生长的作用。当利用慢病毒下调C918细胞中HMGA1表达时,肿瘤生长受到明显抑制。通过分子生物学分析,我们证实了 HMGA1是通过PI3K/Akt/MMP-9通路发挥了在裸鼠体内调节UM细胞增殖的效应。全文结论HMGA1是UM发生及进展过程中的重要致癌基因,其在肿瘤组织中的过表达状态与UM细胞增殖、迁移、转移等生物学功能密切相关,揭示HMGA1表达及相关调控机制可为UM的临床治疗提供新的诊疗思路和分子靶点。本课题利用慢病毒LV-HMGA1-RNAi分别转染两种不同的UM细胞C918和MUM-2B,构建HMGA1表达稳定下调的UM细胞模型,我们发现HMGA1对UM肿瘤细胞增殖和转移的促进作用可能是通过激活P13K/Akt/MMP-9通路而完成的。MiR-222在人类多种恶性肿瘤中均存在着表达异常;已知miR-222可通过与多个靶基因结合,搭建出一张高效且复杂的调控网络,影响肿瘤发生和转移行为。我们利用miR-222-3pmimics及miR-222-3p inhibitor分别转染C918和MUM-2B细胞,结果发现,在miR-222-3p mimics转染组中,C918和MUM-2B的细胞活性明显升高,凋亡程度降低且迁移能力增强;相反,在miR-222-3p inhibitor转染组中C918和MUM-2B的凋亡程度加重,细胞活性和迁移能力均被削弱。我们通过查询生物学网站miRTarBase进行分子靶点预测,数据库检索结果提示,miR-222与HMGA1之间存在着相互作用靶点。通过RT-PCR证实,HMGA1表达水平与miR-222 mimics呈正向调控关系,与miR-222 inhibitor呈反向调控关系。分别提取miR-222-3p mimics及miR-222-3p inhibitor转染组中UM细胞的总RNA 及总蛋白质,行 RT-PCR 和 Western blot 检测,分析 miR-222 对 PI3K/Akt/MMP-9通路信号水平的影响。结果发现,miR-222受到HMGA1基因直接调控,HMGA1通过促进miR-222表达,从而激活PI3K/Akt/MMP-9通路,发挥着对UM肿瘤细胞增殖和转移的调控作用。最后,我们在裸鼠体内进行了再次验证,发现HMGA1同样在活体内发挥着促进瘤体生长的作用,且此功能是通过PI3K/Akt/MMP-9通路参与完成的。综上所述,本课题提出,通过抑制HMGA1表达,靶向性阻断MMP-9上游的PI3K/Akt通路,从而阻止由MMP-9介导的UM细胞侵袭和迁移;HMGA1与miR-222 之间可能存在有相互的作用靶点,miR-222 可通过对 PI3K/Akt/MMP-9 通路进行活化而参与UM的进展过程。本课题通过对HMGA1在UM肿瘤中作用机制的深入研究,为UM肿瘤生物标志物和临床治疗靶点研究提供了可靠的基础数据和理论支持。
张玉宇[2]（2020）在《在肝细胞肝癌辐射抵抗中miR-873/NDFIP1对瓦伯格效应的调控机制》文中进行了进一步梳理肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）为主的原发性肝癌在全世界恶性肿瘤的发病率居第六位,死亡率居第四位,放射治疗作为HCC重要的局部治疗手段已广泛应用于临床。临床实际治疗中由于大部分HCC患者病灶体积较大,并且HCC常伴有乏氧坏死组织显着降低了辐射敏感性;国内患者大多伴有慢性病毒性肝炎、肝硬化等基础肝脏疾病,导致正常肝细胞组织对射线的耐受性差;肝癌病灶周围的脊髓、胃和小肠等均属于对辐射敏感的器官,临床上难以给予根治性的放疗剂量。上述原因最终导致放疗疗效不理想。因此,围绕HCC在乏氧条件下的能量代谢和辐射抗性的调控机制的进行研究,有助于提高HCC局部放疗疗效,并为靶向治疗提供新的分子靶点。研究背景:电离辐射通过间接诱发氧自由基诱导肿瘤细胞DNA的单链及双链损伤杀伤肿瘤细胞。肿瘤微环境的乏氧导致肿瘤细胞的活性氧和氧自由基显着减少,导致辐射抗性的发生。肿瘤细胞即使在氧供应充足和线粒体功能正常的情况下,仍然采用有氧糖酵解的方式摄取葡萄糖转化为乳酸,而不利用氧化磷酸化的方式供能,这种的现象叫做瓦伯格效应,是恶性肿瘤细胞能量代谢的主要特征。有氧糖酵解中的代谢产物如乳酸、丙酮酸、谷胱甘肽和NADPH等酸性物质累积,这些氧化还原剂可高效地清除活性氧和氧自由基,上调了内源性抗氧化能力,进一步导致了辐射抗性的发生。micro RNA是肿瘤发生和发展的重要调控因子,众多学者发现mi R-873在胶质母细胞瘤、结直肠癌和肺腺癌等不同的恶性肿瘤中异常表达,通过靶向调控不同的靶基因发挥癌基因或抑癌基因的作用。文献报道mi R-873可参与NF-κB、ERK、PI3K/AKT和Wnt/β-catenin等多种信号通路的调控。然而,mi R-873在HCC发生发展中的表达情况以及在HCC能量代谢和辐射抗性关系等生物学功能方面尚未见报道。研究目的:肿瘤细胞通过瓦伯格效应维持自身的快速持续增殖,并促进辐射抗性的发生。阐明乏氧微环境中HCC的能量代谢和辐射抗性的分子调控机制,对提高HCC局部放疗疗效具有重要的意义。研究方法:基于以上研究现状,本研究首先检测了86对HCC组织样本（肿瘤组织和癌旁组织）中的mi R-873表达,并与临床信息的相关性进行统计学分析。采用细胞增殖、迁移和侵袭实验探讨mi R-873在HCC的生物学功能。通过细胞克隆形成实验、MTT、流式细胞术等方法探讨mi R-873对HCC辐射抗性的影响。通过糖代谢相关实验和气相色谱质谱（GC-MS）分析法追踪13C标记的葡萄糖的代谢产物通量等方法对mi R-873能量代谢途径和相关指标进行分析、阐明其与瓦伯格效应的关系。应用公共mi RNA数据库进行预测其调控的靶基因为NDFIP1,并应用荧光素酶报告基因、q RT-PCR和免疫组化等方法进行研究其二者的靶向调控关系。通过gain-and-loss方法重复上述实验证实NDFIP1在HCC发生发展中的生物学功能与瓦伯格效应的关系。应用Western Blot、q RT-PCR、IHC等方法从体内、外实验检测其上、下游的调控信号通路分子。研究结果:1.体内、外检测mi R-873在HCC中表达水平及与临床信息的相关性分析（1）mi R-873在HCC组织中的表达与临床信息的相关性本研究收集了86对HCC患者的肿瘤和癌旁组织,检测mi R-873的表达,并深入分析HCC中mi R-873的表达水平与患者基本信息、肿瘤相关指标和临床预后等信息（患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、临床分期、淋巴血管转移、生存期和复发时间等临床治疗预后情况）的相关性,统计学分析了HCC中mi R-873表达的临床意义。结果显示,肝癌组织中的mi R-873呈高表达,明显高于癌旁组织。而且mi R-873的表达量与肿瘤临床分期、淋巴结转移及远处转移等恶性程度呈正相关,与肿瘤分化程度呈负相关,并且与HCC患者生存期和复发时间呈负相关,多因素分析显示HCC的临床分期和mi R-873的表达高低为预后的不良因素。（2）mi R-873在肝癌细胞和正常细胞的表达采用q RT-PCR方法检测了5种肝癌细胞系（SMMC-7721、Hep G2、Hep3B、SKHEP-1、MHCC97H）和3种人正常肝细胞系（L02、7701、7702）中mi R-873的表达水平,得出与正常肝细胞系相比,肝癌细胞系中的mi R-873均呈高表达（p<0.01）。综上得出mi RNA-873在HCC中作为癌基因可能发挥重要作用。2.探讨mi R-873在HCC中的生物学功能（1）过表达mi R-873基因对HCC增殖、迁移和侵袭的影响通过逆转录病毒转染法,将mi R-873 mimics转染到SMMC-7721细胞中,构建稳定mi R-873过表达的SMMC-7721细胞系（SMMC-7721-mi R-873high）,经q RT-PCR法验证转染成功后,通过CCK-8和Transwell实验对其增殖、迁移和侵袭能力进行检测。结果分析发现,与SMMC-7721-NC细胞相比,SMMC-7721-mi R-873 high细胞具有较强的增殖、迁移和侵袭能力（p<0.01）。（2）抑制mi R-873基因对HCC增殖、迁移和侵袭的影响通过逆转录病毒转染法,将mi R-873 inhibitor#1和#2分别转染到Hep3B细胞中,构建稳定mi R-873低表达Hep3B细胞系（Hep3B-anti-mi R-873-#1和Hep3B-anti-mi R-873-#2）,经q RT-PCR法验证转染成功后,同样通过CCK-8和Transwell实验检测两种mi R-873低表达的Hep3B细胞和正常Hep3B细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果显示:与Hep3B-NC细胞相比,两种mi R-873低表达的Hep3B细胞均显着抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力（p<0.01）。综合上述实验结果得出,mi R-873在HCC中作为癌基因,具有促进HCC增殖、迁移和侵袭的生物学功能。3.探讨miR-873对HCC辐射抗性的影响（1）过表达mi R-873对HCC辐射抗性的影响在SMMC-7721细胞中转染mi R-873的mimics过表达mi R-873,给予10 Gy的X线照射后24和48 h,经MTT法检测细胞增殖能力,结果显示,与转染NC对照组相比,过表达mi R-873的SMMC-7721细胞存活率升高约15%（p<0.05）。给予0、1、2、4、6、8 Gy的X线照射后细胞克隆形成实验,结果显示,过表达mi R-873的SMMC-7721细胞存活分数显着增加,应用流式细胞术检测经6 Gy X线照射的过表达mi R-873的SMMC-7721细胞,结果显示,细胞凋亡率明显降低（p<0.01）。表明过表达mi R-873可产生辐射抗性。（2）抑制mi R-873表达对HCC辐射抗性的影响在Hep3B细胞转染anti-mi R-873抑制mi R-873的表达,给予10 Gy的X线照射后24和48 h,经MTT法检测细胞增殖能力,结果显示,与转染anti-NC相比,mi R-873低表达的Hep3B细胞存活率下降约15%（p<0.05）。给予0、1、2、4、6、8 Gy的X线照射后细胞克隆形成实验得出抑制mi R-873的Hep3B细胞存活分数显着降低。应用流式细胞术检测经6 Gy X线照射的抑制mi R-873的Hep3B细胞的凋亡情况,结果显示,细胞凋亡率明显增加,并且细胞周期发生G2/M期阻滞（p<0.05）。表明抑制mi R-873表达可降低HCC的辐射抗性。综上实验结果证明,在HCC中过表达mi R-873产生辐射抗性,而抑制mi R-873可明显降低HCC的辐射抗性。4.探讨mi R-873在HCC中对糖代谢的调控功能（1）过表达或抑制mi R-873对HCC糖代谢的影响通过检测细胞外酸化率（ECAR）、耗氧率（OCR）、葡萄糖的摄取量、乳酸的产生量等糖代谢的指标进行分析。结果显示:抑制mi R-873基因表达的Hep3B细胞基础ECAR和最大ECAR均显着降低,而OCR显着升高（p<0.01）,葡萄糖的摄取和乳酸的产生量均呈降低趋势（p<0.05）。同理,在SMMC-7721细胞中转染mimics过表达mi R-873并对上述糖代谢指标检测,结果显示,过表达mi R-873后ECAR、葡萄糖摄取和乳酸产生量均呈升高趋势（p<0.01）,而OCR降低（p<0.01）。综上结果得出,mi R-873增强HCC的糖代谢能力。（2）研究mi R-873参与调控HCC有氧糖酵解采用气相色谱-质谱分析法（GC-MS）追踪过表达mi R-873的SMMC-7721细胞中13C标记的葡萄糖的代谢通量。结果显示:过表达mi R-873的SMMC-7721细胞培养基中13C标记的葡萄糖水平显着降低,13C标记的细胞内和细胞外乳酸水平升高（p<0.05）,过表达mi R-873后促进了HCC的有氧糖酵解。同时,检测到13C标记的葡萄糖-6-磷酸（G6P）、1,6-二磷酸（F1,6BP）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）等糖酵解的中间代谢产物水平升高,而三羧酸循环（TCA）的中间代谢产物柠檬酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸的水平降低（p<0.05）,综上结果表明,mi R-873在HCC中促进有氧糖酵解,而非氧化磷酸化。5.mi R-873的调控靶基因及其生物学功能（1）预测并验证mi R-873的靶基因1)生物信息学预测mi R-873调控的靶基因采用公共mi RNA数据库（Target Scan、mi Randa、Target Rank）通过与糖酵解相关的3’-UTRs基因位点进行预测mi R-873的靶基因为NDFIP1。通过将含有mi R-873靶位点的NDFIP1的3’-UTR克隆到荧光素酶报告基因载体中,利用荧光素酶报告基因验证两者之间具有靶向关系。2)研究mi R-873对NDFIP1的调控作用利用不同浓度的pre-mi R-873瞬时转染HEK293T细胞后,应用Western Blot检测内生NDFIP1蛋白的水平,结果表明mi R-873转染量与NDFIP1呈负相关（p<0.01）。采用q RT-PCR和免疫组化染色检测了20对临床HCC样本中mi R-873和NDFIP1的表达情况,得出HCC中NDFIP1 m RNA水平显着低于癌旁组织,并发现在HCC中mi R-873的表达与NDFIP1呈负相关（p=0.008）。（2）探讨NDFIP1作为mi R-873的靶基因对HCC糖酵解的影响在SMMC-7721细胞中过表达mi R-873和（或）NDFIP1后进行上述糖代谢相关检测,实验分为四组（NC、mi R-873、mi R-873+vector、mi R-873+NDFIP1）。结果显示,通过检测ECAR、OCR、葡萄糖的摄取量、乳酸的产生量等指标,发现过表达mi R-873后可增强有氧糖酵解,但同时过表达NDFIP1后可明显降低由过表达mi R-873而增强的糖酵解能力（p<0.01）,结果证明mi R-873通过抑制NDFIP1来促进有氧糖酵解。（3）探讨NDFIP1作为mi R-873的靶基因在HCC中的生物学功能通过gain-and-loss实验探究NDFIP1在HCC增殖、迁移和侵袭的生物学功能。在SMMC-7721细胞中转染p CDH-CMV-NDFIP1使其过表达,通过细胞增殖实验和Transwell实验结果显示,与SMMC-7721-NC细胞相比,过表达NDFIP1的SMMC-7721细胞显着减弱了增殖、迁移和侵袭能力（p<0.01）。在SMMC-7721细胞中同时过表达NDFIP1和mi R-873,通过细胞增殖实验和Transwell实验检测结果显示,同时过表达这两个基因的SMMC-7721细胞较单独过表达mi R-873的SMMC-7721细胞显着减弱了增殖、侵袭和迁移能力（p<0.01）。在Hep3B细胞中同时应用si RNA抑制NDFIP1和anti-mi R-873抑制mi R-873的表达,并通过细胞增殖实验和Transwell实验检测结果显示,同时抑制两个基因表达的Hep3B细胞较单独抑制mi R-873的Hep3B细胞可显着增强细胞的增殖、迁移和转移的能力（p<0.01）。这些结果提示,mi R-873通过抑制NDFIP1的表达来发挥促进HCC增殖、迁移和侵袭的癌基因的生物学功能。6.阐明mi R-873/NDFIP1调控瓦伯格效应的信号通路机制采用Western Blot检测HIF-1α、c-Myc、AKT-s473和S6K等调控糖代谢信号通路的关键蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,过表达mi R-873的SMMC-7721细胞中HIF-1α、c-Myc和总AKT水平无变化,但可诱导AKT-s473和S6K磷酸化。应用PI3K特异性抑制剂（LY294002）处理过表达mi R-873的SMMC-7721细胞,经过Western Blot检测相关蛋白表达,结果显示,LY294002显着抑制AKT磷酸化,同时降低了mi R-873诱导增强的糖酵解途径中关键酶Glut1和HK2的表达（p<0.01）。m TOR抑制剂（雷帕霉素）和LY294002均可抑制mi R-873过表达的SMMC-7721细胞中葡萄糖摄取和乳酸产生量的增加（p<0.05）。综上数据表明,AKT或m TOR的激活是mi R-873诱导有氧糖酵解所必需的,证明其下游调控信号通路为AKT/m TOR信号通路。7.阐明mi R-873在HCC中的上游调控分子机制使用q RT-PCR检测在Co Cl2模拟缺氧条件下HCC中mi R-873表达。结果显示,应用Co Cl2处理后会显着上调SMMC-7721和Hep3B细胞中mi R-873的m RNA表达水平（p<0.01）。在上述两种细胞中首先分别转染两种si-HIF-1α降低HIF-1α的表达,再应用同样的Co Cl2处理后,应用q RT-PCR检测mi R-873的m RNA的表达量,发现mi R-873的表达显着下调（p<0.05）。进一步阐明HIF-1α如何调控mi R-873的表达,我们使用mi RStart和JASPAR数据库预测mi R-873的TSS和HRE,发现HIF-1α与mi R-873中TSS上游的-1kb序列区中HREs结合。因此,将含有预测HRE序列的mi R-873（-1 kb）启动子区域克隆到p GL3载体中。同样用COCl2处理HEK293T细胞后mi R-873启动子荧光素酶活性增加,而转染si-HIF-1α后明显降低荧光素酶活性（p<0.01）。应用裸鼠皮下移植瘤实验进一步研究HIF-1α对mi R-873的调控作用。利用HIF-1α特异性抑制剂（BAY87-2243）对Hep3B皮下移植瘤的雄性BALB/c裸鼠连续灌胃15天后处死小鼠,用q RT-PCR法检测肿瘤组织mi R-873的m RNA表达水平和IHC法检测HIF-1α蛋白的表达。结果显示,与对照组小鼠相比,经BAY87-2243处理的小鼠mi R-873的m RNA表达量显着降低（p<0.01）,IHC显示HIF-1α蛋白的表达显着减少。结论:1.mi R-873在HCC中高表达,与HCC恶性程度呈正相关,与临床预后呈负相关。2.mi R-873作为癌基因发挥促进HCC增殖、迁移和侵袭的生物学功能;3.过表达mi R-873产生辐射抗性,靶向抑制mi R-873可显着降低HCC的辐射抗性,有利于提高HCC的放射敏感性;4.mi R-873通过增强HCC有氧糖酵解同时抑制氧化磷酸化,进而增强瓦伯格效应;5.NDFIP1是mi R-873的靶基因,作为抑癌基因,发挥抑制HCC增殖、迁移、侵袭和瓦伯格效应的生物学功能;6.mi R-873/NDFIP1轴通过AKT/m TOR信号通路增强了HCC的瓦伯格效应,进而促进HCC的生长和转移;7.在HCC乏氧微环境中,引起HIF-1α的过表达后上调了mi R-873的表达,进而调控瓦伯格效应的发生,促进HCC增殖、迁移、侵袭和辐射抗性的发生。
杜江[3]（2020）在《MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究》文中研究说明目的:分别观察miRNA-451、c-Myc以及E-cadherin在三阴性乳腺癌、癌旁组织中的表达情况以及相互关系,验证miRNA-451与c-Myc表达之间可能存在的调控关系,通过慢病毒转染,观察miRNA-451不同表达水平下c-Myc、E-cadherin蛋白表达变化,以及调控c-Myc表达对三阴性乳腺癌细胞增殖活性、细胞迁移、侵袭能力以及细胞周期、凋亡的影响。方法:（1）收集2016-08至2018-02新疆医科大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌标本16例,采用自身配对的方式对乳腺癌组织以及癌旁组织中作为实验组以及对照组PCR方法和Western Blot检测miRNA-451、c-Myc及E-cadherin的基因、蛋白表达水平;（2）首先构建c-Myc 3’UTR野生及突变质粒,生物信息方法分析并预测可能的转录因子结合位点,PCR方法扩增c-Myc基因3’-UTR序列,连接于荧光素酶报告检测各组荧光素酶活性,以海肾荧光素酶作为对照,检测细胞干预前后萤光素酶变化情况。双荧光素酶报告结果,以萤火虫/海肾荧光素酶比值表示;（3）构建稳定的MDA-MB-231细胞,培养稳定传代2-3代后,分为五组:1)BLANK组（不转染任何质粒）;2)miRNA-451-mimics-NC（拟似物阴性对照组）;3)miRNA-451-mimics4（拟似物组）;4)miRNA-451-inhibitor-NC（抑制物阴性对照组）;5)miRNA-451-inhibitor（抑制物组）,使用PCR方法和Western Blot分别检测各组中miRNA-451、c-Myc及E-cadherin的基因及蛋白表达水平,CCK8方法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移侵袭,流失细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况。结果:1)三阴性乳腺癌组织中c-Myc表达水平显着高于癌旁组织（t=-2.447,P=0.022）,三阴性乳腺癌组织中miRNA-451表达水平显着低于癌旁组织（t=3.799,P=0.001）,三阴性乳腺癌组织中E-cadherin表达水平显着低于癌旁组织（t=2.309,P=0.028）,c-Myc、miRNA-451与E-cadherin存在负相关关系（相关系数=-2.489,P=0.021）,c-Myc、miRNA-451以及E-cadherin表达情况与临床资料统计分析未见明显相关性（P>0.05）。2)数据库检测结果显示miRNA--451与c-Myc存在互补结合位点,荧光素酶活性检测结果表明miRNA-451mimic能够与c-Myc基因3’-UTR结合并抑制荧光素酶活性;与对照组相比,野生型载体中的报告荧光活性显着下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。miRNA-451与c-Myc基因存在互补区域,miRNA-451通过结合c-Myc3’UTR区下调c-Myc的表达,c-Myc是miRNA-451抑制乳腺癌EMT和侵袭转移的主要靶标基因。3)RT-PCR以及Western Blot检测显示,与空白对照组相比,三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系转染miRNA-451-mimics后,c-Myc表达量显着降低（P<0.05）,E-cadherin表达量显着升高（P<0.05）;转染miRNA-451-inhibitor后,c-Myc表达量显着升高（P<0.05）,E-cadherin表达量显着降低（P<0.05）。三阴性乳腺癌细胞过表达miRNA-451后,不仅明显抑制细胞的增殖能力、迁移、侵袭能力,流式细胞检测提示细胞G0/G1期比例增加,从而促进细胞凋亡。三阴性乳腺癌中miRNA-451过表达可抑制肿瘤活性。c-Myc在高转移潜能的三阴性乳腺癌中过表达,miRNA-451的过表达可抑制肿瘤细胞EMT和侵袭转移。结论:（1）三阴性乳腺癌组织中c-Myc呈高表达状态,三阴性乳腺癌组织中miR-451以及E-cadherin呈低表达状态,并呈负向相关的关系;（2）miRNA-451与c-Myc具有互补结合位点,并存在负向靶标调节关系,c-Myc是miRNA-451的下游靶基因;（3）在三阴性乳腺癌中,miRNA-451的表达沉默可导致c-Myc的过表达,从而下调E-cadherin的表达,导致EMT以及肿瘤侵袭转移的发生。
李行[4]（2019）在《长链非编码RNA HOTAIR和microRNA-149基因多态性与肺癌易感性的关系及其机制的研究》文中指出目的:在全世界范围内,肺癌是发病率最高并且死亡人数最多的恶性肿瘤之一。根据最新的统计数据显示,肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,而且发病率仍在逐年上升。所以我国现今对于肺癌的预防、早诊早治工作仍需进一步加强和改善,对于肺癌的防治工作仍是抗癌工作的重中之重。早期肺癌的症状通常较为隐匿,目前缺乏行之有效的早诊手段,所以对于肺癌的早诊早治工作的开展难度很大,多数肺癌患者在确诊时已经处于中晚期,而原发性肺癌患者的五年生存率仅为15%。大约70%的患者确诊时已处在局部晚期或已经发生转移的恶性程度,失去了最佳手术治疗的机会。并且由于肺癌的异质性和易出现化疗药物耐药性,近些年肺癌患者的预后状况并没有明显的改善。20世纪70年代时,肺癌在我国恶性肿瘤死亡率中排在第5位,与同期的其他国家相比,仍处于一个相对较低的水平,但经过其后几十年的发病率上升后,肺癌已经成为我国癌症死亡人数最多的恶性肿瘤。肺癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果,尽管吸烟被公认为引起肺癌发生的最重要的环境危险因素,但统计数据显示,仍然有15%的男性肺癌患者和53%的女性肺癌患者的发病并不是由吸烟直接造成的。越来越多的证据表明,遗传因素在肺癌的发生发展过程中发挥着不可替代的重要作用,但在肺癌发生过程中的确切分子机制尚未完全阐明,因此对于遗传因素在肺癌中所发挥作用的确切机制有必要进行更深入的探索。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一组长度大于200碱基长度的,不能编码蛋白的RNA,具有组织表达特异性和时空表达特异性。据估计,非编码RNA约占人类基因组的70%以上。有功能研究证据表明,lncRNA在多种肿瘤发生过程中发挥基因表达调控的重要作用,lncRNA可能影响肿瘤细胞的细胞增殖,细胞侵袭、转移能力,细胞周期和细胞凋亡等过程和能力。微小RNA（microRNA）是一组进化保守的,长度为21-24碱基的不能编码蛋白的短链微小RNA。microRNA可以与编码基因的信使RNA的3’非翻译区完全或者不完全互补配对,可能导致该信使RNA被降解或其翻译过程受到抑制,从而调控信使RNA翻译的活动。有研究表明,microRNA可以参与细胞的多种生理、病理过程如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和炎症反应过程,这些过程的失调经常与肿瘤发生有关。有大量证据表明,microRNA可以发挥原癌基因或者抑癌基因的作用,并且许多种microRNA基因位于肿瘤相关的基因所在区域,microRNA的异常表达现象存在于多种恶性肿瘤组织,因此,研究microRNAs与恶性肿瘤发生的关系对于开发恶性肿瘤的诊断标志物和靶向治疗具有重要价值。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是存在于基因组中最常见的一类变异,是DNA序列上单个的碱基替换,人类基因组中总共大约30亿个碱基,平均每1000个碱基中就可能存在一个SNP。已有研究证据表明lncRNA和microRNA上的SNP与多种恶性肿瘤的易感性和预后有关。竞争性内源RNA机制是近些年提出的一个假说,主要的核心观点是:在细胞中信使RNA、长链非编码RNA、假基因（pseudogene）或其他分子拥有共同的microRNA反应元件（microRNA response element,MRE）,是这些分子上的一段共同的特定microRNA互补结合序列,这就可能造成这些分子竞争与microRNA结合,从而影响microRNA调控下游基因过程。有研究报道长链非编码RNA HOTAIR在肺癌中发挥原癌基因的作用,可以促进肺癌的发生发展,但HOTAIR上的SNP位点多态性与肺癌的关系仍不明确。有证据表明,miR-149在肺癌中发挥抑癌基因的作用,但miR-149上的SNP位点多态性与肺癌易感性的联系未有定论。因此本研究探索长链非编码HOTAIR和miR-149基因多态性与肺癌易感性的关系,并验证HOTAIR,miR-149-5p和HNRNPA1在肺癌发生过程中的竞争性内源RNA机制。研究方法:第一部分,我们采用以医院为基础的病例对照研究,探索了长链非编码RNA HOTAIR上的3个SNP位点,rs920778,rs12826786和rs4759314与肺癌易感性之间的关系。研究对象包括551名肺癌病例和543名来自体检中心的健康对照,所有纳入的研究对象全部都是汉族。病例来自中国医科大学附属第四医院、中国人民解放军北部战区总医院和中国医科大学附属第一医院三家三级甲等医院,并且在捐献5ml静脉血前未经过放射治疗和化学治疗。对照均选自同一时期在上述医院体检中心体检的健康人。所有参与研究的对象,均在签署知情同意书后,捐献5ml静脉血。我们采用酚-氯仿法对所有血样提取基因组DNA,使用ABI公司的Taqman探针引物对研究对象的基因组DNA进行SNP分型。两组间连续变量和分类变量的比较分别采用t检验和卡方检验。采用Logistic回归模型计算OR及其95%置信区间来估计不同SNP位点的不同基因型与肺癌发病风险之间的关系。本研究经过中国医科大学伦理委员会审批通过。第二部分的研究探索了miR-149上的一个SNP位点rs2292832与肺癌易感性的关系。研究是采用以医院为基础的病例对照研究。本研究最终纳入555名病例和395名健康对照。病例来自中国医科大学附属第四医院、中国人民解放军北部战区总医院和中国医科大学附属第一医院三家三级甲等医院,对照均来自同一时期在医院体检中心体检的健康人。所有研究对象在签署知情同意书后捐献5ml静脉血。我们从静脉血中提取了全基因组DNA,使用ABI公司的Taqman探针引物对研究对象的基因组DNA进行SNP分型。两组间连续变量和分类变量的比较分别采用t检验和卡方检验。采用Logistic回归计算OR及其95%可信区间来评价不同基因型与肺癌发病风险之间的关系。本研究经过中国医科大学伦理委员会审批通过。第三部分的研究通过构建HOTAIR的小干扰RNA（siRNA）,过表达HOTAIR和miR-149-5p慢病毒转染入肺癌细胞系A549和SPC-A-1来探讨其对癌细胞的增殖、转移,细胞周期和凋亡等细胞生物学行为的影响。我们运用划痕修复实验和Transwell实验来检测HOTAIR和miR-149-5p对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。使用Celigo全视野细胞分析仪检测4个时间点肺癌细胞的融合度,分析HOTAIR和miR-149-5p对细胞增殖的影响。使用流式细胞技术来检测肺癌细胞的细胞周期和凋亡情况,探究HOTAIR和miR-149-5p对细胞周期和凋亡的影响。使用双荧光素酶报告基因验证HOTAIR与miR-149-5p的靶向结合关系以及miR-149-5p与HNRNPA1的靶向结合关系。结果:第一部分病例对照研究结果显示:HOTAIR rs12826786、HOTAIR rs4759314与肺癌的发病风险存在有统计学意义的关联,HOTAIR rs920778与肺癌的易感性的关联无统计学意义的关联。分层分析显示HOTAIR rs4759314与肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌的发病风险有统计学意义的关联。HOTAIR rs12826786与小细胞肺癌的关联有统计学意义。第二部分的病例对照研究结果显示:miR-149 rs2292832与肺癌易感性没有统计学意义上的关联。分层分析结果显示miR-149 rs2292832与非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌的易感性也没有统计学意义上的关联。我们还分析了miR-149 rs2292832多态性与烹饪油烟暴露在肺癌发生中是否存在基因-环境交互作用,结果没有统计学意义。第三部分HOTAIR与miR-149-5p的功能学研究结果显示:HOTAIR在SPC-A-1中本底表达量比肺正常支气管上皮细胞HBE更高,A549本底HOTAIR表达量比HBE低。miR-149-5p在SPC-A-1的本底表达量比HBE低。我们就在A549细胞系中过表达HOTAIR,在SPC-A-1细胞系中敲除HOTAIR和过表达miR-149-5p,进行接下来的一系列功能实验。划痕修复实验结果表明,HOTAIR可以促进肺癌细胞转移,miR-149-5p可以抑制肺癌细胞的转移。Transwell实验结果证明HOTAIR可以促进肺癌细胞的侵袭,miR-149-5p可以抑制肺癌细胞的侵袭。流式细胞仪检测周期的结果表明,HOTAIR过表达可以使G0/G1期的细胞变少,S期细胞增多,从而促进细胞增殖。miR-149-5p过表达可以使G0/G1期细胞百分比增多,引起G0/G1期阻滞,S期的细胞百分比减少,从而抑制细胞增殖。HOTAIR敲除可以使G0/G1期细胞增多,引起G0/G1期阻滞,S期细胞百分比减少,从而抑制细胞增殖。细胞凋亡实验的结果显示HOTAIR和miR-149-5p对凋亡的影响结果没有统计学意义。双荧光素酶活性检测结果和Western Blot的结果显示miR-149-5p与HNRNPA1和miR-149-5p与HOTAIR是靶向结合的关系,HOTAIR-miR-149-5p-HNRNPA1 ceRNA机制是成立的。结论:1.HOTAIR rs4759314、HOTAIR rs12826786与肺癌易感性有关。分层分析显示HOTAIR rs4759314与肺腺癌、肺鳞癌、肺小细胞癌易感性有关,HOTAIR rs12826786与小细胞肺癌易感性有关。2.miR-149 rs2292832与肺癌易感性无统计学意义上的关联。3.miR-149-5p可抑制肺癌细胞的迁移、侵袭、增殖,HOTAIR可促进肺癌细胞的迁移、侵袭、增殖,HOTAIR-miR-149-5p-HNRNPA1形成的竞争性内源RNA机制成立。
任筱璐[5]（2020）在《mTOR通过上调糖酵解关键酶LDHA的表达影响肺腺癌增殖及转移的研究》文中进行了进一步梳理目的:通过对临床资料及手术切除组织进行分析,探讨原发性肺腺癌患者血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）与远处转移、预后、最大标准化摄取值（the maximum of standardized uptake value,SUVmax）及肿瘤组织LDHA的关系,及LDHA在肺腺癌细胞的能量代谢及生物学行为中所发挥的作用和可能的调控途径。方法:1.（1）回顾2012年1月至2017年12月就诊于山西省肿瘤医院的初治肺腺癌患者1240例,按照是否发生远处转移,分为远处转移组和对照组,对两组患者的年龄、性别、吸烟史、EGFR基因突变、T分期及N分期进行倾向性评分匹配,并分析组间血清LDH及肿瘤标记物的差异。（2）对上述筛选后的患者进行随访,剔除因非肿瘤原因导致死亡、新发第二原发肿瘤,失访等各种原因导致随访资料不完整者。最终纳入1102例患者,按照LDH和肿瘤标记物的水平分别分成正常组及升高组,并比较组间总生存期（Overall Survival,OS）的差异。2.收集2016年1月至2019年3月就诊于山西省肿瘤医院,并于治疗前行PET/CT检查的初治肺腺癌患者共286例,记录其完整的临床资料,包括性别、年龄、吸烟情况、TNM分期等。选取其中6例行手术治疗的患者,比较癌组织及癌旁组织中LDHA的表达情况,并同时分析癌组织中LDHA与血清LDH的关系。对其余280例患者的血清LDH及SUVmax进行分析,根据中位LDH及中位SUVmax将患者分别分为对照组和升高组,进一步分析血清LDH与SUVmax的关系。3.细胞实验:（1）采用瞬时转染的方法转染A549细胞,PCR及Western blot分别筛选并鉴定LDHA的过表达、干扰质粒以及PTEN的干扰质粒的转染效率,选取转染效率最高的质粒进行实验。不同浓度的雷帕霉素处理细胞,采用免疫荧光双染法确定雷帕霉素的实验浓度。（2）按照处理方式不同分组细胞:对照组（常规培养细胞）,阴性对照组（过表达NC）,LDHA过表达组（过表达LDHA）,基因沉默对照组（干扰NC）,LDHA干扰组（LDHAsiRNA）,雷帕霉素组,PTEN干扰组（PTENsiRNA）,PTEN干扰+LDHA干扰组（PTENsiRNA+LDHAsiRNA）,分别测定各组细胞的葡萄糖消耗、乳酸及ATP生成情况。采用CCK-8、划痕实验、Transwell实验分别测定各组细胞的增殖、迁移及侵袭能力,并测定各组的细胞周期及凋亡情况。结果:1.（1）经倾向性评分匹配后共1240例患者进入本研究,对照组及远处转移组各620例。纳入的患者组间一般情况未见差异（均P>0.05）,血清LDH及肿瘤标记物两组间均有差异（均P<0.05）。进一步将上述的变量进行Logistic回归分析并绘制列线图,高LDH（OR=1.598,95%CI:1.1692.184,P=0.003）、高CEA（OR=1.614,95%CI:1.2452.092,P<0.001）、高CYFRA211（OR=1.640,95%CI:1.2372.175,P=0.001）及高CA125（OR=2.668,95%CI:2.0203.524,P<0.001）与肺腺癌患者的远处转移相关。（2）最终完成随访者1102例,中位随访时间:26.63月,95%CI:24.2629.01月;中位OS:20.33月,95%CI:18.8521.81月。LDH正常组的中位OS为24.53月,LDH升高组的中位OS为13.93月,LDH正常组的OS优于LDH升高组（P<0.001）。2.6名行手术治疗肺癌患者的肿瘤组织的LDHA表达量高于癌旁组织（P<0.05）,且癌组织中LDHA高表达的患者血清LDH升高（P=0.048）。存在淋巴结转移、远处转移及SUVmax大于9.0的患者血清LDH水平升高（均P<0.05）。年龄大于60岁、女性、存在淋巴结转移、远处转移的患者SUVmax升高（均P<0.05）,且血清LDH与SUVmax呈正相关（r=0.187,P=0.002）。3.（1）能量代谢:LDHA过表达组和PTEN干扰组（即上调mTOR）的葡萄糖的消耗、乳酸及ATP生成均增加（均P<0.01）;LDHA干扰组及雷帕霉素组（即下调mTOR）,葡萄糖的消耗、乳酸及ATP生成均下降（均P<0.01）。PTEN干扰+LDHA干扰组的葡萄糖消耗、乳酸及ATP生成较对照组减少（均P<0.01）,较PTEN干扰组减少（均P<0.05）,与LDHA干扰组无明显区别（P=0.150/0.694/0.168）。（2）生物学行为:细胞增殖、迁移距离及转移数目在LDHA过表达组和PTEN干扰组均增加（均P<0.01）,在LDHA干扰组及雷帕霉素组均下降（均P<0.01）。PTEN干扰+LDHA干扰组的细胞增殖、迁移距离及转移数目较对照组均下降（均P<0.01）,较PTEN干扰组均下降（均P<0.05）,较单纯下调LDHA时细胞增殖及转移距离增加（均P<0.05）,细胞转移数无明显区别（P=0.467）。（3）细胞周期及细胞凋亡:LDHA过表达和PTEN干扰组的S期细胞减少,G2期细胞增多（均P<0.05）,LDHA干扰组、雷帕霉素组及PTEN干扰+LDHA干扰组G1期细胞增多,G2期细胞减少（均P<0.05）。LDHA过表达组和PTEN干扰组均未增加细胞的凋亡率（均P>0.05）。LDHA干扰组及雷帕霉素组细胞凋亡增加（均P<0.01）。PTEN干扰+LDHA干扰组凋亡增加,较PTEN干扰组增加,较LDHA干扰组减少（均P<0.01）。结论:1.肺腺癌患者的血清LDH水平升高提示远处转移风险及死亡风险升高,中位生存期缩短。2.肺腺癌患者肿瘤组织的LDHA高于癌旁组织,LDHA高表达的患者血清LDH升高,血清LDH与SUVmax正相关。3.细胞实验中,上调LDHA或上调mTOR后A549细胞的能量代谢活跃,葡萄糖摄取、乳酸生成及ATP生成均增多,且细胞增殖、迁移及侵袭能力均增强,细胞凋亡未见明显区别;反之,能量代谢程度减弱,细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为减弱,凋亡增加。上调mTOR但是干扰LDHA后,细胞的葡萄糖代谢水平下降到下调LDHA的水平,细胞的增殖、迁移及侵袭的能力则介于上调mTOR及下调LDHA之间,在细胞周期及细胞凋亡中也观察到类似的现象。为针对性的选择分子靶标提供一定的思路。
赵志国[6]（2019）在《微小RNA-141靶向调控EGFR基因抑制头颈鳞癌细胞生长和侵袭的研究》文中研究指明研究背景与目的:头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）作为人类最常见的六种癌症之一,70%以上的患者伴有复发或者转移,是目前严重影响人类生存健康的上皮来源恶性肿瘤。因此,寻找有效的治疗方案来治疗HNSCC成为当前的迫切需要。miRNA是一类内生性单链非编码小RNA,长度为20-24个核苷酸,通过结合到mRNA来调节蛋白编码,存在于动植物当中,广泛参与转录后基因的表达和调控,如细胞分化、增殖、凋亡和细胞周期调节等。目前,只有少数miRNAs的生物学功能被阐明,这些miRNAs被证实广泛地参与生命过程中的各种生理和病理过程。miRNA-141是miRNA-200家族中的一个,位于12p13.31,是一个成熟的序列,全长共22nt。近期研究发现miRNA-141可作为癌基因或者抑癌基因,通过调节不同的信号传导通路,在多种癌症中异常表达,例如胃癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、膀胱癌和卵巢癌,参与恶性肿瘤的增殖、分化、迁移,影响患者的预后。目前,miRNA-141在头颈鳞癌发生发展中的作用机制尚无明确报道。EGFR即表皮生长因子受体,是一种广泛分布的细胞表面受体。EGFR是ErbB保守的受体家族成员之一,具有络氨酸激酶活性,在细胞生长、转移和分化的生理过程中起重要作用。EGFR可启动核内相关基因,促进细胞的分裂与增殖。目前已知在头颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和膀胱癌中EGFR表达均增高。目前尚未有miR-141与EGFR之间关系的报道。CDK4即细胞周期蛋白依赖性激酶4,其正常表达在细胞周期有序进行的过程中非常重要。目前已知CDK4在多种癌症中高表达,促进癌细胞的增殖,是一种癌基因。Bcl-2是一种已知的凋亡抑制基因,其产物bcl-2蛋白可以抑制多种恶性肿瘤的凋亡过程,延长肿瘤细胞的生长周期。MMP2能够降解多型胶原蛋白、结合蛋白及弹力蛋白,参与降解基底膜胶原与细胞外基质,促进癌细胞侵入破坏的细胞间连接结构,向周围组织浸润和迁移。在本研究中,我们将分析miR-141在头颈鳞状细胞癌中的表达及其在疾病的临床分期及预后的关系。此外,我们将分别在头颈鳞癌细胞FaDu和Cal-27中过表达或者抑制miR-141。通过体外细胞功能实验及动物实验来检测miR-141对EGFR、CDK4、bcl-2和MMP2表达的影响,探讨miR-141在头颈鳞状细胞癌中的作用。初步阐明miR-141表达在头颈鳞癌中的作用和意义,为HNSCC的诊疗提供新的治疗靶点提供参考依据。研究方法:采用实时荧光定量的方法,检测miR-141在头颈鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达情况;通过生物信息学软件MiRDB预测miR-141的靶基因EGFR,采用荧光素酶实验验证miR-141和EGFR的关系,并采用实时荧光定量的方法,检测EGFR在头颈鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达情况;采用Western blot在INOK、FaDu和Cal-27细胞中检测EGFR蛋白的表达,并用实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-141和EGFR的表达;用miR-141 mimics和miR-141inhibitor片段分别转染头颈鳞癌FaDu和Cal-27细胞。转染后,采用Western blot在各组细胞中检测EGFR蛋白的表达,并采用实时荧光定量PCR检测miR-141和EGFR在各组中的表达;然后通过MTT实验观察miR-141对FaDu和Cal-27细胞增殖的调节作用,采用Western blot和实时荧光定量PCR检测CDK4的表达情况。通过JC-1测定实验,观察miR-141对FaDu和Cal-27细胞凋亡的影响,Western blot和实时荧光定量PCR检测miR-141对bcl-2的影响。通过transwell实验检测miR-141对FaDu和Cal-27细胞的迁移能力的影响,采用Western blot和实时荧光定量PCR检测miR-141对MMP2的表达的调节作用。构建裸鼠头颈鳞癌肝转移模型,尾静脉注入miR-141过表达的FaDu和对照FaDu细胞,通过HE染色观察头颈鳞癌细胞的肝定植情况,并采用Western blot和实时荧光定量PCR检测EGFR、CDK4、bcl-2和MMP2的表达。结果:在我们收集的30对组织中分析miR-141的表达,发现HNSCC组织中miR-141表达相对低于邻近组织,并且它与HNSCC的发生和发展相关。同时发现EGFR在HNSCC组织中高表达。miR-141表达较高的患者存活时间长于miR-141表达较低的患者。在HNSCC中,miR-141与EGFR表达呈负相关。通过miRDB预测软件发现miR-141可以与EGFR的3’-UTR组合。荧光素酶测定显示,当FaDu和Cal-27细胞与EGFR和miR-141共转染时,荧光素酶活性受到抑制;当EGFR mut或miR-141反义物被转染到细胞中时,没有抑制消失。此外,在HNSCC细胞中存在更高的EGFR表达和更低的miR-141表达。当miR-141在细胞中过表达时,EGFR的表达降低,当miR-141受到抑制时,EGFR的表达升高。说明了EGFR是miR-141的直接靶标。MTT实验表明,miR-141的过表达抑制了HNSCC细胞的增殖。相反,当miR-141被抑制时,HNSCC细胞的增殖受到促进。研究还发现miR-141的过表达抑制了CDK4的表达,miR-141的下调促进了CDK4的表达。JC-1测定显示,与对照组相比,miR-141的转染可促进FaDu和Cal-27细胞的凋亡。Western blot和real-time PCR显示,这可能是由于miR-141对bcl-2的抑制引起的。Transwell测定显示,miR-141的转染抑制FaDu和Cal-27细胞的迁移和侵袭,相反,miR-141的抑制促进细胞转移。蛋白质印迹和实时PCR显示miR-141的过表达抑制了MMP2的表达,miR-141的下调促进了MMP2的表达。在动物实验中,miR-141高表达的头颈鳞癌细胞注射后的裸鼠肝转移明显减少,瘤体体积也较小。同时,采用Western blot和RT-PCR方法检测靶基因EGFR表达降低,EGFR调控的下游基因CDK4、bcl-2和MMP2表达也降低。结论:1、Has-miR-141在头颈鳞癌组织中的表达低于癌旁正常组织;EGFR在头颈鳞癌组织中的表达高于癌旁正常组织;两者呈负相关。2、Has-miR-141通过靶向结合作用调控EGFR发挥抑癌基因的作用。3、Has-miR-141可以抑制头颈鳞癌细胞的增殖和迁移,促进头颈鳞癌细胞的凋亡。4、Has-miR-141与EGFR、CDK4、bcl-2和MMP2呈负向关系,miR-141可能通过调控EGFR间接调控CDK4、bcl-2和MMP2,抑制头颈鳞癌细胞的增殖和迁移,促进头颈鳞癌细胞的凋亡。
赵轶峰[7]（2019）在《miR-433靶向JNK1促进细胞凋亡抑制胃癌细胞增殖和迁移的实验研究》文中认为目的:胃癌是最常见的癌症之一,尽管针对胃癌的诊断、治疗研究不断深入,但预后仍差,生存率仍低。研究显示,miRNAs参与了肿瘤的发生发展,针对miRNAs寻找肿瘤的有效治疗措施已成为当前肿瘤分子诊断治疗的重要研究方向之一。本研究目的在于探讨miR-433发生与胃癌发生发展的关系,揭示miR-433与JNK1相互作用与胃癌细胞生物学行为的关系,阐明miR-433通过JNK1抑制胃癌细胞增殖、凋亡及其迁移和侵袭中的作用与机制,为胃癌的分子病理学基础提供相关的实验资料,期望能够找到胃癌治疗的新靶点,为胃癌的治疗提供新的思路和策略。方法:首先,进行人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）以及人BGC-823、MNK-28和MNK-45三种胃癌细胞株的培养,用TRIzol试剂盒提取总RNA,采用TaqMan MicroRNA检测方法进行qRT-PCR,检测在胃癌细胞系和的miR-433水平;生物信息学发现JNK1 mRNA含有miR-433潜在的结合位点;将人工合成的与miR-433作用的人JNK1基因的3’UTR端插入到萤火虫荧光素酶基因的下游,用双荧光素酶报告系统检测萤火虫荧光素酶和肾荧光素酶的活性;分别应用miR-433转染、miR-433和JNK1共转染至MNK-45,蛋白印记检测JNK1的蛋白表达。其次,将miR-433转染、miR-433和JNK1共转染至MNK-45后,CCK-8法检测细胞增殖,PI染色检测细胞周期,应用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡,采用Western blotting方法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax、PCNA和Caspase-3的表达,观察miR-433通过JNK1对MNK-45细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡的作用。随后,常规方法进行细胞迁移和侵袭试验,采用Western blotting方法检测细胞迁移因子MMP-2、MMP-8的表达,观察miR-433通过JNK1对MNK-45细胞迁移和侵袭的作用。结果:研究结果首先发现,BGC-823、MNK-28和MNK-45三种胃癌细胞的miR-433表达水平均显着低于与正常人GES-1细胞;miR-433显着抑制含JNK1 3’UTR下游的荧光素酶活性,表明JNK1可能是miR-433在胃癌细胞中的靶向基因;miR-433基因转染能显着抑制MNK-45细胞的JNK1蛋白表达,该作用被miR-433和JNK1共转染废除。随后,结果显示,miR-433基因转染可明显抑制MNK-45细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,抑制了PCNA蛋白表达,上调Caspase-3蛋白表达,提高了Bax/Bcl-2比值;miR-433和JNK1共转染则显着抑制了miR-433基因转染对MNK-45细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的有利作用。最后,miR-433基因转染显着抑制了MNK-45细胞的迁移与侵袭能力,抑制了MMP-2和MMP-9的蛋白表达,同样地,这些作用被JNK1转染逆转。结论:胃癌细胞株miR-433表达下调,且与JNK1表达呈负相关;提高miR-433表达能够抑制胃癌MNK-45细胞的增殖,诱导细胞凋亡,从而降低侵袭和迁移能力;JNK1高表达可以解除miR-433过表达抑制胃癌MNK-45细胞增殖、诱导凋亡、降低迁移和侵袭的作用。总之,miR-433参与了胃癌的发生和进展过程,提高miR-433表达通过靶向JNK1发挥了促进细胞凋亡抑制胃癌细胞迁移与侵袭的生物学过程。miR-433成为胃癌的诊断和治疗的一个新的潜在靶点。
孙晶晶[8]（2020）在《PTEN基因在小鼠乳腺癌和恶性黑色素瘤增殖及转移中的作用研究》文中进行了进一步梳理背景:侵袭和转移是恶性肿瘤最主要的死亡原因,乳腺癌和恶性黑色素瘤为常见高侵袭转移性肿瘤。研究表明,抑癌基因PTEN突变或表达缺失显着增强肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力,肿瘤微环境基质细胞PTEN功能状态同样极大地影响着肿瘤的发生、发展、侵袭和转移功能。荷瘤宿主整体PTEN降低或缺失是否会促进肿瘤细胞的增殖、远处转移和转移癌的形成,迄今鲜有研究报道。目的:研究PTEN功能抑制或缺失对小鼠乳腺癌细胞和恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移能力的作用;研究荷瘤小鼠PTEN受抑时能否促进乳腺癌和恶性黑色素瘤的增殖和远处转移能力。方法:采用PTEN特异性抑制剂VO-Ohpic处理小鼠乳腺癌4T1细胞和恶性黑色素瘤B16细胞,MTT比色法和集落形成法检测细胞的增殖活性,细胞划痕愈合法和Transwell实验分别测定细胞的迁移及侵袭能力,流式细胞术测定细胞周期时相分布,实时荧光定量RT-PCR法和Western blotting法检测PTEN基因及相关蛋白的表达水平。BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠分别接种4T1细胞和B16细胞,分别建立小鼠乳腺癌、恶性黑色素瘤的原位移植瘤模型和转移瘤模型,小动物活体成像技术观察4T1细胞和B16细胞的体内生长及转移能力。结果:1抑制剂VO-Ohpic可有效抑制4T1细胞和B16细胞的PTEN基因mRNA及蛋白表达。2不同浓度VO-Ohpic显着增强4T1细胞和B16细胞的增殖活性,细胞的集落形成能力明显增高。当VO-Ohpic大于800 nmol/L时,逐渐转为抑制效应。200 nmol/L和500 nmol/L VO-Ohpic处理后,4T1细胞和B16细胞的划痕愈合加速,Transwell实验穿膜迁移细胞数和穿Matrigel胶的侵袭细胞数明显增加。同时,AKT和PI3K的磷酸化水平显着增高,提示抑制PTEN可激活PI3K-AKT信号调控通路。3采用VO-Ohpic抑制PTEN表达后,4T1细胞和B16细胞在小鼠体内的生长加速、转移能力增高,肺脏、肝脏和肠道均有转移癌灶形成。4小鼠腹腔注射10μg/kg或20μg/kg VO-Ohpic,小鼠肺脏、肝脏和肠道组织PTEN的水平显着降低,4T1细胞和B16细胞接种后原位移植肿瘤生长迅速,并可向肺脏等部位转移而形成转移癌,脏器组织PTEN水平越低则越易形成转移癌灶。移植瘤组织PTEN基因mRNA和蛋白的表达也明显降低。结论:1抑癌基因PTEN功能受抑,显着增强小鼠乳腺癌4T1细胞和恶性黑色素瘤B16细胞的增殖、侵袭和转移能力。2荷瘤小鼠机体或器官组织PTEN水平降低,显着促进乳腺癌和恶性黑色素瘤细胞在体内的原位生长和转移瘤的形成。3 PTEN通过PI3K-AKT信号通路调控小鼠乳腺癌细胞和恶性黑色素瘤的增殖、侵袭和转移行为。
邵文静[9]（2019）在《LncRNA DLEU1调控子宫内膜癌发展进程的作用及机制研究》文中研究表明子宫内膜癌（endometrial carcinoma,EC）是绝经期及围绝经期女性常见的生殖系统恶性肿瘤、位居第二位,在发达国家女性恶性肿瘤中占据第四位[1],近年来EC新发病例人数及死亡人数成倍增加[2-4],威胁着全世界妇女的健康。中国国家癌症中心统计分析结果显示,随着人们生活模式的改变、饮食结构的调整以及激素类食品药品的无意识暴露,子宫内膜癌的发病率呈逐年上升且发病年龄呈年轻化趋势,严重影响了老年妇女的健康寿命及育龄期妇女的生殖健康,给家庭及社会带来重大的影响[5]。子宫内膜癌的发生发展是环境因素和遗传变异相互作用的结果,涉及多种基因和转录因子的差异性表达、细胞信号转导通路调节异常以及细胞微环境稳态失衡等一系列因素,不同的病理改变和分子特征决定了EC患者的风险水平和预后情况。长链非编码RNAs（long non-conding RNA,LncRNAs）是一类不能编码蛋白质、转录长度超过200个核苷酸的RNA分子,可通过参与表观遗传、转录及转录后途径调控靶基因的表达[6,7],与多种肿瘤的增殖、迁移及侵袭过程有关。一些异常表达的LncRNAs在子宫内膜癌生物学过程中发挥原癌基因的作用[8-10],促进肿瘤的病程进展。DLEU1是一种定位于人染色体13q14.2-q14.3区域、高度保守的LncRNA,又称为淋巴细胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1）,在多种实体肿瘤中(如骨肉瘤[11]、胶质瘤[12]、肝细胞癌[13]及膀胱癌[14]等)呈高水平表达;在女性生殖系统肿瘤如宫颈癌[15]、子宫内膜癌[16]及卵巢癌[17]中,DLEU1同样发挥着重要的作用。在卵巢上皮来源恶性肿瘤中[17],DLEU1可能作为竞争性内源性RNA（ceRNA）海绵吸附miRNA、消除miRNA表达及作用进而对靶基因表达进行调控,对肿瘤细胞的增殖活性、EMT过程、迁移及侵袭能力起促进作用,在肿瘤中可能存在着DLEU1-miRNA-mRNA调控轴作用机制。众多研究结果显示,miR-490能够通过调控下游靶基因表达发挥其抑癌基因的功能,从而影响如胶质瘤[18]、前列腺癌[19]、肝细胞癌[20]、卵巢癌[21]及乳腺癌[22]等恶性肿瘤的发生和发展。SP1是一种核转录因子,是一种序列特异性的DNA结合蛋白,SP1在肿瘤的生长和转移过程中通过调控癌基因、抑癌基因、细胞周期调节因子和生长相关细胞信号转导通路等参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、新生血管、迁移及侵袭等过程[23-26],在小细胞肺癌[23]、宫颈癌[24]、子宫内膜癌[25]及乳腺癌[26]等多种恶性肿瘤中发挥着重要的作用。在卵巢癌[170]、子宫内膜癌[225]、宫颈癌[172]、乳腺癌[173]及肝细胞癌[171]等多种实体肿瘤中SP1本身的表达水平也受到包括miRNA在内的多种上游转录因子及细胞信号转导通路的调控。在不同的肿瘤中,不同的miRNA作为上游因子靶向调控SP1,通过影响SP1的表达进而影响肿瘤细胞的恶性生物学行为及病情进展。有研究报道显示DLEU1在EC中呈高水平表达[16],但DLEU1在EC中的准确表达模式、生物学功能以及潜在的分子机制尚不清楚。因此,本研究探讨在EC中DLEU1通过消除miR-490的表达及作用进而调控靶基因SP1的转录,旨在解明子宫内膜癌中可能存在DLEU1-miR-490-SP1调控轴作用机制。目的:本研究为解明调控子宫内膜癌发展进程的分子机理,通过研究DLEU1在子宫内膜癌表达水平及其与临床病理改变及预后的相关性分析;DLEU1表达水平对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响;miR-490在DLEU1调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为过程中所发挥的作用以及DLEU1通过DLEU1-miR-490-SP1调控轴促进子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的作用机制,为临床极早从分子水平遏制子宫内膜癌的发展进程提供研究依据。方法:1.采用qRT-PCR法检测EC组织及正常子宫内膜组织,HHUA、KLE、Ishikawa、ECC-1子宫内膜癌细胞株及正常子宫内膜细胞中DLEU1表达情况。2.利用shRNA基因干扰技术抑制Ishikawa细胞DLEU1表达,MTT、流式细胞技术、Transwell小室实验、Western blot等方法检测Ishikawa细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞的迁移及侵袭能力、凋亡以及EMT过程相关蛋白表达情况。3.采用qRT-PCR法检测EC组织及正常子宫内膜组织,HHUA、KLE、Ishikawa、ECC-1子宫内膜癌细胞株及正常子宫内膜细胞中miR-490表达情况。4.采用qRT-PCR法检测sh-DLEU1基因干扰抑制Ishikawa细胞DLEU1表达后miR-490的表达情况。5.利用miR-490 inhibitor抑制Ishikawa细胞miR-490表达及作用,MTT、流式细胞技术、Transwell小室实验、Western blot等方法检测Ishikawa细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞的迁移及侵袭能力、凋亡以及EMT过程相关蛋白表达情况。6.荧光素酶报告基因技术检测miR-490的靶基因及其结合位点。7.利用si RNA基因干扰技术抑制Ishikawa细胞SP1表达,MTT、流式细胞技术、Transwell小室实验、Western blot等方法检测Ishikawa细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞的迁移及侵袭能力、凋亡以及EMT过程相关蛋白表达情况。结果:1.DLEU1在子宫内膜癌中表达情况及其与临床病理改变及预后的相关性（1）DLEU1在EC组织中表达水平（3.17±0.92）显着高于正常子宫内膜组织（0.97±0.43）（P<0.05）。（2）DLEU1在HHUA（2.74±0.22）、KLE（3.45±0.46）、Ishikawa（3.77±0.25）、ECC-1（2.52±0.24）细胞株中表达水平显着高于正常子宫内膜细胞（0.98±0.12）（P<0.05）,其中在Ishikawa细胞株中表达水平最高。（3）DLEU1在EC组织中呈高水平表达,在晚期、高级别子宫内膜癌中呈高表达趋势。2.DLEU1表达对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响（1）sh-DLEU1转染Ishikawa细胞后,DLEU1表达水平（0.38±0.18）与sh-NC组（0.98±0.15）相比明显下降（P<0.05）。（2）与sh-NC组相比,DLEU1表达水平下降后Ishikawa细胞增殖活性明显降低（P<0.05）;细胞凋亡率百分比明显增高（P<0.05）;促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9）表达增加,抑制凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达减少;细胞迁移及侵袭能力降低（P<0.05）;EMT过程减弱（E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白表达减少）。3.DLEU1通过消除miR-490表达及作用调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为（1）sh-DLEU1转染Ishikawa细胞后,miR-490表达水平（3.33±0.30）与sh-NC组（0.99±0.15）相比明显升高（P<0.05）。（2）miR-490在EC组织中（0.54±0.28）表达水平显着低于正常子宫内膜组织（0.92±0.41）（P<0.05）;miR-490在HHUA（0.57±0.11）、KLE（0.35±0.11）、Ishikawa（0.24±0.08）、ECC-1（0.56±0.12）子宫内膜癌细胞株中表达水平显着低于正常子宫内膜细胞（0.97±0.14）（P<0.05）,其中在Ishikawa细胞株中表达水平最低。（3）与sh-DLEU1组相比,miR-490表达及作用受到抑制后Ishikawa细胞增殖活性升高（P<0.05）;细胞凋亡率百分比降低（P<0.05）;促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9）表达减少,抑制凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达增加;细胞迁移及侵袭能力增强（P<0.05）;EMT过程增强（E-cadherin蛋白表达减少,N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白表达增加）。4.DLEU1通过DLEU1-miR-490-SP1轴调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的作用机制（1）荧光素酶报告基因检测结果显示,在Ishikawa细胞中,野生型SP1-3,UTR质粒与miR-490 mimic质粒共转染后细胞的荧光素酶表达量（0.43±0.09）较mimic control组（0.96±0.16）表达量明显降低（P<0.05）;突变型SP1-Mut 3,UTR质粒与miR-490 mimic质粒共转染后细胞的荧光素酶表达量（0.96±0.08）与mimic control组（0.97±0.09）接近（P>0.05）。（2）与control组相比较,增强miR-490表达及作用后Ishikawa细胞中SP1mRNA（0.47±0.13）（P<0.05）及SP1蛋白表达水平降低,抑制miR-490表达及作用后Ishikawa细胞中SP1 mRNA（2.95±0.21）（P<0.05）及SP1蛋白表达水平升高。（3）与miR-490 inhibitor组相比,抑制SP1表达后Ishikawa细胞增殖活性降低（P<0.05）;细胞凋亡率百分比升高（P<0.05）;促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9）表达增加,抑制凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达减少;细胞迁移及侵袭能力降低（P<0.05）,EMT过程减弱（E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白表达减少）。结论:1.DLEU1在子宫内膜癌组织及细胞中呈高水平表达,并且在晚期及高级别子宫内膜癌组织呈现更高比率的高水平表达;表明DLEU1作为癌基因参与了子宫内膜癌的发生发展过程。2.DLEU1增强了子宫内膜癌细胞增殖活性及抑制了其凋亡水平;增强了子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力及促进EMT过程。证明DLEU1对子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为起正性调节作用。3.在子宫内膜癌中DLEU1与miR-490存在负性调节关系。miR-490在子宫内膜癌组织及细胞中呈低水平表达,证明miR-490作为抑癌基因参与了子宫内膜癌的发生发展过程。4.抑制miR-490表达及作用可以使抑制DLEU1表达后子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的“遏制状态”解除,证明DLEU1通过海绵吸附miR-490、消除miR-490表达及作用促进子宫内膜癌细胞恶性生物学行为。5.在子宫内膜癌Ishikawa细胞中miR-490靶向调控SP1,结合位点是3,UTR端,miR-490对SP1起负性调控作用。6.DLEU1通过DLEU1-miR-490-SP1调控轴促进子宫内膜癌细胞恶性生物学行为及子宫内膜癌病变进展。
尧阳扬[10]（2020）在《E3泛素连接酶FBXW5失活Hippo通路促进胃癌细胞转移的分子机制》文中认为研究背景及目的:Hippo信号通路异常会导致胃癌发生和进展。Hippo信号通路的核心成分主要受泛素-蛋白酶体调控,如LATS1/2激酶结构域PPx Y序基能与WD40结构域直接结合并被泛素化、降解。F-box蛋白家族是SCF（Skp1-Cullin1-F-box protein）E3连接酶复合物中的重要一员,发挥特异性识别底物的功能,FBXW5作为F-box蛋白家族的新成员,含有重复的WD40结构片段,然而其在胃癌中的作用还不清楚。本研究旨在探讨FBXW5与Hippo信号通路的关系及其在胃癌中的临床意义。研究方法:利用生物信息学分析网站或工具分析FBXW5的表达及其预后意义、分析FBXW5与Hippo通路下游相关癌基因表达的关系;利用免疫组织化学法分析临床胃癌石蜡样本中各蛋白的表达以及分析裸鼠皮下瘤体中各蛋白的表达;蛋白免疫印迹法（Western blot）分析新鲜临床标本及裸鼠瘤体中FBXW5的表达,及各样本或细胞中FBXW5蛋白与Hippo通路相关蛋白的调控关系;利用荧光定量PCR探讨FBXW5对Hippo通路相关癌基因的调控作用;免疫荧光法用于探讨YAP1的细胞内定位的改变;Transwell小室试验、细胞划痕试验用于探讨FBXW5对胃癌细胞侵袭或迁移能力的影响;CCK-8及平板克隆形成实验用于研究FBXW5对细胞耐药的影响;免疫共沉淀分析FBXW5与Hippo通路各核心成分的结合关系;CHX半衰期试验分析FBXW5对LATS1半衰期的影响;体内泛素化试验验证FBXW5对LATS1泛素化过程的促进作用;裸鼠皮下成瘤实验验证FBXW5对移植瘤生长速率的影响。实验结果:生物信息学分析显示FBXW5 m RNA和蛋白在多种恶性肿瘤中存在表达。Western blot实验证明FBXW5蛋白在胃癌中高表达。进一步,我们通过免疫组化实验分析FBXW5的临床意义,在发现组,我们纳入了79例胃癌组织石蜡标本,结果提示:FBXW5的高表达与患者淋巴结转移（p<0.001）、TNM分期（p=0.018）、分化程度（p=0.042）有关;而后,纳入了120例胃癌组织石蜡标本的验证组实验结果显示:FBXW5高表达与患者淋巴结转移（p<0.001）、TNM分期（p=0.001）、浸润深度T（p=0.006）以及肿瘤最大径（p=0.002）有关;并且发现组和验证组中FBXW5高表达的患者预后均较差（发现组:log-rank p=0.020;验证组:log-rank p=0.025）。细胞功能学实验证实干扰FBXW5抑制胃癌细胞的侵袭、转移及EMT;上调FBXW5则相反。且FBXW5诱导胃癌细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的抵抗。我们利用生物信息学工具,通过对TCGA和GTEx数据库的挖掘和分析提示FBXW5调控Hippo通路下游的靶基因CTGF、CYR-61及c-Myc,随后用荧光定量PCR对这一结果进行了验证。Western blot和免疫荧光实验结果提示FBXW5对Hippo信号通路存在调控作用,FBXW5促进YAP1蛋白的入核;免疫共沉淀法和体内泛素化实验提示FBXW5与LATS1蛋白存在结合,缩短LATS1蛋白的半衰期,且促进LATS1的泛素化过程;FBXW5沉默将减缓皮下移植瘤的生长速率,通过免疫组化和Western blot法分析移植瘤中的蛋白表达,结果显示FBXW5沉默后,CD31、N-cadherin、Ki-67及YAP1蛋白表达降低,为FBXW5在细胞水平表现出的功能及机制提供了佐证。研究结论:FBXW5蛋白的高表达与胃癌患者的肿瘤浸润、淋巴结转移及TNM分期有关,导致患者预后不良;FBXW5通过结合并促进LATS1的泛素化和降解失活Hippo信号通路,促进胃癌细胞的侵袭、转移及耐药。
二、恶性肿瘤与癌基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恶性肿瘤与癌基因（论文提纲范文）
（1）MicroRNA-222介导PI3K/Akt/MMP-9信号通路参与调控HMGA1对葡萄膜黑色素瘤生物学功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 HMGA1在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 葡萄膜黑色素瘤中HMGA1对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 MicroRNA-222对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 葡萄膜黑色素瘤中HMGA1靶向miR-222对PI3K/Akt/MMP-9通路调控的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五部分 HMGA1对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文文章 |
（2）在肝细胞肝癌辐射抵抗中miR-873/NDFIP1对瓦伯格效应的调控机制（论文提纲范文）
| 引言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝细胞肝癌 |
| 1.1.1 原发性肝癌流行病学 |
| 1.1.2 肝细胞肝癌的病因 |
| 1.1.3 肝细胞肝癌的临床治疗 |
| 1.1.4 肝细胞肝癌的生物标志物 |
| 1.2 miRNA-873 |
| 1.2.1 miR-873 的生物学功能 |
| 1.2.2 miRNA-873 与肝细胞肝癌 |
| 1.2.3 miR-873 与糖代谢信号通路的调控 |
| 1.2.4 miRNA与辐射敏感性 |
| 1.3 NDFIP1基因 |
| 1.3.1 NDFIP1基因的结构与生物学功能 |
| 1.3.2 NDFIP1与糖代谢 |
| 1.3.3 NDFIP1与辐射敏感性 |
| 1.4 瓦伯格效应 |
| 1.4.1 瓦伯格效应与非编码RNA |
| 1.4.2 瓦伯格效应的调控转录因子 |
| 1.4.3 瓦伯格效应的调控信号通路 |
| 1.4.4 瓦伯格效应与辐射抗性 |
| 1.5 立题依据 |
| 1.6 创新性 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 主要实验试剂和器材 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 试剂的配制方法 |
| 2.3.1 磷酸缓冲盐溶液(1×PBS) |
| 2.3.2 Western Blot实验相关试剂的配制 |
| 2.3.3 提取质粒相关溶液的配制 |
| 2.4 质粒构建 |
| 2.4.1 引物的设计与合成 |
| 2.4.2 PCR获得NDFIP1基因片段 |
| 2.4.3 载体酶切 |
| 2.4.4 目的基因与载体连接 |
| 2.4.5 转化 |
| 2.4.6 质粒的验证 |
| 2.5 细胞株来源及培养 |
| 2.5.1 细胞株 |
| 2.5.2 细胞培养 |
| 2.5.3 细胞转染 |
| 2.5.4 细胞照射 |
| 2.6 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.7 Western Blot实验 |
| 2.7.1 提取细胞总蛋白 |
| 2.7.2 BCA法蛋白样品定量 |
| 2.7.3 Western Blot步骤 |
| 2.8 细胞增殖实验 |
| 2.9 细胞迁移实验 |
| 2.10 细胞侵袭实验 |
| 2.11 实验动物模型建立 |
| 2.12 免疫组化实验 |
| 2.13 细胞能量代谢实验 |
| 2.13.1 葡萄糖摄取实验 |
| 2.13.2 乳酸产生量测定 |
| 2.13.3 细胞外酸化速率测定 |
| 2.13.4 细胞耗氧量测定 |
| 2.13.5 基础耗氧量测定 |
| 2.14 代谢产物的气相色谱-质谱分析(GC-MS) |
| 2.15 荧光素酶报告质粒构建及相关实验 |
| 2.15.1 荧光素酶报告质粒构建 |
| 2.15.2 荧光素酶报告基因法检测miR-873 调控NDFIP1的能力 |
| 2.16 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.17 肝细胞肝癌组织样本收集 |
| 2.18 统计分析方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 体内、外检测miR-873 在HCC中表达及与临床信息的相关性分析 |
| 3.1.1 miR-873 在HCC组织中的表达与临床信息的相关性 |
| 3.1.2 miR-873 在肝癌细胞和正常细胞的表达 |
| 3.2 miR-873 在HCC中的生物学功能分析 |
| 3.2.1 过表达miR-873 对HCC增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 3.2.2 抑制miR-873 后对HCC增殖、迁移和侵袭的影响 |
| 3.3 探讨miR-873 对HCC辐射抗性的影响 |
| 3.3.1 过表达miR-873 对HCC辐射抗性的影响 |
| 3.3.2 抑制miR-873 对HCC辐射抗性的影响 |
| 3.4 探讨miR-873 在HCC中对糖代谢的调控功能 |
| 3.4.1 过表达或抑制miR-873 对HCC糖代谢的影响 |
| 3.4.2 研究miR-873 参与调控HCC有氧糖酵解 |
| 3.5 miR-873 的调控靶基因及其生物学功能 |
| 3.5.1 预测并验证miR-873 的靶基因 |
| 3.5.2 探讨NDFIP1作为miR-873 的靶基因对HCC糖酵解的影响 |
| 3.5.3 探讨NDFIP1作为miR-873 的靶基因在HCC中的生物学功能 |
| 3.6 阐明miR-873/NDFIP1调控瓦伯格效应的信号通路机制 |
| 3.7 阐明miR-873 在HCC中的上游调控分子机制 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 miR-873 在HCC中表达及生物学功能 |
| 4.2 miR-873 对HCC糖代谢的调控功能 |
| 4.3 研究miR-873 的调控靶基因及其生物学功能 |
| 4.4 阐明miR-873/NDFIP1调控瓦伯格效应上、下游信号通路 |
| 4.5 miR-873/NDFIP1在HCC中通过促进瓦伯格效应产生辐射抗性 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 三阴性乳腺癌、癌旁组织中miRNA-451、c-Myc与 E-cadherin的检测以及临床资料分析 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 聚合酶链反应PCR法检测三阴性乳腺癌组织、癌旁组织中miRNA-451、c-Myc以及E-cadherin基因 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 验证miRNA-451与c-Myc靶向调控关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 miRNA-451 基因对细胞功能影响的研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）长链非编码RNA HOTAIR和microRNA-149基因多态性与肺癌易感性的关系及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:lncRNA HOTAIR单核苷酸多态性与肺癌发病风险关系的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象与资料收集 |
| 2.2 SNP的选择 |
| 2.3 基因组DNA提取和SNP分型 |
| 2.3.1 实验所用主要设备和主要试剂 |
| 2.4 对SNP的生物信息学分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 研究对象的基本情况 |
| 3.2 HOTAIR SNP与肺癌易感性之间的关系 |
| 3.3 HOTAIR SNP与肺腺癌易感性之间的关系 |
| 3.4 HOTAIR SNP与鳞状细胞癌易感性之间的关系 |
| 3.5 HOTAIR SNP与小细胞癌易感性之间的关系 |
| 3.6 HOTAIR SNP 与肺癌发病风险的关系的分层分析 |
| 3.7 HOTAIR rs4759314 与吸烟暴露交互作用对肺癌易感性的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:microRNA-149 单核苷酸多态性与肺癌发病风险关系的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象与资料收集 |
| 2.2 基因组DNA提取和SNP分型 |
| 2.2.1 实验所用主要设备和主要试剂 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 研究对象的基本资料 |
| 3.2 miR-149 rs2292832 基因多态性与肺癌及各病理学分型易感性的关系 |
| 3.3 对烹饪油烟暴露情况分层分析,mi R-149 rs2292832基因多态性与肺癌易感性的关系 |
| 3.4 miR-149 rs2292832基因多态性与烹饪油烟暴露的交互作用与肺癌和肺腺癌易感性的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:长链非编码RNA HOTAIR通过竞争性内源RNA机制结合mi R-149-5p调节HNRNPA1 的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养和转染 |
| 2.1.1 实验所需主要设备和主要试剂 |
| 2.1.2 细胞培养实验内容 |
| 2.1.3 细胞瞬时转染实验内容 |
| 2.2 HOTAIR、miR-149-5p过表达慢病毒的包装和双荧光素酶质粒的构建 |
| 2.3 生物信息学预测分析和双荧光素酶活性检测 |
| 2.3.1 实验所需主要设备及主要试剂 |
| 2.3.2 实验内容与方法 |
| 2.4 细胞周期检测 |
| 2.4.1 实验所需主要设备和主要试剂 |
| 2.4.2 实验内容 |
| 2.5 细胞凋亡检测 |
| 2.5.1 实验所需主要设备和主要试剂 |
| 2.5.2 实验内容 |
| 2.6 划痕修复实验和Transwell实验 |
| 2.6.1 实验所需主要设备和主要试剂 |
| 2.6.2 划痕修复实验实验内容 |
| 2.6.3 Transwell侵袭实验实验内容 |
| 2.7 细胞增殖实验 |
| 2.7.1 实验所需主要设备和主要试剂 |
| 2.7.2 实验内容 |
| 2.8 实时荧光定量PCR |
| 2.8.1 实验所需主要设备和主要试剂 |
| 2.8.2 实验内容 |
| 2.9 Western Blot |
| 2.9.1 实验所需主要设备及主要试剂 |
| 2.9.2 实验内容 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 qPCR检测A549、SPC-A-1和HBE细胞系中miR-149-5p,HOTAIR相对表达量 |
| 3.2 Western Blot检测分别转染了过表达HOTAIR和过表达miR-149-5p慢病毒的A549、SPC-A-1 的细胞系中HNRNPA1 蛋白的相对表达量 |
| 3.3 Celigo全视野细胞分析仪检测细胞增殖。 |
| 3.4 划痕修复实验和Transwell实验 |
| 3.4.1 划痕修复实验 |
| 3.4.2 Transwell实验 |
| 3.5 细胞周期检测 |
| 3.6 细胞凋亡检测 |
| 3.7 双荧光素酶活性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）mTOR通过上调糖酵解关键酶LDHA的表达影响肺腺癌增殖及转移的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 肺腺癌患者乳酸脱氢酶与远处转移及预后的关系 |
| 临床研究一 乳酸脱氢酶在转移患者及非转移患者的差异 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象及研究方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肺腺癌患者的一般临床特征及乳酸脱氢酶水平 |
| 2.2 肺腺癌患者中相关因素对远处转移的预测作用 |
| 临床研究二 乳酸脱氢酶与肺腺癌患者预后的关系 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象及研究方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肺腺癌患者的一般临床资料及Kaplan-Meier生存分析 |
| 2.2 肺腺癌患者的Cox比例风险模型分析 |
| 讨论 |
| 第二部分 肺腺癌患者LDH与SUVmax的相关性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象及研究方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肺腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织的LDHA表达情况 |
| 2.2 肺腺癌患者LDH及SUVmax与一般临床资料的关系 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肿瘤组织LDHA与血清LDH及~(18)F-FDG摄取值相关 |
| 3.2 血清LDH与~(18)F-FDG摄取值相关 |
| 第三部分 LDHA受mTOR信号通路调控影响肺腺癌能量代谢、增殖及转移 |
| 实验一 LDHA受mTOR调节影响肺腺癌细胞的能量代谢 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞模型建立及相关检测结果 |
| 2.2 能量代谢检测结果 |
| 实验二 LDHA受mTOR调节影响肺腺癌细胞的增殖及转移 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组细胞增殖及侵袭能力检测结果 |
| 2.2 各组细胞的细胞周期和细胞凋亡检测结果 |
| 讨论 |
| 3.1 LDHA参与细胞能量代谢、增殖、侵袭及转移 |
| 3.2 mTOR调节细胞能量代谢、增殖、侵袭及转移 |
| 3.3 LDHA受mTOR调节 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）微小RNA-141靶向调控EGFR基因抑制头颈鳞癌细胞生长和侵袭的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 miRNA-141与EGFR在头颈鳞状细胞癌中的表达及相关性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验与分析方法 |
| 2.3.1 头颈鳞癌组织miRNA基因表达谱检测 |
| 2.3.2 提取组织样本的总RNA |
| 2.3.3 RNA浓度和纯度的测定 |
| 2.3.4 反转录(Reverse Transcription,RT) |
| 2.3.5 实时荧光定量分析 |
| 2.3.6 头颈部鳞状细胞癌患者组织中miRNA-141 的差异表达与临床病理特征之间的关系 |
| 2.3.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 头颈鳞癌组织miRNA基因芯片检测 |
| 3.2 生物信息学软件预测miR-141 下游靶基因 |
| 3.3 miR-141和EGFR在头颈部鳞状细胞癌原发灶癌组织和癌旁正常组织中的表达 |
| 3.4 头颈部鳞状细胞癌患者组织中miRNA-141 的表达与临床病理特征之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 miR-141 对头颈鳞癌细胞系中EGFR表达及细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响 |
| 5 前言 |
| 6 材料和方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 研究对象 |
| 6.3 实验与分析方法 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 细胞转染、双荧光素酶报告基因检测 |
| 6.3.3 Western Blot |
| 6.3.4 RT-PCR检测INOK、FaDu和 Cal-27 细胞中miR-141和EGFR的表达水平 |
| 6.3.5 MTT实验 |
| 6.3.6 JC-1 测定 |
| 6.3.7 Transwell实验 |
| 6.3.8 统计分析 |
| 7 结果 |
| 8 讨论 |
| 第三部分 miR-141/EGFR轴抑制头颈鳞癌转移的体内研究 |
| 9 前言 |
| 10 材料和方法 |
| 10.1 主要试剂和仪器 |
| 10.1.1 主要试剂 |
| 10.1.2 主要仪器 |
| 10.2 研究对象 |
| 10.3 实验与分析方法 |
| 10.3.1 头颈鳞癌肝转移在体实验 |
| 10.3.2 苏木精伊红染色(HE染色) |
| 10.3.3 Western Blot测定组织样本中EGFR、CDK4、bcl-2、MMP2 蛋白的表达 |
| 10.3.4 RT-PCR方法检测组织样本中miR-141和EGFR、CDK4、bcl-2、MMP2的表达 |
| 11 结果 |
| 12 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA 和 lncRNA 相互作用与恶性肿瘤相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）miR-433靶向JNK1促进细胞凋亡抑制胃癌细胞增殖和迁移的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-433 对胃癌细胞JNK1 表达的调控作用 |
| 1.1 实验对象和方法 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.5 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 miR-433 在各种细胞株中的表达情况 |
| 1.2.2 JNK1 mRNA含有miR-433 的潜在结合位点 |
| 1.2.3 荧光素酶报告分析结果 |
| 1.2.4 蛋白印记检测结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 miRNAs与胃癌的关系 |
| 1.3.2 JNK1 信号通路 |
| 1.3.3 胃癌中miR-433 通过靶向JNK1 基因发挥作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-433 诱导MNK-45 细胞的细胞周期阻滞以及抑制其增值、侵袭和迁移 |
| 2.1 实验对象和方法 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验材料 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 miR-433 抑制MNK-45 细胞增殖 |
| 2.2.2 miR-433 诱导MNK-45 细胞周期阻滞 |
| 2.2.3 miR-433 抑制MNK-45 细胞的侵袭和迁移 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 miR-433 抑制MNK-45 细胞增殖、诱导MNK-45 细胞周期阻滞 |
| 2.3.2 miR-433 抑制MNK-45 细胞的侵袭和迁移 |
| 2.4 小结 |
| 三、miR-433 诱导MNK-45 细胞凋亡以及对其细胞凋亡和转移相关蛋白表达的影响 |
| 3.1 实验对象和方法 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 流式细胞仪检测细胞增殖情况 |
| 3.2.2 细胞凋亡相关蛋白表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 自噬及其在肿瘤中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）PTEN基因在小鼠乳腺癌和恶性黑色素瘤增殖及转移中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 PTEN基因与恶性肿瘤的增殖和转移 |
| 1 PTEN基因的结构与功能 |
| 1.1 PTEN基因的结构 |
| 1.2 PTEN基因的功能 |
| 1.2.1 抑制细胞增殖,促进细胞凋亡 |
| 1.2.2 抑制细胞的粘附和迁移功能 |
| 1.2.3 诱导细胞周期阻滞 |
| 1.2.4 抑制新生血管生成 |
| 1.2.5 调控胚胎的正常发育 |
| 1.2.6 其它 |
| 2 PTEN基因相关的调控信号通路 |
| 2.1 PTEN/Pl3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 2.2 PTEN/FAK/p130cas信号通路 |
| 2.3 PTEN/ERK/MAPK信号通路 |
| 2.4 其它信号通路 |
| 3 PTEN基因与肿瘤细胞增殖 |
| 4 PTEN基因与肿瘤细胞凋亡 |
| 5 PTEN基因与肿瘤浸润转移 |
| 6 PTEN基因与肿瘤耐药性 |
| 7 PTEN基因与肿瘤微环境 |
| 8 小结与展望 |
| 第二章 PTEN抑制乳腺癌细胞的增殖和转移能力 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.3 常用缓冲液、试剂的配制及准备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养和动物饲养 |
| 2.2.2 细胞增殖活性的检测和观察 |
| 2.2.2.1 MTT法检测4T1的增殖活性 |
| 2.2.2.2 细胞集落形成法观察细胞的增殖活性 |
| 2.2.3 定量RT-PCR检测PTEN基因的表达 |
| 2.2.3.1 引物序列 |
| 2.2.3.2 细胞内总RNA抽提 |
| 2.2.3.3 cDNA合成 |
| 2.2.3.4 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.4 细胞侵袭和迁移检测 |
| 2.2.4.1 Transwell小室实验观察细胞的侵袭及迁移 |
| 2.2.4.2 细胞划痕法检测细胞迁移 |
| 2.2.5 FCM检测细胞周期 |
| 2.2.6 Western-blotting法测定相关蛋白的表达 |
| 2.2.6.1 蛋白样品制备 |
| 2.2.6.2 BCA法对蛋白质进行定量 |
| 2.2.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白 |
| 2.2.6.4 转膜 |
| 2.2.6.5 封闭及抗体孵育 |
| 2.2.6.6 ECL发光显色及分析 |
| 2.2.7 动物实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 VO-Ohpic有效抑制乳腺癌4T1 细胞PTEN表达 |
| 3.2 PTEN功能降低促进乳腺癌4T1细胞的增殖 |
| 3.3 抑制PTEN增强乳腺癌4T1细胞的迁徙和侵袭能力 |
| 3.4 抑制PTEN可活化PI3K/AKT信号通路 |
| 3.5 4T1细胞PTEN功能受抑促进其在体内的生长与转移 |
| 3.6 小鼠机体PTEN功能受抑促进乳腺癌的生长与转移 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 PTEN抑制恶性黑色素瘤细胞的增殖和转移能力 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.3 常用缓冲液、试剂的配制及准备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养和动物饲养 |
| 2.2.2 细胞增殖活性的检测和观察 |
| 2.2.2.1 MTT法检测B16细胞的增殖活性 |
| 2.2.2.2 结晶紫染色观察B16细胞的增殖活性 |
| 2.2.3 定量RT-PCR检测PTEN基因的表达 |
| 2.2.3.1 引物序列 |
| 2.2.3.2 细胞内总RNA抽提 |
| 2.2.3.3 cDNA合成 |
| 2.2.3.4 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.4 细胞侵袭和迁移检测 |
| 2.2.4.1 Transwell小室实验观察B16 细胞的侵袭及迁移 |
| 2.2.4.2 划痕法检测细胞迁移 |
| 2.2.5 FCM检测细胞周期 |
| 2.2.6 WB法测定相关蛋白的表达 |
| 2.2.6.1 蛋白样品制备 |
| 2.2.6.2 BCA法对蛋白质进行定量 |
| 2.2.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白 |
| 2.2.7 动物实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 VO-Ohpic抑制小鼠恶性黑色素瘤B16 细胞PTEN表达 |
| 3.2 PTEN功能降低促进恶性黑色素瘤B16细胞的增殖 |
| 3.3 抑制PTEN增强黑色素瘤B16细胞的迁徙和侵袭能力 |
| 3.4 抑制PTEN可活化PI3K/AKT信号通路 |
| 3.5 B16细胞PTEN受抑增强其在体内的生长与转移 |
| 3.6 小鼠机体PTEN功能受抑增强恶性黑色素瘤的生长与转移 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（9）LncRNA DLEU1调控子宫内膜癌发展进程的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 子宫内膜癌概述 |
| 1.2 长链非编码RNA概述 |
| 1.3 长链非编码RNA与表观遗传调控 |
| 1.4 长链非编码RNA与转录过程调控 |
| 1.5 长链非编码RNA与转录后过程调控 |
| 1.6 长链非编码RNA与子宫内膜癌 |
| 1.7 长链非编码RNA DLEU1 的研究现状 |
| 第2章 DLEU1 在子宫内膜癌中表达情况及其与临床病理改变及预后的相关性 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病例资料 |
| 2.1.2 细胞及来源 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 EC组织RNA提取 |
| 2.2.2 EC细胞及正常子宫内膜细胞RNA提取 |
| 2.2.3 RNA浓度及纯度测定 |
| 2.2.4 逆转录 |
| 2.2.5 实时定量RT-PCR |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 DLEU1在EC组织与正常子宫内膜组织中的表达差异 |
| 2.4.2 子宫内膜癌患者的一般状况及临床病理改变 |
| 2.4.3 DLEU1 表达水平与临床病理改变关系分析 |
| 2.4.4 DLEU1 在不同子宫内膜癌细胞株与正常子宫内膜细胞中的表达差异 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 DLEU1 表达对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞及来源 |
| 3.1.2 shRNA设计及合成 |
| 3.1.3 实验分组情况 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 sh-DLEU1 瞬时转染 |
| 3.2.2 qRT-PCR检测DLEU1 表达水平 |
| 3.2.3 细胞功能实验 |
| 3.2.4 免疫印记实验(Western Blot) |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 sh-DLEU1对Ishikawa细胞DLEU1 表达的抑制情况 |
| 3.4.2 sh-DLEU1对Ishikawa细胞增殖活性的影响 |
| 3.4.3 sh-DLEU1对Ishikawa细胞凋亡情况的影响 |
| 3.4.4 sh-DLEU1对Ishikawa细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 sh-DLEU1对Ishikawa细胞迁移与侵袭能力的影响 |
| 3.4.6 sh-DLEU1对Ishikawa细胞EMT过程的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 DLEU1 通过消除miR-490 表达及作用调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞及来源 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 miR-490 引物序列 |
| 4.2.2 RNA mimic/inhibitor细胞转染 |
| 4.2.3 细胞功能实验 |
| 4.2.4 凋亡相关及EMT过程相关蛋白表达情况 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 sh-DLEU1对Ishikawa细胞miR-490 表达模式的影响 |
| 4.4.2 miR-490 在子宫内膜癌组织及子宫内膜癌细胞株中表达情况 |
| 4.4.3 增强及抑制miR-490 表达效率 |
| 4.4.4 DLEU1 通过mi R-490 调控Ishikawa细胞恶性生物学行为 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 DLEU1 通过DLEU1- miR-490- SP1 轴调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的作用机制 |
| 引言 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞及来源 |
| 5.1.2 主要实验仪器 |
| 5.1.3 主要实验试剂 |
| 5.1.4 野生型及突变型SP1 的构建 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 荧光素酶报告基因检测 |
| 5.2.2 miR-490对SP1 的调节作用 |
| 5.2.3 SP1对Ishikawa细胞恶性生物学行为的影响 |
| 5.3 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 miR-490 靶基因及结合位点分析 |
| 5.4.2 miR-490与SP1 之间调控关系 |
| 5.4.3 si-SP1 转染效率 |
| 5.4.4 SP1对Ishikawa细胞恶性生物学行为的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论及创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）E3泛素连接酶FBXW5失活Hippo通路促进胃癌细胞转移的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 胃癌治疗靶点的研究概述 |
| Hippo信号通路概述 |
| 泛素化概述 |
| 第一部分 FBXW5 在胃癌中的表达以及临床意义 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 FBXW5 在人类常见恶性肿瘤中广泛表达 |
| 3.2 FBXW5 在胃癌中的表达及其与预后的关系 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 FBXW5 促进胃癌细胞的侵袭、转移及耐药 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 检验FBXW5 干扰及过表达的转染效能 |
| 3.2 FBXW5 促进胃癌细胞的侵袭、迁移及EMT |
| 3.3 FBXW5 促进胃癌细胞的耐药 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 FBXW5对Hippo信号通路的调控 |
| 1.引言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 FBXW5 调控Hippo信号通路下游靶基因的表达 |
| 3.2 FBXW5 在胃癌细胞中调控Hippo信号通路 |
| 3.3 FBXW5 结合LATS1 并促进其降解 |
| 3.4 FBXW5 促进LATS1 蛋白的泛素化 |
| 3.5 阻断LATS1-YAP1 导致FBXW5对Hippo通路的调控丧失 |
| 3.6 裸鼠成瘤实验验证FBXW5 的功能及机制 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、恶性肿瘤与癌基因（论文参考文献）
- [1]MicroRNA-222介导PI3K/Akt/MMP-9信号通路参与调控HMGA1对葡萄膜黑色素瘤生物学功能的影响[D]. 程英. 山东大学, 2020(11)
- [2]在肝细胞肝癌辐射抵抗中miR-873/NDFIP1对瓦伯格效应的调控机制[D]. 张玉宇. 吉林大学, 2020(08)
- [3]MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究[D]. 杜江. 新疆医科大学, 2020(07)
- [4]长链非编码RNA HOTAIR和microRNA-149基因多态性与肺癌易感性的关系及其机制的研究[D]. 李行. 中国医科大学, 2019(01)
- [5]mTOR通过上调糖酵解关键酶LDHA的表达影响肺腺癌增殖及转移的研究[D]. 任筱璐. 山西医科大学, 2020(12)
- [6]微小RNA-141靶向调控EGFR基因抑制头颈鳞癌细胞生长和侵袭的研究[D]. 赵志国. 中国医科大学, 2019(01)
- [7]miR-433靶向JNK1促进细胞凋亡抑制胃癌细胞增殖和迁移的实验研究[D]. 赵轶峰. 天津医科大学, 2019(02)
- [8]PTEN基因在小鼠乳腺癌和恶性黑色素瘤增殖及转移中的作用研究[D]. 孙晶晶. 兰州大学, 2020(01)
- [9]LncRNA DLEU1调控子宫内膜癌发展进程的作用及机制研究[D]. 邵文静. 吉林大学, 2019(02)
- [10]E3泛素连接酶FBXW5失活Hippo通路促进胃癌细胞转移的分子机制[D]. 尧阳扬. 南昌大学, 2020(08)