一、山羊实验感染肝片吸虫的血清IgG水平动态观察（论文文献综述）
孙益春[1]（2021）在《基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立》文中指出
何婷[2]（2021）在《食源性吸虫的分子鉴定与快速诊断试条的研制及评价》文中认为一、广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析目的:本研究选取核糖体内转录间隔区（ITS+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ（NAD Ⅰ）、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（COX Ⅰ）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pepck）这4个遗传分子标记,采用分子生物学的方法与技术鉴定广西南宁地区的片形吸虫种类,并分析其种群遗传多态性。方法:从南宁某屠宰场收集11头感染了片形吸虫的水牛的肝脏,分离获得151条片形吸虫成虫,并孵育获得其虫卵。提取片形吸虫成虫的基因组DNA,PCR扩增ITS+、NAD Ⅰ和COX Ⅰ序列并测序,所得序列经NCBI在线BLAST做同源性分析,构建线粒体基因NADⅠ和COXⅠ单倍型网络图及系统进化树,结合pepck基因多重PCR的结果鉴定虫种;提取部分片形吸虫虫卵的基因组DNA,PCR扩增ITS+序列并测序;用BioEdit软件做多序列比对分析,掌握片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况。结果:共获得151条片形吸虫成虫,lTS+序列扩增产物长度约964bp,仅NN20-2样本是Fh型,与GcnBank中肝片形吸虫瑞士样本（登录号:MK321602）完全同源;NN17-11、NN20-9和NN20-14等三个样本携带巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重序列特征,属于Fg/Fh杂合型,序列图谱上特定变异位点出现双峰,个体间双峰比值存在差异,NN17-11 为 Fg:Fh=1:1,NN20-9 和 NN20-14 为 Fg:Fh=1:5;其余147个样本是Fg型,可细分为19个亚型,其中NN4-1等100个样本与GenBank中巨片形吸虫越南样本（登录号:MN970009）完全同源,其余样品中共出现14个变异位点,多为双峰。线粒体基因NAD Ⅰ序列扩增产物长约535bp,有34个变异位点,细分为28种单倍型;COX Ⅰ序列扩增产物长约438bp,有22个变异位点,细分为21种单倍型,所有样本的NAD Ⅰ和COX Ⅰ均属于巨片形吸虫类群。pepck电泳结果显示NN17-11、NN20-2、NN20-9和NN20-14等4个样本出现巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重条带,其它样本只有巨片形吸虫的单一条带。虫卵的ITS+序列检测结果显示,ITS-Fh型片形吸虫NN20-2成虫有1个虫卵（1/30）转变为Fg/Fh型;巨片形吸虫NN20-3成虫有5个虫卵（5/30）呈现Fg/Fh型,其余虫卵与母体基本一致。结论:广西南宁的片形吸虫种群以纯种巨片形吸虫为主,同时存在少量的杂合型片形吸虫;结合多个遗传标记进行分析,能够更加准确可靠地鉴定南宁片形吸虫虫种。二、快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条研制与效果评价目的:研制特异性抗原Cs4快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条,其次结合G蛋白与抗原同时双标金的方法进行改良,评价并比较两种试条的检测效果。方法:构让pET28b-Cs4重组表达载体,IPTG诱导Cs4重组蛋白（rCs4）的表达,使用组氨酸标签亲和纯化柱纯化rCs4;分别将SPA与rCs4包被在硝酸纤维素膜的合适位置,作为质控线和检测线,G蛋白单标记胶体金、G蛋白和Cs4抗原同时双标记胶体金分别作为检测探针,制备检测抗rCs4特异性抗体的单标金和双标金免疫层析试条。两种试条同时险测华支睾吸虫病（42份）、囊虫病（18份）、裂头蚴病（10份）、卫氏并殖吸虫病（17份）、日本血吸虫病（10份）和片形吸虫病（13份）患者以及健康者（42份）的血清,评价和比较两者的诊断价值。结果:单标金试条的敏感性为97.6%（41/42）,特异性为93.6%（103/110）,总符合率为94.7%（144/152）,双标金试条的敏感性为90.5%（38/42）,特异性为88.2%（97/110）,总符合率为88.8%（135/152）,两种试条的敏感性（P>0.25）、特异性（P>0.10）和总符合率（P>0.05）之间的差异均无统计学意义,但双标金试条的交叉反应略高。此外,用6μl血清即可检测,10-15min内观察试条的检测结果。结论:用Cs4抗原研制的胶体金免疫层析试条可以快速诊断华支睾吸虫病,且具有较高的诊断价值。
龚静芝[3]（2021）在《片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立》文中研究表明片形吸虫病（Fasciolosis）是由大片吸虫（Fasciola gigantica）和肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种人畜共患寄生虫病。该病主要感染反刍动物和人,是一种食源性寄生虫病,受到感染的动物或人表现为急性肝炎、慢性肝纤维化、胆管炎等,严重时能造成动物的大量死亡,对人类及畜牧业的危害十分严重。目前对于该病的防控主要依赖于药物治疗,因此,对于该病的诊断、尤其是早期诊断尤为重要,能够做到早诊断、早治疗,就能减少该病对人类及动物健康的危害,降低畜牧业的经济损失。片形吸虫病的诊断研究一直是该领域的研究热点。目前临床上主要采用的经典粪便虫卵镜检法不能应用于片形吸虫病的早期诊断;国际上虽然存在几种较好的免疫学诊断方法,但是其诊断抗原多为虫体纯化的天然混合抗原,成本高,具有一定交叉反应。为解决这一重要难题,本课题在前期的蛋白组学的基础上,通过生物信息学方法筛选到一些候选的诊断靶标,通过原核表达、蛋白纯化、Western bloting对诊断靶标进行筛选及评价,并筛选到一个新组织蛋白酶（命名为CL7）,建立了间接ELISA方法,并用该方法对田间样品进行了检测。随后对筛选的诊断靶标蛋白CL7进行单克隆抗体及多克隆抗体制备,进而建立了双抗夹心ELISA方法,用于检测片形吸虫的循环抗原,以达到片形吸虫病的早期诊断的目的。具体内容概述如下:1.诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化本研究选取 Annexin（Ann）、Leucine aminopeptidase（LAP）、CUB domain protein（CUB）以及一个命名为CathepsinL7（CL7）新的组织蛋白酶家族成员的蛋白基因进行分子克隆、载体构建、体外原核表达,蛋白纯化,用Western bloting对四个诊断靶标进行筛选及评价,随后以四种蛋白为包被抗原建立相应的间接ELISA（indirect enzyme linked immunoabsordent assay iELISA）方法以筛选最佳诊断靶标。使用片形吸虫感染的羊阳性血清和健康羊阴性血清用来评价其敏感性,结果表明:Ann、CUB敏感性（SEN）较低;LAP、Ann+LAP、CL7的敏感性较高。使用片形吸虫感染的羊阳性血清（n=16）和其他常见寄生虫阳性血清（n=16）,进行交叉反应,结果显示CL7特异性（SPE）最高,其他二者次之。在四个靶标蛋白中CL7是最有潜力的。2.CL7生物信息学分析、单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立本实验首次对CL7基因进行研究,通过生物信息学分析,证明其属于CL家族一员（组织蛋白酶L）,因此命名为（CL7）,并将其基因序列上传GenB ank,基因号:MN150457。同时本文对CL7还进行结构域分析、建模和可靠性3D建模。为建立适用于早期诊断的夹心ELISA（sandwich ELISA sELISA）方法,以CL7作为免疫原分别免疫小鼠和新西兰兔,成功获得11株CL7单克隆抗体（mAbs）和兔多克隆抗体。选取四株高滴度单抗:2B5、3B10、5A2、9H9进行小鼠腹水的制备、纯化、效价测定,亚型表位鉴定。结果表明:2B5、3B10、5A2、9H9分别属:IgG1、IgG2b、IgG1、IgG3,叠加ELISA结果显示2B5与5A2识别相似或相同表位,3B10与9H9识别相似或相同表位。用2B5和3B10与兔多克隆抗体进行组合,建立多种sELISA方法。对比发现CL7单抗2B5与兔多抗组合建立的sELISA效果最佳。并对该CL7 sELISA建立标准曲线,用于循环抗原CL7的定量分析。经ROC统计分析显示:CL7 sELISA对片形吸虫感染羊血清（n=12）检测下线为1.087ng/mL（Cut-off:0.4115）,并将上述阳性血清用于SEN与SPE的评估,结果表明二者均达到100%,CL7 sELISA检测不同感染期水牛的阳性（3-7感染周）、阴性血清时,检测下线为2.009 ng/mL（Cut-off:0.4845）,SPE达到100%,SEN达到93.75%。因此CL7 sELISA可应用于反刍动物片形吸虫的早期诊断。综上所述,本实验成功表达了四种片形吸虫重组蛋白,发现了一个良好的诊断靶标蛋白CL7,并建立了一种可以用于早期诊断的sELISA方法,对片形吸虫的诊断具有重要的应用价值。
张雪[4]（2020）在《朝阳市某羊场寄生虫病流行病学调查及防治措施研究》文中进行了进一步梳理为了解朝阳市羊场寄生虫病的流行情况,进而制定针对性的防治措施,我们于2018年11月至2019年5月在本市某羊场进行了寄生虫的流行情况调查,即通过尸体剖检和粪便检查法对羊场蠕虫的感染现状进行了调查,并以间接血凝试验和普通PCR法确定了弓形虫和隐孢子虫的感染情况。由调查结果得知,由该羊场共检出捻转血矛线虫、肝片吸虫、毛尾线虫、莫尼茨绦虫、弓形虫和隐孢子虫六种寄生虫,其中捻转血矛线虫的感染最为严重;粪便虫卵计数表明,该羊场寄生虫的感染率为86%（86/100）,其中六月龄以内的母羊感染率为95%,六月龄以内公羊感染率为70%,而六月龄以上母羊感染率为88%,公羊为80%。通过间接血凝实验得知弓形虫感染率为7.5%（9/120）,以分子生物学方法检测得知隐孢子虫的感染率为7%（7/100）。在此基础上,使用主成分分别为伊维菌素、阿苯达唑或左旋咪唑的驱虫药对该羊群进行了驱虫实验,虫卵减少率分别为8 4.1%、6 5.4%、62.2%;驱虫后40天羊只平均增重分别为4kg、3.06kg、2.9kg;进一步分别以正常剂量、加半倍量和加倍量的用量给药,虫卵减少率则分别为伊维菌素66.2%、72.5%和93.1%,阿苯达唑43.5%、45.7%和53.2%,左旋咪唑50.4%、59.8%和 57.3%。综合实验结果发现,该羊场以消化道寄生虫的感染为主,且多为混合感染;同时,该羊场对常用驱虫药物的耐药性也应得到重视。针对调查结果,为加强羊场的寄生虫防治效果,该羊场应在加强羊群饲养管理的同时,做好卫生清洁工作,合理放牧,定期以选定的驱虫药物驱虫。
盛兆安[5]（2020）在《大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究》文中研究表明背景:片形吸虫病主要是由片形属的肝片吸虫和大片吸虫感染所致的人畜共患寄生虫病,对公共卫生安全造成严重威胁。片形吸虫在感染宿主的过程中会不断产生可溶性的分子及胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）调控宿主免疫微环境,在宿主体内建立持续感染。脊椎动物的胃肠道内共生微生物在维持免疫系统的发育和功能的同时,对宿主的营养和能量代谢平衡亦起着至关重要的作用。目前已经有大量的研究显示寄生虫与宿主肠道菌群具复杂的相互作用关系,本研究通过描绘大片形吸虫感染后对宿主肠道菌群与免疫相关分子相互关系,对宿主-寄生虫-肠道菌群的复杂关系深入探讨,为实验室研究转化临床应用奠定基础。方法:（1）通过大片吸虫囊蚴感染水牛、BALB/C小鼠,大片吸虫成虫ESP、15k EVs、100k EVs腹腔注射小鼠;（2）对涉及与寄生虫免疫相关的Th1型和Th2型免疫细胞因子、转录因子和Toll样受体,血清中特异性抗体等免疫学指标进行检测,初步推测大片吸虫感染所诱导的宿主免疫反应类型;（3）收集实验动物的肠道内容物,经Illumina Hi Seq测序平台进行16S r RNA测序分析,评价大片吸虫感染对肠道菌群构成和功能的影响;（4）使用差速离心的方法,对大片吸虫产生的两种不同形态的胞外囊泡15,000×g（15k EVs）和100,000×g（100k EVs）进行分离鉴定,使用shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行分析;（5）将免疫学指标与肠道菌群数据进行相关性分析,推断大片形吸虫感染与宿主肠道菌群的相互作用机制。结果:发现宿主对大片吸虫的易感性与Th2型免疫反应密切相关,大片吸虫感染早期诱导Th1/2混合型的免疫反应,慢性感染阶段则转为典型的Th2型免疫反应。血清中特异性的IgG和IgG1的抗体水平随感染进程呈上升趋势。表明大片吸虫感染所诱导的Th2型相关的细胞因子和IgG1可能是其在自然宿主水牛体内成功建立感染的关键。同时小鼠模型发现激活的ERK通路和抑制经典的TLRs-IKB-NF-κB（p65）通路,参与了大片吸虫诱导的Th2型免疫反应。依据不同离心力,成功分离鉴定了两种不同形态的胞外囊泡15k EVs和100k EVs,并经shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行鉴定,发现其中含有多种与免疫调控、诊断、疫苗候选分子相关的蛋白;体内实验发现ESP、15k EVs、100k EVs均可诱导小鼠Th2/Treg型免疫反应,并通过上调T细胞共抑制分子CLAT-4和PD-1,限制Th1型免疫的发展。水牛感染大片吸虫可显着降低水牛肠道菌群的α-多样性,肠道菌群的构成在不同胃肠道部位的结果差异较大。RDA/CCA分析在科水平上Peptostreptococcaceae和Family＿XIII与高水平的IgG1和IL4相关。F.gigantica感染显着减少水牛结肠中产短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFAs）菌群Lachnospiraceae＿NK3A20＿group、Alistipes的丰度,降低结肠SCFAs浓度,大片吸虫感染小鼠同样观察到可减少结肠中产SCFAs的uncultured＿bacterium＿Lachnospiraceae丰度,提示Th2型免疫反应与下调菌群产生SCFAs相关。大片吸虫感染与成虫ESP、15k EVs、100k EVs注射均可降低小鼠结肠内容物菌群的α-多样性的,RDA/CCA分析Bacteroidetes和Proteobacteria与Th2和Treg型细胞因子具较强的相关性,而Bacteroidaceae和Cyanobacteria可能参与了大片吸虫感染引起的宿主纤维化的进程。结论:大片吸虫感染可通过调控宿主的肠道菌群的结构与菌群代谢产物影响宿主的免疫应答,促进其在宿主体内存活。对大片吸虫-宿主-肠道菌群作用关系的深入了解有助于我们更好的防控片形吸虫病提供参考。
周磊[6]（2020）在《青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查及西藏螺内寄生虫鉴定》文中指出青藏高原是我国四大牧区之一。传统的放牧方式是畜牧业的主要形式,畜牧业是当地的经济支柱。传统且粗犷的放牧方式,导致当地的寄生虫病频发,寄生虫病的肆虐对青藏高原的畜牧业经济造成了重大的损失。本研究首先对高原牦牛、藏羊开展了肝片吸虫的血清学调查,系统性的分析了2012-2017年间采集的牦牛血液样本3276份和藏羊血液样本1092份肝片吸虫的感染情况及潜在风险因素。其次,针对肝片吸虫的中间宿主螺进行研究,采集西藏自治区寄生虫病频发的五个地区的螺进行螺种鉴定,调查了螺体内寄生虫的感染情况。并通过肝片吸虫的线粒体基因cox1对牦牛肝片吸虫、螺内寄生虫进行了分子特征、单倍型研究。取得结果如下:1.牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查本次检测的四个高原地区均有肝片吸虫阳性检出,总体血清阳性率为44.3%。不同地区牦牛肝片吸虫阳性率为34.1%～72.0%;其中青海和甘肃牦牛肝片吸虫的阳性率高于四川牦牛,而西藏牦牛与四川牦牛肝片吸虫阳性率无统计学差异（P>0.05）。公牦牛和母牦牛肝片吸虫阳性率分别为43.3%和45.6%,无显着差异。不同年龄牦牛肝片吸虫阳性率为24.3%～47.3%;其中2～4岁牦牛（P<0.001）和4岁以上牦牛（P<0.001）肝片吸虫阳性率均显着高于0-1岁牦牛,而1-2岁牦牛与0-1岁牦牛肝片吸虫感染差异不显着（P>0.05）。不同年份牦牛肝片吸虫阳性率为18.5%～54.4%;其中2013年牦牛（P<0.001）、2014年牦牛（P<0.001）、2015年牦牛（P<0.01）、2016年牦牛（P<0.001）和2017年牦牛（P<0.001）均显着高于2012年牦牛。从整体水平看,2012～2017间牦牛肝片吸虫阳性率呈上升趋势。西藏四个地区均有藏羊肝片吸虫阳性检出,总体血清阳性率为37.1%。不同地区藏羊肝片吸虫阳性率为12.1%～61.6%;其中索县（P<0.05）、青龙乡（P<0.001）和班戈县（P<0.001）藏羊感染肝片吸虫的风险均显着高于聂荣县。公藏羊和母藏羊肝片吸虫阳性率分别为36.9%和37.4%,无显着差异。不同年龄藏羊肝片吸虫阳性率为23.9%～46.1%;其中1～2岁藏羊（P<0.001）和2岁以上藏羊（P<0.001）肝片吸虫阳性率均显着高于0-1岁藏羊。2.西藏地区螺种分布及螺内寄生虫感染情况调查当雄县、尼木县、曲水县、林芝县、波密县这五个地区,海拔高度分别为:5000m、3700m、3700m、2800m、2900m。共采集螺样本812只,其中当雄县采集样本40只,主要螺种为小土蜗,尼木县采集样本300只,主要螺种为耳萝卜螺,曲水县采集样本260只,主要螺种为耳萝卜螺,林芝县采集样本142只,主要螺种为耳萝卜螺,波密县采集样本70只,主要螺种为小土蜗。通过本次调查,发现西藏地区的淡水螺种类主要为耳萝卜螺和小土蜗,在高海拔和低海拔的区域都有小土蜗和耳萝卜螺的分布。螺内寄生虫的调查发现,螺体内存在雷蚴、子雷蚴、尾蚴、囊蚴这四个形态的寄生虫蚴虫。通过形态学观察,确定主要的寄生虫为肝片吸虫。此外,发现数量不多的尾部分叉的复殖吸虫尾蚴。经过统计发现,尼木县、曲水县、当雄县这三个地区的螺体内主要为肝片吸虫感染,感染率分别为:70.67%、26.15%、27.5%;林芝县的螺体内主要为肝片吸虫和复殖吸虫感染,感染率分别为:33.8%、4.93%;波密县螺体内未发现寄生虫感染。本次调查结果表明,西藏地区的螺内寄生虫的感染率高于其他地区,该结果也与西藏地区动物体内的寄生虫病感染率高的情况相吻合。3.牦牛肝片吸虫、螺内寄生虫分子特征研究提取牦牛肝片吸虫、螺内寄生虫DNA、PCR扩增cox1基因、序列纯化、基因测序,应用生物信息学软件DNAMAN、Mega等对cox1基因进行了多序列比对和进化分析。发现本次测序的肝片吸虫cox1序列仅有个别碱基差异。NJ进化树分析发现T4、T7、T9、T10、T14、T17、T34、T46分一个分支;T8和T15分一个分支;T26分一个分支;T58为一个分支;T44为一个分支;T56为一个分支;Y1、Y2、Y3、T33、T37、T43、T48、T55为一个分支。同源性分析发现本次获得的肝片吸虫cox1基因与之前报道的cox1参考基因的同源性为99.6%～100%。Pop ART 1.7分析发现22个肝片吸虫cox1基因共聚积成5个单倍型,其中T4、T7、T9、T10、T14、T17、T34、T46为一个单倍型;T8和T15为一个单倍型;Y1、Y2、Y3、T26、T33、T37、T43、T48、T55、T56为一个单倍型;T44为一个单倍型;T58为一个单倍型。Dna SP软件分析发现这些单倍型多样性和差异性指数分别为0.913和0.00092。
那冠琼[7]（2020）在《多肽类抗生素、吩噻嗪类和新型“瘦肉精”等兽药的免疫快速检测方法研究》文中认为近年来,随着畜牧业的高速发展,兽药在保证食源性动物增产、增效的同时,食品中兽药残留已经成为一个日益严重的全球性公共卫生问题。兽药的不当使用会使其残留在动物可食用组织、鸡蛋和奶制品中,不仅影响国际贸易、造成经济损失,更重要的是会给消费者的健康带来潜在风险。为了满足监测和控制食品兽药残留的需要,急需建立简单、廉价、灵敏、快速和高通量的分析方法。本研究主要针对多肽类抗生素杆菌肽锌（BAC）和多粘菌素（POL）、截短侧耳素类抗生素泰妙菌素（TIA）和沃尼妙林（VAL）、抗寄生虫药硝碘酚腈（NIT）、氯氰碘柳胺（CLT）和碘醚柳胺（RAF）、非甾体类抗炎药双氯芬酸（DIC）和卡洛芬（CAR）、抗组胺药赛庚啶（CPH）和吩噻嗪类（PZs）兽药,设计并合成人工抗原,制备高灵敏度的单克隆抗体,以此为研究基础建立相应的免疫学快速检测方法。（1）根据BAC的结构特征,设计并合成了人工抗原BAC-BSA,获得了两株抗BAC单克隆抗体6D2-G10和3F2-F11细胞株,抗体亚型均为IgG1型。6D2-G10具有更高的灵敏度,IC50值为0.59ng/mL,亲和力常数为6.69×109L/mol,对BAC结构类似物几乎没有交叉反应。基于6D2-G10,建立了牛奶中BAC残留的胶体金试纸条快速检测法,裸眼消线值为25 ng/mL,利用试纸条读条仪扫描后,建立BAC标准抑制曲线,实现了牛奶中BAC的定量检测,IC50为3.16ng/mL,检测限为0.82ng/mL。批间和批内平均添加回收率为84.3%～96.0%,变异系数为4.9%～10.7%。（2）设计并合成了人工抗原POL-E-BSA,获得了一株可同时识别POL-E和POL-B的单克隆抗体4H11-C3,该抗体属于IgG1型,亲和力常数为3.20×109 L/mol。基于4H11-C3,建立了 ic-ELISA方法检测牛奶样品中POL-E和POL-B残留,牛奶稀释4倍即可降低大部分基质效应干扰,检测POL-E灵敏度IC50为0.21 ng/mL,线性检测范围为 0.03～1.44 ng/mL,检测限为 0.02 ng/mL。检测 POL-B 的 IC50为 0.40 ng/mL,线性检测范围为0.06～2.65 ng/mL,检测限为0.03 ng/mL。平均添加回收率为89.3%～103.4%,变异系数为3.9%～6.9%。（3）保留VAL和TIA的共同结构基团（三环刚性结构）,成功合成了人工免疫原VAL-BSA,获得了高灵敏度的可同时检测VAL和TIA的单克隆抗体1B7-G10,该抗体为IgG1亚型,亲和力常数为1.28×109 L/mol,且对其他PLEs结构类似物RET、TYL、AVE、IVE和DOR无交叉反应。经ic-ELISA鉴定,检测VAL和TIA的IC50分别为0.99 ng/mL和0.39 ng/mL。基于1B7-G10,建立了胶体金试纸条方法定性定量检测猪肝中VAL和TIA,裸眼消线值分别为50 ng/g和25 ng/g,读条仪定量检测IC50分别为6.06 ng/g和3.45 ng/g,检测限为0.96 ng/g和0.29 ng/g,平均回收率为80.7%～102.0%,变异系数为4.6%～10.8%。（4）根据NIT、CLT和RAF的结构特征,设计合成了人工免疫原NIT-BSA和CLT-BSA,并获得了一株抗NIT单克隆抗体细胞株8G7-C6和一株可同时识别CLT、RAF的细胞株1E3-A10。两株单克隆抗体均为IgG1亚型,亲和力常数分别为2.93×109L/mol和8.90× 109 L/mol。8G7-C6的灵敏度IC50为0.96 ng/mL,且对NIT结构类似物无交叉反应。1E3-A10 抗 CLT 的 IC50 为 0.28 ng/mL,抗 RAF 的 IC50 为 0.39 ng/mL。基于 8G7-C6 抗体,成功建立了胶体金试纸条检测牛奶中NIT的残留,裸眼消线值为50ng/mL,IC50为5.71 ng/mL,检测限为1.14ng/mL。在牛奶中的平均添加回收率为84.6%～106.9%,变异系数为4.8%～9.9%。基于1E3-A10,我们建立了 ic-ELISA法检测牛奶中CLT和RAF,IC50为0.28 ng/mL和0.33 ng/mL,检测限为0.03 ng/mL和0.05 ng/mL,线性检测范围为0.05～1.63 ng/mL 和 0.08～1.38 ng/mL。（5）根据DIC和CAR的结构特征,设计并合成了免疫原DIC-BSA和CAR-BSA,成功获得一株抗DIC单克隆抗体1E5-B12和一株抗CAR单克隆抗体1F5-C8,两株单抗均为IgG1亚型,亲和常数分别为1.72×109 L/mol和6.19×109 L/mol。经ic-ELISA鉴定,1E5-B12 的 IC50 为 3.14ng/mL,1F5-C8 的 IC50 为 0.10ng/mL。基于 1E5-B12,建立了胶体金试纸条法检测牛奶中DIC,裸眼消线值为125 ng/mL,经读条仪定量检测后,IC50计算为8.54 ng/mL,检测限为1.40 ng/mL,牛奶添加DIC平均回收率为78.4%～104.3%,变异系数为4.7%～9.5%。基于1F5-C8,我们建立了胶体金试纸条检测牛肌肉中的CAR,裸眼消线值为12.5 ng/g,IC50为1.74 ng/g,检测限为0.28 ng/g,肌肉添加CAR平均回收率为79.5%～90.6%,变异系数为5.9%～8.8%。（6）采用溴乙酸亲核取代法修饰羟基化的CPH（COH）,制备新型半抗原,应用活泼酯法将其与BSA偶联制备免疫原CPH-BSA,获得一株IgG1型广谱高灵敏度单克隆抗体10D3-C3,亲和力常数为7.35×109 L/mol。该抗体可同时识别CPH和6种PZs（APZ、FPZ、CPZ、PPZ、PTZ 和 TDZ）。经 ic-ELISA 鉴定,该抗体对 CPH 和 PZs 的 IC50 为0.03～0.76 ng/mL。基于10D3-C3,建立了胶体金试纸条检测方法,检测饲料中CPH和PZs的裸眼消线值为5～100ng/g,IC50为0.57～7.75 ng/g,检测限为0.10～1.35 ng/g。饲料添加CPH和PZs的平均回收率为79.0%～103.4%,变异系数为4.5%～12.7%。
周鸿让[8]（2020）在《重组酶介导的核酸等温扩增技术快速检测棘球绦虫的研究》文中提出棘球蚴病（Echinococcosis）又称包虫病（Hydatidosis）,是一种可引起严重疾病负担并影响全球公共卫生安全和畜牧业发展的慢性人兽共患寄生虫病[1],可造成严重的医疗、社会和经济负担及后果[2-5]。所以早期、准确的诊断和检测,实时监测各类宿主的感染情况,对该病的防控具有重要意义[1,6]。本研究针对棘球绦虫的鉴别与棘球蚴病诊断方法的可操作性、检测灵敏度以及特异性,并依据重组酶介导的等温扩增方法（Recombinase-aided isothermal amplification,RAA）的原理,建立了检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的核酸等温扩增技术,具体开展以下三部分研究工作,以期为棘球绦虫的检测以及棘球蚴病的诊断提供可选择的检测方法:一、重组酶介导的等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫G1方法的建立与初步应用评价本部分以细粒棘球绦虫G1（EgG1）线粒体基因序列（GenBankTM No.AF297617）作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成6对引物。经筛选获取最佳引物,并从温度、引物及醋酸镁3个方面以优比RAA反应体系。以PCR作为平行对照,分别以不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T（Simple）克隆质粒进行RAA灵敏度扩增检测,同时以多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板进行RAA扩增用于特异性评价。此外,分别对不同样本（感染EgG1的动物组织样本（10份）、模拟现场阳性犬粪样本（3份）以及现场阳性犬粪样本（5份））进行检测,以验证所建立的RAA检测方法的可靠性和实用性。本研究建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段。经优化确立最佳温度为37℃,最佳引物（10μmol/L）用量为2μL,即反应浓度为0.4μmol/L,最佳醋酸镁（280mmol/L）用量为2.5μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。灵敏度方面,RAA法最低可检测到10 pg基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;特异性方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染EgG1样本检测结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。二、重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用评价本部分以多房棘球绦虫（Em）线粒体基因序列（GenBankTM No.AB01 8440）作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成5对引物。经筛选获取最佳引物后,再从温度、引物及醋酸镁3个方面以优化RAA反应体系。以PCR作为平行对照,分别以不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的质粒进行RAA扩增,以评价RAA检测方法的灵敏度;同时以其他寄生虫基因组DNA为模板进行RAA扩增用于特异性评价。此外,分别对不同样本（感染Em的动物组织样本（9份）、模拟现场阳性犬粪样本（3份）以及现场阳性犬粪样本（2份））进行检测,以验证所建立的RAA检测技术的可靠性和实用性。本研究建立的RAA法可在40 min内特异性扩增Em的目的基因片段。经优化确立最佳温度为37℃,最佳引物（10μmol/L）用量为2μL,即反应浓度为0.4μmol/L,最佳醋酸镁（280mmol/L）用量为2.5μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。灵敏度方面,RAA法最低可检测到10 pg基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;特异性方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染的样本检测结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。三、重组酶介导的多重核酸等温扩增法鉴别细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫技术的建立与初步应用评价本部分利用第一与第二部分所设计的引物（专利申请号:20191116433 7.5）建立了可在40 min内特异性扩增EgG1与Em目的基因片段的重组酶介导的多重核酸等温扩增方法（Multiplex recombinase-aided isothermal amplification,mRAA）。实验分别从温度、引物及醋酸镁3个方面进行多重RAA反应体系的优化。以mPCR作为平行对照,应用mRAA方法扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的质粒,以评价RAA检测方法的灵敏度;同时检测多种寄生虫的基因组DNA,以评价其特异性。对所建立的方法优化后,应用于样本（感染棘球绦虫的动物组织样本19份（Eg,10份;Em,9份）、模拟现场阳性犬粪样本3份（含Eg与Em混合样本,3份）以及现场阳性犬粪样本7份（Eg,5份;Em,2份））的检测,以验证所建立的mRAA检测技术的可靠性和实用性。本研究经优化确立了最佳温度为37℃,EgG1正、反向引物（10μmol/L）最佳用量各为1μL,即反应浓度为0.2μmol/L,Em正、反向引物（10μmol/L）各为1.5μL,即反应浓度为0.3 μmol/L,醋酸镁（280mmol/L）最佳用量为2.5 μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。在灵敏度检测方面,mRAA最低可检测出0.1 ng的基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;在特异性检测方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染样本mRAA检测结果均为阳性,且与mPCR检测结果一致。本研究建立的RAA以及mRAA检测方法较常规PCR快速,检测灵敏度和特异性均较高,其在EgG1与Em虫种的鉴定方面以及棘球蚴病基因诊断方面具有重要价值,为快速检测提供一种新的敏感和特异的工具。有望为棘球蚴病的现场防治工作提供高效、快速的技术支撑。
张小凡[9]（2020）在《细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究》文中提出棘球蚴病又称为包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫（棘球蚴）寄生于人和多种食草类家畜引起的一种人兽共患病,其主要寄生部位为肝脏和肺脏。包虫病严重危害人类健康和畜牧业生产,为我国重点防治的重大疾病。由细粒棘球蚴寄生引起的囊型包虫病,在我国广泛流行,受危胁人口数、患病数和发病率居全球首位。树突状细胞（dendritic cells,DC）是一类功能最强的专职抗原提呈细胞,可有效启动初次免疫应答,在寄生虫感染时决定机体免疫应答方向。髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressorcells,MDSC）和调节性 T 细胞（regulatoryT cells,Treg）是两群主要引起免疫抑制作用的细胞,两者在细粒棘球绦虫原头节感染小鼠的外周血、腹腔和脾脏中明显富集。DC和MDSC可诱导Treg的产生,且DC可由MDSC分化产生。研究发现,寄生虫可释放携带多种生物活性物质（蛋白质、脂质和核酸等）的外泌体,参与寄生虫-寄生虫的信息交流,寄生虫-宿主的相互作用,在寄生虫感染致病过程中起重要作用。寄生虫源外泌体含有大量的miRNAs,可被宿主细胞摄取,进而调控宿主的免疫应答。然而,DC和抑制性细胞群（MDSC和Treg）在细粒棘球蚴感染小鼠的原发感染病灶肝脏的动态变化情况尚不清楚;原头节源外泌体及其含有的miRNAs在细粒棘球蚴感染致病过程中发挥的作用及机制尚未见报道。本研究建立细粒棘球蚴感染小鼠模型,利用流式细胞术检测小鼠感染早、中、晚期（3、6和12个月）肝脏白细胞DC、MDSC和Treg的比例动态变化情况。采用超速离心获得细粒棘球绦虫原头节源外泌体样囊泡（protoscoleces derived exosome like vesicles,PSC-ELVs）和囊液源外泌体样囊泡（hydatid fluid derived exosome like vesicles,HF-ELVs）,进行高通量测序以及生物信息学分析,获得PSC-ELVs和HF-ELVs的ncRNAs（包括 miRNAs、lncRNAs 和 circRNAs）表达谱,对 PSC-ELVs 中含量前20的miRNAs进行筛选和鉴定,分析预测其潜在的靶基因,构建lncRNA-mRNA-miRNA调控网络,初步探索PSC-ELVs中最为丰富的miRNAs可能参与宿主的免疫调控和发病机制,为进一步研究这两种ELVs中miRNAs在寄生虫-宿主相互作用中的免疫调控功能提供理论基础。细粒棘球绦虫排泄分泌抗原（excretion-secretion antigens,ES）可调控DC的成熟和功能,影响炎症因子释放,调节Th1/Th2型免疫应答。外泌体是ES的重要组成部分,广泛参与核酸运输,细胞间物质交换和抗原递呈等。本研究通过将原头节源外泌体与骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）共培养,分析其对BMDC表面MHCII分子和共刺激分子表达,以及细胞因子分泌的影响,探索原头节源外泌体及其含有的miRNAs对DC的功能及作用机制,为原头节源外泌体及其含有的miRNAs参与宿主免疫应答的作用提供理论及分子基础,也为包虫病临床诊断和基因治疗等研究提供新思路。一、细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究建立细粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型,每只感染组小鼠腹腔注射2 000个原头节,对照组腹腔注射等量生理盐水。小鼠感染后3、6和12个月（感染早、中、晚期）收集肝脏白细胞,采用流式细胞术检测小鼠肝脏白细胞中DC、MDSC及其亚型M-MDSC、PMN-MDSC与Treg细胞的比例;动态分析感染小鼠肝脏DC和免疫抑制细胞群（MDSC和Treg）比例的变化。结果显示,小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中DC细胞比例分别为（5.27±0.55）%、（6.87±0.32）%和（18.5±0.64）%,对照组分别为（5.92±0.43）%、（5.99±0.12）%和（13.73±0.22）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中MDSC 比例分别为（1.61±0.36）%、（5.68±0.69）%和（16.18±0.69）%,对照组分别为（2.19±0.42）%、（0.99 ±0.07）%和（4.18±0.84）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）;小鼠感染后3、6和12个月后肝脏白细胞中M-MDSC 比例分别为（0.69±0.27）%、（5.30±0.72）%和（10.75±0.29）%,对照组分别为（0.42± 0.24）%、（0.69±0.02）%和（2.12±0.13）%,感染后 6 和 12 个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）;小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中PMN-MDSC 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32±0.02）%和（5.14±1.03）%,对照组分别为（1.77±0.26）%、（0.28±0.05）%和（1.99±0.90）%,感染后3和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24±0.38）%和（3.41±0.07）%,对照组分别为（3.48±0.46）%、（3.65±0.45）%和（3.12±0.12）%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义（P均<0.01）。小鼠感染原头节6和12个月后,肝脏白细胞中DC、MDSC与Treg细胞比例增加;其中MDSC比例变化更明显,以M-MDSC为主;同时可由M-MDSC分化形成的DC也明显升高,提示M-MDSC可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用,且可能促进DC的产生。二、细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析通过对细粒棘球绦虫原头节（protoscoleces,PSCs）的培养液和绵羊可育囊的囊液（hydatid fluid,HF）进行超速离心获得PSC-ELVs和HF-ELVs。使用透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blotting,对分离获得的两种外泌体进行鉴定,其大小,形态与外泌体一致,且含有特定的外泌体标记物。采用高通量测序分析了两种ELVs的ncRNAs（包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs）表达谱,并利用GO和Pathway对PSC-ELVs中含量前20的miRNAs功能进行预测。在PSC-ELVs和HF-ELVs中,分别鉴定出1 18和58个miRNAs,两者共表达的miRNAs共有53个,其中PSC-ELVs特异表达65个,HF-ELVs特异表达5个。在PSC-ELVs和HF-ELVs分别鉴定出2 361和1 254个lncRNAs,其中两者共表达的lncRNAs共有1 004个,PSC-ELVs特异表达1 357个,HF-ELVs特异表达250个。PSC-ELVs中含量前20的miRNAs和circRNAs的表达量高于HF-ELVs中相应的miRNAs和circRNAs,而lncRNAs的表达量则低于HF-ELVs。通过荧光定量PCR检测,对miRNAs测序结果进行验证。此外,从PSC-ELVs含量前20的miRNAs中筛选出与宿主免疫应答有关的miRNAs,及其调控的lncRNAs 和 mRNAs,并构建了一个包含 5 个 miRNAs,41 个 lncRNAs 和 23 个mRNAs的ceRNA调控网络。PSC-ELVs含量前20的miRNAs的靶基因可能参与调控寄生虫感染过程中的炎症反应、MAPK级联反应和胶原分解代谢过程。此外,egr-miR-4989-3p 为 PSC-ELVs 和 HF-ELVs 中含量最高的 miRNA,与 egr-miR-277a-3p同属一个miRNA家族,具有相同的种子序列。本研究为首次鉴定获得PSC-ELVs和HF-ELVs中的ncRNAs谱,可能与宿主免疫应答和发病机理有关。这两种外泌体中含量丰富的miRNAs可能介导相关信号通路或与靶基因相互作用方式,在外泌体参与寄生虫-宿主相互作用中发挥重要的免疫调控作用。三、细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究通过将PSC-ELVs与BMDC共孵育,激光共聚焦显微镜观察发现PSC-ELVs可被BMDC内化摄取,qRT-PCR检测发现PSC-ELVs能将携带的miRNAs转运至BMDC中。通过qRT-PCR和ELISA分别检测处理后的BMDC细胞因子mRNA和蛋白质水平的表达,流式细胞术检测BMDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子表达水平,结果发现PSC-ELVs可有效诱导BMDC产生促炎性因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-β、IFN-γ和抑炎性因子IL-10,且大多数与LPS存在协同作用,上调细胞表面MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40、PDL1和PDL2的表达,这一结果提示PSC-ELVs可能携带某些毒力分子诱导BMDC成熟且往刺激型DC极化,呈现明显的促炎特性,可能产生Th1型细胞介导的免疫应答,有助于杀伤并清除入侵的病原体而保护机体。将miR-277a-3p和miR-4989-3p的mimic 和 inhibitor 转染 BMDC 后,qRT-PCR 检测发现,miR-277a-3p 和 miR-4989-3p诱导BMDC促炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α的mRNA水平显着增加,抑炎性因子IL-10的mRNA水平显着降低,提示miR-277a-3p和miR-4989-3p可诱导BMDC产生炎性因子,往刺激型DC极化。miR-277a-3p和miR-4989-3pmimic诱导BMDC IGF1和NF-κB1的mRNA水平显着降低,NF-κB P65的mRNA和蛋白质水平显着增加,并增加其磷酸化水平,提示IGF1和NF-κB1是miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在的靶基因,可能通过活化NF-κB P65并使其磷酸化,进而诱导促炎性因子产生。本研究为进一步明确原头节源外泌体及其含有的miRNAs调控宿主免疫应答机制及包虫病防治研究提供新思路和分子基础。
曾敏浩[10]（2020）在《绵羊肝片吸虫人工感染模型的建立及其血浆代谢组学分析》文中提出肝片吸虫病是由肝片吸虫（Fasciola hepatica）寄生于动物肝脏和胆管而引起的一种食源性、水源性重要人畜共患寄生虫病。本病呈世界性流行,据统计,全球约有2.5亿-3亿牛、羊感染肝片吸虫,每年因片形吸虫造成的经济损失超过30亿美元。特别重要的是,肝片吸虫还可以感染人,给畜牧业生产带来巨大经济损失,也对人类健康造成极大威胁。目前,虫卵检查法是我国肝片吸虫病的主要诊断方法,而肝片吸虫从感染到发育成成虫需要两个月以上的时间,这时已经对动物机体已经造成了严重损伤,应用虫卵检查法不能进行诊断。因此有必要发展一种适合肝片吸虫早期诊断的方法。近年来也有一些免疫学诊断方法被开发出来,但多数没有在临床中大规模应用。虽然国外已有商品化ELISA诊断试剂盒,但价格昂贵,制备也相对困难。因此,我们急需一种早期、敏感、特异,成本相对低的诊断方法,以便广泛利用。组学技术发展如火如荼,代谢组学作为一种新型技术也在研究疾病发病机理与诊断方面有重要作用,而当机体受病原侵袭时,机体代谢的变化也是最为敏感的。因此本研测定肝片吸虫感染羊的代谢谱,为相关早期诊断提和致病机制的研究提供可靠依据。因此,本研究首先建立绵羊肝片吸虫人工感染模型。采集自然感染肝片吸虫的绵羊胆囊,收集肝片吸虫虫卵。将虫卵孵化出的毛蚴感染小土窝螺（Galba pervia）,并人工养殖获得囊蚴。将实验绵羊分为实验组11头与对照组10头,实验组羊只喂服囊蚴。在感染囊蚴后按计划采集实验羊只血浆或血清样本保存。粪检检查肝片吸虫虫卵确定虫体成熟时间,样品收集完毕后剖检回收虫体。感染后第0、3、7、20、34、48、56、72、84、98天的血清样本利用生化分析仪对35个生化指标进行检测,分析绵羊在感染肝片吸虫后血清生化指标的动态变化过程。血浆样品进行基于液相色谱/质谱联用技术（Liquid Chromatograph/Mass Spectrometry,LC/MS）的代谢组学测定,结合多元统计分析,获得感染后第7、56、98天绵羊血浆差异代谢物。通过生物信息学分析,探讨绵羊在感染肝片吸虫后机体代谢发生的变化,并筛选差异代谢物作为具有诊断潜力的生物标志物。结果显示:在37℃条件下,毛蚴最快12天从虫卵逸出。25-30℃环境温度、70%以上湿度条件下,尾蚴最早在螺被感染的第25天逸出。喂服囊蚴后84天,所有实验组绵羊粪便中均检出虫卵。剖检回收虫体,回收率高达50%（109/220）-60%（132/220）。本研究对血清进行生化检测的结果表明,在35项生化指标的检测中,22个项目出现了变化,其中肝脏功能相关指标15个,血脂指标3个,肾功能指标2个,还有乳酸脱氢酶和α-淀粉酶。肝片吸虫对机体的损伤集中在肝脏和胰腺,对肾功能、电解质和微量元素以及血糖含量没有明显影响或影响较小。且对机体损伤的动态变化与虫体在宿主体内的移行过程相关。代谢组检测正离子模式下,感染第7、56、98天的差异代谢物分别有13、27、82种;负离子模式下,感染第7天无具有显着差异的代谢物,第56、98天分别有37、83种。通路分析结果显示,影响因子最大、富集程度最高的是感染第98天筛选出的血浆差异代谢物分析得出的代谢通路;其次,是感染第56天;感染第7天的差异代谢物最少,差异代谢通路也最少。联合诊断分析结果显示,绵羊感染肝片吸虫囊蚴第7、56、98天,各联合诊断因子的AUC值分别为1、0.964、1,均具有良好的诊断能力。结论:本研究成功建立了肝片吸虫人工感染模型,完成了从虫卵到成虫的完整生活史复原,丰富了研究肝片吸虫不同发育阶段的材料。绵羊血清生化指标显示了,童虫在移行过程中对机体的损伤集中在肝脏和胰腺,且变化趋势可能与移行的阶段有关。并首次基于LC/MS代谢组学分析获得绵羊感染肝片吸虫的血浆代谢表达谱。绵羊在感染第7、56和98天均具有显着的代谢差异,且分别获得了在三个时期具有诊断潜力的差异代谢物和联合诊断因子。有望在应用在进一步的肝片吸虫感染诊断中。
二、山羊实验感染肝片吸虫的血清IgG水平动态观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、山羊实验感染肝片吸虫的血清IgG水平动态观察（论文提纲范文）
（2）食源性吸虫的分子鉴定与快速诊断试条的研制及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 背景 |
| 第一部分 广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析 |
| 前言 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 DNA提取 |
| 2.3.2 PCR引物的合成 |
| 2.3.3 目的序列的扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.5 DNA序列分析 |
| 2.3.6 单倍型网络图和系统进化树的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 成虫的遗传多态性分析 |
| 3.1.1 PCR结果 |
| 3.1.2 ITS+序列分析 |
| 3.1.3 NAD Ⅰ序列分析 |
| 3.1.4 COX Ⅰ序列分析 |
| 3.1.5 pepck多重PCR分析 |
| 3.1.6 多个分子标记综合分析 |
| 3.2 虫卵ITS+序列分析 |
| 3.3 基于NAD Ⅰ和COXⅠ序列的遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条研制与效果评价 |
| 前言 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 重组蛋白的表达 |
| 2.1.2 试条的研制 |
| 2.1.3 试条的评价 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.3. 方法 |
| 2.3.1 质粒的准备 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.3 胶体金免疫层析试条的制备 |
| 2.3.4 试条的使用和判断 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.1.1 纯化试剂盒的选择 |
| 3.2 试条的制备 |
| 3.2.1 纤维素膜的选择 |
| 3.2.2 rCs4浓度的选择 |
| 3.2.3 胶体金的用量 |
| 3.3 试条检测效果的评价 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（3）片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫的生物学特征和生活史 |
| 1.1.1 片形吸虫的主要生物学特性 |
| 1.1.2 片形吸虫的生活史 |
| 1.2 片形吸虫病的临床表现和流行趋势及危害 |
| 1.2.1 片形吸虫病的临床表现 |
| 1.2.2 片形吸虫病的流行趋势及危害 |
| 1.3 片形吸虫病的治疗和预防 |
| 1.4 片形吸虫病诊断研究进展 |
| 1.4.1 经典方法 |
| 1.4.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4.3 免疫学诊断 |
| 1.5 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.5.1 排泄分泌物抗原ESP |
| 1.5.2 脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins FABP) |
| 1.5.3 谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase GST) |
| 1.5.4 鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-like protein SAP) |
| 1.5.5 亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase LAP) |
| 1.5.6 组织蛋白酶(Cathepsin proteases CAT) |
| 1.5.7 其他抗原 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肝片吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录步骤 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 Ann CUB目的基因的合成 |
| 2.2.5 Ann CUB克隆载体的构建 |
| 2.2.6 Ann CUB表达载体的构建 |
| 2.2.7 Ann、CUB、CL7、LAP原核表达和纯化 |
| 2.2.8 Ann、CUB、LAP、CL7 Western blotting免疫反应性分析 |
| 2.2.9 筛选最佳抗原靶标 |
| 2.2.10 计算统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Ann、CUB目的基因的合成和Ann、CUB、CL7双酶切鉴定 |
| 2.3.2 Ann、CUB、LAP、CL7表达载体测序结果 |
| 2.3.3 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.4 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的免疫反应性 |
| 2.3.5 Ann、CUB、LAP、CL7多种间接ELISA方法建立 |
| 2.3.6 LAP、Ann+LAP、CL7三种ELISA方法特异性实验 |
| 2.3.7 CL7 iELISA方法的评价 |
| 2.3.8 CL7 iELISA方法田间样本检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CL7单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CL7抗原的序列上传和生物学分析 |
| 3.2.2 BALB/c小鼠免疫 |
| 3.2.3 鼠单克隆抗体制备 |
| 3.2.4 单抗腹水制备和纯化 |
| 3.2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.6 兔多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 夹心ELISA方法的建立 |
| 3.2.8 夹心ELISA方法的评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CL7生物学分析 |
| 3.3.2 CL7单克隆抗体的制备 |
| 3.3.3 CL7兔多克隆抗体制备 |
| 3.3.4 CL7夹心ELISA方法的建立和评价 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（4）朝阳市某羊场寄生虫病流行病学调查及防治措施研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 我国羊养殖业概况 |
| 1.2 国内外羊寄生虫病研究概况 |
| 1.3 羊常见寄生虫病 |
| 1.3.1 内寄生虫病 |
| 1.3.2 外寄生虫病 |
| 1.4 寄生虫的危害 |
| 1.5 寄生虫病常用诊断技术 |
| 1.5.1 流行现状调查 |
| 1.5.2 完全剖检技术 |
| 1.5.3 病原学诊断 |
| 1.5.4 血清学诊断 |
| 1.6 常用驱虫药及其使用情况 |
| 1.7 羊寄生虫病的防治 |
| 1.7.1 做好流行病学调查 |
| 1.7.2 加强羊群的饲养和管理 |
| 1.7.3 建立科学的放牧制度 |
| 1.7.4 粪便的无害化处理 |
| 1.7.5 定期对羊群进行驱虫 |
| 1.8 研究的目的意义 |
| 2 羊寄生虫病的流行现状调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验器材 |
| 2.1.2 主要实验试剂与药品 |
| 2.1.3 羊场情况以及羊群发病情况调查 |
| 2.1.4 样品采集 |
| 2.1.5 粪便虫卵检查 |
| 2.1.6 尸体剖检 |
| 2.1.7 间接血凝试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 镜检观察结果 |
| 2.2.2 羊完全剖检结果观察 |
| 2.2.3 寄生虫感染情况粪检结果 |
| 2.2.4 弓形虫间接血凝试验结果 |
| 3 隐孢子虫的巢式PCR检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 DNA的提取 |
| 3.1.3 PCR扩增 |
| 3.1.4 PCR扩增产物的检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 4 羊场常用驱虫药的驱虫试验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验药品 |
| 4.1.2 驱虫实验方案 |
| 4.1.3 驱虫效果的判定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 临床症状观察 |
| 4.2.2 驱虫前后粪检结果 |
| 4.2.3 驱虫后增重结果 |
| 5 羊场对常用驱虫药的耐药性试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 检测方法 |
| 6.2 寄生虫感染情况分析 |
| 6.3 驱虫药筛选及耐药性检测分析 |
| 6.4 寄生虫防治建议 |
| 6.5 试验不足之处 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概述 |
| 1.1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行现状 |
| 1.1.3 片形吸虫病的防控现况 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的相互作用机制 |
| 1.2.1 片形吸虫的生活史 |
| 1.2.2 片形吸虫宿主适应性 |
| 1.2.3 宿主抗片形吸虫感染的机制 |
| 1.2.4 宿主的免疫应答与片形吸虫感染的互作关系 |
| 1.2.5 片形吸虫的免疫逃避策略 |
| 1.3 蠕虫感染与肠道菌群之间相互作用研究进展 |
| 1.3.1 蠕虫感染对微生物丰富度和多样性的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对宿主代谢的影响 |
| 1.3.3 蠕虫与肠道菌群相互作用关系的假设 |
| 1.3.4 蠕虫-微生物相互作用关系的应用 |
| 1.3.5 片形吸虫与肠道菌群的可能机制 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 大片吸虫感染对水牛宿主免疫微环境的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.2.3 主要设备、仪器 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物感染及取材 |
| 2.3.2 RNA的分离及反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR检测(RT-q PCR) |
| 2.3.4 血清抗体检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 水牛感染大片吸虫肝门淋巴结免疫学指标变化 |
| 2.4.2 水牛感染大片吸虫脾脏免疫学指标变化 |
| 2.4.3 水牛感染大片吸虫血清中抗大片吸虫ESP特异性抗体检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大片吸虫胞外囊泡的分离鉴定与蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 3.2.3 主要的仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 大片吸虫ESP和 EVs的收集 |
| 3.3.2 蛋白浓度定量分析 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 粒径检测 |
| 3.3.5 Western blot鉴定胞外囊泡所含蛋白质 |
| 3.3.6 Shotgun鉴定100k胞外囊泡中蛋白 |
| 3.3.7 小鼠免疫与感染 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 大片吸虫成虫ESP、EVs的分泌特征 |
| 3.4.2 大片吸虫成虫15k EVs、100k EVs鉴定 |
| 3.4.3 虫体回收 |
| 3.4.4 肝脏病理损伤评分 |
| 3.4.5 血清中ALT、AST的变化 |
| 3.4.6 血清中特异性抗体的变化 |
| 3.4.7 大片吸虫成虫100k EVS的蛋白组整体分析 |
| 3.4.8 大片吸虫成虫100k EVS鉴定的蛋白分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠T细胞分化相关TLR-ERK通路的初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物及材料 |
| 4.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要的实验仪器、设备 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠囊蚴感染分组 |
| 4.3.2 小鼠腹腔注射分组 |
| 4.3.3 样品收集 |
| 4.3.4 RT-q PCR检测 |
| 4.3.5 抗体ELISA检测 |
| 4.3.6 动物病理组织切片的制备 |
| 4.3.7 组织匀浆的制备 |
| 4.3.8 细胞因子ELISA检测 |
| 4.3.9 Western blot检测 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 小鼠感染大片吸虫囊蚴结果 |
| 4.4.2 大片吸虫 成虫 ESP、15k EVs和100k EVs腹腔注射小鼠模型 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 大片吸虫感染对水牛胃肠道菌群的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂/耗材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 测序数据的分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.5.1 肠系膜淋巴结、肝门淋巴结、脾脏和肝脏TLRs在感染组和对照组的表达情况 |
| 5.5.2 α-多样性分析 |
| 5.5.3 主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCo A) |
| 5.5.4 水牛感染大片吸虫对胃肠道菌群各分类水平组成 |
| 5.5.5 LEf Se(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size,LEf Se)分析 |
| 5.5.6 CCA/RDA分析 |
| 5.5.7 结肠中SCFAs水平检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物及材料 |
| 6.2.2 主要试剂、耗材 |
| 6.2.3 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 小鼠囊蚴感染对结肠内容肠道菌群构成的影响 |
| 6.4.2 腹腔注射小鼠模型结肠内容物菌群分析结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 水牛RT-qPCR使用引物 |
| 附表2 小鼠RT-qPCR使用引物 |
| 附表3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（6）青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查及西藏螺内寄生虫鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 淡水螺概况 |
| 1.2.1 淡水螺类与环境的关系 |
| 1.2.2 椎实螺的生物学分类、生活史及形态特征 |
| 1.3 西藏地区主要螺种简介 |
| 1.3.1 耳萝卜螺 |
| 1.3.2 小土蜗 |
| 1.4 西藏螺地区螺内寄生虫病概况 |
| 1.4.1 复殖吸虫 |
| 1.4.2 肝片吸虫 |
| 1.5 寄生虫病对畜牧业的危害 |
| 1.6 寄生虫病的预防与治疗 |
| 1.6.1 预防防治 |
| 1.6.2 治疗 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样本来源与采集方法 |
| 2.1.2 ELISA检测试剂盒 |
| 2.1.3 主要器材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 血清学检测 |
| 2.2.2 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 牦牛肝片吸虫检测结果 |
| 2.3.2 藏羊肝片吸虫检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 西藏地区螺类分布及螺内寄生虫调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本来源与采集方法 |
| 3.1.2 样本的保存与运输 |
| 3.1.3 主要器材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 螺类的初步分类 |
| 3.2.2 螺的解剖与测量。 |
| 3.2.3 螺的形态学鉴定 |
| 3.2.4 螺内寄生虫的分离 |
| 3.2.5 寄生虫的形态学鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 螺的形态鉴定 |
| 3.3.2 西藏地区的螺类分布 |
| 3.3.3 肝片吸虫形态 |
| 3.3.4 复殖吸虫蚴虫的收集及形态学观察 |
| 3.3.5 西藏螺内寄生虫种类及感染率情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 椎实螺的地理分布 |
| 3.4.2 不同海拔高度椎实螺的分布情况 |
| 3.4.3 螺内寄生虫的感染情况 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 西藏地区螺内肝片吸虫、牦牛肝片吸虫的分子特征研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样本来源与采集方法 |
| 4.1.2 主要器材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 虫体DNA提取 |
| 4.2.2 PCR扩增 |
| 4.2.3 电泳 |
| 4.2.4 测序 |
| 4.2.5 序列比对及进化分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肝片吸虫的PCR扩增结果 |
| 4.3.2 序列比对与进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）多肽类抗生素、吩噻嗪类和新型“瘦肉精”等兽药的免疫快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 抗生素类兽药概述 |
| 1.2.1 理化性质 |
| 1.2.2 作用机理 |
| 1.2.3 残留危害与限量标准 |
| 1.2.4 检测方法 |
| 1.3 抗寄生虫类兽药概述 |
| 1.3.1 理化性质 |
| 1.3.2 作用机理 |
| 1.3.3 残留危害与限量标准 |
| 1.3.4 检测方法 |
| 1.4 非甾体类抗炎兽药概述 |
| 1.4.1 理化性质 |
| 1.4.2 作用机理 |
| 1.4.3 残留危害和限量标准 |
| 1.4.4 检测方法 |
| 1.5 抗组胺药与吩噻嗪类药物概述 |
| 1.5.1 理化性质 |
| 1.5.2 作用机理 |
| 1.5.3 残留危害与限量标准 |
| 1.5.4 检测方法 |
| 1.6 立题依据和主要研究内容 |
| 1.6.1 本课题的意义及研究目的 |
| 1.6.2 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 多肽类抗生素单克隆抗体的制备及免疫学检测技术的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与化学试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 实验动物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 免疫原的设计与合成 |
| 2.3.2 免疫原的表征 |
| 2.3.3 动物免疫 |
| 2.3.4 小鼠多抗血清检测 |
| 2.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 2.3.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.3.7 BAC胶体金试纸条的建立与优化 |
| 2.3.8 POL的ic-ELISA检测法的建立 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 人工抗原的合成和鉴定 |
| 2.4.2 小鼠多抗血清的鉴定 |
| 2.4.3 单克隆细胞株筛选 |
| 2.4.4 单克隆抗体性质鉴定 |
| 2.4.5 BAC胶体金试纸条的建立与优化 |
| 2.4.6 COL的ic-ELISA方法的建立 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 截短侧耳素类抗生素单克隆抗体的制备及免疫学检测技术的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与化学试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 实验动物与细胞 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 免疫原的设计和合成 |
| 3.3.2 免疫原的表征 |
| 3.3.3 动物免疫 |
| 3.3.4 小鼠多抗血清检测 |
| 3.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3.7 胶体金试纸条的建立与优化 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 人工抗原的合成与鉴定 |
| 3.4.2 小鼠多抗血清鉴定 |
| 3.4.3 单克隆细胞株筛选 |
| 3.4.4 单克隆抗体性质鉴定 |
| 3.4.5 胶体金试纸条的建立与优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 抗寄生虫药单克隆抗体的制备及免疫学检测技术的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与化学试剂 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.2.4 实验动物和细胞 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 免疫原的设计与合成 |
| 4.3.2 免疫原的表征 |
| 4.3.3 动物免疫 |
| 4.3.4 小鼠多抗血清检测 |
| 4.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 4.3.6 单克隆细胞的鉴定 |
| 4.3.7 NIT胶体金试纸条的建立与优化 |
| 4.3.8 CLT的ic-ELISA检测法的建立 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 人工抗原的合成与鉴定 |
| 4.4.2 小鼠多抗血清鉴定 |
| 4.4.3 单克隆细胞株筛选 |
| 4.4.4 单克隆抗体性质鉴定 |
| 4.4.5 NIT胶体金试纸条的建立与优化 |
| 4.4.6 CLT的ic-ELISA方法的建立 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 非甾体类抗炎药单克隆抗体的制备及免疫学检测技术的建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与化学试剂 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验材料 |
| 5.2.3 溶液配制 |
| 5.2.4 实验动物和细胞 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 免疫原的设计和合成 |
| 5.3.2 免疫原的表征 |
| 5.3.3 动物免疫 |
| 5.3.4 小鼠多抗血清检测 |
| 5.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 5.3.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 5.3.7 胶体金试纸条的建立与优化 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 人工抗原的合成与鉴定 |
| 5.4.2 小鼠多抗血清的鉴定 |
| 5.4.3 单克隆细胞株筛选 |
| 5.4.4 单克隆抗体性质鉴定 |
| 5.4.5 胶体金试纸条的建立和优化 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 赛庚啶和吩噻嗪类药物单克隆抗体的制备及免疫学检测技术的建立 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 仪器与化学试剂 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验材料 |
| 6.2.3 溶液配制 |
| 6.2.4 实验动物和细胞 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 免疫原的设计和合成 |
| 6.3.2 免疫原的表征 |
| 6.3.3 动物免疫 |
| 6.3.4 小鼠多抗血清检测 |
| 6.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 6.3.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 6.3.7 胶体金试纸条的建立与优化 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 人工抗原的合成与鉴定 |
| 6.4.2 小鼠多抗血清鉴定 |
| 6.4.3 单克隆细胞株筛选 |
| 6.4.4 单克隆抗体性质鉴定 |
| 6.4.5 胶体金试纸条的建立与优化 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）重组酶介导的核酸等温扩增技术快速检测棘球绦虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 棘球绦虫与棘球蚴病检测技术 |
| 2.1 病原学检查 |
| 2.2 影像学诊断 |
| 2.3 免疫学诊断 |
| 2.4 分子生物学诊断 |
| 3 研究目的和内容 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 研究内容 |
| 第一部分 重组酶介导的等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫方法的建立及初步应用评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 寄生虫样本及其基因组DNA来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 寄生虫材料基因组DNA验证 |
| 2.2.3 引物设计与筛选 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 RAA反应体系的建立 |
| 2.2.6 PCR反应体系的建立 |
| 2.2.7 扩增反应条件的优化 |
| 2.2.8 RAA检测灵敏度评价 |
| 2.2.9 RAA检测特异性评价 |
| 2.2.10 不同种类标本的RAA法检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同寄生虫基因组提取验证 |
| 3.2 EgG1的引物筛选结果 |
| 3.3 RAA反应体系优化 |
| 3.4 PCR反应体系优化 |
| 3.5 RAA检测灵敏度验证 |
| 3.6 RAA检测特异性验证 |
| 3.7 样本检测 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 寄生虫样本及其基因组DNA来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 寄生虫材料基因组DNA验证 |
| 2.2.3 引物设计与筛选 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 RAA反应体系的建立 |
| 2.2.6 PCR反应体系的建立 |
| 2.2.7 扩增反应条件的优化 |
| 2.2.8 RAA检测灵敏度评价 |
| 2.2.9 RAA检测特异性评价 |
| 2.2.10 不同种类标本的RAA法检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同寄生虫基因组提取验证 |
| 3.2 Em的引物筛选结果 |
| 3.3 RAA反应体系优化 |
| 3.4 PCR反应体系优化 |
| 3.5 RAA检测灵敏度验证 |
| 3.6 RAA检测特异性验证 |
| 3.7 样本检测 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 重组酶介导的多重核酸等温扩增法鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫技术的建立及初步应用评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 寄生虫样本及其基因组DNA来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 寄生虫材料基因组DNA验证 |
| 2.2.3 引物设计与筛选 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 多重RAA反应体系的建立 |
| 2.2.6 多重PCR反应体系的建立 |
| 2.2.7 扩增反应条件的优化 |
| 2.2.8 多重RAA检测灵敏度评价 |
| 2.2.9 多重RAA检测特异性评价 |
| 2.2.10 不同种类标本的多重RAA法检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同寄生虫基因组提取验证 |
| 3.2 目的片段的扩增 |
| 3.3 多重RAA反应体系优化 |
| 3.4 PCR反应体系优化 |
| 3.5 多重RAA检测灵敏度验证 |
| 3.6 多重RAA检测特异性验证 |
| 3.7 样本检测 |
| 4 讨论 |
| 研究小结 |
| 1 主要结果 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 申请专利与发表文章 |
| 附件 |
（9）细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 建立细粒棘球蚴小鼠感染模型 |
| 2.4.2 肝脏白细胞悬液制备 |
| 2.4.3 流式细胞术检测肝脏DC细胞比例 |
| 2.4.4 流式细胞术检测肝脏MDSC及其亚型比例 |
| 2.4.5 流式细胞术检测肝脏Treg细胞比例 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 DC细胞在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 3.2 MDSC及其亚群在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 3.3 Treg细胞在肝脏白细胞中的比例变化 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细粒棘球绦虫原头节和囊液分离 |
| 2.4.2 细粒棘球绦虫原头节体外培养 |
| 2.4.3 细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离和纯化 |
| 2.4.4 透射电镜分析(TEM) |
| 2.4.5 纳米粒径跟踪分析(NTA) |
| 2.4.6 Western blotting |
| 2.4.7 外泌体总RNA的提取和纯化 |
| 2.4.8 外泌体总RNA浓度和纯度测定 |
| 2.4.9 miRNA文库构建及测序 |
| 2.4.10 全转录组测序文库构建及测序分析 |
| 2.4.11 ceRNA调控网络构建 |
| 2.4.12 荧光定量PCR (qRT-PCR)分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体的分离鉴定 |
| 3.1.1 透射电镜分析(TEM) |
| 3.1.2 纳米粒径跟踪分析(NTA) |
| 3.1.3 Western blotting检测外泌体特有蛋白标志物 |
| 3.2 外泌体源miRNAs测序结果分析 |
| 3.2.1 样本测序结果基本情况 |
| 3.2.2 PSC-ELVs和HF-ELVs中保守miRNAs鉴定 |
| 3.2.3 PSC-ELVs和HF-ELVs中miRNAs数量和表达水平分析 |
| 3.2.4 靶基因预测及其功能富集和信号通路分析 |
| 3.2.5 荧光定量PCR (qRT-PCR)验证 |
| 3.3 外泌体源lncRNAs和circRNAs表达谱分析鉴定 |
| 3.4 mRNA-miRNA-lncRNA相互作用网络 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细粒棘球绦虫原头节源外泌体的分离鉴定:同第二章内容 |
| 2.4.2 原头节源外泌体总蛋白浓度测定 |
| 2.4.3 小鼠骨髓来源的DC体外培养 |
| 2.4.4 外泌体内化实验 |
| 2.4.5 miRNA功能获得性和缺失性研究 |
| 2.4.6 BMDC总蛋白制备 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.4.8 ELISA |
| 2.4.9 BMDC总RNA提取 |
| 2.4.10 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.4.11 流式细胞术检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PSC-ELVs总蛋白含量 |
| 3.2 BMDC纯度鉴定 |
| 3.3 BMDC摄取原头节源外泌体 |
| 3.4 原头节源外泌体转运miRNAs至BMDC |
| 3.5 转录水平原头节源外泌体活化BMDC |
| 3.6 原头节源外泌体诱导BMDC产生炎性因子 |
| 3.7 原头节源外泌体诱导BMDC表面标志物表达水平的改变 |
| 3.8 原头节外泌体源miR-277a-3p和miR-4989-3p诱导BMDC上调炎性因子表达 |
| 3.9 miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在靶基因 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章及申请专利 |
| 附件 |
（10）绵羊肝片吸虫人工感染模型的建立及其血浆代谢组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肝片吸虫病 |
| 1.1.1 肝片吸虫的生活史 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行病学 |
| 1.1.3 片形吸虫病的诊断 |
| 1.2 代谢组学 |
| 1.2.1 代谢组学的常用平台 |
| 1.2.2 代谢组学在寄生虫学领域的应用 |
| 1.2.3 基于代谢组学的疾病诊断研究 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 2 人工感染模型的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 虫卵的收集 |
| 2.2.2 中间宿主的感染和饲养 |
| 2.2.3 绵羊的感染 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 虫体和虫卵的鉴定 |
| 2.3.2 小土窝螺感染结果 |
| 2.3.3 绵羊感染囊蚴结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 小土窝螺的采集与饲养管理 |
| 2.4.2 虫卵的孵化及囊蚴的收集 |
| 2.4.3 肝片吸虫囊蚴的感染模型动物的选择 |
| 2.5 小结 |
| 3 绵羊血清生化分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验仪器 |
| 3.1.2 主要实验耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 绵羊血浆代谢组学分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要实验仪器 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 血浆的采集和保存 |
| 4.2.2 血浆样品代谢物的检测 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血浆样品检测结果 |
| 4.3.2 数据分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 差异代谢物的筛选 |
| 4.4.2 代谢通路分析 |
| 4.4.3 诊断标志物的筛选 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 6 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、山羊实验感染肝片吸虫的血清IgG水平动态观察（论文参考文献）
- [1]基于GAPDH、Catl-1两种重组蛋白的绵羊肝片吸虫病间接ELISA和胶体金试纸条诊断方法的建立[D]. 孙益春. 东北农业大学, 2021
- [2]食源性吸虫的分子鉴定与快速诊断试条的研制及评价[D]. 何婷. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [3]片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立[D]. 龚静芝. 扬州大学, 2021
- [4]朝阳市某羊场寄生虫病流行病学调查及防治措施研究[D]. 张雪. 内蒙古农业大学, 2020(06)
- [5]大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究[D]. 盛兆安. 广西大学, 2020
- [6]青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查及西藏螺内寄生虫鉴定[D]. 周磊. 西藏大学, 2020(12)
- [7]多肽类抗生素、吩噻嗪类和新型“瘦肉精”等兽药的免疫快速检测方法研究[D]. 那冠琼. 江南大学, 2020(12)
- [8]重组酶介导的核酸等温扩增技术快速检测棘球绦虫的研究[D]. 周鸿让. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [9]细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA谱鉴定及作用于树突状细胞的功能与机制研究[D]. 张小凡. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [10]绵羊肝片吸虫人工感染模型的建立及其血浆代谢组学分析[D]. 曾敏浩. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
标签：基因合成;