一、一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中指出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
曹军[2]（2021）在《犬NGAL作为急性肾损伤早期诊断敏感标志物的研究》文中指出急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是犬常见疾病之一,由于缺乏敏感的早期诊断标志物而延误治疗,所以发病率和死亡率一直居高不下。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（Neutrophil gelatinase-related apolipoproteins,NGAL）是人和其它动物 AKI早期诊断的重要分子标志物,但犬AKI的病因不同,NGAL能否作为犬AKI早期诊断敏感标志物有待进一步研究。为此,本研究首先建立了犬肾脏缺血-再灌注（Ischemia-reperfusion,I/R）损伤模型,通过分子诊断标志物的比较研究,明确了 NGAL也是早期诊断犬I/R-AKI的敏感标志物。进而利用重组大肠杆菌表达的犬NGAL抗原制备单克隆抗体,建立了检测犬NGAL的双抗体夹心ELISA方法,并利用犬AKI临床样品对建立的ELISA方法进行验证,为NGAL在犬AKI早期诊断中的应用提供了理论依据和诊断试剂。1.犬I/R-AKI模型的建立及其诊断标志物的比较研究为了探明NGAL能否作为早期诊断犬I/R-AKI的分子标记,将12只比格犬随机分为对照组和I/R组,I/R组手术摘除右肾,左肾动、静脉用无损伤血管夹夹闭60 min后进行再灌注,然后进行手术缝合。对照组打开腹腔,摘除右肾后直接缝合。在再灌注后12 h和72 h,分别采集两组犬的肾脏组织进行病变观察,结果显示I/R组呈现典型的AKI病变,包括肾小管刷状缘消失、管腔内淤血、内皮细胞变性坏死、管腔内有蛋白管型或管腔狭窄。在再灌注后不同时间采集两组犬的血样和尿样,利用全自动生化分析仪检测血液尿素氮（BUN）、血清肌酐（sCr）和尿肌酐（uCr）,采用ELISA检测血清NGAL（sNGAL）和尿NGAL（uNGAL）。结果与对照组相比,I/R组的sCr在再灌注后24 h显着升高,36 h超过参考值上限,60 h达到峰值;uNGAL/uCr 比值（UNCR）从再灌注2 h开始迅速上升,6～60 h期间保持较高水平;uNGAL和sNGAL从再灌注后2h快速上升,12h达到峰值,随后逐渐下降。ROC分析显示uNGAL和sNGAL检测灵敏度显着高于sCr（P<0.0001）,特异性无显着差异。在再灌注后12 h和72 h分别采集两组犬的肾组织进行qRT-PCR和免疫组化比较分析,进一步证明NGAL是早期诊断犬I/R-AKI的敏感分子标记。2.犬NGAL单克隆抗体的制备与鉴定为了开发具有自主知识产权的犬NGAL检测试剂,根据犬NGAL基因序列设计引物,从比格犬肾组织提取总RNA,用RT-PCR扩增犬NGAL成熟肽编码序列,将其插入pET28a（+）表达载体,转化大肠杆菌后利用IPTG诱导重组蛋白表达,利用镍亲和柱纯化重组蛋白。以纯化的犬重组NGAL免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,免疫转印进行单克隆抗体鉴定。结果显示克隆的犬NGAL编码序列与发表序列的同源性为100%,重组大肠杆菌表达的犬NGAL为预期的25 kDa,纯化的重组蛋白纯度大于90%;经过3轮克隆化筛选,获得6株阳性杂交瘤细胞株,细胞培养上清的 ELISA 抗体效价分别为 1:10240、1:64000、1:32000、1:10240、1:32000 和 1:64000,小鼠腹水单抗的 ELISA 效价分别为 1:64000、1:128000、1:128000、1:64000、1:128000、1:128000,均能与犬NGAL发生特异性反应,纯化抗体效价均大于1:1024000。上述结果提示制备的单克隆抗体可以用于犬NGAL检测试剂的研发。3.犬NGAL双抗体夹心ELISA的建立目前国内尚无犬NGAL诊断试剂盒上市。本研究以犬重组NGAL为抗原,利用相加ELISA对6株单克隆抗体的NGAL结合位点进行检测,然后用双抗体夹心ELISA筛选最佳抗原-抗体配对,根据单因子分析结果确定双抗体夹心ELISA的最佳反应条件,通过临床血清和尿液样品检测批内、批间变异系数和回收率,并用18只健康犬和18只AKI犬的血样和尿样,与进口 ELISA试剂盒进行平行检测。结果显示:6株单克隆抗体中,NC-1、NC-3的NGAL结合位点相同,NC-2、NC-4、NC-5、NC-6的抗原结合位点相同,其中NC-5和NC-3的P/N值最高,因此选为ELISA的捕捉抗体和检测抗体。捕捉抗体的最佳包被液为50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）,包被浓度为2 μg/mL;最佳封闭液为含1%酪蛋白的PBST（含0.05%Tween 20的PBS）,封闭条件为37℃封闭3 h;检测样品反应条件为37℃孵育45min;检测抗体最佳稀释倍数为1:8000,反应条件为37℃孵育45 min;底物反应条件为室温避光孵育10 min。用纯化的犬NGAL重组蛋白描绘标准曲线,双抗体夹心ELISA的检测限为0.292 ng/mL。检测低浓度和高浓度NGAL血清样本的批内变异系数分别为8.63%和6.70%,批间变异系数分别为10.34%和7.48%;检测低浓度和高浓度NGAL尿样的批内变异系数分别为8.33%和4.54%,批间变异系数分别为10.01%和4.62%。血样和尿样平均回收率分别为91.9%和96.7%。与进口犬NGAL检测试剂盒相比,本研究建立的双抗体夹心ELISA检测血样和尿样NGAL的符合率分别为97.18%和99.06%,可以用于犬NGAL的检测。4.犬NGAL双抗体夹心ELISA在AKI诊断中的应用为了验证双抗体夹心ELISA能否用于犬AKI的早期诊断,本研究共采集27个品种犬血样256份和尿样106份,根据BUN、sCr检测及临床症状,将纳入病例分成健康对照组、细小病毒感染组和不明原因腹泻组（非肾脏病组）,将肾病犬分为AKI组和慢性肾脏病组,用双抗体夹心ELISA检测sNGAL和uNGAL浓度,并计算UNCR。在初诊后第5日,对非肾病组uNGAL高于临界值的11只犬进行BUN、sCr、uCr、sNGAL、uNGAL检测及UNCR计算。结果显示,在血样检测的256只犬中,40例为健康犬,52例为细小病毒感染犬,50例为不明原因腹泻犬,60例有急性肾损伤,54例有慢性肾脏病。非肾损伤组的sNGAL、uNGAL、UNCR差异不显着,显着低于（P<0.0001）肾损伤组,其中急性肾损伤组的sNGAL显着（P<0.0001）高于慢性肾病组,uNGAL和UNCR与慢性肾病组无显着差异。在1 1只复诊犬中,8只犬的BUN、sCr浓度超过正常值上限,sNGAL和uNGAL浓度升高,结合临床症状诊断为AKI。这些结果表明建立的NGAL双抗体夹心ELISA可以用于犬AKI的早期诊断。
史一恒[3]（2021）在《脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备及免疫检测方法研究》文中研究表明脂环酸芽孢杆菌是一类具有嗜酸耐热特性的革兰氏阳性菌的统称,它能够造成多种果汁品质下降,严重影响果汁产业的健康发展。建立灵敏、精确的检测方法,方便高效的识别果汁中脂环酸芽孢杆菌的污染,一直是学者研究的热点,也是果汁企业亟待解决的关键。本研究以建立脂环酸芽孢杆菌的免疫检测体系为主线,通过解析脂环酸芽孢杆菌的细胞壁蛋白,寻找菌体表面潜在的特异识别靶点,并以此为抗原,制备了脂环酸芽孢杆菌的单克隆抗体,并最终实现了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的灵敏、特异识别。主要研究内容和结论如下:（1）选择脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3923作为研究对象,提取菌体细胞壁蛋白,并借助免疫蛋白质组学的研究手段对其中具有免疫原性的蛋白进行鉴定,结果表明:在A.acidoterrestris DSM 3923细胞壁上存在超过200个蛋白,集中分布在10-75 k Da之间,其中分子量范围在35-75 k Da之间的蛋白丰度较低,免疫原性也相对较弱;分子量范围在10-35 k Da之间的蛋白丰度较高,免疫原性也相对较强。在挑选的22个免疫原性蛋白中,成功鉴定出18个,归属于12类蛋白,其中有2种为新发现的免疫原性蛋白。这些蛋白可以参与碳水化合物和能量代谢、物质跨膜运输、催化氧化还原反应、应答氧化应激、维持细胞生长以及多肽合成,另有一种蛋白功能未知。（2）以12类免疫原性蛋白为研究对象,根据其编码基因序列进行引物设计,借助原核表达技术获得融合蛋白,并对其免疫原性进行再次验证,结果表明:通过合理设计获得的引物,可以用于特异扩增目的基因片段,产物长度与理论值一致,且无任何碱基突变。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下,目的基因可以在大肠杆菌中高效表达,其中4类融合蛋白以可溶性形式存在,其余融合蛋白形成包涵体。对利用镍柱纯化后的蛋白进行免疫原性分析发现,除苹果酸脱氢酶以外,其它11类蛋白均能与A.acidoterrestris多克隆抗体发生强烈的免疫反应。（3）选取假定蛋白N007＿08970作为免疫原,对BALB/c小鼠进行免疫,从而制备单克隆抗体,并对纯化的抗体进行效价和特异性评价,结果表明:经过4次腹腔注射免疫之后,6只小鼠均可产生较高效价的抗血清。选择5号小鼠用于细胞融合,最终筛选获得7株阳性杂交瘤细胞。将1G10细胞株注射入小鼠腹腔,通过腹水生产单克隆抗体,亚型鉴定为Ig G1-kappa。经过蛋白G亲和层析纯化后的抗体纯度较高,浓度为2.28 mg/m L,效价可达1:80000。Western blot分析结果发现制备的单克隆抗体可以与抗原发生强烈的免疫反应,且能专一地识别A.acidoterrestris DSM 3923细胞壁上相应的抗原靶点,具有极高的特异性。（4）以A.acidoterrestris单克隆抗体为捕获抗体,以A.acidoterrestris多克隆抗体为检测抗体,建立了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的间接夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）方法,结果表明:方法中单克隆抗体与多克隆抗体最佳工作浓度分别为2.5μg/m L和2μg/m L,酶标二抗的最佳稀释度为1:4000;抗体包被最适条件为4℃过夜;5%（v/v）脱脂奶粉封闭效果最好,封闭温度为37℃,封闭时间2h;菌体抗原与两种抗体以及多克隆抗体与酶标二抗的最适反应时间均为60 min;底物显色15 min之后,方法对脂环酸芽孢杆菌的检测效果最佳,在苹果汁中的检测限达5.4×102 CFU/m L。方法能够有效地区分目标菌与非目标菌,结果重复性与稳定性良好,可以在22h内对目标菌污染量为1 CFU/m L的果汁进行有效识别。（5）以脂环酸芽孢杆菌单克隆和多克隆抗体为核心,以对苯二胺为过氧化物酶底物,同时借助荧光素钠产生荧光信号,建立了具有比色和荧光双重信号模式的免疫检测体系,并对方法的检测性能进行评价,结果表明:当体系中单克隆抗体与多克隆抗体浓度均为2.5μg/m L,酶标二抗稀释度为1:5000时,方法对果汁中的脂环酸芽孢杆菌检测效果最好,两种模式下的检测限均可达4.8×102 CFU/m L,且具有优良特异性。本方法可以在24h内有效地识别脂环酸芽孢杆菌污染浓度为1 CFU/m L果汁样品。
丁钰[4]（2020）在《重组贝伐珠单抗细胞培养工艺研究》文中研究表明贝伐珠单抗是一种单克隆抗体,在肿瘤和黄斑变性的治疗中发挥着重要作用,具有很高的医学价值和广阔的市场应用前景。本课题组已经构建并筛选出一株稳定表达贝伐珠单抗的重组中国仓鼠卵巢（recombinant Chinese hamster ovary,r CHO）细胞,本文计划对该细胞株进行细胞培养工艺研究,并对该细胞株培养过程存在的问题进行研究和探讨。首先通过单因素实验初步筛选出适合该重组CHO细胞的5个培养参数,包括初始活细胞密度（initial viable cell density,IVCD）、基础培养基、培养温度、变温活细胞密度（shift VCD）和补料培养基,结果显示基础培养基存在乳酸累积现象,因此进一步通过调整补料方式和添加铜离子对乳酸代谢进行调控,最终确定当铜离子添加浓度为120μg/L,补料策略为d3～d14补料量维持第二天残糖水平为2 g/L最有利于细胞生长代谢和抗体产物表达。此外,本文采用实验设计（全因子设计和中心复合设计）和响应面分析的方法,优化了重组贝伐珠单抗的细胞培养工艺,对最佳工艺参数进行验证,得到最佳参数组合:初始活细胞密度0.9±0.1×106 cells/m L、变温活细胞密度20±2×106 cells/m L、BM04占比75%、Cu SO4?5H2O添加浓度为140μg/L、培养时间14天,并对实验过程中抗体浓度及抗体电荷异质性的检测方法进行了方法学验证。本研究的最后初步探索了金属离子(Cu2+/Mn2+)和岩藻糖（Fucose）对该细胞株表达抗体糖基化的影响,实验结果表明铜离子和锰离子对细胞抗体G0和Afucosylated糖型的合成具有协同作用,但高浓度铜离子会抑制细胞产生抗体,导致抗体浓度降低。本文对该重组贝伐珠单抗细胞的培养工艺进行了初步研究,通过调整补料方式、铜离子添加浓度对乳酸代谢进行调控,提高了细胞培养过程的耐受性。虽然对细胞抗体糖基化的研究不够深入,但本文所得结论对同类细胞摇瓶培养工艺开发或研究具有重要的参考价值,也为反应器工艺放大及规模化生产提供研究思路和基础数据。
沈晨光[5]（2018）在《乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究》文中认为季节性流感主要由乙型流感病毒和甲型流感病毒引起,流感的季节性流行每年在全球范围内造成大量的重症和死亡病例,可在局部范围内暴发疫情的乙型流感,约占流感总发病率的25%左右,其对人类健康造成的危害不容忽视。由于病毒种类的多样性和病毒表面抗原的高变性,当今流感疫苗和抗病毒药物对乙型流感的防治效果均不理想,研制乙型流感新型特效药物和疫苗意义重大。流感表面血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白为流感病毒包膜上最主要的膜蛋白,存在包括病毒受体结合位点（Receptor binding site,RBS）在内的多个病毒生命周期中必需的功能区,可诱导宿主产生多种类型的保护性抗体,是新型广谱抗流感药物和疫苗研究的主要靶蛋白。近几年来,流感HA广谱抗体的研发和广谱表位的鉴定,为流感高效抗病毒药物及疫苗的研制带来了新希望。研究显示,乙型流感HA蛋白RBS区存在广谱中和表位,但当前的乙型流感疫苗并不能诱导机体产生针对两种病毒亚系的广谱中和抗体。因此,乙型流感RBS区广谱中和表位是否较普遍存在,何种免疫方式能够刺激此类广谱表位在机体高效诱导跨亚系广谱中和抗体,识别RBS区保守表位的跨亚系中和抗体通过何种机制发挥抗病毒作用等科学问题均值得深入研究。本研究尝试了多种乙型流感RBS区广谱抗体诱导策略,通过活毒滴鼻序贯免疫策略,制备出一株IgG亚型的乙型流感RBS区广谱中和抗体C12G6。C12G6识别病毒RBS区高度保守表位,同已报道的乙型流感HA广谱单抗相比,具更优的体外抗病毒活性,为第一株发现的对Yamagata和Victoria亚系乙型流感均具血凝抑制（Hemagglutination Inhibition,HI）活性的抗体。在小鼠和雪貂动物保护模型中,C12G6显示出良好的体内抗病毒效果,具备一定的晚期抗病毒疗效,保护活性优于已报道的其他广谱中和单抗和流感抗病毒药物“达菲”,并同“达菲”联合使用具协同抗病毒效果。Cl2G6所具备的多种高效抗病毒机制解释了其良好的体内外抗病毒活性的原因,其可通过直接抑制病毒感染细胞、抑制病毒子代释放、抑制病毒基因组释放、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（CDC）协同抑制病毒,值得关注的是,C12G6为目前发现的抗病毒机制最多样化的流感广谱抗体。乙型流感病毒不断变异,C12G6虽具备良好的抗病毒反应性,但其逃逸突变病毒株仍随时可能进化产生,开发由多种类型乙型流感广谱单抗联合组成的抗病毒鸡尾酒药物,可大大降低因病毒逃逸突变使药物失效的风险。为诱导不同类型的乙型流感RBS区广谱中和单抗,本研究发现,对于乙型流感活毒滴鼻免疫,IgM亚型抗体含量高的免疫初期血清,其抗病毒反应谱强于IgG亚型抗体含量高的免疫后期血清,提示IgM亚型抗体可能具备更为广谱的抗病毒反应性。据此,本研究制备出数株具高效效抗病毒活性的乙型流感RBS区广谱中和单抗,其中抗病毒活性最优的IgM亚型RBS区广谱抗体C7G6-IgM,可高效抑制所有测试病毒对细胞的感染,其体外抗病毒谱和活性均大大优于包括C12G6在内的本研究中的和已报道的所有乙型流感HA广谱中和抗体,并在小鼠和雪貂动物模型上显示出了良好的抗病毒保护活性。上述研究结果表明,乙型流感病毒RBS区确实存在跨亚系广谱表位,但常规的免疫策略很难激发机体产生针对此类表位的有效应答,活毒滴鼻序贯免疫策略是诱导此类表位产生应答的有效手段,为乙型流感通用疫苗的设计提供重要科学依据;本研究筛选到针对乙型流感RBS表位区的多个广谱中和单抗,证明识别乙型流感RBS区广谱中和单抗具备多种抗病毒作用机制,为乙型流感新型抗病毒药物的研制提供科学依据;本研究还发现识别乙型流感RBS区特定表位的IgM亚型抗体,可高效抑制多亚系病毒感染细胞,提示IgM亚型抗体的研究可为高变异病原体提供新的防控手段。
宋绍征[6]（2016）在《转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究》文中研究表明自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了三代发展。人组织纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator, t-PA）是由血管内皮细胞合成并分泌的一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,是一种良好的第二代溶栓药物。重组人纤溶酶原激活剂（recombinant human plasminogen activator, rhPA）是天然t-PA的重组突变体,属于新型第三代溶栓药物,具有较天然t-PA更加优越的溶栓功能。利用动物乳腺生物反应器来生产t-PA及其重组突变体,具有产量高、成本低、翻译后修饰、生物活性高等优于其它表达系统的特点。应用多种纯化技术相结合的策略,能够方便、快捷、高效地将目标蛋白从动物乳汁中分离纯化出来。现今,国内外已有很多关于以上研究内容的报道。本研究目的旨在：将构建正确而有效的rhPA乳腺特异性表达载体（F、E、K1区缺失重组体t-PA）应用到转基因兔中,研究其表达水平和活性功能,以期获得高效表达rhPA的转基因兔；研究各种分离纯化表达兔乳中rhPA的方法和策略,以期获得高纯度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型,以期获得最佳的动物溶栓效果；同时,还研究了rhPA单克隆抗体的制备和筛选方法,以期获得能够用作亲和层析配体的多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）。从而,最终获得一种新颖、高效的溶栓药物。相关研究方法和结果如下：1.采用常规分子生物学技术,分别以山羊p-酪蛋白基因（β-casein）、山羊p-乳球蛋白基因（BLG）和牛αs1酪蛋白基因（asl-casein）作为调控元件,以天然t-PA的F、E、K1区缺失体作为编码蛋白序列,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。经酶切图谱和测序比对结果显示,构建的载体与理论序列完全一致。2.通过胶原酶消化组织法建立山羊乳腺上皮细胞分离培养体系,电转染三种载体,经600μg/mL G418筛选两周后,挑取生长旺盛、状态较好的单克隆细胞集落,传代扩大培养。经PCR检测,PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA三种载体分别获得了79株、66株、63株整合阳性单克隆细胞株,并应用51μM催乳素进行诱导表达。ELISA检测72h后细胞诱导上清液,25株转PCL25/rhPA基因细胞株高水平表达rhPA,3株转BLC14/rhPA基因细胞株表达rhPA,而转AP/rhPA基因细胞株未见表达。经纤维蛋白平板溶圈法（FAPA）检测,所有诱导表达上清液均具有体外溶栓活性功能。结果表明,在细胞水平,PCL25/rhPA和BLC14/rhPA载体能够有效地驱动rhPA基因特异性表达,且PCL25/rhPA载体的表达水平明显高于其它两种载体。从而,验证了构建的PCL25/rhPA载体是合理而有效的。3.将以上三个构建（PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA）经显微注射导入到兔受精卵中,共移植94只受体,妊娠71只,出生319只仔兔,PCR检测85只为转基因整合阳性兔,妊娠率为75.5%（71/94）,整合率为26.6%（85/319）。ELISA检测57只存活转基因兔（或后代）乳汁,共12只乳腺特异性表达rhPA （PCL25/rhPA11只,BLC14/rhPA1只）,表达水平约在5.2-630 μg/mL之间。SDS-PAGE电泳和Western Blot检测该12只兔乳,均出现约39KDa大小的目标特异性条带。FAPA结合ELISA测定表达产物的体外溶栓比活性,最高可达360倍左右（A29,与阿替普酶相比）。测交检测高表达水平的A29系转基因兔,1只F2代（A29F2-09）的所有后代仔兔均为整合阳性（100%,13/13）；Real-time PCR检测相对拷贝数,该只兔约是其它同系转基因兔的2倍。从而,证明了A29F2-09为纯合子转基因兔,且rhPA表达水平约1000μg/mL,明显高于非纯合子兔；不同系转基因兔拷贝数与表达水平间没有相关性。以上结果表明,PCL25/rhPA载体能够在转基因兔乳腺中高效表达活性rhPA;表达水平主要与整合位点有关；当整合位点一致时,表达水平随拷贝数的增加也相应地累积提高。4.通过传统弗氏佐剂和快速免疫佐剂两种方法免疫小鼠,结果显示在免疫小鼠血清效价、免疫原剂量和免疫周期上,快速免疫佐剂都大大地优越于弗氏佐剂（1010/109,20μg/1300μg,35d/70d）。通过电脉冲和化学PEG两种方法将免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,结果显示电融合效率明显高于化学PEG融合（166%/88.4%）。通过HAT和HT筛选及有限稀释法亚克隆后,共获得12株能够稳定分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株（标号Cl-C12）。ELISA-elution检测,有3株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb,标号C1、C4、C8）,占单克隆抗体总数的25%（3/12）。小鼠腹腔诱导法大量制备抗体,C1、C4、C8株腹水效价分别是108、1010、108,且无交叉非特异性反应,能够为亲和层析所用。5.通过离心脱脂、35%饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等方法进行兔乳前处理,获得粗纯样品。将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱,偶联率高达96.5%。尝试五种不同的洗脱液（A:0.1mol/L甘氨酸,pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸,pH3.5；C:0.1mol/L甘氨酸,pH5.0; D:0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液,pH7.9; E:0.2M NaH2PO4-柠檬酸,pH2.2）,来探索最佳洗脱效果的条件,结果显示0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液（pH7.9）洗脱效果最佳,但pH较低的强酸缓冲液（A、B、E）也能够达到洗脱要求,而pH较高的C洗脱液则出现杂蛋白较多且回收率低。再尝试Chromdex75 prep grade凝胶过滤预装柱来进一步分离纯化目标蛋白rhPA,上样体积为1%和2.5%能够将目标蛋白完全分开,出现两个独立的峰；而上样体积为5%则不能够将目标蛋白完全分开,出现两个相互交叉重叠峰。经免疫检测及飞行时间质谱鉴定该纯化产物为目标rhPA。与BSA对照品相比,双向电泳结果显示,纯化产物的大小约39KDa（在35-40KDa之间）,等电点约7.1（BSA等电点约4.7）,纯度可达96%-99%或更高（BSA纯度96%-99%）。与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构；FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药。6.以HitrapTM CaptoTM Q-1mL离子交换柱去内毒素,经试剂盒测试,内毒素含量低于0.015EU/mL.分别以0.3mL/只小鼠腹腔注射1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%浓度的角叉菜胶,来探索诱导小鼠尾部血栓形成的最佳条件,结果显示以0.05%浓度的角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成条件最佳。以不同的“给药”浓度（低剂量组0.1mg/只、中剂量组0.4mg/只、高剂量组1.6mg/只及阿替普酶、生理盐水对照组）对小鼠血栓模型病进行治疗,结果显示纯化产物rhPA作为溶栓药物治疗小鼠尾部血栓,在效果和剂量上明显优越于阿替普酶,且rhPA高剂量组（1.6mg/只）在三次给药后（32h）能够完全治愈小鼠尾部血栓疾病。以上结果表明,我们构建的F、E、K1区缺失重组体t-PA （PCL25/rhPA载体）是合理、有效的,且能够在转基因兔乳腺中高效表达；表达产物rhPA能够相对单独地存在于兔乳中,且能够被分离纯化出来；纯化产物具有高回收率、高纯度、高生物活性功能,且能够用于动物溶栓模型试验,具有较阿替普酶对照品更好的疗效。同时,也证明了我们所建立的这一整套技术体系是相对完善、可行的,在国内外较少见报道,为以后大量新型重组溶栓药物的研发提供了新的思路,也为后期进一步临床试验奠定了扎实的基础。
万志敏[7]（2015）在《抗体压下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析》文中提出禽流感病毒（Avian Influenza Virus AIV）为正粘病毒科（Orthomxoviridae）,流感病毒属（Influenzavirus）,单链负股分节段RNA病毒。根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的遗传进化不同,将HA分为H1-H17共17个亚型,NA分为N1-N10共10个亚型。H9N2禽流感病毒（AIV）是1966年首次在北美被分离到,该病毒经过数十年的演变现在在全世界多个地区的家禽中流行,并且造成地方性流行,一般发病比较温和,有产蛋下降和呼吸道症状,但是如果继发感染其他细菌和病毒可能会导致死亡率升高,给世界养禽业造成了不可估量的损失。而随着H9N2的进化,其宿主范围越来越广,不仅能感染禽类,也能感染猫,猪,雪貂甚至人等多种哺乳动物,引起了H9N2对公共卫生威胁的重视。同时H9N2为高致病性H5N1和H7N9提供内部骨架,这两种病毒都导致了人很高的死亡率,这个更引起了人们对HgN2流感的重视。HA和NA是流感病毒最为重要的两个表面糖蛋白。HA负责与唾液酸受体结合,而NA负责把病毒从细胞表面解离出来达到释放和传播病毒的效果,两者的活性及与唾液酸的相互作用是相互平衡的。H9和N2的结构都已经用X-ray晶体学技术解析出来,但是哪些氨基酸在抗原位点起关键作用并没有很多报道。本研究运用本实验室分离的A/chicken/Jiangsu/x1/2004 （H9N2）（X1）株HgN2病毒免疫小鼠,制备抗HA和NA单克隆抗体。通过研究这些单克隆抗体的生物学特性和其与HA和NA结合的部位来确定在抗体产生过程中HA和NA蛋白哪些氨基酸是起关键作用。1.抗H9N2病毒HA和NA单克隆抗体的研制流感病毒RNA聚合酶缺少DNA聚合酶具有的校对功能,导致其复制过程中误码率很高,流感病毒在抗体作用下,病毒为逃避抗体压易出现针对抗体的变异株,这也是流感很难控制的一个原因。基于这一原理用单克隆抗体给其抗体压,病毒很会产生针对抗体的变异,使其失去中和特性,通过比对可以确定抗体与蛋白的结合部位。为确定尽可能多的蛋白抗原表位首先需要制备尽可能多的单克隆抗体。本研究我们应用X1株病毒按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,用感染X1株病毒的鸡胚成纤维细胞（CEF）做间接免疫荧光试验（IFA）检测杂交瘤细胞培养上清。结果：获得16株分泌抗H9N2禽流感病毒单克隆抗体的阳性细胞株,分别命名为1C3、1D1、1G8、2A1、2A8、 2G4、2G11、3B10、4G3、5B4、5E10、5G4、6A5、6A10、6B6和6E6。用血凝抑制（HI）试验进一步筛选鉴定其抗HA的活性,结果获得了8株抗H9N2 HA的单克隆抗体,分别是1C3、2G4、3B10、5B4、6A5、6A10、6B6和6E6。用H9N2 HA基因构建pcDNA-HA并转染293T细胞,以筛选上述其他HI阴性的杂交瘤细胞上清,结果表明,单克隆抗体2A8能与pcDNA-HA转染表达HA的细胞反应,证明单克隆抗体2A8也为抗HA的抗体,但该抗体的HI为阴性。为检测剩余阳性杂交瘤是否有抗H9N2 NA单克隆抗体,我们用不同亚型禽流感病毒H1N1, H1N2, H9N1感染MDCK细胞进行IFA检测分析,发现上述获得的单克隆抗体1D1和1G8两株均可以与H1N2反应,显示免疫荧光阳性,而不与其他病毒反应,表明这两株抗体为抗H9N2 NA的单克隆抗体。综上所述,本研究通过杂交瘤技术共获得抗H9N2 HA的单克隆抗体9株,其中8株为HI阳性,1株HI阴性；获得抗H9N2 NA的单克隆抗体2株。单克隆抗体的研制为进一步研究抗原表位氨基酸分析提供了条件。2.抗体压力下H9N2病毒HA蛋白抗原位点氨基酸变异分析HA是流感病毒最为重要的表面糖蛋白之一,负责与唾液酸受体结合。H9具有5个抗原区域,分别命名为抗原Ⅰ,Ⅱ Ⅲ,Ⅳ和V。其中Ⅰ和Ⅱ抗原区域在三聚体的头部,这部位产生的抗体表现出HI现象。上述研究获得单克隆抗体中有8株HI阳性的抗H9N2 HA的单克隆抗体,我们鉴定其亚类都为IgG,用8株抗体的腹水检测HI效价,发现其HI效价都很高,达到211-219。用细胞中和试验证明,这些单克隆抗体具有很好的中和X1株H9N2病毒的能力,中和效价达到1：5120-1：655360。利用分离的所有H9N2病毒与这8株单克隆抗体进行HI试验,发现1C3和2G4两株单克隆抗体能与所有试验的H9N2病毒产生很高HI效价,表明这两株抗体可能针对H9N2上HA的保守部位。利用筛选病毒的抗体逃逸株方法,本研究我们开展了在单克隆抗体压力下的表位变化分析,以期筛选获得相应的X1株病毒逃逸株。结果表明,不同单克隆抗体压力下的H9N2存活能力不完全一致,其中病毒在1C3和2G4两株抗体作用下生存能力较弱,经过多次筛选才得到病毒逃逸株。通过精确筛选,共获得9株H9N2病毒相应单克隆抗体逃逸株（其中2G4单克隆抗体压力下产生两株逃逸株）。对单克隆抗体逃逸株HA测序分析,发现了10个氨基酸位点发生变异,变异位置分别在147、153、164、167、168、196、198、200、201和207位点,其中164、167、168、196、198和207等6个位点是第一次报道。这10个位点都位于H9N2 HA的抗原位点I和II区域,新发现了6个位点位于H3的等同抗原区域B。利用NCBI公布的1563株H9N2病毒HA全序列分析发现,田间野生H9N2病毒的这10个位置都出现不同程度的变异,且这些变异与本研究获得的结果相一致。该研究结果证明,抗体压力下的H9N2 HA抗原关键氨基酸位点发生变异是产生免疫逃逸的重要基础,这些结果也为今后的疫苗研制和H9N2监测提供了科学依据。3.抗体压力下H9N2 NA抗原位点氨基酸变异分析NA是流感病毒最重要的表面糖蛋白之一,其结构为四聚体。NA负责把病毒从细胞表面解离出来达到释放和传染的作用。很多抗流感病毒的药物都是针对NA蛋白设计的。本研究以研究内容一的两株抗H9N2 NA的单克隆抗体为研究对象,通过Mu-NANA为底物检测单克隆抗体对NA活性的抑制作用。结果发现,单克隆抗体1G8对H9N2 NA有很好的抑制作用,效价达到25.4μg/mL;而单克隆抗体1D1没有呈现相同的作用。为了进一步验证单克隆抗体1D1在NA中的作用,本研究用酶联凝集素试验（ELLA）对其NA活性的抑制作用进行了检测,结果发现,两株抗体都能抑制NA的活性,抑制活性效价分别为1.8μg/mL和0.4μg/mL。这些结果提示,单克隆抗体1G8能很好地抑制NA活性,针对的位点可能位于NA活性中心附近；而单克隆抗体1D1结合部位距NA活性中心可能较远,不能完全阻止Mu-NANA和NA结合。利用抗H9N2 NA特异性单克隆抗体处理X1株病毒,筛选在抗体免疫压力下的H9N2 NA变异逃逸株。结果成功筛选获得单克隆抗体1D1压力下的逃逸株,命名为m1D1；单克隆抗体1G8压力下获得两株逃逸株分别命名为m1G8-1和m1G8-2。将这些逃逸株NA测序分析,结果发现,m1D1出现R338S变异,m1G8-1和m1G8-2分别出现D198N,K199E变异。利用NCBI公布的1130株H9N2的NA全序列分析,发现在这三个位置的氨基酸并不保守,都出现了不同程度的变异,其中198和199位置出现了和逃逸株相同的氨基酸变异。这些结果证明,抗体压力下的NA变异,是禽流感逃逸的主要方式之一；这些结果也为禽流感的进化和检测提供了科学依据。4.单克隆抗体2A8与H9N2 HA结合位点的鉴定HA是流感病毒最为重要的表面糖蛋白之一,具有典型的三聚体结构,大部分针对其头部的抗体都具有m效价,但是有些针对茎部抗原区域的抗体不具备m功能,但能有效中和病毒感染；这类抗体一般具有较广的反应谱。本研究我们运用实验内容一制备的HI阴性的抗H9N2 HA单克隆抗体2A8进行中和试验,发现其能很好的中和X1株病毒,中和效价为12.5μg/mL,同时IFA中2A8能很好的与H1N1和H1N2结合,证明这株抗体为广谱性单克隆抗体。应用低浓度的单克隆抗体2A8与H9N2作用,然后筛选相应的逃逸株。结果获得4株H9N2单克隆抗体2A8的免疫逃逸株,序列分析发现,免疫逃逸是由于在HA的270和282两个位点出现了变异而导致,属于H9N2病毒HA抗原Ⅳ区或H3的抗原位点C。利用NCBI公布的1563株H9N2的HA全序列分析发现,在HA的270和282位点出现存在不同程度的变异,其中282位置变异较大,变异率达45%,这两个位点变异与本研究获得的结果相吻合。
王钰[8]（2015）在《鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定及囊膜蛋白抗原表位的鉴定》文中指出鸭坦布苏病毒病（duck Tembusu virus disease）是于2010年在我国新出现的一种以采食、产蛋下降和瘫痪为特征的禽类传染病,其病原为鸭坦布苏病毒（duck Tembusu vius,DTMUV）。DTMUV主要危害鸭和鹅,也有鸡群感染发病的报道,不同来源的DTMUV分离病毒株的基因同源性均高于98%。该病在蚊虫活跃季节发病率高,但冬季也有发病,因此传播途径不限于蚊媒。鸭坦布苏病毒为黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群中的坦布苏病毒（Tembusu virus）。病毒的基因组为正股单链RNA,长约11 knt,基因组结构为5’UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’UTR。囊膜蛋白（E）是DTMUV主要的表面结构蛋白,参与病毒与宿主细胞受体的结合,含有病毒的主要中和抗原表位。DTMUVNS1蛋白参与病毒的组装,也可以二聚体或六聚体的形式分泌至胞外,拮抗宿主的先天性免疫。E蛋白和NS1蛋白为DTMUV的2个最主要免疫保护性抗原,关于其抗原表位信息报道较少。本研究分离鉴定了一株鸭源坦布苏病毒,研究其生物学特性,测定其全基因序列,分析其基因进化特征。应用细胞融合技术制备了 4株抗DTMUV E蛋白和NS1蛋白的单克隆抗体,其中针对E蛋白的单克隆抗体能区分DTMUV和日本脑炎病毒（JEV）抗原,DTMUV囊膜蛋白特异抗原表位的发现为DTMUV血清学诊断方法的建立奠定基础。具体研究如下:1鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析2012年10月徐州地区某鸭场爆发了樱桃谷种鸭产蛋骤然下降的疫病,患病鸭表现为发热、采食减少、产蛋下降,剖检可见脾肿大、卵泡出血、萎缩等。本研究从送检病料中分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株。DTMUV XZ-2012株能适应鸡胚培养,于BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU/mL。应用RT-PCR的方法扩增DTMUV XZ-2012基因,测序发现其基因组全长为10990nt,编码的多聚蛋白有3426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与文献报道的BYD株、YY5株、JS2010株等DTMUV的全基因同源性为98.5%-99.3%。与国内最初分离的DTMUV BYD株等相比,DTMUV XZ-2012的基因变异主要分布于E基因、NS1基因和NS2a基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力。2鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定用纯化的鸭坦布苏病毒重组EDⅢ蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒EDⅢ抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C4和3D12。经间接ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价均为1:12800。腹水效价分别为1×105和2×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,3C4株单抗的亚类为IgG1κ型,3D12株单抗的亚类为IgG2bK型。间接免疫荧光试验与Westernblot鉴定结果表明3C4、3D12株杂交瘤细胞能特异性识别细胞中鸭坦布苏病毒的EDⅢ蛋白,与日本脑炎病毒没有交叉反应。中和试验显示这两株单抗没有中和活性。3鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备利用纯化的鸭坦布苏病毒NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒NS1蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F6和2F12。经间接ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:6400、1:12800。腹水效价均为1:1×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,2F6、2F12株单抗的亚类均为IgG1,2株单抗的轻链均为κ型。Western blot与间接免疫荧光试验鉴定结果表明2F6、2F12株杂交瘤细胞能特异性识别DTMUV接种细胞中的NS1蛋,2F12与日本脑炎病毒接种细胞有交叉反应,2F6与JEVNS1没有交叉反应。4鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白B细胞表位的鉴定为了对获得的2株抗鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白的单克隆抗体所针对的抗原表位进行精确定位,本研究通过原核表达了截短的EDⅢ蛋白,人工合成了多肽抗原。通过ELISA和Western blot方法精确定位了这两株单克隆抗体所识别的抗原表位。结果显示这两株囊膜蛋白单克隆抗体针对的是同一表位310SLVKNP315。经分析发现该表位高度保守,且与其他黄病毒不交叉。以上结果丰富了鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位图谱,为EDⅢ蛋白相关功能的进一步研究和鸭坦布苏病毒鉴别诊断奠定了基础。
郑晓星[9]（2012）在《产气荚膜梭菌plc和NetB基因的表达及单克隆抗体制备与鉴定》文中进行了进一步梳理产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, C. perfringens）是一种重要的人兽共患病病原体,广泛分布于自然界,导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症,以及人类的气性坏疽和食物中毒。产气荚膜梭菌分泌的多种毒素在其引发的疾病中具有重要作用。本实验对所有产气荚膜梭菌均能分泌的α毒素与另一种新型毒素NetB毒素进行原核表达,通过PCR方法分别扩增编码α毒素去除信号肽后的plc基因片段和去除信号肽的NetB基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc和pGEX-NetB,经双酶切鉴定和序列测定后转化至大肠杆菌BL211（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,当1.0mmol/L IPTG诱导5h时重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,两个重组蛋白的相对分子质量分别为66kDa和62kDa。表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备单克隆抗体。将纯化蛋白pGEX-plc和pGEX-NetB免疫BALB/c小鼠,加强免疫3d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆后获得9株分泌抗plc单克隆抗体的杂交瘤细胞（分别命名为H8C11、F4D9、F4C3、H11H12、F4G12、H8F8、 A10H9、A10E5和G7H8）和5株分泌抗NetB单克隆抗体的杂交瘤细胞（分别命名为D6H8、 F9G3、E7G2、E11C11和E7B11）。经Ig亚类鉴定试剂盒检测,表明A10E5和A10H9属于IgG2a, D6H8属于IgG2b,其余均属于IgG1。Western blot结果表明所有单克隆抗体均与相应的融合蛋白反应并出现特异性条带,其中A10H9和A10E5能够识别产气荚膜梭菌分泌的a毒素。制备的H8C11、F4D9、F4C3、D6H8、F9G3和E7G2腹水经辛酸-饱和硫酸铵法纯化后可见清晰的IgG的重链和轻链,分子量大小分别约为58kDa和26kDa。经间接ELISA方法检测,腹水中单克隆抗体的效价明显高于杂交瘤细胞上清,并且体外传代10次以上的杂交瘤细胞仍具有稳定分泌单克隆抗体的能力。抗α毒素杂交瘤细胞染色体的平均数量为91.1条,抗NetB毒素杂交瘤细胞染色体的平均数量为88.2条,均多于SP2/0细胞的56条染色体。免疫荧光试验证明,7株抗plc单克隆抗体（除G7H8和H11H12以外）能够结合产气荚膜梭菌的菌体表面。中和试验证明本实验制备的所有抗plc单克隆抗体都具有a毒素中和活性。
田丽红[10]（2010）在《虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究》文中研究指明猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus,FPV）引起猫科动物以高热、呕吐、脱水、白细胞严重减少和出血性肠炎为主要特征的急性、高度接触性传染病。在自然条件下,FPV可感染虎、豹、狮、水貂、浣熊等多种食肉类动物,具有很高的致死率,严重威胁圈养及野生虎等大型猫科动物的养殖和保护,迫切需要建立能够同时大批量检测多种动物FPV感染的通用诊断方法。VP2蛋白为FPV主要结构蛋白,是FPV衣壳的主要成分,暴露在衣壳蛋白表面,为FPV的主要免疫保护性抗原蛋白,能诱导机体产生中和抗体,是研究FPV诊断抗原制备的首选对象。目前,尚未见有利用原核表达系统完整表达VP2基因的报道。本研究利用CRFK细胞对某东北某虎林园发生传染性出血性肠炎的老虎粪便进行了病毒的分离和鉴定,对分离的虎源FPV保护性抗原VP2蛋白全长基因进行克隆与遗传变异分析。在此基础上,利用原核表达载体PGEX-6P-1在BL21宿主菌中表达该基因。以表达的重组VP2蛋白作为抗原,通过建立检测家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA方法来研究2种属来源FPV VP2蛋白的抗原特性变化及该蛋白作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。基于VP2蛋白为检测FPV优势诊断抗原特性,利用纯化的重组VP2蛋白替代传统的全病毒成份作为诊断抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的SPA作为广谱第二抗体,初步建立适用于2种猫科动物猫泛白细胞减少症血清抗体检测的SPA-ELISA方法。用建立的SPA-ELISA方法对临床30份猫血清样本、86份虎血清样本进行检测,同时与HI、间接ELISA方法进行比较。在此基础上,以纯化的重组VP2蛋白为免疫原,FPV全病毒作为筛选抗原,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备虎源FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体。结果如下：利用CRFK细胞从老虎粪便中成功分离出强毒株FPV-HLJ2,测得该毒株VP2基因全长为1755个核苷酸,编码584个氨基酸。序列分析表明该病毒与虎源FPV-HLJ株核苷酸同源性为100%,实为同一毒株。利用原核表达系统实现了虎源FPVVP2基因的表达,SDS-PAGE和Western blot显示表达产物以包涵体形式存在,大小约为84 ku,并具有抗原性。其中目的蛋白58 ku, GST标签蛋白26ku。在家猫猫泛白细胞减少症间接ELISA抗体检测法的应用中,该外源表达蛋白亦显示出很好的抗原特异性,VP2蛋白上一些位点氨基酸的变异并未影响FPV抗原性,表达的重组VP2蛋白可以作为诊断抗原用于家猫FPV抗体的间接ELISA检测,初步证明该蛋白具有作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。以纯化的重组VP2蛋白替代传统的全病毒成份作为诊断抗原,建立了SPA-ELISA方法,确定了检测2种猫科动物FPV抗体的SPA-ELISA最佳操作程序,批内及批间重复试验均显示变异系数小于10%。对临床30份猫血清样本、86份虎血清样本的对比检测结果显不,SPA-ELISA方法检出率较高,大于HI法的检出率,与间接ELISA法接近。三种检测方法检测猫血清的总体符合率为96.7%。在虎血清检测中,SPA-ELISA方法的阳性检出率亦高于HI方法,二者总体符合率为94.2%。以重组VP2蛋白作为免疫抗原,用FPV全病毒作为筛选抗原,采用传统的杂交瘤技术,经过间接ELISA方法筛选和有限稀释法亚克隆,最终获得了1株可稳定分泌虎源FPVVP2蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C4。间接ELISA方法测定3C4株单抗腹水效价为1：12800,亚类鉴定为IgG2a类型,间接免疫荧光鉴定试验显示,该株单抗能使接种虎源FPV的CRFK细胞产生亮绿色荧光,而免疫印迹试验显示该株单抗未见特异性反应带。本研究初步明确了2种属来源的FPV抗原性差异,实现了FPV VP2蛋白的初步实践应用。基于FPV VP2蛋白建立的SPA-ELISA诊断方法,解决了目前虎等猫科动物FPV抗体检测方法非常单一、不能大批量检测等问题,有望用于豹、狮、熊猫、豹猫、浣熊、水貂、猞猁等更多种类动物血清猫泛白细胞减少症病毒抗体的检测。对实现适用于更多种圈养及野生猫科动物等猫瘟热病的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定具有重要意义。基于FPV VP2蛋白制备的FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体,为FPV、CPV和MEV诊断及分子生物学研究提供一种更为敏感和特异的试剂。
二、一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）犬NGAL作为急性肾损伤早期诊断敏感标志物的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一 犬急性肾损伤研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 致病因素 |
| 2.1 肾前性AKI |
| 2.2 肾性AKI |
| 2.3 肾后性AKI |
| 3 临床症状 |
| 4 病理机制 |
| 4.1 肾前性AKI发病机制 |
| 4.2 肾性AKI发病机制 |
| 4.3 肾后性AKI发病机制 |
| 4.4 犬AKI代谢和机能变化 |
| 5 诊断 |
| 5.1 犬急性肾损伤分级标准现状 |
| 5.2 血常规检查 |
| 5.3 尿常规检查 |
| 5.4 特异性检查 |
| 6 治疗 |
| 6.1 特异性疗法 |
| 6.2 支持疗法 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 NGAL在犬AKI诊断中的应用 |
| 1 概述 |
| 2 急性肾损伤分子标志物及其诊断意义 |
| 2.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C |
| 2.2 白介素-18 |
| 2.3 肾损伤分子 |
| 2.4 视黄醇结合蛋白 |
| 2.5 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白 |
| 3 NGAL与AKI的相关性 |
| 3.1 NGAL对肾脏替代治疗的临床价值 |
| 3.2 NGAL在AKI预后评估的临床价值 |
| 3.3 NGAL在AKI中的诊断意义 |
| 4 NGAL检测方法的研究进展 |
| 5 研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 犬I/R-AKI模型的建立及其诊断标志物的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 常规检查 |
| 2.2 肾脏病理组织学检查 |
| 2.3 BUN、sCr检测 |
| 2.4 uNGAL和sNGAL检测 |
| 2.5 ROC曲线 |
| 2.6 实时定量RT-PCR |
| 2.7 免疫组化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 犬NGAL单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 犬NGAL目的基因扩增 |
| 2.2 重组表达质粒的构建 |
| 2.3 NGAL重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 2.4 间接ELISA的棋盘滴定 |
| 2.5 间接ELISA检测免疫血清效价 |
| 2.6 细胞融合及杂交瘤细胞株筛选 |
| 2.7 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.8 抗体亲和力 |
| 2.9 Western Blotting验证单克隆抗体 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 犬NGAL双抗体夹心ELISA的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 实验动物门诊检查 |
| 2.2 NGAL单克隆抗体抗原结合位点分析及配对验证 |
| 2.3 犬NGAL双抗体夹心ELISA优化 |
| 2.4 NGAL双抗体夹心ELISA检测试剂的参数 |
| 2.5 临床样品对比检测分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 犬NGAL双抗体夹心ELISA在AKI诊断中的应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病例资料统计与分组 |
| 2.2 sNGAL的ELISA检测 |
| 2.3 uNGAL、UNCR的测定 |
| 2.4 不同疾病NGAL的比较分析 |
| 2.5 复诊 |
| 2.6 ROC曲线分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文创新点 |
| 本论文有待改进之处和下一步工作计划 |
| 试验主要溶液试剂及配置方法 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备及免疫检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脂环酸芽孢杆菌简介 |
| 1.1.1 脂环酸芽孢杆菌的发现历史 |
| 1.1.2 脂环酸芽孢杆菌的特性 |
| 1.1.3 脂环酸芽孢杆菌的分布 |
| 1.1.4 脂环酸芽孢杆菌的危害 |
| 1.2 脂环酸芽孢杆菌的检测方法 |
| 1.2.1 脂环酸芽孢杆菌及其芽孢的检测 |
| 1.2.2 脂环酸芽孢杆菌代谢物的检测 |
| 1.3 抗体研究进展 |
| 1.3.1 多克隆抗体 |
| 1.3.2 单克隆抗体 |
| 1.3.3 基因工程抗体 |
| 1.4 免疫分析方法研究进展 |
| 1.4.1 放射免疫分析 |
| 1.4.2 荧光免疫分析 |
| 1.4.3 酶联免疫吸附分析 |
| 1.4.4 胶体金免疫技术 |
| 1.4.5 化学发光免疫分析 |
| 1.4.6 免疫传感器 |
| 1.5 选题背景与研究内容 |
| 1.5.1 选题背景与依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 技术路线图 |
| 第二章 脂环酸芽孢杆菌细胞壁特异蛋白鉴定 |
| 2.1 试验材料、试剂和设备 |
| 2.1.1 供试菌株及培养基 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细菌培养 |
| 2.2.2 A.acidoterrestris细胞壁蛋白的提取 |
| 2.2.3 A.acidoterrestris细胞壁蛋白的纯化 |
| 2.2.4 双向电泳 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 胶内酶解 |
| 2.2.7 MALDI-TOF MS鉴定 |
| 2.2.8 生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 A.acidoterrestris细胞壁蛋白双向电泳图谱 |
| 2.3.2 A.acidoterrestris细胞壁蛋白免疫原性分析 |
| 2.3.3 免疫原性蛋白的质谱鉴定 |
| 2.3.4 蛋白功能分析 |
| 2.3.5 蛋白相互作用预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 脂环酸芽孢杆菌免疫原性蛋白的原核表达 |
| 3.1 试验材料、试剂和设备 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 试验材料 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 A.acidoterrestris免疫原性蛋白相关基因的克隆 |
| 3.2.2 A.acidoterrestris免疫原性蛋白的原核表达 |
| 3.2.3 重组蛋白的纯化 |
| 3.2.4 重组蛋白免疫原性的验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 |
| 3.3.2 重组表达载体的构建 |
| 3.3.3 融合蛋白的原核表达 |
| 3.3.4 融合蛋白的纯化 |
| 3.3.5 融合蛋白免疫原性的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备 |
| 4.1 试验材料、试剂和设备 |
| 4.1.1 供试菌株、实验动物及细胞株 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 小鼠免疫 |
| 4.2.2 间接ELISA测定血清效价 |
| 4.2.3 细胞融合 |
| 4.2.4 选择性培养 |
| 4.2.5 杂交瘤细胞的筛选与亚克隆 |
| 4.2.6 杂交瘤细胞的扩大培养与冻存和复苏 |
| 4.2.7 单克隆抗体的大量制备 |
| 4.2.8 单克隆抗体的纯化 |
| 4.2.9 单克隆抗体的鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 动物免疫 |
| 4.3.2 杂交瘤细胞株的筛选 |
| 4.3.3 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 4.3.4 单克隆抗体效价测定 |
| 4.3.5 SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体 |
| 4.3.6 Western blot验证抗体特异性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 脂环酸芽孢杆菌间接夹心ELISA的建立与评价 |
| 5.1 试验材料、试剂和设备 |
| 5.1.1 供试菌株 |
| 5.1.2 试验材料 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 间接夹心ELISA实验流程 |
| 5.2.2 间接夹心ELISA最适参数的优化 |
| 5.2.3 间接夹心ELISA性能的评价 |
| 5.2.4 人为污染果汁中脂环酸芽孢杆菌的检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 间接夹心ELISA最适条件优化 |
| 5.3.2 间接夹心ELISA性能的评价 |
| 5.3.3 人为污染苹果汁的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 基于比色和荧光双模式的脂环酸芽孢杆菌免疫检测方法的建立与评价 |
| 6.1 试验材料、试剂和设备 |
| 6.1.1 供试菌株 |
| 6.1.2 试验材料 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 双通道免疫检测体系的可行性 |
| 6.2.2 双通道免疫检测体系实验流程 |
| 6.2.3 双通道免疫检测体系最适参数的优化 |
| 6.2.4 方法性能的评价 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 双通道免疫检测体系的建立 |
| 6.3.2 双通道免疫检测体系最适参数的优化 |
| 6.3.3 双通道免疫检测体系性能评价 |
| 6.3.4 人为污染苹果汁中A.acidoterrestris的检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论、创新点和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）重组贝伐珠单抗细胞培养工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 第一章 综述 |
| 1.1 单克隆抗体药物概述 |
| 1.1.1 单克隆抗体药物分类 |
| 1.1.2 单克隆抗体药物的应用和发展现状 |
| 1.1.3 重组贝伐珠单抗 |
| 1.2 单克隆抗体细胞培养 |
| 1.2.1 动物细胞表达系统 |
| 1.2.2 动物细胞培养工艺 |
| 1.2.3 影响单抗细胞培养工艺特性的培养条件 |
| 1.2.4 细胞培养过程对抗体质量的影响 |
| 1.3 本文研究内容、目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 培养基及试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 细胞培养方法 |
| 2.2.1 种子复苏和细胞扩增 |
| 2.2.2 分批培养(batch) |
| 2.2.3 分批补料培养(fed-batch) |
| 2.3 细胞培养过程参数检测方法 |
| 2.3.1 活细胞密度检测 |
| 2.3.2 培养过程参数检测 |
| 2.4 抗体表达量、抗体电荷异质性及抗体糖型检测方法 |
| 2.4.1 抗体含量测定方法 |
| 2.4.2 抗体电荷异质性检测 |
| 2.4.3 抗体糖型检测 |
| 2.5 抗体表达量及抗体电荷异质性检测方法学验证 |
| 2.5.1 抗体表达量检测方法验证(Titer-HPLC) |
| 2.5.2 抗体电荷异质性检测方法验证(CEX-HPLC) |
| 2.5.3 验证结论 |
| 第三章 rCHO细胞生长代谢及其培养条件筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.2.1 基础培养条件筛选单因素实验设计 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同的初始活细胞密度对细胞生长的影响 |
| 3.3.2 不同培养温度对细胞生长的影响 |
| 3.3.3 变温活细胞密度对细胞生长的影响 |
| 3.3.4 基础培养基对细胞生长的影响 |
| 3.3.5 补料培养基对细胞生长的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 补料策略及铜离子对rCHO细胞代谢的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计及结果 |
| 4.2.1 补料策略和铜离子对细胞生长乳酸代谢的影响实验 |
| 4.2.2 DoE实验设计及其验证实验 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 添加物对细胞抗体质量的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验设计 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 铜离子对两种混合培养基(空白对照组)的细胞生长代谢和抗体浓度、质量的影响 |
| 5.3.2 铜离子和锰离子对细胞抗体浓度和质量的影响 |
| 5.3.3 铜离子和锰离子对细胞抗体浓度和糖型的交互作用 |
| 5.3.4 岩藻糖(Fucose)对细胞生长和抗体浓度、糖型的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 主要参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 乙型流感病毒综述 |
| 1.1.1 流感病毒的分类和命名 |
| 1.1.2 乙型流感病毒的结构 |
| 1.1.3 乙型流感的编码蛋白 |
| 1.1.4 流感病毒的生命周期 |
| 1.1.5 乙型流感的进化 |
| 1.1.6 乙型流感的宿主 |
| 1.1.7 乙型流感的流行病学和临床特征 |
| 1.1.8 乙型流感的抗病毒治疗及预防 |
| 1.2 流感病毒血凝素广谱单抗的研究概述 |
| 1.2.1 甲型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
| 1.2.2 乙型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
| 1.2.3 乙型流感病毒血凝素广谱单抗的中和机制 |
| 1.2.4 流感病毒血凝素广谱单抗的制备策略 |
| 1.3 本研究的意义及主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究中用到的主要仪器 |
| 2.2 主要试剂及实验动物 |
| 2.2.1 E.coli菌株 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2.3 细胞株 |
| 2.2.4 流感病毒 |
| 2.2.5 实验动物 |
| 2.2.6 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.2.7 其他常规试剂 |
| 2.3 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.3.1 细胞培养用溶液的配制 |
| 2.3.2 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.3.3 抗原和分子检测用溶液的配置 |
| 2.3.4 病毒培养及检测用溶液的配置 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.4.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.4.3 流感病毒相关实验方法 |
| 2.4.4 鼠单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.4.5 免疫学相关实验方法 |
| 2.4.6 单抗可变区编码序列的测定及分析 |
| 2.4.7 单克隆抗体Fab片段的制备 |
| 2.4.8 人鼠嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 2.4.9 高效排阻色谱和抗体亲和力测定方法 |
| 2.4.10 逃逸突变病毒株筛选方法 |
| 2.4.11 小鼠动物实验方法 |
| 2.4.12 雪貂动物实验方法 |
| 2.4.13 结构生物学相关实验方法 |
| 2.4.14 抗体中和机制研究相关实验方法 |
| 2.4.15 本研究的抗体和病毒序列在Genbank中的检索号 |
| 2.4.16 本研究的统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗的筛选与鉴定 |
| 3.1.1 乙型流感的进化及抗原性分析 |
| 3.1.2 乙型流感RBS区广谱单抗制备策略的初步摸索 |
| 3.1.3 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗活性鉴定 |
| 3.1.4 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗研究小结 |
| 3.2 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的筛选与鉴定 |
| 3.2.1 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的诱导 |
| 3.2.2 乙型流感RBS区多功能性广谱单抗的筛选 |
| 3.2.3 乙型流感RBS区广谱单抗12G6体外抗病毒活性鉴定 |
| 3.2.4 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体外抗病毒活性鉴定 |
| 3.2.5 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体内保护活性鉴定 |
| 3.2.6 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6识别表位鉴定 |
| 3.2.7 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6中和病毒机制分析 |
| 3.2.8 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6研究小结 |
| 3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的筛选与鉴定 |
| 3.3.1 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的制备 |
| 3.3.2 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的初步活性鉴定 |
| 3.3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗嵌合抗体的制备 |
| 3.3.4 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体外抗病毒活性鉴定 |
| 3.3.5 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体内保护活性分析 |
| 3.3.6 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗识别表位分析 |
| 3.3.7 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗抗病毒机制分析 |
| 3.3.8 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗研究小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 流感HA广谱表位诱导机体产生有效免疫应答的困难与对策 |
| 4.2 多功能抗体作为新型治疗性药物的重要性 |
| 4.3 IgM广谱抗体在防治高变异病原体中的重要性 |
| 4.4 流感HA广谱抗体应用于流感治疗的前景与挑战 |
| 4.5 流感HA广谱表位应用于通用流感疫苗设计的前景与挑战 |
| 4.6 本研究的局限性 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（6）转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 溶栓药物与人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)及其重组突变体的研究进展 |
| 1 血栓的概述 |
| 1.1 血栓的形成 |
| 1.2 溶栓机理 |
| 2 溶栓药物及其市场发展前景 |
| 2.1 溶栓药物的发展历程 |
| 2.2 溶栓药物的市场发展前景 |
| 3 人组织纤溶酶原激活剂的概述 |
| 3.1 概念及溶栓原理 |
| 3.2 人组织纤溶酶原激活剂的发展简史 |
| 3.3 人组织纤溶酶原激活剂的结构与功能分析 |
| 4 重组突变体人组织纤溶酶原激活剂的研究 |
| 4.1 国外的研究情况 |
| 4.2 国内的研究情况 |
| 5 问题与展望 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1 乳腺生物反应器的概述 |
| 2 乳腺生物反应器的转基因技术 |
| 2.1 逆转录病毒载体法(retrovirus-mediated gene transfer) |
| 2.2 原始生殖细胞介导法(primordial germ cells,PGCs) |
| 2.3 精子载体法(sperm mediated gene transfer) |
| 2.4 胚胎干细胞技术(embryonic stem cell,ESC) |
| 2.5 体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transplantation,SCNT) |
| 2.6 显微原核注射法(pronuclear microinjection) |
| 3 乳腺生物反应器的目标动物选择 |
| 4 乳腺生物反应器的应用 |
| 4.1 转基因动物乳腺生物反应器模型的建立 |
| 4.2 改善乳汁成分,提高其营养价值 |
| 4.3 生产(重组)医药蛋白 |
| 4.4 利用乳腺生物反应器生产t-PA及其重组突变体 |
| 5 展望与问题 |
| 第三章 乳蛋白分离纯化的研究进展 |
| 1 蛋白分离纯化的概述 |
| 1.1 一般蛋白的分离纯化 |
| 1.2 乳腺生物反应器生产重组蛋白的分离纯化 |
| 2 乳蛋白常用分离纯化技术(层析技术) |
| 2.1 反相层析(Reversed phase chromatography,RPC) |
| 2.2 疏水层析(Hydrophobic interaction chromatography,HIC) |
| 2.3 离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC) |
| 2.4 凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography,GFC) |
| 2.5 亲和层析(Affinity chromatography,AC) |
| 3 t-PA及其重组突变体的分离纯化 |
| 4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 前言 |
| 第一章 乳腺特异性表达rhPA基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种及质粒 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 分子生物学试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 DNA分析软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规分子生物学的操作方法 |
| 2.2 质粒酶切反应 |
| 2.3 酶切产物的回收 |
| 2.4 连接反应 |
| 2.5 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)基因的PCR扩增与克隆 |
| 2.6 乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA的构建 |
| 2.7 乳腺特异性表达载体BLC14/rhPA的构建 |
| 2.8 乳腺特异性表达载体AP/rhPA的构建 |
| 2.9 PCR检测插入rhPA基因片段的正反向 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增产物rhPA的T-A克隆 |
| 3.2 载体PCL25/rhPA的构建 |
| 3.3 载体BLC14/rhPA的构建 |
| 3.4 载体AP/rhPA的构建 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞(GMECs)中的初步验证 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械与仪器 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 山羊乳腺上皮细胞分离和培养 |
| 2.2 外源基因电转染山羊乳腺上皮细胞及筛选 |
| 2.3 抗性细胞株的PCR整合检测 |
| 2.4 山羊乳腺上皮细胞诱导表达rhPA的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 乳腺上皮细胞的分离纯化培养及生长特点 |
| 3.2 转基因乳腺上皮细胞单克隆细胞株的获得 |
| 3.3 ELISA检测乳腺上皮细胞诱导rhPA表达 |
| 3.4 FAPA检测诱导液体外溶栓活性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 rhPA转基因免的制备及其乳腺表达特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂及药品 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因的准备 |
| 2.2 转rhPA基因免的制备 |
| 2.3 转基因免的整合检测 |
| 2.4 转基因兔乳腺表达产物分析 |
| 2.5 转基因免的传代及纯合子培育 |
| 2.6 荧光定量PCR检测转基因免的拷贝数 |
| 3 结果 |
| 3.1 显微注射基因片段的回收 |
| 3.2 转基因兔的获得与传代 |
| 3.3 转基因免乳清的E LISA检测结果 |
| 3.4 转基因免乳清的SDS-PAGE电泳和Western Blot检测结果 |
| 3.5 体外溶栓检测结果 |
| 3.6 Real-time PCR结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 rhPA单克隆抗体的制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞株/系 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂及药品 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 细胞融合过程 |
| 2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.4 杂交瘤细胞株的克隆化 |
| 2.5 杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.6 杂交瘤细胞株的特异性鉴定、稳定性分析及建株 |
| 2.7 PR-mAb的筛选 |
| 2.8 rhPA单克隆抗体的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 两种不同方法的免疫小鼠血清效价检测结果 |
| 3.2 两种不同方法的细胞融合结果 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆(克隆化)及稳定性 |
| 3.5 杂交瘤细胞株的建立及其分泌抗体特异性检测 |
| 3.6 PR-mAb的筛选结果 |
| 3.7 腹水的制备及效价测定 |
| 3.8 腹水抗体的纯化及鉴定 |
| 3.9 纯化抗体效价浓度和特异性反应结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 转基因免乳中rhPA的分离纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 乳原料 |
| 1.2 主要器材 |
| 1.3 主要试剂及药品 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 转基因兔乳前处理 |
| 2.2 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rhPA |
| 2.3 凝胶过滤法进一步精纯 |
| 2.4 双向电泳鉴定纯化产物 |
| 2.5 飞行时间质谱鉴定纯化产物 |
| 2.6 圆二色谱分析纯化产物的二级结构 |
| 2.7 FAPA测定纯化产物(rhPA)的比活性 |
| 3 结果 |
| 3.1 乳样前处理的结果 |
| 3.2 亲和层析柱的制备 |
| 3.3 亲和层析洗脱条件优化结果 |
| 3.4 凝胶过滤不同上样体积优化结果 |
| 3.5 纯化产物的初步鉴定 |
| 3.6 双向电泳的结果与分析 |
| 3.7 飞行时间质谱与圆二色谱结果 |
| 3.8 纯化产物rhPA的比活性计算 |
| 4 讨论 |
| 第六章血栓模型与溶栓动物试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器和材料 |
| 1.3 主要试剂和药品 |
| 2 方法 |
| 2.1 纯化产物去除内毒素 |
| 2.2 内毒素检测 |
| 2.3 血栓动物模型的制备 |
| 2.4 溶栓动物试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 去内毒素及检测结果 |
| 3.2 血栓模型制备结果 |
| 3.3 溶栓动物试验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 全文结论与创新点 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文 |
（7）抗体压下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1. 禽流感病毒的发现和发展 |
| 1.1 禽流感病毒的发现 |
| 1.2 主要的HPAI爆发事件 |
| 1.3 低致病性禽流感研究现状及其对公共安全影响 |
| 2. 禽流感的结构和编码的蛋白 |
| 2.1 禽流感的结构 |
| 2.2 聚合酶蛋白(PA,PB1和PB2蛋白) |
| 2.3 血凝素(HA) |
| 2.4 神经氨酸酶(NA) |
| 2.5 核蛋白(NP) |
| 2.6 基质蛋白(M) |
| 2.7 非结构蛋白(NS) |
| 3. HA产生抗体的部位及抗体的特性 |
| 3.1. HA头部产生的抗体 |
| 3.2 对H1广谱反应的CH65抗体 |
| 3.3 不同亚型的中和抗体 |
| 3.4 单一loop中和性抗体 |
| 3.5 针对茎部的广谱抗体 |
| 3.6 中和1组禽流感的抗体 |
| 3.7 中和2组禽流感的抗体 |
| 3.8 中和所有禽流感的抗体 |
| 3.9 B类流感的广谱中和抗体 |
| 3.10 总结和展望 |
| 研究内容一：抗H9N2病毒HA和NA克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞及实验动物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 A/chicken/Jiangsu/x1/2004(H9N2)(X1)病毒扩增 |
| 2.2 单克隆抗体研制 |
| 2.3 IFA筛选阳性杂交瘤细胞 |
| 2.4 杂交瘤细胞亚克隆 |
| 2.5 HI试验 |
| 2.6 H9N2 HA构建pcDNA-HA转染293T细胞筛分析单克隆抗体 |
| 2.7 单克隆抗体与不同毒株的免疫反应性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 获得多株抗H9N2特异性单克隆抗体 |
| 3.2 单克隆抗体HI检测分析 |
| 3.3 HI阴性的抗HA单抗的鉴定 |
| 3.4 抗NA单克隆抗体的鉴定结果 |
| 4. 讨论 |
| 研究内容二：抗体压力下H9N2病毒HA蛋白抗原位点氨基酸变异分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞及实验动物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 抗体亚类鉴定 |
| 2.3 腹水制备 |
| 2.4 HA和HI检测腹水效价 |
| 2.5 IFA检测腹水IF效价 |
| 2.6 MN试验 |
| 2.7 逃逸株的制备方法 |
| 2.8 野毒株和逃逸株HA测序 |
| 2.9 序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗HA单克隆抗体的亚类鉴定以及腹水抗体效价鉴定 |
| 3.2 单克隆抗体的特异性检测 |
| 3.3 单克隆抗体的病毒逃逸株 |
| 3.4 逃逸株和原始病毒对mAbs的交叉反应实验 |
| 3.5 抗体逃逸株的HA基因序列分析 |
| 3.6 田间野毒氨基酸的变异分析结果 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三：抗体压力下H9N2 NA抗原位点氨基酸变异分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞及实验动物 |
| 1.3 培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 亚类鉴定 |
| 2.2 腹水制备 |
| 2.3 腹水纯化 |
| 2.4 HA试验 |
| 2.5 MN试验 |
| 2.6 抗体逃逸株的制备方法 |
| 2.7 野毒株和抗体逃逸株NA序列分析 |
| 2.8 序列分析 |
| 2.9 NI试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗NA单克隆抗体生物学特性 |
| 3.2 筛选单克隆抗体的X1株H9N2病毒抗体逃逸株 |
| 3.3 单克隆抗体对原始病毒和抗体逃逸株的抑制作用 |
| 3.4 抗体逃逸株的测序结果分析 |
| 3.5 田间野毒NA氨基酸的变异分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容四：HI阴性抗HA单克隆抗体与HA结合位点的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞及实验动物 |
| 1.3 培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 亚类鉴定 |
| 2.2 腹水制备 |
| 2.3 腹水纯化 |
| 2.4 HA试验 |
| 2.5 MN试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 2A8单克隆抗体生物学特点 |
| 3.2 2A8单克隆抗体的抗体逃逸株 |
| 3.3 抗体逃逸株的测序分析 |
| 3.4 田间野毒氨基酸的变异结果分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定及囊膜蛋白抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 鸭坦布苏病毒的概述 |
| 1 病原学分类 |
| 2 形态结构及理化培养特性 |
| 3 基因结构及蛋白特性 |
| 4 流行病学特征 |
| 5 病毒对动物的致病性 |
| 6 病毒感染的诊断方法 |
| 6.1 临床诊断 |
| 6.2 实验室诊断 |
| 7 预防和控制 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病料的采集及处理 |
| 2.2 接种SPF鸡胚分离毒株 |
| 2.3 RT-PCR鉴定鸭坦布苏病毒 |
| 2.4 血凝试验 |
| 2.5 分离毒株的细胞培养 |
| 2.6 空斑形成试验 |
| 2.7 引物设计 |
| 2.8 基因组RT-PCR扩增 |
| 2.9 基因克隆及测序 |
| 2.10 序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 疑似鸭坦布苏病毒病病鸭的病变特征 |
| 3.2 DTMUV XZ-2012株的分离与RT-PCR鉴定 |
| 3.3 DTMUV XZ-2012株接种BHK-21细胞的病变特征 |
| 3.4 DTMUV XZ-2012空斑形成试验结果 |
| 3.5 DTMUV XZ-2012株全基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.6 DTMUV XZ-2012株基因序列分析 |
| 3.7 DTMUV XZ-2012株基因进化树和同源性分析 |
| 3.8 DTMUV XZ-2012株各基因与BYD株和Shandong1株的比较分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DTMUV EDⅢ蛋白的表达及纯化 |
| 2.2 小鼠免疫 |
| 2.3 SP2/O骨髓瘤细胞的复苏及准备 |
| 2.4 饲养细胞的制备 |
| 2.5 免疫小鼠脾细胞的制备 |
| 2.6 细胞融合 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.8 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)培养以及冻存 |
| 2.9 单克隆抗体的制备 |
| 2.10 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体的间接免疫荧光(IFA)分析 |
| 2.12 抗体分泌稳定性的鉴定 |
| 2.13 腹水抗体效价测定 |
| 2.14 单克隆抗体亚类和型的鉴定 |
| 2.15 单克隆抗体与日本脑炎病毒的反应检测 |
| 2.16 单克隆抗体中和活性的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗原的制备纯化结果 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3 Western blot分析结果 |
| 3.4 间接免疫荧光(IFA)分析结果 |
| 3.5 抗体分泌稳定性的鉴定结果 |
| 3.6 腹水抗体效价测定结果 |
| 3.7 单克隆抗体亚类和型的鉴定结果 |
| 3.8 单克隆抗体与日本脑炎病毒的交叉反应结果 |
| 3.9 单克隆抗体中和活性的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DTMUV NS1蛋白的表达及纯化 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 SP2/O骨髓瘤细胞的复苏及准备 |
| 2.4 饲养细胞的制备 |
| 2.5 免疫小鼠脾细胞的制备 |
| 2.6 细胞融合 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.8 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)培养以及冻存 |
| 2.9 单克隆抗体的制备 |
| 2.10 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体的间接免疫荧光(IFA)分析 |
| 2.12 抗体分泌稳定性的鉴定 |
| 2.13 腹水抗体效价测定 |
| 2.14 单克隆抗体亚类和型的鉴定 |
| 2.15 单克隆抗体与日本脑炎病毒的反应检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗原的制备纯化结果 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3 Western blot分析 |
| 3.4 间接免疫荧光(IFA)分析结果 |
| 3.5 抗体分泌稳定性的鉴定结果 |
| 3.6 腹水抗体效价测定结果 |
| 3.7 单克隆抗体亚类和型的鉴定结果 |
| 3.8 单克隆抗体与日本脑炎病毒的交叉反应结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白B细胞表位的鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计 |
| 2.2 目的基因的扩增 |
| 2.3 目的基因与pGEX-6p-I载体的酶切处理 |
| 2.4 重组质粒的构建 |
| 2.5 感受态的制备及转化 |
| 2.6 重组质粒的鉴定 |
| 2.7 目的蛋白的表达与鉴定 |
| 2.8 目的蛋白的SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.9 EDⅢ蛋白B细胞表位鉴定 |
| 2.10 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位的变异分析 |
| 2.11 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位交叉性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸭坦布苏病毒EDⅢ截短蛋白的表达 |
| 3.2 Western blot鉴定单克隆抗体与截短蛋白反应性 |
| 3.3 合成肽的ELISA鉴定 |
| 3.4 融合肽的表达及western blot鉴定 |
| 3.5 EDⅢ蛋白抗原表位的变异分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（9）产气荚膜梭菌plc和NetB基因的表达及单克隆抗体制备与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌的主要毒素 |
| 1.2 产气荚膜梭菌毒素的作用方式 |
| 1.2.1 具有损伤细胞膜作用的毒素 |
| 1.2.2 具有形成微孔作用的毒素 |
| 1.2.3 以不明方式作用于细胞膜的毒素 |
| 1.2.4 具有细胞内活性的毒素 |
| 1.2.5 水解酶 |
| 1.3 坏死性肠炎 |
| 1.3.1 NE临床症状与病理变化 |
| 1.3.2 α毒素与NE |
| 1.3.3 NetB毒素与NE |
| 1.3.4 NE疫苗的研究进展 |
| 1.4 单克隆抗体技术 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基和分子生物学试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.4 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.5 单克隆抗体的生物学活性鉴定 |
| 2.2.6 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增plc基因与NetB基因 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒的PCR鉴定与双酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒的序列鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4 单克隆抗体的制备 |
| 3.4.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.4.2 细胞融合 |
| 3.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与建立 |
| 3.4.4 腹水的制备与纯化 |
| 3.5 单克隆抗体的生物学活性鉴定 |
| 3.5.1 单克隆抗体效价与浓度的测定 |
| 3.5.2 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 3.5.3 间接ELISA检测分泌单克隆抗体稳定性 |
| 3.5.4 杂交瘤细胞的染色体计数 |
| 3.5.5 小鼠单克隆抗体Ig亚类鉴定 |
| 3.5.6 免疫荧光试验 |
| 3.5.7 体外中和试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒的构建及诱导表达 |
| 4.2 杂交瘤细胞的融合及筛选 |
| 4.3 杂交瘤细胞的扩大培养 |
| 4.4 腹水的制备及纯化 |
| 4.5 单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景(或引言) |
| 1.2 猫泛白细胞减少症病毒研究概况 |
| 1.2.1 病毒演化及分类学地位 |
| 1.2.2 FPV的形态学特征及理化学性质 |
| 1.2.3 FPV的细胞嗜性及其体外培养 |
| 1.2.4 FPV基因组结构 |
| 1.2.5 FPV基因组的复制与转录 |
| 1.2.6 FPV编码蛋白 |
| 1.3 猫泛白细胞减少症研究概况 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 诊断 |
| 1.3.4 防制 |
| 1.4 葡萄球菌A蛋白研究概况 |
| 1.4.1 SPA生物学特性 |
| 1.4.2 SPA应用 |
| 1.5 单克隆抗体在细小病毒研究上的应用 |
| 1.5.1 单克隆抗体概述 |
| 1.5.2 单克隆抗体在肉食兽细小病毒研究上的应用 |
| 1.6 课题研究的目的和意义 |
| 2 虎源猫泛白细胞减少症病毒的分离和鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株及菌株 |
| 2.1.2 病料 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂及其配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 金标记FPV试纸条检测 |
| 2.2.2 病毒分离 |
| 2.2.3 毒株的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离 |
| 2.3.2 血凝试验 |
| 2.3.3 电镜试验 |
| 2.3.4 VP2基因序列测定 |
| 2.3.5 人工感染幼猫试验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 病毒的分离 |
| 2.4.2 病毒的鉴定 |
| 2.5 本章小节 |
| 3 虎源FPV VP2基因的原核表达及其抗原特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 质粒载体与菌种 |
| 3.1.3 抗体和血清 |
| 3.1.4 主要试剂及其配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 VP2基因原核表达载体(PGEX-6P-VP2)的构建 |
| 3.2.2 重组VP2蛋白的诱导表达 |
| 3.2.3 重组VP2蛋白的纯化 |
| 3.2.4 重组VP2蛋白的Western blot分析 |
| 3.2.5 纯化重组VP2蛋白抗原特性研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 虎源FPV VP2基因原核表达载体的构建和鉴定 |
| 3.3.2 重组VP2蛋白的诱导表达 |
| 3.3.3 诱导表达条件的优化 |
| 3.3.4 表达产物的可溶性分析 |
| 3.3.5 重组VP2蛋白的纯化 |
| 3.3.6 纯化重组VP2蛋白Western blot分析 |
| 3.3.7 纯化重组VP2蛋白抗原特性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 表达基因的选择 |
| 3.4.2 表达载体的选择 |
| 3.4.3 VP2蛋白纯化 |
| 3.4.4 VP2蛋白抗原特性研究 |
| 3.4.5 纯化重组蛋白中的E.coli菌体成分 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 检测二种猫科动物猫瘟热抗体SPA-ELISA方法的建立及应用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 抗体和血清 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 虎抗FPV阳性血清的制备 |
| 4.2.2 SPA-ELISA方法的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 虎抗FPV阳性血清的制备 |
| 4.3.2 SPA-ELISA方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于FPV检测法 |
| 4.4.2 SPA-ELISA结果判定标准的确定 |
| 4.4.3 SPA-ELISA试验条件优化 |
| 4.4.4 ELISA操作规范 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 虎源FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体的制备 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 免疫抗原、检测抗原及细胞系 |
| 5.1.2 抗体和血清 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要试剂及其配制 |
| 5.1.5 主要设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 动物免疫 |
| 5.2.2 单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 5.2.3 饲养细胞的制备 |
| 5.2.4 骨髓瘤细胞的复苏与培养 |
| 5.2.5 脾细胞的制备 |
| 5.2.6 细胞融合 |
| 5.2.7 融合细胞的检测 |
| 5.2.8 阳性细胞的克隆 |
| 5.2.9 细胞冻存 |
| 5.2.10 细胞复苏 |
| 5.2.11 单克隆抗体腹水的制备 |
| 5.2.12 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 免疫小鼠血清抗体效价 |
| 5.3.2 ELISA检测抗原最佳包被浓度的确定 |
| 5.3.3 细胞融合与杂交瘤细胞株的建立 |
| 5.3.4 单抗腹水效价的测定和亚型鉴定 |
| 5.3.5 间接免疫荧光(IFA)鉴定试验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 免疫抗原的制备 |
| 5.4.2 单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 5.4.3 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 5.4.4 关于单抗制备影响因素 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]犬NGAL作为急性肾损伤早期诊断敏感标志物的研究[D]. 曹军. 扬州大学, 2021(02)
- [3]脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备及免疫检测方法研究[D]. 史一恒. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]重组贝伐珠单抗细胞培养工艺研究[D]. 丁钰. 贵州大学, 2020(03)
- [5]乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究[D]. 沈晨光. 厦门大学, 2018(08)
- [6]转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究[D]. 宋绍征. 扬州大学, 2016(02)
- [7]抗体压下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析[D]. 万志敏. 扬州大学, 2015(05)
- [8]鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定及囊膜蛋白抗原表位的鉴定[D]. 王钰. 南京农业大学, 2015(06)
- [9]产气荚膜梭菌plc和NetB基因的表达及单克隆抗体制备与鉴定[D]. 郑晓星. 东北农业大学, 2012(03)
- [10]虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究[D]. 田丽红. 东北林业大学, 2010(12)