一、表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染（论文文献综述）
郝梦媛,杭琦,师恭曜[1]（2022）在《VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望》文中研究指明随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点,被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程,系统归纳了VIGS在不同作物中的应用,总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素,并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望,以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。
李雨珈[2]（2021）在《桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析》文中研究说明桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding associated virus,MVBa V）是桑树病毒病的主要病原病毒,属于番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的成员,其S RNA编码的核外壳（nucleocapsid,N）蛋白。筛选、鉴定MVBa V N蛋白互作蛋白,进而研究其互作机制对揭示MVBa V的致病机理具有重要作用。前期研究中我们制备了MVBa V N蛋白多克隆抗体,本研究在检测其灵敏度和特异性的基础上,采用免疫共沉淀筛选N蛋白的互作蛋白,并经双分子荧光互补和酵母双杂交系统对10个候选互作蛋白进行验证,对部分编码互作蛋白的基因进行表达分析。主要研究结果如下:1、通过Western blot验证,表明所制备的抗体能够检测出低至0.50 ng的MVBa V N融合蛋白,在稀释倍数1:1000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。2、以具有典型桑脉带病症状的桑叶为材料提取总蛋白,利用免疫共沉淀联合质谱分析（Co IP-MS）的方法,筛选到与MVBa V N存在相互作用的蛋白有106个,其中包括MVBa V编码的运动蛋白（non-structural movement,NSm）、非结构蛋白（non-structural suppressor,NSs）、核外壳蛋白（nucleocapsid protein,N蛋白）。3、选取类乳胶蛋白423（MLP-like protein 423,MLP-LP423）、结瘤素相关蛋白1（Nodulin-related protein 1,NRP1）、果胶酯酶（Pectinesterase,PECT）、烯醇化酶（Enolase,ENO）、14-3-3蛋白B（14-3-3-like protein B,14-3-3LPB）、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphate aldolase,FBA）、核糖体再循环因子（Ribosome-recycling factor,RRF）、丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase,SHMT）、腺苷高半胱氨酸水解酶（Adenosylhomocysteinase,SAHH）和丙二烯氧化物合酶（Allene oxide synthase,AOS）共10个候选互作蛋白进行双分子荧光互补试验和酵母双杂交系统验证,结果显示,MLP-LP423、NRP1、PECT、14-3-3LPB、FBA、RRF和SAHH共7个蛋白与病毒N蛋白之间存在互作。4、利用实时荧光定量PCR对14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH基因在健康桑树、病毒病桑树以及不同非生物胁迫和激素处理桑幼苗的表达模式进行检测。桑树受MVBa V侵染后,14-3-3LPB的表达量在根部和茎部中呈上调表达;PECT的表达量在叶部和茎部中呈上调表达,在根部中呈下调表达;RRF的表达量在上部叶片和茎部中呈上调表达;SAHH的表达量在根部及叶部中呈上调表达,在茎部中呈下调表达。PECT在不同非生物胁迫和激素处理下的表达量均呈现下调趋势,14-3-3LPB、RRF和SAHH的变化趋势则各不相同。研究结果为进一步阐明MVBa V的致病机制及其与寄主蛋白之间的互作机制打下一定基础。
姚依秀[3]（2021）在《与黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）运动蛋白互作的西瓜C1MTB蛋白功能及调控机制研究》文中进行了进一步梳理
李换换[4]（2021）在《利用诱捕策略获得抗PVY的PBS1基因的研究》文中研究表明1.马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是马铃薯的主要病害,其感染引起马铃薯退化及减产。在模式植物拟南芥中报道了AvrPphB-PBS1-RPS5抗病防御系统,而马铃薯中未见报道。本论文中我们克隆到马铃薯中的StPBS1基因。特异性的改造StPBS1蛋白上AvrPphB识别切割位点为PVY病毒编码的蛋白酶NIa-Pro的切割位点。改造的StPBS1通过识别NIa-Pro来引发对PVY的免疫反应,因此被命名为诱捕策略。通过改造的StPBS1的遗传转化获得了抗PVY转基因马铃薯,为马铃薯的抗PVY基因工程提供了一种新的策略。首先在马铃薯叶片接种分泌AvrPphB效应因子的假单胞杆菌来验证了马铃薯中AvrPphB引发的免疫系统的存在。通过本地blast及蛋白序列分析发现马铃薯中存在与AtPBS1高度同源的StPBS1基因,且StPBS1蛋白的AvrPphB切割位点等基序极度保守。在本氏烟草瞬时表达体系中证实StPBS1的STKPQ基序改造为SEMPH的StPBS1R与StRPS5,Hv PBR1,Ta PBR1,StPBR1共表达能够诱导叶片坏死,说明这四个R基因可能为StPBS1R的下游基因。对StPBS1R的作用机理进行研究时发现StPBS1R的C端足以激活StPBR1引起HR,而Ta PBR1诱导的超敏反应需要StPBS1R的N端与C端的同时存在。接下来将StPBS1改造为识别NIa-Pro的StPBS1NR和StPBS1NIa。亚细胞定位结果显示StPBS1的诱捕改造并不影响其细胞膜定位,且在马铃薯叶片瞬时表达结果中引起PVY侵染后的HR反应而抑制PVY病毒的扩散。通过农杆菌介导的叶圆盘转化法获得多株马铃薯转化幼苗,包括12个StPBS1转化株系,6个StPBS1NR转化株系,3个StPBS1NIa转化株系。与野生型植株相比,三种转基因植株的PVY侵染症状都明显减轻,RT-qPCR检测结果表明PVY的病毒滴度在StPBS1与StPBS1NIa转基因植株中显着降低,说明转StPBS1与StPBS1NIa基因的马铃薯株系获得了PVY的抗性。
何宛芹[5]（2021）在《凤果花叶病毒和苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用》文中指出番茄是重要的蔬果作物,而大豆是重要的蔬油兼用作物,也是人类和牲畜的优质蛋白来源。然而,番茄和大豆生产中极易感染各种植物病毒,并造成巨大的产量和经济损失。凤果花叶病毒（pepino mosaic virus,PepMV）和苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）分别是世界范围内番茄和大豆作物的重要病毒病原,严重威胁着番茄和大豆安全生产。迄今作物病毒病缺乏有效的防治药剂,而简单快速、灵敏特异、准确实用的检测技术是病毒病监测、预警和开展绿色防控的关键。为此,本研究分别创制了抗PepMV和抗AMV的特异、灵敏的单克隆抗体,并以创制的单克隆抗体为检测抗体建立了检测这两种病毒的灵敏和特异的血清学方法,为PepMV和AMV的诊断检测、流行病学研究以及科学防控提供试剂和技术支持。1.凤果花叶病毒单克隆抗体的创制及其血清学检测方法用差速离心的方法从感染PepMV的本氏烟中提取了PepMV粒子,病毒粒子作为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,利用鼠杂交瘤细胞技术创制分泌抗PepMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合、PepMV抗体选择和细胞克隆,获得6株分泌高度特异和高度灵敏的PepMV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,即15B2、8H6、23D11、20D9、3A6和8E3。这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体类型均为IgG1、kappa轻链,间接ELISA效价均达到10-7。Western blot实验分析发现,6个PepMV单克隆抗体均特异性识别PepMV的衣壳蛋白。ACP-ELISA结果显示,6个单克隆抗体均与PepMV发生特异性免疫反应,而不与番茄黄曲叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、马铃薯X病毒和健康植物发生交叉反应。以创制的单克隆抗体为检测抗体建立了检测番茄植株中PepMV的ACP-ELISA、dot-ELISA、Tissue print-ELISA和DAS-ELISA四种血清学方法。建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和DAS-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度分别达1:163,840、1:20,480和1:1,310,720倍稀释（重量/体积,g/m L）。利用建立的血清学方法对田间样本中的PepMV进行了检测分析,并用RT-PCR和DNA测序验证了4种血清学方法检测PepMV的可靠性和有效性。2.苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其血清学检测方法用差速离心的方法从感染AMV的大豆植株中提取了AMV粒子,以提纯的病毒粒子作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,利用鼠杂交瘤细胞技术创制了5株分泌AMV的高度特异和灵敏的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,即22G7、7G12、13G1、21D5和22D2。5个杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的间接ELISA效价均达到10-7。Western blot实验结果发现,5株单克隆抗体特异性地识别AMV的外壳蛋白。ACP-ELISA分析发现,5个单克隆抗体均与AMV发生特异性免疫反应,而不与大豆花叶病毒、大豆矮化病毒、黄瓜花叶病毒、李属坏死环斑病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物发生交叉反应。以创制单克隆抗体为检测抗体建立了检测大豆中AMV的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA三种血清学方法。建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度分别达1:81,920和1:20,480倍稀释（重量/体积,g/m L）。利用建立的血清学方法对田间大豆样本中的AMV进行了检测分析,并用RT-PCR和DNA测序验证了三种血清学方法检测AMV的准确性和有效性。
杨晓宁[6]（2021）在《烟草与CMV互作因子筛选、评价及应用》文中研究表明黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）是世界上分布最广的植物病毒之一,对烟叶的产量和品质都有较大影响,严重威胁烟叶生产的可持续发展。目前,烟草病毒病没有特效的防治措施,选育抗病品种是保障烟叶生产最为快速有效的途径。本研究以CMV的致病因子2b蛋白为诱饵,筛选与其互作的寄主因子,获得NtCSN5b,并验证了二者的互作。在此基础上,进一步对NtCSN5b组织特异性表达模式进行分析,鉴定该基因在不同抗性品种中的表达情况;获得基因敲除及过表达植株,并对基因过表达和突变体的CMV抗性进行人工接种鉴定;同时对敲除和过表达材料的农艺性状进行调查,评价了其在育种中的利用价值。主要研究结果如下:（1）以烟草（Nicotiana tabacum）品种K326的叶片为材料构建c DNA质粒文库,以黄瓜花叶病毒的2b蛋白为诱饵进行了酵母筛库,共筛选出11个蛋白。这些蛋白功能多样,其中一个蛋白NtCSN5b参与植物发育过程中的光形态建成及泛素降解途径,在植物的病原菌调控方面也具有非常重要的作用,将此蛋白确定为研究对象。通过同源克隆技术,克隆了NtCSN5b基因,并通过酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀实验,分别在体外及体内证实了2b蛋白与寄主因子NtCSN5b的互作。（2）对NtCSN5b基因的进化关系进行了分析,发现该基因与林烟草（Nicotiana sylvestris）中Nsy CSN5b的亲缘关系最近;对NtCSN5b和2b的亚细胞定位进行分析,发现二者均定位于细胞核与细胞质;组织特异性表达结果表明NtCSN5b在根茎叶中均有表达。为了明确目的基因NtCSN5b在不同CMV抗性品种中的表达模式,选取FC8（抗）、台烟8号（抗）,中烟100（感）、红花大金元（感）四种材料接种CMV后在不同的时间点对NtCSN5b表达模式进行分析,发现感病品种接种CMV后在第四天与第八天NtCSN5b的表达量显着高于抗病品种。（3）为明确NtCSN5b的功能,以中烟100为材料创建NtCSN5b基因的过表达材料,以K326为材料创建NtCSN5b的敲除材料并筛选纯合子。将中烟100、K326与敲除和过表达材料分别接种CMV,30天后调查病情指数,发现过表达材料的发病程度显着高于野生型,而敲除材料的发病程度显着低于野生型,并且过表达材料中CMV病毒粒子含量显着高于中烟100,而敲除材料中CMV病毒粒子的含量低于K326。（4）为评价该基因的育种价值,将敲除突变体和过表达材料播种于大田中,在成熟期调查田间主要农艺性状,包括株高,茎围,节距,叶数,叶长,叶宽。与对照K326相比,敲除突变体的农艺性状除叶片数外未发生显着变化;与对照中烟100相比,个别过表达材料有显着差别,但总体上过表达与突变体对烟草的主要农艺性状影响不明显。综上所述,本研究通过对CMV-2b蛋白与烟草NtCSN5b互作进行研究,发现NtCSN5b在烟草中对CMV的侵染起到负调控作用,且NtCSN5b过表达和敲除后对烟草多数农艺性状并无明显影响,以上研究为培育具有CMV抗性的育种材料提供新思路。
颜克如[7]（2021）在《杭白菊病毒检测及不同世代脱毒苗产量品质的研究》文中进行了进一步梳理杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）属菊科菊属,主产于浙江省桐乡市。杭白菊主要以扦插、分株等无性繁殖方式繁殖种苗,多年的无性繁殖,使得植物病毒大量积累和快速传播,导致品种退化,影响菊花产量和品质,严重阻碍了杭白菊产业的健康发展。本研究主要调查桐乡的多个杭白菊基地的生产状况,对具有病毒症状的样品进行采集并检测;通过“多步分步法”进行多次茎尖剥离获得脱毒苗;开展杭白菊不同世代脱毒苗生长发育和产量品质的分析。具体研究结果如下:1、杭白菊主产区病毒病的调查和采样。对杭白菊主产区浙江省桐乡市进行病毒病的调查,调查了螺蛳浜、花园里、桂花村、颜井村、庙头村、钱林村和农业技术推广服务中心育种基地等七个主要种植区,对具有病毒病典型症状的植株取样,每个地点采集样品20份,共计140份样品。调查结果发现七个种植区域的杭白菊发病症状相似,叶片均表现褪绿皱缩、花叶、明脉、矮化等四种典型症状。初步确认桐乡市主产区的杭白菊受到病毒病感染。2、杭白菊的病毒病检测。对表现褪绿、皱缩花叶、明脉、矮化等四种典型症状的杭白菊病叶进行电镜（TEM）观察,均在细胞质中观察到了略弯曲的线状病毒粒子和呈带状的聚集体。小RNA测序结果表明感染杭白菊病毒的序列与菊花B病毒（Chrysanthemum virus B,CVB）和菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）核苷酸相似性均较高,分别在92.67%～100%和79.82%～98.67%之间。用已报道的10种菊花病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,结果表明样本中只检测到了CVB和CVR两种病毒,分别扩增出约650 bp的CVB条带和1641 bp的CVR条带,检出率均为100%,但未检测到其他8种菊花病毒病。经测序和比对发现,序列（MT890491）与CVB序列（EU499736.1）相似度最高,为91.58%,序列（MT680920）与CVR序列（MN652896）相似度最高,为97.98%。综上所述,所检测杭白菊病样均受到CVB和CVR的复合侵染。3、微流控芯片快速检测菊花B病毒方法的建立。以RT-PCR检测含CVB的样品c DNA为模板,设计了CVB-12、CVB-13、CVB-14、CVB-15和CVB-16等5个引物组合,利用微流控荧光读数仪进行恒温扩增,筛选可快速检测CVB的特异性引物。结果显示,CVB-13引物组合检出CVB的时间最短（8 min）,作为微流控芯片法检测CVB的特异性引物组合;将样品c DNA用dd H2O分别进行10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的倍比稀释,以稀释后的c DNA作为模板分别进行微流控芯片法和RT-PCR灵敏度比较试验。结果表明,利用微流控芯片法建立的CVB快速检测体系,其检测灵敏度高于RT-PCR检测法。4、不同世代脱毒杭白菊田间农艺性状和产量的测定。在2019年11月8日和2020年11月12日分别对杭白菊品种‘早小洋菊’的一代苗脱毒苗和普通苗、二代脱毒苗和普通苗的株高等田间农艺性状进行测定。测定结果显示,一代脱毒苗的株高为56.11 cm、叶面积为994.65 mm2、97个分枝数、139片花瓣、7层花瓣、单花重为1.36 g;二代脱毒苗苗的株高为47.11 cm,叶面积为950.34 mm2,83个分枝数,5层花瓣,118片花瓣,单花重为0.79 g,不同世代脱毒苗的株高、叶面积、分枝数、花瓣数、花瓣层数和单花重等农艺性状均显着优于普通苗。一代和二代脱毒苗亩产均显着高于普通苗,比普通苗分别增产67.96%和75.27%。5、不同世代脱毒杭白菊净光合速率（Pn）和叶绿素含量的测定。在2019年9月和2019年11月分别对‘早小洋菊’一代脱毒苗和普通苗的Pn进行测定。在2020年9月和2020年11月分别对‘早小洋菊’二代脱毒苗和普通苗的Pn进行测定。结果表明,在不同世代的蕾期和采摘期,脱毒苗的Pn均大于普通苗。对于叶绿素相对含量,在蕾期,一代和二代脱毒苗的叶绿素相对含量均显着高于普通苗,一代脱毒苗和普通苗叶绿素相对含量分别为41.78 SPAD和35.62 SPAD,二代脱毒苗和普通苗的叶绿素相对含量分别为53.34 SPAD和46.48 SPAD。到采摘期,一代和二代脱毒苗叶绿素相对含量均略大于普通苗,差异不显着。6、不同世代脱毒杭白菊品质的测定。测定结果显示,一代脱毒苗的绿原酸(C16H18O9)、木犀草苷(C21H20O11)和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(C25H24O12)含量分别为0.50%、0.25%和0.91%,二代脱毒苗的绿原酸、木犀草苷,3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量分别为0.48%、0.17%和0.91%,均符合《中国人民共和国药典》（2015年版一部）规定。不同世代脱毒苗的绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量均高于普通苗,但木犀草苷含量均低于普通苗。对不同世代脱毒苗和普通苗的指纹图谱相似度分析,表明一代脱毒苗、二代脱毒苗和普通苗之间的相似度均大于0.98,表明脱毒种苗与普通苗具有相同的内在质量,质量保持稳定。
周本国[8]（2021）在《烟蚜与蚜传病毒病发生相关性及绿色防控技术研究》文中研究指明烟蚜及烟草马铃薯Y病毒病（PVY）等蚜传病毒病是烟草上的重要病虫害,常年发生严重,且难以防治,给烟叶生产造成巨大损失。本研究的主要目的是对烟草上的蚜虫种类及蚜传病毒病种类进行鉴定,对蚜传病毒病的遗传多样性进行分析,并对蚜虫和蚜传病毒病发生流行相关性、蚜虫和蚜传病毒病的绿色防控技术进行研究,为有效控制烟蚜及蚜传病毒病的发生危害提供理论基础和应用模式。主要研究结果如下:1.烟草蚜虫种类鉴定及其传毒方式研究开展了烟草蚜虫种类鉴定,明确安徽烟区危害烟草的蚜虫种类主要是桃蚜（烟蚜）。开展了蚜虫传毒方式研究,明确了烟蚜的口针、头部以及腹部均可带毒,烟蚜体内的持毒时间可达10h,烟蚜的传毒效率与其带毒率并不成正比。2.烟草蚜传病毒病检测、危害及遗传多样性研究开展了烟草蚜传病毒病种类鉴定,采用ELISA、PCR方法和小RNA高通量测序方法检测了670份烟草样品,明确了安徽烟区蚜传病毒病种类主要为PVY等。开展了烟田周边毒源植物检测和大棚烟苗带毒率检测,明确了毒源植物主要有油菜、小麦、杂草、蚕豆、白菜、萝卜、元胡、菠菜、豌豆、马铃薯等,且烟草在苗床即可带毒。开展了蚜传病毒病的遗传多样性分析,明确了CMV、PVY、TVBMV三种病毒在安徽烟区的遗传多样性。3.利用siRNA高通量测序技术筛选烟草蚜传新病毒利用小RNA高通量测序方法检测出烟草新病毒TV2,对其序列进行了分析,TV2的基因组全序列5979个核苷酸,与马铃薯卷叶病毒（PLRV）具有最高的同源性,为87%,在烟草上首次报道了一个新的马铃薯卷叶病毒属病毒基因组全序列。在安徽烟区首次检测到危害烟草的芸薹黄化病毒（BrYV）和辣椒脉斑驳病毒,对Br YV-AH分离物基因组全序列进行了分析,该病毒基因组全长5678bp,编码6个开放阅读框,属于马铃薯卷叶病毒属成员,是一株重组病毒。4.烟蚜及蚜传病毒病发生流行相关性研究开展了有翅蚜迁飞动态监测与蚜传病毒病发生相关性研究,所得结果表明有翅蚜迁飞的数量和时间与蚜传病毒病发生轻重正相关。有翅蚜迁飞数量越大,蚜传病毒病发生相对越严重;有翅蚜迁飞高峰期和蚜传病毒发生高峰期正相关。有翅蚜迁飞到烟田传毒后,带毒烟株有个隐症过程,这一过程持续时间长短,主要与气候因素和烟草生育期有关,如气候条件利于病害发生,则隐症期较短,如气候条件不利于病害发生,则隐症期可长达15-20天。5.烟蚜及蚜传病毒病绿色防控技术研究与应用开展了治虫防病绿色防控技术研究与应用,包括天敌昆虫蚜茧蜂、物理方法（无纺布覆盖、黄板等）防治烟蚜、新型免疫诱抗剂预防蚜传病毒病等。筛选出以下几种治虫防病效果较好的绿色防控技术:蚜茧蜂防治烟蚜平均防治效果达到75%,生产季节平均减少防蚜农药3次,减少防治病毒病农药1次,平均减少化学农药投入6.4元/667m2,平均减少施药成本12元/667m2;和周边常规防治区相比,无纺布覆盖防蚜示范区、黄板诱蚜示范区和免疫诱抗剂预防病毒病示范区的相对防效分别达到80%、40%和40%以上。
叶昕彤[9]（2021）在《利用CRISPR/Cas9靶向斯里兰卡木薯花叶病毒创制抗病木薯材料》文中进行了进一步梳理斯里兰卡木薯花叶病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV）属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus）,是一种双组份的单链环状DNA病毒,由烟粉虱（Bemisia tabaci）特异性传播。由SLCMV引起的木薯花叶病（cassava mosaic disease,CMD）是全球范围内对木薯产量影响最为严重的病害之一,已造成巨大的经济损失。自2017年以来,SLCMV已入侵我国,而我国的主要木薯品种对该病毒均无抗性。因此,相关抗病木薯品种的培育显得尤为迫切。CRISPR/Cas9作为新兴的基因编辑工具,在作物转基因育种和基因组编辑育种中发挥了重要作用。为获得抗SLCMV的木薯材料,本研究利用CRISPR/Cas9系统特异性靶向编辑SLCMV病毒基因组DNA,筛选抗病效果优良的sgRNA靶点并转化我国木薯主栽品种华南8号。主要结果如下:（1）两类单靶点CRISPR/Cas9体系构建及抗病效果检测分别使用sgRNA在线设计工具Benchling和CRISPR-P设计了靶向SLCMV DNA-A的AC1和基因间隔区（intergenic region,IR）的sgRNA,并分别构建CRISPR/Cas9体系,以及引入Trex2和Cas9共表达的CRISPR/Cas9-Trex2体系。通过本氏烟瞬时表达实验,我们筛选出了一些可以指导CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas9-Trex2系统高效靶向编辑SLCMV并抑制病毒侵染的sgRNA。（2）多靶点CRISPR/Cas9体系构建及抗病效果检测为进一步发挥CRISPR系统的抗病潜力,同时降低病毒由于CRISPR干扰导致的变异逃逸风险,我们将一些有效抑制SLCMV的CRISPR靶向位点进行组合,构建了双靶点和三靶点载体并对其抗病效果进行检测和比较。结果表明,单靶点和双靶点载体均可稳定且高效地减轻植物发病症状,而三靶点载体对病毒抑制效率较低。（3）稳定表达CRISPR/Cas9的转基因木薯株系构建为获得稳定表达CRISPR/Cas9系统的木薯株系,我们对木薯脆性胚性愈伤组织进行了农杆菌介导的遗传转化,获得SC8木薯转基因阳性株系共42个。通过定量PCR对各株系的Cas9表达量进行检测,筛选出了Cas9表达量较高的木薯株系。在后续实验中,我们将以Asia II 1烟粉虱为SLCMV的传播介体,对转基因木薯的抗病性进行验证。综上所述,本研究分别构建了单靶点和多靶点的CRISPR/Cas9体系并进行了抗病效果的检验,随后通过遗传转化得到了稳定表达CRISPR/Cas9系统的转基因木薯株系。本研究设计并验证了CRISPR/Cas9靶向编辑SLCMV的有效抗病性,初步验证了Trex2蛋白在提高CRISPR/Cas9系统抗病毒效果上的作用。本研究为抗病毒作物品种的培育提供了重要参考,同时也为抗SLCMV的木薯品种培育打下了坚实的基础。
杨敬竞[10]（2021）在《蜘蛛毒液多肽抗烟粉虱应用初探》文中指出烟粉虱（Bemisia tabaci）广泛分布于我国境内,是多种重要植物病毒的传播介体,对农业生产造成了严重损失。目前,我国境内对烟粉虱的防控主要依赖化学防治手段,综合防控措施的发展仍不够成熟。随着化学杀虫剂的大量使用,烟粉虱已对多种杀虫剂产生了抗性。蜘蛛等捕食者的毒液中,神经毒性多肽（神经毒肽）种类丰富且具有较强的杀虫活性。利用毒液中昆虫特异性的神经毒肽防控害虫,既可有效延缓抗性的产生,也能减少常规化学杀虫剂对生态环境及食品安全的威胁。然而,开发利用蜘蛛毒液多肽防控烟粉虱的研究仍处于空白阶段。应用神经毒肽防控害虫的关键在于将其运输至昆虫血淋巴中的靶标位点。目前,利用昆虫病原真菌及纳米技术等手段可帮助神经毒肽穿越昆虫体表屏障进入血淋巴,但是该种方法的特异性较差。此外,利用虫传病毒的外壳蛋白（capsid protein,CP）作为运载蛋白可增强神经毒肽穿越昆虫肠道屏障进入血淋巴的能力,起到特异性的杀虫效果。为探索蜘蛛毒液中毒性多肽在烟粉虱防控中的应用前景,本研究首先筛选了部分神经毒肽并验证其对烟粉虱的血淋巴毒性。同时,我们尝试利用烟粉虱特异性传播的菜豆金黄花叶病毒属病毒的外壳蛋白帮助神经毒肽穿越烟粉虱中肠屏障进入血淋巴。主要结果如下:1)毒性多肽的筛选及其对烟粉虱血淋巴毒性的验证通过对已有报道的毒性多肽的筛选,我们得到了8个具有抗烟粉虱潜力的毒性多肽。随后,我们选取了其中5个神经毒肽并利用显微注射技术测定其对烟粉虱的血淋巴毒性。结果表明,ω-HXTX-Hv1a（Hv1a）、μ-AGTX-Aa1a（Aa1a）神经毒肽对烟粉虱存在一定的血淋巴毒性,显微注射GST-Hv1a、GST-Aa1a后,烟粉虱死亡率显着上升,产卵量显着降低。2)病毒外壳蛋白融合毒肽的经口毒性验证通过人工饲喂实验,我们对GST-Hv1a、GST-Aa1a的经口毒性进行了验证,结果表明其对烟粉虱的存活率没有显着影响。随后,通过对不同病毒CP可溶性的比较,我们选用了木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）的CP作为Hv1a的运载蛋白,进行融合表达后饲喂烟粉虱验证其经口毒性,结果表明其对烟粉虱的存活率同样没有显着影响。3)表达病毒外壳蛋白转基因植物的构建为进一步探索病毒CP在帮助神经毒肽进入烟粉虱血淋巴中的作用,我们首先在本氏烟（Nicotiana benthamiana）瞬时表达CP并证实了烟粉虱可取食植物中表达的CP。随后,荧光共聚焦结果显示Hv1a-GFP可在本氏烟中正常发出荧光,CP-GFP与GFP-CP则无法正常发出荧光。同时,本研究构建了Hv1aGFP、CP-GFP转基因拟南芥,验证后获得了可正常表达Hv1a-GFP蛋白的拟南芥,但并未获得可正常表达CP-GFP的转基因拟南芥。后续的研究中,利用GFP荧光可观察烟粉虱取食后CP及Hv1a在烟粉虱体内的分布情况。综上所述,本研究筛选了具有抗烟粉虱潜力的神经毒肽并验证了Hv1a及Aa1a对烟粉虱的血淋巴毒性。随后,我们尝试利用病毒CP作为运载蛋白帮助毒性多肽穿越烟粉虱中肠屏障。我们通过瞬时表达技术验证了烟粉虱能够取食植物中表达的CP,并构建了Hv1a-GFP及CP-GFP转基因植物用于观察CP作为运载蛋白帮助神经毒肽进入血淋巴的潜力。本研究为筛选合适的蜘蛛毒肽开发针对烟粉虱或半翅目昆虫的生物杀虫剂提供了参考,同时也为后续抗烟粉虱转基因植物的开发起到了一定的借鉴意义。
二、表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染（论文提纲范文）
（1）VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望（论文提纲范文）
| 1 VIGS技术原理 |
| 2 VIGS的发展 |
| 2.1 病毒沉默载体的发展 |
| 2.2 VIGS技术的拓展 |
| 2.2.1 小RNA介导的VIGS |
| 2.2.2 寄主诱导的基因沉默 |
| 2.3 VIGS接种方式的发展 |
| 3 VIGS在作物中的应用 |
| 3.1 VIGS在单子叶作物中的应用 |
| 3.2 VIGS在棉花中的应用 |
| 3.3 VIGS在蔬菜中的应用 |
| 3.4 VIGS在果树中的应用 |
| 3.5 VIGS在药用植物中的应用 |
| 4 影响VIGS效率的因素 |
| 4.1 环境因素 |
| 4.2 病毒载体 |
| 4.3 插入基因片段 |
| 4.4 侵染方式 |
| 5 VIGS的检测 |
| 6 VIGS存在的问题及解决方法 |
| 7 展望 |
（2）桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 桑脉带相关病毒 |
| 1.2 正番茄斑萎病毒属核外壳蛋白的功能及其互作蛋白 |
| 1.3 植物相关蛋白及其功能 |
| 1.3.1 乳胶蛋白 |
| 1.3.2 结瘤素相关蛋白1 |
| 1.3.3 果胶酯酶 |
| 1.3.4 烯醇化酶 |
| 1.3.5 14-3-3 蛋白 |
| 1.3.6 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 1.3.7 核糖体再循环因子 |
| 1.3.8 丝氨酸羟甲基转移酶 |
| 1.3.9 腺苷高半胱氨酸水解酶 |
| 1.3.10 丙二烯氧化物合酶 |
| 1.4 植物激素及其在植物病毒与寄主互作中的作用 |
| 1.5 病毒与寄主蛋白互作研究技术 |
| 1.5.1 免疫共沉淀技术 |
| 1.5.2 双分子荧光互补技术 |
| 1.5.3 酵母双杂交系统 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种与质粒来源 |
| 2.1.3 酶及试剂 |
| 2.1.4 所用仪器 |
| 2.1.5 实验相关引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物材料的种植与管理 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA的反转录 |
| 2.2.4 PCR反应体系与条件 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 产物纯化与回收 |
| 2.2.7 目的片段与载体连接 |
| 2.2.8 化学转化 |
| 2.2.9 大肠杆菌质粒小量提取 |
| 2.2.10 限制性内切酶切割DNA片段 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.12.1 提取桑的非变性蛋白 |
| 2.2.12.2 Co-IP |
| 2.2.13 蛋白质的质谱鉴定 |
| 2.2.14 电转化农杆菌感受态制备及转化 |
| 2.2.14.1 制备感受态 |
| 2.2.14.2 转化 |
| 2.2.14.3 农杆菌侵染烟草 |
| 2.2.15 转化酵母NMY51 |
| 2.2.16 相对荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MVBaV N多克隆抗体的灵敏度和特异性检测 |
| 3.2 Co-IP联合质谱分析 |
| 3.3 候选蛋白基因ORF的扩增及序列分析 |
| 3.3.1 候选蛋白基因ORF的扩增 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 MVBaV N蛋白候选互作蛋白的验证 |
| 3.4.1 双分子荧光互补实验验证 |
| 3.4.1.1 双分子荧光表达载体的构建 |
| 3.4.1.2 共注射烟草显微观察N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.4.2 酵母双杂验证MVBaV N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.4.2.1 猎物质粒的构建 |
| 3.4.2.2 酵母双杂交实验验证N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.5 互作蛋白基因的表达分析 |
| 3.5.1 生物胁迫下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.1.1 MVBaV对14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.1.2 MVBaV对 PECT的表达影响 |
| 3.5.1.3 MVBaV对 RRF的表达影响 |
| 3.5.1.4 MVBaV对 SAHH的表达影响 |
| 3.5.2 幼苗不同组织14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.3 外源激素处理下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.3.1 外源激素对14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.3.2 外源激素对PECT的表达影响 |
| 3.5.3.3 外源激素对RRF的表达影响 |
| 3.5.3.4 外源激素对SAHH的表达影响 |
| 3.5.4 非生物胁迫下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.4.1 非生物胁迫下14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.4.2 非生物胁迫下PECT的表达影响 |
| 3.5.4.3 非生物胁迫下RRF的表达影响 |
| 3.5.4.4 非生物胁迫下SAHH的表达影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MVBaV N蛋白的互作蛋白 |
| 4.1.1 与MVBaV N蛋白互作的病毒蛋白 |
| 4.1.2 与MVBaV N蛋白互作的寄主蛋白 |
| 4.1.2.1 MLP类蛋白 |
| 4.1.2.2 NRP1 蛋白 |
| 4.1.2.3 果胶酯酶 |
| 4.1.2.4 14-3-3LPB蛋白 |
| 4.1.2.5 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 4.1.2.6 核糖体再循环因子 |
| 4.1.2.7 腺苷高半胱氨酸水解酶 |
| 4.2 互作基因的表达模式 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 蛋白质的质谱鉴定方法与步骤 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）利用诱捕策略获得抗PVY的PBS1基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 马铃薯的经济地位及其PVY病害 |
| 1.1.1 马铃薯的经济地位 |
| 1.1.2 马铃薯PVY病害 |
| 1.2 植物抗病分子机制 |
| 1.3 马铃薯抗PVY基因工程 |
| 1.4 诱饵工程 |
| 1.5 拟南芥AvrPphB-PBS1-RPS5抗病机制 |
| 1.5.1 PBS1蛋白的发现 |
| 1.5.2 AvrPphB对PBS1进行切割及切割原理 |
| 1.5.3 PBS1与下游RPS5相互作用原理 |
| 1.5.4 PBS1机制在各物种之间的进化关系 |
| 1.5.5 诱饵蛋白PBS1的改造 |
| 1.6 研究目的、意义及技术路线 |
| 1.6.1 目的意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 材料、仪器与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料及来源 |
| 2.1.2 实验所用试剂盒 |
| 2.1.3 实验所用仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA单链合成 |
| 2.2.3 PCR反应 |
| 2.2.4 TA克隆 |
| 2.2.5 定点突变 |
| 2.2.6 酶切 |
| 2.2.7 连接 |
| 2.2.8 农杆菌侵染本氏烟草 |
| 2.2.9 农杆菌侵染马铃薯叶片 |
| 2.2.10 假单胞菌侵染马铃薯叶片 |
| 2.2.11 马铃薯的遗传转化 |
| 2.2.12 Western Blot实验 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 马铃薯中存在识别AvrPphB的免疫系统 |
| 3.2 马铃薯中PBS1及其相关基因的筛选与克隆 |
| 3.2.1 马铃薯中存在StPBS1基因 |
| 3.2.2 StPBS1下游R基因的筛选 |
| 3.2.3 克隆PBS1及相关R基因 |
| 3.3 本氏烟草中AvrPphB不能激活StPBS1介导的R基因 |
| 3.3.1 假单胞杆菌接种本氏烟草最佳OD_(600)为0.002 |
| 3.3.2 本氏烟草中AvrPphB不能激活StPBS1介导的R基因 |
| 3.4 本氏烟草AvrPphB-StPBS1~R-R系统验证 |
| 3.5 StPBR1或TaPBR1激活需要StPBS1的C端 |
| 3.6 接种PVY后StPBS1、StRPS5和StPBR1基因表达模式分析 |
| 3.7 诱捕策略改造StPBS1后获得对PVY抗性 |
| 3.7.1 对StPBS1进行抗PVY病毒的改造 |
| 3.7.2 StPBS1亚细胞定位分析 |
| 3.7.3 马铃薯瞬时表达StPBS1~(NIa)与StPBS1~(NR)获得对PVY的抗性 |
| 3.8 抗PVY的转基因马铃薯的获得 |
| 3.8.1 马铃薯遗传转化植株的获得 |
| 3.8.2 StPBS1、StPBS1~(NR)以及StPBS1~(NIa)基因已成功导入马铃薯植株中 |
| 3.8.3 转基因马铃薯中成功表达PBS1蛋白 |
| 3.8.4 转基因马铃薯获得对PVY的抗性 |
| 第四章 讨论和结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 常用培养基及试剂的制备 |
| 附录Ⅱ 本实验所用的引物 |
（5）凤果花叶病毒和苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 凤果花叶病毒的研究进展 |
| 1.1 寄主范围、危害症状及传播方式 |
| 1.2 病毒形态及病毒基因组结构 |
| 1.3 凤果花叶病毒的检测技术 |
| 1.3.1 田间诊断 |
| 1.3.2 电镜观察 |
| 1.3.3 分子生物学检测 |
| 1.3.4 血清学方法 |
| 1.4 防治策略 |
| 1.4.1 加强田间管理 |
| 1.4.2 交叉保护 |
| 1.4.3 选育抗病品种 |
| 2 苜蓿花叶病毒的研究进展 |
| 2.1 寄主范围、病害症状 |
| 2.2 传播方式和病害流行 |
| 2.3 病毒形态及基因组结构 |
| 2.4 苜蓿花叶病毒的检测技术 |
| 2.4.1 分子生物学检测技术 |
| 2.4.2 血清学方法 |
| 2.5 防治策略 |
| 2.5.1 种子处理与加强田间管理 |
| 2.5.2 防控蚜虫 |
| 2.5.3 选育抗病品种 |
| 3 单克隆抗体技术及其在植物病毒检测中的应用 |
| 3.1 单克隆抗体的建立及应用 |
| 3.2 单克隆抗体的结构及分类 |
| 3.3 杂交瘤细胞技术的基本原理 |
| 3.4 单克隆抗体在植物病毒检测中的应用 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 凤果花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料、田间样品和试剂 |
| 1.2 提纯PepMV粒子 |
| 1.3 单克隆抗体的制备 |
| 1.3.1 免疫小鼠 |
| 1.3.2 细胞融合与培养 |
| 1.3.3 杂交瘤细胞的筛选及细胞克隆 |
| 1.3.4 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 1.3.5 腹水的制备及纯化 |
| 1.3.6 单克隆抗体的类型及亚类鉴定和效价测定 |
| 1.4 PepMV单抗的Western blot分析 |
| 1.5 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.5.1 ACP-ELISA方法的步骤 |
| 1.5.2 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 1.5.3 ACP-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.6 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.6.1 dot-ELISA方法的步骤 |
| 1.6.2 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 1.6.3 检测PepMV的dot-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.6.4 检测PepMV的dot-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.7 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.7.1 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的步骤 |
| 1.7.2 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 1.7.3 检测PepMV的Tissue print-ELISA的特异性分析 |
| 1.7.4 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.8 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.8.1 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立 |
| 1.8.2 检测PepMV的DAS-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.8.3 检测PepMV的DAS-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.9 检测PepMV的RT-PCR方法 |
| 1.9.1 Trizol法提取植物总RNA |
| 1.9.2 RT-PCR |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 PepMV粒子的提纯 |
| 2.2 杂交瘤细胞的筛选和克隆 |
| 2.3 抗体制备、效价测定及抗体类型和亚类鉴定 |
| 2.4 Western bolt分析PepMV单抗的特异性 |
| 2.5 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.2 ACP-ELISA方法分析PepMV单抗的特异性 |
| 2.5.3 ACP-ELISA方法分析PepMV单抗的灵敏度 |
| 2.6 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.1 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.2 检测PepMV的dot-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.6.3 检测PepMV的dot-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.7 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.1 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.2 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.8 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立 |
| 2.8.1 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立 |
| 2.8.2 检测PepMV的DAS-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.8.3 检测PepMV的DAS-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.9 检测PepMV的血清学方法在田间样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 第三章 苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料、田间样品和试剂 |
| 1.2 苜蓿花叶病毒粒子的提纯 |
| 1.3 单克隆抗体的制备 |
| 1.3.1 免疫小鼠 |
| 1.3.2 细胞融合与培养 |
| 1.3.3 杂交瘤细胞的筛选及细胞克隆 |
| 1.3.4 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 1.3.5 单抗腹水的制备及纯化 |
| 1.3.6 单克隆抗体的类型及亚类鉴定和效价测定 |
| 1.4 Western blot分析AMV单抗的特异性 |
| 1.5 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.5.1 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 1.5.2 检测AMV的ACP-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.5.3 检测AMV的ACP-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.6 检测AMV的dot-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.6.1 检测AMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 1.6.2 检测AMV的dot-ELISA的特异性和灵敏度分析 |
| 1.6.3 检测AMV的dot-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.7 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.7.1 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 1.7.2 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析 |
| 1.7.3 检测AMV的Tissue print-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.8 检测AMV的RT-PCR方法 |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 苜蓿花叶病毒粒子的提纯 |
| 2.2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆 |
| 2.3 抗体制备、效价测定及亚类鉴定 |
| 2.4 Western blot分析AMV单抗的特异性 |
| 2.5 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.2 检测AMV的ACP-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.5.3 检测AMV的ACP-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.6 检测AMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.1 检测AMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.2 检测AMV的dot-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.6.3 检测AMV的dot-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.7 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.1 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.2 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.8 血清学方法在田间样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 4 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录A 常用生化与分子生物学试剂及仪器 |
| 附录B 常用缓冲液和培养基配方 |
（6）烟草与CMV互作因子筛选、评价及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 烟草CMV病毒病抗性种质研究现状 |
| 1.2 黄瓜花叶病毒的生物学特性 |
| 1.2.1 黄瓜花叶病毒的株系、传播途径及寄主症状 |
| 1.2.2 黄瓜花叶病毒的基因组及编码蛋白 |
| 1.2.3 2b蛋白 |
| 1.3 CSN5 研究进展 |
| 1.4 酵母双杂交 |
| 1.5 本研究的切入点及技术路线 |
| 1.5.1 研究的切入点 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 与CMV-2b蛋白互作的烟草寄主因子筛选 |
| 2.1 实验所需要的材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 实验所需材料 |
| 2.1.2 实验试剂及配方 |
| 2.1.3 实验所需仪器 |
| 2.1.4 数据分析 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 诱饵蛋白自激活和毒性检验 |
| 2.2.3 酵母双杂实验 |
| 2.2.4 BiFC实验 |
| 2.2.5 免疫共沉淀实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 诱饵蛋白毒性及自激活检测 |
| 2.3.2 筛选与2b蛋白互作的烟草寄主因子 |
| 2.3.3 确定候选基因 |
| 2.3.4 2b蛋白与NtCSN5b互作的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 NtCSN5b基因在烟草中的表达研究 |
| 3.1 实验所需要的材料与仪器 |
| 3.1.1 实验所需材料 |
| 3.1.2 实验试剂及配方 |
| 3.1.3 实验所需仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 NtCSN5b系统进化树的构建及分析 |
| 3.2.2 亚细胞定位 |
| 3.2.3 组织特异性表达分析 |
| 3.2.4 NtCSN5b在不同CMV抗性品种中的表达模式分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NtCSN5b进化关系分析 |
| 3.3.2 亚细胞定位 |
| 3.3.3 NtCSN5b组织特异性表达 |
| 3.3.4 NtCSN5b在不同抗性品种中的表达模式分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 NtCSN5b基因敲除及过表达材料表型鉴定 |
| 4.1 实验所需材料、试剂及仪器 |
| 4.1.1 实验所需材料 |
| 4.1.2 实验试剂及配方 |
| 4.1.3 实验所需仪器 |
| 4.1.4 数据分析 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 载体构建 |
| 4.2.2 组织培养 |
| 4.2.3 筛选阳性植株 |
| 4.2.4 纯合材料接种CMV鉴定 |
| 4.2.5 ELISA实验测定病毒含量 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 过表达株系获得 |
| 4.3.2 敲除突变体获得 |
| 4.3.3 表型鉴定 |
| 4.3.4 CMV病毒含量测定及病情指数调查 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 NtCSN5b育种利用价值评价 |
| 5.1 实验所需材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂及地点 |
| 5.1.3 实验设计 |
| 5.1.4 数据分析 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 育苗 |
| 5.2.2 移栽 |
| 5.2.3 田间管理 |
| 5.2.4 调查农艺性状 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）杭白菊病毒检测及不同世代脱毒苗产量品质的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 List of Abbreviations |
| 第一章 文献综述 |
| 1 杭白菊的资源及药理作用 |
| 1.1 杭白菊的资源 |
| 1.2 杭白菊的药理作用 |
| 2 菊花主要病毒病特性 |
| 2.1 菊花B病毒(CVB) |
| 2.2 菊花R病毒(CVR) |
| 2.3 烟草花叶病毒(TMV) |
| 2.4 黄瓜花叶病毒(CMV) |
| 2.5 番茄斑萎病毒(TSWV) |
| 2.6 马铃薯X病毒(PVX) |
| 2.7 马铃薯Y病毒(PVY) |
| 2.8 小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV) |
| 2.9 番茄不孕病毒(TAV) |
| 2.10 菊花褪绿斑驳类病毒(CCh MVd) |
| 2.11 菊花矮化类病毒(CSVd) |
| 3 菊花病毒检测 |
| 3.1 分子生物学技术 |
| 3.2 电镜检测法 |
| 3.2.1 乙型线状病毒科(Betaflexiviridae) |
| 3.2.2 雀麦花叶病毒科（Bromoviridae） |
| 3.2.3 帚状病毒科(Virgaviridae) |
| 3.2.4 番茄斑萎病毒科(Tospoviridae) |
| 3.2.5 甲型线状病毒科(Alphaflexiviridae) |
| 3.2.6 马铃薯Y病毒科(Potyviridae) |
| 3.3 双抗体夹心酶联免疫吸附检测法 |
| 3.4 生物学测定 |
| 4 菊花脱毒方法研究进展 |
| 5 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 桐乡杭白菊主要病毒的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 试剂及仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 杭白菊病毒调查和病样的采集 |
| 1.2.2 电镜观察 |
| 1.2.3 小RNA测序鉴定 |
| 1.2.4 RT-PCR验证和测序分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 桐乡市杭白菊种植区域病毒病的田间调查结果 |
| 2.2 杭白菊田间病样的病毒电镜观察结果 |
| 2.3 小RNA测序分析及拼接注释 |
| 2.4 RT-PCR验证和序列分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 微流控芯片快速检测菊花B病毒方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 微流控芯片快速检测CVB引物的筛选 |
| 1.2.3 微流控芯片法和RT-PCR灵敏度比较 |
| 1.2.4 微流控芯片法的检测应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 微流控芯片快速检测CVB引物的筛选 |
| 2.2 微流控芯片法和RT-PCR灵敏度比较 |
| 2.3 微流控芯片法的检测应用 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 不同世代脱毒杭白菊农艺性状和产量品质的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 供试试剂 |
| 1.1.3 供试仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 脱毒苗的创制和扩繁 |
| 1.2.2 脱毒种苗的田间繁育 |
| 1.2.3 田间农艺性状及产量的测定 |
| 1.2.4 光合指标的测定 |
| 1.2.5 叶绿素含量的测定 |
| 1.2.6 品质的测定 |
| 1.2.7 指纹图谱的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脱毒苗的创制和组培扩繁 |
| 2.2 脱毒种苗的田间繁育及生产 |
| 2.3 不同世代脱毒杭白菊田间农艺性状的差异 |
| 2.4 不同世代脱毒杭白菊测产指标的差异 |
| 2.5 不同世代脱毒杭白菊净光合速率的变化 |
| 2.6 不同世代脱毒杭白菊叶绿素含量的变化 |
| 2.7 不同世代脱毒杭白菊对品质的影响 |
| 2.8 不同世代杭白菊指纹图谱的建立与相似度评价 |
| 3 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 1.1 桐乡杭白菊主要病毒的检测与鉴定 |
| 1.2 微流控芯片快速检测菊花B病毒方法的建立 |
| 1.3 不同世代脱毒杭白菊农艺性状和产量品质的研究 |
| 2 问题与展望 |
| 2.1 CVB和 CVR复合致病机制的探索 |
| 2.2 微流控芯片法快速检测多种植物病毒体系的建立 |
| 2.3 脱毒苗使用年限的探索 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（8）烟蚜与蚜传病毒病发生相关性及绿色防控技术研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 烟草病虫害发生情况 |
| 1.2 烟草蚜虫研究进展 |
| 1.2.1 形态及为害 |
| 1.2.2 生活史及习性 |
| 1.2.3 发生与环境的关系 |
| 1.2.4 传毒方式 |
| 1.2.5 预测预报 |
| 1.2.5.1 春季越冬寄主调查 |
| 1.2.5.2 有翅蚜迁飞动态系统监测 |
| 1.2.5.3 田间烟蚜种群数量调查 |
| 1.2.6 综合防治 |
| 1.2.6.1 农业防治 |
| 1.2.6.2 物理防治 |
| 1.2.6.3 生物防治 |
| 1.2.6.4 化学防治 |
| 1.3 烟草蚜传病毒病研究进展 |
| 1.3.1 烟草蚜传病毒病危害现状 |
| 1.3.2 烟草马铃薯Y病毒病(PVY)研究进展 |
| 1.3.2.1 PVY多样性 |
| 1.3.2.2 PVY血清学特征 |
| 1.3.2.3 PVY分子特征 |
| 1.3.2.4 HC-Pro研究 |
| 1.3.3 烟草黄瓜花叶病毒病(CMV)研究进展 |
| 1.3.4 烟草脉带花叶病毒病(TVBMV)研究进展 |
| 1.3.5 烟草番茄斑萎病毒病(TSWV)研究进展 |
| 1.3.6 烟草蚜传病毒病高通量检测技术 |
| 1.3.7 烟草蚜传病毒病遗传多样性分析 |
| 1.3.8 烟草蚜传病毒病预测预报研究进展 |
| 1.3.9 烟草蚜传病毒病综合防治研究进展 |
| 1.4 烟蚜和蚜传病毒病相关性研究进展 |
| 1.4.1 蚜虫的传毒特性 |
| 1.4.2 影响PVY传播的因素 |
| 1.4.3 PVY的蚜传机制 |
| 1.4.4 蚜虫迁飞与PVY发生流行的关系 |
| 1.4.5 治蚜与防病的关系 |
| 1.5 研究存在的主要问题和意义 |
| 1.6 研究的主要内容 |
| 1.6.1 烟草蚜虫带毒部位及其发生规律研究 |
| 1.6.2 烟草蚜传病毒病检测及危害研究 |
| 1.6.3 利用siRNA高通量测序技术筛选烟草蚜传新病毒 |
| 1.6.4 蚜虫及蚜传病毒病发生流行相关性研究 |
| 1.6.5 蚜虫及蚜传病毒病绿色防控关键技术研究与应用 |
| 第二章 烟草蚜虫种类鉴定及其传毒方式研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 烟草蚜虫种类鉴定 |
| 2.1.2 烟蚜传毒方式研究 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 蚜虫种类鉴定 |
| 2.2.2 烟蚜形态观察与描述 |
| 2.2.3 CMV毒源鉴定 |
| 2.2.4 口针中CMV检测结果 |
| 2.2.5 烟蚜头部CMV检测结果 |
| 2.2.6 烟蚜腹部CMV检测结果 |
| 2.2.7 烟蚜持毒时间的测定 |
| 2.2.8 烟蚜传毒效率的测定 |
| 2.3 结论 |
| 2.3.1 毒源的鉴定 |
| 2.3.2 烟蚜各部位CMV的检测 |
| 2.3.3 烟蚜持毒时间及其传毒效率的测定 |
| 第三章 烟草蚜传病毒病检测、危害及遗传多样性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 大田蚜传病毒病种类鉴定 |
| 3.1.2 烟田周边毒源植物检测 |
| 3.1.3 大棚烟苗带毒率检测 |
| 3.2 结论与分析 |
| 3.2.1 大田蚜传病毒病种类鉴定 |
| 3.2.2 烟田周边毒源植物检测 |
| 3.2.3 大棚烟苗带毒率检测 |
| 3.2.4 CMV、PVY、TVBMV遗传多样性分析 |
| 第四章 利用siRNA高通量测序技术筛选烟草蚜传新病毒 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 烟草新病毒Tobacco Virus 2的序列分析 |
| 4.1.2 芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus-AH)烟草分离物序列分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 烟草新病毒Tobacco Virus 2的序列分析 |
| 4.2.2 芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus-AH)烟草分离物序列分析 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 烟蚜及蚜传病毒病发生流行相关性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 2016 年监测结果 |
| 5.2.2 2017 年监测结果 |
| 5.2.3 2018 年监测结果 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 治虫防病绿色防控技术研究与示范 |
| 6.1 天敌蚜茧蜂控制烟蚜技术研究与应用 |
| 6.1.1 繁蜂设施与器材 |
| 6.1.2 烟蚜茧蜂繁育技术 |
| 6.1.3 烟蚜茧蜂释放技术 |
| 6.1.4 种蚜种蜂保育技术 |
| 6.1.5 烟蚜茧蜂对烟蚜的防治效果 |
| 6.2 物理防治技术研究 |
| 6.3 黄板诱蚜示范 |
| 6.3.1 目的 |
| 6.3.2 地点 |
| 6.3.3 品种 |
| 6.3.4 实施情况 |
| 6.3.5 调查统计 |
| 6.3.6 结果与分析 |
| 6.4 .新型免疫诱抗剂防治烟草病毒病技术研究与示范 |
| 6.4.1 基本情况 |
| 6.4.2 施药情况 |
| 6.4.3 调查统计 |
| 6.4.4 结果与分析 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 研究结果 |
| 7.1.1 明确了烟草蚜虫种类及其传毒方式 |
| 7.1.2 明确了烟草蚜传病毒病种类、危害及遗传多样性 |
| 7.1.3 利用siRNA高通量测序技术筛选出烟草蚜传新病毒 |
| 7.1.4 明确了烟蚜及蚜传病毒病发生流行的相关性 |
| 7.1.5 开展了治虫防病绿色防控技术研究与应用 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.2.1 利用小RNA高通量测序方法检测新病毒 |
| 7.2.2 明确了皖南烟区烟蚜及蚜传病毒病发生流行的相关性 |
| 参考文献 |
（9）利用CRISPR/Cas9靶向斯里兰卡木薯花叶病毒创制抗病木薯材料（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述及研究目的 |
| 1.1 双生病毒概述 |
| 1.1.1 双生病毒的分类 |
| 1.1.2 双生病毒的基因组结构 |
| 1.1.3 双生病毒的传播 |
| 1.1.4 木薯花叶病 |
| 1.2 双生病毒的复制机制 |
| 1.3 CRISPR基因编辑系统概述 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9 基因编辑系统概述 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas13a基因编辑系统概述 |
| 1.4 CRISPR系统在抗病毒作物育种中的应用 |
| 1.4.1 CRISPR系统在作物育种中的应用概述 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 在抗病毒作物育种中的应用 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas13a在抗病毒作物育种中的应用 |
| 1.5 立题依据及研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 2 基本材料与方法 |
| 2.1 基本材料 |
| 2.1.1 供试植物 |
| 2.1.2 供试病毒 |
| 2.1.3 实验相关试剂及仪器设备 |
| 2.2 基本实验方法 |
| 2.2.1 植物基因组DNA的粗提取 |
| 2.2.2 分子亚克隆 |
| 2.2.3 农杆菌感受态的转化 |
| 2.2.4 农杆菌介导的本氏烟瞬时表达 |
| 2.2.5 植物叶片RNA的提取 |
| 2.2.6 RNA反转录合成c DNA |
| 2.2.7 培养基及病毒悬浮液配方 |
| 3 靶向SLCMV的单靶点CRISPR/Cas9 体系构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试植物与病毒 |
| 3.1.2 相关试剂与设备 |
| 3.1.3 sgRNA序列的设计 |
| 3.1.4 CRISPR/Cas9 载体的构建 |
| 3.1.5 利用瞬时表达体系对sgRNA进行筛选 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.1.7 本章中使用的引物序列 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 sgRNA设计及CRISPR/Cas9 体系构建 |
| 3.2.2 sgRNA筛选的本氏烟瞬时表达体系建立 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9 介导的SLCMV抗性检测 |
| 3.2.4 sgRNA设计及CRISPR/Cas9-Trex2 体系构建 |
| 3.2.5 CRISPR/Cas9-Trex2 介导的SLCMV抗性检测 |
| 3.3 讨论 |
| 4 靶向SLCMV的多靶点CRISPR/Cas9 体系构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试植物与病毒 |
| 4.1.2 相关试剂与设备 |
| 4.1.3 多靶点CRISPR/Cas9 载体的构建 |
| 4.1.4 多靶点载体表达后成熟sgRNA释放的检测 |
| 4.1.5 多靶点CRISPR/Cas9 载体抗SLCMV效果验证 |
| 4.1.6 数据分析 |
| 4.1.7 本章中使用的引物序列 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 多靶点CRISPR/Cas9 体系构建及sgRNA释放的检测 |
| 4.2.2 多靶点CRISPR/Cas9 介导的SLCMV抗性验证 |
| 4.3 讨论 |
| 5 表达CRISPR/Cas9 的转基因木薯培育 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试植物 |
| 5.1.2 相关试剂与设备 |
| 5.1.3 木薯的遗传转化 |
| 5.1.4 转基因木薯阳性株系鉴定 |
| 5.1.5 转基因木薯组培苗的移栽和炼苗 |
| 5.1.6 转基因木薯Cas9 表达量检测 |
| 5.1.7 木薯组培培养基及营养液配方 |
| 5.1.8 数据分析 |
| 5.1.9 本章中使用的引物序列 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 木薯愈伤组织的遗传转化 |
| 5.2.2 转基因木薯株系的PCR鉴定 |
| 5.2.3 转基因木薯阳性株系Cas9 基因表达量的检测 |
| 5.3 讨论 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 本研究的特色与创新之处 |
| 6.3 本研究值得继续研究的问题 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）蜘蛛毒液多肽抗烟粉虱应用初探（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述与选题依据 |
| 1.1 烟粉虱 |
| 1.1.1 烟粉虱概述 |
| 1.1.2 烟粉虱隐存种 |
| 1.1.3 烟粉虱的防控 |
| 1.2 双生病毒 |
| 1.2.1 双生病毒概述 |
| 1.2.2 双生病毒的危害 |
| 1.2.3 烟粉虱对菜豆金黄花叶病毒属病毒的传播 |
| 1.3 蜘蛛毒液 |
| 1.3.1 毒液的成分 |
| 1.3.2 毒性多肽的筛选 |
| 1.3.3 神经毒肽的转运 |
| 1.4 立题依据及研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 基本材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试植物 |
| 2.1.3 供试病毒 |
| 2.2 仪器设备及试剂耗材 |
| 2.2.1 主要商用仪器设备 |
| 2.2.2 其他设备 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验耗材 |
| 2.3 基本实验技术与方法 |
| 2.3.1 烟粉虱总DNA的提取 |
| 2.3.2 烟粉虱隐存种鉴定 |
| 2.3.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.4 分子亚克隆 |
| 2.3.5 蛋白质原核表达及纯化 |
| 2.3.6 SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色 |
| 2.3.7 Western blot检测 |
| 2.3.8 蛋白浓度检测 |
| 2.3.9 本研究所用引物 |
| 3 神经毒肽的筛选及其对烟粉虱血淋巴毒性的验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫与植物 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 神经毒肽的筛选 |
| 3.1.4 表达与纯化 |
| 3.1.5 显微注射 |
| 3.1.6 产卵量测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 神经毒肽的筛选 |
| 3.2.2 神经毒肽的表达及纯化 |
| 3.2.3 显微注射神经毒肽对烟粉虱存活率的影响 |
| 3.2.4 显微注射神经毒肽对烟粉虱产卵量的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4 病毒外壳蛋白融合毒肽的经口毒性及转基因植物构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试昆虫与植物 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 |
| 4.1.3 双层膜人工饲喂 |
| 4.1.4 本氏烟瞬时表达 |
| 4.1.5 转基因拟南芥的构建 |
| 4.1.6 植物蛋白的提取 |
| 4.1.7 烟粉虱蛋白的提取 |
| 4.1.8 植物DNA的提取 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 神经毒肽的人工饲喂 |
| 4.2.2 CP融合毒肽的表达纯化 |
| 4.2.3 饲喂CP融合毒肽对烟粉虱存活率的影响 |
| 4.2.4 病毒外壳蛋白与神经毒肽在本氏烟中的瞬时表达 |
| 4.2.5 转基因拟南芥的构建 |
| 4.3 讨论 |
| 5 总讨论 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究的特色与创新之处 |
| 5.3 本研究的不足之处及值得继续研究的问题 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染（论文参考文献）
- [1]VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望[J]. 郝梦媛,杭琦,师恭曜. 中国农业科技导报, 2022(01)
- [2]桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析[D]. 李雨珈. 广西大学, 2021(12)
- [3]与黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）运动蛋白互作的西瓜C1MTB蛋白功能及调控机制研究[D]. 姚依秀. 新疆农业大学, 2021
- [4]利用诱捕策略获得抗PVY的PBS1基因的研究[D]. 李换换. 内蒙古大学, 2021(12)
- [5]凤果花叶病毒和苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用[D]. 何宛芹. 浙江大学, 2021(01)
- [6]烟草与CMV互作因子筛选、评价及应用[D]. 杨晓宁. 中国农业科学院, 2021
- [7]杭白菊病毒检测及不同世代脱毒苗产量品质的研究[D]. 颜克如. 浙江大学, 2021(01)
- [8]烟蚜与蚜传病毒病发生相关性及绿色防控技术研究[D]. 周本国. 安徽农业大学, 2021(01)
- [9]利用CRISPR/Cas9靶向斯里兰卡木薯花叶病毒创制抗病木薯材料[D]. 叶昕彤. 浙江大学, 2021(01)
- [10]蜘蛛毒液多肽抗烟粉虱应用初探[D]. 杨敬竞. 浙江大学, 2021(01)