一、用鸡伤寒沙门氏菌的膜蛋白和9R活菌苗预防鸡伤寒的可行性（论文文献综述）
周莹莹[1]（2021）在《鸡白痢沙门菌诱导Th2应答相关抗原的鉴定及功能研究》文中研究指明鸡白痢（Pullorumdisease）是一种急性、全身性传染病,给养禽业带来了巨大的危害,其病原为鸡白痢沙门菌（Salmonella enterica serovar Pullorum,Salmonella Pullorum）,具有宿主专嗜性,可引起雏鸡的急性败血症;也可以感染成年鸡,常导致母鸡产蛋减少,体重下降,或导致孵化率和出雏率明显下降,该病原菌亦可垂直传播给子代。鸡白痢沙门菌作为兼性胞内寄生菌,在鸡体内诱导的免疫应答偏向于Th2型,有助于其在巨噬细胞内存活,为细菌持续感染提供了有利的条件,是鸡白痢免疫防控的难点。挖掘鸡白痢沙门菌中与Th2应答相关的抗原（诱导Th2应答或抑制Th1应答的抗原）,有助于鸡白痢沙门菌持续感染的机制的解析,同时为鸡白痢疫苗的研制提供新思路和新靶点。巨噬细胞M1/M2表型与T细胞介导Th1/Th2应答存在相互联系,M1巨噬细胞产生的IL-12、趋化因子CXCL9和CXCL10会促进Th1细胞的分化,Th1应答中的IFN-γ会刺激巨噬细胞产生M1极化;M2巨噬细胞产生的趋化因子CCL17、CCL22和CCL24则促进Th2细胞的分化,Th2应答中的IL-4会诱导巨噬细胞产生M2极化。因此,通过检测巨噬细胞的极化分型可以间接反映宿主的T细胞应答类型。巨噬细胞的极化分型中存在着不同的精氨酸代谢途径,其中诱导型一氧化氮合成酶（Induciblenitricoxidesynthase,iNOS）是M1巨噬细胞的重要标志物,可将精氨酸代谢为一氧化氮（Nitric oxide,NO）和鸟氨酸。因此巨噬细胞NO的产生可以作为其极化分型的指标。本研究通过构建鸡白痢沙门菌转座突变库,以巨噬细胞为感染模型,基于突变株感染后巨噬细胞中NO的产生判断巨噬细胞是否发生M1极化,从而筛选出促进Th1应答的候选突变株,相应的基因编码产物即为抑制Th1或诱导Th2应答的候选抗原。构建相关基因的缺失株,通过体外实验和体内实验评价缺失株诱导Th1/Th2免疫应答的能力以及机体免疫应答对相应病原菌的清除作用,并初步评价其作为疫苗候选株的潜能。进一步为鸡白痢沙门菌持续感染机制的解析以及鸡白痢防控技术的开发提供理论依据和靶点。1.鸡白痢沙门菌中调控巨噬细胞产生NO的基因筛选利用pSC189转座质粒构建鸡白痢沙门菌449/87的转座子突变库,PCR及抗性鉴定结果显示转座子插入到鸡白痢沙门菌基因组中的成功率为100%。以鸡巨噬细胞系HD11为感染模型,利用转座突变株感染细胞,通过检测NO的产生情况进行鸡白痢沙门菌影响宿主NO产生相关基因的高通量筛选。本文共筛选了2807个转座突变株,与野生株449/87感染组相比,诱导HD11产生NO上调的菌株有49个,下调的菌株有12个。通过PCR、测序和比对分析对筛选出来的转座突变株进行基因定位,并构建相应的基因缺失株和回复株,以构建的鸡白痢沙门菌基因缺失株、回复株和野生株感染HD11,对上述筛选结果进行验证,结果表明,与野生株449/87感染组相比,arcB、cyaA、cysB、hilA、glnD、invE和prgI的单基因缺失株可显着上调NO的产生。2.鸡白痢沙门菌中NO相关基因对巨噬细胞M1/M2极化分型的影响利用贴壁培养法制备鸡外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）来源的原代巨噬细胞,流式细胞术检测结果显示以7.5×106cells/孔接种6孔板时,获得的巨噬细胞纯度最高,为93%。野生株449/87和基因缺失株感染原代巨噬细胞后NO的检测结果显示,cysB、arcB、prgI、invE、hilA、cyaA和glnD7个基因的单基因缺失株均能显着上调巨噬细胞产生的NO,与HD11细胞感染模型的结果一致。将上述7个单基因缺失株感染HD11和原代巨噬细胞后,检测iNOS的活性,IFN-γ、IL-12p40、IL-4和IL-10 mRNA水平及IL-12p40蛋白质水平。结果显示,与野生株449/87相比,7个单基因缺失株感染后HD11和原代巨噬细胞中iNOS活性显着增加,IL-12p40蛋白水平也显着提高,表明缺失株感染巨噬细胞后会促进其M1极化。与野生株449/87感染组相比,7个单基因缺失株感染HD11后Th2相关细胞因子IL-4和IL-10 mRNA水平没有变化,而Th1相关细胞因子IL-12p40 mRNA显着上调;另外,除了449/87ΔcysB和449/87ΔglnD,其余5个基因（prgI、invE、hilA、cyaA和arcB）的单基因缺失株均可以显着上调HD11感染后的IFN-γ mRNA水平,表明这5个缺失株可能通过上调HD11产生的IFN-γ促进其M1极化。在鸡原代巨噬细胞感染模型中,相比野生株449/87,cyaA、hilA和invE单基因缺失株感染后Th1相关细胞因子IFN-γ mRNA显着上调,而Th2相关细胞因子IL-4mRNA显着下调,表明449/87ΔcyaA、449/87ΔhilA和449/87Δ invE通过上调原代巨噬细胞产生的IFN-γ从而促进其发生M1极化,且同时通过下调IL-4从而抑制其发生M2极化。3.鸡白痢沙门菌449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA诱导鸡体免疫应答的研究将鸡白痢沙门菌449/87、449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA分别通过肌肉注射方式接种海兰白雏鸡,在感染后不同时间点分别收集肝脏和脾脏,观察脏器的组织病理学变化。通过检测血清抗体、脾脏CD4+/CD8+T细胞的比例、淋巴细胞增殖和细胞因子表达水平,评估了 449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA感染雏鸡后激发的体液和细胞免疫应答。血清抗体检测结果显示,449/87和449/87ΔhilA感染雏鸡后可诱导机体产生相同水平的鸡白痢沙门菌抗体,而449/87ΔcyaA感染组的抗体低于449/87野生株感染组,表明CyaA的缺失降低了鸡白痢沙门菌激发的体液免疫应答水平。脾脏CD4+和CD8+T细胞的比例及脾脏淋巴细胞增殖试验检测结果显示,与449/87野生株感染组相比,449/87ΔcyaA感染的鸡脾脏CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增加（21 d）,449/87ΔhilA感染组脾脏CD4+T细胞比例增加（28 d）;449/87ΔcyaA和449/87ΔhilA感染的鸡分别在感染后21和28 d时其脾脏细胞增殖能力显着增强,表明这两个基因缺失株诱导T淋巴细胞应答的能力增强。脾脏细胞因子检测结果显示,与449/87野生株感染组相比,449/87ΔhilA感染组IFN-γ mRNA水平显着升高（感染后的3和7 d）;449/87ΔcyaA感染组IFN-γ mRNA表达水平升高（感染后7d）,IL-4 mRNA水平显着降低（感染后的3 d）。以上结果表明,449/87AcyaA和449/87ΔhilA感染后海兰白鸡产生的应答均偏向Th1型。对449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA感染组肝脏和脾脏中的载菌量进行检测,发现449/87ΔcyaA感染组肝脏和脾脏中定植的菌量较少,且分别在感染后7d和21d,肝脏和脾脏中的449/87ΔcyaA被清除。449/87ΔhilA感染组肝脏和脾脏中沙门菌的定植量低于野生株组,且在感染后第21d,肝脏中的449/8 7ΔhilA被清除。以上结果表明缺失株诱导的Th1应答可加速机体对细菌的清除。4.鸡白痢沙门菌449/87ΔcyaA作为疫苗候选株的免疫保护效力评估以3日龄海兰白雏鸡为模型进行449/87和449/87ΔcyaA的LD50测定,结果显示肌肉注射时449/87和449/87ΔcyaA的 LD50分别为7.02×107 CFU和4.82×109 CFU,表明CyaA缺失后鸡白痢沙门菌的毒力减弱。将449/87△cyaA以1×107CFU/只的剂量通过肌肉注射免疫接种3日龄海兰白雏鸡进行疫苗免疫保护效力的评估。体重变化和临床表现显示,与PBS对照组相比,449/87ΔcyaA免疫组的鸡只生长性能正常,且未出现任何临床症状。血清抗体水平检测结果显示449/87ΔcyaA免疫后第14和21d鸡体产生针对鸡白痢沙门菌的抗体。脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,449/87ΔcyaA免疫组的脾脏细胞在ConA和可溶性抗原刺激下增殖能力显着提高。细胞毒性淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）结果显示,449/87ΔcyaA免疫组的脾脏CD8+T细胞对靶细胞（449/87感染的巨噬细胞）具有较强的杀伤能力,显着高于未免疫组。免疫后第14d对雏鸡进行攻毒,攻毒后免疫组鸡只没有明显临床症状,鸡只的存活率为100%;而未免疫攻毒组的鸡却呈现高发病率和死亡率。细菌定植结果显示,在攻毒后的第3和14d,免疫后攻毒组肝脏中的鸡白痢沙门菌载量显着低于未免疫攻毒组。上述结果表明鸡白痢沙门菌减毒株449/87ΔcyaA可诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,为雏鸡提供良好的保护效力,具有作为鸡白痢疫苗候选株的潜力。
魏星[2]（2019）在《表达APECⅠ型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌αroA基因缺失株的构建及安全效力评估》文中进行了进一步梳理禽致病性大肠杆菌（avainpathogenic Escherichia coli,APEC）会引起鸡大肠杆菌病,常诱发心包炎、肝周炎、气囊炎、卵黄性腹膜炎等,造成严重的经济损失,阻碍家禽养殖业的健康发展。鸡白痢沙门氏菌（Salnmoella enterica serovar Pullorum,S.Pullorum）和鸡伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Gallinarum,S.Gallinarum）是危害养鸡业发展的重要病原菌,该类病原菌可通过水平/垂直传播,主要感染3周龄以内的雏鸡,对青年鸡和成年鸡同样会造成不良影响,如下痢、产蛋率下降等。基于目前限制抗生素使用的要求,寻找一个安全、有效的免疫方法来防治禽致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌感染是亟需解决的问题。本实验室前期研究结果表明,表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）对鸡群预防禽致病性大肠杆菌感染具有60%的免疫保护力,考虑到SG9R菌株对1月龄雏鸡有一定的致病性影响,尚未应用于3周龄以内的雏鸡。因此,本研究基于上述表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）构建其αroA基因缺失株,并对其致弱性缺失株的安全性和保护效果进行探究。旨在为开发有效预防禽大肠杆菌病和鸡沙门氏菌病的多联基因工程减毒疫苗及沙门氏菌疫苗载体奠定基础。1.表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）基因缺失株的构建及其生物学特性研究通过比对NCBI GenBank上不同沙门氏菌菌株的αroA基因序列,设计两对PCR引物,分别用于扩增鉴定重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）中的αroA编码基因,以及用于扩增Red同源重组的缺失靶基因同源臂,即该缺失靶基因的5’端序列与αroA两翼序列同源,3’端序列与pKD3上cat基因序列两翼同源。利用Red同源重组技术,成功构建含氯霉素抗性基因的αroA基因缺失一次重组菌SG9R（pYA3342-fim）△αroA::cat。进一步导入含FLP重组酶的pCP20质粒,去除氯霉素抗性片段,最终成功构建αroA基因缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA。通过基因克隆技术,将αroA基因克隆至表达质粒载体pBR322并转化至αroA缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA中,成功构建αroA基因回补株SG9R（pYA3342-fiim）△αroA/pαroA。在此基础上,常规糖发酵试验和氨基酸利用试验等生化反 应 检 测 结 果 显 示 SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 和SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA生化特性保持一致,表明αroA基因缺失对细菌生长代谢没有显着影响;生长曲线测定结果表明αroA基因缺失会一定程度减慢SG9R（pYA3342-fim）在体外的增殖速度;甘露糖敏感血凝和血凝抑制结果表明,这三株菌均能和鸡红细胞发生明显的凝集反应,并且凝集活性能被D-甘露糖抑制,表明该重组菌SG9R（pYA3342-fim）成功表达大肠杆菌APECI型菌毛;αroA缺失株即SG9R（pYA3342-fim）△αroA的遗传稳定性经30代测试结果表明该缺失株具有良好的遗传稳定性;微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）结果显示这三株菌对头孢菌素、链霉素、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考、多粘菌素、美罗培南、恩诺沙星及环丙沙星均敏感,表明αroA基因缺失不会导致细菌耐药性的产生。表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）αroA基因缺失株的成功构建为后续进一步探究αroA基因缺失减毒活疫苗安全性评估研究奠定基础。2.表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）基因缺失株的安全效力评估为探究重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）△αroA作为活疫苗候选株的安全性和潜在应用价值,本试验研究对该缺失株进行了安全性评价和免疫保护研究。将 1 日龄 SPF 鸡（n=50）随机分成 10 组,即 SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA、SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA 分别以 1×108cfu、1×109cfu、1 ×1010fu的剂量经口服途径对鸡进行免疫,另设PBS对照组,每组5羽,免疫剂量为0.2mL/羽。结果显示:原型疫苗株SG9R（pYA3342-fim）1×108cfu、1×109cfu剂量组的鸡都健康,无不良反应,而1×1010cfu剂量组的5只鸡有2只鸡在24h内出现羽毛疏松、精神沉郁等症状,36h后食欲恢复正常、精神状态转好,未出现死亡。缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA 1×108cfu、1×109cfu、1×1010cfu各剂量组的鸡都健康,无不良反应。回补菌株SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA 1×108cfu、1×109cfu 剂量组的鸡都健康,无不良反应,而1×1O10cfu剂量组的5只鸡有1只鸡在24h内出现羽毛疏松、精神沉郁等症状,36h后食欲恢复正常、精神状态转好,未出现死亡。这三株菌的安全性评价结果表明αroA基因缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA 比 原 型 疫 苗 株 SG9R（pYA3342-fim）和 回 补 株SG9R（pYA3342-fim）△αroA/paαroA更加安全,1×109cfu是较为安全的剂量。结合文献资料信息和本试验结果,确定下一步免疫保护试验的免疫剂量为1×109cfu。将1日龄SPF鸡（n=75）随机分成5组,即SG9R（pYA3342-fim）免疫组、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 免疫组、SG9R（pYA3342-fim）△αroA/paαroA 免疫组、PBS 攻毒对照组、正常对照组,每组15羽。以口服途径对各组1日龄的鸡进行初次免疫,免疫剂量为]×109cfu,初次免疫2周后,以相同免疫剂量和途径对各组鸡进行二次免疫,二次免疫2周后,以相同免疫剂量和途径对各组鸡进行三次免疫。结果显示:SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA、SG9R（pYA3342-fim）△aarA/pαroA,对鸡的日增重无显着影响,也不影响鸡的采食量、精神状况。三次免疫2周后,用1×1010cfu的禽致病性大肠杆菌强毒株QD2（血清型078）通过后胸气囊接种方式对各试验组鸡群经进行攻毒,SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 和 SG9R（pYA3342-fim）△αroA/parA 免疫组以及PBS攻毒对照组的鸡的死亡率分别为33.3%、20%、26.7%、66.7%;用1×1010cfu的鸡白痢沙门氏菌强毒分离株SP03经口服途径对各试验组鸡群进行攻毒,SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 和 SG9R（pYA3342-fim）△αroA/parA 免疫组以及PBS攻毒对照组的发病率分别为46.7%、33.3%、40%、73.3%。临床剖检和病理组织石 蜡 切 片 观 察 发 现 SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA、SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA免疫组的鸡攻毒后的临床症状和心脏、肝脏及脾脏组织的病变程度较攻毒对照组的显着减轻。免疫保护试验结果表明,重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）△αroA缺失株作为减毒活疫苗候选株能够有效地预防禽致病性大肠杆菌的感染,对鸡白痢沙门氏菌的感染也能起到有效的交叉保护作用。
满成连[3]（2018）在《鸡白痢沙门菌LPS合成和生物被膜形成相关基因缺失株的构建及免疫效力评价》文中研究指明鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种严重危害家禽生产的可经垂直传播的传染病。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》将其确定为优先防治病种,对种鸡群提出净化要求。在我国及其他发展中国家,常采用药物预防和控制该病,虽有一定的效果,但不能达到清除病原的目的,且长期使用抗生素会产生多重耐药性和药物残留等问题。疫苗免疫是防控该病的有效措施之一,常用疫苗为沙门菌减毒活疫苗。全血玻片凝集试验是养殖场检疫和淘汰阳性鸡的常用方法,但正常情况下无法区别自然感染动物和免疫动物（Differentiation of Infected and Vaccinated Animals,DIVA）,因此研制具有 DIVA 特性的疫苗对种群的净化具有积极作用。鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG由本实验室构建,具有致病力低、免疫原性高和DIVA等特性。生物被膜作为鸡白痢沙门菌对抗不良环境而形成的结构性细菌群落,可导致持续感染。为了进一步降低沙门菌的致病力、提高其安全性,本研究利用λ-Red同源重组技术在LPS合成相关基因缺失株的基础上,进一步构建鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因的缺失株,并对其相关生物学特性进行评价,为鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株的筛选奠定基础。1.鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因缺失株的构建利用λ-Red同源重组技术,在单基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG的基础上进一步缺失与生物被膜形成相关基因csgA和外膜蛋白基因ompR,通过PCR扩增及序列分析证实缺失株构建成功,分别命名为S6702△rfaL△csg4、S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA△ompR和S6702△rfaG△csgA△ompR。进一步的生物学特性测定显示,单基因和双基因缺失株与野生株的生长速度无显着性差异,三基因缺失株的生长速度较其它菌株稍慢。生物被膜形成能力测定显示,缺失生物被膜形成相关基因csgA和外膜蛋白基因ompR后,双基因和三基因缺失株均无生物被膜形成能力。7种药物的药敏试验显示,野生株S6702和6株缺失株的敏感性相近,但与另一株鸡白痢沙门菌S004和肠炎沙门菌疫苗株Sm24的敏感性有一定差异。缺失株的遗传稳定性测定显示,缺失株在连续传代过程中能够稳定地遗传缺失了部分片段的各个基因,在与野生株S004混合培养过程中不能够通过自然重组获得缺失基因,具有良好的安全性。2.鸡白痢沙门菌基因缺失株的致病性和免疫保护性评价通过测定半数致死量（LD50）评价基因缺失株的致病性。腹腔接种2日龄SPF鸡,野生株S6702的LD50为5.5×108CFU,与其相比较,单基因缺失株S6702ArfaL和S6702ArfaG的LD50提高了至少16倍,双基因缺失株和三基因缺失株的LD50有了进一步提高。免疫保护试验中,2日龄SPF雏鸡分别口服免疫1×108CFU的缺失株和Sm24。免疫后各免疫组体重与健康对照组相比无显着差异。免疫后第14天血清的玻片凝集试验显示,缺失株免疫血清与实验室自制染色抗原和北京中海染色抗原均不产生凝集反应。利用间接ELISA检测血清中IgG抗体,免疫后第14天后IgG抗体水平较低。口服免疫14天后,腹腔注射109 CFU毒力较强的鸡白痢沙门菌野生株S004,单基因缺失株能提供66.7%的保护率,双基因缺失株和三基因缺失株能够提供83.3%的保护率,Sm24肠炎疫苗株能够提供50%的保护率。通过分析攻毒后的第7天和14天体重水平,发现S6702△rfaG、S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR 组的平均体重比 S6702△rfaL、S6702△rfaL△csgA和S6702△rfaL△csgA△ompR的稍高,抗体水平分析结果与此一致。为进一步验证S6702△rfaG△csgA和S6702ArfaG△csgA△owpR菌株的免疫效力,以S6702ArfaG为对照,按照上述方式免疫,免疫14天后,分别采用口服和腹腔注射的方式攻毒,腹腔注射攻毒组结果显示,S6702ArfaG、S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR组的保护率均为66.7%,差异不显着,Sm24的保护率为50%。口服攻毒组结果显示,从第3天到第5天,攻毒对照组的分离率接近100%,免疫组分离率明显下降,第5天的分离率仅有30%左右,并且各免疫组之间差异不显着。综上所述,鸡白痢缺失株S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR具有致病力低、免疫效力高和DIVA等优势,可作为鸡白痢沙门菌减毒活疫苗的候选株。
张倩[4]（2017）在《我国祖代种鸡场禽白血病、禽网状内皮组织增殖症和鸡白痢的监测与分析》文中进行了进一步梳理禽白血病（Avian leucosis,AL）、禽网状内皮组织增殖症（Reticuloendotheliosis,RE）和鸡白痢（Pullorumdisease,PD）是严重危害我国养鸡业的传染病,这三种疫病的病原均可经卵垂直传播,净化是控制这3种疫病的关键措施。按照《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》要求,到2020年国内全部种禽场的禽白血病和鸡场沙门氏菌病达净化标准。因此,掌握上述三种疫病在我国祖代种鸡群中的感染状况,对开展净化工作具有重要意义。本研究在2011～2016年间,采用ELISA和平板凝集方法对我国祖代种鸡场进行了 ALV-p27抗原、ALV-J抗体、ALV-A/B抗体、REV抗体和鸡白痢抗体抽样检测,监测范围涉及19个省、市、自治区的60个祖代种鸡场,检测蛋清样品44476份,血清样品46502份,共获得检测数据229639个。通过对群间、空间、时间上的分布情况分析,解析不同疫病感染水平的变化情况和内在联系。监测结果显示,6年中,ALV-p27抗原场阳性率为18.75%～66.67%,个体阳性率为0.07%～4.64%; ALV-J 抗体场阳性率为 26.32%～64.71%,个体阳性率为 0.35%～5.57%; ALV-A/B抗体场阳性率为36.84%～88.24%,个体阳性率为1.58%～9.23%。ALV-J亚群和ALV-A/B亚群混合感染的场阳性率在15.79%～58.82%之间。表明ALV感染在祖代种鸡场广泛存在,2011～2016年间,场阳性率均在35%以上,个体阳性率呈现逐年上升趋势,ALV-J亚群和ALV-A/B亚群混合感染现象严重。不同亚群混合感染使ALV检测和防控难度增加,应有针对性地采取ALV通用检测技术,确保对感染鸡群的净化淘汰效果。2011～2016年间,REV抗体的场阳性率为63.16%～88.24%,个体阳性率为2.71%～13.22%。表明祖代鸡场中REV抗体检出率在三种病中最高,总体流行趋势先升后降。种鸡场REV感染大量存在,会对于鸡群总体免疫能力造成影响,影响鸡场其他疫病的控制。各年度的鸡白痢抗体场阳性率在17.65%～78.95%,个体阳性率在0.34%～6.73%。经对比分析表明,祖代鸡场中鸡白痢抗体检出率在6年间变化较大,其个体阳性率与鸡群REV、ALV感染率率的变化趋势一致。鸡白痢作为祖代种鸡群长期重点防控的疫病,其感染率出现了较大幅度的波动变化,应与REV、ALV等免疫抑制性疾病的影响有关。混合感染分析显示,两种或三种疫病混合感染现象的鸡场比例在23.53%～68.42%之间,其中三种疫病混合感染最为普遍;而混合感染两种病的鸡场中,REV与ALV或鸡白痢混合感染的鸡场比较多,ALV与鸡白痢混合感染的鸡场则较少。表明祖代鸡场中ALV、REV和鸡白痢混合感染现象较为严重。祖代鸡群中的ALV、REV、鸡白痢感染普遍存在,可能会增加种鸡群向其下一代感染的风险。三种疫病的混合感染情况也提示我国祖代种鸡场在种源引进、预防疫苗污染、监控鸡群感染状态方面存在疏漏。本研究还对不同代次、不同品种、不同来源祖代种鸡群疫病感染情况进行了差异显着性分析。结果显示,ALV-p27抗原、ALV-J抗体、REV抗体和鸡白痢抗体在祖代种鸡的检出率大于曾祖代种鸡,差异极显着;肉种鸡的检出率大于蛋种鸡,差异极显着;地方品种鸡的检出率大于进口品种鸡和国内自培育种鸡,差异极显着。ALV-A/B抗体在曾祖代种鸡的检出率大于祖代种鸡,差异极显着;肉种鸡的检出率大于蛋种鸡,差异不显着;国内自培育种鸡的检出率大于进口品种鸡和地方品种鸡,差异极显着。监测结果表明,祖代种鸡场、肉种鸡、地方品种鸡感染ALV-J、REV和鸡白痢的风险较高;曾祖代种鸡场、肉种鸡、国内自培育种鸡感染ALV-A/B的风险较高。应根据不同疫病的流行特点对风险较大的祖代鸡群进行重点监控。
郭龙宗[5]（2017）在《种鸡场沙门氏菌感染状况的调查与防控》文中提出禽沙门氏菌感染严重影响养鸡生产,也是一种重要的人畜共患病,涉及到食品安全。本研究对烟台、威海、潍坊地区种鸡群沙门氏菌的感染状况进行了血清学的调查和分析,还做了沙门氏菌的分离与鉴定,以期为区域种鸡群沙门氏菌感染的控制提供科学依据。1、种鸡场沙门氏菌流行病学调查2012-2015年连续跟踪监测55个鸡场91批种鸡群的环境、雏鸡、孵化毛蛋等107 422份样品,沙门氏菌的分离率为3.8%。其中42批祖代肉种鸡不同周龄的沙门氏菌平均平板凝集阳性率,在19周阳性率最高达21.3%,在58周阳性率最低为10.3%,23批祖代蛋种鸡平均平板凝集阳性率在19周最高,达到7.52%,这一周龄与肉种鸡相同,其他周龄都在6.8%以下,肉种鸡的阳性率要显着高于蛋种鸡;按照鸡群引进年度进行分类,沙门氏菌平板凝集阳性率每年都呈下降趋势,采用血清8倍稀释之后的平板凝集数据则更加明显,2015年度祖代批次30-50周龄血清8倍稀释后的平板凝集阳性率为0%,但55周后有上升趋势;在父母代鸡群,36周后平板凝集阳性率也呈逐年下降趋势,但血清8倍稀释后平板凝集阳性率2015年比2013-2014年度鸡群下降也最为明显,高峰阳性率从2%到10%下降到2%以下,但仍高于祖代肉种鸡群的产蛋末期。2、未稀释的沙门氏菌平板凝集阳性血清和8倍稀释后平板凝集仍为阳性血清检出率和特异性比较。孵化毛蛋中持续分离到沙门氏菌的场区,其种鸡血清8倍稀释后沙门氏菌平板凝集仍呈阳性的血清,用BIOCHEKB+D群沙门氏菌菌属抗体检测试剂盒进行检测,阳性吻合率达97.9%,毛蛋中间断性可分离到病原阳性场可达98.8%,两种方法具有较高的相关性。但未稀释血清平板凝集阳性组和血清2倍稀释后平板凝集阳性组则差距明显。对未分离到沙门氏菌病原的5个场317份平板凝集阳性血清用ELISA方法进行检测,结果只有1份阳性。选取的一个肉种鸡病原学阳性场和一个病原学阴性场,血清平板凝集2场之间的阳性率有差异,但阴性场也有持续的平板凝集阳性产生;8倍稀释平板凝集阳性只在病原分离阳性的场检出,8倍稀释后平板凝集阳性更有利于排除假阳性的干扰,评估鸡群是否受到野毒感染,便于现场采取对应的控制措施。3、沙门氏菌分离株的鉴定选取2012至2016年分离自不同场、来源的典型67株沙门氏菌,通过PCR、生化反应和单因子血清凝集反应确定,其中肠炎沙门氏菌59株,鼠伤寒沙门氏菌1株,疑似沙雷氏菌1株,亚利桑那菌6株,分离菌以肠炎沙门氏菌为主。对阳性种鸡场的跟踪发现,整个饲养周期内种鸡的死淘率明显高于阴性鸡群,多个场阳性鸡群饲养全程所产雏鸡的卵黄囊沙门氏菌分离率在0.05%-0.33%。产蛋期种鸡的集中感染,造成了下一代雏鸡前期死淘率,投诉率的升高。4、种鸡场沙门氏菌的预防控制和成效通过制定HACCP（危害关键点控制计划）方案,生物安全措施强化,饲料环节控制、场区有害生物控制、水源与垫料的消毒措施、酸化剂使用、孵化卫生控制,制定执行孵化场的“零爆蛋”计划、使用肠炎沙门氏菌疫苗免疫、定期的检测淘汰阳性鸡等综合措施下,产蛋鸡群的生产成绩获得明显提高,投诉率也有显着下降。
陈凯[6]（2017）在《表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的减毒鸡伤寒沙门氏菌重组疫苗的构建及免疫保护研究》文中认为沙门氏菌病（Salmonellosis）是由沙门氏菌引起的常见人畜共患病,除了初生动物,一般人畜感染后呈现无症状的带菌状态,长期排菌,造成养禽业严重的经济损失。其中肠炎沙门氏菌（Salmonellaenterica serovar Enteritidis,S.enteritidis）是引起沙门氏菌病和食物中毒的主要原因之一。日常生产中预防和控制肠炎沙门氏菌的主要方法是抗生素治疗,但是由于抗生素的不合理使用,所产生的耐药性问题和药物残留问题越来越受到关注。因此,寻找一个安全有效的途径来防治肠炎沙门氏菌是亟需解决的问题。经过不断地探索发现,采用疫苗免疫结合合理用药的方式是防治肠炎沙门氏菌感染较为有效的方法。因此,开发出具有强保护力的广谱的新型基因工程苗有着重要的意义。本研究通过使用以asd基因为营养缺陷标志基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R染色体-质粒平衡致死系统,表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛抗原,并评价该重组口服疫苗对肠炎沙门氏菌病的免疫保护效果。1.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的克隆与表达SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌及其相近的D-群沙门氏菌血清型中,在体外克隆和表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子sef结构基因,并检测重组菌毛的生物学活性。以表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA为模板,利用分步PCR扩增出编码SEF14菌毛操纵子的基因序列,将其克隆至表达载体pBR322,构建和筛选出含sef完整基因并正确插入pBR322的重组质粒pBR322-sef。再将此重组质粒转化至不含任何菌毛和鞭毛的大肠杆菌SE5000工程菌,并命名为psef。将pBR322空载体质粒转化至SE5000,构建阴性对照菌,命名为p322。结果发现,重组菌psef能与SEF14菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,而不与p322发生任何可见的凝集反应。电镜下可以观察到重组菌psef菌体表面表达了菌毛,Western blot可得到分子量大约为14.3kDa的蛋白条带,表明SEF14菌毛已成功在SE5000表达。本研究为进一步研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛生物学作用及开发出以SEF14菌毛作为免疫原的基因工程苗奠定了基础。2.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要亚单位sefA的克隆、原核表达与多克隆抗体的制备根据Genbank发表的肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要结构亚单位sefA基因序列设计一对引物,以肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA作为模板,PCR扩增sfA基因片段,将PCR产物按预定的阅读框插入原核表达载体pET-28a（+）,构建出重组质粒pET-28a（+）-efA,将重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）进行高效诱导表达,得到大小约为14kDa的可溶性重组蛋白。经过条件摸索,重组菌在IPTG浓度为0.2mM的条件下,25℃诱导5h时蛋白表达量最高。通过Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠,获得高特异性的SEFA多抗血清,该多抗血清能识别肠炎沙门氏菌及重组原核表达载体。本研究构建、表达并获得高纯度的融合蛋白rSEFA,并成功获得鼠源SEFA多抗血清,为进一步探究构建能表达SEF14菌毛抗原的重组基因工程疫苗奠定基础。3.表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究基于研究一构建的具sef操纵子基因并能表达SEF14菌毛的psef重组质粒,使用SalI和NcoI双酶切将其插入含asd基因的表达载体pYA3342中,再转化至减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R△asd突变株中,构建出重组菌SG9R（pYA3342-sef）;利用PCR技术扩增出编码表达SEF14菌毛的sefA主要结构亚单位基因,以同样的方法构建出重组菌SG9R（pYA3342-sefA）。采用玻板凝集试验和Western blot验证重组菌菌毛的表达,并进行鸡巨噬细胞系HD11的吞噬试验和存活试验,分析两组重组菌的生长特性、遗传稳定性及口服安全性等生物学特性。细胞试验表明,HD11对SG9R（pYA3342-sef）组吞噬数量少于SG9R（pYA3342-sefA）组和SG9R（pYA3342）组,该组菌在HD11中的存活能力也低于SG9R（pYA3342-sefA）组和SG9R（pYA3342）组,且差异均显着（P<0.05）。将35日龄非免疫清远麻鸡口服接种重组菌,并在二周后进行二免,其中SG9R（pYA3342-sef）、SG9R（pYA3342-sefA）为免疫组,SG9R（pYA3342）为空载体对照组,另设PBS空白对照组。免疫后每组每周随机取3只鸡分离外周血淋巴细胞,通过流式细胞术分析外周血CD3+CD8+T淋巴细胞动态变化。结果表明,SG9R（pYA3342-sef）组CD3+、CD8+ T细胞各时期含量均高于SG9R（pYA3342-sefA）组和SG9R（pYA3342）组和PBS对照组,且在二免两周达到最高;分别采集各组鸡每周的血清,利用间接ELISA检测其体内特异性IgG抗体的水平,结果显示二免一周和二免两周时SG9R（pYA3342-sef）组血清IgG抗体水平显着高于SG9R（pYA3342-sefA）组和SG9R（pYA3342）组和PBS对照组（P<0.05）;二免两周后收集气管黏膜样品和肠黏膜样品,利用间接ELISA检测特异性sIgA的水平,SG9R（pYA3342-sef）组十二指肠、空肠、盲肠和回肠sIgA抗体水平显着高于SG9R（pYA3342-sefA）组和SG9R（pYA3342）组和PBS对照组（P<0.05）;在二免两周后对每组鸡口服攻毒肠炎沙门氏菌标准株SD-2,观察发现虽然每组鸡均未死亡,但但攻毒后一周每组随机剖检5只鸡,SG9R（pYA3342-sef）组病变显着低于SG9R（pYA3342-sefA）组和SG9R（pYA3342）组和PBS对照组。总结试验结果表明,重组疫苗菌株SG9R（pYA3342-sef）对肠炎沙门氏菌具有较好的免疫保护作用。
安树敏[7]（2016）在《鸡白痢沙门菌△fur△speDE的构建及其免疫生物学特性初步研究》文中研究指明鸡白痢沙门菌（Salmonella enterica serovar Pullorum）是一类禽致病性革兰阴性杆菌。雏鸡感染后表现为急性败血症,以拉白色粥样或黏性粪便为特征,呈现高发病率和高死亡率。成年鸡感染后表现为隐性带菌或慢性经过,不造成死亡。鸡白痢沙门菌不仅能够水平传播,还可以经蛋垂直传播,导致了鸡蛋孵化率的降低和雏鸡死亡率的升高。在许多发展中国家,鸡白痢沙门菌仍是家禽养殖业中危害严重的细菌之一,造成了巨大的经济损失。为控制鸡白痢,国内外采取了一系列措施,包括疫苗免疫、抗生素治疗、检疫淘汰和生物安全措施等。多年实践表明,在特定情况下,疫苗接种是防控鸡群鸡白痢的最有效措施之一。用于防控沙门菌的疫苗主要分为灭活疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗三种,而减毒活疫苗以其安全性好、稳定性强、在减毒的同时不丧失免疫原性等优点,被认为是较为理想的疫苗。良好的减毒活疫苗必须保持细菌毒力和免疫保护效力之间的平衡,因此,利用基因工程构建减毒活疫苗的关键在于靶基因的选择。本文选择fur和speDE基因作为减毒靶基因,利用λ-red同源重组系统,构建了鸡白痢沙门菌S06004△fur△speDE基因缺失株,并对其生物学特性进行了评价,初步探讨了该基因缺失株作为减毒活疫苗的可行性。1鸡白痢沙门菌△furAspeDE基因缺失株的构建及其LD50测定本研究成功构建了鸡白痢沙门菌S06004Afur△speDE基因缺失株。PCR鉴定和测序结果表明,fur和speDE基因敲除成功。与野生株相比,S06004△fur△speDE的部分生物化学特性发生了改变,且S06004△fur△speDE的生长速度慢于野生株的生长速度。通过遗传稳定性分析,S06004△fur△speDE连续传至50代后,缺失的基因不能够再回复。以海兰白品系雏鸡为动物模型,对S06004△fur△speDE进行毒力评价,结果表明,与野生株相比,S06004△fur△speDE的LD50提高了约105倍,而S06004△fur和S06004△speDE的LDso仅分别提高了约73.4倍和4.95倍。这些结果说明speDE和fur基因的缺失造成了鸡白痢沙门菌S06004毒力的下降,S06004△fur△speDE具有良好的安全性,可作为减毒活疫苗候选株进行后续研究。2减毒鸡白痢沙门菌△fur△speDE免疫生物学特性初步研究本研究通过细胞和雏鸡模型初步评价了S06004△fur△speDE的免疫生物学特性。以S06004△fur△speDE和野生株分别感染禽巨噬细胞HD-11后发现,S06004△fur△speDE对细胞的黏附能力与野生株相比无显着差别,但侵袭细胞及在细胞内增殖的能力显着降低（P<0.05）。基因缺失株在机体内消减动态的分析及其免疫保护效力的评价结果显示,S06004△fur△speDE以口服和肌肉注射2种途径分别免疫3日龄雏鸡后,在口服组中,免疫10天后S06004△fur△speDE在肝脏和脾脏中被清除,而肌注组在免疫21天后,S06004△fur△speDE在肝脏和脾脏中被清除。S06004△fur△speDE以口服和肌注2种方式分别免疫3日龄雏鸡2周后,再分别以口服和肌注方式攻毒,结果显示,S06004△fur△speDE以2种方式免疫2周后,能够对野生菌攻毒提供100%免疫保护,其体重净增量也比未免疫组有所提高；肝脏和脾脏病理切片显示,组织病变程度明显轻于未免疫组。间接ELISA检测血清中IgG抗体和黏膜IgA抗体的产生水平,结果显示S06004△fur△speDE能诱导机体产生较高水平的IgG抗体和IgA抗体。荧光定量PCR方法检测S06004AfurAspeDE免疫过程中肝脏细胞因子的表达,结果显示,与对照组相比,IFN-y表达水平上调。以上结果表明,S06004△fur△speDE除了具有良好的安全性外,还能够提供良好的免疫保护,为其作为沙门菌减毒活疫苗候选株奠定了坚实基础。
殷俊磊[8]（2016）在《鸡白痢沙门菌T3SS2及其效应蛋白CigR的致病与免疫作用》文中研究指明鸡白痢沙门菌（Salmonella enterica serovar Pullorum, Salmonella Pullorum）,又称雏沙门菌,是鸡白痢（Pullorum disease）的病原,具有高度适应专一宿主的特点,能垂直传播,可引起雏鸡的急性败血症,多侵害3周龄以内幼雏,发病率和死亡率极高;对日龄较大的青年鸡也可致病和致死；成年鸡亦可被感染,常导致母鸡产蛋减少,生殖道畸形,体重下降,也导致孵化率和出雏率明显下降,还可感染火鸡,偶能感染其它禽和鸟类,给许多国家的养禽业带来了巨大的危害,并引起严重的经济损失。目前,免疫接种可作为防控沙门菌病的一种重要手段,相对于传统的灭活疫苗,减毒活疫苗能提供更加高效的保护,且能诱导较高的细胞免疫反应。沙门菌致病岛（Samonella pathogenicity island, SPI）2是位于沙门菌基因组上的一个约40 kb的主要毒力基因簇,其编码的Ⅲ型分泌系统2（type Ⅲ secretion system 2, T3SS2）可以分泌多种功能不同的效应蛋白,这些效应蛋白对沙门菌在宿主细胞内的存活和增殖起着重要作用,为进一步引起全身性的感染提供必要条件。目前,已有30多个沙门菌T3SS2效应蛋白被鉴定,其中很多效应蛋白的功能并不单一,大部分与沙门菌的毒力密切相关,cigR是唯一一个缺失后可引起鼠伤寒沙门菌毒力上升的效应蛋白基因。另外,并非这些效应蛋白均存在于所有血清型的沙门菌中,这意味着有些效应蛋白基因在部分沙门菌中是缺失的,或者有些基因在一些沙门菌中是以假基因的形式存在。目前,关于沙门菌毒力基因的研究已越来越深入,但主要模型还是集中在鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌。鸡白痢沙门菌具有其独特的特征,但对于鸡白痢沙门菌相关的研究还很少,尤其是在T3SS2及其效应蛋白方面。本研究主要基于T3SS2及其效应蛋白CigR探讨了其与鸡白痢沙门菌致病性之间的关系,并初步评估了鸡白痢沙门菌减毒株作为疫苗株防控该病的可行性,为从分子水平上探明鸡白痢沙门菌与鸡体的相互作用关系打下基础,也为进一步研究鸡白痢沙门菌感染与致病机理及找到更好防控该病的方法提供理论依据和实验数据。1.鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株的构建及其生物学特性以鸡白痢沙门菌菌株S06004为研究对象,采用λ-red同源重组系统成功构建了鸡白痢沙门菌S06004株的致病岛2（SPI2,约40 kb）缺失株S06004△SPI2。然后测定了该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和致病性等基本生物学特性,并与野生株进行比较。结果显示,SPI2的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性；与野生株一样,该缺失株均能发酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶,而不能发酵蔗糖、麦芽糖、山梨醇、卫矛醇、侧金花醇、乳糖、丙二酸盐、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氢等；且该缺失株具有良好的遗传稳定性；其对2日龄雏鸡的LD50是野生株的252倍。表明SPI2在鸡白痢沙门菌的致病过程中起着重要作用,SPI2的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的显着下降,这为进一步研究鸡白痢沙门菌SPI2的功能及研发减毒疫苗奠定了基础。2.鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株对雏鸡的免疫保护效力评估分别通过口服和肌肉注射两种免疫途径评价鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株S06004ASPI2对2日龄雏鸡的免疫保护效力,其中,口服免疫剂量为2×108CFU/只,肌注免疫剂量为2×107CFU/只。体重变化及临床表现结果显示,两种免疫途径均不影响雏鸡的生长性能,与对照组一样,免疫后雏鸡并未表现出任何临床症状,且该缺失株在雏鸡体内具有一定的定植能力；血清抗体水平测定及外周血淋巴细胞增殖实验结果显示,两种免疫途径均能诱导雏鸡产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答反应；在免疫后第10天,分别用鸡白痢沙门菌菌株S06004和鸡伤寒沙门菌菌株SG9对雏鸡进行攻毒,并观察其临床症状,统计其死亡情况,结果显示,在攻毒早期免疫组鸡出现了暂时的和轻微的厌食、腹泻及精神萎顿等症状,5天左右即可恢复,死亡率和发病率极低,而未免疫攻毒对照组的鸡却呈现高发病率和死亡率,临床症状明显。上述结果表明鸡白痢沙门菌减毒株S06004ASPI2对雏鸡具有良好的保护效力,可以作为理想的疫苗候选株,同时为鸡白痢沙门菌减毒疫苗的进一步研究提供了数据。3.鸡白痢沙门菌致病岛2对T3SS2效应蛋白基因表达的影响经序列分析,在鸡白痢沙门菌菌株S06004染色体上共有20个T3SS2效应蛋白基因,其中sifB、sspH2和steC是以假基因的形式存在。采用实时荧光定量PCR方法,通过相对定量分析（2-△△CT）来比较鸡白痢沙门菌菌株S06004与其SPI2缺失株S06004ASPI2在感染禽巨噬细胞HD11 2.5 h、7.5 h和15h时,这20个T3SS2效应蛋白基因mRNA表达水平与S06004感染该细胞1.5 h时这些基因mRNA表达水平的差异。结果显示,这20个效应蛋白基因包括假基因sifB、sspH2和steC在鸡白痢沙门菌感染过程中均有不同程度的表达；SPI2的缺失对基因cigR、gtgA、slrP、sopD、sseK1、steB和steC的表达并没有显着的影响,对基因pipB2、sifB、sopD2、sseJ、sseL、sspH2和steD的表达在三个时间点均有显着影响,而对基因pipB、steA和sifA的表达只在一个或两个时间点有显着影响；缺失株感染时未检测到基因sseF、sseG和spiC的表达。表明鸡白痢沙门SPI2显着影响一些T3SS2效应蛋白基因的表达,而另一些效应蛋白基因的表达并不受SPI2影响；假基因sifB、sspH2和steC在鸡白痢沙门菌的感染过程中也可进行转录；缺失株感染时基因sseF、sseG和spiC未表达与其位于SPI2上有关。这有助于进一步揭示T3SS2及其效应蛋白在鸡白痢沙门菌感染过程中的致病机制,也为深入研究其功能提供了重要线索。4.鸡白痢沙门菌中T3SS2效应蛋白基因分布研究沙门菌T3SS2效应蛋白基因在不同的沙门菌菌株中存在一定的差异性。本研究采用PCR方法检测了在1962年至2013年间从我国分离的237株鸡白痢沙门菌中25个T3SS2效应蛋白基因的分布特征；同时,通过序列比对分析了这25个基因在18株不同血清型沙门菌中的流行特征,它们的全基因组序列来自GenBank。PCR结果显示,在这237株菌株中,基因cigR、pipB、pipB2、slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseJ、sseL、 steA、steB、steC和steD均存在,gogB和sspHl均缺失,基因gtgA、gtgE、sifA、sifB、sseI、 sseK2和sspH2在这237株菌株中的检出率分别为99.6%、45.2%、98.7%、99.2%、5.9%、15.2%和97.5%；与1962年至1979年间相比,2000年至2013年间gtgE、sseI和sseK2的分布水平显着降低。序列比对分析结果显示,有15个基因（cigR、pipB、pipB2、sifA、sifB、 slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseL、steA、steC和steD）在这18株不同血清型沙门菌菌株中均存在,sifB、sseK1、sspH2和steC在一些菌株中是以假基因的形式存在。结果表明,gtgE、ssel和sseK2在这237株菌株中分布具有一定的年代规律性；大部分被检测基因在鸡白痢沙门菌中具有广泛分布；一些基因在微进化过程中形成了假基因。这为进一步分析相关基因的流行特征提供了重要线索,也为更加深入地研究这些效应蛋白基因的功能及了解相关基因的进化提供了数据。5.鸡白痢沙门菌T3SS2效应蛋白CigR功能的初步解析CigR既是一个由沙门菌致病岛3编码的T3SS2效应蛋白,也是一个膜蛋白。本研究采用λ-red同源重组系统成功构建了鸡白痢沙门菌株S06004的cigR基因缺失株S06004△cigR,初步解析了CigR的基本功能。结果显示,cigR的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但能够增强鸡白痢沙门菌在禽巨噬细胞HD11和鸡体内的增殖和/或存活能力,显着降低鸡白痢沙门菌生物膜形成的能力；该缺失株对2日龄雏鸡的LDso仅是野生株的五分之一；另外,在鸡白痢沙门菌感染HD11过程中,利用实时荧光定量PCR方法检测结果显示,cigR的缺失显着影响CXCLI1、 CXCLI2、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和iNOS的产生,而对IL-4、IL-18、NF-kB1、TGF-β4和]TNF-α的产生并没有显着影响。表明cigR的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的显着升高,显着降低其生物膜形成的能力,并且CigR能够显着影响一些细胞因子、趋化因子及其它免疫相关因子产生。这为更加深入地研究该蛋白的功能奠定了基础。
邹雅洁[9]（2016）在《表达大肠杆菌外膜蛋白抗原的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究》文中认为鸡大肠杆菌病（Chicken Colibacillosis）是由禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli, APEC）引起的传染病,感染该病会造成鸡体局部或全身性感染并引起一系列疾病最终导致死亡,该病已成为危害养禽业的重要疫病之一。鸡大肠杆菌病的防控和治疗以药物和疫苗为主,抗菌药物仍是主要防治措施。但随着人们对抗菌药物越来越广泛的使用,大肠杆菌的耐药性、药物残留等问题日趋突出,近些年来,由于这些问题抗生素的使用遭到了广泛的置疑和反对。预防该病最有效的方法是接种疫苗,采取疫苗预防与合理用药相结合的措施是最为有效的方法。因此开发具有交叉保护的广谱疫苗是防控本病的重中之重。本研究选择减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R株为宿主菌,以asd基因作为营养缺陷标志,以编码大肠杆菌外膜蛋白的S632基因为外源基因,构建减毒鸡伤寒沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统表达大肠杆菌外膜蛋白抗原,以探讨该重组口服疫苗对预防禽致病性大肠杆菌的保护效果。1.大肠杆菌外膜蛋白基因S632的克隆与原核表达本研究根据GenBank发表的大肠杆菌外膜蛋白的主要编码基因S632序列,采用DNAStar序列分析软件对比分析,针对S632设计一对引物。以江苏省42株疑似大肠杆菌的临床分离株为模板,PCR扩增目的片段S632,将目的片段克隆至pMD 19-T simple vector,而后转化大肠杆菌DH5a,经筛选鉴定后对其进行测序并对结果进行分析。发现其中有28株菌为大肠杆菌,测序结果表明,S632在大肠杆菌中普遍存在且高度保守。将已构建的重组质粒pET-42a-S632转化BL21（DE3）进行诱导培养,当以终浓度为1.0mM IPTG诱导4h时表达量最高,检测到分子量大约为63 KDa的目的蛋白。通过SDS-PAGE分析,该融合蛋白为包涵体,通过尿素变性、复性及镍柱亲和层析纯化的方法,最终获得浓度为0.964mg/ml的纯化融合蛋白,命名为pS632。该蛋白可作为包被抗原,为后续ELISA实验检测特异性抗体提供了材料。2.表达大肠杆菌共同外膜蛋白抗原的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌构建及免疫效果研究利用PCR技术扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白的基因S632,将其插入含有asd基因的表达载体pYA3342中,构建重组表达载体pYA3342-S632,再将重组质粒电转化至已缺失编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R△asd突变株中,构建重组减毒鸡伤寒沙门氏菌活疫苗SG9R （pYA3342-S632）。并对重组菌的生长特性、口服安全性等生物学特性进行评定。将重组菌SG9R (pYA3342-S632、SG9R （pYA3342）接种20日龄非免疫SPF鸡,分别作为免疫组及载体对照组,同时以PBS组为空白对照组。分别采集各组免疫鸡免疫后不同时间段血清,利用间接ELISA法测定其体内特异性IgG抗体动态水平,首次免疫14d后,重组疫苗菌免疫组血清IgG抗体水平明显高于空载体对照组和PBS空白对照组（P<0.05）,差异显着；而空载体对照组与PBS空白对照组之间无显着性差异（P>0.05）。在二免两周后收集并制备气管粘膜液样品和肠粘膜液样品,利用间接ELISA法测定其体内特异性sIgA抗体水平,SG9R （pYA3342-S632）免疫组可在鸡的十二指肠粘膜中检测到特异性s1gA抗体。免疫后,每组每周随机抽取3只试验鸡,分离外周血淋巴细胞,利用流式细胞术（FCM）监测每组鸡外周血中CD3+和CD8+T淋巴细胞动态变化。结果显示,免疫后外周血中CD3+T细胞及CD8+T细胞含量均呈逐渐增加的趋势,各时期含量均高于PBS对照组,在二次免疫一周后达到较高水平随后保持平稳。用禽致病性大肠杆菌强毒株QD2（O78:H54）分别对各实验组进行后胸气囊攻毒,观察10 d内,重组疫苗菌免疫组、空载体对照组及空白对照组的死亡率分别为20.0%、70.0%和80.0%。用肠炎沙门氏菌50336菌株进行攻毒,PBS空白对照组的死亡率高达90%,重组疫苗菌免疫组和空载体对照组死亡率分别为60%和70%。上述结果显示,重组疫苗对禽致病性大肠杆菌具有较好的免疫保护效果。
黄小雨[10]（2015）在《不同饲养模式对黄山黑鸡J亚群禽白血病、鸡白痢感染情况的影响》文中研究指明在黄山大部分地区都有饲养黄山黑鸡,且多分布在山区,目前主要位于黟县和祁门县边界处,是该地山区农民放养的多种地方鸡之一。该品种经过长期人工选育和自然驯化,具有性情活泼,耐粗饲,觅食性、就巢性、适应性强等特点,是安徽黄山特有的珍贵品种,其味道鲜美,滋补性强。论文通过对笼养和放养模式下黄山黑鸡J亚群禽白血病和鸡白痢感染情况的跟踪检测,同时对其繁殖性能进行评价。选择同一批黄山黑鸡种鸡600只,在母鸡见蛋后随机分为两组,每组各300只,分别进行笼养（♂:♀=1:15）和山地放养（♂:♀=1:10）。采用ELISA法、血清平板凝集法试验和种蛋孵化试验等对两种饲养模式黄山黑鸡白血病、鸡白痢、种蛋的蛋品质和繁殖性能进行了对比分析。结果显示:1、笼养组种鸡200日龄肛拭子阳性率为19.6%,其中公鸡为21.9%,母鸡为18.3%;放养组种鸡肛拭子阳性率为7.8%,其中公鸡为14.7%,母鸡为3.6%;笼养组300日龄蛋清P27抗原阳性率为7.8%,放养组为3.3%;笼养组子代1日龄雏鸡胎粪阳性率为3.4%,放养组为2.9%。结果表明,笼养组种鸡白血病阳性率高于放养组,且公鸡阳性率普遍高于母鸡,其子代笼养组的阳性率同样高于放养组;2、比较两种饲养模式黄山黑鸡鸡白痢感染情况,对黄山黑鸡231日龄、251日龄、274日龄、301日龄和327日龄的血清进行了检测,笼养组各日龄鸡白痢阳性率分别为0%、1.01%、2.38%、1%和0%,放养组为7%、7.44%、3.13%、2%和1%。放养组鸡白痢阳性率高于笼养组;3、比较两种饲养模式黄山黑鸡的蛋品质差异,对种蛋的蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳颜色进行了测定。结果表明,不同饲养方式黄山黑鸡种蛋的蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳颜色之间存在显着差异（P<0.05）。笼养组蛋重为48.1 g,显着高于放养组（P<0.05）,蛋壳厚度为0.423 mm,显着高于放养组（P<0.05）,蛋壳颜色为41.3,蛋壳颜色深度明显高于放养组（P<0.05）;而放养组种蛋的蛋形指数为1.31,明显高于笼养组的1.29（P<0.05）。对两种饲养模式下的黄山黑鸡种蛋孵化出的雏鸡体重进行测定,结果表明笼养组和放养组种蛋孵化出的雏鸡体重呈显着差异（P<0.05）,笼养组雏鸡平均体重以及公、母平均体重分别比放养组高1.91 g、1.78 g、1.97 g,达差异显着水平（P<0.05）。在做孵化时,统计每组种蛋的孵化指标。结果表明,放养组笼养组种蛋受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率分别为93.98%、96.94%、91.10%,放养组的分别为93.46%、95.52%、89.26%,笼养组黄山黑鸡种蛋的死胚率为3.06%,放养组的为4.48%,笼养组的各项指标均优于放养组。本试验初步掌握了两种饲养模式黄山黑鸡J亚群禽白血病和鸡白痢感染情况及繁殖性能,为黄山黑鸡种源性疾病净化与防控提供基础。
二、用鸡伤寒沙门氏菌的膜蛋白和9R活菌苗预防鸡伤寒的可行性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用鸡伤寒沙门氏菌的膜蛋白和9R活菌苗预防鸡伤寒的可行性（论文提纲范文）
（1）鸡白痢沙门菌诱导Th2应答相关抗原的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 沙门菌持续感染宿主的研究进展 |
| 1 沙门菌的宿主嗜性 |
| 2 沙门菌的持续感染 |
| 3 沙门菌持续感染存在的部位 |
| 4 影响沙门菌持续感染的宿主和病原体因素 |
| 5 沙门菌持续感染机制的研究 |
| 6 针对沙门菌持续感染的T细胞应答 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 巨噬细胞M1/M2分型的研究进展 |
| 1 M1/M2巨噬细胞的定义和特征 |
| 2 M1/M2巨噬细胞参与Th1/Th2应答 |
| 3 M1/M2巨噬细胞在炎症中的作用 |
| 4 M1/M2巨噬细胞的转换 |
| 5 M1/M2巨噬细胞中Akt信号通路的作用 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡白痢沙门菌中调控巨噬细胞产生NO的基因筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌中NO相关基因对巨噬细胞M1/M2极化分型的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡白痢沙门菌449/87ΔhilA和449/87ΔcyaA诱导鸡体免疫应答的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡白痢沙门菌449/87ΔcyaA作为疫苗候选株的免疫保护效力评估 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）表达APECⅠ型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌αroA基因缺失株的构建及安全效力评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1、鸡大肠杆菌病和沙门氏菌病的防治进展 |
| 1.1 鸡大肠杆菌病的防治进展 |
| 1.2 鸡沙门氏菌病的防治进展 |
| 2、沙门氏菌重组疫苗 |
| 3、沙门氏菌减毒活疫苗相关基因 |
| 3.1 aro基因 |
| 3.2 asd基因 |
| 4、鸡伤寒沙门氏菌SG9R的研究进展 |
| 4.1 SG9R的减毒机制 |
| 4.2 SG9R的应用 |
| 5、研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 试验研究 |
| 研究一 表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R(pYA3342-fim) αroA基因缺失株的构建及其生物学特性研究 |
| 1、材料 |
| 1.1 菌株、质粒 |
| 1.2 培养基及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2、方法 |
| 2.1 一次同源重组菌的构建 |
| 2.1.1 αroA基因缺失引物设计 |
| 2.1.2 携带氯霉素抗性的PCR产物的制备和纯化 |
| 2.1.3 SG9R(pYA3342-fim)感受态细胞的制备 |
| 2.1.4 质粒pKD46的转化 |
| 2.1.5 Red同源重组酶的诱导以及感受态细胞的制备 |
| 2.1.6 氯霉素抗性基因的PCR产物电转化 |
| 2.1.7 一次同源重组菌SG9R(pYA3342-fim)△αroA::cat的PCR鉴定 |
| 2.1.8 温度敏感型质粒pKD46的消除 |
| 2.2 二次重组菌的构建 |
| 2.2.1 FLP位点专一性重组 |
| 2.2.2 二次重组菌SG9R(pYA3342-fim)△αroA的鉴定 |
| 2.3 回补株的构建 |
| 2.4 SG9R(pYA3342-fim)△αroA的生物学特性研究 |
| 2.4.1 生化反应比较 |
| 2.4.2 生长特性比较 |
| 2.4.3 甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验 |
| 2.4.4 缺失株SG9R(pYA3342-fim)△αroA遗传稳定性检测 |
| 2.4.5 微量稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) |
| 3、结果 |
| 3.1 融合PCR产物的制备 |
| 3.2 一次同源重组菌SG9R(pYA3342-fim)△αroA::cat的PCR鉴定 |
| 3.3 二次重组菌SG9R(pYA3342-fim)△αroA的鉴定 |
| 3.4 回补株的鉴定 |
| 3.5 SG9R(pYA3342-fim)△αroA的生物学特性研究 |
| 3.5.1 生化反应比较 |
| 3.5.2 生长特性比较 |
| 3.5.3 甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验 |
| 3.5.4 缺失株SG9R(pYA3342-fim)△αroA遗传稳定性测试 |
| 3.4.5 微量稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) |
| 4、讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R(pYA3342-fim)αroA基因缺失株的安全效力评估 |
| 1、材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 培养基及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验动物 |
| 2、方法 |
| 2.1 活菌数测定 |
| 2.2 口服疫苗候选株对1日龄雏鸡的安全性试验 |
| 2.3 口服疫苗候选株对预防禽致病性大肠杆菌感染的研究 |
| 2.3.1 试验分组与免疫方法 |
| 2.3.2 口服疫苗候选株对鸡体重增重的影响 |
| 2.3.3 攻毒试验 |
| 2.3.4 组织切片制备与观察 |
| 2.4 口服疫苗候选株对预防鸡白痢沙门氏菌感染的研究 |
| 2.4.1 试验分组与免疫方法 |
| 2.4.2 口服疫苗候选株对鸡体重增重的影响 |
| 2.4.3 攻毒试验 |
| 2.4.4 组织切片制备与观察 |
| 3、结果 |
| 3.1 口服疫苗候选株对1日龄雏鸡的安全性试验 |
| 3.2 口服疫苗候选株对预防禽致病性大肠杆菌感染的研究 |
| 3.2.1 口服疫苗候选株对鸡体重增重的影响 |
| 3.2.2 攻毒保护结果 |
| 3.2.3 各组鸡免疫攻毒后临床剖检结果 |
| 3.2.4 攻毒保护各组病理变化 |
| 3.3 口服疫苗候选株对预防鸡白痢沙门氏菌感染的研究 |
| 3.3.1 口服疫苗候选株对鸡体重增重的影响 |
| 3.3.2 攻毒保护结果 |
| 3.3.3 各组鸡免疫攻毒后临床剖检结果 |
| 3.3.4 攻毒保护各组病理变化 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（3）鸡白痢沙门菌LPS合成和生物被膜形成相关基因缺失株的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1 沙门菌的致病机理 |
| 2 生物被膜研究进展 |
| 3 沙门菌疫苗的研究进展 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因缺失株的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌多基因缺失株的致病性和免疫保护性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
（4）我国祖代种鸡场禽白血病、禽网状内皮组织增殖症和鸡白痢的监测与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.2 禽网状内皮组织增殖症 |
| 1.3 鸡白痢 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 2011-2016年我国祖代种鸡场ALV-p27抗原的监测分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 样品 |
| 2.2.2 主要试剂盒 |
| 2.2.3 主要溶液配制 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 2.3.2 ALV-p27抗原检测 |
| 2.3.3 数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 祖代种鸡场ALV p27抗原监测结果 |
| 2.4.2 ALV-p27抗原在祖代鸡群中的分布 |
| 2.4.3 ALV-p27抗原在祖代种鸡群中的空间分布 |
| 2.4.4 ALV-p27抗原在祖代种鸡群中的时间分布 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 ALV-p27抗原检测样本的选择 |
| 2.5.2 疫苗中ALV污染对种鸡群的影响 |
| 2.5.3 ALV的种群净化 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 2011-2016年我国祖代种鸡场ALV-J亚群抗体的监侧与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 样品 |
| 3.2.2 主要试剂盒 |
| 3.2.3 主要溶液配制 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 3.3.2 ALV-J亚群抗体检测 |
| 3.3.3 数据分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 祖代种鸡场ALV-J抗体监测结果 |
| 3.4.2 ALV-J抗体在祖代鸡群中的分布 |
| 3.4.3 ALV-J亚群抗体在祖代种鸡群中的空间分布 |
| 3.4.4 ALV-J亚群抗体在祖代种鸡群中的时间分布 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 祖代种鸡群和商品鸡群中ALV-J感染情况的比较 |
| 3.5.2 地方品种中ALV-J感染情况分析 |
| 3.5.3 ALV-J感染的防控策略分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 2011-2016年我国祖代种鸡场ALV-A/B亚群抗体的监测与分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 样品 |
| 4.2.2 主要试剂盒 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 4.3.2 ALV-A/B亚群抗体检测 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 祖代种鸡场ALV-A/B抗体监测结果 |
| 4.4.2 ALV-A/B抗体在祖代鸡群中的分布 |
| 4.4.3 ALV-A/B亚群抗体在祖代种鸡群中的空间分布 |
| 4.4.4 ALV-A/B亚群抗体在祖代种鸡群中的时间分布 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 祖代种鸡场ALV-J亚群、ALV-A/B亚群混合感染分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 5.3.2 检测方法 |
| 5.3.3 数据分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 ALV-J和ALV-A/B混合感染情况 |
| 5.4.2 单一亚群感染情况 |
| 5.4.3 两种亚群混合感染情况 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 2011-2016年我国祖代种鸡场REV抗体的监测与分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 样品 |
| 6.2.2 主要试剂盒 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 6.3.2 REV抗体检测 |
| 6.3.3 数据分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 祖代种鸡场REV抗体监测结果 |
| 6.4.2 REV抗体在祖代鸡群中的分布 |
| 6.4.3 REV抗体在祖代种鸡群中的空间分布 |
| 6.4.4 REV抗体在祖代种鸡群中的时间分布 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 2011-2016年我国祖代种鸡场鸡白痢抗体的监测与分析 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料 |
| 7.2.1 样品 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 主要仪器 |
| 7.3 方法 |
| 7.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 7.3.2 鸡白痢抗体检测 |
| 7.3.3 数据分析 |
| 7.4 结果 |
| 7.4.1 祖代种鸡场鸡白痢抗体监测结果 |
| 7.4.2 鸡白痢抗体在祖代鸡群中的分布 |
| 7.4.3 鸡白痢抗体在祖代种鸡群中的空间分布 |
| 7.4.4 鸡白痢抗体在祖代种鸡群中的时间分布 |
| 7.4.5 ALV-p27抗原、REV抗体和鸡白痢抗体检出情况比较 |
| 7.5 讨论 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 祖代种鸡场ALV、REV、鸡白痢混合感染分析 |
| 8.1 前言 |
| 8.2 材料 |
| 8.3 方法 |
| 8.3.1 禽场调查和样品选择 |
| 8.3.2 检测方法 |
| 8.3.3 数据分析 |
| 8.4 结果 |
| 8.4.1 ALV、REV、鸡白痢混合感染情况 |
| 8.4.2 单一病种感染情况 |
| 8.4.3 两种疫病混合感染情况 |
| 8.4.4 三种疫病混合感染情况 |
| 8.5 讨论 |
| 8.5.1 鸡群存在三种疫病混合感染对生产造成严重危害 |
| 8.5.2 祖代种鸡群ALV和REV混合感染较为严重 |
| 8.6 小结 |
| 第九章 结论 |
| 第十章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）种鸡场沙门氏菌感染状况的调查与防控（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 沙门氏菌的病原学 |
| 1.1.1 形态、染色 |
| 1.1.2 培养特性、生化特性 |
| 1.1.3 对理化因素的抵抗力 |
| 1.1.4 毒力因子 |
| 1.2 沙门氏菌流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.3.1 鸡白痢 |
| 1.3.2 禽伤寒 |
| 1.3.3 禽副伤寒 |
| 1.4 病理变化 |
| 1.5 沙门氏菌检测方法 |
| 1.5.1 传统检测方法 |
| 1.5.2 免疫分析技术 |
| 1.5.3 分子生物学技术 |
| 1.6 沙门氏菌的净化及防控 |
| 1.6.1 综合防制 |
| 1.6.2 种鸡群沙门氏菌的净化 |
| 1.6.3 药物控制和治疗 |
| 1.6.4 疫苗的应用 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.2 主要使用的培养基 |
| 2.1.3 实验主要使用的单因子血清和抗原 |
| 2.1.4 实验中的样品来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 琼脂平板及肉汤培养基的配制 |
| 2.2.2 沙门氏菌平板凝集实验方法 |
| 2.2.3 雏鸡、毛蛋微生物检测接种实验方法 |
| 2.2.4 环境性样本的沙门氏菌扩增方法 |
| 2.2.5 沙门氏菌的分离纯化增菌及生化鉴定 |
| 2.2.6 单因子血清凝集法鉴定沙门氏菌 |
| 2.2.7 样品DNA的提取 |
| 2.2.8 引物及PCR反应体系 |
| 2.2.9 用ELLISA方法测定血清中沙门氏菌B+D群菌属抗体的实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流行病学调查结果 |
| 3.1.1 沙门氏菌分离情况流行病学调查结果 |
| 3.1.2 平板凝集实验流行病学统计结果 |
| 3.1.3 8倍稀释平板凝集阳性血清与ELISA检测、临床相关性 |
| 3.2 沙门氏菌分离鉴定及分型实验结果 |
| 3.2.1 沙门氏菌分离纯化实验结果 |
| 3.2.2 不同扩增与鉴别培养基的筛选 |
| 3.2.3 PCR鉴定实验结果 |
| 3.2.4 生化反应实验结果 |
| 3.2.5 单因子血清凝集实验结果 |
| 3.3 2012-2015年分离及鉴定沙门氏菌情况 |
| 3.4 沙门氏菌阳性群对种鸡死淘的影响 |
| 3.5 沙门氏菌感染对雏鸡质量的影响 |
| 3.5.1 不同饲养模式下雏鸡中沙门氏菌的分离率 |
| 3.5.2 沙门氏菌感染对后代雏鸡造成的影响跟踪 |
| 3.6 沙门菌的控制措施 |
| 4 讨论 |
| 4.1 沙门氏菌的分离 |
| 4.2 与种鸡群平板凝集阳性率对鸡群净化的评估 |
| 4.3 血清8倍稀释方法对鸡群感染状况的评估可行性 |
| 4.4 沙门氏菌净化措施及净化控制效果 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的减毒鸡伤寒沙门氏菌重组疫苗的构建及免疫保护研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、沙门氏菌疫苗研究进展 |
| 1.1 沙门氏菌病的危害 |
| 1.2 沙门氏菌病的防治策略 |
| 1.3 常规禽用沙门氏菌疫苗 |
| 1.3.1 减毒活疫苗 |
| 1.3.2 灭活疫苗 |
| 1.3.3 亚单位疫苗 |
| 1.3.4 核酸疫苗 |
| 1.4 展望 |
| 二. SG9R研究进展 |
| 2.1 SG9R的来源 |
| 2.2 SG9R的减毒机制 |
| 2.3 SG9R作为减毒活疫苗的应用 |
| 2.4 SG9R作为减毒活疫苗载体的应用 |
| 2.5 SG9R作为减毒活疫苗载体的研究意义 |
| 三、SEF14菌毛研究进展 |
| 3.1 SEF14菌毛的发现 |
| 3.2 SEF14菌毛的形态结构 |
| 3.3 SEF14菌毛的表达 |
| 3.4 SEF14菌毛的免疫保护作用 |
| 四、研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 研究一 肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的克隆与表达 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 sef基因的扩增和克隆 |
| 2.2 sef基因的表达鉴定 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要亚单位sefA的克隆、原核表达与多克隆抗体的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 培养基和主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验动物 |
| 2. 方法 |
| 2.1 sefA基因目的片段的扩增 |
| 2.2 pMD-19-T-sefA重组质粒的构建 |
| 2.3 pET-28a (+)-sefA-BL21重组质粒的构建 |
| 2.4 重组蛋白的表达和可溶性分析 |
| 2.5 重组蛋白的大量诱导表达和纯化 |
| 2.6 多抗血清的制备 |
| 2.7 ELISA测定血清效价 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PCR扩增sefA基因 |
| 3.2 重组质粒pMD-19-T-sefA的酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒pET-28a(+)-sefA的酶切鉴定 |
| 3.4 重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 3.5 BCA法测定rSEFA蛋白含量 |
| 3.6 重组纯化蛋白的鉴定 |
| 3.7 ELISA测定血清效价 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 培养基和主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试验动物 |
| 2. 方法 |
| 2.1 重组菌SG9R (pYA3342-sef)与SG9R (pYA3342-sefA)的构建 |
| 2.2 重组菌的表达鉴定 |
| 2.3 重组菌生长曲线测定 |
| 2.4 鸡巨噬细胞HD11吞噬试验和存活试验 |
| 2.5 重组菌SG9R(pYA3342-sef)、SG9R(pYA3342-sefA)体外稳定性试验 |
| 2.6 菌液制备及活菌数测定 |
| 2.7 重组菌对仔鸡的安全性试验 |
| 2.8 重组口服疫苗对鸡的免疫保护试验 |
| 2.9 重组口服疫苗对鸡的细胞免疫的影响 |
| 2.10 血清中特异性抗体IgG检测 |
| 2.11 黏膜特异性抗体sIgA检测 |
| 2.12 攻毒试验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 SG9R (pYA3342-sef)的构建与鉴定 |
| 3.2 SG9R (pYA3342-sefA)的构建与鉴定 |
| 3.3 重组菌的表达鉴定 |
| 3.4 生长曲线 |
| 3.5 鸡巨噬细胞HD11吞噬试验和存活试验 |
| 3.6 重组菌体外稳定性试验 |
| 3.7 重组口服疫苗的安全性试验 |
| 3.8 外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞动态变化检测 |
| 3.9 免疫鸡血清IgG抗体检测结果 |
| 3.10 抗SEFA特异性sIgA抗体检测结果 |
| 3.11 免疫鸡体增重结果 |
| 3.12 仔鸡免疫重组口服活疫苗攻毒保护结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
（7）鸡白痢沙门菌△fur△speDE的构建及其免疫生物学特性初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 禽源沙门菌的危害与防治 |
| 1 禽源沙门菌的感染 |
| 2 沙门菌的防治 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡白痢沙门菌△fur△speDE的构建及其LD_(50)测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 减毒鸡白痢沙门菌△fur△speDE免疫生物学特性初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文 |
（8）鸡白痢沙门菌T3SS2及其效应蛋白CigR的致病与免疫作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 鸡白痢沙门菌研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 沙门菌致病岛2 Ⅲ型分泌系统研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株的构建及其生物学特性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株对雏鸡的免疫保护效力评估 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡白痢沙门菌致病岛2对T3SS2效应蛋白基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡白痢沙门菌中T3SS2效应蛋白基因分布研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 鸡白痢沙门菌T3SS2效应蛋白CigR功能的初步解析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（9）表达大肠杆菌外膜蛋白抗原的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、染色体-质粒平衡致死系统研究进展 |
| 1.1 营养缺陷标志基因的选择 |
| 1.2 染色体-质粒平衡致死系统的构建 |
| 1.3 染色体-质粒平衡致死系统在疫苗中的应用 |
| 二、鸡大肠杆菌外膜蛋白研究进展 |
| 2.1 外膜蛋白的组成、结构及其功能 |
| 2.2 外膜蛋白的致病作用 |
| 2.3 外膜蛋白的免疫原性 |
| 三、研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 研究一 大肠杆菌外膜蛋白基因S632的克隆与原核表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 菌株、载体 |
| 1.3 培养基和主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床分离鉴定大肠杆菌及S632基因目的片段的扩增 |
| 2.2 pMD19-T-S632重组质粒的构建 |
| 2.3 S632基因的表达及SDS-PAGE分析 |
| 2.4 重组蛋白的大量诱导表达及表达后的处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 病原菌的分离培养 |
| 3.2 PCR扩增分离株大肠杆菌的S632基因 |
| 3.3 重组质粒pMD18-T-S632的测序鉴定 |
| 3.4 重组质粒pET-42a-S632转化BL21的PCR鉴定 |
| 3.5 融合蛋白诱导表达及纯化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 表达大肠杆菌共同外膜蛋白抗原的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌构建及免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组菌SG9R(pYA3342-S632)的构建 |
| 2.2 口服疫苗的生长曲线测定 |
| 2.3 接种菌液的制备及活菌数的测定 |
| 2.4 重组菌对仔鸡的安全性试验 |
| 2.5 重组口服疫苗对鸡的免疫保护试验 |
| 2.6 重组口服疫苗对鸡的细胞免疫的影响 |
| 2.7 血清中特异性抗体IgG检测 |
| 2.8 粘膜特异性抗体sIgA检测 |
| 2.9 攻毒试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.2 重组表达质粒pYA3342-S632的构建与鉴定 |
| 3.3 生长试验 |
| 3.4 口服重组疫苗的安全性 |
| 3.5 外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞动态变化检测 |
| 3.6 免疫鸡血清中IgG抗体检测结果 |
| 3.7 特异性sIgA抗体检测结果 |
| 3.8 免疫鸡体增重结果 |
| 3.9 仔鸡免疫重组口服活疫苗攻毒保护结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）不同饲养模式对黄山黑鸡J亚群禽白血病、鸡白痢感染情况的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文符号及缩略词 |
| 文献综述 |
| 1 黄山黑鸡 |
| 2 饲养模式 |
| 2.1 鸡的不同饲养方式 |
| 2.1.1 笼养 |
| 2.1.2 平养 |
| 2.1.3 放养 |
| 3 J亚群禽白血病 |
| 3.1 病原学 |
| 3.1.1 分类 |
| 3.1.2 形态及理化特性 |
| 3.1.3 基因组结构 |
| 3.2 流行病学 |
| 3.3 临诊症状及病理变化 |
| 3.4 危害 |
| 3.5 诊断和检测 |
| 3.5.1 病毒的分离和鉴定 |
| 3.5.2 血清学检测方法 |
| 3.5.3 分子生物学检测方法 |
| 3.6 防治 |
| 4 鸡白痢 |
| 4.1 病原学 |
| 4.2 流行病学 |
| 4.3 临诊症状及病理变化 |
| 4.4 危害 |
| 4.5 诊断和检测 |
| 4.5.1 细菌的分离和鉴定 |
| 4.5.2 凝集试验法 |
| 4.5.3 ELISA方法 |
| 4.5.4 PCR方法 |
| 4.6 防治 |
| 4.6.1 预防措施 |
| 4.6.2 治疗 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 主要溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.0 试验动物分组 |
| 1.2.1 样品的采集与处理 |
| 1.2.2 泄殖腔棉拭子、蛋清和胎粪样品中ALV P27抗原ELISA的检测 |
| 1.2.3 鸡白痢的检测 |
| 1.2.4 种蛋的孵化 |
| 1.2.5 数据处理与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品的采集结果 |
| 2.1.1 泄殖腔棉拭子、蛋清及胎粪样品 |
| 2.1.2 血清样品 |
| 2.2 在不同饲养模式下的黄山黑鸡禽白血病检测结果 |
| 2.3 在不同饲养模式下的黄山黑鸡鸡白痢检测结果 |
| 2.4 不同饲养模式对黄山黑鸡种蛋蛋品质的影响 |
| 2.5 不同饲养模式对黄山黑鸡雏鸡体重的影响 |
| 2.6 不同饲养模式对黄山黑鸡孵化性能的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、用鸡伤寒沙门氏菌的膜蛋白和9R活菌苗预防鸡伤寒的可行性（论文参考文献）
- [1]鸡白痢沙门菌诱导Th2应答相关抗原的鉴定及功能研究[D]. 周莹莹. 扬州大学, 2021
- [2]表达APECⅠ型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌αroA基因缺失株的构建及安全效力评估[D]. 魏星. 扬州大学, 2019(01)
- [3]鸡白痢沙门菌LPS合成和生物被膜形成相关基因缺失株的构建及免疫效力评价[D]. 满成连. 扬州大学, 2018(01)
- [4]我国祖代种鸡场禽白血病、禽网状内皮组织增殖症和鸡白痢的监测与分析[D]. 张倩. 中国农业大学, 2017(02)
- [5]种鸡场沙门氏菌感染状况的调查与防控[D]. 郭龙宗. 山东农业大学, 2017(07)
- [6]表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的减毒鸡伤寒沙门氏菌重组疫苗的构建及免疫保护研究[D]. 陈凯. 扬州大学, 2017(01)
- [7]鸡白痢沙门菌△fur△speDE的构建及其免疫生物学特性初步研究[D]. 安树敏. 扬州大学, 2016(02)
- [8]鸡白痢沙门菌T3SS2及其效应蛋白CigR的致病与免疫作用[D]. 殷俊磊. 扬州大学, 2016(02)
- [9]表达大肠杆菌外膜蛋白抗原的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究[D]. 邹雅洁. 扬州大学, 2016(02)
- [10]不同饲养模式对黄山黑鸡J亚群禽白血病、鸡白痢感染情况的影响[D]. 黄小雨. 安徽农业大学, 2015(03)