一、冠瘿组织中Nopaline合酶的定量研究——Ⅰ.不同植物冠瘿株中Nopaline合酶的定量比较（论文文献综述）
杨绪勤[1]（2014）在《黄瓜果瘤和果实无光泽性状基因的定位与功能分析》文中认为黄瓜（Cucumis sativus L.;2n=2x=14）属于葫芦科（Cucurbitaceae）家族，是世界上非常重要蔬菜作物之一。果刺和果瘤一起构成了黄瓜果实的刺瘤性状，按果瘤性状可将黄瓜果实分为有果瘤和无果瘤两种类型，由于消费者对黄瓜有无果瘤的外观性状存在不同的喜好，因此果瘤性状影响着黄瓜的市场价值。模式作物拟南芥、水稻，以及甜瓜、西瓜和冬瓜等常见的葫芦科作物不具有果瘤性状，目前关于黄瓜果瘤性状形成的机制还不清楚。遗传分析表明，果瘤性状是单基因Tu（Tuberculate fruit gene）控制的显性性状。根据以前对Tu基因初步定位研究结果和已经公开的黄瓜基因组序列，本研究开发了332个SSR标记和20个SNP标记用于Tu基因的精细定位。使用2808株F2（S06×S52）大群体，利用图位克隆技术将Tu基因定位于第五染色体物理距离41.6kb区间内，该候选区域含有两个候选基因，分别是编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Csa016922和C2H2锌指蛋白基因Csa016861：Csa016922序列在两亲本S52（有果瘤）和S06（无果瘤）之间没有任何差异，呈现出100%序列同源性；而Csa016861基因序列在两亲本S52和S06呈现很大差异，S06共缺失4888bp片段，即S06完全缺失Csa016861，包括其启动子和CDS区。在Csa016861基因的启动子和CDS区域分别设计显性标记TY-1和TY-2，检测94个来自于世界各地的黄瓜品种，发现在38个有果瘤品种均存在Csa016861，同时56个无果瘤品种均缺失Csa016861，初步认为Csa016861是Tu的候选基因。另外，开发的两个显性标记TY-1和TY-2均可用于黄瓜果瘤性状的分子标记辅助选择育种。使用S06品种半脱壳的3082个子叶节作为外植体和构建好的过量表达载体pBI121-35S-Tu，通过农杆菌GV3101浸染法，进行黄瓜遗传转化实验。阳性转化苗果实呈现出果瘤性状表型互补的现象，验证了Csa016861就是Tu基因，控制果瘤性状。Tu基因仅含有一个外显子，CDS区编码的213个氨基酸序列中含有植物C2H2型锌指蛋白特有的高度保守的一段氨基酸序列QALGGH，因此，Tu是编码C2H2型锌指蛋白的基因。Southern杂交实验显示，Tu基因在黄瓜基因组中以单拷贝形式存在。瞬时转化烟草实验结果表明，Tu主要定位于细胞核中，符合转录因子特征。通过定量RT-PCR，半定量RT-PCR及mRNA原位杂交，发现在果瘤发育过程中，Tu基因在果瘤上面的刺部位特异性表达。在无毛无瘤突变体gl中，尽管存在Tu，但Tu基因并不能表达，说明无毛基因gl对Tu起到隐性上位的作用。这些研究结果同时也说明果刺（毛）是黄瓜果瘤形成的前提条件。本研究可以解释黄瓜果实有果瘤肯定有刺，有刺不一定有瘤，无刺肯定无瘤的现象。通过对黄瓜果实不同部位细胞分裂素（CTK）的含量比较分析，确定果瘤性状的形成与CTK高含量有关，CTK加快细胞分裂而导致细胞数目增多的结果。本研究分析了开花前2天（果瘤起始时期）S06转基因植株果实刺瘤部位和S06果实表皮的基因表达谱，发现Tu基因很可能调控CTK通路（No. ko00908）上的两个上游CTK-羟化酶基因Csa5M644580和Csa5M224130，因此Tu基因很可能调控CTK的合成。另外，甜瓜的Tu同源基因（No: MELO3C005347）在甜瓜果实中不能表达，导致无瘤甜瓜的形成，为Tu基因能够调控黄瓜果瘤性状提供了更多的证据。本研究还分析了Tu基因的进化特点，发现黄瓜Tu基因很可能是拟南芥ZFP6的直系同源基因。最后，本研究提出了黄瓜果实刺瘤性状形成的遗传网络机制。果实光泽性状也是黄瓜非常重要的外观性状之一，影响着黄瓜的市场价值。通过对光泽性状的多个群体的遗传分析表明，黄瓜无光泽性状为单基因D （dull fruit skin gene）控制的显性性状。本研究通过检测第五染色体的66个已经发表的分子标记，发现有46个分子标记在定位亲本S94（无光泽）和S06（有光泽）间呈现多态性。进一步通过群体分离法分析法（BSA），发现11个标记与D/d基因紧密连锁。使用216株F2（S06×S94）分离群体，将D/d基因初步定位于SCZ69标记和SSR16203标记之间，遗传距离分别为0.3cM和0.6cM，这两个标记之间物理距离为422.8kb。根据这422.8kb候选序列，总共开发了155个SSR标记，其中8个SSR标记在S94和S06间呈现出多态性。使用842株F2（S06×S94）分离大群体，将标记获得的分离数据与田间性状数据整合，构建了D/d基因的精细定位图谱，D/d被定位于新开发的SSR标记SSR37和SSR112之间，物理距离为244.9kb，该区间含有31个候选基因。通过半定量RT-PCR分析，确定D候选基因为Csa016880、Csa016887或Csa016899。与D/d位点紧密连锁的2个共显性标记SSR37和SSR112，对72个黄瓜品种进行检测，结果表明SSR37和SSR112这两个标记均可用于黄瓜果实光泽性状的分子标记辅助选择育种。本研究为D/d的最终克隆奠定了良好的基础。
王小敏[2]（2012）在《玉米SKIP同源基因ZmSKIP的克隆及在非生物胁迫中的功能分析》文中提出在农作物的栽培中，非生物胁迫是限制植物生长及产量的主要因子。玉米是集粮食、饲料和工业原料于一体的我国第二大粮食作物，在国家粮食安全及国民经济发展中占有举足轻重的地位。干旱缺水、土壤盐渍化等非生物胁迫已经成为我国许多地区玉米生产的主要限制因素，直接影响着玉米的生长及产量。传统的抗逆育种存在着周期长、费时费力的不足，而利用基因工程技术可以将抗逆基因导入植株提高植物对非生物胁迫的抗性已经具有广泛的应用。因此发掘玉米中抗非生物胁迫的基因并利用基因工程改造玉米是提高玉米在非生物胁迫下稳产或减产少的有效途径。近年来，已有报道前体mRNA（pre-mRNA）剪切因子能够响应非生物胁迫并提高非生物胁迫的抗性。在本研究中，我们在玉米中克隆了一个pre-mRNA剪切因子SKIP同源的基因ZmSKIP，并且研究了它在逆境中的功能，为玉米抗逆基因工程育种提供重要的参考。主要结果如下：1、ZmSKIP编码一个含有609个氨基酸的蛋白。对蛋白保守结构域的分析结果显示ZmSKIP具有SNW/SKIP蛋白特有保守的S-N-W-K-N序列，与水稻中的SKIP基因同源性高达85%。ZmSKIP具有一个核定位序列。根据其核酸序列分析，在玉米基因组中，SKIP基因只有一个拷贝。通过生物信息学分析，ZmSKIP是SNW/SKIP共剪切基因的同源蛋白。2、ZmSKIP转录受干旱、高盐、ABA（Abscisic Acid）的诱导。在ZmSKIP启动子驱动GUS基因表达的转基因烟草中，GUS染色表明GUS在测试的各组织中都有表达，尤其在幼嫩的叶片中表达强烈。GUS酶活性荧光测定结果表明在NaCl、甘露醇、PEG（Polyethylene Glycol）和ABA的处理条件下表达明显增强。3、为了证实ZmSKIP蛋白的亚细胞定位，构建了CaMV35S：ZmSKIP：：GFP融合表达载体，并转化烟草原生质体，激光共聚焦显微观察结果显示ZmSKIP定位于细胞核。4、为进一步确定ZmSKIP基因的功能，构建了CaMV35S启动子驱动ZmSKIP的表达载体并转化烟草。在含有300mM甘露醇、200mM NaCl和0.1mM ABA的MS培养基中，转基因烟草的根生长受到的抑制较少。在干旱、高盐和ABA处理条件下，土壤中生长的转基因植株表现出了明显的抗性。5、在逆境处理条件下测定了超表达ZmSKIP转基因烟草T1代植株和野生型烟草植株的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase， CAT）、过氧化物酶（Peroxidase, POD）的活性和丙二醛（Malondialdehyde， MDA）含量以及相对电导率（Relative Electrical Conductivity,REC）。结果表明，在干旱、甘露醇、NaCl和ABA处理条件下，相对于野生型烟草，转基因烟草表现出较高的抗氧化酶活性和较低的相对电导率（伤害率）和MDA含量。6、采用荧光定量PCR方法测试了在甘露醇、NaCl和ABA处理12小时的植株中的逆境相关基因的表达量，结果也显示，相对于正常条件下生长的烟草，超表达ZmSKIP转基因植株在甘露醇、NaCl和ABA处理12小时条件下，CAT基因表达均明显上调。对于APX基因，转基因烟草在处理后都有上调，而野生型烟草则是下调。对于PR5基因，野生型烟草在处理后出现下调，转基因烟草在甘露醇处理条件下有明显上调。7、在外源水杨酸（Salicylic Acid, SA）处理条件下，GUS酶活荧光定量分析以及生理生化指标和植物表型分析表明，与野生型烟草相比，超表达ZmSKIP转基因烟草并没有表现出明显的差异。ZmSKIP对于外源水杨酸也没有表现出明显的诱导。以上结果表明，在烟草中超表达ZmSKIP能够提高植株非生物胁迫抗性，ZmSKIP基因能作为一个很好的候选基因应用于提高转基因植物抗性。
曾原飞[3]（2012）在《Hpt为选择标记中国水仙遗传转化体系的建立及导入LYCB基因研究》文中提出中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）属于石蒜科水仙属，多年生单子叶球根花卉，是多花水仙的一个变种。作为我国十大传统名花之一的水仙，花清香淡雅，雕刻造型独特，花期正值春节而深得广大百姓喜爱，素有“凌波仙子”雅称。但存在花色单一，品种缺乏，繁殖周期长，品种退化严重等问题，严重制约产业的进一步发展，同时中国水仙为三倍体，难以采用常规杂交育种方法进行品种改良。转基因技术将为中国水仙品种创新提供新的途径。本研究以福建漳州水仙‘金盏银台’的花葶为材料，以hpt基因为选择标记，优化转化条件，建立以花葶为受体材料的遗传转化体系；构建水仙LYCB基因的植物表达载体，将LYCB基因导入中国水仙花中，获得再生植株。探索利用基因工程手段培育水仙花色新品种。主要研究结果如下：1.以hpt基因为选择标记、水仙花葶为外植体的中国水仙遗传转化体系的建立。通过对影响转化的各种条件的优化，建立中国水仙花葶以hpt基因为选择标记的高效遗传转化体系。实验结果表明优化的转化程序为：花葶预培养6d，侵染的农杆菌菌液OD600值为0.5，侵染时间为10min，在附加有浓度为100μm·L-1乙酰丁香酮的共培养培养基中培养3d，选择压为潮霉素10mg·L-1，延后5d筛选；筛选培养基中加入5mg·L-1BA+0.3mg·L-1NAA能提高分化率；经GUS染色和PCR检测，转化率达到11.11%。2. LYCB基因表达载体的构建及导入中国水仙的研究用双酶切将pCAMBIA1301的GUS切除，将中国水仙LYCB基因连接在GUS基因的位置，构建pC1301-LYCB植物表达载体，在建立转化体系的基础上，将中国水仙LYCB基因导入中国水仙中获得抗性植株。
张艳华[4]（2011）在《根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究》文中研究说明申克氏孢子丝菌（Sporothrix schenckii）是一种双相型病原真菌,引起人和动物的孢子丝菌病（Sporotrichosis）。本研究首次成功建立了根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌JLCC32757遗传转化体系,并探讨了影响转化效率的主要因素。该转化体系效率达600个转化子/106个分生孢子,可在短期内获得大量T-DNA（Transfer DNA）插入突变体,且这些突变体有丝分裂稳定。已获得突变菌株2130株,初步建立了小范围的申克氏孢子丝菌T-DNA标签的突变体库,并得到了一些生长、发育、代谢等表型发生改变的突变体,为揭示申克氏孢子丝菌分子机理、探讨致病机制等奠定了坚实的基础。申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变体的分子分析表明,T-DNA已插入到申克氏孢子丝菌基因组中,其中87%为T-DNA单拷贝插入,13%为T-DNA多拷贝插入,利用TAIL-PCR即可获得T-DNA插入位点的侧翼序列,表明根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌遗传转化是一种有效的插入突变策略,是进行申克氏孢子丝菌功能基因组学研究的有力工具。筛选申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变体,获得产色素缺陷菌株JLCC32757-M2013。与野生型相比,该菌株失去产色素的能力,其菌丝、分生孢子形态均发生明显改变。分子分析表明,T-DNA以单拷贝插入到申克氏孢子丝菌类泛素结合酶E2基因（SsUBCc）,破坏菌体内类泛素结合酶E2基因的正常表达,导致SsUBCc基因和色素合成相关基因在转录水平的表达量降低,菌株毒力下降。以突变株JLCC32757-M2013的SsUBCc基因为参照,PCR扩增模板DNA结果表明,50ng/μl模板DNA稀释1600倍时,仍能获得清晰的PCR扩增产物,含有400个突变体的DNA池的模板核酸浓度足以保证每个突变体PCR扩增的需要。由此以每100个突变体为单位,构建了21个突变体池和DNA池,既保证实验的可靠性又方便从突变体库中筛选靶基因突变的菌株,为充分利用T-DNA插入突变体库进行申克氏孢子丝菌反向遗传学研究提供技术支持。
于丽萍[5]（2010）在《玉米种子胚特异性启动子emb5的功能分析》文中指出通过基因工程技术,将目的基因片段在特定的组织中以一定的表达量表达,以提高作物对盐碱、干旱等非生物胁迫与病、虫害等生物胁迫的抗性,或改良作物农艺性状或品质等,已成为现在作物品种改良的一种重要手段。而如何控制目的基因片段在特定时期、特定组织中高效表达,是目前限制基因工程技术在作物遗传改良中更有效应用的重要因素。除克隆更有效的目的基因片段外,作为基因表达调控关键元件之一的启动子的获得已成为作物基因工程改良中亟待解决的问题。启动子有组成型启动子（constitutive promoter）、组织特异性启动子（tissue-specific promoter）和诱导型启动子（inducible promoter）三种。迄今为止,植物表达载体中应用最广泛的是以CaMV 35S为代表的组成型启动子,最大优点是活性高,缺点是导致外源基因在转基因植物的几乎所有发育阶段的不同部位都表达,不但会增加细胞内物质和能量的负荷,有时还会引起植物的形态发生改变,影响植物的生长与发育。而采用组织特异性启动子可有效地控制外源基因在特定的组织或器官中表达,减少基因产物对受体生物及环境产生副作用。然而遗憾的是,虽然已相继克隆到许多组织特异启动子,但还没有一种组织特异性启动子能像CaMV 35S一样在作物基因工程改良中得到广泛的应用。2006年,Kriz等（2006）克隆到了玉米Emb5基因启动子emb5的1653bp序列,并将其作为一种玉米胚特异性启动子申请专利（Patent No:US 7,078,234 B2）,但是未对emb5启动子进行详细的结构功能分析,至今也未见有这方面研究报导文献。本研究拟在对玉米胚特异性启动子emb5的组织特异性和活性进一步分析鉴定的基础上,对其与胚特异性相关的核心序列结构区域及相关顺式作用元件进行分析鉴定,为通过系统改造获得一个启动活性更强、序列长度更短、易于操控、具有广泛应用价值的胚特异启动子奠定基础。本研究以玉米自交系Qi319为材料,提取基因组DNA,通过PCR技术从中扩增出1653bp的emb5启动子序列。测序结果表明,仅有8个碱基发生突变,与已报道得序列同源性达到99.52%。序列分析表明,emb5的1653bp序列中含有高等植物启动子所特有的基本核心序列TATA-box和CAAT-box,并含有1个真核启动子基本调控元件GC盒,2个种子特异表达调控元件G-box和Skn-1-motif （GTCAT）;并多次出现可能增强种子特异表达作用的A-box（CCGTCC）序列和其它如响应激素、光信号等的顺式作用元件等。由于玉米基因转化困难,生长周期长,作为系统分析鉴定emb5启动子功能的研究材料不太现实,所以寻找一种模式植物作为替代研究材料是必需的。由于缺乏易转化、生长周期短、遗传背景相对简单、清楚的单子叶植物模式材料,所以我们想首先验证一下来源于单子叶植物的玉米胚特异性启动子emb5,是否能在双子叶模式植物拟南芥中具有相似的胚特异活性,以便以模式植物拟南芥作为分析emb5启动子结构功能的研究材料。为此,我们分别以emb5和CaMV 35S为启动子,构建了以GUS为报告基因的植物表达载体pBI121,通过Floral-dip法转化拟南芥。对转基因拟南芥GUS活性的组织化学染色分析与GUS活性的组织荧光定量测定分析显示,emb5仅在转基因拟南芥种子胚发育的中后期高效表达,启动GUS表达活性显着高于CaMV 35S,而在根、茎、叶、花中检测不到表达。结果表明emb5在单、双子叶植物中都具有较高的胚特异活性。因此,在生物信息学分析基础上,通过对全长emb5启动子5′-逐步缺失的方法,获得7段不同长度的启动子片段,分别命名为pA（-1143bp-1bp）,pB（-956bp-1bp）,pC（-732bp-1bp）,pD（-523bp-1bp）,pE（-331bp-1bp）,pF（-251bp-1bp）和pG（-127bp-1bp）,均连接GUS作为报告基因,借助植物表达载体pBI121,转化拟南芥,对emb5启动子的核心序列区域进行分析鉴定,结果如下:1、GUS活性的组织化学染色分析显示,最短的片段pG（-127bp-1bp）完全丧失了启动子的活性,其余6个片段仅在转基因植株种子胚发育中后期检测到GUS活性。在成苗时期的根、茎、叶和花组织中均没有检测到GUS活性。这些结果清楚地表明emb5启动子中与胚特异活性相关的核心序列区域位于-1653 bp -127 bp之间。2、转基因植株种子胚发育后期GUS活性的组织荧光定量测定分析显示:（1）5′端缺失到emb5的约2/3时,片段（即pD）活性与全长启动子活性基本相同,而其余片段的启动子活性随着5′端的逐步缺失而逐渐降低;（2）emb5缺失510bp（-1653bp-1143bp）区域后（即pA）活性与pD缺失192bp（-523bp-331bp）区域后（即pE）活性都显着降低,表明-1653bp-1143bp和-523bp-331bp区域可能分别含有增强启动子活性的顺式作用元件;（3）pC片段缺失209bp（-732bp-523bp）区域后（即pD）活性反而显着增强,表明在-732bp-523bp区域可能存在抑制启动子活性的负调控元件。以上研究分析表明,emb5启动子在单子叶与双子叶植物中都具有较高的胚特异活性,而且emb5启动子5′端缺失约2/3后的片段（即pD）虽然只有500多碱基,但具有与全长启动子几乎相同的胚特异启动子活性。这意味着相对于全长1653bp的emb5启动子,短小的pD,不但更利于基因工程操作,而且由于去掉了许多已知与未知调控元件,减少了在转基因植物中可能被众多调控因子调控的干扰。因此更有可能成为作物遗传改良中理想的单、双子叶植物都适宜的胚高效特异启动子。
杨晓杰[6]（2010）在《转基因棉花中T-DNA整合特征研究》文中认为整合的外源基因以低拷贝数时能较稳定的遗传表达;然而,无论是花粉管通道注射和基因枪轰击,还是根癌农杆菌介导的棉花遗传转化体,都普遍存在整合有3个以上转基因拷贝的转化体。因此,无论是基于育种应用的角度,还是研究转基因整合特征,分析转基因植物外源基因的拷贝数均为基础步骤。本文首次采用基因表达定量分析的PfaffI法应用于外源基因拷贝数的研究,并利用该方法对三种方法转化棉花的外源基因拷贝数做了比较研究。外源基因的整合是随机分布在染色体的不同区域里。我们认为,外源基因在受体基因组整合的随机分布这一特征并不能被认为受体基因组中T-DNA整合位点碱基序列或结构上的任意性。对整合到受体基因组T-DNA,往往伴随有T-DNA自身或受体基因组DNA的重复、缺失及倒置等现象,但有关文献多集中在模式植物中。因此,本文主要对根癌农杆菌介导的棉花转化体T0代单株的T-DNA整合特征做了较为深入的研究。全文研究结论如下:1) PfaffI法在分析转基因棉花中整合T-DNA拷贝数的应用:本文首次采用分析基因表达研究用的实时定量PCR中的PfaffI法分析转基因棉花中整合外源基因拷贝数。与Southern Blot杂交结果比较表明,该法的分析结果等于或高于后者。考虑到Southern Blot法研究转基因拷贝数最重要缺陷,相比较而言,PfaffI法能够更加真实地鉴定出外源基因的拷贝数。2)三种转化方法转化棉花中整合T-DNA拷贝数的差异:根癌农杆菌介导、基因枪轰击和花粉管通道注射转基因当代群体中外源基因拷贝为1-2的植株比例分别是26.2%,60%和42.8%。且根癌农杆菌介导的转基因群体中,高达27.3%的株系整合的外源基因在5拷贝以上,而基因枪轰击和花粉管通道注射法转基因群体中则没有5拷贝以上转基因植株。3)转基因棉花中载体骨架的整合和T-DNA的缺失及剪辑位点的碱基组成:在转基因棉花中, T-DNA左、右臂均有存在载体骨架序列的整合和T-DNA边界及边界内侧的缺失等现象。T-DNA左臂剪辑位点为A或T的比例占89.5%;而右臂剪辑位点为G的比例分别占87%。4) T-DNA在转基因棉花基因组的分布:T-DNA在棉花基因组中的整合位点可以分为蛋白编码区序列、质粒来源DNA序列、微卫星序列、转座子和拟转座子序列、35S启动子序列及未知序列等六大类。T-DNA在棉花基因组中的整合位点没有明显的染色体区域偏爱性,但棉花基因组中与T-DNA的右臂附近区域序列“同源”的基因组序列很可能是T-DNA整合的热点序列。
张萍[7]（2009）在《杨树抗杨四瘿螨抑制消减文库构建及表达谱分析》文中指出杨四瘿螨[Tetra lobulifera （Keifer）]为世界性分布的杨树重要害螨,在我国为一新纪录种,国内尚无对该螨的详细报道,杨四瘿螨为其暂定中文名。本实验对杨四瘿螨生物学特性做了初步研究。在相同立地条件下,随着杨四瘿螨危害程度的加剧,寄主的生长势被削弱且受害越严重的杨树,其侧枝发达,主干生长缓慢。采用抑制性消减杂交技术（SSH）,以杨四瘿螨诱导48、72h的美洲黑杨无性系为实验方（tester）,以未经诱导的美洲黑杨无性系为驱动方（driver）构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库,共获得了710个克隆,测序拼接得到496条有效EST序列。通过BLAST对比分析,获得了一批涉及胁迫响应、信号传递及能量代谢等功能的差异基因。通过Realtime-PCR技术对候选基因进行了表达分析,有10个候选基因在4个时间点表达量有明显上升的趋势。运用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术克隆获得两个候选基因的全长序列,命名为PtWRKY和PtERF。PtWRKY cDNA序列全长为2053bp,编码588个氨基酸的开放阅读框（ORF）,具有2个WRKY基因典型的结构域;PtERF为全长1074bp的序列,编码包含210个氨基酸的开放阅读框,氨基酸序列符合典型的AP2/ERF转录因子特征。构建了两个候选基因的过量表达载体,并进行杨树遗传转化,对筛选获得的植株进行PCR和实时定量检测,实验结果显示相关基因已整合到杨树基因组中。
付娟娟[8]（2008）在《萝卜春化过程中的生理生化变化及开花基因LFY的克隆》文中研究指明中国萝卜（Raphanus sativus L.var. longgpinnatus Bailey）是原产于中国的一种重要蔬菜,我国萝卜种植面积在120万ha左右,位居各种蔬菜种植面积的前三位。目前,限制萝卜周年生产和均衡供应的瓶颈问题是缺乏耐抽薹萝卜种质,这也是生产中经常出现先期抽薹而造成重大损失的根本原因。因此,探明萝卜耐抽薹机制,将分子育种技术与传统育种技术有机的结合起来,创新萝卜耐抽薹种质,对加速我国萝卜育种进程具有重要理论和实践意义。本试验研究了萝卜春化过程中生长点的生理生化变化、萝卜高效遗传转化体系的建立,并克隆了开花关键基因LFY。主要试验结果如下:（1）低温处理过程中,抽薹性差异较大的两个品种短叶十三和长春大型可溶性蛋白、游离氨基酸、可溶性糖含量变化趋势基本一致。可溶性蛋白、游离氨基酸含量总体表现为逐渐升高的趋势,而可溶性糖含量则呈下降趋势。耐抽薹的萝卜品种长春大型,其可溶性蛋白和可溶性糖含量明显低于短叶十三,游离氨基酸含量则相反。两品种赤霉素（GAs）、生长素（IAA）的含量在花芽分化开始时均有较明显的峰值,在处理后期又出现另一明显峰值。（2）通过对影响转化效果的诸因素的研究,初步筛选出适宜萝卜品种短叶十三真空渗入的遗传转化体系:真空渗入时间为104pa负压条件下连续处理10 min,菌液浓度OD600为0.81.2,渗入培养基为1/2MS无机+B5有机+6-BA 0.04 mg·L-1+AS 19.6 mg·L-1,在蕾期对花蕾进行真空渗入。（3）以萝卜品种短叶十三的花蕾为材料,通过RT-PCR的方法,克隆了开花关键基因LFY部分cDNA序列,和已公布的大白菜LFY基因具有93%以上的同源性,将此序列以相反方向先插入到分子量较小（2686 bp）的中间载体pUC19上,并在两片段之间插入小麦乙酞辅酶A的第20个内含子,再将连接好的三个片段酶切后插入到植物表达载体pROK2 35S启动子之后,从而构建了双元dsRNA抑制载体,并通过真空渗入遗传转化法转入到弱冬性萝卜短叶十三试材中。
于恒秀[9]（2007）在《利用转基因技术改良水稻抗性和品质的研究》文中研究说明水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球约二分之一的人口以稻米为主食,传统的遗传育种方法在提高水稻产量、抗性和品质方面已作出了重要贡献,但由于稻属种质资源的限制及常规育种方法的局限性,给水稻进一步的遗传改良带来一定困难。随着分子生物学研究的深入,基因的分离、克隆和重组技术以及转基因技术的日趋成熟,遗传转化已成为水稻遗传改良的一种有效手段。抗虫、抗病和抗除草剂转基因水稻的培育可为水稻的高产与稳产提供重要保证,也可减少化学农药的使用,改善环境质量。通过调控淀粉合成相关基因的表达,可以改良稻米的淀粉品质,以提高其食味品质或加工品质。本研究重点利用转基因技术进行水稻改良的研究,主要研究内容包括两大方面。一是将不同来源的抗虫、抗病和抗除草剂基因,包括苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）毒蛋白cryIA（c）基因、雪花莲凝集素（Galanthus nivalis agglutinin, GNA）基因、甜椒编码类铁氧还原双亲蛋白（Amphipathic protein 1, AP1）基因和土壤吸水链霉菌（bialaphos resistance, Bar）抗除草剂基因,导入4个高产粳稻品种广陵香粳、武香粳9号、武香9915和扬辐粳8号中,研究抗病、抗虫和抗除草剂转基因水稻,特别是含有不同目的基因组合的多抗转基因水稻的培育方法,二是,将控制直链淀粉合成的水稻蜡质（Waxy,Wx）基因的不同转基因构建,包括其全长基因组序列（简称全长Wx基因）、Wx-cDNA和反义RNA结构（简称反义Wx基因）,导入具有不同直链淀粉含量的水稻品种协青早、龙特甫、武香粳9号、武香9915、苏御糯和广陵香糯等中,研究调控蜡质基因表达对改良稻米品质的效果,在此基础上进一步获得具有优良食味品质或特高直链淀粉含量的水稻新品种（系）。主要研究结果如下:1、转Bt基因水稻。通过双菌双载体或超双元载体介导的农杆菌介导共转化法,将Bt cryIA（c）基因和潮霉素抗性选择标记基因（HPT）同时导入粳稻品种武香粳9号和广陵香粳中,从其自交后代中筛选获得了无HPT基因的转Bt基因水稻材料。抗虫性鉴定结果表明,转Bt基因水稻对稻纵卷叶螟和二化螟的抗性较未转化对照有了明显提高,具体表现为:稻纵卷叶螟对转Bt基因水稻离体叶片的危害程度明显小于未转化对照,转Bt基因水稻离体叶片上的稻纵卷叶螟幼虫全部死亡;二化螟高龄虫对分蘖期转Bt基因水稻离体茎杆危害程度明显小于未转化对照,转Bt基因植株茎杆上只有少量的螟虫排泄物;二化螟幼虫在苗期转Bt基因水稻上死亡率达到100%,较未转化对照有明显提高;二化螟造成的成株期转Bt基因水稻的枯心率明显低于未转化对照,部分转化子对二化螟的抗性由未转化对照的高感上升为抗或中抗级别;在不施用任何农药的田间自然条件下,转Bt基因水稻表现为无稻纵卷叶螟危害,未转化对照的受害率达100%。2、转AP1基因水稻。通过超双元载体介导的农杆菌共转化法,将AP1基因和HPT基因同时导入粳稻品种武香粳9号、广陵香粳中,从其自交后代中筛选获得了含有AP1基因而无HPT基因的水稻。抗病性鉴定结果表明,转AP1基因水稻叶片上白叶枯病病斑长度均极显着小于未转化对照,广陵香粳转基因水稻的抗性级别由未转化对照的中抗上升为抗;转AP1基因水稻虽然与未转化对照对纹枯病的抗性级别均为中感,但相对病班长度均显着或极显着地小于未转化对照;大部分转AP1基因水稻对稻曲病的抗性较未转化对照有所提高。3、转GNA和Bar基因水稻。以粳稻品种广陵香粳、武香9915和扬辐粳8号为材料,以同时含有GNA和Bar基因的双元载体EHA105/pCUGNA-BAR介导的转化法,将GNA和Bar基因导入以上受体品种中,通过除草剂抗性鉴定和PCR分析,筛选获得了同时含有Bar基因和GNA基因的纯合转基因水稻。抗性鉴定表明,褐飞虱在转基因水稻上的进食量显着低于未转化对照和感虫对照品种台农本地1号（TN1）,褐飞虱在转基因水稻上的繁殖率亦显着低于未转化对照,即转基因水稻对褐飞虱的进食量和繁殖率有明显的抑制作用;转基因水稻4901-1苗期对褐飞虱的抗性达到了中抗水平,较未转化对照扬辐粳8号的感虫水平有了明显提高。4、聚合多个抗性基因培育多抗转基因水稻。利用双菌双载体介导的共转化,将AP1基因、Bt基因和HPT基因同时导入粳稻品种广陵香粳中,并将其与同时含有GNA和Bar基因的转基因水稻杂交,从其自交后代中筛选获得了同时含有两个、三个或四个目的基因、但无HPT基因的多种类型的多价转基因水稻材料。通过抗性鉴定试验表明,这些多价转基因水稻表现出预期的抗病和/或抗螟虫和/或抗飞虱和除草剂的多抗特性,具体表现为:（1）含AP1基因的多价转基因水稻对白叶枯病（KS-1-20）的抗性级别与只含AP1基因的单价转基因水稻的抗性级别相同,均由未转化对照的中抗上升为抗病水平,但多价转基因水稻的病斑长度较只含AP1基因的单价转基因水稻有极显着地减小,且GNA基因和Bar基因对白叶枯病抗性的提高程度要大于Bt基因;用4个白叶枯病菌种混合后接种,同样表现为GNA基因和Bar基因可提高含AP1基因转基因水稻对白叶枯病的抗性;含AP1基因多价转基因水稻对纹枯病的抗性级别由未转化对照的中感上升为抗病,且GNA和Bar基因对纹枯病的抗性的提高程度大于Bt基因;（2）含Bt基因的多价转基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟抗性较未转化对照有了明显提高,具体表现为,稻纵卷叶螟对含Bt基因的多价转水稻离体叶片的危害程度明显小于未转化对照,含Bt基因的多价转水稻离体叶片上的稻纵卷叶螟幼虫全部死亡;含Bt基因的多价转水稻对二化螟的抗性由未转化对照的高感上升为抗或中抗级别;在不施用任何农药的田间自然条件下,含Bt基因的多价转基因水稻表现为无稻纵卷叶螟危害,未转化对照的受害率达100%;（3）褐飞虱取食含GNA基因的多价转基因水稻后排泄的蜜露量均较未转化对照和感虫对照品种TN1有极显着的减少,含GNA基因的不同多价转基因水稻上褐飞虱排泄的蜜露量差异不显着。5、转反义Wx基因水稻及其品质分析。从通过双菌双载体或超双元载体介导的共转化获得的武香粳9号、协青早和龙特甫转反义Wx基因水稻的自交后代中,筛选获得了无HPT基因的转反义Wx基因水稻。对转反义Wx基因水稻的分析表明:（1）反义Wx基因导入水稻后,可抑制转基因水稻胚乳中内源Wx基因的表达,表现为未成熟种子胚乳中的成熟2.3-kbWx基因RNA以及未剪切的3.3-kbWx基因RNA量均较未转化对照降低,成熟种子胚乳中的Wx蛋白表达量,直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的降低,且在粳稻和籼稻中都选育获得了直链淀粉含量降低到糯性水平的转基因水稻植株;（2）直链淀粉含量降低后,对种子的其它淀粉品质性状也有明显的影响,表现为胶稠度变软;糊化温度在不同品种中表现不同,武香粳9号和协青早的转基因水稻,直链淀粉含量下降后,糊化温度变化不显着,龙特甫的转基因水稻,当直链淀粉含量明显下降后,糊化温度极显着升高;转基因水稻中的直链淀粉含量降低后对淀粉粘滞性谱（RVA）特性也有一些影响,但不同来源的转反义Wx基因水稻的表现不完全一致。当直链淀粉含量降低到糯性水平时,转基因水稻RVA谱的PKV、HPV和CPV均极显着降低;（3）当转基因水稻籽粒中直链淀粉含量极显着降低时,淀粉粒的充实情况变差;（4）转基因水稻直链淀粉含量降至糯性水平时,千粒重明显降低,最多可降低17.05%。6、转全长Wx基因水稻及其品质分析。对EHA105/p13W2介导获得的协青早、龙特甫、武香粳9号、武香9915和广陵香糯的转全长Wx基因水稻的分析表明:（1）全长Wx基因导入水稻后,大部分转基因水稻中Wx基因的表达量提高,表现为未成熟种子胚乳中的2.3-kbWx基因RNA量较未转化对照升高,成熟种子胚乳中的Wx蛋白表达量,直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的升高,糯稻、粳稻和籼稻的转基因水稻的直链淀粉含量分别可达24.92%、24.14%,和27.52%,分别较对照提高了22.91%、9.72%和2.99%,即与籼稻相比,糯稻和粳稻品种转基因水稻中升高的幅度较大;（2）直链淀粉含量提高后,糯稻和粳稻转全长Wx基因水稻的胶稠度变硬,而籼稻转全长Wx基因水稻因其直链淀粉含量变化较小,胶稠度也无显着变化;广陵香糯来源的转基因水稻的糊化温度极显着降低,而其余四个品种转基因水稻的糊化温度均未发生显着变化;不同品种的转全长Wx基因水稻的RVA谱与未转化对照相比,表现出不同的差异;（4）粳稻和糯稻的转全长Wx基因水稻的直链淀粉含量升高幅度较大时,淀粉粒的充实情况变好,籼稻的转全长Wx基因水稻,因其直链淀粉含量升高幅度较小,其淀粉粒的变化亦较小;（5）糯稻和粳稻的转全长Wx基因水稻,当直链淀粉含量提高明显时,糙米千粒重有所提高,最高可较对照增加16.89%。7、糯稻中表达Wx cDNA及其对稻米品质的影响。以双菌双载体介导的共转化法,将Wx cDNA和HPT基因同时导入到了广陵香糯和苏御糯中。对转Wx-cDNA水稻成熟种子的分析结果表明:（1）大部分转Wx cDNA水稻胚乳中的Wx蛋白表达量提高,直链淀粉含量有不同程度的提高;（2）直链淀粉含量提高后,转Wx cDNA水稻的胶稠度变硬,糊化温度的变化在不同转化子中表现不完全一致,有升高也有降低;（3）当转Wx cDNA水稻的直链含量提高时,其RVA谱的特征值PKV、HPV和CPV均较相应的未转化对照大;（5）当直链淀粉含量明显升高时,转Wx cDNA水稻的淀粉粒的充实情况变好,糙米千粒重有所提高,最高可较对照增加8.56 %。
卢碧霞[10]（2006）在《转金属硫蛋白基因水稻的特异表达及其对重金属抗性的研究》文中研究指明哺乳动物金属硫蛋白（Metallothioneins简称MTs）是一类低分子量,富含半胱氨酸的金属结合蛋白。由于其具有重金属解毒的功能,我们将小鼠金属硫蛋白基因（mMT）克隆在绿色组织特异表达启动子和组成型启动子35S的下游,构建了植物表达载体pCAMBIO1301RSmMT﹑pCAMBIO1301ASmMT和pCAMBIO130135SmMT,并将其导入农杆菌AGL0中,用农杆菌侵染法转化水稻,通过水稻植株的再生和抗生素筛选,成功的得到了转基因水稻植株。以mMT cDNA为探针对T0和T1代转基因水稻进行了Southern blot检测,证明外源基因确实整合到水稻基因组内并稳定传递到后代;以mMT cDNA为探针进行Northern blot杂交,检测到不同启动子引导的金属硫蛋白在转基因水稻的不同组织中的表达。35S组成型启动子引导的mMT在转基因水稻的根部和叶部都有mMT的表达;而绿色组织表达启动子引导的MT只在转基因水稻的叶部检测到MT的表达,在根部没有检测到MT的表达。Western blot结果证明了外源基因在蛋白质水平上的表达。为了探讨水稻金属硫蛋白（rMT）在重金属结合方面的功能﹑RNAi抑制基因表达的功效及与小鼠金属硫蛋白的功能关系,我们又克隆了水稻金属硫蛋白的三个基因并将其融合,构建了水稻金属硫蛋白RNA干涉表达载体pJRrMT1a﹑pJRMT2a﹑pJRrMT3a和pJRrMT123a,导入农杆菌GV3101中,用农杆菌侵染法转化水稻,通过愈伤组织的形成,芽﹑根的形成,用抗生素筛选,成功的得到了转基因水稻植株,通过对转基因水稻株系的T0和T1代PCR和Southern blot检测,证明外源基因确实整合到水稻基因组内并稳定地传递到后代;以水稻金属硫蛋白基因全长设计引物,以水稻ACT1作为内源参照,进行半定量RT-PCR,检测到转基因水稻mRNA有不同程度的降解。通过对不同表达系统转基因水稻T1代株系抗生素筛选分析表明,转基因水稻植株的抗生素抗性在后代中得到了保持。不同转基因株系在含有相应抗生素的水溶液中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。对转mMT基因水稻T1代株系抗重金属分析表明,转mMT基因水稻的T1和对照中花11对Cd2+的抗性有明显差异,在含有不同浓度Cd2+ （ 0～1.0mmol/L）的水溶液中转mMT基因植株生长正常,表现出了对Cd2+的高度抗耐性。而对照株在Cd2+ 0.3mmol/L的浓度下即受到毒害。原子吸收光谱测定Cd2+在转mMT基因水稻不同组织中的分布表明,特异启动子引导的mMT转基因水稻中叶部和茎中Cd2+含量明显高于根部,而35S引导的mMT转基因水稻Cd2+的含量主要在根部,叶部和茎中含量很少。Southern blot、
二、冠瘿组织中Nopaline合酶的定量研究——Ⅰ.不同植物冠瘿株中Nopaline合酶的定量比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、冠瘿组织中Nopaline合酶的定量研究——Ⅰ.不同植物冠瘿株中Nopaline合酶的定量比较（论文提纲范文）
（1）黄瓜果瘤和果实无光泽性状基因的定位与功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 黄瓜生物学特征 |
| 1.2 图位克隆及其他常见的几种植物基因克隆技术 |
| 1.2.1 图位克隆技术简介 |
| 1.2.2 图位克隆使用的 DNA 分子标记 |
| 1.2.3 作图亲本和分离群体类型的选择 |
| 1.2.4 图位克隆操作步骤 |
| 1.2.5 其他几种植物基因克隆技术 |
| 1.3 黄瓜遗传转化研究进展 |
| 1.3.1 遗传转化简介 |
| 1.3.2 常用农杆菌和转化方法 |
| 1.3.3 黄瓜遗传转化影响因素 |
| 1.3.4 转基因植株的检测及鉴定 |
| 1.3.5 农杆菌介导的黄瓜遗传转化研究进展 |
| 1.4 C_2H_2型锌指蛋白功能研究 |
| 1.4.1 C_2H_2锌指蛋白的概念 |
| 1.4.2 C_2H_2锌指蛋白基因功能 |
| 1.5 黄瓜果实果刺与表皮毛的关系 |
| 1.5.1 果刺性状有关基因 |
| 1.5.2 黄瓜叶片表皮毛与果刺结构分析 |
| 1.5.3 植物表皮毛的调控机制 |
| 1.6 黄瓜果实果瘤及光泽性状的认识 |
| 1.6.1 黄瓜果瘤性状及研究进展 |
| 1.6.2 黄瓜果实光泽性状的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.7.1 本研究的目的意义 |
| 1.7.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 黄瓜果瘤基因 Tu 的遗传分析及精细定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 黄瓜材料的种植及性状调查 |
| 2.2.3 基因组 DNA 提取 |
| 2.2.4 分子标记的开发 |
| 2.2.5 Tu 基因的精细定位 |
| 2.2.6 候选序列分析 |
| 2.2.7 多个黄瓜品种验证候选 Tu 基因 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 亲本S52和S06果实表型的形态学观察 |
| 2.3.2 黄瓜果瘤性状的遗传分析 |
| 2.3.3 初步定位候选序列拼接 |
| 2.3.4 多态性分子标记开发 |
| 2.3.5 Tu 基因的定位 |
| 2.3.6 Tu 基因的鉴定 |
| 2.3.7 显性标记 TY-1 和 TY-2 在 94 个黄瓜品种中的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 黄瓜果瘤基因 Tu 遗传转化验证与功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 Tu 基因的生物信息学分析 |
| 3.2.3 黄瓜 S52 果实总 RNA 的提取及 cDNA 第一链合成 |
| 3.2.4 Tu 基因全长的获得 |
| 3.2.5 双元表达载体构建及电击导入农杆菌 GV3101 |
| 3.2.6 黄瓜遗传转化过程 |
| 3.2.7 阳性转化苗检测 |
| 3.2.8 亚细胞核定位 |
| 3.2.9 半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR分析 |
| 3.2.10 mRNA原位杂交 |
| 3.2.11 CTK 含量测定 |
| 3.2.12 数字基因表达谱(DGE)分析 |
| 3.2.13 无毛基因 gl 与 Tu 基因的关系分析 |
| 3.2.14 甜瓜 Tu 同源基因的表达分析 |
| 3.2.15 Tu 基因的同源性比对与进化树分析 |
| 3.2.16 本章使用的引物 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 黄瓜遗传转化结果 |
| 3.3.2 Tu 基因编码 C_2H_2型锌指蛋白 |
| 3.3.3 Tu 主要定位于细胞核中 |
| 3.3.4 Tu 基因在果刺中特异性表达 |
| 3.3.5 Tu 基因的 mRNA 原位杂交分析 |
| 3.3.6 果瘤性状的形成与 CTK 含量有关 |
| 3.3.7 Tu 基因可能参与 CTK 合成 |
| 3.3.8 无毛基因 gl 对 Tu 基因存在隐性上位作用 |
| 3.3.9 Tu 同源基因在甜瓜果实中不能表达 |
| 3.3.10 Tu 基因进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 黄瓜无光泽性状的遗传分析及精细定位 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 黄瓜材料 |
| 4.2.2 黄瓜材料的种植及性状调查 |
| 4.2.3 基因组 DNA 提取 |
| 4.2.4 有光泽和无光泽基因池建立 |
| 4.2.5 分子标记的选择和标记开发 |
| 4.2.6 分子标记扩增程序 |
| 4.2.7 与D/d基因连锁标记的筛选 |
| 4.2.8 标记命名与数据采集 |
| 4.2.9 连锁分析 |
| 4.2.10 D/d候选基因的分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 有光泽/无光泽表型的形态学观察 |
| 4.3.2 黄瓜无光泽性状的遗传分析 |
| 4.3.3 D/d基因的初步定位 |
| 4.3.4 SSR标记的开发 |
| 4.3.5 D/d基因的精细定位 |
| 4.3.6 共显性标记 SSR37 和 SSR112 在 72 个黄瓜品种的检测 |
| 4.3.7 D/d 候选基因分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结和展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文与专利 |
（2）玉米SKIP同源基因ZmSKIP的克隆及在非生物胁迫中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词列表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.1.1 问题的提出 |
| 1.1.2 研究的意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 非生物胁迫对植物的影响及植物抗胁迫的机理 |
| 1.2.2 植物抗非生物胁迫的分子生物学机制 |
| 1.2.3 植物抗非生物胁迫基因工程研究进展 |
| 1.2.4 剪切因子在植物抗非生物胁迫中的作用 |
| 1.2.5 Pre-mRNA 剪切因子 SKIP 基因的研究进展 |
| 1.3 本文研究的目的和研究内容 |
| 1.3.1 本文研究的目的 |
| 1.3.2 本文研究的主要内容 |
| 1.3.3 总体技术路线 |
| 2 ZmSKIP 基因的克隆及表达分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ZmSKIP 基因的克隆及序列分析 |
| 2.3.2 ZmSKIP 基因胁迫表达模式 |
| 2.3.3 ZmSKIP 定位于细胞核 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 ZmSKIP 启动子的克隆及非生物胁迫诱导表达的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 启动子克隆及响应元件分析 |
| 3.3.2 pLP100-pZmSKIP-GUS 转基因植株 GUS 组织染色分析 |
| 3.3.3 ZmSKIP 启动子非生物胁迫诱导分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 ZmSKIP 基因的遗传转化及转基因植株鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 超表达 ZmSKIP 基因载体的构建 |
| 4.3.2 载体的转化及转基因植株的筛选 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 超表达 ZmSKIP 转基因烟草的非生物胁迫抗性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 超表达 ZmSKIP 转基因植株对非生物胁迫的形态学分析 |
| 5.3.2 超表达 ZmSKIP 植株在非生物胁迫下生理响应 |
| 5.3.3 超表达 ZmSKIP 植株改变了胁迫相关基因的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 后续研究工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（3）Hpt为选择标记中国水仙遗传转化体系的建立及导入LYCB基因研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 缩写词（续） |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 中国水仙概况 |
| 2 中国水仙组织培养研究进展 |
| 2.1 直接诱导不定芽发生途径 |
| 2.2 愈伤组织间接诱导发生途径 |
| 3 农杆菌介导单子叶植物遗传转化的研究 |
| 4 中国水仙遗传转化研究进展 |
| 4.1 花卉花色基因工程研究进展 |
| 4.1.1 类黄酮色素生物合成相关基因的研究进展 |
| 4.1.2 类胡萝卜素生物合成相关基因的研究进展 |
| 4.1.3 LYCB 基因研究进展 |
| 4.2 中国水仙花色基因工程研究进展 |
| 5 本研究意义及内容 |
| 5.1 研究意义 |
| 5.2 研究内容 |
| 第二章 以 hpt 为选择标记基因中国水仙遗传转化体系的建立 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 中国水仙花葶消毒与接种 |
| 1.3 根癌农杆菌和质粒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 培养基和培养条件 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 表达载体 pC1301 转化根癌农杆菌 |
| 2.1.1 pC1301 菌液培养及质粒提取 |
| 2.1.2 根癌农杆菌 EHA105 的培养 |
| 2.1.3 根癌农杆菌感受态细胞制备与转化 |
| 2.1.3.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.1.3.2 转化 |
| 2.1.4 pC1301 质粒导入 EHA105 的鉴定 |
| 2.1.4.1 PCR 检测鉴定 |
| 2.1.4.2 酶切鉴定 |
| 2.2 中国水仙花葶的潮霉素敏感性试验 |
| 2.3 以 hpt 为选择标记基因中国水仙遗传转化体系的建立 |
| 2.3.1 E/pC1301 农杆菌侵染液的制备 |
| 2.3.2 中国水仙花葶转化基本步骤 |
| 2.3.3 中国水仙花葶遗传转化条件的优化 |
| 2.3.3.1 外植体预培养时间对转化的影响 |
| 2.3.3.2 不同 OD600 值对花葶转化的影响 |
| 2.3.3.3 不同侵染时间对花葶转化的影响 |
| 2.3.3.4 乙酰丁香酮（AS）浓度对转化的影响 |
| 2.3.3.5 不同潮霉素（Hyg）浓度对转化的影响 |
| 2.3.3.6 不同筛选方式对转化的影响 |
| 2.3.3.7 筛选培养基中不同激素对转化的影响 |
| 2.3.3.8 农杆菌侵染后水仙花葶 GUS 瞬时表达检测 |
| 2.3.4 抗性植株的培养 |
| 2.3.4.1 抗性芽的筛选诱导培养 |
| 2.3.4.2 抗性芽的增殖培养 |
| 2.3.4.3 壮苗培养和生根培养 |
| 2.3.5 抗性植株叶片 GUS 组织化学法检测 |
| 2.3.6 抗性植株的 PCR 检测鉴定 |
| 2.3.6.1 pC1301 质粒提取 |
| 2.3.6.2 抗性植株及非转基因植株基因组总 DNA 的提取及纯化 |
| 2.3.6.3 GUS 基因的 PCR 检测 |
| 2.3.7 转化的数据统计及处理 |
| 2.3.8 移栽 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 EHA105/pC1301 的鉴定结果 |
| 3.2 中国水仙花葶的潮霉素敏感性试验 |
| 3.3 以 hpt 为选择标记基因中国水仙遗传转化体系的优化 |
| 3.3.1 外植体预培养时间对花葶转化的影响 |
| 3.3.2 不同 OD600值对花葶转化的影响 |
| 3.3.3 不同侵染时间对花葶转化的影响 |
| 3.3.4 乙酰丁香酮（AS）浓度对花葶转化的影响 |
| 3.3.5 不同潮霉素浓度对花葶转化的影响 |
| 3.3.6 不同筛选方式对花葶转化的影响 |
| 3.3.7 筛选培养基中不同激素对花葶转化的影响 |
| 3.3.8 农杆菌侵染后水仙花葶 GUS 瞬时表达检测 |
| 3.4 抗性植株叶片 GUS 组织化学法检测结果 |
| 3.5 抗性植株的 PCR 检测鉴定 |
| 3.5.1 抗性植株总 DNA 的提取 |
| 3.5.2 抗性植株 PCR 鉴定 |
| 3.6 抗性植株的培养和移栽 |
| 4 讨论 |
| 4.1 以水仙花葶为受体材料的中国水仙遗传转化体系 |
| 4.2 潮霉素和筛选方式对遗传转化中的作用 |
| 4.3 预培养对农杆菌介导的水仙花葶转化中的作用 |
| 4.4 乙酰丁香酮（AS）对植物遗传转化的作用 |
| 4.5 转基因植株移栽 |
| 第三章 LYCB 植物表达载体的构建及转化中国水仙研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 载体和菌株 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 1.4 培养基和培养条件 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 植物表达载体的构建 |
| 2.1.1 中国水仙花苞总 RNA 提取 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 带酶切位点的 LYCB 基因 cDNA 全长序列克隆和目的片段回收 |
| 2.1.4 目的片段与载体连接 |
| 2.1.5 大肠杆菌感受态细胞制备和转化 |
| 2.1.5.1 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.1.5.2 转化 |
| 2.1.6 pCAMBIA1301 质粒提取 |
| 2.1.7 质粒酶切及目的片段回收 |
| 2.1.8 质粒连接反应 |
| 2.1.9 连接产物的转化及筛选 |
| 2.1.10 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.11 LYCB 基因植物表达载体构建路线 |
| 2.2 LYCB 基因转化中国水仙研究 |
| 2.2.1 重组质粒 pC1301-LYCB 转化农杆菌 EHA10538 |
| 2.2.2 重组质粒 pC1301-LYCB 转化农杆菌 EHA105 的鉴定 |
| 2.2.2.1 PCR 鉴定 |
| 2.2.2.2 酶切鉴定 |
| 2.2.3 转化程序 |
| 2.2.4 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体的构建 |
| 3.1.1 中国水仙花苞总 RNA 提取结果 |
| 3.1.2 带有 BglⅡ和 Bst EⅡ酶切位点的引物扩增 LYCB 基因全长克隆 |
| 3.1.3 pCAMBIA1301 质粒和 pMD18-T-LYCB 双酶切结果 |
| 3.1.4 重组表达载体 pC1301-LYCB 的 PCR 和酶切鉴定结果 |
| 3.2 LYCB 基因转化中国水仙研究 |
| 3.2.1 EHA105/pC1301-LYCB 工程菌的制备 |
| 3.2.2 EHA105/pC1301-LYCB 转化中国水仙 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录：图版和图版说明 |
| 致谢 |
（4）根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 申克氏孢子丝菌和申克氏孢子丝菌病 |
| 1.1.1 申克氏孢子丝菌概述 |
| 1.1.2 孢子丝菌病流行趋势 |
| 1.1.3 申克氏孢子丝菌细胞壁的生物学特征 |
| 1.2 黑色素是双相型病原真菌的重要致病因子 |
| 1.2.1 双相型病原真菌黑色素的特性 |
| 1.2.2 黑色素增强双相型病原真菌对吞噬细胞的抗性 |
| 1.2.3 黑色素增强双相型病原真菌对环境胁迫的抗性 |
| 1.3 蛋白泛素化系统及其应用 |
| 1.3.1 蛋白磷酸化药物研究现状 |
| 1.3.2 泛素化比磷酸化更复杂 |
| 1.3.3 泛素化和磷酸化调控机制比较 |
| 1.4 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究进展 |
| 1.4.1 丝状真菌转化方法研究进展 |
| 1.4.2 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化研究进展 |
| 1.4.3 根癌农杆菌用于丝状真菌功能基因组学研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第2章 根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌遗传转化体系的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 申克氏孢子丝菌对潮霉素的敏感性 |
| 2.2.2 申克氏孢子丝菌分生孢子的制备 |
| 2.2.3 农杆菌细胞的制备 |
| 2.2.4 农杆菌与申克氏孢子丝菌共培养 |
| 2.2.5 筛选转化子 |
| 2.2.6 检测转化子的遗传稳定性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 申克氏孢子丝菌对潮霉素的敏感性 |
| 2.3.2 农杆菌预培养过程中添加AS 对申克氏孢子丝菌转化的影响 |
| 2.3.3 共培养时间对转化效率的影响 |
| 2.3.4 不同农杆菌菌株对转化效率的影响 |
| 2.3.5 表型改变突变体的筛选 |
| 2.3.6 转化子遗传稳定性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 真菌转化受体 |
| 2.4.2 根癌农杆菌预培养过程中添加乙酰丁香酮 |
| 2.4.3 根癌农杆菌菌株 |
| 2.4.4 共培养条件 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 申克氏孢子丝菌T-DNA 插入突变体的分子分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 试剂盒和酶 |
| 3.1.5 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 申克氏孢子丝菌基因组DNA 的提取 |
| 3.2.2 PCR 检测T-DNA 插入突变体 |
| 3.2.3 Southern blotting 检测突变体T-DNA 插入拷贝数 |
| 3.2.4 TAIL-PCR 分离突变体T-DNA 侧翼序列 |
| 3.2.5 TAIL-PCR 产物测序 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 T-DNA 插入突变株PCR 检测 |
| 3.3.2 Southern blotting 检测突变体T-DNA 插入拷贝数 |
| 3.3.3 TAIL-PCR 扩增T-DNA 插入突变株侧翼序列 |
| 3.3.4 PCR 扩增申克氏孢子丝菌ATMT 转化子完整T-DNA |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 转化子中T-DNA 插入的拷贝数 |
| 3.4.2 T-DNA 插入位点侧翼序列的扩增 |
| 3.4.3 左臂或右臂丢失现象 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 申克氏孢子丝菌色素缺陷突变株JLCC32757-M2013 分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 试剂和引物 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 突变株JLCC32757-M2013 的形态观察 |
| 4.2.2 T-DNA 插入突变株JLCC32757-M2013 分子分析 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR 分析SsUBCc 基因和色素合成相关基因的表达 |
| 4.2.4 突变株JLCC32757-M2013 致病力分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 突变株JLCC32757-M2013 的形态观察 |
| 4.3.2 T-DNA 插入突变株JLCC32757-M2013 分子分析 |
| 4.3.3 Real-time PCR 分析SsUBCc 基因和色素合成相关基因的表达 |
| 4.3.4 突变株JLCC32757-M2013 致病力分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 病原真菌黑色素与致病性 |
| 4.4.2 黑色素生物合成抑制剂的应用 |
| 4.4.3 泛素化与色素合成 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 高通量筛选T-DNA 插入突变体的反向遗传学方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 试剂和引物 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 确定PCR 检测所需核酸DNA 含量的最低浓度 |
| 5.2.2 构建申克氏孢子丝菌T-DNA 插入突变体池和DNA 池 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 检测所需核酸DNA 的最低极限 |
| 5.3.2 申克氏孢子丝菌T-DNA 插入突变体池和DNA 池 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 突变体库将在后基因组时代发挥重要作用 |
| 5.4.2 突变体池的容量 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）玉米种子胚特异性启动子emb5的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物基因启动子的结构特点 |
| 1.1.1 转录起始位点(Transcription start site) |
| 1.1.2 TATA 盒(TATA-box) |
| 1.1.3 CAAT 盒(CAAT-box) |
| 1.1.4 GC-box 保守序列(GC-box conserved sequence) |
| 1.2 植物基因启动子的类型 |
| 1.2.1 组成型启动子(constitutive promoter) |
| 1.2.1.1 CaMV 35S 启动子 |
| 1.2.1.2 Nos 和Ocs 启动子 |
| 1.2.1.3 ActⅠ启动子 |
| 1.2.2 诱导型启动子(Inducible promoter) |
| 1.2.2.1 光诱导启动子 |
| 1.2.2.2 创伤诱导启动子 |
| 1.2.2.3 化学物质诱导启动子(Chemical inducible promoter) |
| 1.2.2.4 温度诱导启动子(Temperature inducible promoter) |
| 1.2.3 组织或器官特异性启动子(tissue- or organ-specific promoter) |
| 1.2.3.1 块茎专一性表达启动子(tuber-specific promoter) |
| 1.2.3.2 维管束特异性表达启动子(vascular-specific promoter) |
| 1.2.3.3 叶片特异性表达启动子(leaf-specific promoter) |
| 1.2.3.4 花 药 ( 花 粉 ) 特 异 性 表 达 启 动 子 (anther- or pollen- specific promoter) |
| 1.2.3.5 果实特异性表达启动子(fruit–specific promoter) |
| 1.2.3.6 种子特异性启动子(seed-specific promoter) |
| 1.2.3.7 胚特异性启动子(embryo-specific promoter) |
| 1.2.3.8 胚乳组织特异性启动子(endosperm-specific promoter) |
| 1.3 启动子在植物基因工程中的应用 |
| 1.3.1 组成型启动子的应用 |
| 1.3.2 诱导型启动子的应用 |
| 1.3.3 组织特异启动子的应用 |
| 1.3.3.1 抗虫基因工程 |
| 1.3.3.2 抗病基因工程 |
| 1.3.3.3 抗除草剂基因工程 |
| 1.3.3.4 花卉改良基因工程 |
| 1.3.3.5 果品储藏基因工程 |
| 1.3.3.6 种子品质基因工程及生物反应器 |
| 1.4 启动子的研究方法 |
| 1.4.1 顺式作用元件的研究方法 |
| 1.4.1.1 5′端缺失法 (5′-flanking region deletion) |
| 1.4.1.2 内部缺失突变法 (internal deletion mutagenesis) |
| 1.4.1.3 衔接物扫描突变法 (linker-scanning mutagenesis) |
| 1.4.1.4 定点突变法 (site-directed mutagenesis) |
| 1.4.2 DNA 与蛋白质互作的研究方法 |
| 1.4.2.1 凝胶阻滞分析法 (gel retarding analysis) |
| 1.4.2.2 足迹法(foot printing) |
| 1.5 本课题的研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 植物材料培养与处理 |
| 2.1.3 载体和菌株 |
| 2.1.4 工具酶及生化试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 实验所用引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物基因组DNA 的提取 |
| 2.2.2 质粒DNA 的提取 |
| 2.2.3 PCR 扩增 |
| 2.2.4 凝胶电泳中DNA 片段的回收 |
| 2.2.4.1 DNA 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.4.2 DNA 片段的回收 |
| 2.2.5 DNA 片段与克隆载体的连接 |
| 2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化 |
| 2.2.7 重组质粒的细菌菌落鉴定 |
| 2.2.7.1 蓝白斑筛选 |
| 2.2.7.2 菌落PCR 鉴定 |
| 2.2.7.3 质粒DNA 的酶切鉴定 |
| 2.2.8 克隆片段的序列测定 |
| 2.2.9 植物表达载体的构建 |
| 2.2.9.1 启动子5′端缺失 |
| 2.2.9.2 植物表达载体的构建 |
| 2.2.10 表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.10.1 农杆菌感受态制备 |
| 2.2.10.2 表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.11 拟南芥的遗传转化及转基因植株的鉴定 |
| 2.2.11.1 农杆菌的培养 |
| 2.2.11.2 拟南芥转化 |
| 2.2.11.3 转基因拟南芥植株的鉴定 |
| 2.2.12 转基因拟南芥植株的GUS 活性组织化学染色 |
| 2.2.13 转基因拟南芥的GUS 活性荧光定量检测 |
| 2.2.13.1 GUS 荧光检测分析 |
| 2.2.13.2 GUS 提取 |
| 2.2.13.3 GUS 提取液蛋白含量测定 |
| 2.2.13.4 酶反应 |
| 2.2.13.5 荧光测定 |
| 2.2.13.6 酶活力计算 |
| 2.2.14 网络资源及数据库 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 emb5 启动子的结构元件分析 |
| 3.1.1 emb5 全长启动子的克隆 |
| 3.1.2 emb5 启动子的结构元件分析 |
| 3.2 emb5 启动子在拟南芥中具较高的胚特异活性 |
| 3.2.1 pEm::GUS 植物表达载体的构建 |
| 3.2.2 pEm::GUS 转基因拟南芥植株的获得 |
| 3.2.3 emb5 启动子在拟南芥中胚特异活性分析 |
| 3.3 emb5 启动子在转基因拟南芥中的5′端缺失分析 |
| 3.3.1 5′端缺失片段表达载体的构建 |
| 3.3.2 5′端缺失片段转基因拟南芥植株的获得 |
| 3.3.3 emb5 启动子胚特异活性相关区域的定位 |
| 3.3.4 5′缺失片段在种子萌发期及幼苗期的功能鉴定 |
| 3.3.5 pD 片段具有全长emb5 启动子相同的胚特异活性 |
| 3.3.6 emb5 启动子存在2 个正调控区域 |
| 3.3.7 emb5 启动子存在1 个负调控区域 |
| 3.4 emb5 启动子的胚特异顺式作用元件分析 |
| 3.4.1 emb5 启动子包含7 个7-bp 的保守元件 |
| 3.4.2 重复元件的功能分析 |
| 3.4.2.1 GOF 植物表达载体的构建 |
| 3.4.2.2 转基因拟南芥T1 代植株的获得 |
| 4 讨论 |
| 4.1 emb5 启动子在拟南芥中具有较高的胚特异活性 |
| 4.2 emb5 启动子的环境响应元件分析 |
| 4.3 emb5 启动子的活性调控结构模式 |
| 4.4 emb5 启动子胚特异表达顺式作用元件分析 |
| 4.5 pD 片段是一个具有潜在应用价值的胚特异性启动子 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）转基因棉花中T-DNA整合特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 转基因植物中外源基因遗传与表达研究进展 |
| 1.1.1 转基因植物中外源基因遗传方式 |
| 1.1.2 影响转基因植物中外源基因表达的因素 |
| 1.2 转基因棉花遗传工程中常用的三种遗传转化方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导转化法 |
| 1.2.2 基因枪轰击转化法 |
| 1.2.3 花粉管通道转化法 |
| 1.3 根癌农杆菌介导遗传转化植物分子机制 |
| 1.4 转基因植物外源基因拷贝数方法学研究进展 |
| 1.4.1 Southern Blot 法 |
| 1.4.2 荧光原位杂交法 |
| 1.4.3 实时定量 PCR 法 |
| 1.5 转基因植物中 T-DNA 插入子侧翼序列克隆方法 |
| 1.5.1 质粒拯救法 |
| 1.5.2 反向 PCR 法 |
| 1.5.3 热不对称交错 PCR 法 |
| 1.6 转基因植物中 T-DNA 整合分子特征 |
| 1.7 转基因定点整合技术 |
| 1.7.1 基因定点整合技术的理论基础 |
| 1.7.2 植物中应用的定点重组系统 |
| 1.8 课题研究目的及意义和研究内容 |
| 1.8.1 研究目的及意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 PfaffI 法分析转基因棉花T-DNA 拷贝数 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 棉花材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 化学和分子生物学试剂 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卡那霉素抗性检测 |
| 2.2.2 棉花基因组 DNA 的提取 |
| 2.2.3 质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.4 转基因棉花 PCR 分子检测 |
| 2.2.5 实时定量 PCR 分析转基因拷贝数 |
| 2.2.5.1 Southern Blot 法确定单拷贝转基因棉花株系 |
| 2.2.5.2 SadⅠ和 NPTⅡ的标准曲线的建立 |
| 2.2.5.3 PfaffI 法分析转基因拷贝数 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 实时定量 PCR 分析阳性对照转基因拷贝数 Southern 杂交 |
| 2.3.1.1 杂交探针标记效率 |
| 2.3.1.2 限制性内切酶硝化棉花基因组DNA |
| 2.3.1.3 棉花基因组NPTⅡ基因拷贝数的Southern杂交 |
| 2.3.2 实时定量 PCR 分析转基因拷贝数 |
| 2.3.2.1 卡那霉素抗性检测 |
| 2.3.2.2 棉花基因组DNA的电泳检测 |
| 2.3.2.3 转基因棉花PCR分子检测 |
| 2.3.2.4 实时定量PCR引物扩增特异性 |
| 2.3.2.5 SadⅠ和NPTⅡ定量PCR 扩增曲线和熔解曲线 |
| 2.3.2.6 SadⅠ和NPTⅡ定量PCR扩增效率 |
| 2.3.2.7 转基因拷贝数的估算 |
| 2.3.2.8 转基因T代单株的Southern杂交验证 |
| 2.3.3 三种转基因方法转化棉花外源基因拷贝数比较 |
| 第三章 根癌农杆菌介导转基因棉花中 T-DNA 整合特征 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 棉花材料 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 化学和分子生物学试剂 |
| 3.1.4 PCR 引物 |
| 3.1.5 培养基配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 棉花基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.2 转基因棉花 PCR 分子检测 |
| 3.2.3 转基因棉花基因组中 T-DNA 侧翼序列 |
| 3.2.3.1 Tail-PCR 扩增引物的设计 |
| 3.2.3.2 Tail-PCR 第一轮反应 |
| 3.2.3.3 Tail-PCR 第二轮反应 |
| 3.2.3.4 Tail-PCR 第三轮反应 |
| 3.2.4 Tail-PCR 扩增 T0代转化材料产物的克隆 |
| 3.2.4.1 扩增产物的胶回收 |
| 3.2.4.2 胶回收产物与p MD-18T 载体的连接 |
| 3.2.4.3 连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 |
| 3.2.4.4 阳性克隆的蓝白斑筛选 |
| 3.2.4.5 阳性克隆的菌落 PCR 鉴定 |
| 3.2.4.6 阳性菌落质粒提取 PCR 鉴定及测序 |
| 3.2.5 T-DNA 边界区域的重组分析 |
| 3.2.5.1 T-DNA 边界序列重组分析 |
| 3.2.5.2 T-DNA 侧翼序列的生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 根癌农杆菌转基因 T0代单株 T-DNA 侧翼序列的克隆 |
| 3.3.1.1 根癌农杆菌转基因 T0代单株的 PCR 鉴定 |
| 3.3.1.2 Tail-PCR 反应条件的优化及三轮PCR 产物电泳分析 |
| 3.3.1.3 Tail-PCR 第三轮PCR 产物胶回收琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 3.3.1.4 PCR 产物的TA 克隆 |
| 3.3.1.5 阳性克隆的菌落 PCR 鉴定 |
| 3.3.2 根癌农杆菌转基因 T0代棉花中 T-DNA 边界区域的整合特征 |
| 3.3.3 根癌农杆菌转基因 T0代棉花中 T-DNA 剪辑位点碱基组成特征 |
| 3.3.4 根癌农杆菌转基因 T代棉花中 T-DNA 在棉花基因组的分布 |
| 3.3.5 棉花基因组中 T-DNA 高频整合的一个序列 |
| 第四章 讨论和结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 三种转基因方法分别转化植物外源基因拷贝数差异 |
| 4.1.2 研究转基因植物外源基因拷贝数技术与方法 |
| 4.1.3 转基因植物中 T-DNA 整合分子特征 |
| 4.2 结论(创新点) |
| 4.2.1 PfaffI 法在分析转基因棉花中整合T-DNA 拷贝数的应用 |
| 4.2.2 三种转化方法转化棉花中整合T-DNA 拷贝数的差异 |
| 4.2.3 转基因棉花中整合 T-DNA 的分子特征及剪辑位点碱基组成 |
| 4.2.4 T-DNA 在转基因棉花基因组的整合热点序列特征 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（7）杨树抗杨四瘿螨抑制消减文库构建及表达谱分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 林木抗虫研究进展 |
| 1.2 植物抗螨研究进展 |
| 1.2.1 形态特征与抗螨的关系 |
| 1.2.2 植物化学物质与抗螨的关系 |
| 1.2.3 螨类在分子水平上的研究 |
| 1.3 植物抗虫相关基因的研究 |
| 1.3.1 昆虫取食诱导的植物防御相关基因 |
| 1.3.2 信号传导相关基因 |
| 1.4 差异表达基因检测技术研究进展 |
| 1.4.1 mRNA 差异显示技术 |
| 1.4.2 RNA 随机引物聚合酶链式反应 |
| 1.4.3 代表性差示分析 |
| 1.4.4 基因表达序列分析 |
| 1.4.5 抑制消减杂交技术 |
| 1.4.6 基因鉴定整合程序 |
| 1.4.7 基因芯片技术 |
| 1.5 SSH 技术在植物功能基因组学研究中的应用 |
| 1.5.1 植物的生长发育及组织特异性研究 |
| 1.5.2 生物胁迫诱导的基因差异表达研究 |
| 1.5.3 非生物胁迫诱导的基因差异表达研究 |
| 1.6 生物信息学 |
| 1.7 CDNA 末端快速扩增技术（RACE） |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 第二章 杨四瘿螨生物学特性研究 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 杨四瘿螨种类鉴定 |
| 2.1.2 杨四瘿螨形态特征 |
| 2.1.3 对杨树的危害 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 杨四瘿螨种类鉴定及形态特征观测 |
| 2.2.2 对杨树的危害 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 杨四瘿螨形态特征观测 |
| 2.3.2 对杨树的危害 |
| 第三章 杨四瘿螨诱导的美洲黑杨抑制消减文库的构建及分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA 的提取分离 |
| 3.2.2 mRNA 分离 |
| 3.2.3 抑制消减文库构建 |
| 3.2.4 PCR 扩增产物纯化 |
| 3.2.5 重组子筛选（T/A 克隆法） |
| 3.2.6 EST 数据处理 |
| 3.2.7 Realtime-PCR 检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 总RNA 的分离 |
| 3.3.2 两次PCR 扩增结果 |
| 3.3.3 外源插入片断PCR 检测 |
| 3.3.4 EST 序列获得 |
| 3.3.5 Realtime-PCR 检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 SSH 抑制消减文库构建 |
| 3.4.2 EST 序列分析 |
| 第四章 抗杨四瘿螨相关基因克隆 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 PtWRKY 和PtERF 基因全长克隆 |
| 4.1.3 电泳产物切胶回收 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 总RNA 的分离 |
| 4.2.2 PtWRKY 基因cDNA 全长的克隆 |
| 4.2.3 PtERF 基因cDNA 全长的克隆 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 PtWRKY 基因 |
| 4.3.2 PtERF 基因 |
| 第五章 抗杨四瘿螨相关基因功能验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 抗生素 |
| 5.1.3 植物培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 植物表达载体构建 |
| 5.2.2 遗传转化 |
| 5.2.3 转基因杨树的PCR 检测 |
| 5.2.4 Realtime-PCR 检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 TOPO 反应阳性克隆检测 |
| 5.3.2 LR 反应阳性重组子检测 |
| 5.3.3 农杆菌介导的遗传转化 |
| 5.3.4 转基因植株的获得 |
| 5.3.5 转基因T89 杨DNA 的提取 |
| 5.3.6 转基因T89 杨的PCR 检测 |
| 5.3.7 Realtime-PCR 检测 |
| 5.4 讨论 |
| 全文主要结论 |
| 本研究主要创新点 |
| 论文的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 详细摘要 |
（8）萝卜春化过程中的生理生化变化及开花基因LFY的克隆（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1 植物花芽分化与抽薹研究进展 |
| 1.1 外界条件对花芽分化和抽薹的影响 |
| 1.1.1 光照 |
| 1.1.2 温度 |
| 1.1.3 矿质营养和水 |
| 1.2 植物花芽分化过程中的生理生化代谢特点 |
| 1.2.1 碳水化合物代谢 |
| 1.2.2 可溶性蛋白代谢 |
| 1.2.3 植物生长调节物质代谢 |
| 1.3 花芽分化分子遗传机制 |
| 2 植株原位真空渗入法遗传转化方法研究进展 |
| 2.1 发展概况 |
| 2.2 真空渗入遗传转化原理 |
| 2.2.1 转化原初组织位点 |
| 2.2.2 转化植物的遗传 |
| 2.3 真空渗入法的转化条件 |
| 2.3.1 植物的基因型和菌株 |
| 2.3.2 真空度 |
| 2.3.3 植物发育时期 |
| 2.3.4 菌液浓度与转化介质（IM）构成 |
| 3 RNA 干扰技术及其植物基因工程中的应用 |
| 3.1 RNAi 的分子机制 |
| 3.1.1 RNAi 的发现 |
| 3.1.2 RNA 干涉的特征 |
| 3.1.3 RNA 干涉的作用机理 |
| 3.2 RNA 沉默的生物学功能 |
| 3.3 RNAi 技术在植物基因工程中的应用 |
| 3.3.1 果实性状的控制 |
| 3.3.2 植物抗病性研究 |
| 3.3.3 在植物雄性不育及育性恢复研究中的应用 |
| 3.4 RNAi 存在的问题及前景预测 |
| 第一章 春化过程中萝卜幼苗生长点的生理生化变化 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验方法 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.1.4 测定方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 萝卜低温春化过程中可溶性蛋白含量的变化 |
| 1.2.2 萝卜低温春化过程中游离氨基酸含量的变化 |
| 1.2.3 萝卜低温春化过程中可溶性糖含量的变化 |
| 1.2.4 萝卜低温春化过程中 GAs 含量的变化 |
| 1.2.5 萝卜低温春化过程中 IAA 含量的变化 |
| 1.2.6 萝卜低温春化过程中 ZR 含量的变化 |
| 1.2.7 萝卜低温春化过程中 ABA 含量的变化 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 萝卜植株真空渗入高效遗传转化体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 萝卜植株真空渗入遗传转化体系适宜苗态的建成 |
| 2.3 影响萝卜植株真空渗入遗传转化因素处理试验 |
| 2.3.1 不同真空渗入时间对转化影响试验 |
| 2.3.2 不同菌液浓度对转化影响试验 |
| 2.3.3 植株不同组织器官对转化影响试验 |
| 2.3.4 不同渗入培养基对转化影响试验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 不同真空渗入时间对转化效果的影响 |
| 2.4.2 不同菌液浓度对转化效果的影响 |
| 2.4.3 植株不同组织器官对转化效果的影响 |
| 2.4.4 不同渗入培养基对转化效果的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 萝卜开花基因 LFY 的克隆、dsRNA-LFY 植物表达载体的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株及载体 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RNA 的提取方法（Trizol） |
| 3.2.2 LFY 基因的克隆 |
| 3.2.3 双链 RNA 抑制载体pROK2-dsLFY 的构建 |
| 3.2.4 重组植物表达载体向农杆菌种的转化 |
| 3.3 萝卜植株的遗传转化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 萝卜 LFY 基因的克隆及反义和正义 LFY 基因的 PCR 扩增 |
| 3.4.2 双链 RNA 抑制载体的构建 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 RNAi 的导入方式及其对dsRNA 长度的要求 |
| 3.5.2 关于内含子片段的探讨 |
| 3.5.3 使用 RNA 干扰技术时应注意的问题 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（9）利用转基因技术改良水稻抗性和品质的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述：植物转基因技术及其在水稻改良上的应用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物遗传转化方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导的基因转化 |
| 1.2.2 基因枪介导的基因转化 |
| 1.2.3 花粉管通道介导的基因转化 |
| 1.2.4 其它转化方法 |
| 1.3 转基因技术在水稻改良上的应用 |
| 1.3.1 抗虫 |
| 1.3.2 抗病 |
| 1.3.3 抗除草剂 |
| 1.3.4 品质改良 |
| 1.3.5 其它性状的改良 |
| 1.4 水稻转基因育种中存在的几个主要问题及解决途径 |
| 1.5 主要参考文献 |
| 第2章 转基因技术改良水稻对病、虫及除草剂抗性的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试水稻品种 |
| 2.2.2 质粒载体与细菌菌株 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 质粒DNA的提取、纯化及转化 |
| 2.2.5 水稻愈伤组织的诱导及培养 |
| 2.2.6 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻转化 |
| 2.2.7 转基因水稻潮霉素抗性检测 |
| 2.2.8 PCR 分析 |
| 2.2.9 Southern 杂交分析 |
| 2.2.10 抗病性鉴定 |
| 2.2.11 除草剂抗性鉴定 |
| 2.2.12 BT毒蛋白的ELISA检测 |
| 2.2.13 螟虫抗性鉴定 |
| 2.2.14 褐飞虱抗性鉴定 |
| 2.2.15 农艺性状调查 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 转Bt 基因水稻的培育及其抗虫性 |
| 2.3.1.1 共转化法获得转基因水稻 |
| 2.3.1.2 抗性选择标记的去除 |
| 2.3.1.3 转基因水稻植株中BT 毒蛋白的含量 |
| 2.3.1.4 转基因水稻的抗虫性 |
| 2.3.1.5 转基因水稻的主要农艺性状 |
| 2.3.2 转AP1 基因水稻的培育及其抗病性 |
| 2.3.2.1 共转化法获得转AP1 基因水稻 |
| 2.3.2.2 抗性选择标记的去除 |
| 2.3.2.3 转基因水稻的抗病性 |
| 2.3.2.4 转基因水稻的农艺性状 |
| 2.3.3 转GNA 和Bar 基因水稻的培育及其抗性 |
| 2.3.3.1 含GNA 和Bar 基因双价转基因水稻的获得 |
| 2.3.3.2 转基因水稻对除草剂Basta 的抗性 |
| 2.3.3.3 转基因水稻对褐飞虱的抗性 |
| 2.3.3.4 转基因水稻的农艺性状 |
| 2.3.4 多价转基因水稻的培育及其抗性 |
| 2.3.4.1 Bt 与AP1 基因双价转基因水稻的培育 |
| 2.3.4.2 有性杂交选育三价和四价转基因水稻 |
| 2.3.4.3 多价转基因水稻的抗性 |
| 2.3.4.3.1 抗病性 |
| 2.3.4.3.2 抗虫性 |
| 2.3.4.4 多价转基因水稻的农艺性状 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 本章主要研究结果 |
| 2.4.2 转基因水稻的实用性 |
| 2.4.3 多抗转基因水稻的应用潜力 |
| 2.5 主要参考文献 |
| 第3章 转基因技术改良水稻品质的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 水稻材料 |
| 3.2.1.2 菌株及载体 |
| 3.2.2 质粒DNA 的提取、纯化 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 水稻愈伤组织的诱导及培养 |
| 3.2.5 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻转化 |
| 3.2.6 转基因水稻植株中潮霉素抗性的检测 |
| 3.2.7 PCR分析 |
| 3.2.8 Southern 杂交分析 |
| 3.2.9 总RNA的提取和Northern杂交分析 |
| 3.2.10 水稻成熟种子中GBSS 蛋白表达分析 |
| 3.2.11 直链淀粉含量的测定 |
| 3.2.12 胶稠度和糊化温度的测定 |
| 3.2.13 淀粉粘滞性谱分析 |
| 3.2.14 胚乳淀粉粒扫描电镜观察 |
| 3.2.15 水稻农艺性状调查 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转反义Wx 基因水稻的培育及其品质表现 |
| 3.3.1.1 无选择标记转基因水稻的筛选及其分子鉴定 |
| 3.3.1.2 转基因水稻中内源Wx 基因的表达 |
| 3.3.1.3 转基因稻米的理化品质 |
| 3.3.1.4 转基因水稻淀粉RVA 谱特性 |
| 3.3.1.5 转基因糯稻与常规糯稻品种淀粉RVA 谱的比较 |
| 3.3.1.6 转基因水稻胚乳淀粉粒的结构 |
| 3.3.1.7 转基因水稻的主要农艺性状表现 |
| 3.3.2 转全长Wx 基因水稻的培育及其品质表现 |
| 3.3.2.1 转基因水稻的分子鉴定 |
| 3.3.2.2 转基因水稻中Wx基因的表达 |
| 3.3.2.3 转基因稻米的理化品质 |
| 3.3.2.4 转基因水稻淀粉的RVA 谱特性 |
| 3.3.2.5 转基因水稻种子胚乳中淀粉粒结构 |
| 3.3.2.6 转基因对稻米粒重的影响 |
| 3.3.3 糯稻中表达Wx cDNA 及其对稻米品质的影响 |
| 3.3.3.1 转基因水稻的分子鉴定 |
| 3.3.3.2 转基因水稻中Wx cDNA 的表达 |
| 3.3.3.3 转基因稻米的理化品质表现 |
| 3.3.3.4 转基因水稻的RVA 谱特性 |
| 3.3.3.5 转水稻种子胚乳淀粉粒的结构 |
| 3.3.3.6 表达Wx cDNA 对稻米粒重的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 本章主要研究结果 |
| 3.4.2 导入Wx 基因的不同转基因构建对稻米直链淀粉含量的影响 |
| 3.4.3 直链淀粉含量改变对稻米其它品质性状的影响 |
| 3.5 主要参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（10）转金属硫蛋白基因水稻的特异表达及其对重金属抗性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 金属硫蛋白概述 |
| 1.1.1 金属硫蛋白的一般特点 |
| 1.1.2 金属硫蛋白的分类 |
| 1.1.3 金属硫蛋白的结构 |
| 1.1.4 金属硫蛋白的生物学功能 |
| 1.2 植物金属硫蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 植物 MT 的主要特性 |
| 1.2.2 植物 MT 的分类 |
| 1.2.3 植物 MT 基因的表达 |
| 1.2.4 植物MT 的功能 |
| 1.3 植物组织特异性表达的研究 |
| 1.3.1 启动子的一般特点 |
| 1.3.2 启动子的类型 |
| 1.3.3 特异性启动子的应用 |
| 1.4 转金属硫蛋白基因植物研究与进展 |
| 1.5 RNA 干涉的研究进展 |
| 1.5.1 RNAi 概述 |
| 1.5.2 RNAi 作用机理 |
| 1.5.3 RNAi 技术 |
| 1.5.4 RNAi 的应用 |
| 1.6 立题意义及主要的技术路线 |
| 1.6.1 立题意义 |
| 1.6.2 主要的技术路线 |
| 第二章 转金属硫蛋白基因的特异表达系统的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 AtSTP3 绿色组织特异表达启动子 |
| 2.1.2 rbcS 绿色组织特异表达启动子 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料与动物材料 |
| 2.2.2 菌株与质粒 |
| 2.2.3 试剂与酶 |
| 2.2.4 仪器 |
| 2.2.5 小鼠总 RNA 的提取 |
| 2.2.6 克隆小鼠金属硫蛋白基因（MT） |
| 2.2.7 拟南芥总 DNA 的提取 |
| 2.2.8 克隆 AtSTP3 启动子 |
| 2.2.9 水稻总 DNA 的提取 |
| 2.2.10 克隆RbcS 启动子 |
| 2.2.11 表达载体构建 |
| 2.2.12 农杆菌真空渗透法Agroinfiltration 研究GUS 瞬间表达情况 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 克隆小鼠金属硫蛋白基因(m MT) |
| 2.3.2 克隆 AtSTP3 启动子 |
| 2.3.3 克隆rbcS 启动子 |
| 2.3.4 表达载体的构建 |
| 2.3.5 两个启动子表达系统的 GUS 瞬间表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 从小鼠中克隆金属硫蛋白基因及序列分析 |
| 2.4.2 从水稻中克隆启动子及序列分析 |
| 2.4.3 两个特异表达启动子瞬时表达的活性 |
| 2.4.4 所构建系统的应用价值 |
| 2.5 总结 |
| 第三章 应用农杆菌介导的方法进行水稻遗传转化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌株与质粒 |
| 3.2.3 试剂与酶 |
| 3.2.4 仪器及设备 |
| 3.2.5 培养基 |
| 3.2.6 转基因植物的获得 |
| 3.2.7 GUS 组织化学染色 |
| 3.2.8 GUS 活性定量测定 |
| 3.2.9 转基因水稻的分子检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 含pCAMBIA1301 质粒农杆菌的获得 |
| 3.3.2 转基因植株的获得 |
| 3.3.3 两个启动子转基因材料的 GUS 组织化学染色检测结果 |
| 3.3.4 两个启动子转基因材料的GUS活性定量检测结果 |
| 3.3.5 转基因水稻的PCR 检测 |
| 3.3.6 转m MT基因植株的 Southern blot检测 |
| 3.3.7 转mMT 基因植株的Northern blot 检测 |
| 3.3.8 转m MT 基因植株的 Western blot 检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 添加 AS 对水稻转化效率的影响 |
| 3.4.2 rbcS 启动子的克隆及特异表达 |
| 3.4.3 转基因植株Southern blot 结果 |
| 3.4.4 转基因沉默 |
| 3.5 总结 |
| 第四章 水稻金属硫蛋白基因RNAi 表达系统的构建及遗传转化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌株与质粒 |
| 4.2.3 试剂与酶 |
| 4.2.4 克隆水稻金属硫蛋白基因 |
| 4.2.5 水稻金属硫蛋白基因的融合 |
| 4.2.6 表达载体构建 |
| 4.2.7 转基因植物的获得 |
| 4.2.8 转基因水稻的分子检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 克隆水稻金属硫蛋白rMT1a 基因 |
| 4.3.2 克隆水稻金属硫蛋白rMT2a 基因 |
| 4.3.3 克隆水稻金属硫蛋白rMT3a 基因 |
| 4.3.4 融合水稻金属硫蛋白基因 |
| 4.3.5 含pJawoh18RNAi, pJRrMT1a ﹑pJRrMT2a﹑pJRrMT3a and pJRrMT123a质粒农杆菌的获得 |
| 4.3.6 转基因植株的获得 |
| 4.3.7 转基因植株的 PCR 检测 |
| 4.3.8 转基因植株的 Southern blot 检测 |
| 4.3.9 转基因植株的RT-PCR 检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 从水稻中克隆金属硫蛋白基因及序列分析 |
| 4.4.2 转基因植株的PCR 检测结果 |
| 4.4.3 转基因植株的 Southern blot 结果 |
| 4.4.4 转基因植株的半定量RT-PCR 检测结果 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 转基因水稻 T1 代性状分析及对重金属抗性的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.1.1 重金属的污染及治理方法 |
| 5.1.2 利用植物基因工程的方法提高植物对重金属的抗性 |
| 5.1.3 利用植物基因工程的方法减少农产品中重金属的含量 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 仪器与试剂 |
| 5.2.3 转mMT 基因 T_1 代种子抗嘲霉素萌发实验 |
| 5.2.4 转水稻金属硫蛋白基因 RNA 干涉的水稻种子抗除草剂萌发实验 |
| 5.2.5 转基因种子抗重金属萌发实验 |
| 5.2.6 转基因植株抗重金属实验 |
| 5.2.7 不同启动子引导的mMT 转基因水稻组织中 Cd~(2+)分布 |
| 5.2.8 转水稻金属硫蛋白基因 RNA 干涉的水稻组织中 Cd~(2+)分布 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 转mMT 基因水稻T_1 代种子抗嘲霉素实验结果 |
| 5.3.2 转水稻金属硫蛋白基因 RNA 干涉的水稻种子抗除草剂萌发实验 |
| 5.3.3 转基因种子抗重金属萌发实验结果 |
| 5.3.4 转基因水稻植株对重金属抗性的研究结果 |
| 5.3.5 转mMT 基因水稻组织中Cd~(2+)含量及分布 |
| 5.3.6 转水稻金属硫蛋白基因RNA 干涉的水稻组织中Cd~(2+)含量及分布 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 各个表达系统转基因水稻种子对抗生素萌发实验结果分析 |
| 5.4.2 各个表达系统转基因水稻对重金属抗性的差异分析 |
| 5.4.3 转基因水稻对环境治理的意义 |
| 5.4.4 转基因水稻对食品安全的意义 |
| 5.5 总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 缩写 |
| 附录Ⅱ:克隆载体构建流程 |
| 博士期间已发表与待发表的论文 |
| 致谢 |
四、冠瘿组织中Nopaline合酶的定量研究——Ⅰ.不同植物冠瘿株中Nopaline合酶的定量比较（论文参考文献）
- [1]黄瓜果瘤和果实无光泽性状基因的定位与功能分析[D]. 杨绪勤. 上海交通大学, 2014(07)
- [2]玉米SKIP同源基因ZmSKIP的克隆及在非生物胁迫中的功能分析[D]. 王小敏. 重庆大学, 2012(05)
- [3]Hpt为选择标记中国水仙遗传转化体系的建立及导入LYCB基因研究[D]. 曾原飞. 福建农林大学, 2012(12)
- [4]根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究[D]. 张艳华. 吉林大学, 2011(09)
- [5]玉米种子胚特异性启动子emb5的功能分析[D]. 于丽萍. 山东农业大学, 2010(06)
- [6]转基因棉花中T-DNA整合特征研究[D]. 杨晓杰. 中国农业科学院, 2010(10)
- [7]杨树抗杨四瘿螨抑制消减文库构建及表达谱分析[D]. 张萍. 南京林业大学, 2009(01)
- [8]萝卜春化过程中的生理生化变化及开花基因LFY的克隆[D]. 付娟娟. 山东农业大学, 2008(02)
- [9]利用转基因技术改良水稻抗性和品质的研究[D]. 于恒秀. 扬州大学, 2007(06)
- [10]转金属硫蛋白基因水稻的特异表达及其对重金属抗性的研究[D]. 卢碧霞. 西北农林科技大学, 2006(05)