一、中国丁型肝炎病毒抗原编码区基因异质性与乙型肝炎病毒亚型关系的初步研究（论文文献综述）
刘贺[1]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中指出目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
王彦[2]（2018）在《我国丁型肝炎病毒感染情况调查和病毒分子特性研究》文中研究表明研究背景丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus,HDV）是乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）的卫星病毒,必须在HBV或其他嗜肝DNA病毒的辅助下才能包装成完整的病毒颗粒。HDV的感染能够引起非常严重的肝脏损伤,加速肝脏的疾病进展,提高肝硬化、肝脏失代偿、肝癌甚至死亡的风险。乙肝疫苗的实施能够有效降低HBV的感染率,减少HBV感染者,从而降低HDV的感染流行,但近几年国际研究显示,HDV的感染率呈现上升趋势,并且在人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）阳性的HBV感染人群中显着高于单独乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface Antigen,HBsAg）阳性的人群。目前,我国HBV处于中度流行,有超过9000万人为HBV慢性感染者,并且部分地区HIV疫情严重,截止2017年11月30日,已报告我国存活的HIV感染者和获得性免疫缺乏综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）患者约 75 万人,调查显示有 6.3%-10.9%的HIV感染者合并HBV感染,HDV感染会加重肝脏损伤。因此,有必要对该部分人群进行HDV的感染情况调查,及时制定合理有效的预防措施控制HDV.的流行。本研究将对我国慢性HBV感染和HIV/HBV合并感染者进行HDV感染情况调查,评估感染相关风险因素,分析HDV、HBV和HIV-1主要流行基因型及其之间可能存在的关系,为我国HDV流行的预防和控制提供数据支持。研究方法基于Taqman探针和实时定量PCR的技术,建立双靶向HDV核酸检测的方法。采用世界卫生组织（World Health Organization,WHO）HDV国际标准品对该方法进行评价。从全国七个省市自治区（北京、内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、广西壮族自治区、云南省、四川省和广东省）的部分医院采集慢性乙肝肝炎患者样本3000人份,其中HIV/HBV合并感染者样本759人份,对感染者的临床信息和人口学信息进行收集。采用HDV抗体和核酸的检测方法,对收集的样本进行HDV筛查,调查我国不同地区和人群中HDV的感染情况。通过卡方检验和Logistic回归分析HDV感染的相关因素,及其对肝脏疾病进展的影响。对HDV核酸检测呈阳性的血清/血浆样品进行HDV全基因组序列的扩增和测序,获得HDV全基因组序列;对采集的样本HBV S区基因片段和HIV pol基因片段进行扩增和测序,分析三种病毒的感染模式以及分子病毒学特征。研究结果一、HDV核酸检测方法的建立本研究建立了双靶向HDV核酸检测的方法,经WHO HDV国际标准品评测,最低检出线为575 IU/ml。本研究建立的HDV核酸检测方法能够用于中国地区HDV流行毒株的检测,与HDV抗体检测方法相结合,可用于中国临床中HDV的筛查和HDV感染者中HDV病毒活动性监测。二、我国七个省市自治区HDV的感染情况调查本研究中七个省市自治区均存在HDV的感染,总体的感染率为2.63%（79/3000）。多因素Logistic回归分析发现,与HDV感染相关的因素为HIV的合并感染和研究地区,HDV的感染率在HIV/HBV合并感染人群中显着高于HIV阴性人群（aOR=9.61,95%CI:5.06-18.27）,相对于北京市研究现场,四川省研究现场的HDV的感染率显着增加（aOR=11.10,95%CI:3.73-33.08）。本研究中,我国不同地区慢性乙型肝炎患者中HDV感染率存在很大的差异,四川研究现场HDV的感染率最高,为13.88%,并且显着高于其他六个研究现场:其次是广西壮族自治区研究现场,HDV的感染率为5.32%,广东省研究现场HDV感染率为2.45%,新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区、北京市和云南省四个研究现场HDV感染率较低分别为0.88%,0.50%,0.48%和 0.45%。本研究发现HDV感染者与非HDV感染者之间,肝脏疾病临床指标具有显着差异,在HDV感染人群中,天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）和总胆红素水平升高的人群比例以及乙型肝炎病毒e抗体（Hepatitis Be antibody,HBeAb）阳性的人群比例显着高于非HDV感染人群。说明HDV的感染对肝脏细胞造成了损伤,同时对乙肝病毒的复制产生了负性影响。经Logistic回归模型分析,发现四川省研究现场HDV感染的相关因素除HIV的感染外,还包括性别因素,HDV感染率在男性人群中高于女性。在广西壮族自治区研究现场,与非静脉吸毒者相比,HDV感染率在静脉吸毒者中显着增加（aOR=31.83,95%CI:4.71-215.09）。在HIV/HBV合并感染者人群中,相对于新疆研究现场,四川研究现场的HDV感染率显着增加（aOR=20.67,95%CI:2.56-166.70）,且四川研究现场HDV感染率显着高于其他研究现场;在非HIV感染的慢性乙型肝炎患者中,相对于新疆研究现场,广西研究现场的HDV感染率显着增加（aOR=16.74,95%CI:2.50-112.01）。但与广东省和四川省研究现场差异不显着。三、我国七个省市自治区慢性乙型肝炎患者中,HDV、HBV和HIV-1分子病毒学特征本研究共获得HDV全基因组序列20条,经系统进化树分析,发现中国HDV流行毒株的基因型包括HDV-1型和HDV-2a型,其中,在HDV感染率最高的四川地区,HDV的主要流行基因型为HDV-2a型。本研究共获得HIV-1 pol基因序列236条,HIV-1的主要流行亚型为CRF07BC,CRF01AE 和 B’,其次是 CRF08BC,CRF6701B,CRF57BC,CRF65cpx,CRF68-01B。另外,在北京和四川研究现场出现了新的重组型。北京研究现场HIV-1的主要流行亚型为CRFO1AE（51.61%）,CRF07BC（31.18%）和 B’（10.75%）;四川研究现场 HIV-1 的主要流行亚型为CRF07BC（92.5%）和CRF01AE（3.75%）;广东省研究现场HIV-1的主要流行亚型为 CRF07BC（46%）,CRF01AE（22%）和 CRF5501B（16%）。本研究共获得790条HBVS区序列,构建系统进化树分析,HBV的基因型为HBV-C型（52.03%）,HBV-B 型（28.86%）,HBV-D 型（18.10%）,和 HBV-I 型（0.25%）以及6例新的重组基因型。在各研究现场之间HBV基因型分布存在显着性差异。北京、云南省和内蒙古自治区研究现场的HBV基因型以C型为主,广东省和广西壮族自治区研究现场以HBV-B型为主,新疆维吾尔自治区研究现场以HBV-D型为主（约占84.11%）,四川省研究现场HBV-B型和HBV-C型均为主要的流行基因型,另外还存在两例HBV-Ⅰ型。本研究中HDV感染者的HBV基因型以HBV-B型和HBV-C型为主,HDV/HBV/HIV合并感染者中,HIV的基因型为CRF07BC,但HBV基因型和HIV基因型在HDV感染者中的分布与HDV阴性人群没有明显差异,均属于当地主要的流行基因型。结论本研究建立了 HDV核酸的检测方法,经WHO国际标准品评价后,最低检测线为575 IU/ml。近几年,首次对全国七个地区进行较大规模的慢性乙型肝炎患者以及HIV/HBV合并感染者中HDV感染情况调查,发现HDV在我国整体为低流行趋势,但是四川省研究现场的HIV感染者和广西壮族自治区的静脉吸毒者为HDV感染的高危人群。本研究也发现HDV的感染可能会对肝脏细胞产生损伤,加重疾病的进展。因此,有必要对我国慢性HBV感染者中的疑似HDV感染进行HDV的筛查,及时指导临床用药。对于我国四川研究现场（凉山彝族自治州）和广西壮族自治区研究现场需要提高HBV疫苗的覆盖率,特别是HIV阳性的人群和静脉吸毒人群,降低HBV的感染率,提高HDV的预防和控制。本研究为中国大陆地区对HDV流行的预防和控制提供了一定的数据支持。
高英堂[3]（2003）在《肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究》文中提出HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒,其长期持续的慢性感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。随着人们对肝炎病毒认识的不断深入,尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展,使临床上现有的血清免疫学方法和以单一PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显,由于不能真实、全面地反映患者体内病毒基因组的各种变异和动态变化,对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大限制。为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践,需要利用新的分子生物医学技术,研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂。据此,我们重点研究了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用,以及新型肝炎病毒SENV的实验研究。本文涉及的实验方法包括生物信息学分析（即芯片上探针和PCR引物的设计、测序序列的检索和比对）、探针和PCR引物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及显色、芯片杂交结果的数据处理等。芯片制备过程中的优化环节包括:尼龙膜型号和探针固定照射剂量的选择,探针3′末端加尾碱基数的确定,利用探针的互补寡核苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性,利用PCR扩增直接参入地高辛信号分子,分析其长度、浓度及杂交时间对杂交信号的影响,比较了HBV标本的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率。经过二年多的反复实验研究,初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备。在HBV基因芯片的研制过程中,先后制备了HBV-450S、HBV-90S、HBV-120S、HBV-P/S区75S和HBV-C/X区25S等不同点阵数的基因芯片。最早的HBV-450S芯片包含的基因信息最丰富,理论上可检测HBV的7种基因型、4种血清亚型、4个P基因耐药相关的突变位点、2个S抗原突变位点、6个C区变异和X区的缺失突变,但部分探针特异性较差。在随后的改进中,HBV-P/S区75S是目前临床实验研究较好的芯片,对基因型、血清亚型和拉米夫定耐药突变均能特异检测。同时,利用制备的HBV基因芯片,对45例纳入葛兰素威康公司评价新药拉米夫定疗效临床研究的乙肝患者、270例三中心医院的门诊慢性乙型肝炎患者和466例来自6个
谭文杰,刘善虑,苗季,丛旭,詹美云[4]（1995）在《中国4株丁型肝炎病毒抗原编码区基因的cDNA克隆与序列分析》文中进行了进一步梳理从我国四川、广西、河南的丁型肝炎病毒抗原（ＨＤＡｇ）或抗体（ａｎｔｉ－ＨＤ）阳性的ＨＢｓＡｇ携带者中，筛选出４株ＨＤＶＲＮＡ阳性标本，经逆转录和聚合酶反应（ＲＴ－ＰＣＲ）后，获得包含ＨＤＶ抗原编码区的ＣＤＮＡ片段，并对其进行克隆与序列测定。经计算机分析比较表明：四川、广西株与美国－１株同源性最高，分别为９９．３％、９９．０％；而河南－１、河南－２株与台湾株的同源性较高。分别为９４．３％、９２．１％，上述４株与日本－１、秘鲁－１的同源性在６６．１％－７７．８％之间。推导的ＨＤＡｇ的氨基酸序列的同源性为：四川、广西株与美国株分别为９９．５％、９６．４％；河南－１、河南－２株与台湾株分别为８９．７％、８９．３％，故我国至少存在基因型Ｉ型的两种亚型，其中四川、广西株为ＩＡ型；河南２株皆为ＩＢ型。同时，实验结果还证实了ＨＤＶ毒株的异质性呈地区分布特征。
谭文杰,苗季,詹美云[5]（1996）在《中国丁型肝炎病毒抗原编码区基因异质性与乙型肝炎病毒亚型关系的初步研究》文中认为为了研究乙型肝炎病毒（HBV）与丁型肝炎病毒（HDV）的协同作用,阐明在我国不同地区与民族中HDV感染率与HBV亚型的关系,我们经筛选获得西藏、内蒙、河南、四川等地藏、蒙、汉族共8份血清,HBsAg和HDV RNA皆为阳性。HBsAg亚型经反相间接血凝法测定,经逆转录-聚合酶链反应获得HDV的cDNA片段,将其克隆到载体pGEM-3zf（-）或pGEM-T上,进行序列分析,确定其基因亚型。经比较研究丁型肝炎病毒基因亚型与HBsAg亚型的关系表明:我国HDV抗原编码区基因的异质性及不同地区民族HDV感染率的差异与HBsAg亚型无关。
董菁,成军,杨倩[6]（2004）在《乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义》文中研究指明乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2 kb,结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架（ORF）之后,一直沿用至今. 我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X 基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp, 编码产物为56 aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎（CHB）患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/ C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60%,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.
于风雪[7]（2013）在《白细胞介素28、P21活化激酶4基因多态性与慢性乙型肝炎病人抗病毒治疗应答的关联性分析》文中提出全世界约1/3人口曾经或正存在乙型肝炎病毒的血清学表现，3.5-4亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）携带者。乙型肝炎的疾病谱和自然史多种多样，从非活动性病毒携带状态至进行性加重不等，重者发展为肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。在亚洲，有40%的慢性乙型肝炎病人（chronic hepatitis B, CHB）死于肝硬化或肝细胞癌。乙型肝炎的遗传易感性和对治疗的应答体现在HBV与宿主基因组之间的长期共进化作用，这种进化是以人群中DNA分子的多态性为基础的。因此，运用遗传流行病学和分子流行病学的研究方法，确定和HBV感染后抗病毒治疗应答相关的易感基因和易感位点，对乙型肝炎个体化防治具有重要意义。白细胞介素28（IL-28）细胞因子,又称IFN-λ,分2个亚型，IL-28A和IL-28B，在抗病毒过程中起到免疫防御作用，P21活化蛋白激酶4（PAK4）位于IL-28B基因上游64kb处，属于P21活化蛋白激酶家族，Rac和Cdc42的效应蛋白。它是肌动蛋白细胞支架、神经轴突生长、细胞存活、激素信号系统和基因转录的重要调节器，PAK4特向作用于三磷酸鸟苷（GTP）形成GTP结合蛋白Cdc42Hs并且微弱作用于MAP激酶（mitogen-activatedprotein）的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）家族，参与丝状伪足形成的调节，在肌动蛋白细胞骨架重组中起着一定作用。前期全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）在美国、澳大利亚和日本分别证实分属IFN-λ家族的细胞因子IL28B附近的基因突变与丙型肝炎病毒感染后转归和治疗应答有关。IL28及其附近的PAK4基因多态性是否与中国汉族人群乙型肝炎病毒感染后抗病毒治疗应答有关目前很有争议。本研究拟采用分子流行病学病例对照研究设计，Hapmap数据库筛选出可能会影响HBV感染后抗病毒治疗应答的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism, SNP），基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS）技术对目标基因位点分型，分析基因型与慢性乙型肝炎的关系，探讨IL28、PAK4的基因多态性对中国汉族慢性乙型肝炎病人抗病毒治疗应答的影响，以期为临床个体化治疗和预后提供依据。第一部分白细胞介素28基因多态性与慢性乙型肝炎病人拉米夫定治疗应答的关系目的：本研究选择白细胞介素28A基因（interleukin28A，IL28A，IFN-λ2）、白细胞介素28B基因（interleukin28B，IL28B，IFN-λ3）为候选基因，选取rs8099917和rs12980602两个位点分析宿主遗传因素与慢性乙型肝炎拉米夫定治疗应答的关系。方法：354例首次应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者作为研究对象，以调查问卷形式收集研究对象的基线资料、发病情况、检查结果，并在拉米夫定治疗1年时对病人的HBeAg血清转换情况、HBV DNA病毒载量及ALT复常情况进行跟踪随访。完全应答定义为HBe抗原转阴、HBVDNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；部分应答定义为HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；不符合上述标准者定义为非应答。利用CNKI和Pubmed查询免疫疾病易感基因和与治疗应答相关的文献，用Hapmap在中国汉族人群选择待研究基因的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）位点，Haploview软件排除呈高度连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的位点。收集外周血，采用血液基因组DNA提取试剂盒从抗凝全血提取DNA。运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted LaserDesorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）的实验平台对候选基因： IL28B-rs8099917（TT、 GT、 GG），IL28A-rs12980602（TT、CT、CC）进行DNA的SNPs分型。采用SPSS16.0进行数据处理和分析，对181例拉米夫定治疗应答组和173例非应答组计量资料两两比较用独立样本的t检验，单因素计数资料比较采用卡方检验，以非条件Logistic回归校正混杂因素并计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（95%confidence intervals，95%CI），以P<0.05为有统计学意义，统计检验均为双侧。结果：1位点连锁不平衡用Haploview软件证实rs8099917和rs12980602不存在连锁不平衡，选择的2个位点等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），不存在连锁不平衡，说明研究样本具有群体代表性。2应答组和非应答组患者基线特征的比较应答组中男性、吸烟和饮酒者所占的比例均低于非应答组（61.33%vs76.30%，P=0.002；29.83%vs43.35%，P=0.008；38.67%vs52.02%，P=0.012），证明性别、吸烟、饮酒是拉米夫定治疗应答的独立影响因素，男性患者、有吸烟饮酒史的患者更不容易实现治疗应答。年龄、HBV DNA和ALT水平在两组间均无统计学差异（50.86±11.03vs52.22±10.82；7.67log copies/ml vs7.69log copies/ml；279.50IU/L vs317.50IU/L；P＞0.05）。将纤维化程度分为f0-f4，与拉米夫定的治疗应答呈显着负相关，OR值为0.716（95%CI=0.432-0.986），P=0.036，纤维化程度越高，治疗应答率越低。3rs8099917位点与拉米夫定治疗应答的关系对rs8099917基因位点检测结果发现，TT为其显性基因，无论在应答组还是非应答组未发现GG基因型，单因素分析应答组突变基因型GT携带率明显高于非应答组（8.8%vs2.3%），OR值为4.097（95%CI=1.342-12.512, P=0.015）。在多因素分析中，当校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT基线水平后，IL-28B rs8099917位点的突变基因型GT仍显示与拉米夫定治疗的高应答有关，OR值为4.025（95%CI=1.316-12.354），P=0.013。携带rs8099917GT基因型者可能预示着拉米夫定治疗的成功。4rs12980602位点与拉米夫定治疗应答的关系对rs12980602基因位点检测的结果与rs8099917相似，TT也是其显性基因。单因素分析应答组突变基因型CT和CC携带率明显高于非应答组（18.8%vs9.2%），OR值为2.27（95%CI=1.202-4.284）；P=0.014)。但在多因素分析中，当校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT基线水平后，IL-28B rs12980602位点的突变基因型CT和CC显示与拉米夫定治疗应答无相关性，OR值为1.765（95%CI=0.884-3.617, P=0.109）。结论：1用Haploview软件证实rs8099917位点和rs12980602位点不存在连锁不平衡，说明研究样本具有群体代表性。2性别、吸烟、饮酒是拉米夫定治疗应答的独立影响因素，男性患者、有吸烟饮酒史的患者不容易实现治疗应答。3白细胞介素28基因的rs8099917和rs12980602两个位点基因多态性与HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人拉米夫定治疗应答有关联，携带rs8099917位点突变基因型GT，rs12980602位点突变基因型CT和CC者可能预示着拉米夫定治疗的成功，尤其以rs8099917位点突变基因型GT为生物学标志。4肝纤维化早期预示着对拉米夫定治疗的高应答。第二部分白细胞介素28、P21活化激酶4基因多态性与慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干扰素治疗应答的关系目的：聚乙二醇干扰素治疗费用昂贵且治疗有一定的副作用，所以高应答率病人的选择对临床合理用药来说非常必要。本研究选择IL28A（IFN-λ2）、IL28B（IFN-λ3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4基因（p21activatedkinases4，PAK4）为候选基因，选取rs8099917、 rs12980602和rs9676717三个位点分析宿主遗传因素与慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素治疗应答的关系。方法：240例首次应用聚乙二醇干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者作为研究对象，以调查问卷形式收集研究对象的基线资料、发病情况、检查结果，并在聚乙二醇干扰素治疗6月时对病人的HBeAg血清转换情况、HBVDNA病毒载量及ALT复常情况进行跟踪随访。完全应答定义为HBe抗原转阴、HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；部分应答定义为HBV DNA检测不到或低于检测下限，或较基线下降≥2log10、ALT水平下降至正常；不符合上述标准者定义为非应答。利用CNKI和Pubmed查询免疫疾病易感基因和与治疗应答相关的文献，用Hapmap在中国汉族人群选择待研究基因的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）位点，Haploview软件排除呈高度连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的位点。收集外周血，采用血液基因组DNA提取试剂盒从抗凝全血提取DNA。运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted LaserDesorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）的实验平台对候选基因： IL28B-rs8099917（TT、 GT、 GG），IL28A-rs12980602（TT、CT、CC），PAK4-rs9676717（TT、 CT、CC）进行DNA的SNPs分型。采用SPSS16.0进行数据处理和分析，比较92例聚乙二醇干扰素治疗应答组和148例非应答组计量资料两两比较用独立样本的t检验，单因素计数资料比较采用卡方检验，以非条件Logistic回归校正混杂因素并计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（95%confidence intervals，95%CI），以P<0.05为有统计学意义，统计检验均为双侧。结果：1位点连锁不平衡用Haploview软件证实rs8099917、 rs12980602和rs9676717不存在连锁不平衡，选择的3个位点等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），不存在连锁不平衡，说明研究样本具有群体代表性。2应答组和非应答组患者基线特征的比较应答组饮酒者占36.96%，明显低于非应答组的50%（P=0.048），饮酒是聚乙二醇干扰素治疗应答的独立影响因素，有饮酒史的患者不容易实现治疗应答。年龄、男性所占比例、吸烟者所占比例、HBV DNA和ALT基线水平在两组间均无统计学差异（38.07±14.62vs37.3±12.67；67.39%vs66.22%；41.30%vs51.35%；7.67log copies/ml vs7.69log copies/ml；279.50IU/L vs317.50IU/L；P＞0.05）。3rs8099917位点与聚乙二醇干扰素治疗应答的关系对rs8099917基因位点检测结果表明，TT为其显性基因，应答组无GG基因型，应答组和非应答组TT、 GT和GG基因型的携带率无统计学差异（89.13%,10.87%,0.00%vs87.84%,9.46%,2.70%，P=0.838）。rs8099917位点与聚乙二醇干扰素治疗后6月的应答关联性分析结果表明，两者间没有明显的关联性，单因素分析OR值为0.881（95%CI=0.388-2.002），P=0.838；多因素分析校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT水平后，OR值为0.881（95%CI=0.388-2.002），P=0.999。4rs12980602位点与与聚乙二醇干扰素治疗应答的关系对rs12980602位点检测的结果与rs8099917位点相似，TT也是其显性基因，应答组和非应答组TT、 CT和CC基因型的携带率无统计学差异（82.61%,15.22%,2.17%vs81.08%,18.92%,0.00%，P=0.186）。rs12980602位点与聚乙二醇干扰素治疗后6月的应答关联性分析结果表明，两者间没有明显的关联性，单因素分析OR值为0.902（95%CI=0.458-1.778），P=0.766；多因素分析校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT水平后，OR值为0.688（95%CI=0.311-1.523），P=0.356。5rs9676717位点与与聚乙二醇干扰素治疗应答的关系对rs9676717位点检测结果表明，应答组与非应答组TT、 CT和CC基因型的携带率有显着统计学差异（56.52%，32.61%，10.87%vs40.54%，52.70%，6.76%，P=0.009）。单因素分析rs9676717位点携带突变基因型CT+CC与干扰素治疗后的应答有显着的负相关性，OR值为0.524（95%CI=0.310-0.888），P=0.016。当多因素分析校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV DNA，ALT水平后，PAK4基因的rs9676717位点的突变基因型CT+CC仍显示与干扰素治疗应答呈负相关， OR值为0.173（95%CI=0.037-0.799）；P=0.025。结论：1饮酒是聚乙二醇干扰素治疗应答的独立影响因素，有饮酒史的慢性乙型肝炎患者不容易实现治疗应答。2位于IL-28的rs8099917和rs12980602位点与慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干扰素治疗的应答率无关，而携带PAK4的突变基因型CT+CC降低干扰素治疗6月患者的应答。第三部分IL-28B基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除及干扰素治疗应答关系的Meta分析目的：采用Meta分析的方法，对国内外在不同人群不同类别乙型肝炎患者中开展的研究结果进行综合评价，评价IL-28B基因rs12979860位点及rs8099917位点与HBV感染后病毒自发清除及治疗应答的相关性。方法：利用关键词“IL-28B、SNP、hepatitis B、spontaneous clearance、treatment and interferon"联合检索PUBMED、 MEDLINE、 EMBASE、Cochrane library数据库、中国万方数据库、中文科技期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库的中英文文献。末次检索日期是2013年3月25日。共检索到32篇文献。由两位研究人员对检索到的所有文献题目和摘要进行评估筛选，最后选出5篇关于rs12979860位点与HBV感染后自发清除的相关文献、7篇关于rs12979860位点与HBV感染后干扰素治疗应答的文献、3篇关于rs8099917位点与HBV感染后自发清除的相关文献、3篇关于rs8099917位点与HBV感染后干扰素治疗应答的文献。纳入Meta分析提取纳入文献的信息如下：第一作者、出版年、研究设计类型、受试者来自的国家和种族、乙型肝炎诊断类型、病例组和对照组的定义和数量、提取DNA和分型的方法、病毒亚型、治疗方法等。文献未提供基因型的，利用相应的基因频率计算，分别提取rs12979860位点及rs8099917位点的相关数据，对两个位点的显性模型进行了Meta分析。计算优势比（OR）及其95%CI作为效应量。首先对纳入分析的原始文献进行Q检验，分析异质性，根据异质性检验结果，选择固定效应模型或随机效应模型求其效应合并值。用漏斗图和Begg’s检验进行发表偏倚分析，以P<0.05为差异有统计学意义。所有数据用STATA11.1分析。结果：1rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除的关系共有5篇符合分析条件的关于rs12979860位点与HBV感染后自发清除的相关文献。Meta分析的异质性检验显示：各研究间不存在异质性（I2=20.0%，P=0.287）。根据异质性检验结果选择M-H固定效应模型对rs12979860位点显性模型（TC+CC vs CC）进行数据合并，结果显示，合并后的OR为1.05（95％CI：0.83-1.32，P=0.70），证明rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除没有关联。Begg’s偏倚分析显示无明显发表偏倚，P>0.1。2rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答的关系有7篇符合分析条件的关于rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答关系的相关文献。Meta分析的异质性检验显示：合并后的OR为1.57（95％CI：1.06-2.33，P=0.024）但各研究间存在异质性（I2=61.6%，P=0.016）。根据异质性检验结果对数据进行分层分析，按照乙型肝炎病人诊断类别分HBeAg阳性组和HBeAg阴性组进行分析。HBeAg阳性组的4篇文献仍然存在异质性（I2=77.7%，P=0.004），采用随机效应模型分析结果如下：rs12979860位点显性模型（TC+TT vs CC）合并后的OR为0.717（95％CI：0.190-2.701，P=0.623），证明rs12979860位点与HBeAg阳性慢性乙型肝炎病毒感染后干扰素治疗应答没有关联。HBeAg阴性组3篇文献采用固定效应模型分析结果如下：各研究间不存在异质性（I2=0.0%，P=0.710）。根据异质性检验结果对rs12979860位点显性模型（TC+TT vs CC）选择M-H固定效应模型进行数据合并，结果显示，合并后的OR为2.132（95％CI：1.15-3.95，P=0.016），rs12979860位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答呈正相关，突变基因型TC+TT显着提高HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。无发表偏倚。3rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除的关系共有3篇符合分析条件的关于rs8099917位点与HBV感染后自发清除的相关文献。Meta分析的异质性检验显示：各研究间不存在异质性（I2=0.0%，P=0.705）。根据异质性检验结果对rs8099917位点显性模型（GG+GTvs TT）选择M-H固定效应模型进行数据合并，结果显示，合并后的OR为1.084（95％CI：0.72-1.623，P=0.696），证明rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除没有关联。无发表偏倚。4rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答的关系有3篇符合分析条件的关于rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答关系的相关文献。对rs8099917位点显性模型（GG+GT vs TT） Meta分析的异质性检验显示：合并后的OR为0.400（95％CI：0.24-0.66，P=0.000），证明rs8099917位点与乙型肝炎病毒感染后治疗应答呈负相关，突变基因型GG+GT显着降低慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。各研究间不存在异质性（I2=36.8%，P=0.206），无发表偏倚。结论：1通过Meta分析证实，IL28B rs12979860位点基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除以及HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人干扰素治疗应答无关，与HBeAg阴性慢性乙型肝炎病人干扰素治疗应答存在一定的相关性。IL28B rs12979860位点基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除以及HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人干扰素治疗应答无关，与HBeAg阴性慢乙肝病人干扰素治疗应答呈正相关，以野生型等位基因C为参照，突变基因型TC+TT显着提高HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。2通过Meta分析证实，IL28B rs8099917位点基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除无关，与乙型肝炎病毒感染后治疗应答呈负相关，突变基因型GG+GT显着降低慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的应答率。
范晶华[8]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中研究指明[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
马宁[9]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中指出第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
李可可,刘莹,姚品芳,陈真,王红,李劲[10]（2014）在《中国人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和标准的比较》文中研究表明目的:将来自中国不同地区不同民族乙型肝炎检测"大三阳"学生的外周血乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）进行基因分型并探讨不同方法对HBV基因分型的效果进行比较,建立较为客观精确的HBV基因分子分型方法和标准.方法:反映HBV-S区的型特异性的聚合酶链式反应-限制性酶切片断长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）方法进行基因分型;依据HBV-S区的型特异性的PCR扩增片段大小直接进行分型;通过对NCBI数据库中共计220个条目已确认B、C、D型的HBV-S基因DNA序列的同源性比对,构建一个以HBV的S区DNA序列分子进化树为基础的基因分型标准.对待检样品S区的PCR产物进行DNA测序并与标准进化树的DNA序列进行比对并重新构建进化树而进行HBV基因分型.结果:在共计216例乙型肝炎检测"大三阳"（乙型肝炎两对半检查中,HBsAg、HBeAg和HBcAb均为阳性）样品中,第1种分型方法鉴定出:B型155例、C型41例、D型7例,尚有13例不能确定是C型还是D型.进一步经第2种分型方法确认其中10例未分型的均为C型,余3例不能确定是C型还是D型.经测序、比对及构建分子进化树,测序的30例中与PCRRFLP分型特别是亚型的结论多不相同.并且首次在国内发现3例HBV-G型（为广西壮族和瑶族男性）.结论:3种方法比较各有优劣.PCR-RFLP法较为精细可以分到亚型,但该法的缺陷是不能区分C2型和D2型.根据PCR片段直接分型法较为快捷简便,但引物特异性不高,分型不准确.将待检HBV-S基因DNA序列导入标准进化树的分型方法较为准确客观,是HBV基因分型的"金标准".但针对HBV的普遍变异和种群异质性,需要建立HBV-S的蛋白分型标准.
二、中国丁型肝炎病毒抗原编码区基因异质性与乙型肝炎病毒亚型关系的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国丁型肝炎病毒抗原编码区基因异质性与乙型肝炎病毒亚型关系的初步研究（论文提纲范文）
（1）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（2）我国丁型肝炎病毒感染情况调查和病毒分子特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 丁型肝炎病毒特性 |
| 2 丁型肝炎病毒的感染模式 |
| 3 丁型肝炎病毒的致病性 |
| 4 丁型肝炎病毒的流行 |
| 5 中国丁型肝炎病毒的流行 |
| 6 丁型肝炎病毒分子流行病学调查 |
| 第一部分 HDV核酸检测方法的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 HDV核酸检测方法 |
| 3.2 慢性HBV感染样本的HDV RNA检测 |
| 3.3 慢性HBV感染样本的HDV抗体(IgG和IgM)检测 |
| 3.4 HDV抗原基因的分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分: 我国七个省市自治区HDV感染情况调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究人群 |
| 2.2 入组标准 |
| 2.3 研究材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 慢性乙型肝炎患者样本采集 |
| 3.2 HDV的感染情况筛查 |
| 3.3 HDV感染的相关因素分析 |
| 3.4 HDV感染对肝功能的影响 |
| 3.5 HDV感染对HBV复制的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 :我国七个省市自治区慢性乙型肝炎患者中,HDV、HBV和HIV-1的分子特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 样本的收集 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 病毒基因组序列的鉴定 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 病毒基因片段的扩增 |
| 3.2 HDV基因组特征 |
| 3.3 HIV-1基因序列特征 |
| 3.4 HBV基因序列特征 |
| 3.5 HBV与HDV相互作用区域氨基酸序列特征 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言- 国内外研究进展综述 |
| 一、生物芯片 |
| 二、肝炎病毒基因诊断的研究进展 |
| 三、肝炎病毒诊断芯片的研究状况 |
| 四、SENV 的研究进展 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、基因芯片实验体系的优化 |
| 二、HBV 基因芯片的制备和应用 |
| 三、HCV 基因分型芯片的研制及应用 |
| 四、HBV、HCV 联检基因芯片 |
| 五、SENV 的致病性研究 |
| 讨论 |
| 一、肝炎病毒基因芯片制备的方法学 |
| 二、肝炎病毒基因芯片的临床应用 |
| 三、SENV 的临床检测实验研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (材料和方法的图表) |
| 致谢 |
（7）白细胞介素28、P21活化激酶4基因多态性与慢性乙型肝炎病人抗病毒治疗应答的关联性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 白细胞介素 28 基因多态性与慢性乙型肝炎病人拉米夫定治疗应答的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白细胞介素 28、P21 活化激酶 4 基因多态性与慢性乙型肝炎病人聚乙二醇干扰素治疗应答的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IL-28B 基因型与乙型肝炎病毒感染后病毒自发清除及干扰素治疗应答关系的 Meta 分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 慢性乙型肝炎治疗的新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）中国人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和标准的比较（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料血样来源: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HBV的DNA提取: |
| 1.2.2 PCR-RFLP: |
| 1.2.3 依据H B V-S区的型特异性PCR片段直接分型法进行分型: |
| 1.2.4 改良的型特异PCR片段直接分型法: |
| 1.2.5 DNA测序-构建进化树法: |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR-RFLP结果 |
| 2.3 改良的型特异性PCR法 |
| 2.4 构建进化树的结果 (为径向图, 分枝树状图未列出) |
| 3 讨论 |
| ■背景资料 |
| ■同行评议者 |
| ■研发前沿 |
| ■相关报道 |
| ■创新盘点 |
| ■应用要点 |
| ■同行评价 |
四、中国丁型肝炎病毒抗原编码区基因异质性与乙型肝炎病毒亚型关系的初步研究（论文参考文献）
- [1]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [2]我国丁型肝炎病毒感染情况调查和病毒分子特性研究[D]. 王彦. 中国疾病预防控制中心, 2018(01)
- [3]肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究[D]. 高英堂. 南开大学, 2003(04)
- [4]中国4株丁型肝炎病毒抗原编码区基因的cDNA克隆与序列分析[J]. 谭文杰,刘善虑,苗季,丛旭,詹美云. 中华实验和临床病毒学杂志, 1995(04)
- [5]中国丁型肝炎病毒抗原编码区基因异质性与乙型肝炎病毒亚型关系的初步研究[J]. 谭文杰,苗季,詹美云. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [6]乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义[J]. 董菁,成军,杨倩. 世界华人消化杂志, 2004(04)
- [7]白细胞介素28、P21活化激酶4基因多态性与慢性乙型肝炎病人抗病毒治疗应答的关联性分析[D]. 于风雪. 河北医科大学, 2013(10)
- [8]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)
- [9]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [10]中国人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和标准的比较[J]. 李可可,刘莹,姚品芳,陈真,王红,李劲. 世界华人消化杂志, 2014(16)