一、CAA患者造血干细胞内Ca~(2+)含量、CD95~+表达水平及相关因素的研究（论文文献综述）
周东蕊[1]（2021）在《血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究》文中进行了进一步梳理研究目的:1.观察血塞通注射液对大鼠大脑中脉闭塞（MCAO）28天神经功能的影响,探究血塞通对损伤皮层LINGO-1,EGFR,PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。2.观察血塞通注射液对体外培养SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损伤的保护作用,验证血塞通注射液对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。研究方法:1.采用改良的Longa法对SD大鼠进行MCAO模型的制备,假手术组大鼠只进行皮肤切开以及钝性分离血管和神经,不插入栓线。大鼠MCAO模型的成功建立评价方法选用TTC染色法。2.根据术后Longa评分将手术组大鼠随机分为模型组,血塞通小剂量组,血塞通大剂量组和尼莫地平组（即阳性药物组）。假手术组和模型组注射同等剂量的生理盐水,其余组别给与相对应的药物治疗。术后1-28天,每日清晨给药前对大鼠进行称重,根据mNSS神经功能评分表进行评分。评价血塞通对大鼠MCAO术后不同时间点（7天,14天和28天）神经功能和体重恢复的疗效。MCAO术后28天,将所有大鼠麻醉后断头取脑,采用HE染色观察大鼠大脑皮层的病理变化,采用Western blot法检测皮层梗死侧的SYN和PSD-95的蛋白表达变化,探索血塞通注射液对皮层梗死区的神经保护作用。采用qRT-PCR、免疫组织化学（IHC）和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层LINGO-1,EGFR以及PI3K/AKT的mRNA和蛋白表达,探索血塞通的神经保护机制。3.采用qRT-PCR和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达,进一步探索血塞通的神经保护机制。4.体外培养SH-SY5Y细胞,CCK-8法确定最佳缺氧时间,建立OGD/R损伤SH-SY5Y细胞模型,CCK-8法确定血塞通和bpV的最适药物浓度。将SH-SY5Y细胞随机分为正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组等5个组别,按照不同组别给与相对应的药物,正常组给与无血清的EBSS液,模型组给与无糖的Earle’s液。镜下观察血塞通对OGD/R损伤SHSY-5Y细胞生长状态的影响。采用qRT-PCR和Western Blot检测OGD/R损伤SH-SY5Y细胞的PI3K/AKT以及PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达对体内实验进一步验证,观察当使用bpV时,PTEN及其下游的PI3K/AKT通路、GSK-3β mRNA和蛋白的表达情况。研究结果:1.TTC染色显示:假手术组大鼠右脑为均一的红色,表明脑组织并未损伤;手术组大鼠由于大脑右侧被梗塞而出现广泛的白色,表明MCAO可诱导大鼠右侧脑组织梗死。研究结果证明大鼠MCAO模型成功建立。2.各组大鼠的体重在造模前未见显着的差异（P>0.05）;在MCAO术后第7天和第14天,各组大鼠体重均明显低于假手术组（P<0.05或者P<0.01）;术后第28天,除模型组外,各药物治疗组大鼠的体重与假手术组没有明显差异（P>0.05）。术后第14天的假手术组大鼠的体重高于第7天假手术组的体重,余组别两个时间点比较未见明显差异（P>0.05）;而第28天各组大鼠的体重均显着高于第14天相同组别的大鼠（P<0.01）。手术组各组大鼠苏醒后EZ-Longa评分组间未见明显差异（P>0.05）。在第7天的mNSS评分中,血塞通大剂量组明显低于模型组（P<0.05）。药物治疗后14天,血塞通治疗组（包括小剂量和大剂量）和尼莫地平组大鼠的mNSS评分与模型组相比显着降低（P<0.05）。而药物治疗后28天,血塞通治疗组大鼠的mNSS评分与模型组相比明显降低（P<0.05或P<0.01）;血塞通大剂量组在降低大鼠的mNSS评分方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05）。这说明血塞通治疗可长期缓解MCAO大鼠的神经功能障碍,且具有剂量依赖性。MCAO术后相同组别的mNSS评分在不同时间点的比较显示:第7天和第14天同一组别的mNSS评分无显着差异（P>0.05）;除尼莫地平组外,第28天的mNSS评分显着高于同一组别第14天的mNSS评分（P<0.05）。MCAO术后28天,HE染色结果显示:假手术组大鼠的脑组织形态和细胞结构完整。模型组大鼠脑组织呈大面积损伤,组织着色较浅,神经细胞坏死、核固缩、深染;治疗组大鼠的脑组织也出现一定的损伤,但是和模型组相比,损伤程度较轻,神经细胞的数量也多;与血塞通小剂量组和尼莫地平组相比,血塞通大剂量组的脑组织结构更完整,神经细胞数量亦明显增多。MCAO术后28天,与模型组相比较,各治疗大鼠的PSD-95蛋白表达显着升高（P<0.01）;对各治疗进行比较发现,血塞通大剂量组在提高PSD-95表达方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05或P<0.01）。与模型组相比,血塞通大剂量组和尼莫地平组可显着提高大鼠大脑皮层SYN蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）;与血塞通小剂量组相比,血塞通大剂量组在提高SYN蛋白表达方面具有显着的优势（P<0.05）。MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:各组LINGO-1,EGFR,PI3K以及AKT mRNA表达无显着变化（P>0.05）。IHC结果显示:LINGO-1的阳性颜色为深棕色,假手术组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达较少;各治疗组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达显着低于模型组的阳性表达（P<0.01）;而对各治疗组之间皮层LINGO-1的阳性表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。各组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的阳性颜色均为深棕色,假手术组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT呈低表达;各治疗组大鼠大脑皮层P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达显着高于模型组（P<0.01）;对各治疗组之间的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:各治疗组大鼠的Lingo-1蛋白的相对表达相较于模型组显着下降（P<0.01）,接近正常水平;而各治疗组之间进行比较,Lingo-1的表达未见明显差异（P>0.05）。各治疗组的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT高于模型组（有趋势,或P<0.05,或P<0.01）;治疗组之间比较无明显差异（P>0.05）。3.MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:除血塞通大剂量组的大鼠脑组织的PTEN mRNA表达明显高于假手术组的mRNA（P<0.05）,其余各组大鼠脑组织的PTEN mRNA表达组间比较未见显着差异（P>0.05）;各组大鼠脑组织的GSK-3β mRNA表达组间亦未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:与模型组相比,各治疗组的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;而各治疗组之间的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白水平无明显差异（P>0.05）。4.CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的最佳缺氧时间为7 h;血塞通和bpV对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的最适药物浓度分别为20μg/ml和1μmol/L。通过镜下观察血塞通,bpV以及血塞通+bpV对OGD 7 h/R 24 h培养的SH-SY5Y细胞生长状态的影响发现,血塞通组、bpV组以及血塞通+bpV组的贴壁细胞数量较模型组多,大部分细胞呈多边形或梭形,部分细胞突触缩短,但大部分细胞突触仍存在,各治疗组之间的细胞形态未见明显的差异。SH-SY5Y细胞OGD 7h/R24 h培养后,qRT-PCR结果显示:正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组细胞的PI3K,AKT,PTEN和GSK-3β mRNA的水平未见显着差异（P>0.05）。Western blotting检测结果显示,与模型组相比,各治疗组大鼠大脑皮层的 P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN 以及 P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平显着升高（P<0.05,或P<0.01）;各治疗组之间的P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN以及P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平比较未见明显差异（P>0.05）。研究结论:1.血塞通可以长期缓解MCAO大鼠的脑组织损伤并促进神经重塑和再生从而增加MCAO术后大鼠的体重,改善MCAO大鼠的神经功能。2.血塞通发挥的神经保护作用机制包括抑制LINGO-1表达,激活EGFR和PI3K/AKT信号通路,抑制PTEN的表达进一步激活PI3K/AKT通路,从而抑制下游GSK-3β的活性,长期促进突触的重塑和再生。3.血塞通可以缓解OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,通过抑制PTEN的活性,激活其下游PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,发挥长期的神经保护作用。
马喆[2]（2021）在《基于线粒体-内质网连接探究松龄血脉康对脑缺血再灌注损伤保护作用》文中研究说明脑卒中是我国的常见病及多发病,预后较差。在脑卒中的所有类型中,缺血性脑卒中是主要类型。缺血性脑卒中急性期血管再通的治疗,有利于缺血半暗带的恢复,但是也会并发脑缺血再灌损伤,加重病情。线粒体-内质网连接即线粒体和内质网之间紧密相连的部位,可以调节线粒体和内质网之间的生理功能,包括维持Ca2+稳态、进行脂质和代谢物交换等。线粒体功能障碍,内质网应激,自噬功能障碍,Ca2+稳态失调和氧化应激等均与线粒体-内质网连接密切相关。脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中发展过程中的一个病理过程,是影响缺血性脑卒中的预后和转归的重要因素之一,其病理机制包括线粒体能量代谢障碍、氧化应激、细胞凋亡等。松龄血脉康胶囊是临床常用药物,具有平肝潜阳、清热凉血等作用,可以治疗高血压、高血脂等病且疗效显着,而高血压、高血脂是发生脑缺血再灌注损伤的高危因素。有研究表明松龄血脉康胶囊可以减少脑缺血再灌注损伤后神经元细胞凋亡的发生,但其具体分子机制仍需更多的研究。因此,本研究基于线粒体-内质网连接探讨松龄血脉康对脑缺血再灌注损伤的治疗作用及机制,拟证实松龄血脉康胶囊通过改善线粒体-内质网连接的结构和功能,调节线粒体氧化应激、内质网应激以及细胞凋亡等发挥神经保护作用,为松龄血脉康在脑缺血再灌注损伤的临床应用提供科学的实验依据。目的本研究选取线粒体-内质网连接中主要结构蛋白IP3R3、VDAC1、sigma-1R为研究靶点,从线粒体-内质网连接的结构和功能、钙稳态、氧化应激、内质网应激和细胞凋亡角度论证松龄血脉康胶囊治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法本实验采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型。雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组。假手术组只分离血管,不插线栓。模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型。假手术组及模型组蒸馏水灌胃,松龄血脉康组灌胃松龄血脉康胶囊溶液（472.5mg/kg·d）,依达拉奉组腹腔注射依达拉奉注射液（7mg/kg·d）,干预5天后取材。1.Garcia改良神经功能评分检测造模成功后24 h及药物干预5 d后各组大鼠的神经功能。错步实验观察药物干预5 d后大鼠神经功能恢复情况,HE染色、尼氏染色对大鼠大脑缺血区神经元形态结构进行观察,TUNEL染色法检测大鼠大脑缺血区的细胞凋亡情况。2.电镜下对各组大鼠大脑缺血区线粒体-内质网连接形态结构进行观察。检测各组大鼠大脑缺血区线粒体的Ca2+含量。蛋白质印迹法检测线粒体-内质网连接Ca2+通路相关蛋白IP3R3、VDAC1和sigma-1R的表达。3.检测线粒体-内质网连接中氧化应激相关指标,包括SOD、MDA和ATP。蛋白质印迹法检测线粒体凋亡相关蛋白Cytochrome C的表达。4.蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和内质网应激相关蛋白CHOP、Caspase-12的表达。结果1.Garcia改良神经功能评分结果显示,造模24 h后,假手术组神经功能评分为22分,模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组评分均低于假手术组,差异有统计学意义（P<0.01）,表示造模成功。造模5 d后,模型组神经功能评分仍低于假手术组,差异有统计学意义（P<0.01）;松龄血脉康组与依达拉奉组神经功能评分显着高于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）。松龄血脉康组及依达拉奉组神经功能评分显着高于造模24 h后评分,差异有统计学意义（P<0.01,P<0.05）。错步实验结果为,假手术组错步次数较少。与假手术组相比,模型组错步次数显着增加（P<0.01）。与模型组相比,松龄血脉康组及依达拉奉组错步次数显着减少（P<0.01）。HE染色及尼氏染色结果发现,假手术组神经元细胞形态完整、结构正常,尼氏体数量多。模型组大鼠神经元细胞皱缩,染色质色深浓,胞核与胞质无明显分界,部分细胞呈空泡状改变,尼氏体少。与模型组比较,松龄血脉康组及依达拉奉组大鼠大脑皮层神经元细胞皱缩减少、细胞形态及结构明显好转,尼氏体增多。TUNEL染色结果显示,假手术组的大鼠缺血区脑组织无阳性细胞染色。与假手术组相比,模型组阳性细胞百分比显着增加（P<0.01）。与模型组相比,松龄血脉康组及依达拉奉组阳性细胞百分比显着减少（P<0.01）。2.各组大鼠线粒体-内质网连接电镜结果显示,假手术组的线粒体-内质网连接结构清晰完整。在模型组中线粒体-内质网连接结构损伤,线粒体和内质网均有肿胀,线粒体双层膜结构缺失、脊结构消失,内质网结构损伤。松龄血脉康组及依达拉奉组的线粒体-内质网连接结构较模型组好转,线粒体双层膜结构无明显缺失,脊结构损伤水肿,内质网肿大但结构完整。线粒体Ca2+含量检测结果发现假手术组Ca2+含量较低。与假手术组相比,模型组Ca2+含量显着增加（P<0.01）。与模型组相比,松龄血脉康组与依达拉奉组Ca2+含量有减少趋势,但差异没有显着性。WB检测线粒体-内质网连接Ca2+通道相关蛋白结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠脑组织IP3R3相对蛋白表达量显着增加,VDAC1及sigma-1 R相对蛋白表达量显着减少（P<0.01）。与模型组相比,松龄血脉康组及依达拉奉组大鼠脑组织IP3R3相对蛋白表达量显着减少（P<0.01）,松龄血脉康组VDAC1和sigma-1 R蛋白表达量显着增加（P<0.05）,依达拉奉组VDAC1和sigma-1 R蛋白表达量显着增加（P<0.01）。3.SOD、MDA及ATP检测结果发现,与假手术组相比,模型组大鼠脑组织的SOD含量及ATP含量显着减少（P<0.05）,MDA含量显着增加（P<0.05）。与模型组相比,松龄血脉康组及依达拉奉组大鼠脑组织的ATP含量显着增加（P<0.01）,松龄血脉康组（P<0.05）及依达拉奉组（P<0.01）SOD含量显着增加,MDA含量显着减少（P<0.01）。WB检测各组大鼠线粒体相关凋亡蛋白Cytochrome C表达显示,与假手术组相比,模型组的Cytochrome C相对蛋白表达量显着增高（P<0.01）。与模型组相比,松龄血脉康组及依达拉奉组的Cytochrome C相对蛋白表达量显着减少（P<0.01）。4.WB检测各组大鼠内质网应激凋亡通路相关蛋白表达量显示,与假手术组相比,模型组大鼠脑组织的Cleaved Caspase-3、CHOP和Caspase-12相对蛋白表达量显着增加（P<0.01）。与模型组相比,松龄血脉康组和依达拉奉组的Cleaved Caspase-3、CHOP、Caspase-12相对蛋白表达量显着降低（P<0.01）。结论1.松龄血脉康胶囊具有神经保护作用,可以改善大脑神经功能,维持神经元形态结构,减少细胞凋亡,减轻脑缺血再灌注损伤。2.松龄血脉康胶囊神经保护作用机制可能与维持脑缺血再灌注损伤后线粒体-内质网连接Ca2+稳态,以及调节线粒体内质网连接Ca2+通道蛋白IP3R3、VDAC1及sigma-1 R表达有关。3.松龄血脉康胶囊可以改善脑缺血再灌注损伤后细胞氧化应激状态,促进ATP产生,减少细胞凋亡。4.松龄血脉康胶囊可能通过抑制线粒体-内质网连接中内质网应激信号通路凋亡蛋白发挥神经保护作用,改善脑缺血再灌注损伤。提示线粒体-内质网连接在脑缺血再灌注损伤的病理生理中起着重要的作用,可作为脑缺血再灌注损伤的治疗靶点。同时,我们的研究也为松龄血脉康胶囊在临床改善脑缺血再灌注损伤的应用提供科学依据。
赵慧[3]（2020）在《免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究》文中提出目的:脑卒中后脑内炎症反应参与损伤级联扩大及神经功能恶化,但其特点与直接作用尚不明确。本研究通过注射百日咳毒素（pertussis toxin,PTx）增强脑缺血或出血后脑内炎症反应,观察脑内炎症特点、病理变化及临床结局,明确脑卒中后脑内炎症的直接作用。在细胞调节水平,具有获得性免疫功能的固有淋巴细胞（innate lymphoid cell,ILC）亚群对脑卒中的免疫调节作用与机制尚不明确。因此我们研究以2型为代表的ILC及其调节因子白介素（interleukin,IL）-33对脑卒中的影响,以明确脑卒中后免疫细胞介导的炎症反应特征与机制,为免疫调节治疗提供实验依据。方法:第一部分:野生型C57BL/6小鼠100只,雄性,予以分为5组,假手术组（Sham组）、脑缺血组（MCAO组）、PTx处理脑缺血组（20μg/kg PTx+MCAO组）、脑出血组（ICH组）、PTx处理脑出血组（20μg/kg PTx+ICH组）（随机数字法）,每组20只。采用线栓法对野生型C57BL/6小鼠建立60分钟大脑中动脉缺血再灌注模型。采用胶原酶微量泵注射法制备野生型C57BL/6小鼠脑出血模型。应用改良的神经功能缺损评分量表、转棒疲劳实验检测第1-3天各组小鼠的神经功能损伤情况;用流式细胞术对第3天各组小鼠的病灶侧脑组织免疫细胞浸润情况进行分析,包括小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞;小动物活体成像技术对第3天各组小鼠中枢活性氧进行标记示踪;免疫荧光染色的方法对内皮细胞与紧密连接蛋白ZO-1、内皮细胞与紧密连接蛋白Claudin-5共染,观察第3天各组小鼠的血脑屏障通透性。第二部分:野生型C57BL/6小鼠40只,雄性,予以分为2组,假手术组（Sham组）与脑缺血组（MCAO组）（随机数字法）,每组20只。流式细胞分析比较各组小鼠MCAO模型制备后第3天脑、脾、外周血的ILC2计数;免疫荧光染色法分析少突胶质细胞、星形胶质细胞中IL-33表达水平。应用药理学干预和转基因动物,研究删除、转输或活化ILC2细胞对神经功能评分和梗死体积的影响:分组1)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与删除ILC2组（anti-CD90.2组）（随机数字法）,每组10只。2)应用免疫缺陷的Rag2-/-γc-/-小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与ILC2转输组（ILC2组）（随机数字法）,每组10只。3)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与IL-33处理组（IL-33组）（随机数字法）,每组10只。应用小动物磁共振成像仪T2成像比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天脑梗死病灶体积;改良的神经功能缺损评分量表、转角实验比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天神经功能损伤情况。结果:第一部分:（1）各组小鼠神经功能损伤情况:与MCAO组相比,第1-3天20μg/kg PTx+MCAO组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高（*P<0.05）,转棒疲劳实验小鼠停留的时间明显减少（*P<0.05）。与ICH组相比,20μg/kg PTx+ICH组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高（*P<0.05）,转棒疲劳实验的时间明显减少（*P<0.05）。（2）各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布:与Sham组相比,MCAO组与ICH组小鼠脑内小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞显着增多（*P<0.05）。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞明显增多（*P<0.05）。此外,分别与MCAO、20μg/kg PTx+MCAO组相比,ICH、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8+T细胞明显减少（*P<0.05）。（3）各组小鼠脑氧化应激对比:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的活性氧产生显着增多,氧化应激水平显着增高（*P<0.05）。20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的氧化应激水平较未处理组明显增高（*P<0.05）。（4）各组小鼠血脑屏障染色:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达显着减少。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kgPTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达进一步减少。第二部分:（1）与Sham组相比,MCAO组野生型C57BL/6小鼠脑内ILC2计数明显增多（**P<0.01）,脾与外周血中ILC2计数明显减少（*P<0.05）,提示脑缺血后ILC2向中枢浸润增多。（2）为研究ILC2是否影响脑卒中病理进程,我们利用抗CD90.2单抗删除ILC2及将ILC2转输至Rag2-/-γc-/-小鼠（无T、B、NK细胞）体内,经核磁影像与神经功能评分阐述ILC2对脑卒中预后的影响。实验发现,在脑缺血再灌注后第1-3天,抗CD90.2抗体删除ILC2显着增加小鼠脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。而通过将ILC2转输至Rag2-/-γc-/-小鼠可有效降低脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。上述结果表明ILC2对缺血性脑卒中具有保护作用。（3）继而,我们利用病理切片染色发现,少突胶质细胞是表达IL-33的主要细胞,且在脑缺血再灌注后表达显着上调（*P<0.05）。推测胶质细胞来源的IL-33可能是维持脑部ILC2细胞存活与活化的主要细胞。缺血性脑卒中小鼠体内给予IL-33能够扩增ILC2数量,减小脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。结论:第一部分:PTx引起的系统炎症反应可进一步加重小鼠脑卒中后神经功能损伤程度体现为:中枢内小胶质细胞活化,髓系与淋巴细胞的浸润增多;PTx引起的免疫炎症过程可能与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞在中枢内浸润增高有关,而与小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞的中枢浸润关系不密切。相比ICH模型,MCAO模型以中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8+T细胞的中枢浸润为主,提示天然免疫可能主要参与了脑缺血急性期损伤加重。PTx对小鼠脑内活性氧的产生及其氧化应激水平有进一步放大作用。PTx诱发的炎症反应下调脑卒中后第3天血脑屏障的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的表达,使其破坏加重,进一步扩大脑内免疫炎症反应水平。第二部分:MCAO小鼠脑内有大量的ILC2浸润,而外周ILC2显着减少,提示外周ILC2可能在脑缺血后迁移至脑损伤部位。通过删除或转输ILC2的相关实验提示ILC2可减轻脑缺血再灌注小鼠神经功能损伤和病灶体积,证明ILC2对缺血性脑卒中发挥保护作用。IL-33可在体内扩增ILC2,表明脑内胶质细胞来源的IL-33可能是维持ILC2细胞活化的关键分子。ILC2减小梗死体积、帮助神经功能的修复可能是通过其上游的IL-33调节作用完成,其中少突胶质细胞可能是IL-33的主要来源。
李记泉[4]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中研究表明目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。
赵翀[5]（2020）在《NFATC4及TRPV2在急性髓系白血病中的作用及机制研究》文中研究指明目的:急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是成人最常见的急性白血病类型,主要由造血干细胞的发育停滞在早期阶段并出现恶性增殖所致,基因突变及基因表达改变、异常免疫应答均在其中发挥重要作用。瞬时受体电位通道-辣椒素（Transient receptor potential channel-vanilloid,TRPV）是近年来新发现的一种钙通道,其中TRPV2参与调节细胞的正常生理过程及肿瘤的发生发展,且在免疫系统广泛表达并参与调节免疫应答,但其在AML中的作用目前尚不清楚。我们前期发现TRPV2在AML细胞中高表达,推测TRPV2可能参与AML的发生发展。因此,考虑到免疫应答在肿瘤发生发展中的重要性,本研究第一部分通过生物信息学方法探讨免疫相关基因在AML中的作用及机制;第二部分拟通过体内外实验深入探讨TRPV2在AML发生发展中的作用及机制,并初步了解其是否参与调节AML的免疫应答。方法:1.生物信息学方法探讨分析AML预后相关的关键免疫基因、转录因子、下游KEGG信号通路、免疫基因集及免疫细胞。2.通过RT-qPCR和Western blot技术检测AML细胞系TRPV2的表达情况;敲低TRPV2表达或加入抑制剂,观察TRPV2对AML细胞增殖的影响。3.对THP-1 shControl（Ctr）、THP-1 shTRPV2样本进行RNA-Seq,筛查TRPV2下游关键信号通路,验证TRPV2敲低后下游信号通路中关键基因的表达变化。4.体外rescue实验验证TRPV2通过上述基因及通路影响表型。5.小鼠体内实验进一步验证TRPV2在AML发生发展中的作用。结果:1.NFATC4是与AML预后不良相关的关键免疫基因,受重组活化基因-1（Recombination activating gene 1,RAG1）正向调控（R=0.248,P<0.01）。2.NFATC4影响下游ABC转运蛋白（ABC transporters）信号通路（R=0.309,P<0.001,正相关）,check-point免疫基因集（R=0.300,P<0.001,正相关）及调节T细胞（regulatory T cells,Tregs）（R=0.526,P<0.001,正相关）,与AML不良预后相关。3.AML细胞表达较高的TRPV2,在AML细胞系中通过慢病毒感染敲低TRPV2表达或抑制剂抑制TRPV2活性,细胞增殖能力在24h、48h、72h均较对照组下降（P<0.05）,细胞凋亡率在24h、48h、72h均较对照组升高（P<0.05）。4.在AML细胞系中敲低TRPV2表达后,下游PI3K/Akt信号通路表达下调;加入PI3K抑制剂,Akt磷酸化减少,细胞凋亡增加,过表达TRPV2可扭转该表型。5.体内实验结果显示,慢病毒感染sh Control和sh TRPV2的C1498细胞构建的AML模型小鼠,敲低组外周血CD4+细胞比例升高（27.998%±3.703%vs 21.998%±4.728%）,Tregs比例下降（4.863%±0.873%vs 7.583%±0.918%）,骨髓、脾脏、肝脏白血病细胞负荷减轻,中位生存期较对照组延长（64±25天vs 26±5天）。结论:1.免疫基因NFATC4正向调控ABC转运蛋白信号通路、check-point免疫基因集及Tregs,与AML不良预后相关。2.白血病细胞高表达TRPV2,激活PI3K/Akt通路促进细胞增殖,并且影响免疫微环境,从而促进急性髓系白血病的进展。
王琪[6]（2020）在《双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究》文中指出双峰驼（Camelus Bactrianus）是生存于荒漠和半荒漠草原地带的古老物种,是我国重要的优势畜种资源,具有重要的经济和科研价值。由于双峰驼是严格的季节性发情动物,其生长速度慢、生殖周期长、繁殖性能低,而且双峰驼排卵机理尚不清楚,故而本研究以双峰驼为研究对象,展开蛋白质组及差异蛋白功能的研究。首先,我们选取繁殖季节和非繁殖季节双峰驼（公驼）血清,通过蛋白质组学（i TRAQ）筛选出与生殖相关的差异蛋白,利用生物信息学及分子生物学进一步筛选和鉴定与激素合成分泌相关的差异蛋白-视黄醇结合蛋白（Retinol-Binding Protein 4,RBP4）,并通过体外细胞模型验证RBP4蛋白的功能;其次,通过i TRAQ技术筛选肌肉注射精清（Seminal Plasm,SP）诱导排卵后的卵巢组织差异表达蛋白质;利用内分泌学、组织形态学、影像学及分子生物学进一步筛选出可能参与调控诱导排卵的靶蛋白-钙离子/钙调依赖性蛋白激酶II-γ（Calcium/calmodulin kinase II-γ,CAMK2G）;最后,通过体外卵巢颗粒细胞模型研究CAMK2G对雌激素受体（ER）的调控机制。本研究所取得的结果如下。1.通过i TRAQ方法,共筛选出359个公驼的血清蛋白,基于1.2和0.8的倍数变化临界值,且p<0.05,共筛选出32种差异蛋白（11种上调和21种下调）;筛选和鉴定了5个与生殖相关的差异蛋白（PCGF5、H1.2、ANTXR2、FOLR1和RBP4）。2.RBP4在性腺轴中均有不同程度的表达,但在睾丸组织中RBP4表达水平较高;双峰驼支持细胞中添加不同浓度的Vit A,可以影响IGFs、RBP4和AR的表达水平,且对RBP4（负相关）和AR（正相关）有剂量依赖性;过表达（敲低）RBP4对IGFs的表达有抑制（促进）作用,并且同时下调（上调）AR的表达水平;RBP4可通过类固醇合成通路调控雄激素受体AR的表达。3.通过i TRAQ共筛选出404个卵巢差异表达蛋白,260个上调蛋白（SP组）,144个下调蛋白,进一步筛选出5个可能参与诱导排卵的差异蛋白（CAMK2G、FST、NR5A1、PAK1和PRL）;通过RT-PCR、Western blot和组织免疫荧光等发现,排卵前后差异蛋白在性腺轴及生殖器官中表达水平不同,推测诱导排卵过程均有性腺轴的参与。4.调控CAMK2G的表达水平对各受体及相关蛋白有不同影响;过表达/敲低CAMK2G可以上调/下调ER的表达水平;CAMK2G的特异性抑制剂KN-93可下调ER的表达水平;CAMK2G可通过介导17βHSD和P450scc的表达来调节类雌激素受体（ER）的表达水平。本研究揭示:RBP4与公驼的繁殖相关,主要参与调节雄激素的合成,故而推测RBP4可作为一个调控因子调控激素的合成分泌;CAMK2G通过参与类固醇通路调控雌激素受体的表达,推测CAMK2G可能是双峰驼诱导排卵过程的一个调控分子。
涂宏蕾[7]（2020）在《运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用》文中指出目的:血液恶性肿瘤的免疫治疗在近几年已经实现了重大的突破。然而,部分患者免疫治疗后出现耐药和复发,不同患者或同一患者不同阶段,对相同免疫疗法反应不同,存在严重异质性,然而,我们现阶段,对免疫治疗异质性的理解还严重不足。传统的研究方法是基于大样本,从整体水平来研究肿瘤对治疗的反应,而忽视了单个免疫细胞活性状态的差异,免疫突触的形成,免疫细胞对肿瘤靶细胞的识别,以及免疫细胞杀伤效率存在异质性的问题。为了克服这个缺陷,本课题基于急性髓系白血病（AML）免疫治疗的需求,设计了能在单细胞层面观察免疫细胞和白血病细胞相互识别,相互作用的微流控芯片。运用该微流控芯片,能够精确控制白血病细胞和T细胞的数量和比例,以及所处的内环境,同时,利用微流控芯片高通量的优点,能够一次追踪大量的T细胞与白血病细胞之间动态的相互作用。我们期望我们建立的单细胞研究平台在未来,有潜力可以作为辅助诊断工具,更好的评估患者接受过继性免疫细胞疗法的疗效以及异质性,为临床个体化的免疫治疗方案的设计提供技术支持。方法:1.设计并制备一种微流控芯片,与细胞原位孵育系统及显微镜延时成像系统（time-lapse imaging）整合,追踪T细胞和白血病细胞的动态运动轨迹,以定量分析T细胞的效应功能。2.通过调控输入细胞浓度的初始浓度,从1?106/m L-20?106/m L,以及不同的效靶比,以使单个微流控芯片井中获得最佳的T细胞-白血病细胞对。3.选择OT-I＿OVA体系用于体外单细胞研究抗原提呈,T细胞活化。细胞分组情况如下:（1）阳性对照组:OT-I＿C1498-OVA+;（2）阴性对照组:Na?ve T细胞＿C1498-OVA+,Na?ve T来自于普通C57BL/6小鼠的脾脏;（3）阴性对照组:OT-I＿C1498-OVA-。4.Fluo-4钙离子荧光探针预处理OT-I细胞,研究T细胞免疫突触形成的异质性。5.充分混合的OT-I细胞和C1498细胞悬浮液中加入小鼠来源抗PD-1抗体,来研究免疫检查点抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响。实验分两组:（1）治疗组:OT-T＿C1498+PD-1抗体;（2）对照组:OT-T＿C1498。结果:1.我们发现OT-I＿C1498-OVA+组显示出明显更高的细胞死亡,且随时间不断增加,显着高于Na?ve T细胞＿C1498-OVA+和OT-I＿C1498-OVA-组,5小时内三组的细胞死亡率分别为32.89%,16.09%和14.75%。63.28%的OT-I细胞能够在5小时内杀死了一个或多个OVA+的白血病细胞（C1498）,对OVA-的C1498细胞,仅有9.51%的OT-I细胞能够识别并且发挥细胞毒作用,同样,Na?ve T细胞对C1498细胞基本不能识别,仅表现了非特异性杀死,杀伤率为8.30%,后两组比较（OT-I＿C1498-OVA-和Na?ve T细胞＿C1498-OVA+）没有明显的统计学差异。2.由于T细胞抗原受体的参与和T细胞活化,同一来源的单个T细胞发挥细胞毒性所需的时间具有很强的异质性。51%的OT-I细胞能够在50分钟内杀死白血病C1498细胞。只有16.3%的OT-I细胞能够在20分钟内杀死白血病细胞,在20-30分钟之间杀死白血病细胞的T细胞占14.5%。自T细胞的激活,18.2%的T细胞需要大于等于60分钟才能杀死白血病C1498细胞。3.T细胞发挥杀伤作用时,T细胞与白血病细胞之间的初始距离从0μm到18μm不等。当T细胞和C1498细胞直接接触时,有85%的C1498细胞被杀死,而初始距离在1至15μm之间时,有15%的C1498细胞被杀死。4.同种来源的T细胞杀伤能力的异质性:有54.5%的T细胞在5小时内杀死了1个白血病细胞,而有4.9%的T细胞杀死了2个白血病细胞,只有0.78%的T细胞杀死了3个或更多的白血病细胞,剩余占39.8%的T细胞没有杀死任何白血病细胞。5.从最初的白血病细胞与T细胞相互接触到白血病细胞死亡,我们总共分析了522个被T细胞杀死的白血病细胞。细胞死亡时间从20分钟到300分钟不等,重要的是,自T细胞与靶细胞最初接触,有90%的杀伤发生在相互接触90分钟之后。白血病细胞死亡数量最多是发生在接触后3.5小时到4小时,占死亡总数的22.4%。6.我们分析了对照组中1024个OT-I细胞的杀伤效率和有PD-1抗体的实验组中的777个OT-I细胞的杀伤效率。结果显示:微环境中加入PD-1抗体后,OT-I细胞在5小时内的杀伤效率明显增强,并且PD-1抗体能部分加速T细胞对靶细胞的杀伤。在3.5小时的时候,对照组和治疗组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为37.52%±5.33 vs 61.48%±7.86（p<0.05）;在5小时的时候,两组中OT-I细胞的总杀伤效率分别为63.28%±2.93 vs 73.04%±3.7（p<0.05）。7.在5小时内,在对照组中,没有发挥细胞毒性的T细胞占总T细胞的39.8%。而在使用了PD-1抗体的实验组中,仅有27.3%的T细胞没有发挥细胞毒性,明显低于对照组（p<0.05）。此外,在对照组中,分别杀死1、2和3个白血病C1498细胞的T细胞分别占统计的总的T细胞数量的54.47%,4.92%和0.77%,均明显低于加入了PD-1抗体的治疗组,治疗组结果为:60.77%,10.53%和1.43%。8.在行免疫检查点（PD-1）抑制治疗后,在对照组（没有用PD-1抗体）中,在2小时内被T细胞攻击致死的C1498细胞数量占死亡总数的12.06%,而在治疗组中,2小时内被杀死细胞的比例为30.85%。在治疗组中,当C1498细胞与T细胞接触时间在3-3.5之间,细胞死亡的比例达到最大,比对照组的3.5-4小时达到最大比例提前了半小时。结论:使用我们的微流控芯片和OT-I＿OVA系统能够很好的体外观察T细胞的抗原识别,杀伤,具备在单细胞水平研究T细胞-靶细胞相互作用的异质性的可行性。本研究成功阐述了单个免疫细胞-靶细胞的异质性,以及免疫检查点抑制（PD-1/PD-L1）对细胞异质性的影响。此外,从方法学来看,这项研究基于微流控芯片,为探讨细胞间间隙连接,细胞内脂质变化,旁分泌以及细胞耐药提供了一个新的技术平台。此平台具有方便,快速,高通量和易操作的优点。能够为研究疾病的早期诊断以及细胞间的相互作用提供帮助。该技术平台为在单细胞水平上研究癌症免疫治疗的疗效和耐药性开辟了新的途径,增强我们对癌症免疫治疗基础理论的探索,为设计个性化的癌症免疫疗法提供理论支持。
张英驰[8]（2020）在《电磁场治疗通过促进骨髓间充质干细胞迁移和成骨分化调节骨重塑的机制研究》文中认为目的:骨成熟后,总是处于不断吸收和形成过程,我们称之为骨重塑。骨吸收和骨形成的动态平衡是骨组织应力适应和损伤修复的基础。骨重塑的失调伴随着各种骨疾病的产生。在骨重塑的过程中,破骨细胞溶解骨基质后释放的细胞因子诱导间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）向骨吸收部位定向迁移,然后分化为成骨细胞,并修复被吸收的骨质。故MSC的迁移能力和分化方向对骨重塑的正常运转至关重要。在与骨量减少相关的骨科疾病中,可观察到MSC的迁移能力和成骨分化的减弱。早在20多年前,科学家们发现电磁场可治疗骨折的延迟愈合。因其无创和副作用小的特点,电磁场治疗在骨科疾病中有巨大的应用潜力。已有的研究证实了电磁场可促进MSC的成骨分化,但其机制仍未十分明确。另外,电磁场对MSC的迁移能力是否有一定影响,尚未有研究报导。因此,本研究对电磁场在MSC迁移和成骨分化中发挥的生物学效应进行了实验研究。方法:本研究以人骨髓间充质干细胞（h-BMSC）作为细胞模型,应用的电场磁场为7.5-75 Hz/1 m T正弦交变电磁场,实验分两部分完成。第一部分:研究电磁场对h-BMSC迁移能力的影响及可能机制。首先,我们利用Transwell迁移试验检测不同频率（7.5、15、30、50和75 Hz）电磁场刺激后h-BMSC迁移能力的改变。经过筛选,50 Hz/1 m T的电磁场刺激对h-BMSC的促迁移效应最强。然后,在50 Hz/1 m T电磁场刺激的同时应用L型钙通道阻断剂维拉帕米（10μM）和/或黏着癍激酶（FAK）抑制剂PF573228（5μM）,检测细胞内Ca2+含量、细胞粘附蛋白（FAK、Tailin和Vinculin）的表达、Rho家族GTP酶（Rho A、Rac1和Cdc42）的活性和细胞骨架F-actin的组建,以明确电压门控钙通道（voltage-gated calcium channel,VGCC）、FAK、Rho家族GTP酶（Rho GTPases）在电磁场促h-BMSC迁移效应中扮演的角色,以及他们之间的上下游关系。第二部分:研究电磁场促h-BMSC成骨分化的潜在机制。首先,我们检测了h-BMSC在成骨诱导培养联合不同频率（7.5、15、30、50和75 Hz）电磁场刺激过程中一种配体门控钙离子通道——嘌呤受体P2X7的表达量。用上述实验筛选出15 Hz/1m T电磁场联合成骨诱导培养基刺激h-BMSC 7 d（8 h/d）后,检测P2X7下游的Akt/GSK3β/β-catenin通路的改变。然后,我们利用P2X7特异性抑制剂A740003（5μM）和/或PI3K抑制剂LY294002（10μM）,检测当P2X7和/或PI3K被阻断后电磁场对Akt/GSK3β/β-catenin通路活性和h-BMSC成骨分化的影响。另外,我们还在h-BMSC成骨诱导的过程中,联合应用电磁场和P2X7激动剂（Bz ATP和ATP）,检验二者是否具有协同促成骨效应。结果:第一部分中,我们发现不同频率（7.5、15、30、50和75 Hz）电磁场均具有一定的促h-BMSC迁移的效应,其中50 Hz/1 m T的电磁场刺激对h-BMSC的促迁移效应最强。50 Hz/1 m T电磁场刺激可使h-BMSC 24 h后,细胞内Ca2+含量升高、细胞粘附蛋白（FAK、Tailin、Vinculin）的表达增加、Rho GTPases（Rho A、Rac1、Cdc42）的活性增强和F-actin的组建增加。10μM维拉帕米可部分抑制电磁场介导的促迁移效应和细胞内Ca2+含量的升高。在50 Hz/1 m T电磁场刺激的同时,单独或联合使用维拉帕米（10μM）和PF573228（5μM）,均可部分抑制电磁场对粘附蛋白表达、Rho GTPases活性和F-actin组建的促进作用,其中维拉帕米和PF573228联合使用并未比二者单独使用产生更显着的抑制效果。第二部分中,我们发现不同频率电磁场均可增加成骨分化过程中h-BMSC的P2X7的表达,而对非成骨诱导状态下的h-BMSC中的P2X7表达无明显影响。其中15 Hz/1 m T电磁场诱导P2X7表达的效果最强,这种诱导效应随电磁场刺激时间的增加而增强,并在14 d达到最高点。15 Hz/1 m T电磁场对成骨诱导的h-BMSC刺激7 d后,成骨标志物RUNX2、ALP和OPN的表达增加,钙结节的形成显着增多,而A740003（5μM）和/或LY294002（10μM）可部分逆转这一效应。我们也检测了P2X7下游的Akt/GSK3β/β-catenin通路相关蛋白的表达,结果表明15 Hz/1 m T电磁场刺激7 d可显着升高磷酸化Akt、磷酸化GSK3β和核内β-catenin的水平,而这种效应可被A740003（5μM）或LY294002（10μM）所抑制,其中LY294002的抑制程度更强,且这两种抑制剂联合应用与单独应用LY294002的抑制程度无显着差异。最后,我们还发现电磁场和P2X7激动剂（Bz ATP和ATP）单独或联合应用均可促进成骨诱导的h-BMSC中RUNX2、ALP和OPN等成骨标志物的表达,且联合治疗的促进作用显着强于单独应用电磁场或P2X7激动剂。结论:电磁场可通过增强h-BMSC的迁移能力和成骨分化,促进骨形成,调节骨重塑的平衡。电磁场在促进h-BMSC迁移的过程中,首先激活VGCC,增加细胞内Ca2+浓度,细胞内Ca2+的累积激活FAK,增强了黏着癍的形成。同时FAK通过激活Rho GTPases增强细胞骨架的组建,这些变化共同促进了h-BMSC的迁移。在h-BMSC的成骨分化的过程中,持续的电磁场刺激可诱导钙离子通道受体P2X7的表达,这些表达上调的P2X7激活其下游的Akt/GSK3β/β-catenin通路,促进h-BMSC成骨分化。并且,P2X7激动剂的使用与电磁场治疗有协同促成骨作用。本研究立足于以往研究的基础上,对电磁场治疗调节骨重塑的方式和作用机制做出了补充,为进一步理解电磁场的生物学效应及临床应用电磁场治疗骨科疾病提供了理论依据。
张九阳[9]（2020）在《MicroRNA363与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关分子机制的研究》文中研究指明弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,抗CD20单抗联合以蒽环类为基础的多药免疫化疗方案（R-CHOP）可使超过半数患者获得完全缓解甚至治愈。但是,复发难治性DLBCL患者缺乏有效的治疗手段。DLBCL一线免疫化疗耐药的机制十分复杂,抗CD20单抗的耐药性是其中的重要内容。抗CD20单抗靶向人成熟B细胞表面CD20分子,通过抗体依赖的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用和诱导凋亡等机制发挥抗肿瘤作用。因此,肿瘤细胞CD20表达减少或缺失是抗CD20单抗耐药的主要原因。microRNA（miR）-363 来源于 miR-17-92 家族 miR-106a-363 基因簇,我们的前期研究显示miR-363在R-CHOP耐药患者中显着高表达,miR-363高表达与DLBCL患者的不良预后具有显着相关性,但miR-363高表达的机制尚不明确。使用UCSC数据库对miR-106a-363基因簇及其上游序列进行分析发现,在miR-363编码序列上游4kb处存在活化启动子相关的H3K4me3、H3K27Ac以及CpG岛等结构,提示CpG岛附近可能存在潜在的启动子调控元件。荧光基因报告试验证实序列具有启动子功能,是miR-106a-363基因簇的启动子。进一步研究显示,转录因子c-Myc能够与miR-106a-363基因簇启动子结合,调控miR-363表达。同时,c-Myc的结合能力受启动子甲基化水平的调控。综上所述,我们的研究发现miR-106a-363基因簇具有独特的启动子元件,其CpG岛甲基化水平负调控c-Myc介导的miR-363表达。以往研究认为CD20分子具有钙离子通道功能或直接调节钙离子通道活性,钙离子内流对抗CD20单抗介导的细胞凋亡十分重要。然而,有研究发现CD20缺陷的B细胞仍有钙离子内流反应,提示在B细胞中存在其他钙离子调节机制。近期报道B细胞表达一系列钙离子通道蛋白,参与调控细胞内钙离子浓度。我们的研究发现,L-型钙离子通道家族成员CACNA1C在R-CHOP耐药DLBCL患者中低表达,随后的研究显示CACNA1C通过与CD20分子相互作用稳定CD20蛋白结构,抑制CD20蛋白通过泛素化-蛋白酶体途径降解,维持CD20蛋白在DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性,进而影响肿瘤细胞对抗CD20单抗的敏感性。荧光素酶报告试验证实miR-363负调控CACNA1C表达,miR-363过表达导致肿瘤B细胞表面CD20表达降低,诱导抗CD20单抗耐药。多种小分子物质能够调控L-型钙离子通道蛋白的活性,影响钙离子内流和细胞内钙离子浓度,进而调节细胞凋亡过程。我们的体外细胞试验和小鼠模型研究证实CACNA1C相关的L-型钙离子通道激动剂能够促进钙离子内流,增加抗CD20单抗诱导的肿瘤细胞凋亡,CACNA1C蛋白表达未受影响,提示L-型钙离子通道激动剂具有增加抗CD20单抗疗效和克服其耐药的潜在能力,L-型钙离子通道拮抗剂具有降低抗CD20单抗疗效和诱导耐药的可能性。综上所述,本研究创新性发现miR-363高表达与DLBCL免疫化疗耐药相关,miR-106a-363基因簇启动子区高甲基化状态抑制转录因子c-Myc介导的miR-363表达;L型钙离子通道蛋白CACNA1C通过与CD20蛋白相互作用,维持CD20蛋白在DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性;miR-363通过负调控CACNA1C表达导致抗CD20单抗耐药;L-型钙离子通道调节剂能够影响抗CD20单抗介导的钙离子内流,从而影响其抗肿瘤作用,成为提高疗效的潜在方法。第一部分:弥漫大B细胞淋巴瘤中miR-363调控机制的研究目的研究miR-363受启动子甲基化调控与DLBCL不良预后的相关性及其机制。方法从UCSC数据库获取miR-106a-363基因簇上游序列,生物信息学方法预测潜在的启动子区及功能元件。在293T细胞株中使用荧光报告基因试验验证所预测启动子的功能。在DLBCL细胞株中使用Western Blotting和ChIP方法检测c-Myc表达及miR-106a-363基因簇启动子与c-Myc结合情况;RT-PCR、BSP法检测不同DLBCL细胞系DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理前后的miR-106a-363基因簇启动子甲基化水平与miR-363表达的关系。结果1.miR-106a-363基因簇具有独立的启动子结构,位于编码序列上游约4Kb处,荧光报告基因试验证实了该序列具有启动子功能,调控miR-363的转录。2.miR-106a-363基因簇启动子区CpG岛存在4个E-box结构,转录因子c-Myc通过与E-box 2区结合调控miR-363表达,该区域甲基化水平与miR-363表达呈负相关。3.使用DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理DLBCL细胞可降低miR-106a-363启动子E-box 2甲基化水平,上调miR-363表达。结论1.miR-106a-363基因簇具有独立的启动子序列,转录因子c-Myc结合启动子区E-box结构调控miR-106a-363基因簇的转录。2.DLBCL细胞中miR-106a-363启动子区CpG岛甲基化通过抑制c-Myc与E-box结合负调控miR-363表达。第二部分:miR-363介导弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制的研究目的研究miR-363负调控CACNA1C表达与DLBCL细胞对抗CD20单抗耐药的机制。方法以初治DLBCL患者标本为研究对象,检测R-CHOP方案耐药和敏感患者肿瘤细胞CACNA1C蛋白表达水平,分析其与患者预后的相关性。荧光素酶报告试验验证miR-363与CACNA1C表达的相关性。以DLBCL细胞株为研究对象,验证miR-363与CACNA1C表达的相关性及对抗CD20单抗敏感性的影响。构建CACNA1C稳定低表达细胞株,检测对抗CD20单抗疗效的影响。构建小鼠移植瘤模型,观察CACNA1C表达与肿瘤生长和对抗CD20单抗敏感性的关系。荧光定量PCR、免疫荧光、免疫共沉淀、Western Blot检测CANCA1C表达与CD20间的关系。使用蛋白酶体抑制剂处理CACNA1C低表达细胞株,检测CD20蛋白变化。使用L-型钙离子通道激动剂Bay K8644和抑制剂尼莫地平处理OCI-Ly3、OCI-Ly7、OCI-Ly8,流式细胞术检测细胞凋亡,使用DLBCL患者组织构建小鼠PDX模型,观察L-型钙离子通道调节剂对抗CD20单抗敏感性的影响。构建miR-363过表达和敲除的DLBCL细胞株,体外验证miR-363对CACNA1C的调控和对DLBCL细胞的影响。结果1.CACNA1C低表达与R-CHOP方案耐药和不良生存相关,是R-CHOP方案的独立不良预后因素,但是,CHOP方案治疗的DLBCL患者中CACNA1C表达与预后无显着相关性。CACNA1C在正常B细胞发育不同阶段表达存在差异。2.CACNA1C低表达在体外抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡,在小鼠移植瘤模型中抑制抗CD20单抗介导的肿瘤消减。3.抗CD20单抗处理后B细胞表面CACNA1C和CD20存在相互作用,这种蛋白互作抑制CD20降解,增强CD20蛋白稳定性。4.体外和小鼠模型研究证实L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控CACNA1C功能,影响抗CD20单抗介导的钙离子内流,调节DLBCL细胞对抗CD20单抗的敏感性。5.miR-363负调控CACNA1C表达并引起CD20蛋白表达下降,抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡。结论1.miR-363负调控CACNA1C表达,增加CD20蛋白通过蛋白酶体途径降解,介导抗CD20单抗耐药。2.靶向CACNA1C相关的L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控钙离子内流影响抗CD20单抗的疗效。
苏雪莲[10]（2020）在《细胞松弛素B诱导的细胞凋亡早期细胞力学特性改变研究》文中认为癌症已成为仅次于心脑血管疾病的第二大人类死亡原因,其主要的治疗方法之一是化疗。但是,由于现有的化疗药物用药后易产生耐药性以及对某些肿瘤细胞的抑制作用差,导致抗癌治疗效果不显着,迫切需要开发新型化疗药物。文献已报道癌细胞的肌动蛋白微丝骨架很不稳定,然而,目前还没有一种针对肌动蛋白微丝骨架的特效药被应用于临床。临床常用的化疗药以微管靶向作用为主,不能有效地干扰癌细胞的微丝骨架聚合而发挥抗癌作用。细胞松弛素作为一类微丝骨架解聚试剂,可用于干扰癌细胞微丝的聚合,研究其对癌细胞的抑制作用,并了解其对肿瘤细胞杀伤机制。一直以来,关于细胞凋亡的研究主要集中在细胞生化、分子生物学、凋亡分子间相互调控以及晚期凋亡细胞的生物力学方面。而对凋亡早期细胞的力学特性改变的研究开展的非常少,特别是微丝骨架的解聚和细胞内分子拥挤度的加剧与线粒体损伤、细胞表面超微结构改变之间的关联性仍然是一个没有被认识和研究的科学问题。这些问题的解决对于认识微丝靶向试剂诱导的细胞凋亡机制和开发抗癌新药具有重要的研究价值。针对上述存在的问题,本研究基于细胞松弛素B（cytochalasin B,CytB）的微丝骨架解聚作用,建立细胞凋亡和细胞内分子拥挤实验模型。采用细胞力学和纳米形态学的方法以及免疫荧光、免疫印迹等分子生物技术,研究凋亡早期细胞力学特性的改变、力学凋亡机制以及细胞力学与生物学凋亡之间的关联性。将细胞力学凋亡机制纳入到以微丝靶向抗癌药物的研发及其毒副作用的研究中,获得如下创新性研究成果:1.通过比较CytB对微丝骨架稳定性不同的宫颈癌Hela细胞和BMSCs的抑制作用,发现在相同的药物浓度下,Hela细胞的生长抑制率和凋亡率均高于BMSCs。且3倍于Hela细胞药物浓度干预BMSCs,其凋亡率仍低于Hela细胞。此外,用药后两种细胞的微丝骨架不同程度地解聚、杨氏模量和体积减小。这些结果表明CytB对Hela细胞有明显的杀伤作用,但对BMSCs存在一定的毒副作用。这种副作用通过破坏细胞的力学结构、改变力学特性,导致细胞损伤,甚至凋亡。2.基于CytB对Hela细胞的杀伤作用,采用AFM、SEM和CLMS对凋亡早期的细胞的力学特性、表面超微结构、细胞内分子拥挤度进行定量研究和定性分析。发现微丝解聚导致细胞的体积减小、表面粗糙度增加以及细胞内分子拥挤度加剧。结合前人用CytB诱导Hela细胞发生线粒体途径凋亡的研究和类细胞内分子拥挤的计算机模型研究的结果,本工作首次引用“分子拥挤模型”来分析和解释由于CytB引起的微丝骨架解聚造成的细胞内分子拥挤与线粒体损伤和细胞表面粗糙度增加之间的相互关系。可知分子拥挤引发细胞内大分子,如微丝碎片、线粒体等向细胞膜侧重新定位和分布,甚至被挤出细胞膜,导致细胞线粒体转运障碍、损伤和表面粗糙度增加,导致细胞凋亡。3.通过用单细胞力学、Western blot、免疫荧光等实验方法,对处于凋亡早期细胞的力学性质、纳米形态学和凋亡相关分子进行定量研究和定性分析。发现细胞杨氏模量和体积的减小、表面粗糙度的增加均发生在PS膜外翻、Fas/CD95活化之前。这些结果表明在生物学上尚未发生凋亡的细胞,其杨氏模量早已改变,细胞活力已经下降。提示细胞杨氏模量的减小可被看作是细胞松弛素诱导的细胞损伤和凋亡的一个力学指标,用于微丝靶向抗癌药物抑癌效果的评价。
二、CAA患者造血干细胞内Ca~(2+)含量、CD95~+表达水平及相关因素的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CAA患者造血干细胞内Ca~(2+)含量、CD95~+表达水平及相关因素的研究（论文提纲范文）
（1）血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 三七、三七总皂苷各成分对脑卒中的研究进展 |
| 1 中药三七和其成分的研究 |
| 2 三七总皂苷及其各成分对脑卒中的研究进展 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 LINGO-1及其下游信号通路在缺血性脑卒中后神经再生的机制研究 |
| 1 LINGO-1 |
| 2 EGFR |
| 3 PI3K//AKT |
| 4 PTEN |
| 5 GSK-3β |
| 6 PTE、AKT以及GSK-3β的关系 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 大鼠MCAO模型的建立和评价 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 血塞通对MCAO大鼠术后28天LINGO-1,EGFR以及下游PI3K/AKT通路的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 血塞通对MCAO大鼠术后28天PTEN和GSK-3β的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 血塞通对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 mNSS神经功能评分表 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（2）基于线粒体-内质网连接探究松龄血脉康对脑缺血再灌注损伤保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 松龄血脉康治疗脑缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 1.“血脉同治”理论和松龄血脉康的组方依据 |
| 2.CIRI与松龄血脉康胶囊 |
| 3.总结 |
| 参考文献 |
| 综述二 脑缺血再灌注损伤对线粒体-内质网连接影响的机制研究进展 |
| 1.CIRI时,MERC与Ca~(2+)稳态紊乱 |
| 2.CIRI时,MERC与线粒体能量代谢障碍 |
| 3.CIRI时,MERC与ERS介导的细胞凋亡 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 实验一 松龄血脉康对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 松龄血脉康对CIRI大鼠脑线粒体-内质网结构和Ca~(2+)转运通道的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 松龄血脉康对CIRI大鼠脑组织线粒体相关功能的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 松龄血脉康对CIRI大鼠脑组织内质网凋亡通路蛋白的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在校期间主要研究成果 |
（3）免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 PTx引发的炎性反应对脑卒中动物模型的影响与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组小鼠神经功能损伤情况 |
| 2.2 各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布 |
| 2.3 各组小鼠脑氧化应激对比 |
| 2.4 各组小鼠血脑屏障染色 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 2型固有淋巴细胞对缺血性脑卒中动物模型的影响与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺血性脑卒中后小鼠脑与外周ILC2数量变化 |
| 2.2 ILC2对缺血性脑卒中小鼠神经功能与脑梗死体积的影响 |
| 2.3 缺血性脑卒中后第3天小鼠少突胶质细胞是IL-33的主要来源 |
| 2.4 IL-33能够扩增ILC2细胞数量,减少缺血性脑卒中小鼠神经功能缺损与脑梗死体积 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脑血管病的发病机制、诊断与治疗方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 针刺治疗心肌缺血及相关分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（5）NFATC4及TRPV2在急性髓系白血病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 NFATC4 在急性髓系白血病进展中的作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.数据准备和差异基因分析 |
| 2.预后相关免疫基因识别 |
| 3.下游KEGG信号通路、免疫基因集、免疫细胞识别 |
| 4.多数据库验证 |
| 5.统计学分析 |
| 6.本研究的分析流程 |
| 结果 |
| 1.NFATC4 的表达与AML预后差相关 |
| 2.NFATC4 通过调控下游的ABC transporters信号通路、check-point免疫基因集、Treg免疫细胞影响AML预后 |
| 3.RAG1、NFATC4、ABC transporters信号通路、check-point免疫基因集、Tregs之间相互作用以网络图展示 |
| 4.多个线上数据库验证RAG1、NFATC4、ABC transporters信号通路、check-point免疫基因集和Treg免疫细胞中关键基因相关性、预后相关性.. |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 TRPV2 在急性髓系白血病进展中的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.TRPV2 的高表达与AML患者的不良预后相关 |
| 2.TRPV2 正性调控AML细胞的增殖 |
| 3.TRPV2 通过影响凋亡调控AML细胞的增殖 |
| 4.TRPV2 通过激活PI3K/Akt信号通路影响细胞凋亡 |
| 5.TRPV2 在小鼠AML进展中发挥重要作用 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士研究生学位期间发表及待发表学术论文目录 |
（6）双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略表 |
| 第一章 综述 |
| 1.骆驼的生殖生理 |
| 1.1 骆驼的分类及分布 |
| 1.2 骆驼的生殖特性 |
| 1.3 骆驼生殖生理 |
| 2 视黄醇及其代谢过程 |
| 2.1 视黄醇与动物生殖 |
| 2.2 视黄醇结合蛋白RBP的研究进展 |
| 2.3 视黄醇结合蛋白的作用机理 |
| 2.4 视黄醇结合蛋白在生殖疾病方面的研究 |
| 3 钙离子及其代谢过程研究进展 |
| 3.1 钙离子的功能 |
| 3.2 钙离子与生殖 |
| 3.3 钙离子与钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ |
| 3.4 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的生理功能 |
| 3.5 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ与生殖相关疾病的关系 |
| 4 本实验的研究目的意义及创新点 |
| 第二章 双峰驼血清差异蛋白的筛选与鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 血清蛋白的提取 |
| 1.3.2 过滤辅助样品制备(FASP)消解 |
| 1.3.3 iTRAQ标记和SCX分馏 |
| 1.3.4 LC-MS/MS分析 |
| 1.3.5 数据分析 |
| 1.3.6 血清RNA的提取及qPCR反应 |
| 1.3.7 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹 |
| 1.3.8 统计与分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 双峰驼血清iTRAQ分析 |
| 2.2 鉴定差异表达蛋白 |
| 2.3 聚类分析和蛋白质间互作网络(PPI)分析 |
| 2.4 qPCR和 Western blot验证表达谱 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 维生素A结合蛋白(RBP4)对AR的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞原代培养 |
| 1.2.2 体外细胞处理和转染 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR |
| 1.2.4 免疫组织化学染色 |
| 1.2.5 免疫荧光染色 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RBP4 基因在双峰驼各组织的mRNA检测 |
| 2.2 RBP4在双峰驼性腺轴的检测 |
| 2.3 不同浓度VitA对其受体,结合蛋白(RBP4)及IGFs的影响 |
| 2.4 RBP4过表达载体的构建及其酶切鉴定 |
| 2.5 支持细胞转染过表达p-EGFP-RBP4 的效果检测 |
| 2.6 过表达RBP4对IGFs及类固醇激素合成的影响 |
| 2.7 siRNA-RBP4 的合成及沉默效率检测 |
| 2.8 沉默RBP4对IGFs及类固醇激素合成通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 双峰驼精清诱导排卵后卵巢差异蛋白质筛选 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物和处理条件 |
| 1.2.2 精液收集和精清制备 |
| 1.2.3 精清注射及血清样品收集 |
| 1.2.4 样品的采集 |
| 1.2.5 qRT-PCR和 RT-PCR |
| 1.2.6 蛋白质印迹 |
| 1.2.7 组织免疫荧光染色 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 卵泡直径和血清激素水平 |
| 2.2 蛋白质分析 |
| 2.3 差异表达蛋白的鉴定 |
| 2.4 蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)分析 |
| 2.5 表达谱验证 |
| 2.6 组织表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CAMK2G通过类固醇通路调控ER的表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度抑制剂处理细胞 |
| 1.2.2 细胞转染及其它方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CAMK2G的表达分析 |
| 2.2 过表达载体p-EGFP-CAMK2G酶切验证 |
| 2.3 双峰驼颗粒细胞转染过表达p-EGFP-CAMK2G的效果检测 |
| 2.4 过表达CAMK2G对各受体的影响 |
| 2.5 过表达CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响 |
| 2.6 siRNA-CAMK2G沉默效率的检测 |
| 2.7 敲低CAMK2G对各受体及PPI各相关蛋白的影响 |
| 2.8 敲低CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响 |
| 2.9 抑制剂KN-93对CAMK2G的影响 |
| 2.10 抑制剂KN-93对各受体及PPI各相关蛋白的影响 |
| 2.11 抑制剂KN-93对类固醇激素合成通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（7）运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词简表 |
| 1 引言 |
| 第一部分 用于AML单细胞研究的微流控芯片的设计与优化 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 芯片的结构和尺寸 |
| 3.2 实验的设置 |
| 3.3 芯片内细胞分布 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 运用微流控芯片在单细胞水平研究AML免疫治疗的异质性 |
| 5 材料与方法 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 本课题中OT-I_OVA细胞体系的选择与验证 |
| 6.2 在微流控芯片上研究T细胞免疫突触形成的异质性 |
| 6.3 T细胞与靶细胞的初始距离对T细胞细胞毒性的影响 |
| 6.4 T细胞与癌细胞的初始比例对T细胞杀伤效率的影响 |
| 7 讨论 |
| 第三部分 免疫检查点(PD-1/PD-L1)抑制在单细胞水平对AML免疫治疗的影响 |
| 8 材料与方法 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 9 结果 |
| 9.1 免疫检查点(PD-1)抑制后,T细胞杀伤效率的评估 |
| 9.2 免疫检查点(PD-1)抑制对单个T细胞杀伤能力的影响 |
| 9.3 免疫检查点(PD-1)抑制对单个白血病细胞死亡时间的影响 |
| 10 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 AML患者的免疫机制及治疗进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（8）电磁场治疗通过促进骨髓间充质干细胞迁移和成骨分化调节骨重塑的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 电磁场通过激活电压门控钙通道促进骨髓间充质干细胞迁移 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 电磁场促进间充质干细胞P2X7表达从而增强成骨分化 |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 电磁场与干细胞治疗在骨组织工程中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录2 人骨髓间充质干细胞购买证明 |
（9）MicroRNA363与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 弥漫大B细胞淋巴瘤中MIR-363调控机制的研究 |
| 前言 |
| 1 主要试剂及仪器 |
| 2 主要实验步骤 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 MIR-363介导弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制的研究 |
| 前言 |
| 1 主要试剂及仪器 |
| 2 主要实验步骤 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 表观遗传调控因子和钙离子通道与肿瘤发生和耐药相关机制的研究进展 |
| 1 表观遗传调控因子与肿瘤发生和耐药 |
| 2 钙离子通道与肿瘤的发生和耐药 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 在学期间发表文章 |
| 在学期间获得的奖励 |
| 课题及成果 |
| 致谢 |
（10）细胞松弛素B诱导的细胞凋亡早期细胞力学特性改变研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 癌症治疗及癌细胞凋亡研究现状 |
| 1.2.1 细胞凋亡分子机制研究 |
| 1.3 细胞松弛素抗癌研究现状——微丝靶向抗癌试剂 |
| 1.3.1 细胞松弛素B抗癌研究 |
| 1.3.2 微丝靶向试剂抗癌的生物学基础 |
| 1.3.3 肌动蛋白解聚与线粒体损伤 |
| 1.3.4 肌动蛋白解聚与细胞膜死亡受体活化 |
| 1.4 细胞内分子拥挤的模拟研究 |
| 1.4.1 细胞内分子拥挤实验研究 |
| 1.4.2 约束空间内缓冲液拥挤模拟研究 |
| 1.4.3 计算机分子拥挤模型建立及其理论研究 |
| 1.5 研究动机 |
| 第二章 细胞松弛素B诱导细胞建立凋亡和分子拥挤实验模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料及设备 |
| 2.2.2 Hela细胞培养 |
| 2.2.3 BMSCs分离培养、鉴定和细胞冻存 |
| 2.2.4 细胞生长抑制率分析 |
| 2.2.5 细胞凋亡模型的建立 |
| 2.2.6 细胞内分子拥挤实验模型的建立 |
| 2.2.7 扫描电子显微镜观察 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 原代培养BMSCs形态及鉴定 |
| 2.3.2 CytB明显抑制Hela细胞生长 |
| 2.3.3 细胞凋亡率逐渐升高 |
| 2.3.4 细胞内分子拥挤度加剧 |
| 2.3.5 细胞表面超微结构观察 |
| 2.3.6 统计分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CytB诱导Hela细胞凋亡早期的生物学和生物力学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与设备 |
| 3.2.2 CytB诱导的Hela细胞形态学的改变及细胞脱壁分析 |
| 3.2.3 Annexin V-FITC/PI细胞早期凋亡时间确定 |
| 3.2.4 肌动蛋白微丝骨架解聚荧光示踪分析 |
| 3.2.5 细胞膜死亡受体Fas/CD95和线粒体荧光探针标记 |
| 3.2.6 Western blot蛋白表达分析 |
| 3.2.7 AFM细胞表面扫描和纳米压痕实验 |
| 3.2.8 基于AFM的细胞表面微观形貌观察 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CytB诱导Hela细胞脱壁 |
| 3.3.2 细胞形态学改变 |
| 3.3.3 肌动蛋白微丝骨架解聚 |
| 3.3.4 细胞早期凋亡时间确定 |
| 3.3.5 纽蛋白表达下降 |
| 3.3.6 细胞膜死亡受体Fas/CD95逐渐活化 |
| 3.3.7 线粒体随肌动蛋白解聚发生转运障碍 |
| 3.3.8 细胞表面形貌和几何学改建 |
| 3.3.9 细胞杨氏模量下降 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 CytB对微丝骨架正常的BMSCs的毒性作用评价和生物力学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验材料及设备 |
| 4.2.2 Annexin V-FITC/PI细胞早期凋亡时间确定 |
| 4.2.3 肌动蛋白微丝骨架解聚荧光示踪 |
| 4.2.4 AFM单个活细胞扫描与纳米压痕实验 |
| 4.2.5 细胞几何学分析 |
| 4.2.6 细胞杨氏模量分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 高浓度的CytB明显抑制BMSCs生长 |
| 4.3.2 细胞形态学改变 |
| 4.3.3 磷脂酰丝氨酸(PS)膜外翻 |
| 4.3.4 细胞微丝骨架解聚、断裂,细胞内拥挤度加剧 |
| 4.3.5 CytB引发细胞几何学的改建和表面粗糙度的增加 |
| 4.3.6 细胞杨氏模量不断减小 |
| 4.3.7 统计分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 一、发表论文 |
| 二、主持和参与课题 |
| 致谢 |
四、CAA患者造血干细胞内Ca~(2+)含量、CD95~+表达水平及相关因素的研究（论文参考文献）
- [1]血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究[D]. 周东蕊. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]基于线粒体-内质网连接探究松龄血脉康对脑缺血再灌注损伤保护作用[D]. 马喆. 北京中医药大学, 2021(08)
- [3]免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究[D]. 赵慧. 山西医科大学, 2020(01)
- [4]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [5]NFATC4及TRPV2在急性髓系白血病中的作用及机制研究[D]. 赵翀. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究[D]. 王琪. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [7]运用微流控芯片在单细胞水平研究急性髓系白血病细胞与免疫细胞相互作用[D]. 涂宏蕾. 武汉大学, 2020(07)
- [8]电磁场治疗通过促进骨髓间充质干细胞迁移和成骨分化调节骨重塑的机制研究[D]. 张英驰. 华中科技大学, 2020(01)
- [9]MicroRNA363与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关分子机制的研究[D]. 张九阳. 郑州大学, 2020(02)
- [10]细胞松弛素B诱导的细胞凋亡早期细胞力学特性改变研究[D]. 苏雪莲. 兰州大学, 2020(04)