一、用Dot－ELISA检测兔出血症病毒抗体的研究（论文文献综述）
张连芝[1]（2017）在《兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究》文中研究指明兔病毒性出血症（viral haemorrhagic disease of rabbits）是由兔出血症病毒（rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）感染所引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、高致死性的传染性疾病,以全身实质器官出现水肿、淤血和出血为主要特征。RHDV被分为G1G5以及G6（RHDVa,又名RHDV抗原变异株）6种基因型。2010年首次报道了变异型RHDV,它在遗传特性上与RHDV的6个基因型有很大的差异,命名为RHDV2也称为RHDVb。在欧洲野兔体内,发现一个能引起野兔发病的新型毒株与RHDV的基因组结构类似,被称为欧洲褐色兔综合症病毒（EBHSV）。本试验利用RHDV病原建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）检测方法,通过生物信息学分析,将RHDV的VP60基因进行分段表达确定其抗原性,以此建立了间接ELISA方法。本研究主要包括以下四部分内容:1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析在山东不同地区分离了3株RHDV毒株,分别命名为BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株,克隆RHDV病毒的VP60蛋白基因,通过VP60核酸序列进化树分析显示,3个毒株均属G6（RHDVa）变异群,序列同源性比对分析显示,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中其它经典型RHDV毒株核苷酸序列同源性分别在90.2%98.6%、90.5%99.9%、89.4%99.5%,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分别在82.6%82.9%、82.5%82.8%、81.5%81.9%。2014年河北分离到HB毒株与1984年江苏首次分离的WX84毒株遗传距离很近,推测其很可能来自毒株WX84株,近几年,中国从西北、华东、东北和西南四大地区分离到的具有代表性的RHDV毒株与WX84株差异较大,说明RHDV发生了变异,但是四大地区之间的RHDV毒株差异不大,且同世界其他国家和地区RHDV分离株基因序列几乎没有差异,同源性达到90%以上,因此,病毒基因型和流行的地域性没有必然联系。2 RPA检测方法的建立根据BZ/2015株的VP60基因的核酸序列,设计1对特异性引物,优化反应条件,建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增检测方法。通过敏感性、特异性、人工感染和临床应用等表明,该方法能特异扩增出特异片段,检测灵敏度达到0.1 LD50,与常规一步法RT-PCR敏感性相同。该方法具有较好的稳定性、敏感性和特异性。重组酶聚合酶等温扩增反应过程总耗时30 min左右,RPA检测方法和一步法RT-PCR的检出符合率为100%。3 VP60基因分段表达及抗原性分析VP60基因分为3个区域VP60-1（2aa-208aa）、VP60-2（174aa-425aa）和VP60-3（342aa-579aa）。VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60分别克隆到原核表达载体pET32a（+）和pColdⅢ中,4个重组质粒分别命名为pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。对VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因进行IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60条带大小,与预期大小一致。将表达的重组蛋白纯化后的蛋白进行Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60均能和RHDV阳性血清发生特异性反应。4 ELISA方法建立利用纯化的VP60分段蛋白作为包被抗原,以兔出血症病毒阳性血清为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗建立间接ELISA检测方法。分别用ELISA方法和HI试验对7只6周龄SPF兔免疫RHD灭活疫苗后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d的抗体水平进行检测,间接ELISA结果显示,重组蛋白VP60-1和VP60作为包被抗原检测兔免疫后血清中的抗体消长规律一致。HI试验和以VP60-1作为包被抗原的间接ELISA试验检测结果一致,本试验根据两种方法所测得的各组兔群的抗体效价建立了相应的回归方程r2=0.9547,表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显着相关性。
盛蓉[2]（2011）在《携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究》文中指出兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的传染性疾病,病程短、死亡率高,是家兔烈性传染病。VP60蛋白是RHDV主要的结构蛋白,在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。研究发现在没有其他任何成分存在的条件下,VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）。这种病毒样颗粒具有很好的免疫原性,本身就可作为免疫佐剂,可以以胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。研究表明,这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,并作为疫苗载体。口蹄疫（foot-and-mouth disease virus, FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。研究表明O型FMDV至少有5个B细胞表位,其中最重要的一个表位由VP1的141-160位（G-H环）和C端200-213位氨基酸残基线性表位组成,为最重要的B细胞表位,是FMDV最重要的抗原位点。且VP1的第141-160位氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位,能诱导FMDV专一性的T细胞应答。本研究在RHDV衣壳蛋白的C-端（在外）、N-端（在内）和306-307位分别插入单个外源B细胞表位（FMDV VP1B细胞表位200-213aa）和双串联B细胞表位（FMDV VP1141～160aa-GS-（200～213aa））,构建6种重组转移载体并在Sf9细胞中进行表达,通过电镜观察和动物实验,研究加入这些外源片段对VLPs的组装及其免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1、本试验根据GenBank数据库RHDV皖阜株衣壳蛋白VP60的基因序列设计针对VP60基因的特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定正确后,连接至真核表达载体,经酶切鉴定正确后与经退火磷酸化的FMDVB细胞表位连接,进行PCR鉴定、DNA测序。获得的重组质粒转化DH10Bac,蓝白斑筛选后进行PCR鉴定即获得重组转移载体。试验结果显示：本试验成功构建6种重组穿梭载体,分别命名为CF.306F、NF、CFB、306FB和NFB。2、用重组穿梭载体转染Sf9细胞。转染后观察细胞病变,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。提取细胞内重组杆状病毒RNA进行RT-PCR鉴定,阳性的作为重组杆状病毒原液进行扩增和表达,并通过间接免疫荧光（IFA）、血凝试验、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等试验进行鉴定。试验结果显示：RT-PCR结果显示获得6种重组杆状病毒；IFA结果显示6种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳分析6种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,且大小约为65kDa; Western-blot显示6种嵌合蛋白（CF,306F、NF、CFB、306FB和NFB）均能被RHDV单抗A3C和牛O型FMDV多抗血清特异性识别,证明6种嵌合蛋白的载体和表位均具有良好的反应原性；本试验中表达的6种嵌合蛋白,仅NF和NFB有血凝性。3、6种嵌合蛋白经初步纯化后电镜观察。取表达的六种嵌合蛋白分别与弗氏佐剂1：1混合乳化,免疫ICR小鼠,并以RHDV灭活亚单位疫苗和O型FMDV合成肽疫苗作阳性对照,无菌PBS做阴性对照。免疫过程中对免疫小鼠进行尾静脉断尾采血,用间接ELISA测定0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d血清内抗载体VP60和抗表位FMDV VP1ELISA抗体水平。结果显示：6种嵌合蛋白均能形成病毒样粒子（VLPs）,大小和形态与天然RHDV相似。6种嵌合蛋白通过皮下免疫的途径可诱导产生强烈抗载体VP60和中等强度抗FMDV VP1B细胞表位的体液免疫应答,其中嵌合蛋白NF针对载体和表位特异性抗体水平均最高；当插入外源片段长达126bp其表位抗体水平也保持较高水平,说明RHDV VLPs至少可以容纳126bp长度的基因；本研究中有无佐剂并不影响抗体水平；同时两种蛋白剂量大小（50ug/只和25ug/只）不影响表位抗体水平。本研究在分析了RHDV VLPs作为展示载体展示B细胞表位的可能性的基础上,在RHDV结构蛋白VP60的C-端、N-端和306～307aa处分别插入两种O型FMDV VP1蛋白的B细胞表位,成功构建6种重组穿梭载体,并在Sf9细胞中得到表达；免疫印迹显示其均具有良好的反应原性；电镜观察6种嵌合蛋白均可形成VLPs;动物实验显示RHDV-VLPs在小鼠体内能诱导强烈抗VP60和中等强度抗表位的体液免疫应答；RHDV-VLPs可以容纳长达126bp的外源片段也不影响其免疫原性。本研究为以RHDV VLPs为载体的多价疫苗研究提供理论基础,为后期评价RHDV VLPs展示系统奠定了基础。
谭晖[3]（2013）在《携带卵清蛋白T细胞表位的兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究》文中研究指明兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、高度接触性传染病,以致死性和全身实质器官出血为主要特征。RHDV是杯状病毒科成员,结构简单,在兔体内可以诱导机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答,还有极强的诱导干扰素产生的能力。RHDV仅有一个主要结构蛋白VP60, VP60在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）、这种病毒样颗粒具有良好的免疫原性,本身可作免疫佐剂,通过胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。有研究证实这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,或作为疫苗载体。为了探究兔出血症病毒样颗粒（RHDV-VLPs）容纳外源表位的能力,了解其适宜的外源片段插入位点,探索嵌合VLPs的组装及其免疫原性,初步评价RHDV VLPs作为外源表位展示系统的可行性,本研究在RHDV衣壳蛋白VP60的C末端插入OVAT细胞抗原表位,将VP60的502-510位、411.417位、302-309位氨基酸分别替换为OVAT细胞抗原表位（鸡源卵清蛋白OVA257-264位氨基酸,序列SIINFEKL）,通过杆状病毒表达系统构建4种重组兔出血症病毒样颗粒（RHDV-VLPs）,通过电镜观察和动物实验,研究外源片段对VLPs的组装及免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1.重组穿梭载体的构建通过PCR,在RHDV VP60基因序列的特定区域直接插入OVA CD8+T细胞表位（SIINFEKL）,或通过SOE法对RHDV VP60基因序列的特定区域进行部分缺失并用OVA CD8+T细胞表位（SIINFEKL）替换,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定后,将目的片段连接至真核表达载体pFastBacl,并对目的片段进行测序,测序正确的重组质粒转化DH10Bac菌,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组质粒,分别命名为Bacmid-V-579、Bacmid-V-502-510、 Bacmid-V-411-417、Bacmid-V-302-309。2.蛋白表达及鉴定将获得的阳性重组质粒转染Sf9细胞。逐日观察,当出现明显的细胞病变时,收获病毒rBac-v-579、rBac-v-502-510、rBac-v-411-417、rBac-v-302-309.提取细胞内总RNA进行RT-PCR扩增,阳性样品作为重组杆状病毒原液进行扩增和传代,并通过间接免疫荧光试验（IFA）、血凝试验（HA）、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等鉴定嵌合蛋白vp60-ova/579、 vp60-ova/502-510、vp60-ova/411-417、vp60-ova/302-309的表达。RT-PCR结果证实4组目的基因mRNA在转染的细胞中发生转录；IFA结果显示4种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳结果显示,4种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,大小约为60kDa；Western-blot结果显示,4种嵌合蛋白均能被RHDV单抗A3C特异性识别,证明4种嵌合蛋白的载体具有良好的反应原性；此外,血凝实验结果显示4种嵌合蛋白中,vp60-ova/579和vp60-ova/302-309有血凝性, vp60-ova/502-510和vp60-ova/411-417血凝性消失。3.嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性分析对4种嵌合蛋白进行浓缩纯化及定量分析,通过电镜观察嵌合蛋白形成病毒样粒子的能力。将4种纯化定量的嵌合蛋白（vp60-ova/579. vp60-ova/502-510. vp60-ova/411-417和vp60-ova/302-309）,免疫接种7-8周龄C57BL/6雌性小鼠,设VP60、OVA多肽、无菌PBS为对照,各免疫三次,间隔两周,每只小鼠每次免疫40μg蛋白,分别在未免、二免后2周及三免后2周采集小鼠血清,间接ELISA测定0d、28d、42d血清中VP60抗体水平,试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α含量。结果显示：4种嵌合蛋白中,vp60-ova/579、vp60-ova/502-510、 vp60-ova/411-417及vp60-ova/302-309均可形成VLPs,大小约为40nm,形态与天然兔出血症病毒样粒子类似。4种嵌合蛋白均可诱导小鼠产生不同程度的针对VP60载体的体液免疫应答和针对OVAT细胞表位的细胞免疫应答。其中,vp60-ova/579能引起较低的针对VP60的体液免疫应答和较高的针对OVA T细胞表位的细胞免疫应答。初步推测,VP60579位氨基酸可能是4个位点中携带外源T细胞表位的较优位点。本实验构建了携带CD8+T细胞表位的VP60嵌合蛋白。该T细胞表位来自鸡源卵清蛋白OVA257-264（SIINFEKL）,受MHC I类分子限制。T细胞表位分别嵌合在RHDV VLP的不同位置：1)直接插入VP60的C末端,即第579位aa之后；2)取代VP60502-510位氨基酸；3)取代VP60411-417位氨基酸；4)取代VP60302-309位氨基酸。嵌合RHDV病毒样粒子作为载体的研究结果表明,四组嵌合蛋白不同程度的诱发VP60特异性体液免疫应答和针对OVAT细胞表位的细胞免疫应答。本研究为以RHDV VLPs为载体的疫苗研究提供理论依据。
肖跃强[4]（2014）在《兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用》文中研究表明采用动物回归实验分离了4株RHDV毒株，命名为SQ-1、SQ-2、DB-1、BJ-1株，其中SQ-1株不能凝集人“O”型红细胞。克隆病毒VP60蛋白基因，核苷酸序列进化树分析显示，4毒株同属RHDVa变异群，其中SQ-2株位于RHDVa群进化树分支最底端，氨基酸序列进化树分析显示，SQ-2株病毒独立位于RHDVa进化树与原始毒株进化树分支之外，并位于最底端；序列同源性比对分析显示，SQ-1、SQ-2、DB-1、BJ-1株与其它毒株核苷酸序列同源性分别在89.5%-98.0%、91.4%-95.6%、90.2%-98.7%、89.7%-97.6%之间，氨基酸序列同源性分别在94.1%-99.3%、94.8%-96.5%、94.4%-99.5%、94.0%-99.3%之间；通过与血凝性、无血凝性毒株氨基酸序列分析比对发现，SQ-1株VP60蛋白第432、480位氨基酸残基可能对该毒株血凝特性产生一定影响；根据流行年代分析了RHDVa已经发生的变异流行趋势与未来可能的变异方向，304、305、414、425与432氨基酸位点已经演变，近期流行毒株开始出现13、237、299、309、324、346、348与351氨基酸位点变异；RHDVa与原始群毒株存在12个氨基酸残基差异及多个交互变异位点。根据已发表及本研究所克隆VP60蛋白的核苷酸序列，设计合成特异性引物，经反应条件的优化，建立了基于SYBR Green I荧光染料的RHDV Real-timeRT-PCR检测方法。通过敏感性、重复性、标准曲线建立等表明，该方法可检出的最低拷贝数为101，较普通RT-PCR敏感性高一个数量级。实际应用结果显示，Real-time RT-PCR方法检测阳性率为74.8%，而普通RT-PCR方法检测阳性率为65.5%。同时，建立了RT-LAMP检测方法，通过评价特异性、敏感性、检出时间以及临床应用等指标，证实该方法能够特异、敏感的检测RHDV感染，酶切扩增产物证实，该方法能够特异性的扩增；其敏感性高，可检出的拷贝数在102以上，而且临床检出阳性率较普通RT-PCR高；扩增反应可在30min内完成，缩短了检测耗时；动物攻毒试验证实，以上两种方法的检出阳性率均为100%。利用原核表达技术获得了RHDV重组截短的VP60蛋白，并以重组VP60蛋白为诊断抗原，建立了检测RHDV抗体的ELISA诊断方法，检测RHDV阳性血清的最低抗体效价高稀释比例为1:6400，并具有良好的特异性，批内、批间重复变异系数分别小于4.9%、6.9%，与血凝抑制试验（HI）的符合率为94.4%；检测河南、山东、河北等地采集的1710份兔血清样品，检测阳性率为81.5%。同样，利用原核表达体系表达VP60完整蛋白，纯化可溶性部分，利用胶体金标记技术，根据免疫层析原理，以胶体金标记的SPA（金黄色葡萄球菌蛋白A）作为探针，以纯化得到的VP60重组蛋白和纯化的兔IgG分别作为检测线和质控线的捕获试剂，研制并建立了RHDV抗体免疫胶体金快速检测方法。该方法特异性强，敏感性高，较血凝抑制方法高4倍；批间、批内重复均无差异性，临床应用显示，胶体金试纸条检测抗体阳性率为90.0%，而血凝抑制检测抗体阳性率为68.3%，大幅度提高了敏感性。综上，在分析4株RHDV分离毒株遗传变异趋势、进化来源与SQ-1株病毒丢失“O”型红细胞凝集特性诱因的同时，建立了RHDV抗原Real-time RT-PCR与RT-LAMP、抗体间接ELISA与免疫胶体金快速检测方法，通过与相应经典检测方法比对与临床应用，证明所建立的检测方法能够用于临床检测，具有良好的应用前景，为该病的防控提供了理论依据与技术保障。
秦海斌[5]（2007）在《兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立》文中认为兔出血症（ Rabbit haemorrhagic disease,RHD ）是由兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。该病于1984年在中国首次发现,其后在世界其它地区相继发生,给养兔业造成了巨大的经济损失。鉴于RHD病程短、致死率高等特点,临床检测和早期诊断中对检测方法除要求敏感、准确外,还要求其快速化、简单化。现有的血清学检测方法因为商业养殖中对兔的严格免疫导致其无法判定是病毒感染还是疫苗免疫造成了抗体水平的升高而失去了其诊断意义。因此,在RHD的诊断中病原学检测发挥着主导作用。目前,已建立了多种实验室检测方法,其中琼脂扩散、血凝/抑制试验应用较广但灵敏性较低;反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）因仪器、试剂和操作技术要求更适合于实验室操作,相比之下酶标抗体技术操作相对简单又无需太多实验设备,比较适合在临床和检测中推广。然而迄今为止,只有国外少数公司研制成功了抗原检测ELISA试剂盒,其昂贵的成本使其在进行大规模临床检测时难以广泛应用。因此,研制灵敏、快速、操作简便的抗原检测ELISA试剂盒对于RHD的诊断和疫情防治具有重要意义。本试验以分离纯化的地方毒株RHDV-TP株免疫BALB/c小鼠,制备了多株针对RHDV的单克隆抗体,对其生物学特性进行分析鉴定后,筛选出一株效价高、亲和力强的单克隆抗体DE2株,并将其作为诊断试剂,建立了RHDV抗原捕获ELISA检测方法。由于RHDV缺乏体外繁殖系统,本试验将RHDV-TP毒株攻击健康大白兔增殖病毒,发病死亡后采集其肝脏组织匀浆处理,以蔗糖密度梯度离心法纯化RHDV全病毒粒子,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠。以真核表达系统表达的RHDV结构蛋白-VP6O作为基础建立间接ELISA检测方法进行单抗筛选。通过融合与克隆过程,筛选出6株针对RHDV的单克隆抗体AD4、AG10、BC9、BE8、BH3、DE2;其腹水效价介于1:40001:3×104之间。竞争相加ELISA及Western-blot试验结果表明,6株单抗分别针对5个RHDV抗原位点,其中DE2株针对线性抗原位点,DE2株效价较高、亲和力强,有作为诊断试剂进行开发利用的前景。将DE2株单抗腹水纯化后作为捕获抗体包被酶标板,建立了抗原捕获ELISA诊断方法检测RHDV,并对各工作条件进行了优化,筛选出最佳工作体系,然后以对已知阳性抗原样品和阴性抗原样品及临床可疑样品进行检测,并与常规血凝/血凝抑制试验检测结果进行比对。结果显示对于已知阳性样品,捕获ELISA阳性检出率为100%;对于临床可疑样品,捕获ELISA阳性检出率为62.7%,常规血凝试验为55.2%,检出率比HA高7.5%,灵敏度为HA试验的3～13倍。最低病毒检出量测定试验表明,抗原捕获ELISA诊断方法对全病毒的最低检出浓度为26ng/mL,具有很高的灵敏度。上述结果表明,基于DE2株单克隆抗体的抗原捕获ELISA诊断方法可特异性地检测出发病兔肝脏组织中的RHDV,该方法快速、灵敏、准确,能够同时进行大规模的样品检测,省时省力且成本较低,是一种理想的RHDV抗原检测方法。另外,本试验制备的其他单克隆抗体分别针对不同的RHDV抗原表位,今后将对RHDV抗原表位筛选、RHDV的鉴别诊断等相关领域的研究中发挥重要作用。
李建文[6]（2006）在《兔出血症病毒WHNRH株全基因组测序全长cDNA克隆，VP60基因及全病毒真核表达载体构建》文中认为兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起兔的一种急性、烈性、高致死性传染病，是一种毁灭性传染病，给养兔业造成巨大的经济损失。1984年我国首先爆发兔病毒性出血症，目前呈全国性分布，2004年GenBank登录了第一株中国株RHDV的全基因组序列，我国RHDV的分子流行病学资料非常缺乏，且迄今国内仍未见RHDV基因组序列测定的详细报道。目前国内外还没有RHDV反向遗传学和核酸疫苗的相关研究报道。鉴于此，本研究主要包括以下几个方面： 1．兔出血症病毒WHNRH株的分离鉴定：采用病死兔的肝脏组织进行病原的分离，将其经兔体传3代后接种兔呈规律性死亡和病理变化，其特征与兔病毒性出血症相同，采用氯仿处理，聚乙二醇沉淀法对第4代死亡兔肝脏组织进行处理，所得产物具有血凝特性，其血凝效价可达216，该血凝作用能够被抗RHDV的高免血清所抑制，该产物能够与抗RHDV的高免血清在琼脂扩散实验中形成清晰可见的沉淀线，将该液体经磷钨酸染色后进行电镜观察，结果发现该产物中存在一种大小约为30-40nm、无囊膜，符合RHDV形态特征的病毒粒子。参考GenBank中登录的兔出血症病毒的基因组序列，在保守区设计一对RHDV特异的PCR引物对该分离病毒进行RT-PCR扩增，结果扩增出与预期片段大小相符的PCR条带，对产物的克隆测序结果表明，该株病毒与已经报道的RHDV的对应区域的同源率达90.2％-97.2％，从分子水平证实本研究分离毒株为兔病毒性出血症病毒（RHDV），将其命名为WHNRH株。 2．兔出血症病毒WHNRH株基因组序列的测定与分析：采用片段重叠的
陈兴祥,薛家宾,徐为中,周永银,诸玉梅[7]（2003）在《测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立》文中认为通过氯仿和PEG6000处理,SephadexG 200层析纯化RHDV抗原,建立了检测RHDV抗体的间接ELISA试验方法。该方法的抗原最适包被浓度为10μg/ml,血清样品最佳稀释度为1∶400。与血凝抑制试验方法（HI）等相比,该方法具有快速、简单、特异性和重复性好等优点。
陈萌萌[8]（2012）在《运载OVA CD8+T细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及免疫原性研究》文中指出兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病。RHDV是杯状病毒科成员,结构简单,仅有一个主要结构蛋白VP60,研究发现RHDV在兔体内可以诱导机体产生很强的体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答,而且RHDV还有极强的诱导干扰素产生的能力。为了探究兔出血症病毒样颗粒（RHDV-VLPs）容纳外源抗原决定簇的能力,本文主要通过对RHDVVP60N端不同位点进行缺失和取代,研究VP60基因N端序列对RHDVVLPs影响,并以运载的OVA257.264CD8+T细胞（SIINFEKL）表位为参照,通过电镜观察和动物实验,研究VLPs组装所展示外源表位的长度、构象和抗原性,初步评价RHDV VLPs其作为外源表位展示系统的可行性并且为RHDV衣壳蛋白的形成机制和其它方面提供参考依据。主要的试验和结果如下：1.重组穿梭载体的构建通过SOE法对RHDV VP60基因序列的N端进行部分缺失或用CD8+T细胞表位（SIINFEKL）替换RHDV衣壳蛋白VP60的特定区域,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T vector,经酶切鉴定后、将目的片段连接至真核表达载体pFastBacTM1,并对目的片段进行测序,获得的阳性重组质粒转化DH10Bac菌,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组质粒,分别命名为N1、 N2、I1、12和D1。2.蛋白表达及鉴定将获得的阳性重组质粒转染Sf9细胞。逐日观察细胞,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。提取细胞内总RNA进行RT-PCR扩增,阳性样品作为重组杆状病毒原液进行扩增和传代,并通过间接免疫荧光（IFA）、血凝试验（HA）、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等试验鉴定蛋白的表达。RT-PCR结果显示5种重组杆状病毒在转染的细胞中发生转录；IFA结果显示5种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳结果显示,5种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,且大小约为60kDa; Western-blot结果显示,5种嵌合蛋白（N1、N2、I1、12和D1）均能被RHDV单抗A3C特异性识别,证明5种嵌合蛋白的载体具有良好的反应原性；本试验中表达的5种嵌合蛋白,仅N1和N2有血凝性。3.嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性对昆虫杆状病毒表达系统表达的5种嵌合蛋白进行电镜观察,初步纯化4种嵌合蛋白（N1、N2、I1、12）免疫接种7-8周龄C57BL/6雌性小鼠,设RHDV-VLPs-VP60、无菌PBS为对照,共免疫三次,每次间隔两周,分别在二免及三免后两周摘眼球取血,脱颈处死小鼠,无菌取脾。间接ELISA测定Od、28d、42d血清中VP60抗体水平；分离淋巴细胞,ELISPOT检测特异性分泌IFN-y水平。结果显示：5种嵌合蛋白中,N1、N2可形成完整的VLPs,大小约为40nm,形态与天然兔出血症病毒样粒子类似；I1、I2形成的病毒样粒子较小约30nm；D1形成VLPs数量很少,几乎不可见.4种嵌合蛋白（N1、N2、I1、12）通过腹腔注射途径免疫均可诱导小鼠产生抗载体VP60的体液免疫应答和针对外源T细胞表位的细胞免疫应答,其中I1、I2所引发的针对载体特异性抗体水平和细胞免疫应答水平均较高,而N1、N2较低。可初步推测,VP60第196～229位aa区域可能是N端携带外源T细胞表位的较优区域。本文构建整合CD8+T细胞表位的嵌合蛋白。该T细胞表位来自鸡源卵清蛋白OVA257-264（SIINFEKL）,受MHCI类分子限制。T细胞表位分别嵌合在RHDV VLP的不同位置：1)直接插入VP60的N末端（N1）；2)取代VP60N端2～13位氨基酸残基（N2）：3)缺失、取代VP60N端196～207位氨基酸残基（D1和I1）；4)取代VP60N端217～228位氨基酸残基（I2）。嵌合RHDV病毒样粒子作为疫苗载体的研究结果表明,RHDV-VLPs-OVA不同程度的诱发特异性抗VP60的体液免疫应答和特异性IFN-y分泌。本研究为以RHDV VLPs为载体的多价疫苗研究提供理论依据,为后期评价RHDV VLPs展示系统奠定了基础。
任永军[9]（2012）在《家兔病毒性出血症病毒（RHDV）的研究进展》文中研究指明兔病毒性出血症（RHD）是一种导致家兔急性、烈性、高度致死性的传染病,发病率和死亡率较高,是严重威胁家兔产业发展的传染病之一。本文综述RHDV的病原学、检测方法、遗传变异等方面的研究进展,同时对RHDV未来研究方面做一展望,旨在为深入研究RHDV提供一定参考和信息。
张燕娜[10]（2016）在《兔病毒性出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及其基因工程疫苗免疫保护研究》文中指出兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease,RHD）俗称兔瘟,是由兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）引起的一种高传染性,高致死性的急性烈性传染病,给养兔业和相关行业带来了巨大的经济损失。RHDV属于杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）,为单股正链RNA病毒,含有1条约7.4 kb的基因组和1条约2.2 kb的亚基因组。VP60是RHDV的主要结构蛋白,是病毒的免疫保护性抗原,是RHD诊断和疫苗研发的重要分子。RHD无有效的治疗手段,目前控制的主要措施为疫苗免疫预防。为了更好地控制和预防兔出血症,本论文从RHDV的检测和RHD基因工程疫苗的免疫保护机制两方面进行研究。根据VP60蛋白基因序列设计引物建立兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法,利用该方法对不同时间点不同样品中病毒含量的动态变化进行分析;另外从体液免疫应答和细胞免疫应答两方面评估兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制。主要研究内容如下:1.兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及应用根据兔出血症病毒的VP60蛋白基因序列设计引物,经过反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了重复性好、敏感性强的RHDV SYBR Green RT-PCR检测方法,可有效检出重组质粒为14.6拷贝/μL的样品。利用该方法对RHDV感染兔6h、12h、24 h、30 h、36 h的血清、肝、脾中的病毒含量动态变化进行检测。结果表明,血清、肝、脾三种样品中病毒含量均呈现时间依赖效应,随着时间增加,其病毒含量呈现几何数增长。家兔感染RHDV12h、24h、30h及36h后,血清中病毒含量分别达到约105、106、107、108拷贝数;肝脏中病毒分别达到约105、108、108、109拷贝数;脾脏中病毒含量分别达到约105、108、108、108拷贝数左右;肝脏中的RHDV含量最高,说明肝脏是其主要的靶组织。2.兔出血症基因工程疫苗免疫保护机制的研究为研究兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制,以兔出血症基因工程疫苗免疫健康易感家兔,同时设立组织灭活疫苗免疫组和PBS空白对照组,从体液免疫应答和细胞免疫应答两个方面评估疫苗的免疫效力。分别在免疫接种后0、3、7、14、21、28 d采集各组兔血液,通过ELISA方法检测血清中RHDV特异性抗体IgG和IgM水平以及细胞因子白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）的水平变化;用血凝抑制（HI）检测血液中总抗体的水平变化,于21 d对所有试验动物攻毒,以攻毒保护试验评估疫苗的免疫保护能力。试验结果表明,免疫后7天、14天和21天,组织灭活疫苗组和基因工程疫苗组血清中特异性抗体IgG、IgM均显着升高,与对照组相比差异显着（P<0.05）;基因工程疫苗组与对照组相比,免疫后3天、7天和14天血清中IL-2、IL-4和IFN-y含量均显着（P<0.05）增高,组织灭活疫苗组与对照组相比,血清IL-2含量无显着（P>0.05）差异,IL-4和IFN-y含量显着（P<0.05）升高;与对照组相比,免疫后7天、14天、21天两组疫苗组血清的血凝抑制效价均显着升高（P<0.05）;同时还发现,基因工程疫苗组诱导产生的特异性抗体（IgG、IgM）、细胞因子（IL-4、IFN-γ）均比组织灭活苗组高,且免疫后3天、7天、14天、21天以及28天基因工程疫苗组血清中IL-2显着（P<0.05）高于组织灭活苗组;攻毒保护试验结果显示,两种疫苗均能100%保护RHDV的攻击。因此,兔出血症基因工程疫苗可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答反应,有效预防兔出血症。
二、用Dot－ELISA检测兔出血症病毒抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用Dot－ELISA检测兔出血症病毒抗体的研究（论文提纲范文）
（1）兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 兔病毒性出血症的概述 |
| 1.2 RHDV基因组结构及功能 |
| 1.3 RHDV病原学特点 |
| 1.3.1 RHDV形态学 |
| 1.3.2 RHDV对理化因素的抵抗力 |
| 1.3.3 RHDV的血凝特性 |
| 1.4 RHD的流行病学研究 |
| 1.4.1 流行特点 |
| 1.4.2 传染源与传播途径 |
| 1.4.3 易感动物 |
| 1.5 RHD诊断方法的研究进展 |
| 1.5.1 根据临床症状进行初步诊断 |
| 1.5.2 病理剖检及病理组织学诊断 |
| 1.5.3 实验室检测 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.2 主要试剂的配制 |
| 2.1.2.1 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 2.1.2.2 诱导表达试剂 |
| 2.1.2.3 SDS-PAGE试剂的配制 |
| 2.1.2.4 Western blot试剂的配制 |
| 2.1.2.5 ELISA试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RHDV的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 2.2.1.1 兔出血症病毒VP60基因的克隆 |
| 2.2.1.2 VP60基因的核酸序列分析 |
| 2.2.2 兔出血症病毒RPA检测方法的建立 |
| 2.2.2.1 兔出血症病毒VP60基因引物的设计 |
| 2.2.2.2 兔出血症病毒RNA的提取 |
| 2.2.2.3 兔出血症病毒RPA检测方法的建立 |
| 2.2.2.4 特异性试验 |
| 2.2.2.5 敏感性试验 |
| 2.2.2.6 人工感染的样本检测 |
| 2.2.2.7 临床应用 |
| 2.2.3 间接ELISA检测抗体的研究 |
| 2.2.3.1 VP60基因序列比对 |
| 2.2.3.2 VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建 |
| 2.2.3.3 VP60-1、VP60-2、VP60-3 基因的原核表达及纯化 |
| 2.2.3.4 Western blot分析 |
| 2.2.3.5 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.3.6 RHD免疫抗体检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 3.1.1 VP60基因的克隆 |
| 3.1.2 VP60基因的核酸序列系统进化树分析 |
| 3.2 兔出血症病毒RPA检测方法的建立 |
| 3.2.1 重组酶聚合酶等温扩增反应 |
| 3.2.2 RPA反应条件的优化 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 人工感染的样本检测 |
| 3.2.6 临床应用 |
| 3.3 间接ELISA检测抗体的研究 |
| 3.3.1 VP60基因序列比对 |
| 3.3.2 VP60基因的分段扩增及原核表达载体构建 |
| 3.3.3 VP60-1、VP60-2、VP60-3 基因的原核表达及纯化 |
| 3.3.4 Western blot分析 |
| 3.3.5 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3.5.1 抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 3.3.5.2 抗原最佳包被时间的确定 |
| 3.3.5.3 最佳封闭液的确定 |
| 3.3.5.4 最佳封闭时间的确定 |
| 3.3.5.5 二抗工作浓度的确定 |
| 3.3.5.6 ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 3.3.6 RHD免疫抗体检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 4.2 兔病毒性出血症RPA检测方法的建立 |
| 4.3 间接ELISA检测抗体的研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
（2）携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 兔病毒性出血症病毒(RHDV)研究进展 |
| 1 RHDV的分类 |
| 2 RHDV的生物学特性 |
| 2.1 RHDV的形态特征 |
| 2.2 RHDV的理化特性 |
| 2.3 RHDV的血凝特性 |
| 2.4 RHDV血清型及进化特点 |
| 2.5 RHDV的抗原性 |
| 2.6 RHDV的致病性 |
| 2.7 RHDV的培养 |
| 2.8 RHDV的诊断 |
| 3 RHDV的分子生物学研究进展 |
| 3.1 RHDV的结构 |
| 3.2 RHDV的结构蛋白 |
| 3.3 RHDV的非结构蛋白 |
| 3.4 亚基因组 |
| 4 病毒样颗粒(VLPs)的研究进展 |
| 4.1 VLPs的形成 |
| 4.2 VLPs的来源 |
| 4.3 VLPs的免疫原性 |
| 5 RHDV VP60研究新进展 |
| 6 FMDV表位研究动态 |
| 参考文献 |
| 第一章 6种携带口蹄疫病毒B细胞表位的重组转移载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 6种嵌合蛋白的表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 6种嵌合蛋白的空间构象和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）携带卵清蛋白T细胞表位的兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述：兔出血症(RHD)的研究进展 |
| 1 兔病毒性出血症的流行现状 |
| 2 RHDV的分类 |
| 3 RHDV的形态特征 |
| 4 RHDV病毒基因组结构与功能 |
| 5 结构蛋白 |
| 5.1 VP60 |
| 5.2 VP10 |
| 6 非结构蛋白 |
| 7 病毒的理化特性 |
| 8 病毒的血凝性 |
| 9 血清型及进化特点 |
| 10 RHDV致病性 |
| 11 RHDV的培养 |
| 12 RHDV的实验室检测 |
| 13 不同载体表达兔出血症病毒VP60蛋白的研究进展 |
| 13.1 杆状病毒—昆虫细胞表达系统 |
| 13.2 大肠杆菌表达系统 |
| 13.3 酵母表达系统 |
| 13.4 植物表达系统 |
| 13.5 腺病毒表达载体 |
| 14 兔出血症灭活疫苗研究进展 |
| 15 兔出血症病毒重组病毒疫苗 |
| 16 关于RHDV疫苗存在的问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 ：四种携带OVA CD8~+T细胞表位重组穿梭载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌种 |
| 1.2 主要试剂与工具酶 |
| 1.3 核酸序列分析 |
| 1.4 构建图示 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 目的基因的扩增 |
| 1.6.1 常规方法PCR构建目的基因G-V-0-579 |
| 1.6.2 重叠区扩增基因拼接法(SOE法)构建目的基因G-v-o-502-510、G-v-o-411-417、G-v-o-302-309 |
| 1.7 T/A克隆与鉴定 |
| 1.8 重组转移载体的构建与鉴定 |
| 1.9 穿梭载体Bacmid的构建与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组穿梭载体Bacmid-V-579的构建 |
| 2.2 重组穿梭载体Bacmid-V-502-510、Bacmid-V-411-417、Bacmid-V-302-309的构建 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源表位插入位置的选择 |
| 3.2 SOE法操作要点 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 ：四种嵌合蛋白的表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株与细胞 |
| 1.2 主要试剂与工具酶 |
| 1.3 重组杆状病毒的构建和筛选 |
| 1.4 重组病毒的传代与初步鉴定 |
| 1.5 表达产物的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.2 红细胞凝集特性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 嵌合蛋白的红细胞凝集特性 |
| 3.2 免疫荧光和western blot |
| 3.3 RHDV VLPs的构建 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、培养基及重组病毒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 嵌合蛋白的电镜观察 |
| 1.4 嵌合蛋白免疫原性的研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 电镜观察 |
| 2.2 小鼠血清中VP60抗体水平的检测 |
| 2.3 小鼠血清中TNF-α的含量检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 电镜观察重组蛋白VLPs的形成 |
| 3.2 插入位点与体液免疫应答相关性 |
| 3.3 VLPs与细胞免疫应答相关性 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 兔出血症研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 第2章 RHDV 分子生物学、遗传生态学研究进展 |
| 2.1 RHDV 分子生物学 |
| 2.2 病毒生命周期 |
| 2.3 机体抵抗 RHD 的机制 |
| 2.4 遗传多样性/ RHDV 的进化 |
| 2.5 病毒与宿主共进化 |
| 2.6 防控与免疫 |
| 2.7 展望 |
| 第3章 兔出血症抗原抗体检测方法研究进展 |
| 3.1 血凝(HA)、血凝抑制(HI) |
| 3.2 间接血凝(IHA)、间接血凝抑制(IHI) |
| 3.3 免疫琼脂扩散试验（ID） |
| 3.4 对流免疫电泳 |
| 3.5 中和试验 |
| 3.6 免疫荧光技术 |
| 3.7 SPA 菌体免疫扫描电镜法 |
| 3.8 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 3.9 免疫电镜捕获双装饰法 |
| 3.10 实时荧光定量 RT-PCR 方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 RHDV 的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 RHDV Real-time RT-PCR检测方法的建立与应用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 RHDV RT-LAMP 快速检测方法的建立与应用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 RHDV 抗体检测间接 ELISA方法的建立与应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 RHDV 抗体检测胶体金免疫层析方法的建立与应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 兔出血症研究进展 |
| 1.1 病原研究 |
| 1.1.1 病毒的分类 |
| 1.1.2 病毒的形态 |
| 1.1.3 RHDV 的基因组研究 |
| 1.2 RHD 的流行病学 |
| 1.2.1 易感动物 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 流行状况 |
| 1.3 RHD 的诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.2 实验室诊断 |
| 1.4 RHD 的防控及新型疫苗的研究 |
| 1.4.1 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.4.2 重组病毒活载体苗 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 单克隆抗体技术的发展及应用 |
| 2.1 单抗技术的基本原理 |
| 2.2 单克隆抗体的生产过程 |
| 2.3 单克隆抗体技术研究进展 |
| 2.3.1 人源化单克隆抗体 |
| 2.3.2 全人化抗体 |
| 2.4 单克隆抗体生产技术的进展 |
| 2.5 单抗在动物病毒性传染病方面的应用 |
| 2.5.1 单抗对病毒抗原结构与抗原表位的研究 |
| 2.5.2 单抗在免疫学诊断上的应用 |
| 2.5.3 单抗在抗病毒感染方面的应用 |
| 2.6 RHD 单克隆抗体研究及应用 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原制备及纯化 |
| 3.2.2 免疫小鼠 |
| 3.2.3 SP2/0 细胞准备 |
| 3.2.4 饲养层细胞制备 |
| 3.2.5 免疫脾细胞 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 间接ELISA 检测方法建立 |
| 3.2.8 杂交瘤细胞筛选及克隆 |
| 3.2.9 小鼠腹水的制备及纯化 |
| 3.2.10 单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 纯化RHDV 免疫电镜 |
| 3.3.2 小鼠免疫水平 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞制备 |
| 3.3.4 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.3.5 单抗效价测定 |
| 3.3.6 腹水中单抗HI 活性测定 |
| 3.3.7 杂交瘤细胞染色体数分析 |
| 3.3.8 杂交瘤细胞稳定性 |
| 3.3.9 McAb 抗原识别位点分析 |
| 3.3.10 单抗的SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.11 单抗特异性Western-blot 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗原捕获ELISA 检测兔出血症病毒的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 病毒和抗体 |
| 4.1.3 材料与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 RHDV 多克隆抗体制备 |
| 4.2.2 RHDV 单克隆抗体制备 |
| 4.2.3 单抗及多克隆抗体纯化 |
| 4.2.4 RHDV 抗原样品 |
| 4.2.5 抗原捕获ELISA 方法的建立 |
| 4.2.6 抗原捕获ELISA 工作条件的优化 |
| 4.2.7 判定标准 |
| 4.2.8 兔出血症抗原捕获ELISA 检测方法性能评价 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗体与抗原对照样品的制备 |
| 4.3.2 抗原捕获ELISA 方法的建立 |
| 4.3.3 抗原捕获ELISA 工作条件的优化 |
| 4.3.4 兔出血症抗原捕获ELISA 检测方法性能评价 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）兔出血症病毒WHNRH株全基因组测序全长cDNA克隆，VP60基因及全病毒真核表达载体构建（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用的英文缩写词汇含义说明 |
| 前言 |
| 第一章 兔出血症病毒WHNRH株的分离鉴定 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物接种实验 |
| 3.2 血凝及血凝抑制实验 |
| 3.3 琼脂扩散试验 |
| 3.4 电镜观察 |
| 3.5 RT-PCR扩增及产物克隆测序 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二章 兔出血症病毒WHNRH株全基因组序列的测定与分析 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因组内侧序列的RT-PCR扩增 |
| 3.2 基因组5'末端的获取 |
| 3.3 基因组3'末端的获取 |
| 3.4 基因组全序列测定结果及同源性分析 |
| 3.5 RHDV基因组ORF1编码多聚蛋白的氨基酸序列分析 |
| 3.6 RHDV基因组ORF2编码蛋白的氨基酸序列分析 |
| 3.7 RHDV基因组非编码区(UTR)的序列分析 |
| 3.8 RHDV WHNRH株衣壳蛋白VP60的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 兔出血症病毒WHNRH株基因组的全长cDNA克隆 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA的RT-PCR扩增 |
| 3.2 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA T载体克隆的PCR鉴定 |
| 3.3 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA T载体克隆的酶切鉴定 |
| 3.4 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA克隆的序列测定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 兔出血症病毒WHNRH株VP60基因的克隆,VP60基因及全病毒真核表达载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 衣壳蛋白基因(VP60)的PCR扩增及真核表达重组载体的构建 |
| 3.2 VP60基因的序列测定 |
| 3.3 分泌型真核表达载体中VP60的信号肽分析 |
| 3.4 衣壳蛋白VP60基因的突变位点的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免出血症病毒 (RHDV) 纯化 |
| 1.2.1.1 RHDV粗提 |
| 1.2.1.2 Sephadex G-200凝胶层析 |
| 1.2.2 间接ELISA测定 |
| 1.2.3 特异性阻断试验 |
| 1.2.4 重复性试验 |
| 2 结?果 |
| 2.1 RHD病毒的纯化 |
| 2.2 间接ELISA方法测定的最适抗原包被浓度和被检血清最佳稀释度 |
| 2.3 间接ELISA方法的特异性 |
| 2.4 间接ELISA方法测定结果的重复性 |
| 3 讨?论 |
（8）运载OVA CD8+T细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 兔出血症病毒RHDV的介绍 |
| 1.1 兔出血症病毒RHDV的分类 |
| 1.2 RHDV的分子生物学研究进展 |
| 1.3 RHDV的生物学特性 |
| 2 病毒样颗粒 |
| 2.1 病毒样颗粒的特点 |
| 2.2 VLPs在疫苗中的应用 |
| 2.3 VP60 VLPs研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 5种VP60重组穿梭载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PCR扩增目的片段 |
| 2.2 T/A克隆质粒的鉴定 |
| 2.3 重组表达载体的酶切鉴定 |
| 2.4 重组Bacmid鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SOE法构建嵌合基因 |
| 3.2 插入外源表位的位置 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 5种嵌合蛋白的表达及检测 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 转染 |
| 2.2 RT-PCR鉴定重组病毒的mRNA |
| 2.3 重组蛋白的表达及免疫印迹鉴定 |
| 2.8 血凝实验 |
| 2.9 免疫荧光 |
| 3 讨论 |
| 3.1 表达系统的选择 |
| 3.2 关于嵌合蛋白的血凝特性 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 电镜观察 |
| 2.2 载体的ELISA抗体水平 |
| 2.3 ELISPOT检测特异性IFN-γ分泌 |
| 3 讨论 |
| 3.1 电镜 |
| 3.2 动物实验 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）家兔病毒性出血症病毒（RHDV）的研究进展（论文提纲范文）
| 1 RHDV病原学研究进展 |
| 2 RHDV检测方法研究进展 |
| 2.1 血凝与血凝抑制试验 |
| 2.2 琼脂扩散及ELISA试验 |
| 2.3 分子生物学方法 |
| 3 RHDV遗传变异学研究进展 |
| 4 存在问题与展望 |
| 4.1 存在问题 |
| 4.2 展望 |
（10）兔病毒性出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及其基因工程疫苗免疫保护研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(ABBREVIATION) |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 兔出血症病毒(RHDV)概述 |
| 2 病原学 |
| 2.1 RHDV的分类地位及形态结构 |
| 2.2 RHDV基因组结构及功能 |
| 2.3 VP60结构及其功能 |
| 3 RHDV的诊断 |
| 3.1 镜检法 |
| 3.2 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) |
| 3.3 ELISA检测方法 |
| 3.4 PCR检测方法 |
| 3.5 胶体金免疫层析检测 |
| 4 HDV的预防和疫苗研究 |
| 4.1 预防RHDV感染的机制 |
| 4.2 RHDV疫苗现状及最新研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验部分 |
| 第一章 兔出血症病毒SYBR GREEN RT-PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及病毒毒株 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 RT-PCR检测方法的建立 |
| 1.4 RHDV SYBR GREEN RT-PCR的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒模板标准品制备结果 |
| 2.2 SYBR GREEN RT-PCR标准曲线的建立 |
| 2.3 感染RHDV的家兔靶组织中病毒含量检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 兔出血症基因工程疫苗免疫保护研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RHDV特异性抗体IgG的检测结果 |
| 2.2 RHDV特异性抗体IgM的检测结果 |
| 2.3 兔白细胞介素-2(IL-2) ELISA检测结果 |
| 2.4 兔白细胞介素-4(IL-4) ELISA检测结果 |
| 2.5 兔γ干扰素(IFN-γ) ELISA检测结果 |
| 2.6 血凝抑制效价的检测结果 |
| 2.7 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、用Dot－ELISA检测兔出血症病毒抗体的研究（论文参考文献）
- [1]兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究[D]. 张连芝. 山东农业大学, 2017(02)
- [2]携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究[D]. 盛蓉. 南京农业大学, 2011(04)
- [3]携带卵清蛋白T细胞表位的兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究[D]. 谭晖. 南京农业大学, 2013(08)
- [4]兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用[D]. 肖跃强. 吉林大学, 2014(01)
- [5]兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立[D]. 秦海斌. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [6]兔出血症病毒WHNRH株全基因组测序全长cDNA克隆，VP60基因及全病毒真核表达载体构建[D]. 李建文. 四川农业大学, 2006(12)
- [7]测定RHDV抗体的间接ELISA方法的建立[J]. 陈兴祥,薛家宾,徐为中,周永银,诸玉梅. 江苏农业学报, 2003(04)
- [8]运载OVA CD8+T细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及免疫原性研究[D]. 陈萌萌. 南京农业大学, 2012(01)
- [9]家兔病毒性出血症病毒（RHDV）的研究进展[J]. 任永军. 中国养兔, 2012(08)
- [10]兔病毒性出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及其基因工程疫苗免疫保护研究[D]. 张燕娜. 南京农业大学, 2016(04)