一、吞噬的“119”（论文文献综述）
梁菲[1]（2020）在《跑台运动对APP/PS1小鼠海马小胶质细胞清除Aβ功能的影响》文中研究指明目的小胶质细胞是中枢神经系统免疫细胞,其功能障碍与AD的发病密切相关。本研究以雄性APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠为实验对象,探讨3个月的跑台运动干预对该模型小鼠空间学习记忆能力和海马Aβ累积的影响。本研究从小胶质细胞清除、吞噬和降解功能分析运动减少海马Aβ累积的细胞学机制。方法将48只3月龄雄性APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1安静组（APP/PS1-SED,n=24）和APP/PS1运动组（APP/PS1-EX,n=24）,将42只3月龄雄性C57BL/6野生小鼠随机分为野生安静组（WT-SED,n=21）和野生运动组（WT-EX,n=21）。APP/PS1-EX组小鼠和WT-EX组小鼠进行3个月的有氧跑台运动,每天45min,每周5天。运动干预结束后,采用Morris水迷宫实验检测各组小鼠的空间学习和记忆能力。行为学实验结束24小时后,每组取6只小鼠深度麻醉后经心灌注预冷的PBS冲出血液,随后取右半脑置于4%多聚甲醛中固定制成石蜡切片,左侧海马组织用于Elisa实验;每组另取6只小鼠深度麻醉后取左右海马组织,流式分选小胶质细胞后,用于Elisa和Western blot实验;每组再取3只小鼠按10mg/kg体重的剂量腹腔注射methoxy-X04,另取1只APP/PS1-SED组小鼠不注射methoxy-X04,3小时后深度麻醉小鼠,取左右海马用于流式分析;各组剩余小鼠（WT-SED组和WT-EX组各6只,APP/PS1-SED组8只,APP/PS1-EX组9只）深度麻醉后取左右海马分离原代小胶质细胞,用于体外Aβ清除、吞噬和降解实验,TFEB的荧光染色以及溶酶体pH的检测。具体检测指标如下:1)Aβ指标:Elisa检测小鼠海马组织中可溶性Aβ40和Aβ42的水平,石蜡切片methoxy-X04染色检测小鼠海马纤维样Aβ的沉积水平。2)小胶质细胞功能性实验指标及细胞内Aβ水平:在体外Aβ清除实验中,Elisa检测各组小鼠小胶质细胞培养基上清液中残余的Aβ42水平;在在体Aβ吞噬实验中,流式分析各组小鼠海马methoxy-X04+Tmem119+细胞占Tmem119+细胞的百分比、Tmem119+细胞内methoxy-X04的平均荧光强度;在体外Aβ吞噬实验中,Elisa检测小胶质细胞内FAM-Aβ42的水平;在体外Aβ降解实验中,细胞methoxy-X04染色检测t3和t24时刻小胶质细胞内Aβ水平,并计算降解指数;Elisa检测小胶质细胞内可溶性Aβ40和Aβ42的水平。3)溶酶体相关指标:荧光Elisa检测各组小鼠小胶质细胞溶酶体酶CTSB和CTSD的活性及溶酶体pH,Western blot检测小鼠小胶质细胞成熟CTSB、成熟CTSD、LAMP1、LAMP2和TFEB的蛋白水平,细胞免疫荧光染色检测小胶质细胞TFEB的核转位情况。结果1)在定位航行实验中,APP/PS1-SED组小鼠的潜伏期在第4天和第5天时显着高于WT-SED组小鼠,游泳总路程在第5天时显着高于WT-SED组小鼠,站台象限时间百分比在第4天和第5天时显着低于WT-SED组小鼠;与APP/PS1-SED组小鼠相比,APP/PS1-EX组小鼠第5天的潜伏期显着减少。在空间探索实验中,与WT-SED组相比,APP/PS1-SED组小鼠的站台穿越次数显着减少;与APP/PS1-SED组相比,APP/PS1-EX组小鼠的站台穿越次数显着增多。与WT-SED组相比,APP/PS1-SED组小鼠海马组织中可溶性Aβ40、Aβ42和纤维样Aβ沉积水平均显着升高;与APP/PS1-SED组相比,APP/PS1-EX组小鼠海马组织中可溶性Aβ40、Aβ42和纤维样Aβ沉积的水平显着降低。2)与WT-SED组相比,APP/PS1-SED组小鼠海马小胶质细胞培养基上清液中残余的Aβ42水平显着增多,methoxy-X04+Tmem119+细胞占Tmem119+细胞的百分比、Tmem119+细胞内methoxy-X04的平均荧光强度和小胶质细胞内可溶性Aβ42水平显着升高,小胶质细胞内FAM-Aβ42的水平显着降低,小胶质细胞的降解指数显着减小;与APP/PS1-SED组相比,APP/PS1-EX组小鼠海马小胶质细胞培养基上清液中残余的Aβ42水平显着降低,methoxy-X04+Tmem119+细胞占Tmem119+细胞的百分比、Tmem119+细胞内methoxy-X04的平均荧光强度和小胶质细胞内可溶性Aβ42水平显着降低,小胶质细胞的降解指数显着增大,而小胶质细胞内FAM-Aβ42的水平保持不变。3)与WT-SED组相比,APP/PS1-SED组小鼠小胶质细胞核TFEB的表达显着减少,溶酶体pH显着增大,溶酶体酶CTSB和CTSD的活性显着降低;与APP/PS1-SED组相比,APP/PS1-EX组小鼠小胶质细胞核TFEB的表达显着升高,溶酶体膜相关蛋白LAMP1和LAMP2的蛋白水平上调,溶酶体pH显着降低,溶酶体酶CTSD的活性和成熟CTSD的蛋白水平显着升高。结论1)APP/PS1小鼠海马Aβ累积增多,空间学习和记忆能力减退;3个月的跑台运动干预可显着减少APP/PS1小鼠海马Aβ累积,改善Aβ诱发的空间学习记忆能力损害。2)APP/PS1小鼠海马小胶质细胞清除、吞噬和降解纤维样Aβ的能力受损,小胶质细胞内Aβ累积增多;3个月的跑台运动干预能显着增强APP/PS1小鼠海马小胶质细胞清除和降解纤维样Aβ的能力,减少小胶质细胞内Aβ的累积,但对小胶质细胞吞噬纤维样Aβ的能力没有产生显着影响。3)APP/PS1小鼠海马小胶质细胞TFEB核转位减少,溶酶体功能障碍;3个月的跑台运动干预能显着增强APP/PS1小鼠海马小胶质细胞TFEB核转位及其介导的溶酶体功能。
李威[2]（2020）在《红系造血岛巨噬细胞的鉴定及生物学特征研究》文中提出研究背景和目的:红系造血岛（Erythroblastic island,EBI）由一个中央巨噬细胞及围绕其周围的不同分化阶段的红细胞组成,是第一个被发现的造血龛。EBI巨噬细胞对红系发育具有重要调控作用,是红系发育领域的热点和难点。多年来研究者发现了多种可能的EBI巨噬细胞表面分子标记,EBI巨噬细胞调控红系发育的理论不断得到完善,然而由于始终未能发现鉴定和分离高纯度EBI巨噬细胞的方法,EBI巨噬细胞本身功能及其支持红系发育机理的研究受到了很大的阻碍。鉴于促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）对红细胞生成是必需的,EPO受体（Erythropoietin Receptor,EPOR）亦在多种非红系细胞中表达。因此,我们推测EBI巨噬细胞表达EPOR,这样EPO就可以同时作用于红系细胞以及EBI巨噬细胞从而保证高效的红细胞生成。为了验证这一假说,本课题拟结合Epor-eGFPcre小鼠模型、人胎肝以及体外共培养体系,综合运用流式细胞术、Imagestream、RNA-seq、单细胞测序（Single cell RNA-sequence,Sc-RNA-seq）等方法对EBI巨噬细胞进行详细系统地研究,构建EBI巨噬细胞鉴定和分离体系,明确其生物学特征,为深入了解EBI巨噬细胞支持红系发育的作用机理提供新的理论,也为未来研究EBI巨噬细胞在地中海贫血（β-thalassemia）、真性红细胞增多症（Polycythemia vera,PV）和骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome,MDS）等血液系统疾病中的作用提供重要的依据。研究方法（1）EBI巨噬细胞的鉴定、分离和免疫表型分析:利用流式细胞术结合细胞计数证明并不是所有的F4/80+Vcam1+CD169+巨噬细胞都是EBI巨噬细胞;在Epor-eGFPcre小鼠骨髓和胎肝以及人胎肝中,利用流式细胞术、流式细胞分选术和Imagestream方法鉴定并分离小鼠骨髓和胎肝以及人胎肝EBI巨噬细胞,并根据已知的对红系发育起重要作用的表面标记物分析其免疫表型。（2）EPO促进EBI形成的研究:小鼠进行EPO注射后,利用流式细胞术、细胞计数、Imagestream对小鼠骨髓和脾脏中有核红细胞数目、EBI巨噬细胞数目、EBI数目以及小鼠骨髓EBI巨噬细胞粘附分子CD163、CD169和Vcam1进行检测;检测人CD34+造血干细胞来源的巨噬细胞CD163、CD169和EPOR的表达,EPOR的表达同时利用EPO刺激后的信号转导进行验证;晚期红系细胞与人EBI巨噬细胞体外共培养检测EPO对人EBI形成的影响。（3）EBI巨噬细胞转录组学分析:利用分离小鼠骨髓EBI巨噬细胞的方法,分选出高纯度的小鼠骨髓EBI巨噬细胞,进行RNA-seq检测,并应用生物信息学软件进行转录组学分析;用同样的方法对人胎肝EBI巨噬细胞进行RNA-seq测序和转录组学分析;对RNA-seq检测发现的特异高表达分子进行q RT-PCR和流式细胞术或者Western Blot检测在m RNA和蛋白水平分别进行验证。（4）人胎肝EBI巨噬细胞异质性研究:利用流式降维分析法、Cytospins以及Imagestream分析人胎肝不同类型的EBI;分选出人胎肝EBI巨噬细胞进行10X Genomic单细胞测序,利用生物信息学软件进行分析,阐释不同功能的EBI巨噬细胞亚群。结果EBI巨噬细胞的鉴定、分离和免疫表型分析（1）定量结果显示小鼠骨髓中F4/80+Vcam1+CD169+巨噬细胞数:有核红细胞数为1:2.6,而文献报道一个EBI巨噬细胞其周围围绕有核红细胞数目为5-30个;因此,并不是所有的F4/80+Vcam1+CD169+巨噬细胞都是EBI巨噬细胞;小鼠骨髓中约5%的F4/80+巨噬细胞是Epor-eGFP+,胎肝中约31%的F4/80+巨噬细胞是Epor-eGFP+;分选小鼠骨髓和胎肝F4/80+Epor-eGFP+和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞发现他们形态差异很大,提示他们属于不同的巨噬细胞亚群。（2）Imagestream检测发现小鼠骨髓和胎肝中超过90%的EBI是由F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞形成的,其中小鼠骨髓中EBI巨噬细胞周围围绕3个、4个和5个及以上有核红细胞的比例分别是约20%、26%和54%;而小鼠胎肝中EBI巨噬细胞周围围绕3个、4个和5个及以上有核红细胞的比例分别是约10%、20%和70%;Imagestream结果显示在小鼠骨髓和胎肝中超过90%的吞噬红细胞核的巨噬细胞是F4/80+Epor-eGFP+;Imagestream结果显示小鼠骨髓中超过90%的EBI巨噬细胞表达Vcam1、CD169和ER-HR3,约35%的EBI巨噬细胞表达CD163,约52%表达Ly6C以及约32%表达CD11b;之外,Ly6G之前被认为是EBI巨噬细胞的一个分子标记,在所有EBI巨噬细胞中均不表达。（3）流式细胞术检测结果显示小鼠骨髓中所有的F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞均表达CD45;大部分F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞是CD11bmedi/-,而68%的F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞表达CD11b;约90%的F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞表达ER-HR3,而仅约52%的F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞表达ER-HR3;虽然大部分F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞均表达CD169和Vcam1,但是对比F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞,F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞具有较高水平的CD169和Vcam1的表达;F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中约35%表达CD163,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞均不表达CD163;F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中约69%表达Ly6C,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞中约57%的细胞表达Ly6C;这些结果提示F4/80+Epor-eGFP+和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞具有明显的免疫表型差异。（4）流式细胞术检测结果显示在人胎肝CD163+巨噬细胞中约27%表达EPOR,Imagestream结果显示超过90%的人胎肝EBI是由CD163+EPOR+巨噬细胞形成的;分选的CD163+EPOR+巨噬细胞和CD163+EPOR-巨噬细胞形态差异很大,且在CD163+EPOR+巨噬细胞中可观察到吞噬细胞核和衰老红细胞的现象。EPO促进EBI形成的研究（1）分选的小鼠骨髓F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞具有接受EPO刺激后信号转导反应,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞对EPO无反应;EPO注射后导致小鼠骨髓有核红细胞、EBI巨噬细胞以及EBI数明显增加;EBI增多的原因至少部分是由于EPO注射后EBI巨噬细胞Vcam1表达升高引起的;EPO注射后脾脏代偿性造血的EBI也是由F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞形成的,脾脏有核红细胞、EBI巨噬细胞以及EBI数目亦明显增加。（2）人脐带血CD34+造血干细胞来源的巨噬细胞表达CD163、CD169和EPOR;EPO刺激后STAT5和ATK磷酸化明显升高进一步证明了EPOR的表达;体外岛屿形成实验显示EPO可以促进人EBI的形成。小鼠和人EBI巨噬细胞的转录组学分析（1）小鼠骨髓巨噬细胞RNA-seq结果提示F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞具有特殊的支持红系发育的功能如红系发育、受体介导的内吞、凋亡细胞清除、铁稳态等,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞则主要与免疫反应和炎症反应等相关。重要的是,已知的与红系发育息息相关的分子如生长因子Igf1、Il18等,粘附分子Vcam1、CD169和CD163,铁代谢分子以及红细胞核吞噬和消化相关分子Mertk、Timd4、Dnase2α、Trf、Homox1、Slc40a1等均在F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中高表达。除此之外,四个转录因子Klf1、Spic、Nr1h3和Maf选择性地在F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中表达,提示其在EBI巨噬细胞中的选择性调控作用。（2）人胎肝巨噬细胞RNA-seq结果提示人胎肝EBI巨噬细胞上调的信号通路主要与脂类代谢、受体介导的内吞、细胞粘附、细胞外基质重塑等功能相关,而CD163+EPOR-巨噬细胞主要和免疫反应、炎症反应、趋化等功能相关;CD163+EPOR+巨噬细胞高表达促进早期红细胞增殖的细胞因子IGF2、CXCL12等,与红细胞粘附的分子VCAM1、CD163、CD169、EMP等,吞噬和铁代谢相关分子如MERTK、AXL、TIMD4、HMOX1、SLC40A1、TRF等;除此之外,转录因子SPIC、NR1H3、PPARG、KLF1、TLX1、EPAS1和ETV5选择性地表达于CD163+EPOR+巨噬细胞,提示其对EBI巨噬细胞的选择性调控作用。人胎肝EBI巨噬细胞异质性研究（1）Cytospins和Imagestream结果显示人胎肝存在不同类型的EBI,如周围主要围绕早期红细胞的,周围主要围绕晚期红细胞的,吞噬红细胞脱出的细胞核的等;流式降维分析结果显示人胎肝EBI巨噬细胞存在明显异质性。（2）Sc RNA-seq分析结果显示人胎肝EBI巨噬细胞存在不同的功能亚群,主要有四群:一群是分泌细胞因子支持早期红系细胞增殖的;一群是周围围绕不同期别红细胞,监视红系发育进程清除异常红细胞的;一群是为晚期红细胞成熟供铁的;一群主要起到消化红细胞核。结论:（1）在小鼠骨髓和胎肝以及人胎肝中EBI巨噬细胞表达EPOR,且EPO可以通过调控其功能促进EBI形成。（2）EBI巨噬细胞通过分泌生长因子、直接与红细胞粘附、为晚期红细胞合成血红蛋白提供铁以及吞噬红细胞脱出的细胞核等方式支持红系发育。（3）EBI巨噬细胞存在异质性,在人胎肝中存在四个不同功能的EBI巨噬细胞亚群。
叶诗洋[3]（2019）在《敲除小胶质细胞VPS35的中枢神经效应以及在缺血性脑损伤中的作用研究》文中研究说明逆运复合物是一种多聚体的蛋白复合物,其主要功能是促进多种跨膜蛋白的细胞内转运过程。空泡蛋白分选相关蛋白35（Vacuolar protein sorting-associated protein 35,VPS35）是逆运复合物中货物识别亚单元中的关键组成部分,与包括阿尔茨海默病在内的神经退行性相关疾病的病理生理变化息息相关。当VPS35发生功能紊乱时（通过耗尽/突变）,逆运复合物的功能活性受损而产生多种病理后果,其中参与神经退行性病变相关级联反应的蛋白分子以及特异的逆运复合物货物蛋白也将受到损害,同时将会影响下游信号分子的传递。VPS35的表达无处不在,在整个中枢神经系统中都能检测到VPS35的表达,其中VPS35在神经元中的作用受到了大量的关注和研究。神经元中的VPS35参与了多种关键细胞过程的调节,如淀粉样前体蛋白（APP）转运和蛋白水解过程的调节、神经递质受体的转运、线粒体融合/分裂动力学,以及神经递质受体的建立和调节等关键细胞过程。但对于小胶质细胞VPS35的功能却尚不十分明确。近年来的研究发现在阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）病人的小胶质细胞中检测到VPS35的表达水平降低。小胶质细胞VPS35缺乏可减少细胞膜上小胶质细胞吞噬受体的表达,损害小胶质细胞的吞噬能力。虽然这些观察结果提示小胶质细胞VPS35参与AD的发病机制,但小胶质细胞的细胞功能究竟是如何受到VPS35缺陷的影响,以及VPS35缺陷的小胶质细胞是如何影响其周围神经组织的,尚不清楚。此外,缺血性脑损伤作为神经退行性疾病的环境致病因素之一,同时也是临床上最为常见的颅脑疾病,约占脑血管疾病发病率的70%,其高死亡率以及高致残率近年来受到了广泛的关注。当发生缺血性脑损伤时,首先血流受阻,阻碍氧气和葡萄糖的输送,形成缺血状态,导致能量损耗、谷氨酸受体过度活化、谷氨酸兴奋性毒性作用以及神经炎症反应,最终导致神经细胞大量死亡。而小胶质细胞是缺血性脑损伤的第一道防线,伴随转录调控和形态学的改变小胶质细胞可在伤后迅速聚集到损伤部位,释放效应分子,参与免疫应答,吞噬已死亡的细胞碎片。我们前期体外实验的结果发现,小胶质细胞系中敲除VPS35,小胶质细胞活化增强而炎症反应加重和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）表达增加。VPS35功能失调的小胶质细胞在炎症级联反应有何种关系,目前尚不清楚。因此我们试图探讨小胶质细胞VPS35在中枢神经系统功能维持和缺血性脑损伤中发挥何种作用,本研究分为以下两部分进行。第一部分,我们试图探寻小胶质细胞VPS35在中枢神经系统中扮演何种角色。通过RT-PCR技术在E17、P7、P14、P21、P60时间点对VPS35基因表达量的检测中发现,VPS35不仅仅在神经元中表达,同时在小胶质细胞的胞体和细胞突起上广泛表达。VPS35的表达量在小鼠不同年龄阶段各不相同（E17-P60）,在P14天时达到高峰,随后逐渐下降,通过LPS刺激小胶质细胞后VPS35水平明显升高,提示VPS35与LPS刺激的小胶质细胞反应有关。随后我们通过Cre-LoxP基因编辑系统首次培育了VPS35CX3CR1小鼠,一种小胶质细胞上VPS35特异性敲除的基因敲除小鼠模型。经免疫荧光和western blot的检测证实该小鼠模型的原代培养小胶质细胞的VPS35已经成功被清除。VPS35CX3CR1小鼠中的小胶质细胞在AD病最容易受损害的区域-海马和内嗅皮层区域,特别是海马DG（齿状回）和SGZ（颗粒下层）区域密度明显升高,同时我们对该区域的小胶质细胞的形态学进行观察发现,在VPS35CX3CR1小鼠中SGZ区域的小胶质细胞胞体和凸起长度明显增加。小胶质细胞密度和小胶质细胞形态变化往往提示与小胶质细胞活化程度增加有关。此外,多种小胶质细胞活化标志物（IBa-1、CD11b、CD16/32）的荧光染色以及western blot结果表明,小胶质细胞VPS35敲除后与在海马和SGZ区域小胶质细胞活化增加关系密切。为了检测小胶质细胞的增殖,我们使用细胞增殖标记物BrdU（5-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脱氧尿嘧啶核苷）标记,在24h后的脑片染色结果显示敲除组和对照组小胶质细胞增殖情况无显着差异。提示增加的小胶质细胞不是增殖来源。随后我们利用BrdU标记7d后的方法检测小胶质细胞的分化或迁移,结果提示VPS35敲除组BrdU染色标记显着增加。表明增加的小胶质细胞可能来自于分化增加或者迁移。此外BrdU+的细胞明显增加主要集中在VPS35CX3CR1小鼠的SGZ区域,而该区域是成年海马神经发生存在的主要区域,提示有NSC/NPC（neural stem/progenitor cell,神经干细胞/神经前体细胞）增殖和存活率增加。使用Ki67（一种标记分裂期细胞的标记物）与BrdU免疫荧光共定位,结果表明敲除组双阳性的细胞数量显着增加。而BrdU与未成熟神经元标志物DCX免疫荧光共定位结果却相反,敲除组共定位细胞数明显少与对照组。随后,免疫荧光定量分析以及western blot结果显示DCX的表达量显着降低。利用逆转录病毒标记神经元,1月后观察被标记的神经元形态学变化,结果VPS35CX3CR1小鼠的DG区域的神经元树突凸起长度,复杂性和树突棘密度均出现明显减少。以上结果共同提示,小胶质细胞VPS35敲除增加了NSC/NPC的同时减少其向神经元的分化并且阻碍了细胞周期的退出,干扰了成年小鼠海马神经发生,提示在成年小鼠CNS中小胶质细胞VPS35对新生神经元成熟化过程中的调节作用,小胶质细胞VPS35缺陷将导致突触整合前的新生神经元出现神经退行性病变样的形态学变化。为了探索小胶质细胞缺乏VPS35后是如何影响神经元的机制,我们采用原代小胶质细胞与原代神经元细胞共培养技术,观察到缺乏VPS35的小胶质细胞对神经元突触后物质的吞噬作用增强。提示对小胶质细胞出现了对周围神经元的异常修剪。最后,为了探索小鼠神经发生异常是否会影响神经功能,我们通过旷场实验、Y迷宫、强迫游泳、蔗糖偏好等多种行为学实验,证实小胶质细胞VPS35敲除后的小鼠存在长期记忆损害以及类似焦虑的行为学改变。第二部分,由于已经发现小胶质细胞VPS35对小胶质细胞活化产生影响,而小胶质细胞的活化与炎症反应息息相关。因此,我们采用以神经炎症反应为主要病理变化的缺血性脑损伤模型来探索小胶质细胞VPS35的作用。首先,我们使用光血栓脑卒中法（photothrombotic cortical stroke injury）,在受试小鼠的运动皮层区域建立缺血性脑损伤模型。采用TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色、尼氏染色、免疫组化、免疫荧光等技术评估小鼠缺血性脑损伤后损伤部位的大小和神经元细胞死亡数量以及严重程度,结果提示VPS35CX3CR1小鼠在缺血性脑损伤3d后大脑皮层缺血梗死区域明显减小,死亡的神经元数量显着低于对照组。同时利用神经功能评分、步态滑落实验、胶带清除实验来评估损伤后的运动神经功能缺陷,结果表明VPS35敲除组的小鼠的运动功能损害明显较对照组轻微。通过免疫荧光和western blot检测第一阶段DAM（Damage Associated Microglia,损伤相关小胶质细胞）标志物TMEM119、第二阶段DAM标记物LPL在缺血损伤后3d的差异,结果显示在梗死灶周围区域VPS35敲除组中TMEM119阳性小胶质细胞明显增加,而LPL阳性的小胶质细胞显着减少,提示在小胶质VPS35敲除可以干扰两个阶段DAM的产生。使用小胶质细胞活化标志物IBa1、M1型极性标志物iNOS、M2型极性标志物CD206通过免疫荧光、western blot等方法检测损伤后小胶质细胞的活化反应以及小胶质细胞的极性改变,以及趋化因子受体CX3CR1水平的变化,结果显示在损害后3d,VPS35敲除组的小胶质细胞在梗死灶周围区域密度显着增加,形态和分布出现明显差异,M1型促炎反应相关的小胶质细胞比例降低,M2型神经保护效应相关的小胶质细胞比例明显升高。应用RT-PCR技术检测在缺血后6h、1d、3d、7d小鼠的炎症因子和M1型M2型小胶质细胞相关基因Arg1、YM1/2、CD206、CD86、CD32、iNOS的mRNA水平差异,结果显示各时间点VPS35敲除组的小胶质细胞均偏向M2的极性活化,与之前的免疫荧光和western blot结果一致。通过免疫荧光和western blot检测趋化因子的特异性受体-CX3CR1表达变化,结果显示在VPS35敲除组的梗死灶周围区域CX3CR1表达降低,与先前报道的CX3CR1功能缺失后减轻缺血损伤反应一致。综上所述,我们的研究首次揭示了VPS35对维持小胶质细胞内环境稳态至关重要。在CNS中当小胶质细胞VPS35功能受到破坏时,产生的影响不仅是小胶质细胞本身,并且通过干扰其周围的神经干细胞和神经前体细胞的分化和增殖来影响关键的神经发生过程。另外,在皮层缺血性脑损伤模型中我们首次发现了小胶质VPS35的缺失可以起到一种保护作用。该保护作用可能主要是影响了小胶质细胞的活化极性,减轻神经炎症反应发挥神经保护作用。同时初步揭示在缺血性脑损伤反应中CX3CR1可能是小胶质VPS35的潜在货物蛋白,但仍然需要进一步研究来验证。我们的发现为探寻逆运复合物疾病相关货物蛋白以及介质在以小胶质细胞活化为主的神经系统疾病中的作用和作为调控治疗靶点提供了重要的实验证据。
张猛猛[4]（2019）在《玛咖根部多糖的结构鉴定及免疫调节活性的研究》文中进行了进一步梳理玛咖虽然原产地是秘鲁,但我国自引种玛咖以来已成为世界上的玛咖主要出产国。然而近些年来,我国的玛咖市场陷入了低谷。造成这一结果的原因之一就是对于玛咖的物质组成和生理活性没有正确而全面的认识。玛咖多糖作为玛咖的活性成分之一,在近年来逐渐受到关注。但是目前的研究多以我国的玛咖为主,对于原产地秘鲁玛咖中多糖的结构解析和生理活性的探索还很缺乏。因此本文以秘鲁玛咖干根为原料,从中分离出两种多糖,对这两种多糖的基本结构和生理活性进行了研究。主要研究结果如下:（1）作者首先研究了实验中所用的秘鲁玛咖中的纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等基本组成成分的含量。另外,采用水提法提取玛咖多糖,通过单因素法优化了玛咖多糖的提取工艺,确定了最佳提取条件为料液比1:30,提取温度100℃,提取时间2 h,提取次数为一次。最终使用最佳提取条件所得到的玛咖多糖的得率为6.13%。之后通过离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化出三种玛咖多糖MC-1、MC-2和MC-3。选取MC-1和MC-2为后续实验的研究对象。MC-1和MC-2的多糖纯度分别为97.5%和98.3%。之后通过紫外光谱扫描和内毒素检测确认MC-1和MC-2中不含核酸、蛋白质和内毒素等杂质。通过TG-DSC发现MC-1和MC-2具有良好的热稳定性,其中MC-2的热稳定性要好于MC-1。（2）然后通过高效凝胶渗透色谱、红外光谱扫描、气相质谱、甲基化分析、核磁共振和刚果红实验等解析了MC-1的基本结构,发现MC-1的分子量11.3 kDa,主要是由阿拉伯糖（26.21%）,甘露糖（11.81%）和葡萄糖（53.66%）和半乳糖（8.32%）组成,主要的糖苷键类型是（1→5）-α-L-Ara,（1→3）-α-L-Man,（1→2,6）-α-L-Man,（1→）-α-D-Glc,（1→4）-α-D-Glc,（1→6）-α-D-Glc and（1→6）-β-D-Gal。作者以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为模型,研究了MC-1的免疫调节活性。结果表明MC-1可以增强小鼠巨噬细胞细胞的吞噬能力,增加NO,TNF-α和IL-6的表达和分泌,说明MC-1具有显着的免疫调节活性。此外,MC-1在RAW 264.7细胞膜表面的识别受体为TLR2,CR3和MR。（3）作者用同样的方法对MC-2的基本结构进行了鉴定。结果表明MC-2是一种分子量为9.83kDa的多糖,其主要由阿拉伯糖（20.9%）,甘露糖（4.5%）,葡萄糖（71.9%）和半乳糖（2.7%）组成。MC-2的主要糖苷键连接类型是（1→5）-α-L-Ara,（1→3）-α-L-Man,（1→）-α-D-Glc,（1→4）-α-D-Glc,（1→6）-α-D-Glc和（1→6）-β-D-Gal,而且MC-2具有三螺旋的空间构象。在以RAW 264.7细胞为模型的免疫活性评价试验中,MC-2表现出比MC-1更高的对免疫调节活性。此外,MC-2不仅可以诱导M0型巨噬细胞向M1型极化,还可以使M2型巨噬细胞转化为M1表型。尽管MC-2不能将巨噬细胞从M1型转为M2型,但它仍然可以抑制LPS诱导的炎症反应。而MC-2是通过TLR2,TLR4,CR3和MR四种受体来激活巨噬细胞的。（4）在以Caco2细胞单层膜为模型的研究中,发现MC-1和MC-2难以被小肠吸收。但是MC-1和MC-2可以促进Caco2细胞分泌IL-8、IL-10、IL-12和INF-γ等细胞因子,并能够通过Caco2细胞单层膜促进RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO等细胞因子。此外,MC-1和MC-2还可以通过调节TLR4受体的转录水平来调节ZO-1和occludin等蛋白的表达,进而改善LPS导致的Caco2单层膜致密性的损伤。同时MC-1和MC-2还可以抑制LPS引起的Caco2细胞的TNF-α、IL-8和INF-γ等炎症因子的分泌,并提高IL-10等抗炎因子的分泌。（5）作者还对MC-1和MC-2抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和抗脂肪肝等生理活性进行了初步探索。发现MC-1和MC-2拥有较弱的直接抑制肿瘤细胞增殖的能力,但MC-1和MC-2能通过激活巨噬细胞展现较强的抑制肿瘤增殖的活性;MC-1和MC-2的自由基清除能力和还原力都很弱,但MC-1和MC-2能够很好的保护AAPH产生的自由基对红细胞和肝细胞的氧化损伤;MC-1和MC-2几乎没有抗HBV的活性,仅MC-2在较高浓度时对HBeAg有一定的抑制作用;MC-1对于油酸和棕榈酸诱导的肝细胞的脂肪变性没有缓解作用,而MC-2对此展现出了较好的改善能力。以上的研究结果表明,MC-1和MC-2是一种新的玛咖多糖,其对巨噬细胞和肠道免疫系统具有显着的免疫调节活性,并且在抗肿瘤、抗氧化和抗脂肪肝方面表现出一定的潜力。这些结果为玛咖多糖更深入的研究和应用奠定了基础。
王楠楠[5]（2018）在《嗜水气单胞菌Ⅵ型分泌系统效应分子Hcp的功能分析》文中研究说明嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种常见的条件致病菌,广泛存在于水环境中,能导致多种淡水鱼暴发出血性败血症,也能引起人类食物中毒、感染性腹泻、败血症等。Ⅵ型分泌系统（T6SS）是许多革兰阴性菌用于靶向真核宿主细胞或者其他细菌的一种多功能武器,在细菌的毒力作用和细菌间竞争过程中发挥重要作用。溶血素共调节蛋白（Hcp）是T6SS的重要结构成分和效应分子,其分泌被认为是T6SS发挥功能的标志。然而到目前为止,T6SS在嗜水气单胞菌的功能仍未被报道过。本研究对已完成全基因组测序的14株嗜水气单胞菌进行了生物信息学分析,发现T6SS基因簇在嗜水气单胞菌不同分离株中具有多样性;在此基础上,分别对嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35和美国分离株ML09-119的T6SS效应分子Hcp进行了功能分析,并评价了重组Hcp蛋白在常见淡水养殖鱼类—鲫鱼中的免疫原性和保护效力;同时,对嗜水气单胞菌NJ-35中的一组新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP进行了鉴定及功能分析。1.嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35 T6SS基因簇的鉴定及Hcp家族蛋白多样性分析对已完成全基因组测序的14株嗜水气单胞菌进行生物信息学分析。结果显示,除GYK1外,其余6株中国分离株均含有1个T6SS基因簇,而在7株美国分离株中,除ATCC 7966和AHNIH1外均未发现该基因簇的存在。嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35 菌株培养上清中 Hcp 的存在,提示在 NJ-35 中存在着功能性的 T6SS。并发现低温条件可强烈诱导嗜水气单胞菌Hcp的分泌。在NJ-35基因组中存在hcp基因的3个拷贝,其中有1个位于T6SS基因簇内,另2个位于基因簇外。为进一步研究效应分子Hcp在NJ-35中的作用,本试验利用同源重组技术构建了hcp的单基因、双基因及三基因缺失株;并在此基础上,分别构建了相应的互补株。另外,还构建了 hcp基因的交叉互补株。研究结果表明hcp1在NJ-35菌株中Hcp的表达和分泌中发挥重要作用:当hcp1基因被敲除后,hcp3可能起到一定的补充作用,而hcp2在体外培养条件下并不表达。提示,Hcp1可能与T6SS的组装和分泌功能相关。2.Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35致病及环境适应过程中的作用对嗜水气单胞菌NJ-35野生株、hcp基因缺失株及互补株进行生物学特性分析。结果表明,Hcp1对于T6SS的组装是必需的,并且在细菌间竞争过程中发挥关键作用;Hcp2负调控细菌的生物被膜形成能力和对真核细胞的黏附能力,同时促进细菌对斑马鱼的毒力作用和抗四膜虫的捕食能力;Hcp3正调控细菌的生物被膜形成能力和黏附能力。上述结果表明,在嗜水气单胞菌NJ-35中存在功能性的T6SS,并且这3个Hcp在NJ-35的致病及环境适应过程中发挥着不同的作用。3.Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌美国分离株ML09-119致病及环境适应过程中的作用对嗜水气单胞菌美国分离株ML09-119全基因组序列进行分析,发现该菌株中不存在T6SS基因簇,但含有2个hcp基因。为探究ML09-119中hcp的功能,本研究分别构建了 ML09-119的hcp-1和hcp-2单基因及双基因缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,在体外培养条件下,美国分离株ML09-119的hcp-2可检测到转录,而hcp-1未发生转录。对野生株和缺失株的生物学特性分析结果表明,在ML09-119中,hcp-1和hcp-2均不参与细菌的运动性、生物被膜形成及细菌间竞争作用。在动物感染试验中,野生株及hcp-2单基因缺失株注射鲶鱼分别在30 h和36 h内全部死亡。而hcp-1单基因缺失株及hcp-1和hcp-2双基因缺失株注射鲶鱼在48 h内并未全部死亡,存活率分别为40%和30%;并且在感染后12 h时,这两株缺失株在鲶鱼肾脏中的载量均显着下降,hcp-1单基因缺失株在鲶鱼肝脏中的载量也显着降低。上述结果表明,hcp-1参与ML09-119对鲶鱼的致病作用。4.嗜水气单胞菌NJ-35 hcp1基因缺失株和野生株的比较蛋白质组学分析hcp1基因缺失株对HEp-2细胞的黏附能力相较于野生株出现显着性降低（P<0.001）。利用非标记定量蛋白质组学技术检测hcp1单基因缺失株与NJ-35野生株细胞外膜蛋白样品中的差异表达蛋白,共鉴定到23个上调表达蛋白和30个下调表达蛋白。其中,包括一些与细胞黏附作用相关的蛋白,如鞭毛形成相关蛋白、菌毛形成相关蛋白以及外膜蛋白等。实时荧光定量PCR验证结果显示,在hcp1单基因缺失株中,Ⅰ型菌毛形成相关基因fimC和fimD的转录水平均显着下调（P<0.001）,提示hcp1可能通过调控fimC、fimD等基因的表达来影响细菌的黏附性。5.嗜水气单胞菌Hcp重组蛋白的鲫鱼免疫效果分析疫苗免疫是预防运动性气单胞菌败血症（MAS）及其它常见疾病发生的有效方法,对于水产养殖产业的可持续增长十分重要。本研究分析了hcp基因在240株气单胞菌分离株中的分布情况,制备了NJ-35 Hcp的重组蛋白,并分析了该蛋白在中国常见淡水养殖鱼类-鲫鱼中的免疫原性和保护效力。PCR检测结果显示,hcp基因在多种气单胞菌中均有分布,尤其是在嗜水气单胞菌中（39/39）。免疫印迹分析结果表明Hcp在不同血清型嗜水气单胞菌中的表达比较保守。攻毒鲫鱼10天后,与未免疫组（7.14%）相比,重组Hcp蛋白免疫组的存活率（46.67%）显着提高。疫苗免疫组血清IgM抗体水平以及肾、脾和鳃组织中的白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的表达水平均显着上升。以上结果表明重组Hcp蛋白有望成为预防嗜水气单胞菌感染的候选疫苗靶蛋白之一。6.嗜水气单胞菌NJ-35新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP的鉴定及功能分析T6SS可通过效应蛋白的递送而发挥对其他细菌细胞或真核细胞的毒力作用。本研究利用生物信息学分析技术在14株嗜水气单胞菌全基因组中鉴定出多组含有毒素结构域的潜在效应蛋白及其下游同源免疫蛋白。并首次在嗜水气单胞菌NJ-35中鉴定出一组新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP。TseP由U87611145所编码,携带一个S型脓菌素（PyocinS）结构域。为探究NJ-35中TseP的功能,本研究构建了tseP和tsiP基因的缺失株和相应互补株。发现在NJ-35中,tseP和tsiP基因的缺失使得细菌的生物被膜形成能力显着上升,而并不影响细菌的运动性和抗四膜虫吞噬能力。细菌竞争试验结果显示,NJ-35野生株对ΔtsePtsiP和大肠杆菌均具有明显的杀伤作用（P<0.001）;tseP基因的缺失显着减弱了 NJ-35对ΔtsePtsiP的杀伤作用（P<0.01）,而并未降低NJ-35对大肠杆菌的杀伤作用,提示TseP可能参与嗜水气单胞菌种内竞争作用。该试验结果还表明,TseP的抗菌作用依赖于T6SS,其同源免疫蛋白TsiP可保护自身细菌免于TseP的杀伤作用。综上所述,T6SS基因簇在嗜水气单胞菌不同分离株中具有多样性,T6SS效应分子Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌NJ-35致病及环境适应过程中发挥着不同的作用,本研究为研究细菌如何利用T6SS介导微生物间的相互作用提供了新的思路。
杨东达[6]（2020）在《海参内脏多糖的分离、结构鉴定、免疫活性及其应用研究》文中研究表明海参内脏多糖是海参内脏的主要活性成分之一,具有多种生理活性,然而在海参加工过程中海参内脏通常被直接丢掉。目前对海参内脏多糖的研究仅局限于简单的生化指标评价,而对海参内脏多糖的结构特征及相关活性机理缺乏系统的研究。本论文以海参内脏为原料,对海参内脏多糖主要组分进行分离纯化、一级结构及高级结构鉴定、体外体内免疫活性进行了系统研究,探讨了海参内脏多糖/溶菌酶纳米复合物作为姜黄素递送载体的应用。主要研究结果如下:（1）海参内脏多糖的分离:通过酶解海参内脏,经过季铵盐沉淀,醇沉等得到海参内脏粗多糖,平均得率为4.90%。采用DEAE-52柱层析分离纯化海参内脏粗多糖并通过活性预筛选获得两种主要多糖组分,并分别命名为SCVP-1和SCVP-2。经过Sephadex G-200进一步分离纯化,得到纯化的SCVP-1和SCVP-2,其纯度分别为92.51%和96.87%,分子量分别为180.8 kDa和209.1 kDa。（2）海参内脏多糖的结构表征:经HPLC分析表明,SCVP-1构成包括了甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖以及岩藻糖组成,对应的摩尔比为1.00∶1.41∶0.88∶2.14∶1.90∶1.12∶1.24;SCVP-2由氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成,其摩尔比为1.61∶1.00∶4.79∶1.32∶3.29。通过红外光谱和核磁共振波谱表征,推测出SCVP-1是一种具有硫酸软骨素结构的糖胺聚糖,其主要骨架结构为→4)GlcUAβ（1→3）GalNAcβ（1→,Fuc2,4S和Fuc3,4s通过1→3糖苷键与GlcUA的O-3位相连。SCVP-2是一种岩藻聚糖硫酸酯,主要骨架结构为[→3）Fuc2Sα（1→3）Fuc4Sα（1→3）Fuc0sα(1→]n。高级结构分析表明,SCVP-1表面呈松散不规则的片状结构,SCVP-2表面呈纤维状网络交错延伸。两种组分均具晶体结构和较好的热稳定性,热分解温度分别为239.54℃和236.11℃。SCVP-1在溶液中呈球形链构象,SCVP-2呈无规线团链构象,两种多糖分子的粒度分布范围较分散,在溶液中存在聚集行为,其有效直径分别为1112.4 nm和1316.0 nm。两种海参内脏多糖均是阴离子多糖。（3）海参内脏多糖体外免疫调节活性评价:SCVP-1可以促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL-1β、IL-6及TNF-α并提高巨噬细胞的吞噬作用。TLR4受体是SCVP-1激活巨噬细胞的作用靶点,并通过MAPKs和NF-κB信号转导通路来激活巨噬细胞。SCVP-2则能通过调控MAPKs和NF-κB信号转导通路影响炎症细胞因子的过量释放,从而达到抗炎的效果。（4）海参内脏多糖体内免疫调节活性评价:SCVP-1能显着提高免疫低下小鼠的免疫脏器指数,促进脾淋巴细胞的增殖率,提升小鼠的吞噬能力,有效促进小鼠溶血素抗体的生成,提高血清中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平,有效缓解迟发型变态反应,提升抗氧化能力。而SCVP-2对免疫低下小鼠的免疫功能及抗氧化能力并无明显改善。（5）海参内脏多糖SCVP-1在营养成分递送系统中的应用:通过带负电的SCVP-1和带正电的溶菌酶Ly以静电作用力自组装构建纳米复合物。对Ly/SCVP-1纳米复合物进行形貌观察及表征,其外形似球形,粒径大小为197.1nm。并对姜黄素Cur进行负载,负载Cur Ly/SCVP-1纳米复合物能显着提升Cur在磷酸盐缓冲液和小鼠血清中的稳定性及抗肿瘤活性。多糖/蛋白质纳米复合体系能够通过负载不稳定的活性成分从而提高其稳定性,在食品及药品领域具有良好的应用前景。
杨斓[7]（2019）在《支气管败血波氏杆菌及其噬菌体的分离鉴定与特性研究》文中研究表明支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）是一种呼吸道病原菌,可广泛感染多种动物引起呼吸道疾病,尤其是在动物免疫力较低的情况下,容易与其它病原形成混合感染,导致更为严重的疾病。对养猪业而言,Bb单独感染主要引起猪支气管肺炎或非进行性萎缩性鼻炎（Non-progressive atrophic rhinitis,NPAR）,与产毒素多杀性巴氏杆菌共感染可引起进行性萎缩性鼻炎（progressive atrophic rhinitis,PAR）,降低猪只饲料转化率,使得猪只生长缓慢,造成严重的经济损失。噬菌体（Bacteriophage）是一类特异性感染细菌的病毒。根据噬菌体的寄生方式可将噬菌体分为裂解性噬菌体与溶原性噬菌体。裂解性噬菌体主要用于临床防治多重耐药菌的感染,因溶原性噬菌体具有整合到宿主菌的特性,可改变宿主菌的一些性状,故不用于致病菌的防治。本研究旨在从我国规模化猪场中分离支气管败血波氏杆菌并对其进行药物敏感性分析,了解Bb近两年的耐药情况,为指导临床用药奠定基础。并选用临床分离的Bb作为指示菌进行相关噬菌体的分离鉴定,为进一步研究支气管败血波氏杆菌噬菌体奠定基础。主要研究内容如下:1.猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定在20162018年期间,从我国广东、贵州、四川、河南、湖北、福建、河北、江西、山西、内蒙古、湖南等地的1735份病死猪肺脏组织中共分离到119株Bb,分离率为6.86%。将临床分离菌株进行药物敏感性测定,结果显示Bb对磺胺甲恶唑、甲氧苄啶敏感性低,对庆大霉素、红霉素、氧氟沙星、多粘菌素B敏感性较高;耐药基因以sul2检出率较高,同时检测到目前国外未报道的sul3基因。2.支气管败血波氏杆菌噬菌体PHB09的生物学分析采用传统的双层平板法,从湖北省某猪场污水中分离到三株支气管败血波氏杆菌噬菌体,将其中一株以Bb01为指示菌分离到的噬菌体命名为vBBbrSPHB09。PHB09在平板上形成形状不规则、浑浊的噬菌斑。经电镜观察确定PHB09有一正多面体的头部,约62.8±1.5 nm,以及一个长的不收缩的尾部,长约177.7±2.3 nm,宽约7.6±2.5 nm。由此可知,PHB09属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。PHB09能裂解89株Bb（n=119）,而不能裂解其它种属的细菌,如荚膜A型和D型多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌DH5α。将PHB09进行全基因组测序分析,结果表明,PHB09基因组为双链线性DNA,基因组长度大小42,129 bp,G+C含量62.8%。预测到PHB09共59个编码区（CDS）,其中25个CDS为功能性蛋白,其它34个CDS为未知蛋白。通过tRNAscan-SE预测到一个tRNA-Met-CAT。另外预测到PHB09含有一个整合酶基因及溶原模块。通过噬菌体末端大亚基进化树分析可知,PHB09处于一个独立的分支,为一株新型噬菌体。3.整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01的表型特征分析通过测序可知,PHB09为溶原性噬菌体,根据PHB09的溶原特性,筛选出一株整合PHB09基因组的细菌,命名Bb01+,将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01进行基因组测序比对分析,找到PHB09唯一的一个整合位点。将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01分别测定一步生长曲线,发现两者在体外培养无明显差异,表明PHB09整合到宿主菌后不影响宿主菌的生长。将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01稀释到0.5麦氏比浊浓度进行药物敏感性测定,发现两者的MIC结果无显着差异,且未预测到PHB09携带耐药基因,表明PHB09整合到宿主菌后不改变宿主菌的耐药性。4.整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01的致病性研究将菌株进行血清抗性试验检测。整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01与小鼠血清分别于37℃作用1 h、2 h。结果表明,整合菌株Bb01+对血清的敏感性高于亲本菌株Bb01对血清的敏感性,说明整合菌株Bb01+更容易被血清清除。使用鼠源巨噬细胞（RAW264.7）以10:1（细菌:细胞）进行细胞吞噬试验。在相同作用时间下,整合菌株Bb01+对吞噬细胞的抗吞噬能力低于亲本菌株Bb01。表明整合菌株Bb01+更容易被吞噬细胞吞噬。使用人喉癌上皮细胞（Hep-2）以100:1（细菌:细胞）进行细胞黏附与侵入试验。与亲本菌株Bb01相比,整合菌株Bb01+的黏附能力和侵入能力都降低,表明PHB09整合到宿主菌后降低了宿主菌的黏附与侵入能力。将整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01分别以107、108 CFU剂量滴鼻接种5周龄BALB/c小鼠,记录死亡情况并计算MLD。结果显示,2×MLD剂量的整合菌株Bb01+对小鼠不致死。说明PHB09整合到宿主菌后大大降低了宿主菌的致病性。
周骏[8]（2019）在《多功能铁基/硅基纳米药物系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用》文中提出恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一,化疗是中晚期肿瘤治疗最常用的重要手段,但是化疗面临着两点致命的缺陷。第一,临床一线化疗药物（如紫杉醇、多柔比星等）不能特异性识别肿瘤细胞,副作用大且过分抑制机体免疫,引发骨髓抑制和心脏毒性等严重的组织损伤。第二,临床治疗要求肿瘤细胞蓄积足够的药物,并能对药物产生敏感;但是,化疗过程中肿瘤细胞发生结构与功能进化,能对作用机制不同的多类药物产生对抗,并将胞内药物“泵出”（多药耐药性）。而后,多药耐药细胞很快发展为肿瘤的主体成分,导致化疗的失败和肿瘤复发。因此,使用特定的药物载体构建生物功能性药物传输系统,有望实现抗肿瘤药物的靶向传输和肿瘤细胞内释放,高效抑制肿瘤细胞“耐药性”,这已引起研究人员广泛的关注。由于介孔硅和铁基纳米材料良好的生物相容性,优良的药物装载能力及独特的物理化学性质等特性,已被广泛开发为抗肿瘤药物的药物传输系统。该类纳米药物传输系统能利用其在肿瘤部位增强渗透和滞留性效应（EPR）,实现负载药物在肿瘤组织的富集和累积。同时,药物传输系统还能够根据临床需求而调控药物的包封效率并对其表面修饰靶向分子,提高肿瘤细胞的吞噬效率,从而降低化疗药物针对正常组织的毒副作用。此外,铁基纳米材料具有光热、磁热等独特性能,兼具肿瘤的热疗及放疗等疗效。但是,铁基/硅基药物传输系统在肿瘤的化疗和热疗过程中,常会产生相应的耐药性和耐热性。同时肿瘤组织本身的低氧环境也会使化疗和放疗等的效果不佳。因此,开发能够克服肿瘤治疗障碍的新型药物传输系统具有非常紧迫的临床需求和现实意义。综上所述,本论文基于介孔硅和铁基纳米材料,设计并合成了几种新型纳米药物传输系统并对其表面进行生物功能化,力求建立遏制肿瘤治疗障碍的新思路,并在体内和体外分别评价了其相应的肿瘤抑制疗效。本文论文主要的研究内容和结果如下:（1）还原响应性肿瘤靶向中空介孔硅纳米载药系统的构建及抗肿瘤效果评价为了提高化疗药物递送效率,我们选用中空介孔硅作为药物载体,通过还原敏感性的二硫键将转铁蛋白（Tf）修饰到介孔硅表面,其中转铁蛋白既作为封堵物,阻止药物从介孔中漏出,又可作为肿瘤的靶向分子,提高肿瘤细胞对纳米颗粒的吞噬效率。相关实验结果证明我们成功地制备了还原响应性肿瘤靶向中空介孔硅纳米载药系统（HMSNs-S-S-Tf@DOX）。对纳米系统药物释放行为的测试表明该系统具有GSH触发的药物释放特性。体外肿瘤细胞吞噬实验,体内纳米颗粒的生物分布和小鼠活体成像实验证实转铁蛋白赋予了该纳米系统肿瘤靶向能力。进一步地,我们在体外细胞水平上对HMSNs-S-S-Tf@DOX系统进行了激光共聚焦,细胞流式和细胞活性（MTT）等细胞凋亡分析实验,相关结果表明HMSNs-S-S-Tf@DOX系统具有更好的促细胞凋亡效果,说明该系统具有更高的药物递送效率。最后,我们对HMSNs-S-S-Tf@DOX在荷瘤小鼠身上进行了抗肿瘤效果评价,结果证明相比纯药,HMSNs-S-S-Tf@DOX的药物递送效率更高,同时有效降低了DOX的毒副作用。另外相关体内实验结果还说明HMSNs-S-S-Tf具有良好的生物相容性和安全性。本研究为高效,安全的癌症治疗提供了一个有前景的药物递送系统。（2）pH/交变磁场双响应的磁靶向氧化铁纳米载药系统的构建及热化疗联合抗肿瘤效果评价为了进一步提高纳米药物化疗的效果,我们基于纳米氧化铁磁热的性质,构建了pH/交变磁场双响应的氧化铁复合纳米载药系统对肿瘤进行热疗和化疗联合治疗。以纳米氧化铁为核心,在其表面包裹聚吡咯（PPy）,其中聚吡咯上面进一步修饰PEG使纳米颗粒获得亲水性。在装载阿霉素（DOX）之后,由于聚吡咯具有pH与热刺激双响应性,同时基于纳米氧化铁核心的磁热性质,赋予整个纳米系统pH与交变磁场双响应的药物释放特性及对肿瘤热化疗联合治疗的潜力。相关实验证实我们成功制备了pH/交变磁场双响应的氧化铁纳米载药系统（Fe2O3@PPy-DOX-PEG）。对纳米系统药物释放行为的测试表明该系统具有pH和交变磁场触发的药物释放特性。体内外热成像数据表明在交变磁场条件下Fe2O3@PPy-DOX-PEG纳米系统可以产热并且可以对肿瘤进行热疗。体外细胞水平上的凋亡检测实验（激光共聚焦,苔盼蓝染色,细胞流式,MTT细胞活性检测）表明热疗与化疗的联合疗法疗效显着优于单纯的化疗。最后,我们用荷瘤小鼠对Fe2O3@PPy-DOX-PEG进行了体内抗肿瘤效果评估。结果发现,联合治疗的抑瘤效果显着高于单纯的化疗或者热疗,并且Fe2O3@PPy-DOX-PEG在体内表现出良好的生物相容性和安全性。（3）还原响应性肿瘤靶向载氧氧化铁纳米载药系统的构建及氧敏化的肿瘤化疗效果评价为了克服肿瘤缺氧微环境诱导的化疗耐药性,我们制备了具有氧气输送能力的还原响应性氧化铁纳米药物载体。选用多孔中空氧化铁纳米颗粒为基材,将能够运载氧气的全氟化碳（PFC）载入氧化铁的空腔中,表面用含乳糖酸（LA）的两亲性聚合物（LA-PEG-S-S-C18PMH）进行修饰,并在表面疏水区载入疏水性化疗药物依托泊苷（EP）。相关表征手段证实我们成功地制备了还原响应性肿瘤靶向载氧氧化铁纳米载药系统（PHMNP-S-S-PEG-LA@PFC（O2）/EP）。溶液中氧气释放实验证实PHMNP-S-S-PEG-LA@PFC（O2）/EP纳米系统具有较高的氧气装载量和良好的氧气释放能力。在体外细胞水平上,我们运用western bolting证明该载氧纳米系统可以有效缓解细胞缺氧状态,表明其良好的氧气输送能力。同时,通过激光共聚焦,细胞流式和MTT细胞活性检测,我们发现PHMNP-S-S-PEG-LA@PFC（O2）/EP可以有效抑制缺氧诱导的细胞耐药性,显着提高缺氧环境下的化疗表现。最后,在体内实验中,我们利用光声成像,瘤内氧分压检测,证明该载氧纳米系统可以向肿瘤部位高效运输氧气。此外,我们用荷瘤小鼠对PHMNP-S-S-PEG-LA@PFC（O2）/EP进行了体内抗肿瘤效果评估,结果证明与简单的化疗相比,载氧与化疗的联合在消除肿瘤遏制低氧耐药方面具有更加显着的作用,有望进一步用于临床转化。（4）还原响应性肿瘤靶向普鲁士蓝纳米载药系统的构建及饥饿与光热联合抗肿瘤效果评价为了遏制光热过程中细胞的热抵抗力以进一步优化光热的肿瘤抑制效果,我们成功构建了具有肿瘤饥饿能力的还原响应性肿瘤光热普鲁士蓝纳米药物系统。将葡萄糖氧化酶（GOx）载入多孔中空普鲁士蓝纳米颗粒（PHPBN）中,然后引入透明质酸封堵葡萄糖氧化酶,制备多功能普鲁士蓝纳米药物载体（PHPBNs-S-S-HA-PEG@GOx）。相关表征实验证实我们成功地构建了PHPBNs-S-S-HA-PEG@GOx。纳米系统体外药物释放行为实验证明该系统拥有GSH触发的GOx释放特性。体外溶液pH值和H2O2浓度测试表明该纳米系统具有良好的葡萄糖消耗能力。细胞水平ATP检测实验进一步证实了PHPBNs-S-S-HA-PEG@GOx具有显着的饥饿作用。细胞水平和动物水平western bloting检测结果表明纳米细胞可以有效抑制热细胞蛋白（HSPs）的表达,瓦解肿瘤的热抵抗力。最后,我们用荷瘤小鼠对PHPBNs-S-S-HA-PEG@GOx进行了体内抗肿瘤效果评估,结果表明该系统具有良好的肿瘤饥饿效果,同时饥饿联合光热治疗可以有效突破肿瘤的热抵抗,敏化肿瘤光热疗效,本纳米系统对联合治疗瓦解肿瘤治疗瓶颈具有指导意义。
肖怀[9]（2018）在《云南彝族药用昆虫喙尾琵琶甲物质基础及抗肿瘤相关活性研究》文中提出本论文有由五章组成,以物质基础为主,结合肿瘤细胞生长抑制活性、抗氧化活性及免疫调节活性等筛选,对云南传统彝族药用昆虫喙尾琵琶甲（Blaps rynchopetera Fairmaire）进行了全面系统的研究。论文第一章,对喙尾琵琶甲提取物的化学组分及不同萃取部位、单体化合物的肿瘤细胞生长抑制、抗氧化及免疫调节等活性进行了初步研究。对喙尾琵琶甲风干虫体粉末乙醇提取物及不同极性萃取部位的细胞毒活性筛选获得活性较强的氯仿（PP-C）部位及有一定活性的石油醚（PP-B）、乙酸乙酯（PP-D）和正丁醇（PP-E）部位。通过系统提取分离及鉴定,分别从有活性的氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位共鉴定76个化合物,其中9个新化合物,1个新天然产物。9个新化合物包括5个邻苯二酚衍生物,3个吡啶衍生物和1个氰基取代芳烃化合物。选取10种常见人肿瘤细胞株A 549、AGS、Caco-2、Hela、HepG 2、K 562、MDA-MB-231、TE-1、U 251和Bel-7402等,对从细胞毒活性部位分离到的新化合物1、2、5、6、7和部分已知化合物进行了细胞毒活性筛选。结果表明,从乙酸乙酯部位获得的新化合物rynchopeterine B（2）对Caco-2和A 549细胞,rynchopeterine C（5）对Caco-2细胞具有一定的肿瘤细胞生长抑制活性,IC 50分别为119.7μg/mL、108.5μg/mL和158.7μg/mL。乙酸乙酯部位具有很强的抗氧化活性,清除DPPH自由基的IC50值为23.35μg/mL;新化合物17及部分已知化合物15,22,23,2均显示出非常强的清除DPPH自由基活性,其中具有邻二酚羟基结构的化合物活性和阳性对照维生素C相当,化合物15的IC 50为1.02μg/mL,强于维生素C。免疫调节体外活性初步筛选结果表明,喙尾琵琶甲总提取物、氯仿部位、乙酸乙酯部位及多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能具有一定增强作用,而其他萃取部位作用不明显,刺激性防御液则显示明显的吞噬功能抑制作用;对乙酸乙酯部位的体内免疫考察显示,该部位能不同程度增强免疫低下小鼠的免疫器官指数、增加溶血素抗体生成水平、提高外周血免疫细胞水平,而对正常小鼠作用不明显,提示该部位可能具有较好的免疫调节平衡作用。论文第二章,对喙尾琵琶甲多糖含量及多糖中单糖组成进行分析。通过水提醇沉、Sevage法除蛋白制备喙尾琵琶甲精制多糖,用苯酚-硫酸法测得喙尾琵琶甲中的多糖含量为3.86%（n=3）;采用PMP柱前衍生化HPLC法分析喙尾琵琶甲多糖水解液中的单糖,结果显示水解液中含有D-甘露糖,鼠李糖,D-葡萄糖醛酸,D-半乳糖醛酸,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖,岩藻糖等8种已知单糖,其中葡萄糖含量最高,为45.4 mg/g,其他单糖含量在11.4721.45 mg/g之间,单糖总含量为171.7 mg/g。论文第三章,对喙尾琵琶甲中的特征性及活性多酚类化合物含量进行测定。多酚类化合物具有很好的抗氧化活性。以没食子酸为对照,采用福林酚比色法测得干虫体、鲜虫体,乙醇刺激分泌物及直接刺激收集的防御液中多酚含量分别为4.80±0.02,8.07±0.59,10.91±0.40,34.44±0.14 mg.g-1。其中鲜虫体中的含量高于干燥后含量。论文第四章,对喙尾琵琶甲刺激性防御液及虫体石油醚萃取物进行挥发性组分的GC/MS分析,并对防御液和防御液中的主要取代苯醌单体进行肿瘤细胞生长抑制活性筛选。通过与数据库NIST标准图谱匹配,喙尾琵琶甲石油醚萃取部位的GC-MS分析共鉴定了77个独立峰中的56个,共占总峰面积的95.27%,主要成分为长链脂肪酸及脂肪酸酯,长链烷烃等,其中油酸甲酯含量最高（33.27%）。通过直接尾部刺激采集了喙尾琵琶甲的刺激性防御液,静置分为透明黄色油状的上层和棕色乳浊液的下层。分别对总防御液及上下两层进行了GC/MS分析和细胞毒活性检测,发现总防御液及防御液下层对多株肿瘤细胞株有很强的细胞毒活性,而防御液上层的细胞毒活性不明显。分别对总防御液及防御液上、下层进行GC/MS分析比较,总防御液中含量最高的3个化合物为2-乙基对苯醌（31.00%）,1-十三烯（28.02%）和2-甲基对苯醌（22.86%）;防御液下层主峰与总防御液基本一致,但2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌相对含量升高,而1-十三烯的含量降低;防御液上层,几乎90%以上为1-十三烯。对防御液进行分离纯化,并经NMR鉴定了1个单体化合物1-十三烯和1对混合物2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌,和其他物质杂合的对苯醌和对苯酚,该研究结果与GC/MS实验结果一致。对所分离化合物进行了肿瘤细胞生长抑制活性筛选,结果表明,2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌混合物活性明显优于总防御液及防御液下层,对测试细胞株的抑制活性与阳性药顺铂及结构类似的弥托蒽醌相当,而1-十三烯未显示任何细胞毒活性,结果很好的验证了三组防御液的细胞毒活性结果。论文最后对琵甲属昆虫,特别是云南特色药用昆虫喙尾琵琶甲的研究进展进行了综述。
张曦[10]（2019）在《LncRNA-1810034E14Rik对缺血性卒中后小胶质细胞功能的调控作用及机制探讨》文中研究说明研究背景:脑卒中引发的炎症反应直接影响缺血性卒中后脑损伤修复和预后,小胶质细胞活化状态及功能直接调控缺血性卒中后炎症反应,并影响卒中转归。缺血性卒中后,小胶质细胞内多种长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）差异表达,这些lncRNA可能参与调控小胶质细胞功能,但其具体作用机制尚未阐明。LncRNA-1810034E14Rik在小胶质细胞中广泛分布,但对其功能研究尚缺乏。在本论文中,我们探讨了缺血性卒中后lncRNA-1810034E14Rik的变化趋势,及lncRNA-1810034E14Rik能否调控缺血性卒中后小胶质细胞功能。此外,我们还进一步探索了 lncRNA-1810034E14Rik调控小胶质细胞功能的分子机制。研究方法:体外实验中,我们从C57BL/6乳鼠皮层提取原代小胶质细胞,糖氧剥夺（Oxygen glucose deprivation,OGD）后提取RNA进行lncRNA差异表达芯片分析,从中筛选出差异表达的lncRNA,并进行生物信息学分析,挑选出目标lncRNA-1810034E4Rik。我们包装lncRNA-1810034e14Rik过表达慢病毒,OGD 24小时前转染小胶质细胞,用ELISA检测其炎症因子分泌,免疫荧光观察小胶质细胞激活状态,并用划痕实验检测小胶质细胞迁移能力,用荧光微球检测其吞噬功能。同时我们将小胶质细胞与神经元体外条件共培,CCK-8法和LDH释放法检测神经元存活状态。在体内实验部分,我们对C57BL/6鼠行一侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,于再灌注不同时间点检测梗死侧皮层lncRNA-1810034E4Rik表达变化。我们对C57BL/6鼠皮层立体定位注射lncRNA-1810034E14Rik过表达慢病毒,2周后行MCAO并于1天后检测脑梗死体积和神经行为功能。我们利用免疫荧光检测缺血半暗带小胶质细胞激活状态,ELISA检测梗死侧皮层炎症因子浸润情况,最后用western blot对体内外NF-κB信号通路变化情况进行检测。结果:1)LncRNA芯片分析结果显示:OGD后小胶质细胞较对照组lncRNA差异表达,其中lncRNA-1810034E14Rik表达显着下调（0.2倍vs对照）。2)与Control组相比,过表达lncRNA-1810034E14Rik显着减少小胶质细胞激活,降低炎症因子分泌。3)过表达lncRNA-1810034E14Rik对小胶质细胞迁移和吞噬能力影响不明显。4)过表达lncRNA-1810034E14Rik可以减轻OGD后小胶质细胞对神经元的毒性作用。5)与Sham组相比,皮层过表达lncRNA-1810034E14Rik可以改善MCAO小鼠运动功能损伤,减轻脑组织水肿,减少小鼠脑梗死体积;梗死侧炎症因子释放减少,小胶质细胞激活程度降低。6)MCAO后小鼠皮层和OGD后小胶质细胞内NF-κB通路激活,过表达lncRNA-1810034E14Rik显着抑制了 p65磷酸化,减少其核内转移。结论:1)LncRNA-1810034E14Rik可以降低缺血性卒中后梗死体积,改善神经功能损伤;lncRNA-1810034E14Rik明显减少缺血性卒中后小胶质细胞活化,抑制神经炎症反应。2)lncRNA-1810034E14Rik可以通过抑制NF-κB信号通路减少小胶质细胞活化。
二、吞噬的“119”（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、吞噬的“119”（论文提纲范文）
（1）跑台运动对APP/PS1小鼠海马小胶质细胞清除Aβ功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 小胶质细胞概述 |
| 2.1.1 小胶质细胞的来源 |
| 2.1.2 小胶质细胞的免疫学标记 |
| 2.1.3 小胶质细胞的分型 |
| 2.2 小胶质细胞清除Aβ |
| 2.3 小胶质细胞吞噬清除Aβ的机制 |
| 2.3.1 小胶质细胞表面受体介导Aβ的吞噬 |
| 2.3.2 小胶质细胞溶酶体对Aβ的降解 |
| 2.4 AD脑内小胶质细胞的活动异常 |
| 2.4.1 小胶质细胞增生和活化增多 |
| 2.4.2 小胶质细胞形态改变 |
| 2.4.3 小胶质细胞功能障碍 |
| 2.5 运动与AD |
| 2.5.1 运动改善AD认知功能 |
| 2.5.2 运动减轻Aβ累积 |
| 2.5.3 运动改善AD脑内小胶质细胞的活动异常 |
| 2.6 小结 |
| 3 实验一 跑台运动对APP/PS1 小鼠空间学习记忆能力和Aβ累积的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物及分组 |
| 3.2.2 运动方案 |
| 3.2.3 Morris水迷宫实验 |
| 3.2.4 取材 |
| 3.2.5 Elisa检测小鼠海马Aβ40和Aβ42 水平 |
| 3.2.6 Methoxy-X04 染色测定纤维样Aβ沉积 |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 Morris水迷宫实验结果 |
| 3.3.2 小鼠海马可溶性Aβ40、Aβ42 水平 |
| 3.3.4 小鼠海马纤维样Aβ沉积水平 |
| 3.4 分析讨论 |
| 3.4.1 跑台运动对APP/PS1 小鼠空间学习和记忆能力的影响 |
| 3.4.2 跑台运动对APP/PS1 小鼠海马Aβ累积的影响 |
| 3.5 结论 |
| 4 实验二 跑台运动对APP/PS1 小鼠小胶质细胞清除Aβ能力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物、分组、运动方案和取材 |
| 4.2.2 原代小胶质细胞分离培养及鉴定 |
| 4.2.3 纤维样Aβ的制备 |
| 4.2.4 体外Aβ清除实验 |
| 4.2.5 在体Aβ吞噬实验 |
| 4.2.6 体外Aβ吞噬实验 |
| 4.2.7 体外Aβ降解实验 |
| 4.2.8 小胶质细胞分选 |
| 4.2.9 Elisa检测小胶质细胞内Aβ水平 |
| 4.2.10 数据统计分析 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 体外Aβ清除实验结果 |
| 4.3.2 在体Aβ吞噬实验结果 |
| 4.3.3 体外Aβ吞噬实验结果 |
| 4.3.4 体外Aβ降解实验结果 |
| 4.3.5 小胶质细胞内可溶性Aβ水平 |
| 4.4 分析讨论 |
| 4.4.1 跑台运动对小鼠小胶质细胞清除纤维样Aβ能力的影响 |
| 4.4.2 跑台运动对小鼠小胶质细胞吞噬和降解纤维样Aβ能力的影响 |
| 4.4.3 跑台运动对小鼠小胶质细胞内Aβ水平的影响 |
| 4.5 结论 |
| 5 实验三 跑台运动对APP/PS1 小鼠小胶质细胞溶酶体功能的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物、分组和运动方案 |
| 5.2.2 原代小胶质细胞分离和小胶质细胞分选 |
| 5.2.3 TFEB免疫荧光 |
| 5.2.4 Western blot |
| 5.2.5 小胶质细胞溶酶体pH的测定 |
| 5.2.6 小胶质细胞溶酶体酶活性检测 |
| 5.2.7 数据统计分析 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 小胶质细胞溶酶体TFEB的表达和核转位 |
| 5.3.2 小胶质细胞溶酶体膜蛋白LAMP1和LAMP2 的水平 |
| 5.3.3 小胶质细胞溶酶体pH |
| 5.3.4 小胶质细胞溶酶体酶CTSB和 CTSD的表达和活性 |
| 5.4 分析讨论 |
| 5.4.1 跑台运动对小鼠小胶质细胞TFEB表达和核转位的影响 |
| 5.4.2 跑台运动对小鼠小胶质细胞溶酶体功能的影响 |
| 5.5 结论 |
| 6 研究总结 |
| 6.1 总体分析 |
| 6.2 研究总体结论 |
| 6.3 研究的创新与不足 |
| 6.3.1 创新 |
| 6.3.2 不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 动物实验伦理审查表 |
| 致谢 |
| 作者简历及在学期间的学术成果 |
（2）红系造血岛巨噬细胞的鉴定及生物学特征研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 概述 |
| 1.1 文献综述 |
| 前言 |
| (一)红系造血岛的组成、类型及潜在成熟机制 |
| (二)红系造血岛在小鼠、人和大鼠中调控红系发育的研究 |
| (三)巨噬细胞-红细胞相互作用和EBI巨噬细胞的免疫表型特征 |
| (四)EBI巨噬细胞和铁代谢 |
| (五)巨噬细胞分泌生长因子影响红系发育 |
| (六)展望 |
| 1.2 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 EBI巨噬细胞的鉴定及转录组学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 红系发育及相关疾病 |
| 2.1.2 红细胞自身调控机制研究进展 |
| 2.1.3 巨噬细胞对红系发育的调控作用 |
| 2.1.4 巨噬细胞与红细胞之间的粘附分子 |
| 2.1.5 本研究的目的和意义 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 一、EBI巨噬细胞的鉴定、分离和免疫表型分析 |
| 2.3.1 并不是所有的F4/80~+Vcam1~+CD169~+巨噬细胞都是EBI巨噬细胞 |
| 2.3.2 在小鼠骨髓和胎肝F4/80~+巨噬细胞中存在表达Epor-eGFP的亚群 |
| 2.3.3 小鼠骨髓和胎肝F4/80~+Epor-eGFP~+和F4/80~+Epor-eGFP-巨噬细胞形态差异很大 |
| 2.3.4 小鼠骨髓EBIs是由F4/80~+Epor-eGFP~+巨噬细胞形成的 |
| 2.3.5 小鼠胎肝EBIs是由F4/80~+Epor-eGFP~+巨噬细胞形成的 |
| 2.3.6 小鼠骨髓和胎肝红细胞核由F4/80~+Epor-eGFP~+巨噬细胞所吞噬 |
| 2.3.7 小鼠骨髓F4/80~+Epor-eGFP~+和F4/80~+Epor-eGFP-巨噬细胞表达不同的单核/巨噬细胞表面标记 |
| 2.3.8 小鼠骨髓EBI巨噬细胞表达不同的表面标记 |
| 2.3.9 人EPOR流式抗体可以识别EPOR的表达 |
| 2.3.10 人胎肝EBI巨噬细胞表达EPOR |
| 2.3.11 人胎肝红细胞核由CD163~+EPOR~+巨噬细胞吞噬 |
| 二、EPO对小鼠和人EBI形成的影响 |
| 2.3.12 小鼠骨髓EBI巨噬细胞表达功能性Epor |
| 2.3.13 EPO增加小鼠骨髓EBI的形成 |
| 2.3.14 EPO增加小鼠骨髓EBI巨噬细胞Vcam1 的表达 |
| 2.3.15 在EPO应激时小鼠脾脏EBI由 F4/80~+Epor-eGFP~+巨噬细胞形成 |
| 2.3.16 EPO增加人EBI的形成 |
| 2.3.17 EPO不增加人EBI巨噬细胞CD163、CD169 以及MAEA的表达 |
| 三、小鼠骨髓和人胎肝EBI巨噬细胞的转录组学分析 |
| 2.3.18 小鼠骨髓Epor-eGFP~+和Epor-eGFP-巨噬细胞差异表达分析 |
| 2.3.19 小鼠骨髓Epor-eGFP~+巨噬细胞高表达支持红系发育的重要分子 |
| 2.3.20 mRNA水平验证小鼠骨髓Epor-eGFP~+巨噬细胞特异高表达基因 |
| 2.3.21 蛋白水平验证小鼠骨髓Epor-eGFP~+巨噬细胞特异高表达分子 |
| 2.3.22 人胎肝CD163~+EPOR~+和CD163~+EPOR-巨噬细胞差异表达分析 |
| 2.3.23 人胎肝CD163~+EPOR~+巨噬细胞高表达支持红系发育的重要分子 |
| 2.3.24 人胎肝CD163~+EPOR~+巨噬细胞重要表面标记的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 人胎肝EBI巨噬细胞功能异质性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 EBI巨噬细胞异质性研究进展 |
| 3.1.2 单细胞测序在EBI巨噬细胞异质性检测中应用前景 |
| 3.1.3 本研究的目的及意义 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 利用Single cell-RNA-seq技术分析EBI巨噬细胞的异质性 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人胎肝EBI巨噬细胞具有免疫表型异质性 |
| 3.3.2 Imagestream和Cytospins显示人胎肝不同类型EBI的存在 |
| 3.3.3 分选人胎肝EBI巨噬细胞进行单细胞测序流程图 |
| 3.3.4 人胎肝CD163~+EPOR-和CD163~+EPOR~+巨噬细胞分群结果 |
| 3.3.5 人胎肝CD163~+EPOR-巨噬细胞以及红细胞亚群标志性基因 |
| 3.3.6 人胎肝CD163~+EPOR~+巨噬细胞亚群标志性基因 |
| 3.3.7 人胎肝CD163~+EPOR~+和CD163~+EPOR-巨噬细胞标志性信号通路 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文总结及进一步研究意义 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（3）敲除小胶质细胞VPS35的中枢神经效应以及在缺血性脑损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 小胶质细胞VPS35 敲除在中枢神经系统中的作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小胶质细胞VPS35 敲除在缺血性脑损伤中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 小胶质细胞在神经炎症以及神经发生中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（4）玛咖根部多糖的结构鉴定及免疫调节活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 玛咖的营养成分及功能 |
| 1.2.1 营养成分 |
| 1.2.2 玛咖的生物活性 |
| 1.3 玛咖多糖的研究现状 |
| 1.3.1 玛咖多糖的提取纯化 |
| 1.3.2 玛咖多糖的结构鉴定 |
| 1.3.3 玛咖多糖的生理活性 |
| 1.4 植物多糖对巨噬细胞的激活作用 |
| 1.4.1 作用机制 |
| 1.4.2 构效关系 |
| 1.4.3 研究难点 |
| 1.5 本课题的立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据及意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 玛咖多糖的分离纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 主要实验材料及试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 玛咖根基本成分的测定 |
| 2.3.2 玛咖多糖提取流程 |
| 2.3.3 玛咖多糖提取条件的优化 |
| 2.3.4 阴离子交换柱层析纯化玛咖多糖 |
| 2.3.5 葡聚糖凝胶柱层析纯化玛咖多糖 |
| 2.3.6 紫外光谱分析 |
| 2.3.7 内毒素含量检测 |
| 2.3.8 玛咖多糖的热稳定性分析 |
| 2.3.9 统计分析及作图 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 标准曲线 |
| 2.4.2 玛咖根的基本成分 |
| 2.4.3 提取条件的优化 |
| 2.4.4 玛咖多糖的阴离子交换柱层析 |
| 2.4.5 玛咖多糖的葡聚糖凝胶柱层析 |
| 2.4.6 紫外光谱扫描 |
| 2.4.7 内毒素检测 |
| 2.4.8 热稳定性分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 MC-1的结构鉴定及其对巨噬细胞的激活作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 分子量的测定 |
| 3.3.2 红外光谱扫描(FTIR) |
| 3.3.3 单糖组成分析 |
| 3.3.4 高碘酸氧化和Smith降解 |
| 3.3.5 甲基化分析 |
| 3.3.6 核磁共振分析 |
| 3.3.7 刚果红实验 |
| 3.3.8 MC-1对RAW264.7 细胞的毒性 |
| 3.3.9 RAW264.7 细胞吞噬能力的检测 |
| 3.3.10 细胞因子的测定 |
| 3.3.11 实时荧光定量PCR(QPCR) |
| 3.3.12 MC-1在RAW264.7 细胞表面的膜受体 |
| 3.3.13 统计分析及作图 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC-1 的分子量 |
| 3.4.2 MC-1的FTIR图谱 |
| 3.4.3 MC-1 的单糖组成 |
| 3.4.4 高碘酸氧化和Smith降解 |
| 3.4.5 MC-1 的甲基化分析 |
| 3.4.6 MC-1的NMR分析 |
| 3.4.7 刚果红实验 |
| 3.4.8 MC-1对RAW264.7 细胞存活率的影响 |
| 3.4.9 MC-1对RAW264.7 细胞的吞噬能力和胞饮能力的影响 |
| 3.4.10 MC-1对RAW264.7 细胞分泌细胞因子的作用 |
| 3.4.11 MC-1在RAW264.7 细胞表面的膜受体 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 MC-2的结构鉴定及其对巨噬细胞极化的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MC-2 的结构鉴定 |
| 4.3.2 MC-2对RAW264.7 细胞存活率的影响 |
| 4.3.3 MC-2对M0型RAW264.7 细胞分泌IL-6和IL-10 的影响 |
| 4.3.4 MC-2对M0型RAW264.7 细胞分泌细胞因子的影响 |
| 4.3.5 RAW264.7 细胞的极化 |
| 4.3.6 MC-2在RAW264.7 细胞表面的膜受体 |
| 4.3.7 统计分析及作图 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 MC-2 的分子量 |
| 4.4.2 MC-2的FTIR图谱 |
| 4.4.3 MC-2 的单糖组成 |
| 4.4.4 MC-1 的甲基化分析 |
| 4.4.5 MC-2的NMR分析 |
| 4.4.6 MC-2 的刚果红实验 |
| 4.4.7 MC-2对RAW264.7 细胞存活率的影响 |
| 4.4.8 MC-2对M0型RAW264.7 细胞极化的影响 |
| 4.4.9 MC-2对M1型RAW264.7 细胞极化的影响 |
| 4.4.10 MC-2对M2型RAW264.7 细胞极化的影响 |
| 4.4.11 MC-2在RAW264.7 细胞表面的膜受体 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 玛咖多糖对肠道免疫的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料及主要试剂 |
| 5.2.2 主要实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 体外小肠吸收模型的建立 |
| 5.3.2 玛咖多糖在Caco2 单层膜中的转运实验 |
| 5.3.3 玛咖多糖对Caco2 细胞分泌免疫因子的影响 |
| 5.3.4 玛咖多糖通过Caco2 单层膜对RAW264.7 细胞分泌细胞因子的作用 |
| 5.3.5 玛咖多糖对LPS诱导的Caco2 单层膜炎症损伤的作用 |
| 5.3.6 统计分析及作图 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 Caco2 细胞单层膜致密性检测 |
| 5.4.2 玛咖多糖在Caco2 细胞单层膜中的吸收 |
| 5.4.3 玛咖多糖对Caco2 细胞分泌免疫因子的影响 |
| 5.4.4 玛咖多糖通过Caco2 单层膜对RAW264.7 细胞分泌细胞因子的作用 |
| 5.4.5 玛咖多糖对LPS诱导的Caco2 单层膜致密性损伤的作用 |
| 5.4.6 玛咖多糖对LPS诱导的Caco2 细胞分泌细胞因子的作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 玛咖多糖其他生理活性的初步探索 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 主要实验材料及试剂 |
| 6.2.2 实验仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 玛咖多糖抑制肿瘤细胞增殖活性的测定 |
| 6.3.2 玛咖多糖通过人单核巨噬细胞THP-1抑制肿瘤细胞增殖的活性 |
| 6.3.3 玛咖多糖的自由基清除能力 |
| 6.3.4 玛咖多糖的CAA实验 |
| 6.3.5 玛咖多糖对AAPH诱导的红细胞溶血的保护作用 |
| 6.3.6 玛咖多糖抑制HBV的作用 |
| 6.3.7 玛咖多糖对LO2 细胞脂肪变性的影响 |
| 6.3.8 统计分析及作图 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 玛咖多糖对肿瘤细胞增殖的直接抑制活性 |
| 6.4.2 玛咖多糖通过激活THP-1细胞抑制肿瘤细胞增殖的作用 |
| 6.4.3 玛咖多糖的自由基清除能力 |
| 6.4.4 玛咖多糖的细胞抗氧化 |
| 6.4.5 玛咖多糖抑制红细胞的氧化溶血 |
| 6.4.6 玛咖多糖抗HBV的作用 |
| 6.4.7 玛咖多糖对肝细胞脂肪变性的影响 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）嗜水气单胞菌Ⅵ型分泌系统效应分子Hcp的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 嗜水气单胞菌致病性及相关毒力因子 |
| 1 嗜水气单胞菌的致病性 |
| 2 嗜水气单胞菌的主要毒力因子 |
| 2.1 鞭毛 |
| 2.2 菌毛 |
| 2.3 荚膜 |
| 2.4 脂多糖 |
| 2.5 S层 |
| 2.6 胞外产物 |
| 2.7 铁螯合系统 |
| 2.8 分泌系统 |
| 3 嗜水气单胞菌毒力作用的调控因素 |
| 3.1 替代sigma (σ)因子 |
| 3.2 群体感应系统 |
| 3.3 双组分调控系统 |
| 3.4 通用应激蛋白 |
| 4 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 细菌Ⅵ型分泌系统研究现状 |
| 1 T6SS概述 |
| 2 T6SS组成和结构 |
| 3 T6SS效应蛋白及其分泌机制 |
| 3.1 效应蛋白 |
| 3.2 效应蛋白的分泌机制 |
| 4 T6SS的功能 |
| 4.1 参与细菌的致病作用 |
| 4.2 参与细菌间竟争作用 |
| 4.3 促进生物被膜的形成 |
| 5 T6SS的调控机制 |
| 5.1 环境信号 |
| 5.2 翻译后激活 |
| 5.3 σ~(54) |
| 5.4 AraC等转录激活因子 |
| 5.5 H-NS样蛋白 |
| 5.6 铁摄取调控因子 |
| 5.7 群体感应系统 |
| 5.8 双组分调控系统 |
| 5.9 多种毒力因子间的相互调控 |
| 6 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35T6SS基因簇的鉴定及Hcp家族蛋白多样性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 生物信息学分析 |
| 1.5 嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35 hcp基因的原核表达 |
| 1.6 免疫血清的制备 |
| 1.7 Western blot分析 |
| 1.8 基因缺失株的构建 |
| 1.9 基因互补株的构建 |
| 1.10 遗传稳定性检测 |
| 1.11 生长曲线测定 |
| 1.12 嗜水气单胞菌NJ-35 Hcp蛋白的表达水平检测 |
| 1.13 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 嗜水气单胞菌T6SS基因簇的鉴定及进化树分析 |
| 2.2 嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35 T6SS基因簇的分析 |
| 2.3 嗜水气单胞菌NJ-35 T6SS效应分子Hcp的序列分析 |
| 2.4 重组Hcp蛋白的表达及其免疫血清的效价 |
| 2.5 温度对嗜水气单胞菌Hcp表达和分泌的影响 |
| 2.6 重组自杀性质粒的鉴定 |
| 2.7 hcp和clpV1基因单缺失株的鉴定 |
| 2.8 hcp基因双缺失株的鉴定 |
| 2.9 hcp三基因缺失株的鉴定 |
| 2.10 重组互补质粒的鉴定 |
| 2.11 hcp和clp1基因缺失株和互补株遗传稳定性分析 |
| 2.12 hcp和clpV1基因缺失株生长特性分析 |
| 2.13 hcp和clpV1基因缺失株Hcp的表达和分泌水平分析 |
| 2.14 Δhcp1互补及交叉互补株Hcp的表达和分泌水平分析 |
| 2.15 hcp和clpV1基因缺失株和互补株hcp基因的转录水平分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35致病及环境适应过程中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 细菌对斑马鱼半数致死量检测 |
| 1.4 运动能力检测 |
| 1.5 生物被膜形成能力检测 |
| 1.6 细胞黏附试验 |
| 1.7 细菌胞外产物活性检测 |
| 1.8 细菌竞争试验 |
| 1.9 与四膜虫共培养后嗜水气单胞菌的生长情况检测 |
| 1.10 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 hcp2和T6SS参与NJ-35对斑马鱼的毒力作用 |
| 2.2 hcp和T6SS对NJ-35运动能力的影响 |
| 2.3 hcp和T6SS对NJ-35生物被膜形成能力的影响 |
| 2.4 hcp1和T6SS促进NJ-35对HEp-2细胞的黏附能力 |
| 2.6 hcp和T6SS对NJ-35胞外产物活性的影响 |
| 2.7 hcp1和T6SS参与NJ-35的抗菌作用 |
| 2.8 hcp2和T6SS促进NJ-35的抗四膜虫吞噬能力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌美国分离株ML09-119致病及环境适应过程中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 hcp-1和hcp-2基因缺失株的构建 |
| 1.5 基因缺失株的生物荧光蛋白标记 |
| 1.6 遗传稳定性分析 |
| 1.7 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.8 生长曲线的测定 |
| 1.9 运动能力检测 |
| 1.10 生物被膜形成能力检测 |
| 1.11 细菌竞争试验 |
| 1.12 动物试验 |
| 1.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ML09-119与中国分离株NJ-35 T6SS相关基因的比较分析 |
| 2.2 重组自杀性质粒的鉴定 |
| 2.3 hcp-1和hcp-2单基因缺失株的鉴定 |
| 2.4 hcp-1和hcp-2双基因缺失株的鉴定 |
| 2.5 生物荧光蛋白标记嗜水气单胞菌ML09-119的鉴定 |
| 2.6 hcp-1和hcp-2基因缺失株hcp基因的转录水平分析 |
| 2.7 hcp-1和hcp-2基因缺失株生长特性分析 |
| 2.8 hcp-1和hcp-2基因对ML09-119运动能力的影响 |
| 2.9 hcp-1和hcp-2基因对ML09-119生物被膜形成能力的影响 |
| 2.10 hcp-1和hcp-2基因对ML09-119抗菌能力的影响 |
| 2.11 感染ML09-119鲶鱼的存活 |
| 2.12 感染ML09-119鲶鱼组织细菌载量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 嗜水气单胞菌NJ-35 hcp1基因缺失株和野生株的比较蛋白质组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及培养条件 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 细菌外膜蛋白样品的制备 |
| 1.5 外膜蛋白样品的定量 |
| 1.6 双向凝胶电泳分析 |
| 1.7 外膜蛋白样品的质谱测定及生物信息学分析 |
| 1.8 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 嗜水气单胞菌Hcp重组蛋白的鲫鱼免疫效果分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及培养条件 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 细菌基因组的提取 |
| 1.6 hcp基因的PCR检测 |
| 1.7 Western blot分析 |
| 1.8 疫苗的制备 |
| 1.9 免疫程序 |
| 1.10 样品处理 |
| 1.11 抗体效价的检测 |
| 1.12 细胞因子水平检测 |
| 1.13 半数致死量的测定 |
| 1.14 免疫保护试验 |
| 1.15 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 hcp基因在气单胞菌中的分布 |
| 2.2 Hcp在不同来源嗜水气单胞菌菌株中的表达和分泌 |
| 2.3 疫苗免疫后鲫鱼血清IgM抗体水平的变化 |
| 2.4 疫苗免疫后鲫鱼组织细胞因子水平的变化 |
| 2.5 攻毒后鲫鱼的存活率 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 嗜水气单胞菌NJ-35新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP的鉴定及功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 生物信息学分析 |
| 1.5 tseP和tsiP基因缺失株的构建 |
| 1.6 基因互补株的构建 |
| 1.7 遗传稳定性检测 |
| 1.8 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.9 生长曲线的测定 |
| 1.10 运动能力检测 |
| 1.11 生物被膜形成能力检测 |
| 1.12 细菌竞争试验 |
| 1.13 与四膜虫共培养后嗜水气单胞菌的生长情况检测 |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 嗜水气单胞菌中的潜在T6SS效应蛋白/免疫蛋白对 |
| 2.2 嗜水气单胞菌NJ-35 T6SS效应分子TseP的序列分析 |
| 2.3 重组自杀性质粒的鉴定 |
| 2.4 tseP和tsiP基因缺失株的鉴定 |
| 2.5 重组互补质粒的鉴定 |
| 2.6 tseP和tsiP基因缺失株和互补株遗传稳定性分析 |
| 2.7 tseP和tsiP基因缺失株和互补株实时荧光定量PCR验证 |
| 2.7 tseP和tsiP基因缺失株和互补株生长特性分析 |
| 2.9 tseP和tsiP对NJ-35运动能力的影响 |
| 2.10 tseP和tsiP对NJ-35生物被膜形成能力的影响 |
| 2.11 嗜水气单胞菌NJ-35效应蛋白TseP的抗菌作用 |
| 2.12 tseP和tsiP对NJ-35抗四膜虫吞噬能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）海参内脏多糖的分离、结构鉴定、免疫活性及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 海参概述 |
| 1.1.1 海参简介 |
| 1.1.2 海参产业发展现状及应用前景 |
| 1.2 海参内脏的结构、组成成分及综合利用 |
| 1.2.1 海参内脏的结构 |
| 1.2.2 海参内脏的组成成分及综合利用 |
| 1.3 海参多糖的研究 |
| 1.3.1 海参多糖的提取及分离纯化 |
| 1.3.2 海参多糖的结构解析 |
| 1.3.3 海参多糖的生物活性研究 |
| 1.4 多糖/蛋白复合体系在营养成分递送系统中的应用研究进展 |
| 1.5 本论文研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第2章 海参内脏多糖的提取分离纯化及基本化学组成分析 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 海参内脏粗多糖的提取分离 |
| 2.2.2 海参内脏粗多糖的分离纯化 |
| 2.2.3 海参内脏多糖组分的紫外扫描 |
| 2.2.4 海参内脏多糖组分的纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.2.5 海参内脏纯化多糖的化学组成测定 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 海参内脏粗多糖的提取分离 |
| 2.3.2 海参内脏粗多糖的分离纯化 |
| 2.3.3 海参内脏多糖组分的紫外扫描 |
| 2.3.4 海参内脏多糖组分的纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.3.5 海参内脏多糖组分的化学组成测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 海参内脏多糖组分的一级结构及高级结构表征 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2实验方法 |
| 3.2.1 海参内脏多糖组分的单糖组成分析 |
| 3.2.2 海参内脏多糖组分的红外光谱分析 |
| 3.2.3 海参内脏多糖组分的核磁共振分析 |
| 3.2.4 海参内脏多糖组分的热特性分析 |
| 3.2.5 海参内脏多糖组分的晶体特性分析 |
| 3.2.6 扫描电镜(SEM)观察海参内脏多糖组分 |
| 3.2.7 原子力显微镜(AFM)观测海参内脏多糖组分 |
| 3.2.8 海参内脏多糖组分的粒度分布及Zeta电位特性分析 |
| 3.2.9 刚果红实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 海参内脏多糖组分的单糖组成分析 |
| 3.3.2 海参内脏多糖组分的红外光谱分析 |
| 3.3.3 海参内脏多糖组分的核磁共振波谱分析 |
| 3.3.4 海参内脏多糖组分的热特性分析 |
| 3.3.5 海参内脏多糖组分的晶体特性分析 |
| 3.3.6 扫描电镜(SEM)观察海参内脏多糖组分 |
| 3.3.7 原子力显微镜(AFM)观测海参内脏多糖组分 |
| 3.3.8 海参内脏多糖组分的粒度分布及Zeta电位特性分析 |
| 3.3.9 刚果红实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 海参内脏多糖组分的免疫调节活性研究 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2实验方法 |
| 4.2.1 RAW264.7巨噬细胞的复苏和培养 |
| 4.2.2 MTT法检测海参内脏多糖组分对RAW264.7细胞存活率的影响 |
| 4.2.3 SCVP-1对RAW264.7细胞分泌NO、IL-1β、IL-6及TNF-α的影响 |
| 4.2.4 SCVP-1对RAW264.7细胞iNOS、IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 4.2.5 SCVP-1对RAW264.7细胞吞噬中性红的影响 |
| 4.2.6 排除LPS污染SCVP-1 的可能性检测 |
| 4.2.7 Western Blot检测SCVP-1对RAW264.7细胞免疫通路的影响 |
| 4.2.8 特异性抑制剂阻断实验及作用靶点识别研究 |
| 4.2.9 SCVP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、IL-1β、IL-6及TNF-α的影响 |
| 4.2.10 SCVP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞i NOS、IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 4.2.11 Western Blot检测SCVP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞免疫通路的影响 |
| 4.2.12 统计学处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 海参内脏多糖对RAW264.7细胞存活率的影响 |
| 4.3.2 SCVP-1对RAW264.7细胞分泌NO、IL-1β、IL-6及TNF-α的影响 |
| 4.3.3 SCVP-1对RAW264.7细胞iNOS、IL-1β、IL-6及TNF-αm RNA表达的影响 |
| 4.3.4 SCVP-1对RAW264.7细胞吞噬中性红的影响 |
| 4.3.5 排除LPS污染SCVP-1的可能性检测 |
| 4.3.6 SCVP-1对MAPKs信号转导通路的影响 |
| 4.3.7 SCVP-1对NF-κB信号转导通路的影响 |
| 4.3.8 特异性抑制剂阻断实验及作用靶点识别研究 |
| 4.3.9 SCVP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、IL-1β、IL-6 及TNF-α的影响 |
| 4.3.10 SCVP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、IL-1β、IL-6 及TNF-αm RNA表达的影响 |
| 4.3.11 Western Blot检测SCVP-2对LPS诱导的RAW264.7细胞免疫通路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 海参内脏多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠的影响 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 实验仪器 |
| 5.2实验方法 |
| 5.2.1 免疫低下小鼠模型的建立与给药 |
| 5.2.2 小鼠免疫脏器指数的测定 |
| 5.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞活性的测定 |
| 5.2.4 小鼠碳廓清指数和吞噬指数的测定 |
| 5.2.5 小鼠血清溶血素和小鼠血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的测定 |
| 5.2.6 小鼠迟发型变态反应测定 |
| 5.2.7 小鼠血清中抗氧化指标的测定 |
| 5.2.8 统计学处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠免疫脏器指数的影响 |
| 5.3.2 海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 |
| 5.3.3 海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠碳廓清指数和吞噬指数的影响 |
| 5.3.4 海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠血清溶血素的影响 |
| 5.3.5 海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量的影响 |
| 5.3.6 海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠迟发型变态反应的影响 |
| 5.3.7海参内脏多糖SCVP-1和SCVP-2对免疫低下小鼠抗氧化能力的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 海参内脏多糖与溶菌酶纳米复合物的构建及在营养成分递送系统的应用研究 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 溶菌酶Ly和海参内脏多糖组分复合溶液的制备 |
| 6.2.2 海参内脏多糖组分与溶菌酶纳米复合物最佳合成条件的选择 |
| 6.2.3 海参内脏多糖组分/溶菌酶纳米复合物的表征 |
| 6.2.4 姜黄素Cur的负载 |
| 6.2.5 负载Cur纳米复合物的表征 |
| 6.2.6 姜黄素Cur在PBS缓冲液中稳定性的测定 |
| 6.2.7 HPLC测定游离Cur和负载Cur纳米复合物在磷酸盐缓冲液中的稳定性 |
| 6.2.8 细胞毒性试验 |
| 6.2.9 Hep G2细胞对负载Cur纳米复合物的吞噬研究 |
| 6.2.10 小鼠血清中Cur含量测定 |
| 6.2.11 统计学处理 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 溶菌酶Ly和海参内脏多糖组分纳米复合物的形成 |
| 6.3.2 Ly/SCVP-1纳米复合物合成的最佳条件 |
| 6.3.3 Ly/SCVP-1纳米复合物体系相互作用力的影响 |
| 6.3.4 Ly/SCVP-1纳米复合物的表征 |
| 6.3.5 负载Cur Ly/SCVP-1纳米复合物的制备 |
| 6.3.6 负载Cur Ly/SCVP-1纳米复合物的表征 |
| 6.3.7 姜黄素Cur在 PBS缓冲液中的稳定性 |
| 6.3.8 负载Cur Ly/SCVP-1纳米复合物在PBS缓冲液中的稳定性 |
| 6.3.9 体外细胞毒性实验 |
| 6.3.10 Cur-Ly/SCVP-1纳米复合物的细胞吞噬研究 |
| 6.3.11 小鼠血清中Cur含量的测定 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）支气管败血波氏杆菌及其噬菌体的分离鉴定与特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 支气管败血波氏杆菌 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 支气管败血波氏杆菌的危害及流行特点 |
| 1.1.3 支气管败血波氏杆菌的耐药性 |
| 1.2 噬菌体 |
| 1.2.1 噬菌体的形态及分类 |
| 1.2.2 噬菌体进化 |
| 1.2.3 噬菌体的溶原性转换 |
| 1.2.4 噬菌体转导 |
| 1.2.5 噬菌体改变毒素的产生和分泌 |
| 1.3 支气管败血波氏杆菌噬菌体研究进展 |
| 2 目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验所用菌株、细胞 |
| 3.1.2 酶和试剂 |
| 3.1.3 主要培养基及试剂配制 |
| 3.1.4 主要实验器材 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病料的来源 |
| 3.2.2 支气管败血波氏杆菌的分离鉴定 |
| 3.2.3 支气管败血波氏杆菌的药物敏感性分析 |
| 3.2.4 支气管败血波氏杆菌耐药基因的扩增 |
| 3.2.5 支气管败血波氏杆菌噬菌体的分离鉴定 |
| 3.2.6 支气管败血波氏杆菌噬菌体的生物学特性分析 |
| 3.2.7 噬菌体的全基因组测序与分析 |
| 3.2.8 噬菌体整合菌株的筛选 |
| 3.2.9 整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01 生物学特性分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 支气管败血波氏杆菌的分离鉴定 |
| 4.2 支气管败血波氏杆菌药物敏感性分析 |
| 4.3 支气管败血波氏杆菌耐药基因的扩增 |
| 4.4 支气管败血波氏杆菌噬菌体的分离鉴定 |
| 4.5 支气管败血波氏杆菌噬菌体的生物学特性分析 |
| 4.5.1 支气管败血波氏杆菌噬菌体的电镜观察 |
| 4.5.2 支气管败血波氏杆菌噬菌体的裂解谱测定 |
| 4.6 噬菌体的全基因组测序与分析 |
| 4.7 噬菌体整合菌株的筛选 |
| 4.8 整合菌株Bb01+与亲本菌株Bb01 生物学特性分析 |
| 4.8.1 生长特性 |
| 4.8.2 药物敏感性试验 |
| 4.8.3 血清敏感性试验 |
| 4.8.4 细胞吞噬试验 |
| 4.8.5 细胞黏附与侵入试验 |
| 4.8.6 小鼠MLD的测定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 支气管败血波氏杆菌的分离鉴定 |
| 5.2 支气管败血波氏杆菌的耐药性分析 |
| 5.3 支气管败血波氏杆菌噬菌体的生物学分析 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
（8）多功能铁基/硅基纳米药物系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究现状 |
| 1.1.1 肿瘤临床治疗现状及其存在的问题 |
| 1.1.2 纳米载体在肿瘤治疗中的应用价值 |
| 1.2 介孔硅及铁基纳米载体在肿瘤治疗中的研究现状 |
| 1.2.1 介孔硅纳米颗粒在肿瘤治疗中的研究现状 |
| 1.2.2 铁基纳米颗粒在肿瘤治疗中的研究现状 |
| 1.3 传统肿瘤治疗手段的瓶颈 |
| 1.4 本文研究思路及主要研究内容 |
| 1.4.1 本文研究思路 |
| 1.4.2 本文主要研究内容 |
| 1.5 本文创新点 |
| 2 还原响应性肿瘤靶向中空介孔硅纳米载药系统的构建及抗肿瘤效果评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂及设备 |
| 2.2.2 还原响应性肿瘤靶向中空介孔硅纳米载药系统的构建 |
| 2.2.3 还原响应性肿瘤靶向中空介孔硅纳米载药系统在细胞水平的功能检测 |
| 2.2.4 小鼠动物实验及相关治疗指标评估 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 HMSNs-S-S-Tf@DOX的构建及表征 |
| 2.3.2 HMSNs-S-S-Tf@DOX还原响应性药物释放行为评估 |
| 2.3.3 还原响应性肿瘤靶向中空介孔硅纳米载药系统在细胞水平的功能检测 |
| 2.3.4 小鼠体内肿瘤治疗效果评估 |
| 2.3.5 纳米系统对小鼠体内巨噬细胞吞噬和炎症反应的影响评估 |
| 2.4 小结 |
| 3 pH/交变磁场双响应的磁靶向氧化铁纳米载药系统的构建及热化疗联合抗肿瘤效果评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂及设备 |
| 3.2.2 pH/交变磁场双响应的磁靶向氧化铁纳米载药系统的构建 |
| 3.2.3 pH和热触发的Fe_2O_3@PPy-DOX-PEG的药物释放行为检测 |
| 3.2.4 pH/交变磁场双响应的磁靶向氧化铁纳米载药系统在细胞水平的功能检测 |
| 3.2.5 小鼠动物实验及相关治疗指标评估 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 Fe_2O_3@PPy-DOX-PEG的制备与表征 |
| 3.3.2 Fe_2O_3@PPy-DOX-PEG的pH和磁热触发的药物释放行为 |
| 3.3.3 Fe_2O_3@PPy-DOX-PEG纳米载药系统在细胞水平的功能检测 |
| 3.3.4 小鼠体内肿瘤治疗效果评估 |
| 3.3.5 小鼠体内肿瘤磁共振成像 |
| 3.4 小结 |
| 4 还原响应性肿瘤靶向载氧氧化铁纳米载药系统的构建及氧敏化的肿瘤化疗效果评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂及设备 |
| 4.2.2 还原响应性载氧氧化铁纳米载药系统的构建 |
| 4.2.3 PHMNPs-S-S-PEG-LA@PFC(O_2)/EP的氧气负载能力和释放量测定 |
| 4.2.4 PHMNPs-S-S-PEG-LA@PFC(O_2)/EP的还原响应性EP释放行为检测 |
| 4.2.5 含GSH培养基中纳米颗粒聚集行为评估 |
| 4.2.6 还原响应性载氧氧化铁纳米载药系统在细胞水平的功能评估 |
| 4.2.7 小鼠动物实验及相关治疗指标评估 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 PHMNPs-S-S-PEG-LA@PFC(O_2)/EP的制备和表征 |
| 4.3.2 GSH触发的PHMNPs-S-S-PEG-LA@PFC(O2)/EP聚集和EP释放行为的研究 |
| 4.3.3 还原响应性载氧氧化铁纳米载药系统在细胞水平的功能检测 |
| 4.3.4 PHMNPs-S-S-PEG-LA@PFC(O_2)/EP体内肿瘤MR成像研究 |
| 4.3.5 PHMNPs-S-S-PEG-LA@PFC(O_2)的肿瘤再氧化效果评价 |
| 4.3.6 小鼠体内氧气增强的肿瘤化疗效果评估 |
| 4.4 小结 |
| 5 还原响应性肿瘤靶向普鲁士蓝纳米载药系统的构建及饥饿与光热联合抗肿瘤效果评价 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂及设备 |
| 5.2.2 中空多孔普鲁士蓝纳米颗粒的合成 |
| 5.2.3 还原响应性肿瘤靶向中空多孔普鲁士蓝纳米载药系统的制备 |
| 5.2.4 中空多孔普鲁士蓝纳米系统的还原响应性GOx释放行为检测 |
| 5.2.5 中空多孔普鲁士蓝纳米系统体外氧气生成和消耗能力评估 |
| 5.2.6 中空多孔普鲁士蓝纳米系统在细胞水平的功能检测 |
| 5.2.7 小鼠动物实验及相关治疗指标评估 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 PHPBNs-S-S-HA-PEG@GO_x的制备和表征 |
| 5.3.2 PHPBNs-S-S-HA-PEG@GO_x还原响应性GO_x释放行为检测 |
| 5.3.3 PHPBNs-S-S-HA-PEG@GO_x葡萄糖消耗和H_2O_2 分解能力评估 |
| 5.3.4 还原响应性肿瘤靶向中空多孔普鲁士蓝纳米载药系统在细胞水平的功能检测 |
| 5.3.5 PHPBNs-S-S-HA-PEG@GO_x生物催化诱导肿瘤饥饿的体内功效评估 |
| 5.3.6 小鼠肿瘤饥饿和低温光热联合治疗的疗效研究 |
| 5.4 小结 |
| 6 主要结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读学位期间取得的科研成果目录 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（9）云南彝族药用昆虫喙尾琵琶甲物质基础及抗肿瘤相关活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 喙尾琵琶甲化学成分及抗肿瘤相关活性研究 |
| 1 前言 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 化合物的结构鉴定 |
| 2.2 细胞毒活性筛选结果 |
| 2.3 抗氧化活性筛选结果 |
| 2.4 喙尾琵琶甲提取物免疫调节活性研究结果及讨论 |
| 2.4.1 喙尾琵琶甲不同提取部位、多糖及防御液对巨噬细胞吞噬能力的影响 |
| 2.4.2 乙酸乙酯部位(EAF)对正常小鼠溶血素生成水平的影响 |
| 2.4.3 EAF对免疫低下小鼠溶血素生成水平的影响 |
| 3 实验部分 |
| 3.1 仪器、试剂与材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 提取和分离 |
| 3.2.2 细胞毒活性筛选方法 |
| 3.2.3 DPPH自由基抑制活性筛选方法 |
| 3.2.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力试验 |
| 3.2.5 乙酸乙酯部位(EAF)对正常及免疫低下KM小鼠免疫功能影响 |
| 参考文献 |
| 第二章 喙尾琵琶甲中多糖含量测定及其单糖组分分析 |
| 1 前言 |
| 2 仪器、试剂和材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 试剂和材料 |
| 2.3 试验样品来源 |
| 3 试验方法及结果 |
| 3.1 喙尾琵琶甲中多糖含量测定 |
| 3.2 喙尾琵琶甲多糖中单糖含量及组成分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 喙尾琵琶甲中多酚类物质含量分析 |
| 1 前言 |
| 2 仪器、试剂和材料 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 试剂与药品 |
| 2.3 实验材料 |
| 3 方法与结果 |
| 3.1 实验样品准备 |
| 3.2 多酚物质提取 |
| 3.3 标准品溶液的配制 |
| 3.4 测定波长选择 |
| 3.5 吸光度值测定 |
| 3.6 显色时间考察 |
| 3.7 线性关系考察 |
| 3.8 精密度试验 |
| 3.9 重复性实验 |
| 3.10 稳定性实验 |
| 3.11 加标回收率实验 |
| 3.12 多酚含量测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 喙尾琵琶甲刺激性防御液的细胞毒活性及活性成分分析 |
| 1 前言 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 防御液及干燥虫体石油醚提取物挥发性组分分析比较 |
| 2.2 防御液细胞毒活性筛选结果 |
| 3 试验部分 |
| 3.1 仪器、试剂和材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 4 讨论 |
| 4.1 刺激性防御液GC/MS结果与其细胞毒活性相关性分析 |
| 4.2 防御液及防御液中主要活性组分的细胞生长抑制—浓度曲线分析 |
| 4.3 防御液主要组分及风干虫体挥发性组分对比分析 |
| 4.4 喙尾琵琶甲民间抗肿瘤应用的分析 |
| 参考文献 |
| 第五章 琵甲属昆虫医药学应用研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 琵甲属昆虫区系分布及形态学研究 |
| 3 琵甲族昆虫化学成分及活性物质研究 |
| 3.1 挥发油类成分 |
| 3.2 系统提取分离鉴定 |
| 3.3 其他物质基础研究 |
| 4 琵甲属昆虫生物活性相关研究 |
| 4.1 抗肿瘤作用 |
| 4.2 抗菌作用 |
| 4.3 调节机体免疫功能 |
| 4.4 抗氧化作用 |
| 4.5 镇痛作用 |
| 4.6 其它作用 |
| 5 临床应用实例 |
| 6 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）LncRNA-1810034E14Rik对缺血性卒中后小胶质细胞功能的调控作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 缺血性卒中概述 |
| 1.2 神经免疫炎症与缺血性卒中 |
| 1.2.1 脑内免疫炎症与缺血性卒中 |
| 1.2.2 外周免疫细胞与神经免疫炎症 |
| 1) 浸润性白细胞与神经免疫炎症 |
| 2) 淋巴细胞与神经免疫炎症 |
| 1.2.3 靶向神经免疫炎治疗与缺血性卒中 |
| 1.3 小胶质细胞与缺血性卒中 |
| 1.3.1 小胶质细胞生理功能 |
| 1.3.2 小胶质细胞激活与缺血性卒中 |
| 1.3.3 小胶质细胞与缺血性卒中后神经免疫炎症 |
| 1.3.4 缺血性卒中后小胶质细胞对血脑屏障的作用 |
| 1.3.5 缺血性卒中后小胶质细胞对神经元的作用 |
| 1.4 长链非编码RNA与缺血性卒中 |
| 1.4.1 非编码RNA简介 |
| 1.4.2 LncRNA的发现 |
| 1.4.3 LncRNA的功能 |
| 1.5 LncRNA与缺血性卒中 |
| 1.5.1 LncRNA与缺血性卒中后神经元损伤 |
| 1.5.2 LncRNA与缺血性卒中后内皮细胞损伤 |
| 1.5.3 LncRNA与缺血性卒中后神经炎症 |
| 1.6 本论文研究的重点及意义 |
| 1.7 本论文的逻辑结构及基本思路 |
| 1.8 参考文献 |
| 第二章 缺血性卒中后LncRNA-1810034E14Rik表达改变 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 急性缺血性卒中模型建立 |
| 2.2.2.2 小胶质细胞分选 |
| 2.2.2.3 RNA提取 |
| 2.2.2.4 RT-qPCR |
| 2.2.2.5 原代细胞糖氧剥夺 |
| 2.2.2.6 lncRNA芯片分析 |
| 2.2.2.7 原代神经元培养 |
| 2.2.2.8 原代小胶质细胞培养 |
| 2.2.2.9 原代星形胶质细胞培养 |
| 2.2.2.10 原代内皮细胞培养 |
| 2.2.2.11 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 OGD后小胶质细胞内lncRNA-1810034E14Rik显着降低 |
| 2.3.2 缺血性卒中后神经元、星形胶质细胞和内皮细胞lncRNA-18100-34 E14 Rik无明显改变 |
| 2.3.3 LncRNA-1810034E14Rik深度生物信息分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 LncRNA-1810034E14Rik对小胶质细胞功能的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 原代小胶质细胞培养 |
| 3.2.2.2 原代神经元培养 |
| 3.2.2.3 原代细胞糖氧剥夺实验 |
| 3.2.2.4 总RNA提取 |
| 3.2.2.5 RT-qPCR |
| 3.2.2.6 小胶质细胞慢病毒转染 |
| 3.2.2.7 小胶质细胞siRNA干扰 |
| 3.2.2.8 免疫荧光染色 |
| 3.2.2.9 划痕实验 |
| 3.2.2.10 荧光微球吞噬实验 |
| 3.2.2.11 CCK-8细胞活性分析 |
| 3.2.2.12 酶联免疫吸附试验 |
| 3.2.13 原代小胶质细胞原代神经元条件共陪 |
| 3.2.2.14 LDH释放实验 |
| 3.2.2.15 Calcein/PI染色 |
| 3.2.2.16 蛋白提取 |
| 3.3.3.17 蛋白定量 |
| 3.2.2.18 免疫印迹 |
| 3.2.2.19 结果统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 过表达lncRNA-1810034E14Rik减少OGD后小胶质细胞激活 |
| 3.3.2 过表达或干扰lncRNA-1810034E14Rik对OGD后小胶质细胞迁移能力没有影 |
| 3.3.3 过表达或干扰lncRNA-1810034E14Rik对OGD后小胶质细胞吞噬能力没有影响 |
| 3.3.4 过表达lncRNA-1810034E14Rik改善OGD后小胶质细胞炎症状态 |
| 3.3.5 过表达lncRNA-1810034E14Rik减轻OGD后小胶质细胞的神经 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 LncRNA-1810034E14Rik对MCAO后脑损伤有保护作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 急性缺血性卒中模型建立 |
| 4.2.2.2 脑梗死体积测定 |
| 4.2.2.3 神经功能缺损评分 |
| 4.2.2.4 前肢爪抓力测定 |
| 4.2.2.5 疲劳转棒实验 |
| 4.2.2.6 脑水肿程度检测 |
| 4.2.2.7 总RNA提取 |
| 4.2.2.8 RT-qPCR |
| 4.2.2.9 慢病毒立体定位注射 |
| 4.2.2.10 免疫荧光染色 |
| 4.2.2.11 酶联免疫吸附试验 |
| 4.2.2.12 蛋白提取 |
| 4.3.3.13 蛋白定量 |
| 4.2.2.14 免疫印迹 |
| 4.2.2.15 结果统计 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 慢病毒立体定位注射过表达lncRNA-1810034E14Rik |
| 4.3.2 过表达lncRNA-1810034E14Rik减少MCAO后脑梗死体积和脑水肿 |
| 4.3.4 过表达lncRNA-1810034E14Rik改善MCAO后小鼠运动功能障碍 |
| 4.3.4 过表达lncRNA-1810034E14Rik改善MCAO后脑组织炎症状态 |
| 4.3.5 过表达lncRNA-1810034E14Rik抑制MCAO后小胶质细胞激活 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 参考文献 |
| 第五章 LncRNA-1810034E14Rik通过抑制NF-κB减少缺血性卒中后小胶质细胞激活 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 原代小胶质细胞培养 |
| 5.2.2.2 原代细胞糖氧剥夺实验 |
| 5.2.2.3 小胶质细胞慢病毒转染 |
| 5.2.2.4 小胶质细胞siRNA干扰 |
| 5.2.2.5 蛋白提取 |
| 5.3.3.6 蛋白定量 |
| 5.2.2.7 免疫印迹 |
| 5.2.2.8 急性缺血性卒中模型建立 |
| 5.2.2.9 小鼠慢病毒立体定位注射 |
| 5.2.2.10 结果统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 过表达lncRNA-1810034E14Rik抑制OGD后小胶质细胞NF-κB信号通路激活 |
| 5.3.2 过表达lncRNA-1810034E14Rik抑制MCAO后NF-κB激活 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 5.6 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、吞噬的“119”（论文参考文献）
- [1]跑台运动对APP/PS1小鼠海马小胶质细胞清除Aβ功能的影响[D]. 梁菲. 华东师范大学, 2020(08)
- [2]红系造血岛巨噬细胞的鉴定及生物学特征研究[D]. 李威. 郑州大学, 2020(02)
- [3]敲除小胶质细胞VPS35的中枢神经效应以及在缺血性脑损伤中的作用研究[D]. 叶诗洋. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [4]玛咖根部多糖的结构鉴定及免疫调节活性的研究[D]. 张猛猛. 华南理工大学, 2019(01)
- [5]嗜水气单胞菌Ⅵ型分泌系统效应分子Hcp的功能分析[D]. 王楠楠. 南京农业大学, 2018(07)
- [6]海参内脏多糖的分离、结构鉴定、免疫活性及其应用研究[D]. 杨东达. 华侨大学, 2020(01)
- [7]支气管败血波氏杆菌及其噬菌体的分离鉴定与特性研究[D]. 杨斓. 华中农业大学, 2019
- [8]多功能铁基/硅基纳米药物系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用[D]. 周骏. 重庆大学, 2019(01)
- [9]云南彝族药用昆虫喙尾琵琶甲物质基础及抗肿瘤相关活性研究[D]. 肖怀. 云南大学, 2018(01)
- [10]LncRNA-1810034E14Rik对缺血性卒中后小胶质细胞功能的调控作用及机制探讨[D]. 张曦. 南京大学, 2019(01)