一、不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义（论文文献综述）
郑路倩[1]（2021）在《新型自剪切型核酶twister-sister和hatchet的结构以及催化机制研究》文中进行了进一步梳理核酶是一类具有催化活性的非编码RNA分子,在细胞内参与多种重要的生命活动,包括t RNA加工、内含子剪切、蛋白质合成等。根据催化机制不同,核酶可被分为两类:金属依赖型核酶和自剪切型核酶。已有研究表明,自剪切型核酶一般采用广义酸碱催化机制进行位点特异性的自剪切。目前,已发现的自剪切型核酶一共有十类,hammerhead、HDV、VS、hairpin、glm S、twister、pistol、twister-sister、hatchet以及hovlinc。基于自剪切型核酶的催化特性,研究人员开发了多种人工系统应用于RNA体外转录、体内基因表达调控、基因编辑等。而自剪切型核酶的三级结构是研究其催化机制以及开发其相关应用的重要基础。本论文通过X-射线晶体学的方法分别解析了twister-sister核酶和hatchet核酶的三维空间结构,并对其催化机制进行了探讨。为了拿到全长twister-sister核酶的结构,我们在自剪切位点处引入了脱氧核糖核苷酸d C62（2’-H）,通过X-射线晶体学的方法,最终解析了分辨率为2（?）的全长twister-sister核酶的三维空间结构。通过三级结构分析,我们发现原本分散在不同结构单元L1和SL4上的高度保守碱基在三维空间结构中可以形成远距离相互作用。在酶切位点处的碱基C62和A63呈现伸展构象,其中,A63通过碱基堆积作用以及氢键相互作用被锚定在结构内部,而C62指向结构外侧,构象相对灵活。此外,我们发现酶切位点附近碱基G5的N1H与酶切位点处磷酸根的非桥接氧原子形成氢键相互作用,此结构特征同样存在于twister核酶。将G5突变为A、U或者C均会严重破坏twister-sister核酶的活性,证明此碱基在其催化反应中十分重要,但基于现有结果,我们尚无法判断其是否直接参与了催化过程。另外,在酶切位点处存在一系列镁离子,这些镁离子参与了酶切位点复杂氢键网络的形成。其中一个镁离子M2的一个配位水与模拟的2’-OH的距离为3（?）,此配位水有可能在催化过程中发挥广义碱的作用。twister-sister核酶的三级结构展示了其整体结构特征以及催化口袋结构特征,为研究其催化机制提供了重要的结构基础。在同期发现的三类新型自剪切型核酶中,hatchet核酶是唯一一类酶切位点位于近5’端的核酶。本文解析了分辨率为2.1（?）的hatchet核酶的3’产物结构,由于其保守序列以及主要的二级结构均位于3’产物,因而此结构可认为代表了全长hatchet核酶的整体结构。hatchet核酶3’产物的整体三级结构由两个近乎平行的长螺旋组成,环区L1与L3之间以及高度保守碱基之间形成了远距离相互作用从而稳定了整体结构。在三级结构中,原本位于近5’端的酶切位点经过折叠后处于整个结构的中心并被高度保守碱基包围。另外,我们发现催化口袋处形成了一个空穴,其大小足够容纳酶切位点处U1与C（-1）之间易断裂的磷酸根以及碱基C（-1）,基于此,本文建立了全长hatchet核酶处于酶切前构象的结构模型,模型中C（-1）以及酶切位点处的磷酸根可以与一系列高度保守碱基形成相互作用。其中,我们发现高度保守碱基G31与C（-1）的2’-OH之间的距离在形成氢键相互作用的范围内,而将G31突变为c7G31后会彻底破坏hatchet核酶的活性,这表明G31可能在催化过程中充当广义碱的角色。基于上述结果,我们进一步研究了hatchet核酶的催化性质。我们的研究不仅展示了hatchet核酶的整体结构特征以及催化口袋组成,还为进一步获得其全长结构以及明确其催化机制奠定了必要的结构基础。
李国华[2]（2020）在《西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究》文中提出西尼罗病毒病（West Nile virus disease,WND）是由西尼罗病毒（WNV）经蚊虫叮咬感染动物和人的、以西尼罗热（WNF）和西尼罗脑炎（WNE）为主要临床症状的人兽共患传染病。自1999年在美国纽约暴发以来,每年均有动物和人感染发病。据美国动植物卫生检验局（APHIS）统计,2002年美国确诊了12 527例马匹感染,为历史最高。针对传染性疾病,疫苗是最有效的防治手段之一。当前已有4株上市的马用西尼罗病毒疫苗。其中3株是灭活疫苗,1株为含有西尼罗病毒结构基因的金丝雀痘病毒活疫苗（该活疫苗在体内不能复制）。虽然4株疫苗经免疫后均具有良好的免疫保护效果,但是马匹均需要在首免后每年加强免疫一次,才能持续获得免疫保护,疫苗成本和人力成本随之增加。因此,急需研制一种免疫1～2次即可获得持久免疫力的西尼罗病毒活疫苗。流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株（JEV SA14-14-2）属于黄病毒科黄病毒属病毒,与WNV同科同属,是建立西尼罗病毒嵌合株活疫苗的优良载体。JEV SA14-14-2安全性高,自1989年JEV SA14-14-2上市以来,经过30余年的免疫接种,该疫苗未见明显的不良反应,有效控制了流行性乙型脑炎在我国的流行。其次,流行性乙型脑炎病毒和西尼罗病毒同科同属,基因组结构相似,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗容易构建成功。WNV NY99株导致的西尼罗脑炎（WNE）致死率高,严重威胁动物和人的生命健康。虽然我国在2011年从尖音库蚊体内分离到了西尼罗病毒,但还未有动物感染发病报道,因此选用危害较大的WNV NY99株进行疫苗研究。目的:建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,以JEV SA14-14-2为载体,构建含有西尼罗病毒pr MΔE基因的嵌合株病毒ChiVax-WN01,并验证其免疫原性,为研制经济高效的马用西尼罗病毒候选疫苗奠定基础。方法:（1）JEV SA14-14-2全基因组序列测定。本研究采用蚀斑纯化法,利用BHK-21细胞经3轮纯化获得JEV SA14-14-2蚀斑单克隆,并利用BHK-21细胞扩繁病毒。提取病毒RNA并反转录成c DNA,通过PCR方法分11段扩增病毒全长c DNA,分别连入p EASY-Blunt克隆载体测序。利用DNAStar和DNAMAN比对并拼接病毒全长基因组序列,获得JEV SA14-14-2全基因组c DNA序列。（2）建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统。利用DNAStar软件分析JEV SA14-14-2序列,选取4个单克隆酶切位点将病毒基因组全长分为5段（F1～F5）。利用分子生物学技术引入T7 promoter序列、HDVr序列、T7 terminator序列和内含子序列,分段连接5个片段,构建含有病毒全长c DNA的感染性克隆质粒p FLJEV。通过Lipofectamine 3000将p FLJEV转染BSR T7/5细胞拯救病毒。通过蚀斑形态、生长曲线和病毒核酸复制能力鉴定并比较拯救毒和母本毒的生物学特性。（3）西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01构建与鉴定。基于JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,将WNV NY99株（DQ211652）的prMΔE基因替换JEV SA14-14-2的pr MΔE基因,构建含有WNV NY99 pr MΔE基因的嵌合株感染性克隆质粒p ChiVax-WN01。利用Lipofectamine 3000将p ChiVax-WN01转染BSR T7/5细胞拯救病毒。鉴定并比较嵌合株病毒ChiVax-WN01的生物学特性。（4）西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01安全性与实验免疫研究。以BALB/c小鼠为动物模型,经腹腔分别注射105～101 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和JEV SA14-14-2母本毒,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠神经侵袭性。分别经颅内注射100 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和100 PFU JEV SA14-14-2,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠的神经毒性。为验证ChiVax-WN01免疫原性,以BALB/c小鼠为动物模型,分别腹腔接种100 PFU JEV SA14-14-2、100 PFU ChiVax-WN01和PBS,接种后1 d、3 d、5 d、7 d和9d分别取各组小鼠的血浆、脑、肝、脾、肺和肾,利用蚀斑法检测病毒在血液的增殖水平和内脏的分布。通过微量中和试验测定小鼠血清的中和抗体效价。通过ELISpot法测定脾淋巴细胞中分泌IFN-γ、IL-2和IL-4细胞的数量。结果:（1）获得JEV SA14-14-2全长序列,Gen Bank序列号为MK585066。（2）成功构建出JEV SA14-14-2感染性克隆质粒pFLJEV,转染拯救出在病毒滴度、生长动力学特征和蚀斑形态方面与母本病毒无明显差别的子代病毒,经电镜超薄切片可观察到完整病毒粒子。（3）成功构建出嵌合株病毒感染性克隆质粒p ChiVax-WN01,成功拯救出子代病毒ChiVax-WN01,电镜观察可见包装完整的病毒粒子。（4）神经侵袭性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率均为100%,与JEV SA14-14-2组和PBS组无差别。神经毒性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率为50%,有神经毒性,JEV SA14-14-2组和PBS组小鼠存活率100%。病毒在内脏分布情况表明,ChiVax-WN01接种后各个时间点内脏中均未检测到病毒滴度。嵌合株病毒ChiVax-WN01能诱导机体产生中和抗体,效价为1:90,并可显着提高IFN-γ和IL-2分泌细胞在脾淋巴细胞中的比例。以上结果表明,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01腹腔接种具有较高的安全性和良好的免疫原性。结论:成功建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,并基于该系统构建构建了ChiVax-WN01,且ChiVax-WN01在小鼠上具有较好的安全性和免疫原性。
王斌[3]（2020）在《猪肠道冠状病毒细胞受体及毒力因子研究》文中指出冠状病毒具有广泛的天然宿主,可感染人类、畜、禽和其他脊椎动物,且具有跨物种传播能力。感染猪肠道的冠状病毒主要有甲型冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪甲型肠道冠状病毒（Swine enteric alphacoronavirus,SeACoV）以及丁型冠状病毒属的猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）。目前对养猪业危害最为严重的猪肠道冠状病毒为PEDV和PDCoV。本研究系统地进行腹泻样品病毒鉴定、病毒分离、病毒入侵的细胞受体研究以及通过建立病毒反向遗传操作系统探究病毒关键致病基因,以期能够更全面深入地了解猪肠道冠状病毒入侵和致病机制,为疾病防控和疫苗研发提供参考和理论依据。本研究首先对浙江某猪场临床腹泻样品进行病原鉴定,以猪肠道冠状病毒特异性检测引物,通过RT-PCR对腹泻样品核酸进行检测,结果显示该腹泻样品只有PDCoV核酸检测阳性,TGEV、PEDV及SeACoV均为核酸阴性。随后通过LLC-PK1细胞成功地从腹泻样品中分离出病毒,经过病毒基因组cDNA扩增、序列比对及PDCoV结构蛋白抗体的IFA鉴定,确定从腹泻样品中分离出的病毒为PDCoV。将PDCoV全基因组序列与GenBank中已公布的其他毒株序列进行进化树分析发现,本研究获得的PDCoV为中国株。其S基因与CH-WH-2017（MK040451）同源性最高。全基因组重组分析发现该毒株非结构蛋白基因可能来自 CHJXNI2/15（KR131621.1）与 CHN-HG-2017（MF095123.1）重组演化。随后本研究对PDCoV病毒入侵细胞的受体进行研究。通过推测并验证PDCoV S蛋白S1结构域能够通过猪氨基肽酶N（Porcine aminopeptidaseN,pAPN）结合到PDCoV易感细胞膜上,且可溶性pAPN蛋白能够阻断这种结合,体内外实验证实PDCoVS1蛋白能够与pAPN蛋白相互作用。外源表达pAPN蛋白能够介导PDCoV对非易感细胞的入侵和病毒增殖,产生的子代病毒同样具有感染能力。pAPN蛋白敲低实验进一步证实PDCoV对易感细胞的感染能力与细胞pAPN表达量呈正相关,表明pAPN能够作为PDCoV细胞受体介导病毒入侵感染。pAPN蛋白敲除实验则显示,易感细胞pAPN蛋白完全缺失后,仍然有少量PDCoV感染,说明除pAPN外,还存在有其他受体蛋白。为更好地研究猪肠道冠状病毒致病性,本研究尝试建立PDCoV病毒反向遗传操作系统。分段扩增病毒全长基因组,利用人工染色体组载体系统（BAC）为载体,通过同源重组方式将病毒全长基因组克隆到载体上,成功构建病毒全基因组感染性克隆质粒。通过转染细胞,在转染代细胞和感染第一代细胞均检测到病毒结构蛋白表达。至此,PDCoV反向遗传操作技术平台基本建立。以同样的感染性克隆构建方法和病毒拯救技术,本研究成功建立猪肠道冠状病毒PEDV的反向遗传操作系统。基于该系统,本研究对PEDVORF3基因及S蛋白C端7个氨基酸编码基因分别及同时进行缺失,成功获得基因修饰病毒,随后通过仔猪攻毒试验研究病毒致病性变化。实验结果发现ORF3及S蛋白C端7个氨基酸分别缺失均能一定程度致弱病毒,共同缺失后病毒致弱效果更为显着。随后本研究通过高致病性基因Ⅱ型PEDVS基因替换为低致病性基因Ⅰ型S基因的嵌合病毒仔猪致病性实验,证实病毒S基因为影响病毒毒力的关键基因,同时S基因以外的病毒基因同样会在病毒毒力中发挥作用。综上所述,本研究从分子病毒学水平研究了猪肠道冠状病毒细胞入侵和致病机制。成功分离获得一株猪肠道冠状病毒,并鉴定出其细胞入侵受体,通过建立反向遗传操作系统,证实猪肠道冠状病毒S基因是影响病毒毒力的主要因素。
王晏莉[4]（2019）在《核酶与核糖开关转录折叠动力学机制的研究》文中研究说明HDV核酶是一个长约1.7kb的基因组,该RNA分子的核酶区域长约85-nt。当HDV核酶与乙肝病毒（HBV）发生共感染时会加剧该病毒的毒性。HDV核酶主要通过形成一个双假结结构进而发挥其自剪切生物功能。该核酶区域的上游或者下游序列对HDV核酶在转录过程中的折叠有一定的影响。由于执行其生物功能的结构是一个假结结构。因此,我们将假结引入到主方程时序推广法中进而研究HDV核酶以及上、下游序列对其转录折叠动力学机制的影响。Candida内含子是一个全长为379-nt且具有自剪接功能的第I类型内含子。该类型内含子引发的疾病主要是由白色假母丝菌所引起的慢性、亚急性、急性感染而造成。此外,该类型内含子经常可侵犯人体的皮肤、黏膜,也会引起人体的内脏及全身性的感染性疾病。第I类型内含子通过发生两次酯转移反应进而使得该内含子能够从其所在的前体RNA分子中分离。该内含子发挥其生物功能的结构通常是一个复杂的P3-P7假结。由于,该RNA序列很长且功能结构复杂,因此,我们采用分段处理的主方程时序推广法来研究其转录折叠动力学机制。C-di-AMP响应的ydaO核糖开关的二级结构主要是由两个三分支结构组成,且三分支结构通过两个螺旋链接,同时还包含一个大的保守内环,该结构的特殊性使得ydaO核糖开关可以同时结合两个c-di-AMP分子。此外,通过核糖开关的中间区域核苷酸与3’末端区域核苷酸的配对形成的长程假结结构进一步使得适体域能够完好的闭合。所以,ydaO核糖开关与我们常见的核糖开关有所不同。核糖开关的生物学功与其转录过程中所形成的中间结构有很大的关系。因此,ydaO核糖开关是如何在不同的转录条件下转换成不同的功能结构急需解决。在此,我们将配体的动力学机制引入到我们的模型中。本文主要成果如下:（1）建立了包含假结结构的长链RNA转录折叠动力学方法。运用该方法可以预测包含假结结构的长链RNA在不同的转录速率,转录暂停等条件下形成的结构及折叠路径。（2）从理论上预测了不同区域的RNA序列对HDV核酶在转录折叠过程中的影响。揭示了HDV核酶转录折叠过程中在核酶区域的共性及上、下游区域对HDV核酶自剪切结构影响的特异性。四条不同序列的HDV核酶区域1-73片段均能折叠到相同的结构,而99-nt的HDV核酶序列其转录折叠与复性折叠结果截然不同。上游30-nt的核苷酸通过与核酶区域70-90片段形成一个Alt1螺旋进而阻止假结结构的形成。而更长54-nt的上游核苷酸在转录早期形成一个稳定的P（-1）螺旋进而能够促使假结结构的形成从而恢复该核酶活性。尽管55nt的下游序列可以通过与核酶区域形成更稳定的P5螺旋从而在转录期间入侵已经形成的假结结构,但是缓慢的转变速率可以使该核酶保持在具有活性的假结结构进而执行其功能。（3）从理论上预测了念珠菌内含子转录折叠动力学过程,揭示了前11nt序列片段对念珠菌自剪接活性结构的重要性。天然序列的念珠菌内含子有两条折叠路径,一条路径折叠到具有活性的P3-P7结构,另一条路径折叠到稳定的中间结构。而截去前11nt的念珠菌只有一条主要路径,直接折叠到具有活性的P3-P7结构。（4）引入了配体结合动力学机制,将该机制与含有假结的RNA转录折叠动力学机制结合进而从理论上阐明了ydaO核糖开关的调控机制为热力学和动力学联合调控,并给出了c-di-AMP配体浓度,转录速率及配体的解离速率和结合速率对ydaO核糖开关调控机制的影响。较高的配体浓度,较高的转录率及较大的配体结合速率能使更多的结构转换到基因表达OFF态;较低的配体浓度或较低的转录率可导致更多的结构跃迁到基因表达ON态。
赵毕妍[5]（2019）在《基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的初步研究》文中研究指明A组轮状病毒（Rotavirus）是全球范围内引起婴幼儿肠胃炎的主要病原体之一,每年导致200万住院病例和20万死亡病例,造成了严重的社会经济负担。目前关于轮状病毒复制、致病及免疫机制等相关基础研究相对较少,主要原因是缺乏高效的轮状病毒反向遗传学系统。2017年,Komoto等建立了基于14质粒的轮状病毒反向遗传学系统。但是,目前该系统还存在效率低、所得病毒滴度较低等问题。并且,除了Komoto实验室,还没有其他实验室成功利用该系统进行病毒研究的相关报道。为了建立基于质粒的反向遗传学系统,我们按照Komoto的思路进行了 14质粒反向遗传学系统的构建尝试,但14质粒共转染细胞后未能产生感染性病毒颗粒,且未检测到病毒蛋白的表达。随后,我们对14质粒系统进行了优化。首先对转染细胞系和转染试剂进行了优化,确定所用细胞系为B SR-T7/5,所用转染试剂为XtremeGENE;其次,由于病毒双层颗粒转导细胞后可产生感染性病毒颗粒,我们尝试将病毒双层颗粒组成蛋白VP1、VP2、VP3、VP6加入反向遗传学系统。然而VP1、VP2、VP3、VP6表达质粒与1 1个转录质粒共转染后未能获得病毒颗粒;最后,考虑到14质粒共转染数量太多,转染效率低,我们设计克隆将轮状病毒的11个转录质粒减少到四个。蛋白表达情况检测结果显示四个转录质粒共转染细胞后VP2和VP6表达量均高于11质粒,并且电镜观察到胞内存在少许类病毒颗粒,但未观察到明显的病毒质区。检测NSP2蛋白表达情况,我们发现胞内无NSP2蛋白表达,这可能是未形成病毒质区的原因。另外,我们对转录质粒转录情况进行了检测,发现转录质粒所转录出的病毒RNA 3’末端存在非病毒序列。病毒基因3’末端序列准确性会直接影响基因组包装,并进一步影响到病毒颗粒的生成。综上所述,优化后的四质粒系统比14质粒系统蛋白表达水平更高,共转染细胞后可观察到少许类病毒颗粒。另外,我们发现病毒质区的形成和病毒基因序列3’末端序列准确性会直接影响重组病毒的产生。因此,本研究为建立更高效的基于质粒的反向遗传学系统提供了新的思路。
徐海娈[6]（2018）在《猪瘟病毒遗传进化分析与感染性克隆构建》文中指出猪瘟（Classical swine fever,CSF）是一种严重危害养猪业的传染病,目前的防控措施主要以疫苗注射为主。中国猪瘟兔化弱毒疫苗株（hog cholera lapinized virus,HCLV）是世界公认的金标准弱毒疫苗,为我国乃至世界CSF的防控做出了重大贡献。因CSF活苗免疫猪群与猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）野毒感染产生的抗体无法进行区分,且近几年我国部分CSF活疫苗免疫猪群中有新基因亚型的CSFV出现,为我国CSF的防控提出了新的挑战。为此,了解CSFV的遗传进化关系和研发能够区分感染和免疫动物（Differentiating Infevted from Vaccinted Animals,DIVA）的新型CSF标记疫苗就显得极为重要。为了解CSFV E2基因的遗传进化关系,本研究采集20份疑似CSF病料,运用RT-PCR方法对CSFV E2的部分基因进行扩增并序列测定,获得了3株CSFV分离株,分别将其命名为GDFS1-2017-China、GDFS2-2017-China和GDQY-2018-China,将这3株分离毒株的E2部分基因序列（190 bp）与GenBank中注册的中国CSFV参考毒株进行遗传进化关系分析。结果显示,3株CSFV分离株与CSF疫苗株的核苷酸相似性为78.9%81.6%,与CSF石门株的核苷酸相似性为78.9%82.1%。遗传进化关系分析表明,这3株CSFV都属于基因2群的2.1c亚群。为了进一步探究CSFV毒株的种群演化速率关系,利用贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛方法（the Bayesian Markov Chain Monte Carlo method）对GenBank中注册的不同地域、不同时间的CSFV毒株E2基因进行分析,结果显示,CSFV E2基因（1119 bp）的平均核苷酸替代率为3.1045×10-4个核苷酸/位点/年(95%HPD:3.0×10-4,3.3184×10-4)。CSFV时间进化树结果显示,CSFV毒株的最近共同祖先（The most recent common ancestor,TMRCA）来源于1489年,在15世纪中期和17世纪初期产生两个大的进化分支,同时,从上世纪90年代至今发现的CSFV毒株大都来源于17世纪初期的进化分支。CSFV群体动态分析结果显示,CSFV的暴发总体呈上升趋势,18世纪以前上趋势较为平缓,在18世纪初期和19世纪初期经历过两次快速增长,20世纪末期开始,病毒种群迅速下降。本研究以HCLV基因序列为参考,进行全长基因合成,为了获得一个精准的HCLV基因组RNA,在其全基因组序列的5’-UTR端依次插入CMV增强启动子、内含子、T7启动子、榔头状核酶（Hammer ribozyme,HamRz）序列,3’-UTR端依次插入丁型肝炎核酶（Hepatitis delta virus ribozyme,HdvRz）、T7终止子、SV40 PolyA序列,同时在HCLV E1基因C末端插入标记基因FLAG,构建重组质粒CN5266-1-PSK,建立基于RNA聚合酶Ⅱ的HCLV反向遗传操作系统,该操作系统可直接将以CMV为启动子的全长感染性克隆转染猪源易感细胞进行病毒拯救。将重组质粒CN5266-1-PSK转染SK-6和BHK-21细胞,同时设置空白细胞作为对照组,将转染的细胞盲传3代,每一代均用RT-PCR方法检测病毒RNA和用CSFV E2的单克隆抗体进行IFA检测,结果显示,PCR未扩增出特异性目的条带,且SK-6细胞内未见毒株vC-FLAG的特异性荧光,表明没有拯救出毒株vC-FLAG的病毒粒子。在重组质粒CN5266-1-PSK的基础上,为了成功的构建出标记毒株的感染性克隆,分别从标记病毒本身和细胞内拯救系统两个方面对我们的病毒拯救系统进行了验证。首先,我们从标记病毒本身进行验证,构建重组质粒CN5266-1-mut（cut flag）-SwaI-PSK（疫苗株vC）和CN5266-1-mut-SwaI-PSK（标记株vC-FLAG）,对重组质粒进行体外线性化处理,通过体外转录得到RNA,将得到的mRNA用脂质体转染SK-6细胞,将转染的细胞盲传3代,每一代均用CSFV E2的单克隆抗体进行IFA检测,结果显示,SK-6细胞内未见毒株vC和vC-FLAG的特异性荧光,表明没有拯救出毒株vC和vC-FLAG的病毒粒子。为了验证细胞内反向遗传系统中的主要功能原件CMV启动子、HamRz和HdvRz是否发挥作用,我们又构建了重组质粒CN5266-1-EGFP并转染SK-6细胞后24 h,在荧光显微镜下观察,能明显看到发荧光的细胞,表明CMV启动子在SK-6细胞中发挥了作用。接着构建了重组质粒CN5266-1-EGFP（包含HamRz功能位点）和CN5266-1-EGFP（cut GTC）（去除HamRz功能位点）并转染SK-6细胞后48 h进行Western blot检测。结果显示,CN5266-1-EGFP（cut GTC）中标签EGFP的基因表达量明显高于CN5266-1-EGFP,表明HamRz能够发挥剪切功能。最后在重组质粒CN5266-1-EGFP的基础上构建了重组质粒CN5266-1-EGFP-FLAG和CN5266-1-EGFP-FLAG（cut HdvRz）（去除HdvRz序列）并转染SK-6细胞后48 h进行Western blot检测。结果显示,重组质粒CN5266-1-EGFP-FLAG中确实存在两种形式的EGFP,但是CN5266-1-EGFP-FLAG（cut HdvRz）和CN5266-1-EGFP-FLAG中FLAG基因的表达量却没有明显区别,表明HdvRz能够发挥切割作用,但切割效率不高。综上所述,本研究对CSFV的E2基因进行了遗传进化分析,为从当前流行毒株的筛选出疫苗候选毒株提供理论依据,同时构建了猪瘟弱毒株反向遗传系统,并对反向遗传系统中的不同功能元件进行了验证,为下一步CSF标记疫苗的研发奠定基础。
张媛媛[7]（2017）在《基于配体诱导的人工核酶开关对哺乳动物细胞基因表达调控的研究》文中认为近些年合成生物学的研究建立了一系列的能够在细胞内调节基因表达的非编码RNA控制的体系,其中核糖开关,是一类广泛存在于各种生物体内并对小分子代谢物敏感的结构RNA。它们可以不依赖任何蛋白因子,直接结合小分子代谢物,形成选择性茎环结构或通过自我剪切功能,从转录或翻译水平来调控基因表达。据此,将体外筛选出的适体区序列和一些天然核酶的序列相融合构建人工核酶开关,可以利用配体和适体的结合导致的构象改变核酶自我剪切的活性,进而调控相关基因的表达,从而可被运用于包括哺乳动物细胞在内的各种生物机体中。近些年,核酶开关也被用于疾病治疗的研究中,但是将这种基于人工RNA的调节系统对于哺乳细胞内功能基因的作用在临床研究还面临诸多挑战。在肿瘤细胞基因治疗中,HSV-TK/GCV系统与RNA干扰是最为常用的治疗方法。本研究首先以肿瘤细胞为模型,构建了基于茶碱小分子激活的的锤头状核酶开关,建立了稳定转染该系统的HeLa细胞系,利用核酶开关与低毒性小分子配体的结合,调控核酶的剪切,实现对HSV-TK基因mRNA的顺式调节,建立了可逆的、长期的、稳定的低毒性基因调控系统。随后,我们构建了基于配体作用的HDV核酶开关调节系统,通过响应茶碱分子浓度变化调节剪切,精确释放靶基因的pri-miRNA,实现对肿瘤细胞抗凋亡基因Bcl-2的RNA干扰作用的实时有效调控,为今后RNA干扰在肿瘤细胞中的基因治疗更安全有效的运用提供理论基础与研究方法。此外,本研究通过核酶开关的构建,在真核动物细胞中建立了硫胺素焦磷酸（TPP）浓度响应的EGFP荧光传感器,可将其浓度的变化转化为报告基因表达的改变,发展出对哺乳活细胞内代谢物或因子的无标记、无损伤、可视、高效的检测方法。
刘波[8]（2007）在《CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究》文中研究指明目的构建实验所需的真核表达载体，特别是人源性tRNA val启动子驱动CTE介导的核酶高效表达载体pPHCV5-CR以及对应的无CTE介导的载体pPHCV5-R；建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶-CTE复合物对丙型肝炎病毒亚基因组的影响，进一步探讨丙型肝炎治疗研究方向。研究方法1、构建相应的核酶载体合成CTE-DNA，设计、构建含tRNAval启动子的核酶和带有CTE的含tRNAval启动子的核酶。2、建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株在脂质体lipofectamine TM2000介导下，将含有HCV Subgenes的真核表达质粒pHCV BM4-5导入人肝癌细胞系QSR7701中，经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法证实转染成功及其蛋白表达。3、观察四种质粒pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2对HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株中HCV RNA和相应病毒蛋白表达的影响。结果1、经测序后证实，成功构建相应的核酶载体，为下一步实验奠定基础。2、经RT-PCR和Western Blot证实，成功建立稳定转染HCVSubgenomic Replicon和表达的细胞株。3、用构建的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和复合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬时转染含HCV亚基因复制子的稳定转染QSG7701细胞株，48小时后收集细胞进行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR（以β-actin为内对照）结果显示：pPHCV5-CR1转染组未见明显扩增目的条带，pPHCV5-R1转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组；pPHCV5-CR2转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组，pPHCV5-R2转染组可见扩增目的条带，亮度与未转染组和空质粒转染组接近。这些提示：复合核酶（带有CTE）在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，复合核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。WesternBlot（以β-actin为内对照）结果显示：应用软件分析各组细胞目的蛋白表达量无明显差异，可能与瞬时转染作用时间短、蛋白表达变化不明显，也可能与实验重复次数少、可用数据少或者检测方法有关。结论新型核酶（带有CTE）在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，带CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。
于敏[9]（2007）在《猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建》文中进行了进一步梳理戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的急性自限性疾病。其临床特征为发热、全身疲乏、食欲不振、厌油腻、恶心、呕吐、尿色深黄如浓茶、眼睛和皮肤发黄，肝功能检查出现转氨酶迅速升高到几百甚至几千单位，黄疸较常见，并可持续1周。在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍，在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50％，是导致发病和病死的重要因素，尤其对孕妇可造成有20％的病死率。对人类健康具有严重危害性。HEV过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为27～30nm的病毒样颗粒，从而证实该病毒为新型的非甲非乙型肝炎病毒，1989年东京国际会议正式将这一类型的肝炎及其相关病毒分别命名为戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因组为单股正链RNA，约7.5kb，具有3个开放读码框（ORF）。病毒基因组的5′端到3′端依次为5′端非编码区（5′-NCR）、ORF1、ORF3、ORF2、3′-NCR及polyA尾。不同地区来源的HEV基因序列有一定的差异，但是同一地区来源的HEV的基因序列保持相对稳定。随着HEV不断被分离、克隆和鉴定，根据各毒株核苷酸和氨基酸的同源性的大小以及系统进化树的分析，全球的HEV至少有8个基因型。我国主要为Ⅰ和Ⅳ型，而且散发性戊型肝炎中以Ⅳ型为主。为了确定黑龙江省猪群中流行的HEV的基因型，以便更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系，本研究采用RT-PCR方法对从猪粪便样品中分离的HEV大庆株（swOQ）的全基因组进行分片段扩增，并对其两个末端采用末端快速扩增法（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）进行扩增、克隆和测序。测序结果表明swDQ株去除3′端poly（A）尾全长为7234bp，5′-NCR为26bp，3′-NCR为69bp。5′和3′非编码区之间有3个ORF，ORF1从27到5144位核苷酸，全长5118bp，编码1705个氨基酸。ORF2从5141-7165位核苷酸，全长2025bp，编码674个氨基酸。ORF3从5169到5513位核苷酸，全长345bp，编码114个氨基酸，此序列已经登陆GenBank，序列号为DQ279091。通过生物学软件，将swDQ与已报道的4个基因型的29株HEV核苷酸和氨基酸序列比较发现，swDQ HEV全序列与HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ的同源性在74.7～79.1％之间，而与Ⅳ型HEV的同源性最高，其中ORF1区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为81.9～83.5％，氨基酸同源性为93.5～94％，ORF2区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为87.1～88.1％，氨基酸同源性为96.4～97.6％，ORF3区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为94.4～96.5％，氨基酸同源性为90.3～96.5％。系统进化分析可以看出，核苷酸的进化与Ⅳ型HEV在一个分枝上，表明swDQ为Ⅳ型HEV。本研究首次报道了在中国黑龙江省猪体内分离到Ⅳ型HEV的全基因组序列。由于缺乏合适的体外培养系统影响HEV分子生物学特性的进一步研究，获得HEV的感染性分子克隆后，就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入和互补等手段来研究HEV的基因复制和表达、RNA的自发重组和诱导重组、RNA病毒与宿主的相互作用（如病毒在细胞间的传递机制）等，也可进行抗病毒策略研究，还可用于构建新的病毒载体。在国内对猪HEV病毒的拯救尚属空白。本研究在已知猪HEV swDQ株全基因组序列的基础上，根据基因组和克隆载体的酶切位点，将猪HEV全基因组分为6个片段进行了RT-PCR扩增，将得到的片段经过一系列的克隆和亚克隆后，分别构建了含有基因组全长cDNA克隆的pHE和pCHE重组质粒。在pHE中，cDNA克隆的5′端上游引入了T7启动子序列，并选取一个克隆在3′端引入了分子标志NruI位点。进行全序列测序后，发现了7个核苷酸的缺失和一个核苷酸的插入，运用PCR突变修补了突变的碱基，最终获得了含有分子标志NruI的HEV swDQ株基因组全长cDNA的重组质粒pHEa。体外转录后，转染A549细胞和HepG2细胞，通过间接免疫荧光试验和RT-PCR初步检测为阳性。在pCHE中cDNA克隆的5′端上游引入了T7启动子序列、锤头状核酶；3′端引入了丁型肝炎病毒核酶，利用载体上的CMV、β-actin启动子，将含有HEV swDQ株基因组全长cDNA的pCHE转染A549细胞和HepG2细胞后，通过间接免疫荧光试验和RT-PCR初步检测为阳性。以上结果证明，含有HEV swDQ株基因组全长cDNA的pHEa和pCHE重组质粒是有感染性的。本研究首次在我国构建出了猪HEV感染性克隆。综上所述，本研究在充分普查黑龙江省猪群中戊型肝炎的流行及分布的基础上，对来源于猪粪便中的swDQ HEV进行了全基因组序列分析，确定该地区猪群中流行的HEV的基因型，以便更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系。而且在获得全基因组序列的基础上构建了分别利用含有CMV、β-actin启动子和T7启动子的两个感染性克隆，获得有感染性的转录本，拯救出猪HEV，为HEV的分子生物学研究及基因工程疫苗研究打下基础，填补了国内空白。
胡玉琳[10]（2006）在《脱氧核酶及锁核酸核酶对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达抑制作用的研究》文中认为乙型肝炎病毒（HBV）感染是急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要原因。全世界约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒,其中约25-40%的病人最终死于该病的并发症。目前尚无特效药物,因此,开发新型、廉价、高效、副作用小、稳定且有靶向性的基因治疗药物已成为治疗该病的重要途径。脱氧核酶（DNAzyme）是一种具有酶活性的DNA分子。它的结构极似锤头样核酶,含有一保守的催化区和两个可变的侧翼结合区。它可以特异性地与靶RNA配对,切割靶RNA而使其失去生物学活性。锁核酸核酶（LNAzyme）是DNAzyme的一种衍生物,是在DNAzyme的两个结合臂上引入一个或几个LNA单体而形成的。通过LNA单体的引入,使其对RNA的切割能力明显提高,且特异性强。HBV复制过程中包括一个逆转录过程,针对HBV前基因组RNA的特定区域设计合成HBV特异性的脱氧核酶及锁核酸核酶,可以阻断HBV的复制和表达。本实验针对HBV设计合成了未修饰的10-23DNAzyme、点硫代修饰的10-23DNAzyme及LNAzyme。用其转染HepG2.2.15细胞,观察它们对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。结果显示,LNAzyme、点硫代修饰的10-23DNAzyme及未修饰的10-23DNAzyme在一定给药浓度及一定时间范围内对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达有抑制作用。且此抑制作用LNAzyme明显大于点硫代修饰的10-23DNAzyme（P<0.05）,点硫代修饰的10-23DNAzyme又明显大于未修饰的10-23DNAzyme（P<0.05）。此抑制作用表现出一定的量效关系和时效关系。没有发现10-23DNAzyme、LNAzyme有细胞毒作用。
二、不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义（论文提纲范文）
（1）新型自剪切型核酶twister-sister和hatchet的结构以及催化机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 核酶的发现 |
| 1.2 自剪切型核酶研究进展 |
| 1.2.1 hammerhead自剪切型核酶 |
| 1.2.2 hairpin自剪切型核酶 |
| 1.2.3 HDV自剪切型核酶 |
| 1.2.4 VS自剪切型核酶 |
| 1.2.5 glmS自剪切型核酶 |
| 1.2.6 twister自剪切型核酶 |
| 1.2.7 pistol自剪切型核酶 |
| 1.2.8 twister-sister自剪切型核酶 |
| 1.2.9 hatchet自剪切型核酶 |
| 1.2.10 hovlinc自剪切型核酶 |
| 1.3 自剪切型核酶的应用 |
| 1.3.1 保证体外转录RNA样品3’末端均一性 |
| 1.3.2 哺乳动物细胞中RNA元件的表达 |
| 1.3.3 基因表达与调控 |
| 1.3.3.1 直接调控型 |
| 1.3.3.2 配体依赖型 |
| 1.3.4 基因编辑 |
| 1.4 课题的创新性以及研究意义 |
| 2 实验材料、试剂以及仪器 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 亲和层析柱和浓缩管 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.2.1 RNA制备 |
| 2.2.1.1 克隆构建 |
| 2.2.1.2 获取DNA模板 |
| 2.2.1.3 体外转录以及RNA样品纯化 |
| 2.2.1.4 RNA结晶样品制备 |
| 2.2.2 结晶条件初步筛选和优化 |
| 2.2.3 hatchet自剪切型核酶凝胶过滤层析 |
| 2.2.4 hatchet自剪切型核酶体外酶切与连接实验 |
| 2.3 实验仪器与设备 |
| 3 实验流程与方法 |
| 3.1 序列设计 |
| 3.1.1 twister-sister自剪切型核酶保守序列分析与设计 |
| 3.1.2 hatchet自剪切型核酶保守序列分析与设计 |
| 3.2 实验相关蛋白纯化 |
| 3.2.1 pfu DNA聚合酶 |
| 3.2.2 T7 RNA聚合酶 |
| 3.2.3 ULP1蛋白酶 |
| 3.2.4 U1A蛋白 |
| 3.3 RNA样品制备 |
| 3.3.1 HT-GAAA质粒构建 |
| 3.3.1.1 制备E.coli DH5α感受态细胞 |
| 3.3.1.2 PCA(Polymerase cycling assembly)获取目的片段 |
| 3.3.1.3 胶回收目的片段 |
| 3.3.1.4 单酶切处理目的片段 |
| 3.3.1.5 目的片段与载体连接 |
| 3.3.1.6 转化 |
| 3.3.1.7 菌落鉴定 |
| 3.3.2 HT-UUCG质粒构建 |
| 3.3.2.1 突变PCR |
| 3.3.2.2 胶回收线性突变质粒 |
| 3.3.2.3 线性突变质粒末端磷酸化 |
| 3.3.2.4 突变线性化质粒环化 |
| 3.3.2.5 环化后质粒转化 |
| 3.3.2.6 测序以及序列比对 |
| 3.3.3 获取DNA模板 |
| 3.3.3.1 质粒扩增法获取大量DNA模板 |
| 3.3.3.2 PCR扩增法获取大量DNA模板 |
| 3.3.4 体外转录小量测试 |
| 3.3.5 体外转录大量制备 |
| 3.3.6 转录后RNA样品纯化 |
| 3.3.7 RNA结晶样品制备 |
| 3.4 结晶条件初步筛选以及优化 |
| 3.4.1 结晶条件初步筛选 |
| 3.4.2 晶体生长条件优化 |
| 3.5 晶体数据收集和处理 |
| 3.6 相角解析以及结构解析 |
| 3.7 结构分析以及突变体酶切活性实验 |
| 3.8 hatchet自剪切型核酶凝胶过滤分析 |
| 3.9 hatchet自剪切型核酶连接活性实验 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 twister-sister自剪切型核酶三级结构以及催化机制研究 |
| 4.1.1 结构解析所使用序列TwS1 |
| 4.1.2 TwS1体外酶切活性实验结果 |
| 4.1.3 TwS1结晶条件优化 |
| 4.1.4 TwS1晶体衍射数据收集情况 |
| 4.1.5 TwS1晶体衍射数据参数统计表 |
| 4.1.6 TwS1相角解析以及模型修正 |
| 4.1.7 twister-sister自剪切型核酶结构以及催化性质研究 |
| 4.1.7.1 twister-sister自剪切型核酶整体三级结构 |
| 4.1.7.2 twister-sister自剪切型核酶三级结构中的额外碱基配对 |
| 4.1.7.3 twister-sister自剪切型核酶三级结构中的远距离相互作用 |
| 4.1.7.4 twister-sister自剪切型核酶四通道交汇处结构特征 |
| 4.1.7.5 twister-sister自剪切型核酶酶切位点处构象 |
| 4.2 hatchet自剪切型核酶三级结构以及催化机制研究 |
| 4.2.1 HT-GAAA和HT-UUCG的RNA样品纯化 |
| 4.2.1.1 HT-GAAA转录小量测试 |
| 4.2.1.2 HT-UUCG转录小量测试 |
| 4.2.1.3 HT-GAAA以及HT-UUCG纯化后RNA样品 |
| 4.2.2 HT-GAAA和HT-UUCG结晶条件优化 |
| 4.2.3 HT-GAAA和HT-UUCG数据收集情况 |
| 4.2.4 HT-GAAA和HT-UUCG晶体衍射数据参数统计表 |
| 4.2.5 HT-GAAA和HT-UUCG相角解析以及模型修正 |
| 4.2.6 hatchet自剪切型核酶结构以及催化性质研究 |
| 4.2.6.1 hatchet自剪切型核酶的整体三级结构 |
| 4.2.6.2 hatchet自剪切型核酶L1与L3之间的长距离相互作用 |
| 4.2.6.3 hatchet自剪切型核酶高度保守碱基之间的相互作用 |
| 4.2.6.4 hatchet自剪切型核酶酶切位点处结构特征以及酶切前模型 |
| 5 讨论与展望 |
| 5.1 twister-sister自剪切型核酶讨论与展望 |
| 5.1.1 四通道与三通道twister-sister核酶三级结构对比 |
| 5.1.2 四通道twister-sister 核酶与twister 核酶结构对比 |
| 5.1.3 twister-sister自剪切型核酶展望 |
| 5.2 hatchet自剪切型核酶讨论与展望 |
| 5.2.1 HT-UUCG和HT-GAAA三级结构比对 |
| 5.2.2 hachet核酶3’产物结构与HDV核酶 3’产物结构对比 |
| 5.2.3 hatchet自剪切型核酶3’产物二聚体的作用 |
| 5.2.4 hatchet自剪切型核酶展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（2）西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 主要缩略词 |
| 第一篇 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 西尼罗病毒病概述 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 病理变化 |
| 2.5 致病机制 |
| 2.6 诊断 |
| 2.7 防治措施 |
| 3 西尼罗病毒病疫苗研究进展 |
| 4 黄病毒科病毒反向遗传学技术 |
| 4.1 黄病毒科病毒反向遗传系统的发展概述 |
| 4.2 黄病毒科病毒反向遗传系统的构建策略 |
| 4.3 黄病毒科病毒反向遗传操作系统构建的难点 |
| 4.4 黄病毒科病毒反向遗传操作系统的应用 |
| 5 主要研究内容 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 流行性乙型脑炎病毒全长序列测定与比对 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与细菌 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEVSA14-14-2单克隆制备 |
| 2.2 JEV SA14-14-2 cDNA制备 |
| 2.3 JEVSA14-14-2测序引物设计 |
| 2.4 目的基因扩增 |
| 2.5 重组质粒构建与鉴定 |
| 2.6 测序与比对序列 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒蚀斑筛选结果 |
| 3.2 目的基因扩增结果 |
| 3.3 重组质粒鉴定结果 |
| 3.4 全基因组序列比对结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 流行性乙型脑炎病毒反向遗传操作系统的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒、细菌与质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEVSA14-14-2反向遗传操作系统构建策略 |
| 2.2 pACYC177载体改造 |
| 2.3 JEVSA14-14-2引物设计 |
| 2.4 JEV cDNA各片段扩增 |
| 2.5 JEVSA14-14-2感染性克隆构建 |
| 2.6 病毒拯救 |
| 2.7 拯救病毒的生物学特性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 载体改造及各片段扩增结果 |
| 3.2 JEVSA14-14-2感染性克隆鉴定结果 |
| 3.3 拯救病毒生物学特性鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 感染性克隆构建过程中存在的问题 |
| 4.2 感染性克隆各元件作用 |
| 4.3 体外转录体系和体内转录体系比较 |
| 5 小结 |
| 第三章 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的构建及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒、细菌与感染性克隆 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 pChiVax-WN01感染性克隆构建 |
| 2.2 ChiVax-WN01病毒拯救 |
| 2.3 ChiVax-WN01生物学特性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 KLM片段扩增与鉴定 |
| 3.2 pACYC177-KLM和pChiVax-WN01构建与鉴定 |
| 3.3 ChiVax-WN01病毒拯救与生物学特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黄病毒多聚蛋白切割位点 |
| 4.2 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01生物学特性 |
| 4.3 内含子对病毒拯救的影响 |
| 4.4 体外转录系统和体内转录系统比较 |
| 5 小结 |
| 第四章 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 器具 |
| 2 方法 |
| 2.1 神经侵袭性试验 |
| 2.2 神经毒性试验 |
| 2.3 体重及体温变化试验 |
| 2.4 病毒在小鼠体内分布试验 |
| 2.5 微量中和试验 |
| 2.6 ELISpot IFN-γ、IL-2和IL-4试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 神经侵袭性试验 |
| 3.2 神经毒性试验 |
| 3.3 体重和体温 |
| 3.4 病毒内脏分布 |
| 3.5 微量中和试验 |
| 3.6 IFN-γ、IL-2和IL-4酶联免疫斑点试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的安全性 |
| 4.2 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的免疫原性 |
| 4.3 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01神经毒性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）猪肠道冠状病毒细胞受体及毒力因子研究（论文提纲范文）
| 论文课题来源 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 猪肠道冠状病毒流行情况 |
| 2 冠状病毒病原学 |
| 3 冠状病毒受体研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 病毒的分离及鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 临床样品采集 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 试剂及抗体 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要培养基配制 |
| 1.2.2 腹泻样品处理 |
| 1.2.3 腹泻样品病毒RNA提取 |
| 1.2.4 腹泻样品腹泻病毒核酸检测 |
| 1.2.5 病毒的分离及鉴定 |
| 1.2.6 病毒的全长基因组克隆 |
| 1.2.7 病毒基因组遗传进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 腹泻样品中猪肠道冠状病毒核酸检测结果 |
| 2.2 PDCoV病毒的细胞分离 |
| 2.3 病毒全长基因组分段扩增及克隆 |
| 2.4 病毒全基因组遗传进化分析 |
| 2.5 病毒S基因序列同源性分析 |
| 2.6 PDCoV ZJU3毒株全基因组水平重组分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 病毒入侵细胞受体研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 抗体 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 质粒构建 |
| 1.2.2 蛋白免疫印迹实验 |
| 1.2.3 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.2.4 斑点杂交实验 |
| 1.2.5 蛋白表达纯化 |
| 1.2.6 间接免疫荧光实验 |
| 1.2.7 流式细胞分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白表达与纯化 |
| 2.2 PDCoV S1蛋白与猪源易感细胞表面结合情况 |
| 2.3 不同细胞表达pAPN情况鉴定 |
| 2.4 S1蛋白与pAPN蛋白体内外结合情况验证 |
| 2.5 可溶性pAPN蛋白抑制S1蛋白与表达pAPN蛋白的细胞结合 |
| 2.6 外源性表达pAPN蛋白介导PDCoV对非易感细胞的入侵 |
| 2.7 可溶性pAPN对PDCoV病毒增殖的抑制作用 |
| 2.8 PDCoV感染Vero-pAPN细胞病毒增殖情况检测 |
| 2.9 PDCoV感染Vero-pAPN细胞子代病毒感染能力验证 |
| 2.10 易感细胞pAPN蛋白敲低抑制PDCoV感染 |
| 2.11 pAPN敲除后不能完全抑制PDCoV感染 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪丁型冠状病毒反向遗传系统建立尝试 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 抗体与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 溶液配制 |
| 1.2.2 病毒核酸抽提 |
| 1.2.3 RNA反转录 |
| 1.2.4 PCR引物设计与片段扩增 |
| 1.2.5 PDCoV全长基因组cDNA克隆构建 |
| 1.2.6 PDCoV全长基因组克隆重组质粒提取 |
| 1.2.7 PDCoV全长基因组克隆重组质粒鉴定 |
| 1.2.8 PDCoV全基因组克隆质粒大量制备 |
| 1.2.9 PDCoV全基因组克隆质粒转染 |
| 1.2.10 PDCoV全基因组质粒转染验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 成功扩增涵盖PDCoV全基因组的15个片段 |
| 2.2 成功构建PDCoV全基因组cDNA克隆 |
| 2.3 PDCoV全基因组cDNA克隆细胞拯救 |
| 3 讨论 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒反向遗传系统的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒及细胞 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 相关抗体 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 溶液配制 |
| 1.2.2 RNA提取 |
| 1.2.3 逆转录 |
| 1.2.4 引物设计 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 PEDV感染性克隆构建 |
| 1.2.7 PEDV全长感染性cDNA克隆PCR鉴定 |
| 1.2.8 PEDV病毒拯救 |
| 1.2.9 PEDV病毒的免疫荧光检测 |
| 1.2.10 PEDV病毒TCID_(50)测定 |
| 1.2.11 PEDV病毒空斑实验 |
| 1.2.12 动物实验分组 |
| 1.2.13 攻毒后仔猪腹泻状态评分 |
| 1.2.14 粪拭子采集与样品处理 |
| 1.2.15 粪便样品中PEDV核酸拷贝数检测 |
| 1.2.16 仔猪肠道组织样品处理及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PEDV-G2全长感染性克隆构建 |
| 2.2 rPEDV-G2病毒拯救与鉴定 |
| 2.3 荧光标记病毒的构建拯救与鉴定 |
| 2.4 拯救亲本毒与GFP标记病毒仔猪攻毒致病性研究 |
| 2.5 分泌型荧光素酶标记病毒构建与拯救 |
| 2.6 基因Ⅱ型PEDV S基因及ORF3基因修饰毒构建 |
| 2.7 基因修饰毒致病性实验 |
| 2.8 嵌合型重组病毒的致病性研究 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（4）核酶与核糖开关转录折叠动力学机制的研究（论文提纲范文）
| 本论文创新点 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 RNA世界学说 |
| 1.2 RNA的分子结构 |
| 1.3 RNA的结构及分类 |
| 1.4 RNA分子的热力学性质 |
| 1.5 RNA分子的动力学性质与生物功能 |
| 1.6 RNA分子转录折叠动力学的研究方法 |
| 1.7 本文主要研究内容及章节结构 |
| 第二章 侧翼区域对HDV核酶转录折叠动力学机制的影响 |
| 2.1 HDV核酶的危害及研究现状 |
| 2.2 模型和方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 99-nt核酶区域转录折叠动力学机制 |
| 2.3.2 30-nt的上游序列对核酶区域转录折叠动力学的影响 |
| 2.3.3 54-nt的上游序列对核酶区域转录折叠动力学的影响 |
| 2.3.4 55-nt的下游序列对核酶区域转录折叠动力学的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 第I类型内含子中P3-P7假结转录折叠动力学机制 |
| 3.1 第I类内含子介绍 |
| 3.2 念珠菌(Candida)内含子危害及研究现状 |
| 3.3 模型和方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 天然序列的念珠菌内含子转录折叠中及转录后机制 |
| 3.4.2 截去前11-nt序列的念珠菌内含子转录折叠中及转录后机制 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 预测c-di-AMP响应的ydaO核糖开关调控机制 |
| 4.1 c-di-AMP响应的ydaO核糖开关介绍及研究现状 |
| 4.2 模型和方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 有无c-di-AMP配体时ydaO核糖开关的调控机制 |
| 4.3.2 配体浓度与转录速率对ydaO核糖开关调控机制的影响 |
| 4.3.3 配体解离速率与结合速率对ydaO核糖开关调控机制的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结与工作展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 攻博期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 轮状病毒概况 |
| 1.1 轮状病毒的基因组 |
| 1.2 轮状病毒的蛋白 |
| 1.3 轮状病毒的分类及命名 |
| 2 轮状病毒的流行病学 |
| 2.1 轮状病毒致病流行情况 |
| 2.2 轮状病毒流行趋势变化 |
| 3 轮状病毒的感染及致病机制 |
| 3.1 轮状病毒的感染 |
| 3.2 轮状病毒致病机制 |
| 4 反向遗传学研究进展 |
| 4.1 反向遗传学简介 |
| 4.2 反向遗传学系统研究现状 |
| 4.3 反向遗传学系统的应用 |
| 4.4 轮状病毒反向遗传学系统研究进展 |
| 5 本研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 菌种、质粒、细胞、毒株及实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 常用溶液配制 |
| 2.2 分子克隆实验 |
| 2.3 蛋白表达 |
| 2.4 SDS-PAGE鉴定 |
| 2.5 抗体制备 |
| 2.6 抗体的HRP标记实验 |
| 2.7 体外转录及RNA鉴定 |
| 2.8 细胞培养及传代 |
| 2.9 感染性克隆转染及后续感染细胞 |
| 2.10 流式细胞术筛选阳性细胞 |
| 2.11 蛋白免疫印迹(Western Blotting) |
| 2.12 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.13 病毒培养 |
| 2.14 病毒感染滴度测定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 轮状病毒14质粒反向遗传学系统的建立尝试 |
| 1.1 轮状病毒反向遗传学操作系统11个转录质粒的构建 |
| 1.2 轮状病毒反向遗传学操作系统3个辅助质粒的构建 |
| 1.3 稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系构建 |
| 1.4 质粒共转染细胞尝试 |
| 2 轮状病毒反向遗传学系统优化 |
| 2.1 转染试剂优化 |
| 2.2 转染细胞系优化 |
| 2.3 VP1、VP2、VP3、VP6蛋白对反向遗传学系统的影响 |
| 2.4 转染质粒数量优化 |
| 第四章 讨论 |
| 1 建立基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的难点 |
| 2 HDV核酶长度对其自剪切效率的影响 |
| 3 病毒非结构蛋白对反向遗传学系统的影响 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要科研成果 |
（6）猪瘟病毒遗传进化分析与感染性克隆构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表及英汉对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪瘟及猪瘟病毒概述 |
| 1.1.1 猪瘟 |
| 1.1.2 猪瘟病毒 |
| 1.2 CSFV的基因组结构以及蛋白组成 |
| 1.2.1 CSFV的5’-UTR和3’-UTR |
| 1.2.2 结构蛋白 |
| 1.2.3 非结构蛋白 |
| 1.3 CSF的流行现状以及遗传进化研究 |
| 1.4 CSF疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 亚单位疫苗 |
| 1.4.2 多肽疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 病毒活载体疫苗 |
| 1.4.5 基因重组缺失疫苗 |
| 1.4.6 基因突变疫苗 |
| 1.5 反向遗传系统在CSFV研究中的应用 |
| 1.5.1 体外转录方法拯救CSFV |
| 1.5.2 细胞内转录方法拯救CSFV |
| 1.6 榔头状核酶和丁型肝炎核酶 |
| 1.6.1 榔头状核酶 |
| 1.6.2 丁型肝炎核酶 |
| 1.7 本论文的研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、血清、细胞与疫苗 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液的配置 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 我国广东地区CSFVE2基因遗传进化分析 |
| 2.2.2 CSFV毒株的种群演化速率分析 |
| 2.2.3 CSFV疫苗株感染性克隆的构建 |
| 2.2.4 C株和标记C株的体外转录拯救病毒方法的摸索 |
| 2.2.5 CSFV疫苗株反向遗传系统主要功能原件作用的验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 我国广东地区CSFVE2基因的遗传进化分析 |
| 3.1.1 CSFV分离毒株的PCR鉴定 |
| 3.1.2 CSFV分离毒株E2基因的核苷酸序列分析 |
| 3.1.3 CSFV分离毒株E2基因系统进化树分析 |
| 3.2 CSFV毒株的种群演化速率分析 |
| 3.2.1 饱和度分析 |
| 3.2.2 重组检测 |
| 3.2.3 最适核苷酸替代模型的选择 |
| 3.2.4 CSFV时间进化动态 |
| 3.2.5 核苷酸替代率的计算 |
| 3.2.6 病毒分歧时间的计算 |
| 3.2.7 群体演化动态分析 |
| 3.3 CSFV疫苗株感染性克隆的构建 |
| 3.3.1 CN5266-1-PSK酶切鉴定和PCR鉴定 |
| 3.3.2 拯救病毒的荧光鉴定结果 |
| 3.3.3 拯救病毒的PCR鉴定结果 |
| 3.4 C株和标记C株体外转录拯救病毒方法的探索 |
| 3.4.1 CN5266-1-mut-psk的构建 |
| 3.4.2 CN5266-1-mut(cutflag)-PSK的构建 |
| 3.4.3 CN5266-1-mut(cutflag)-SwaI-PSK和CN5266-1-mut-SwaI-PSK的构建 |
| 3.4.4 CN5266-1-mut(cutflag)-SwaI-PSK和CN5266-1-mut-SwaI-PSK的线性化…… |
| 3.4.5 RNA完整性的检测 |
| 3.4.6 间接免疫荧光检测结果 |
| 3.5 CSFV疫苗株反向遗传系统主要功能原件作用的验证 |
| 3.5.1 CMV启动子的功能验证 |
| 3.5.2 榔头状核酶的功能验证 |
| 3.5.3 丁型肝炎核酶的功能验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CSFV遗传进化分析 |
| 4.2 CSFV反向遗传系统的初步建立 |
| 4.3 体外转录拯救CSFV |
| 4.4 CSFV反向遗传系统主要原件的功能验证 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
（7）基于配体诱导的人工核酶开关对哺乳动物细胞基因表达调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 核糖开关的研究历史 |
| 1.2 核糖开关结构及分类 |
| 1.2.1 核糖开关结构 |
| 1.2.2 核糖开关的分类 |
| 1.2.3 串联的核糖开关 |
| 1.2.4 核糖开关分布 |
| 1.3 核糖开关的功能 |
| 1.3.1 维持体内代谢平衡 |
| 1.3.2 参与细胞内信号传导 |
| 1.3.3 核糖开关对基因表达的调控 |
| 1.4 基于RNA的基因表达调控 |
| 1.4.1 基于适配体的基因调控 |
| 1.4.2 适配体在原核生物中的应用 |
| 1.4.3 适配体在真核生物中的应用 |
| 1.4.4 核酶 |
| 1.5 人工构建的核糖开关的表达调控 |
| 1.5.1 依赖小分子配体的变构核酶 |
| 1.5.2 依赖特殊配体的变构核酶 |
| 1.6 人工变构核酶的运用 |
| 1.6.1 人工变构核酶在原核生物中的运用 |
| 1.6.2 人工变构核酶在真核生物中的运用 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 核酶开关对HSV-TK/GCV在肿瘤细胞表达的调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 细胞系 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要实验仪器 |
| 2.2.5 溶液及培养基配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 核酶开关的构建 |
| 2.3.2 细胞培养及瞬时转染 |
| 2.3.3 pTK-EGFP -Theo-HHR-B质粒的构建: |
| 2.3.4 建立稳定转染pTK-EGFP-Theo-HHR-B的HeLa细胞系 |
| 2.3.5 稳定转染pTK -EGFP -Theo-HHR-B的HeLa细胞系在不同浓度茶碱中EGFP表达水平的检测 |
| 2.3.6 qRT-PCR对TK基因mRNA水平的表达检测 |
| 2.3.7 Western Blot检测核酶开关对TK基因表达的调控 |
| 2.3.8 MTT检测核酶开关调控TK基因对肿瘤细胞杀伤力的影响 |
| 2.3.9 qRT-PCR检测核酶开关对基因表达的动态调节行为 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重叠延伸PCR方法构建载体 |
| 2.4.2 细胞内EGFP表达的荧光显微镜观察与流式细胞仪分析 |
| 2.4.3 核酶开关适体对茶碱分子的特异性 |
| 2.4.4 TK-EGFP-Theo-HHR-B重组表达载体鉴定 |
| 2.4.5 建立稳定转染TK-EGFP-Theo-HHR-B的HeLa细胞系 |
| 2.4.6 不同浓度茶碱对TK-EGFP-Theo-HHR-B细胞系EGFP的表达调控 |
| 2.4.7 不同浓度茶碱对核酶开关调控TK基因蛋白表达的影响 |
| 2.4.8 核酶开关对基因表达的动态调节行为 |
| 2.4.9 不同浓度茶碱对核酶开关调控细胞的GCV敏感性的调节 |
| 2.5 本章小结与展望 |
| 第三章 HDV核酶开关对肿瘤抗凋亡基因BCL-2干扰表达的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 溶液及培养基配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基于EGFP的RNAi核酶开关载体的构建 |
| 3.3.2 细胞培养及瞬时转染、EGFP荧光表达检测 |
| 3.3.3 基于调节抗凋亡基因Bcl-2 RNAi的核酶开关载体的构建 |
| 3.3.4 qRT-PCR检测转染后细胞在不同浓度茶碱作用下Bcl-2转录水平 |
| 3.3.5 Western Blot检测转染后细胞在不同浓度茶碱作用下Bcl-2蛋白表达水平 |
| 3.3.6 不同浓度茶碱作用下转染细胞凋亡检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 基于调节报告基因EGFP RNAi的核酶开关的构建 |
| 3.4.2 核酶开关调控肿瘤细胞内EGFP表达的分析 |
| 3.4.3 核酶开关调控肿瘤细胞Bcl-2基因mRNA水平的检测 |
| 3.4.4 核酶开关调控肿瘤细胞Bcl-2基因蛋白表达的检测 |
| 3.4.5 核酶开关调控肿瘤细胞凋亡的检测 |
| 3.5 本章小结及展望 |
| 第四章 基于核酶开关的哺乳细胞内TPP的荧光生物传感器的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株、质粒和细胞系 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.2.4 溶液及培养基配置 |
| 4.2.5 引物和质粒构建列表 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 哺乳细胞中TPP核酶开关质粒的构建 |
| 4.3.2 细胞培养及瞬时转染 |
| 4.3.3 转染后细胞内EGFP表达的荧光显微镜观察与流式细胞仪分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 pEGFP-TPP-HHR-ON/OFF的质粒的构建 |
| 4.4.2 不同TPP浓度下HEK293细胞内EGFP基因表达分析 |
| 4.5 本章小结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
（8）CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 含tRNA~(val)启动子的195位的核酶表达载体pPHCV5-R1的测序结果 |
| 3.2 含tRNA~(val)启动子的150位的核酶表达载体pPHCV5-R2的测序结果 |
| 3.3 以质粒pPSV-1为模板，经PCR获取目的基因，能顺利扩增出大小约173bp的条带 |
| 3.4 CTE介导的含tRNA~(val)启动子150位的核酶表达载体pPHCV5-CR2的测序结果 |
| 3.5 CTE介导的含tRNA~(val)启动子HCV5-NCR区195位的核酶表达载体pPHCV5-CR1的测序结果 |
| 3.6 质粒1.5%琼脂糖凝胶电泳图片及PCR鉴定结果 |
| 3.7 目标质粒P~(BM4-5 HCV)和空白质粒P~(RC/CMV)转染QSG7701细胞形成的阳性克隆图片 |
| 3.8 细胞总RNA1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.9 稳定转染细胞组RT-PCR鉴定 |
| 3.10 稳定转染细胞组westernBlotting鉴定 |
| 3.11 细胞总RNA1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.12 普通核酶和复合核酶对稳定转染的QSG7701细胞中HCV RNA的抑制作用 |
| 3.13 普通核酶和新核酶对稳定转染的QSG7701细胞中HCV蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（9）猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 戊型肝炎的研究进展 |
| 1.1.1 戊型肝炎的病原学 |
| 1.1.2 戊型肝炎的流行病学 |
| 1.1.3 戊型肝炎临床症状和病理变化 |
| 1.1.4 戊型肝炎的诊断 |
| 1.1.5 戊型肝炎疫苗的研究 |
| 1.1.6 戊型肝炎的预防 |
| 1.2 RNA病毒的反向遗传操作研究 |
| 1.2.1 感染性克隆的构建 |
| 1.2.2 感染性克隆的产生 |
| 1.2.3 感染性克隆的应用 |
| 1.2.4 RNA病毒感染性克隆构建的国内外研究进展 |
| 1.2.5 戊型肝炎病毒反向遗传操作的研究 |
| 1.3 戊型肝炎病毒研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 粪便样品及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 细胞菌株质粒与载体 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪戊型肝炎病毒全基因组克隆及序列分析 |
| 2.2.2 重组质粒pHEa的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pCHE的构建 |
| 2.2.4 重组质粒pHEa、pCHE的大量制备 |
| 2.2.5 重组质粒pHEa的体外转录 |
| 2.2.6 A549和HepG2细胞的培养 |
| 2.2.7 重组质粒pHEa体外转录本及pCHE质粒的转染 |
| 2.2.8 全基因组感染性克隆cDNA的感染性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪戊型肝炎病毒全基因组克隆及序列分析 |
| 3.1.1 猪戊型肝炎病毒阳性样品的选择 |
| 3.1.2 全基因组扩增结果 |
| 3.1.3 基因组序列测定结果 |
| 3.2 猪HEV重组质粒pHEa构建 |
| 3.2.1 EcoRV酶切位点及T7启动子的引入 |
| 3.2.2 分子标志NruI的引入 |
| 3.2.3 pHE重组质粒构建 |
| 3.2.4 重组质粒pEH的修正 |
| 3.3 重组质粒pCHE的构建 |
| 3.3.1 T7启动子及核酶的引入 |
| 3.3.2 重组质粒pCHE构建 |
| 3.4 基因组全长cDNA感染性的检测 |
| 3.4.1 细胞病变的观察 |
| 3.4.2 间接免疫荧光试验(IFA)检测培养细胞 |
| 3.4.3 RT-PCR检测 |
| 3.4.4 电镜检测病毒粒子 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HEV阳性样品的选择 |
| 4.2 猪戊型肝炎病毒全基因组克隆及序列分析 |
| 4.3 感染性克隆cDNA的完整性与真实性 |
| 4.4 重组质粒感染性较低的可能原因及未来的解决方法 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）脱氧核酶及锁核酸核酶对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 锁核酸与锁核酸核酶研究进展 |
| 第二节 脱氧核酶研究进展 |
| 第三节 基因治疗研究进展 |
| 第二章 脱氧核酶及锁核酸核酶的设计及转染HepG2.2.15 细胞 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三章 脱氧核酶及锁核酸核酶对转染后HepG2.2.15 细胞HBsAg 和HBeAg 表达抑制作用的研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文、科研课题及取得的成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
四、不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义（论文参考文献）
- [1]新型自剪切型核酶twister-sister和hatchet的结构以及催化机制研究[D]. 郑路倩. 浙江大学, 2021(01)
- [2]西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究[D]. 李国华. 石河子大学, 2020(04)
- [3]猪肠道冠状病毒细胞受体及毒力因子研究[D]. 王斌. 浙江大学, 2020
- [4]核酶与核糖开关转录折叠动力学机制的研究[D]. 王晏莉. 武汉大学, 2019(08)
- [5]基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的初步研究[D]. 赵毕妍. 厦门大学, 2019(12)
- [6]猪瘟病毒遗传进化分析与感染性克隆构建[D]. 徐海娈. 华南农业大学, 2018(08)
- [7]基于配体诱导的人工核酶开关对哺乳动物细胞基因表达调控的研究[D]. 张媛媛. 中国科学技术大学, 2017(09)
- [8]CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究[D]. 刘波. 中南大学, 2007(05)
- [9]猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建[D]. 于敏. 东北农业大学, 2007(01)
- [10]脱氧核酶及锁核酸核酶对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达抑制作用的研究[D]. 胡玉琳. 吉林大学, 2006(10)