一、鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析（论文文献综述）
袁世山,沈瑞忠,原野,刘桂永,金红,崔治中,卢景良[1]（1995）在《鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析》文中研究指明以鸡胚成纤维细胞培养的中国鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株，经蔗糖密度梯度离心法纯化，电镜观察示所得病毒为典型鸡瘟病毒颗粒。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，电泳结果为典型的大分子量ＤＮＡ特征，经ＥｃｏＲＩ或ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄⅢ酶切，插入ｐＵＣ１９载体相应位点，经转化、筛选、鉴定后得相应酶切片段的基因组文库。对其中２３个克隆片段用双酶法进行酶谱分析，绘制出了相应克隆片段的酶切图谱，每个克隆片段中均有１～６个可以利用的插入位点。基因组文库的构建及部分克隆片段的酶谱分析为进一步筛选病毒复制非必需片段以构建重组疫苗表达载体乃至鸡痘病毒分子生物学的研究打下了坚实的物质基础。
张绍杰[2]（2000）在《表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究》文中指出鸡传染性喉气管炎 （Infection Lnyngotrcheitis Vrus，ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各国，我国在50年代发现本病，现己在许多省份流行。目前国内外预防本病所用的疫苗都是弱毒疫茵，但所有的弱毒疫苗都存在以下缺点：（l）由于该病毒的毒力与免疫原性呈正相关，因此，现用的疫苗毒力普遍偏强，接种后反应大；（2）与ILTV强毒一样，其弱毒疫由株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终主带毒；（3）疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡，鸡群与鸡群之间传插过程中毒力会返强，从而成为新的感染源；（4）到目前为止尚无有效方法可以鉴别强毒株和弱毒株。因此，研究新型安全且有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。 糖蛋白 gB是ILTV的主要保护性抗原，它能诱导机体产生体液和细胞介导的保护性免疫应答，是该病毒感染复制必需的蛋白。根据已经发表的ILTV SA。疫苗株的gB基因序列，设计了一对特异性引物，然后通过PCR方法扩增了ILTV中国王岗株的gB基因，并克隆到PUC质粒的EcORI位点中。序列分析结果表明克隆的PCR片段含有2619hp核昔酸，包含了完整的gB基因阅读框架。序列比较分析结果显示，ILTV王岗株（强毒株）的gB基因核昔酸序列与英国的Throne 882株和美国的632株（二者均为强毒株）的 gB基因核昔酸序列完全一致，而与澳大利亚 SAZ株（弱毒株）的gB基因核昔酸的同一性为99．8％，氨基酸的同一性为98．4％。三株ILTV强毒和弱毒比较，弱毒 gB基因在第 89位和第 102位分别发生了一个碱基的插入和缺失，结果导致5 个氢基酸的移码突变，即由强毒的“川＊－C卜11eJie－＊印”变成弱毒的“GIy·切－Asn·Asn－Ser。 将克隆到pUCllg中的ILTV糖蛋白gB基因再亚克隆至杆状病毒转移载体pVL1393中，形成重组质粒甲VLgB。将pVLgB与杆状病毒线性DNA（BAC－N－BlueDNA）共转染Sffi昆虫细胞，经三轮蚀斑纯化，获得重组杆状病毒pVL－ILTVgB。通过PCR方法鉴定证明gB基因被正确插人到杆状病毒基因组中；直接免疫荧光试验结果也表明 ILTV gB基因在重组秆状病毒感染的 Sfg昆虫细胞中被表达。表达的糖蛋白gB作为亚单位疫苗用于下一步的免疫试验。 将克隆在pUCllg中的gB基因和大肠杆菌的L。Z基因分别亚克隆到禽痘病毒转移质粒中然后将其通过脂质体方法转染由鸡痘病毒S－FPV－017 t苗株感染的SPF I张扭杰双达传贝佐顺气管炎间写怵蠢困且阑禹区们＠的构巨及江免沤戮力研灾Zboo年6月鸡胚成纤维细胞中，通过蓝斑筛选出重组鸡痘病毒（rFPV－ILTVgB），并对其进行了 6轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明，其基因组中含有完整的ILTV gB基因：“巾悦＊＿．M删实验也证明了该重组病毒在其感染的sPr 4胚成纤维细胞中表达了ILTV f蛋白gB。 用重组鸡痘病毒rFPV－ILTVgB等接种6周龄的SPF鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立7组（每组】0只鸡）：第1组用商品化V弱毒疫苗点眼免疫：第2组用rFPV－ILTVgB翅皮下注射免疫；第3组用鸡痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射兔疫；第车组用rFPV－ILTVgB免疫2次，间隔2周；第5组用rFPV－ILTVgB一免，2周后用重组杆状病毒表达的 ILTV gB蛋白二免；第 6组用含 ILTV gB基因的重组质粒一免，2周后用 rFPV－ILTVgB二免；第7组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后 4周以致死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。用重组鸡痘病毒rFPV－ILTVgB等接种6周龄的商品鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立4组（每组20只鸡）：第1组用两品化n下V弱毒疫茵点眼兔疫；第2组用：FPV－f VSB翅皮下注射免疫：第3组用鸡痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射免疫；第4组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后4周以致死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。攻毒后的结果显示所有含rFPV－ILTVgB免疫组的SPF鸡或商品鸡均100％保护而免于死亡；！LTV弱毒疫苗免疫的SPF鸡也获100％保护，但ILTV弱毒疫苗免疫的商品鸡在攻毒后有15％死亡；攻毒后SPF鸡对照组死亡率为90％，商品鸡对照组死亡率为60％；所有二次免疫组没有表现明显的免疫增强作用。免疫以后的抗体跟踪检测证明rFPV－ILTVgh诱导的抗ILTV抗体水平与 ILTV弱毒疫苗相当；攻毒后进行的 ILTV分离和 PCR检测结果表明 ILTV弱毒疫苗免疫的SPF 鸡能够更好地阻止攻击强毒的感染，但在商品鸡上不如rFPV－ILTVgB ti。 综合以上实验结果，重组鸡疽病毒rFPV－ILTVgB不仅能诱导体液免疫，也能诱导机体产生针对ILTV的细胞免疫，保护机体抵抗强毒的攻击。该重组鸡痘病霉与现用弱毒疫苗具有同等的免疫效力，但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感染，不会散毒。此外，该重组鸡疽病毒免疫的鸡可以通过血清学方法与自然感染ILTV的鸡加以区别。因此，本实验研究的rFPV－ILTVgB疫苗将有希望从根本上取代现用的ILTV弱毒疫苗，彻底改变ILT防制现状。
夏志平[3]（2002）在《共表达NDV F、IBDV VP0基因的重组鸡痘病毒构建及其实验免疫研究》文中进行了进一步梳理将NDV F基因和IBDV VPO基因分别置于人工合成的复合启动子ATI·p7.5×20的下游，将两个表达单元以复合启动子反向方式连接，插入TK基因中，得到两个复合启动子分别调控两个不同基因的重组转移质粒pVPO-2ATI·p7.5×20-F，经酶切鉴定重组转移质粒构建正确。 将转移质粒pVPO-2ATI·p7.5×20-F用DOTAP Liposomal转染预先感染0.1MOI FPV的CEF细胞，收获病毒后再经BrdU处理后的CEF细胞传代三次。经过挑斑纯化、扩增培养后用间接免疫荧光法筛选表达NDV蛋白的重组鸡痘病毒。同时将其细胞裂解液经聚丙烯凝胶电泳分离、Western Blot检测同时表达NDV或IBDV蛋白的重组病毒。结果从19株病毒中有2株病毒（vFV282a、vFV282b）能正确地表达目的蛋白，并具有良好的抗原活性。 通过CEF细胞、SPF鸡胚、SPF鸡以及商品鸡对实验用重组鸡痘病毒vFV282、NDV E48F8株、IBDV BC6／85 F4株和FPV 102株进行了培养、毒价测定、半数致死量测定、半数感染量测定，为进一步开展重组鸡痘病毒vFV282的免疫原性及免疫保护性研究作准备。 将重组鸡痘病毒vFV282经翼蹼刺种10日龄商品Leghorn公鸡，并于刺种后1wk、2wk、3wk分别进行特异性抗体水平和淋巴细胞转化能力检测，结果发现重组鸡痘病毒vFV282能诱导免疫鸡体产生良好的免疫反应，并能抵抗致死量NDV E48F8株强毒的攻击。 又将重组鸡痘病毒vFV282经翼蹼刺种7日龄商品肉鸡，并于刺种后1wk、2wk、3wk分别进行病毒中和试验和淋巴细胞转化能力检测，结果发现重组鸡痘病毒vFV282能诱导肉鸡产生病毒中和抗体、诱发较高的细胞免疫水平，并能抵抗致死量NDV E48F8株强毒的攻击。 用重组鸡痘病毒vFV282免疫3周龄SPF鸡，于免疫后20d同时攻击致死量的NDV E48F8株、IBDV BC6／85 F4株、FPV 102株病毒评价其免疫保护力。结果表明该重组鸡痘病毒能使免疫鸡产生抗鸡痘的免疫保护力的同时能抵抗NDV和IBDV强毒的攻击。实验结果说明重组鸡痘病毒可以作为疫苗备选株进一步进行研究与开发。
郭建顺[4]（2005）在《鸡痘病毒分子生物学检测方法的建立及其致病机理研究》文中进行了进一步梳理鸡痘是由鸡痘病毒（Fowlpox virus,FPV）引起的一种急性接触性传染病。鸡痘发病的新特点以及FPV 以其独特的优越性作为重组病毒载体疫苗株之一使其越来越来受到人们的广泛关注。为了建立FPV 的分子生物学诊断方法,探讨其在鸡体内的分布、消长规律以及长期毒性,特进行了本研究。试验首先根据已发表的FPV 4b 核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了2 对引物,通过对影响PCR 扩增因素的优化,建立了特异、敏感的FPV 的PCR 检测法。同时试验也对环境中rFPV 的浓缩及PCR 检测方法进行了探讨。回收FPV 4b 核心蛋白基因1 361 bp 的片段,与pMD18-T 载体连接（重组质粒pMD18-T-4b）进行测序。Blast 软件分析表明,该序列与模板DNA（AF198100）的碱基序列的同源性为99.5%,只有7 个碱基差异。结果表明,FPV 4b 核心蛋白基因具有很强的保守性,是制备基因探针非常理想的材料。用EcoRⅠ酶切重组质粒pMD18-T-4b 后得到1 个约360 bp 大小的DNA 片段,以其为模板制备了地高辛标记的cDNA 探针。特异性、敏感性检测和初步应用表明,本试验所建立的检测FPV 的基因探针法具有广泛的应用前景。本试验通过两侧翅内侧皮肤无血管处刺种和气管内（滴鼻、点眼）的途径给10 日龄商品蛋公鸡接种FPV JL 弱毒疫苗株,利用PCR 的方法检测了其在鸡体内的分布、消长规律以及对其毒性进行了研究。2 种接种方法均能在刺种部位皮肤、心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、脑内检测到病毒DNA,消长规律基本相同,但也存在一定差异。毒性试验表明,FPV JL 弱毒疫苗株通过翅内侧皮肤无血管处刺种存在导致全身皮肤感染出痘的危险,滴鼻、点眼途径接种比翅内侧皮肤无血管处刺种免疫效果更确实,使用更安全。上述结果表明,FPV JL 弱毒疫苗株毒性弱,使用安全,但也存在着一定的潜在的生物安全性问题。
李臻[5]（2007）在《HIV多表位核酸疫苗免疫实验及鸡痘病毒转移载体的构建研究》文中认为本研究利用已经设计并人工合成的多表位基因,以HIV-1巨分子颗粒p24为支架,连入安全的真核表达载体质粒pVAX1,构建了新型HIV多表位重组DNA疫苗（pVAX1-MEGN-p24）,细胞转染结果表明,pVAX1-MEGN-p24成功地表达了MEGNp24抗原蛋白。将该重组质粒免疫小鼠,实验结果显示,该重组质粒能够诱导免疫小鼠产生针对HIV细胞免疫和体液免疫,并且以细胞免疫为主。佐剂重组核酸疫苗组具有稳定的特异性CTL反应作用。本研究还构建了新型鸡痘病毒转移载体,并利用该载体获得了一株含HIV多表位基因的重组鸡痘病毒株,运用RT-PCR和IFA方法检测了外源基因重组及鸡痘病毒在鸡胚成纤维细胞中的表达状况。实验结果显示,外源基因已正确重组入鸡痘病毒基因组,且可在鸡胚成纤维细胞中进行有效表达。
田占成[6]（2004）在《表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护效力的研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管病毒（infection bronchitis virus IBV）引起的鸡的一种急性,高度接触性呼吸道传染病。根据病毒的不同组织嗜性，主要有肾型、腺胃型、呼吸道型、产蛋下降等临床症状病变型。目前国内外预防本病所用的疫苗大多数是弱毒疫苗，但现用弱毒疫苗都存在以下缺点：（1）与IBV强毒一样，其弱毒疫苗株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终生带毒；（2）疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡群之间传播过程中毒力会返强，从而成为新的感染源；（3）传染性支气管炎病毒极易发生变异，且易成为病毒重组的供体和受体，给使用IB传统疫苗预防和根除IB带来极大的困难。因此，研究新型安全且有效的疫苗用于IB的防制十分必要。S1糖蛋白是IBV的主要保护性抗原，它主要诱导机体产生体液保护性免疫应答。根据已经发表的IBV XJ3株的S1基因序列，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室刘胜旺研究员设计的一对特异性引物，通过PCR方法扩增了IBV XJ3株的S1基因，并克隆到pUC119质粒的BamHI酶切位点中。序列分析结果表明克隆的片段含有1659bp核苷酸，包含了完整的S1基因阅读框架。将克隆在pUC119中的S1基因和大肠杆菌的LacZ基因分别亚克隆到禽痘病毒转移质粒中，然后，将其通过脂质体方法转染由鸡痘病毒S-FPV-017疫苗株感染的SPF鸡胚成纤维细胞中，通过兰斑筛选出重组鸡痘病毒（rFPV-IBVS1），并对其进行了14轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明,其基因组中含有完整的IBV S1基因；Western-blot实验也证明了该重组病毒在其感染的SPF鸡胚成纤维细胞中真实的表达了IBV S1糖蛋白。用重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1等接种4周龄的SPF鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立4组（每组16只鸡）：第1组点眼免疫商品化IBV弱毒疫苗；第2组翅皮下注射免疫rFPV-IBVS1；第3组翅皮下注射免疫S-FPV-017弱毒疫苗；第4组为非免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后4周以致死剂量的IBV XJ3株进行点眼、滴鼻、喉内接种攻毒。攻毒后的结果显示所有含rFPV-IBVS1免疫组的SPF鸡均100%保护而免于死亡；IBV弱毒疫苗免疫的SPF鸡也获100%保护，免疫以后的抗体跟踪检测证明rFPV-IBVS1诱导的抗IBV抗体水平低于IBV弱毒疫苗免疫组；攻毒后进行的IBV分离和PCR检测结果表明IBV弱毒疫苗免疫的SPF鸡能够更好地阻止攻击强毒的感染。综合以上实验结果，重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1可诱导体液免疫，保护机体抵抗强毒的攻击。该重组鸡痘病毒与现用弱毒疫苗具有同等的免疫效力，但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感染，不会散毒。因此，本实验研究的rFPV-IBVS1疫苗将有希望从根本上取代现用的IBV弱毒疫苗，彻底改变IB防制现状。
王印[7]（2006）在《猪Ⅱ型圆环病毒—伪狂犬重组病毒活疫苗SA215（C）株的构建及其部分生物学特性研究》文中指出猪Ⅱ型圆环病毒（PCV2）是近年来新发现的动物病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合征有关，特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合征，该病最早于1991年在加拿大西部发现，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等，病原学及血清学调查表明，该病在许多国家都广泛存在，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为了研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制，本研究对PCV2 ORF2基因疫苗及PCV2-PRV二价基因工程疫苗进行了研究，主要研究内容如下： 1．PCV2 QRF2基因的克隆及其在ST细胞中的表达 采用PCR方法从包含PCV2 ORF2基因组的重组质粒pMD18-T-ORF2中扩增PCV2ORF2基因的完整编码区，将其克隆到pMD18-T Simple Vector载体后，构建了重组质粒pMD-702*，经序列测定证实，该基因未发生任何碱基突变。用HindⅢ和KpnⅠ双酶切重组质粒pMD-702*，将获得的PCV2 ORF2基因插入到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1（+）中，构建出表达PCV2 ORF2基因的真核重组质粒pcDNA-ORF2，将重组质粒体外瞬时转染ST细胞后，经过RT-PCR方法证明重组质粒pcDNA-ORF2能够在哺乳动物细胞ST中转录，表达的蛋白大小与预期结果相符，且表达蛋白可与PCV2标准阳性血清反应，具有免疫学活性。 2．表达POV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建 将经PCR方法扩增的ORF2全基因插入到PRV通用转移载体pPI-2．EGFP的多克隆位点中，从而构建转移质粒pPI-2．EGFP．ORF2。然后再将该质粒与PRV SA215基因组共转染ST细胞，病变后经空斑纯化得到重组病毒SA215（C）。通过Southern blotting鉴定重组病毒，并通过RT-PCR或Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达，结果表明重组病毒构建正确，且外源基因得到了正确表达。在此基础上，对重组病毒形态学、重组病毒的血清学特性、重组病毒的培养增殖特性等进行了研究，结果表明外源基因的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖。 3．PCV2-PRV二价基因工程疫苗对小鼠和断奶仔猪的免疫原性试验 将重组病毒按疫苗生产程序制成疫苗，并研究二价基因工程疫苗对小鼠和断奶仔猪的免疫原性试验。小鼠试验结果表明对其免疫是安全的，这种疫苗免疫鼠能完全抵抗致死剂量PRV强毒的攻击，具有与亲本株疫苗相当的免疫保护效果。对断奶仔猪的免疫原性试验，对PRV的检测结果表明，SA215（C）能诱导产生PRV中和抗体；
郭志儒,金宁一,王兴龙,金扩世,丁壮,罗坤,顾万钧,殷震[8]（2000）在《鸡痘病毒282E4株基因组2.9kbBamHI片段的序列测定与分析》文中进行了进一步梳理对我国鸡痘病毒 （ FPV） 2 82 E4株基因组 2 .9kb Bam HI片段进行了序列测定与分析。结果表明 ,该片段全长 2 92 3 bp,A+T含量为 72 .0 8%,含 6个完整的开放读码框架 （ ORF）和 2个不完整的 ORF,最大的ORF所编码多肽的相对分子质量为 2 4 60 0。在 2个 ORF的上游存在痘苗病毒晚期启动子的保守序列TAAAT,在 6个 ORF的下游和 2个 ORF的编码区内存在痘苗病毒早期转录终止信号 T5NT。把该片段的核苷酸序列和每个 ORF所编码的氨基酸序列分别对 EMBL核酸序列库和 SWISS-PROT蛋白质序列库进行了同源性搜索 ,未发现同源性片段
金红[9]（2000）在《牛流行热病毒外膜糖蛋白G基因在重组病毒中的表达研究》文中研究表明牛流行热是由病毒引起牛和水牛的急性热性传染病。它广泛流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。为了解牛流行热病毒中国分离株（BEFV JB76H）主要免疫原性糖蛋白G基因的分子生物学特性，以及在重组痘苗病毒和杆状病毒中的表达情况，研究制备BEFV JB76H基因工程疫苗的可行性，进行了本研究。本研究首次以RT-PCR法扩增并克隆了BEFV JB76H主要免疫原性糖蛋白G基因，并进行了脱氧核糖核苷酸序列分析。结果表明，中国分离株G蛋白基因与澳大利亚分离株之间的同源性为91％。说明我国分离株与澳大利亚分离株之间存在较大差异，这可能是由于地域的不同造成牛流行热病毒的变异。利用重组病毒技术，构建了中国分离株G蛋白基因重组痘苗病毒和杆状病毒。结果表明，G蛋白基因中存在的T5CT序列对痘苗病毒P7.5启动子具有终止信号的功能。这一序列的存在导致G蛋白基因几乎不能在天然痘苗病毒P7.5启动子的调控下，在重组痘苗病毒中得到完全表达。动物免疫实验结果表明，使用P7.5启动子的重组痘苗病毒，不能诱导动物产生具有保护效力的中和抗体。为解决这一问题，本研究构建了人工合成强启动子PE/L重组痘苗病毒转移载体，并首次在重组痘苗病毒中采用人工合成强启动子PE/L，成功表达了G蛋白基因。结果表明，在人工合成强启动子PE/L的调控下，由重组痘苗病毒表达的G蛋白基因不仅糖基化水平与天然G蛋白相近，而且表达效率大大提高。对兔子的免疫结果表明，该重组痘苗病毒表达的G蛋白诱导兔子产生中和抗体的速率和效价均高于传统油苗免疫，证明该重组痘苗病毒具有作为牛流行热病毒重组痘苗病毒的潜能。本实验首次成功构建了G蛋白重组杆状病毒。结果表明，重组杆状病毒表达的G蛋白具有牛流行热病毒G蛋白的抗原特异性和免疫原性。另外，本研究探讨研究了牛流行热病毒、痘苗病毒和油苗免疫后对牛外周血淋巴细胞亚类分布的影响。结果显示，这些因素的作用均能导致牛外周血淋巴细胞中CD4+细胞含量的升高。这一结果为研究牛流行热病毒免疫机制提供了一个重要的参考数据。
刘艳丽[10]（2005）在《含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的伪狂犬病病毒Fa株转移载体质粒的构建》文中提出本实验应用酶切、连接、插入的方法,用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为筛选标记,构建了含EGFP的伪狂犬病病毒（PRV）Fa株转移载体质粒。在PRV Fa株BamHⅠ-7重组质粒的基础上,用限制性内切酶NcoⅠ酶切除去gE和11k基因及部分gI和部分28k基因后回收8.6Kb的目的片段,经T1DNA连接酶自身连接之后进行转化,经筛选鉴定,得到阳性转化子,命名为pPB7-1;用SalⅠ消化pPB7-1 DNA,除去gG及部分gD基因后回收约6.0Kb的目的片段,经T1DNA连接酶自身连接之后进行转化,得到的阳性转化子命名为pPⅠ;用EcoRⅠ和BamHⅠ消化pPⅠ DNA,除去EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ等酶切位点,回收约5.7Kb的电泳目的片段,以Klenow大片段酶对其末端进行补平,之后进行平端连接及转化,筛选得到的阳性重组子命名为pPⅠ-1:然后用KpnⅠ消化pPⅠ-1 DNA、回收目的片段（约5.7Kb）、补平、平端连接及转化,筛选白色菌落,得到的阳性重组子命名为pPⅠ-2。再将绿色荧光蛋白载体pEGFP-Cl上含EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pPⅠ-2中gⅠ抗原基因起始密码子ATG下游的Stu Ⅰ位点,在选择培养基中筛选表达EGFP的转化子,构建了以gI为同源序列的含EGFP报告基因的转移载体质粒,其上含有EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamⅠ和KpnⅠ四个单一的多克隆位点,命名为pPⅠ-2.EGFP。大小为7.7Kb经酶切、核酸分子杂交技术鉴定,结果表明该转移载体质粒的构建是成功的。
二、鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析（论文提纲范文）
（2）表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 鸡传染性喉气管炎病毒及鸡传染性喉气管炎 |
| 1 ILTV的发现历史及分类地位 |
| 2 ILTV的形态、理化及生物学特性 |
| 3 毒株分类 |
| 4 流行病学及致病机理 |
| 5 免疫生物学 |
| 6 诊断 |
| 7 防制 |
| 综述二 鸡传染性喉气管炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1 ILTV基因组的结构 |
| 2 ILTV的基因及其编码的主要蛋白 |
| 3 ILTV的复制，蛋白质合成和形态发生 |
| 4 ILTV潜伏感染和病毒被重新激活的机理 |
| 综述三 鸡传染性喉气管炎疫苗研究现状及前景 |
| 1 弱毒疫苗 |
| 2 灭活疫苗和亚单位疫苗 |
| 3 基因工程缺失疫苗 |
| 4 活病毒载体疫苗重组 |
| 5 DNA疫苗 |
| 6 ILT根除的可行性 |
| 综述四 禽痘病毒载体研究进展 |
| 1 禽痘病毒的生物学及分子生物学特征 |
| 2 禽痘病毒作为载体的特性 |
| 3 禽痘病每载体的构建 |
| 4 禽痘病毒载体的应用 |
| 5 小结 |
| 第二部分 研究报告 |
| 实验一 鸡传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白GB基因的克隆及序列比较分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 鸡传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白GB基因在重组鸡痘病毒中的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 鸡传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白GB基因在重组秆状病毒中的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验四 重组鸡痘病毒对SPF鸡的免疫保护性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 重组鸡痘病毒对商品鸡的免疫保护性试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（3）共表达NDV F、IBDV VP0基因的重组鸡痘病毒构建及其实验免疫研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 英文缩写词 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 综述一 鸡痘病毒活载体疫苗研究进展 |
| 1 鸡痘病毒的一般特点 |
| 2 鸡痘病毒活载体的构建 |
| 3 重组FPV活载体疫苗的应用研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 新城疫病毒分子生物学特征及基因工程疫苗研究进展 |
| 1 NDV的一般生物学特征 |
| 2 NDV的几种主要结构蛋白 |
| 3 新城疫工程疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 传染性囊病病毒分子生物学特征及基因工程疫苗研究进展 |
| 1 IBDV的一般生物学特征 |
| 2 IBDV的主要结构蛋白 |
| 3 IBDV的血清型及其特点 |
| 4 IBDV基因工程疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验一 含新城疫病毒F基因、传染性囊病病毒VPO基因的重组转移质粒构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 共表达NDV F、IBDV VPO基因的重组鸡痘病毒的筛选与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 实验用病毒培养、鉴定及抗NDV多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 共表达NDV F、IBDV VPO基因的重组鸡痘病毒对商品蛋鸡的免疫原性及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 共表达NDV F、IBDV VPO基因的重组鸡痘病毒对商品蛋鸡的免疫原性及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验六 共表达NDV F、IBDV VPO基因的重组鸡痘病毒SPF鸡的免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 英文摘要 |
| 个人简历 |
（4）鸡痘病毒分子生物学检测方法的建立及其致病机理研究（论文提纲范文）
| 第一篇 文献综述 |
| 鸡痘病毒的研究进展 |
| 1 FPV 的一般生物学特点 |
| 2 FPV 的流行病学和发病机理 |
| 3 诊断 |
| 4 预防 |
| 5 FPV 的分子生物学 |
| 6 重组FPV 活载体疫苗的研究进展 |
| 7 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 鸡痘病毒 PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 FPV 4b 核心蛋白基因的克隆及其探针制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 FPV 弱毒疫苗株在鸡组织内的分布、消长规律及毒性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
（5）HIV多表位核酸疫苗免疫实验及鸡痘病毒转移载体的构建研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 HIV 疫苗的研究进展 |
| 第二章 鸡痘病毒载体的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 HIV 多表位重组 DNA 疫苗的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 HIV 多表位重组 DNA 疫苗小鼠实验免疫研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组鸡痘病毒转移载体的构建及HIV 多表位重组鸡痘病毒的筛选鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（6）表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护效力的研究（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概况 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 禽痘病毒载体研究进展 |
| 1.4 小结及本试验要达到的目的 |
| 2 实验一 表达传染性支气管炎病毒S1基因重组禽痘病毒的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2.3 S-FPV-017疫苗种毒的制备 |
| 2.2.4 转染和病毒筛选 |
| 2.2.5 重组病毒(RFPV-IBVS1)的PCR检测 |
| 2.2.6 IBVS1蛋白的间接免疫荧光检测 |
| 2.2.7 IBV S1的Western blot 检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 表达鸡IBVS1基因的禽痘病毒转移载体的构建 |
| 2.3.2 鸡IBVS1重组鸡痘病毒的筛选与纯化 |
| 2.3.3 重组禽痘病毒的PCR鉴定 |
| 2.3.4 表达鸡IBVS1蛋白的间接免疫荧光检测 |
| 2.3.5 IBV S1蛋白在重组禽痘病毒中的表达产物检测 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二 重组鸡痘病毒对SPF鸡的免疫保护性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 重组鸡痘病毒(rFPV-IBVS |
| 3.1.3 免疫试验用SPF鸡 |
| 3.1.4 SPF鸡胚 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组鸡痘病毒和鸡痘病毒弱毒疫苗(S-FPV-017)的制备及滴定 |
| 3.2.2 免疫试验的设计 |
| 3.2.3 攻毒试验 |
| 3.2.4 鸡痘病毒的分离及PCR检测 |
| 3.2.5 鸡传染性支气管炎病毒的分离及PCR检测 |
| 3.2.6 抗体检测 |
| 3.2.7 SPF鸡外周血液中T淋巴细胞动态分布检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组鸡痘病毒在鸡体内的复制和稳定性 |
| 3.3.2 重组鸡痘病毒的免疫原性 |
| 3.3.3 重组鸡痘病毒对IBV强毒攻击的免疫保护性 |
| 3.3.4 SPF鸡外周血液中CD4+、CD8+、TCR+T淋巴细胞的动态分布情况 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）猪Ⅱ型圆环病毒—伪狂犬重组病毒活疫苗SA215（C）株的构建及其部分生物学特性研究（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒的生物学特性 |
| 1.1 分类地位 |
| 1.2 病毒的结构和组成 |
| 1.3 病毒的理化性质 |
| 1.4 病毒的培养 |
| 2 猪圆环病毒的基因组 |
| 2.1 病毒基因组构成 |
| 2.2 病毒基因组的复制与转录 |
| 2.3 主要基因组产物 |
| 3 PCV2的流行病学 |
| 4 与PCV2有关的疾病 |
| 4.1 猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS) |
| 4.2 猪皮炎／肾病综合征(PDNS) |
| 4.3 PCV2相关性繁殖障碍 |
| 4.4 猪呼吸道病复合症(PRDC) |
| 4.5 先天性震颤及中枢神经系统疾病 |
| 5 猪圆环病毒疫苗研究 |
| 6 伪狂犬病病毒转移载体 |
| 研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在ST细胞中的表达及其免疫原性的初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、质粒和菌株 |
| 1.2 酶和其它试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因真核表达载体的构建 |
| 2.2 表达 |
| 2.3 表达产物鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因真核表达载体的构建 |
| 3.2 表达产物鉴定 |
| 3.3 ELISA检测ORF2基因表达产物的抗原性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 真核表达载体的建立 |
| 4.2 关于基因的转染方法 |
| 4.3 间接ELISA方法检测ORF2基因表达产物抗原性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组伪狂犬病毒转移载体质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、菌株和细胞 |
| 1.2 酶和其它试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒pPI-2.EGFP和pMD-702*的鉴定 |
| 2.2 重组伪狂犬病毒转移载体质粒pPI-2.EGFP.ORF2的构建 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 质粒pPI-2.EGFP和pMD-702*的酶切鉴定 |
| 3.2 重组伪狂犬病毒转移载体质粒pPI-2.EGFP.ORF2的酶切鉴定 |
| 3.3质粒pPI-2.EGFP与pPI-2.EGFP.ORF2的荧光观察比较 |
| 3.4 ELISA检测PCV-2 ORF2基因融合表达产物的抗原性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GFP基因与其他几种报告基因的比较 |
| 4.2 PRV载体的构建 |
| 4.3 外源基因在伪狂犬病病毒转移载体中的表达 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建及其部分生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株和细胞 |
| 1.2 标准血清 |
| 1.3 酶和其它试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 伪狂犬病毒重组猪圆环病毒ORF2基因活载体疫苗株的构建 |
| 2.2 猪圆环病毒病-伪狂犬病重组病毒株的初步鉴定 |
| 2.3 猪圆环毒病-伪狂犬病重组病毒株的部分生物学特性研究 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 伪狂犬病毒重组猪圆环病毒ORF2基因活载体疫苗株的构建 |
| 3.2 重组病毒SA215(C)的PCR鉴定 |
| 3.3 绿色荧光检测及其病变观察 |
| 3.4 Dot-blots杂交检测鉴定重组病毒结果 |
| 3.5 SA215(C)病毒DNA的BamH Ⅰ酶切及Southern转印杂交检测 |
| 3.6 SA215(C)表达PCV2 ORF2基因的SDS-PAGE电泳及Western印迹分析结果 |
| 3.7 RT-PCR检测重组PRV SA215(C)中ORF2基因在细胞中转录 |
| 3.8 猪圆环病毒病-伪狂犬病重组病毒株SA215(C)的部分生物学特性研究结果 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 关于重组病毒的构建 |
| 4.2 关于真核转染宿主细胞的选择 |
| 4.3 关于蛋白质表达检测 |
| 4.4 关于猪圆环病毒ORF 2基因在PRV SA215株中的表达 |
| 4.5 关于重组病毒SA215(C)株的部分生物学特性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 1 |
（8）鸡痘病毒282E4株基因组2.9kbBamHI片段的序列测定与分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 试剂盒和测序仪 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 测序方法 |
| 1.5 序列分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（9）牛流行热病毒外膜糖蛋白G基因在重组病毒中的表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前 言 |
| 综 述 |
| 1. 牛流行热病研究概况 |
| 2. 外源基因在重组痘苗病毒中的表达及其在免疫中的应用与安全性 |
| 材料与方法 |
| 1. 病毒和细胞 |
| 2. 细菌和质粒载体 |
| 3. BEFV JB76H的培养及病毒RNA的提取与纯化 |
| 4. BEFV JB76H G蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 5. BEFV JB76H G蛋白基因的克隆 |
| 6. BEFV JB76H G蛋白基因限制性内切酶酶谱分析 |
| 7. BEFV G蛋白基因脱氧核糖核苷酸序列的测定与分析 |
| 8. BEFV JB76H G蛋白基因重组痘苗病毒的构建 |
| 9. 重组痘苗病毒中BEFV JB76H G蛋白的表达检测 |
| 10. BEFV JB76H G蛋白基因重组杆状病毒的构建 |
| 11. BEFV JB76H G蛋白基因重组杆状病毒中G蛋白的表达检测 |
| 12. 重组杆状病毒表达的BEFV JB76H G蛋白抗原性检测分析 |
| 13. 重组病毒的兔体免疫实验 |
| 14. 牛外周血淋巴细胞亚类的分布研究 |
| 结果与分析 |
| 1. EFV JB76H糖蛋白G基因RT-PCR扩增条件的建立 |
| 2. BEFV JB76H G蛋白基因克隆载体的构建及重组质粒鉴定 |
| 3. BEFV JB76H G蛋白基因痘苗病毒转移载体的构建 |
| 4. BEFV JB76H G蛋白基因重组痘苗病毒的构建 |
| 5. 免疫印迹法检测重组痘苗病毒中BEFV JB76H G蛋白基因的表达 |
| 6. BEFV JB76H G蛋白基因重组杆状病毒的构建 |
| 7. SDS-PAGE法检测重组杆状病毒中G蛋白的表达 |
| 8. 重组杆状病毒表达的BEFV JB76H G蛋白抗原性分析 |
| 9. 重组病毒的兔体免疫实验结果 |
| 10. 牛外周血淋巴细胞亚类的分布研究 |
| 讨 论 |
| 1. BEFV JB76H G蛋白基因的克隆及脱氧核糖核苷酸序列分析 |
| 2. BEFV JB76H G蛋白基因在重组痘苗病毒中的表达研究 |
| 3. BEFV JB76H G在杆状病毒中的表达 |
| 4. 牛外周血淋巴细胞亚类的分布研究 |
| 结 论 |
| 参考文献 |
| 致 谢 |
| 作者简历 |
（10）含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的伪狂犬病病毒Fa株转移载体质粒的构建（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 1 伪狂犬病毒转移载体 |
| 2 绿色荧光蛋白(GFP)研究进展 |
| 试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株和细胞 |
| 1.2 酶和其它试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 质粒pPB7的鉴定 |
| 1.5 重组质粒pPB7-1的构建 |
| 1.6 重组质粒pPI的构建 |
| 1.7 重组质粒pPI-1的构建 |
| 1.8 重组质粒pPI-2的构建 |
| 1.9 含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒基因缺失转移载体质粒的构建 |
| 1.10 检测pPI-2.EGFP转移载体的绿色荧光 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 质粒pPB7的酶切鉴定 |
| 2.2 重组质粒pPB7-1的酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒pPI的酶切鉴定 |
| 2.4 重组质粒pPI-1的酶切鉴定 |
| 2.5 重组质粒pPI-2的酶切鉴定 |
| 2.6 含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒基因转移载体质粒的鉴定 |
| 2.7 质粒pPI-2.EGFP的荧光观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GFP基因与其他几种报告基因的比较 |
| 3.2 重组DNA分子的构建策略 |
| 3.3 PRV载体系统 |
| 3.4 转移质粒载体 |
| 4 结论 |
| 参考文献: |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析（论文参考文献）
- [1]鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析[J]. 袁世山,沈瑞忠,原野,刘桂永,金红,崔治中,卢景良. 中国畜禽传染病, 1995(01)
- [2]表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D]. 张绍杰. 中国农业科学院, 2000(01)
- [3]共表达NDV F、IBDV VP0基因的重组鸡痘病毒构建及其实验免疫研究[D]. 夏志平. 中国人民解放军军需大学, 2002(02)
- [4]鸡痘病毒分子生物学检测方法的建立及其致病机理研究[D]. 郭建顺. 吉林大学, 2005(06)
- [5]HIV多表位核酸疫苗免疫实验及鸡痘病毒转移载体的构建研究[D]. 李臻. 吉林大学, 2007(03)
- [6]表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护效力的研究[D]. 田占成. 内蒙古农业大学, 2004(04)
- [7]猪Ⅱ型圆环病毒—伪狂犬重组病毒活疫苗SA215（C）株的构建及其部分生物学特性研究[D]. 王印. 四川农业大学, 2006(12)
- [8]鸡痘病毒282E4株基因组2.9kbBamHI片段的序列测定与分析[J]. 郭志儒,金宁一,王兴龙,金扩世,丁壮,罗坤,顾万钧,殷震. 中国兽医学报, 2000(02)
- [9]牛流行热病毒外膜糖蛋白G基因在重组病毒中的表达研究[D]. 金红. 东北农业大学, 2000(01)
- [10]含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的伪狂犬病病毒Fa株转移载体质粒的构建[D]. 刘艳丽. 四川农业大学, 2005(08)