一、猪免疫旋毛虫抗原和感染后的抗体应答（论文文献综述）
柳亚茹[1]（2019）在《猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用》文中指出猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（Porcine Cirovirus Type 2,PCV2）感染所致,临床症状表现为断奶仔猪的多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征及母猪的繁殖障碍等,是严重危害养猪业健康发展的重要疾病之一,给世界各国养猪产业造成了巨大经济损失。该病快速诊断与检测技术的研究一直是各国学者研究的热点课题。虽然目前已经建立了聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、直接免疫荧光、病毒分离鉴定等诊断与检测技术,但缺少可快速读取检测数值的技术方法。因此,开展PCV2抗原抗体快速读取检测数值技术的研究对于该病的成功防控十分必要。本论文基于原核表达纯化的Cap蛋白,建立了PCV2抗体荧光微球免疫层析快速检测技术,基于可配对的PCV2单克隆抗体,建立了PCV2抗原荧光微球免疫层析快速检测技术,丰富了PCV2抗原抗体的快速检测技术。本研究成功扩增出702 bp的Cap基因,构建了pET30a（+）-Cap的原核表达载体,表达了分子量约为36 Ku的含有His标签Cap融合蛋白;通过条件优化,确定了最佳蛋白诱导表达条件,转速180 rpm,IPTG诱导终浓度为0.5 mM,诱导时间5 h,诱导温度为37℃;通过亲和层析的方式成功纯化出Cap融合蛋白,纯化后的蛋白浓度为1.5mg/mL。免疫印迹分析试验表明,纯化的蛋白可与PCV2特异性多抗发生反应,具有良好的反应原性。以表达纯化的含His标签Cap融合蛋白标记荧光微球,实验室已有的无标签的Cap蛋白、兔源PCV2高免血清IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上,点膜仪参数设置为Speed 30 mm/sec,1.0μL/cm,建立了猪圆环病毒2型抗体荧光微球免疫层析快速检测方法。荧光微球标记蛋白抗原的终浓度为50μg/mL,最佳反应条件为待检测血清样品进行20倍稀释,在100μL样品中加入3μL偶联抗原的荧光微球,混合均匀后孵育5 min,加入加样孔,待样液完全浸润NC膜时开始计时,反应15min,用干式免疫荧光分析仪读取T/C比值,判定结果。经对8个不同地区的340份血清样品的检测,同时同商品化猪圆环病毒ELISA抗体检测试剂盒比较,特异性符合率为94.2%,敏感性符合率为99.63%,总体符合率为98.53%;试验结果表明,建立的PCV2抗体荧光微球免疫层析快速检测方法具有快速、简便、敏感、特异等特点,可用于生产临床上猪圆环病毒2型抗体的快速检测。以2株PCV2特异性单抗5C、4E11,基于双抗夹心的方法建立PCV2抗原荧光微球免疫层析检测方法。以5C单抗标记荧光微球,1 mg/mL的4E11单抗、1 mg/mL羊抗小鼠IgG分别包被在检测线（T）和质控线线（C）上,点膜仪参数设置,为Speed 40mm/sec,1.0μL/cm,抗体荧光微球偶联的终浓度为150μg/mL。检测最佳条件:含PCV2的样本稀释20倍,每100μL样品中加入单抗偶联的荧光微球7μL,加入稀释板内混合均匀,室温孵育5 min,加入加样孔,待样液完全浸润NC膜时开始计时,反应12 min,最后用干式免疫荧光分析仪读取T/C比值,判定结果的。对临床收集和制备的120份样品进行了检测,同时同商品化PCV2 PCR检测试剂盒比较,特异性符合率为97.22%,敏感性符合率为100%,总体符合率为99.17%;结果表明,研制的PCV2抗原荧光微球免疫层析快速检测方法具有快速、简便、敏感、特异等特点,可用于PCV2的临床样本快速检测和PCV2疫苗生产中的半成品快速检测与质量控制。
孙阁阁[2]（2019）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究》文中研究表明由旋毛虫引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是通过食用含有旋毛虫感染性幼虫的生的或者不熟的肉类所导致的。近年来在我国周边国家如韩国、泰国、老挝、越南等国也已发生了多次人体旋毛虫病暴发,因此,旋毛虫病作为了一种新现和再现的人兽共患疾病,对人体健康、社会、经济均造成了巨大的影响。目前,国内外对旋毛虫病的诊断主要集中在肌肉幼虫阶段的旋毛虫抗原。国际旋毛虫病委员会（ICT）建议旋毛虫肌幼虫ES抗原可作为诊断旋毛虫的金标准。然而,当旋毛虫肌幼虫ES抗原用于检测旋毛虫感染小鼠或猪的血清时,抗旋毛虫抗体IgG直到感染后3-4周才能检测到阳性;并且感染旋毛虫的病人在感染28天以后抗旋毛虫的抗体阳性率才能达到100%。因此,在旋毛虫感染后存在有23周的“窗口期”（window phase）。在旋毛虫的生活史中,肠道感染性幼虫（IIL）和成虫是旋毛虫对宿主肠黏膜的侵入期,其ES蛋白最早与肠黏膜直接接触并相互作用,能够接触宿主的免疫系统首先引起宿主的免疫应答;因此,IIL和成虫的排泄分泌抗原含有刺激宿主产生早期免疫应答的主要成分。在旋毛虫感染后的早期,最早出现的抗旋毛虫抗体也是针对这些抗原的。由于旋毛虫感染宿主后4周才发育为成囊期幼虫（肌幼虫）且被包裹在胶原囊中,肌幼虫接触宿主的免疫系统比较晚,因此宿主产生的抗肌幼虫抗体也比较晚。所以,现在迫切的需要从旋毛虫肠道期虫体中鉴定和筛选特异性的早期诊断抗原。本研究运用血清学诊断的方法检测旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病的早期诊断价值,从成虫ES蛋白中筛选出旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP）进行克隆表达和功能鉴定,同时检测rTsSP对旋毛虫感染的早期诊断及疫苗靶标的潜在应用价值。材料方法1旋毛虫、实验动物、血清、菌种及细胞系不同种旋毛虫在本实验室传代保种备用。整个实验所用的动物均购买于实验动物中心。血清:旋毛虫不同种属、弓形虫、裂头蚴、日本血吸虫和广州管圆线虫感染小鼠血清,以及其他寄生虫感染病人血清。细胞系:IEC,C2C12,于本实验室液氮中冻存。载体和菌种:克隆载体pGEM-T,表达载体pQE-80L,宿主菌为BL21,为本实验室冻存。2旋毛虫成虫ES抗原的早期诊断价值评估AW ES-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性和特异性。准备30只雌性BALB/c小鼠,感染不同剂量的旋毛虫（100条/只和500条/只）。AW ES-ELISA检测旋毛虫早期和轻度感染小鼠血清的敏感性。最后AW ES-ELISA检测旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估AW ES对旋毛虫病早期诊断价值的敏感性和特异性。3旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（TsSP）生物信息学分析,克隆表达及鉴定将早期感染血清识别的成虫ES蛋白进行质谱分析后,从被鉴定的蛋白中挑选出了具有潜在早期诊断价值的旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP）。应用NCBI,ExPasy,SignalP3.0serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件分析预测了TsSP的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域;在大肠杆菌中克隆表达并纯化,将纯化后的rTsSP皮下接种免疫小鼠,获得rTsSP免疫血清,Western-blot检测rTsSP的免疫原性及抗原性;通过RT-PCR和q-PCR检测TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期是否转录及转录水平的高低;通过间接免疫荧光（IFA）检测TsSP在不同发育虫期虫体表面及内部的表达;对不同虫期虫体进行石蜡包埋及冰冻组织切片,通过IFA观察TsSP在不同时期虫体的具体定位;制备不同虫期的可溶性蛋白,通过ELISA和Western blot,检测TsSP蛋白在不同虫期是否表达及表达量的高低。4 TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞（IEC）的特异性结合作用。将不同稀释度的抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与肠道感染性幼虫（IIL）混合后,分别接种到IEC单层中体外孵育2h进行幼虫体外侵入实验,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）检测抗rTsSP血清对虫体的杀伤作用,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率,并将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的ML经口感染小鼠,计算ADCC作用后肌幼虫的感染率。5 rTsSP对旋毛虫病的早期诊断按重度（500条/只）、中度（300条/只）及轻度（100条/只）3个剂量,将不同剂量的旋毛虫感染小鼠,每组各10只,感染后开始隔天采血,rTsSP-ELISA检测rTsSP对旋毛虫早期感染血清的识别、检测rTsSP对旋毛虫感染小鼠血清的敏感性与特异性。同时检测旋毛虫感染猪血清,旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估rTsSP对旋毛虫病的早期诊断的潜在应用价值。6 rTsSP在免疫保护中的应用为了评估rTsSP的免疫保护作用,每只小鼠皮下免疫20μg rTsSP,隔10天免疫1次,共免疫3次,检测免疫后抗rTsSP抗体水平及所诱导的体液免疫应答,并计算成虫和肌幼虫的减虫率;并用霍乱毒素亚单位（CTB）作为佐剂,通过滴鼻途径对小鼠接种rTsSP。间隔10d免疫1次,共免疫3次,分别检测滴鼻免疫后肠道内总的和特异性sIgA水平;肠道分泌sIgA细胞及杯状细胞的数量;检测脾细胞和肠系膜淋巴结诱导的细胞因子水平的变化;计算感染后收集不同天数成虫和肌幼虫的减虫率。7统计学分析用SPSS17.0分析软件和Graphpad Prism对所有结果和数据进行统计学分析及图表绘制,采用单因素方差分析,重复资料方差分析,t检验和卡方检验进行统计分析,检验水平α=0.05。结果1.成虫ES抗原的早期诊断应用成虫ES-ELISA检测感染旋毛虫不同剂量后不同天数的小鼠血清,结果表明,成虫ES抗原与粗抗原和肌幼虫ES在检测感染100条旋毛虫感染血清时,分别在感染后8、12及12天检测到抗旋毛虫抗体IgG,在检测高剂量组（500/条）时分别在10,8,10天检测到抗旋毛虫抗体。用这3种抗原分别检测旋毛虫早期和晚期病人血清结果表明,成虫ES的敏感性和特异性分别是100%和97.48%。2.TsSP生物信息学分析预测TsSP基因（GI:164521948）序列全长为1372bp,编码429个氨基酸残基,其分子质量为47.55kDa,等电点为8.73;不稳定指数为42.25,脂肪指数为71.52,总的平均亲水性是-0.360,认为该蛋白为亲水性蛋白。该蛋白N端具有明显的疏水性区域,无跨膜区。预测TsSP为分泌型蛋白,存在信号肽,切割位点在18-19位氨基酸残基之间,表明成熟的肽段始于第19位氨基酸,具有信号肽SP序列,认为其能够分泌到细胞外。该蛋白在第37-277位之间是个高度保守的结构功能域Tryp-SPC。I-TASSER预测TsSP属于丝氨酸蛋白酶家族。3.TsSP的克隆表达及鉴定设计PCR外引物和具有特异性酶切位点的内引物,通过巢式PCR扩增出大小为1236bp的TsSP基因,将TsSP基因连接到克隆载体pGEM-T中,双酶切后将TsSP基因再连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒,转染E.coli BL21感受态细胞。双酶切鉴定重组质粒构建成功。对连接成功的单菌落加入IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE,发现在45.2kDa处出现一条明显条带,而未经诱导的细菌未见此条带,表明TsSP重组蛋白表达成功。Western blot分析显示,rTsSP蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsSP血清识别,表明rTsSP具有良好的免疫原性和抗原性。RT-PCR和qPCR结果表明TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期（ML,IIL,3dAW,6dAW和NBL）均转录,并且各个发育期转录水平没有差异（P>0.05）。Western blot和ELISA结果表明TsSP在旋毛虫的各个虫期均表达,并且在IIL和NBL表达水平相对较高;IFA结果显示,TsSP在以上5个虫期均表达,并且主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎部位。4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定4.1 rTsSP与肠上皮细胞结合的特异性分别通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞（IEC）的特异性结合作用,Far-Western结果显示抗rTsSP免疫血清识别了24条蛋白带,分子量为14.4kDa86.5kDa,而rTsSP不能与C2C12蛋白结合,表明rTsSP能与IEC蛋白特异性结合。ELISA检测亦发现rTsSP能与IEC蛋白结合且具剂量依赖性。IFT发现rTsSP可与IEC和肠粘膜特异性结合;共聚焦显微镜检查结果表明rTsSP与IEC的结合部位是细胞膜与细胞质。4.2抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC的抑制或阻断作用体外侵入实验结果表明,在相同血清稀释度（1:50）时,抗rTsSP血清、感染血清及正常血清组的幼虫侵入率分别为31.48%,15.84%及84.16%（P<0.01）,且抗rTsSP抗体对幼虫的侵入作用具有抗体剂量依赖性,随血清稀释度的增加而降低（P<0.01）,表明抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC具有明显的抑制作用。4.3抗rTsSP抗体依赖的ADCC对旋毛虫幼虫的杀伤作用将抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与新生幼虫（NBL）和肌幼虫（ML）共孵育,再分别加入小鼠腹腔巨噬细胞孵育不同时间后,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率。结果显示当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP血清能促进巨噬细胞对NBL和ML的粘附。抗rTsSP血清对NBL和ML的细胞毒性分别为52%与44.67%,明显高于正常血清的21.33%和18%（P<0.01）;细胞毒性具有抗体剂量依赖性,且随孵育时间的延长而增加（P<0.01）。结果表明抗rTsSP抗体依赖的ADCC在体外对NBL和ML具有特异性杀伤作用。将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的100条ML经口感染小鼠,与正常血清组相比,感染后3d与42d的成虫与肌幼虫减率分别为89.4%和36.50%,表明抗rTsSP抗体可通过ADCC方式杀伤ML,并可明显降低ML的感染性及其在肠道中的发育。5.rTsSP的诊断价值在旋毛虫重度、中度和轻度感染小鼠,rTsSP-ELISA分别在感染后8、7及7天检测到抗rTsSP抗体,并且在感染后16、10及10天抗体检测阳性率达到100%;rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染小鼠的敏感性与特异性均为100%。rTsSP-ELISA诊断早期和晚期旋毛虫病人时的敏感性分别为95.24%和100%,对于早期旋毛虫病人诊断的敏感性明显高于肌幼虫ES诊断的敏感性（75%,P<0.05）;rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病人的特异性（99.49%）明显高于ES-ELISA的特异性（91.41%）（P<0.05）。6.rTsSP的免疫保护6.1皮下接种rTsSP诱导的免疫第1次与第2次免疫后血清中rTsSP特异性抗体IgG水平明显升高,末次免疫后10d抗rTsSP抗体IgG效价为1:105;免疫后10、20、30及40d,IgG1水平明显高于IgG2a（P<0.01）,表明rTsSP免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。与PBS组相比,rTsSP免疫组和佐剂对照组在攻击感染后5d的成虫减虫率分别是52.70%和10.30%（P<0.05）;感染后42d,rTsSP免疫组和佐剂对照组的肌幼虫减虫率分别是52.1%和3.66%（P<0.05）。结果表明,rTsSP皮下免疫小鼠可诱导明显的免疫保护。6.2经鼻接种rTsSP诱导的免疫保护用rTsSP经鼻免疫小鼠可引起明显的肠道总sIgA及TsSP特异性sIgA水平升高;血清TsSP特异性抗体IgG/IgM/IgA水平亦明显升高;在免疫接种小鼠的十二指肠中能检测到更多的杯状细胞/酸性粘蛋白和IgA分泌细胞。与对照组相比,rTsSP免疫组的IFN-γ,IL-4和IL-10水平显着增加。末次免疫后10d用300条幼虫攻击感染,与PBS对照组相比,感染后3、5、7、9d的成虫减虫率分别是49.95%、61.30%、68.30%及71.10%（P<0.001）;感染42d免疫组和佐剂组的肌幼虫减虫率分别是62.1%及13.9%（P<0.001）。结果表明,rTsSP经鼻免疫小鼠后诱导了明显的肠道sIgA应答及全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。结论1.旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病早期诊断具有较高的敏感性和特异性,为旋毛虫病的早期诊断提供一个新的诊断抗原来源;2.克隆表达了旋毛虫TsSP,TsSP在旋毛虫的各个虫期均有转录和表达,主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎;3.rTsSP蛋白能够与肠上皮细胞特异性结合,抗rTsSP抗体能够抑制旋毛虫体外侵入肠上皮细胞,抗rTsSP抗体能够介导巨噬细胞对NBL和ML的杀伤作用。TsSP可能是旋毛虫对IEC的主要侵入蛋白;4.rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性,可作为旋毛虫病潜在的早期诊断抗原;5.rTsSP蛋白皮下/经鼻免疫小鼠后,诱导了局部粘膜和全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。
祁欣[3]（2018）在《旋毛虫成虫特异性DNaseⅡ-1和DNaseⅡ-7的表达鉴定及其免疫保护作用》文中提出旋毛虫病是一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,是由于生食或食用了未熟的感染了旋毛虫的肉类而感染。人和动物感染旋毛虫在中国大多数省份均有报道,旋毛虫病不仅严重威胁公众健康,同时还影响养猪业的经济效益和肉类食品安全。因此,需要发展疫苗来阻断旋毛虫从家养动物向人类的传播。我们课题组前期应用Western blot和鸟枪法液相色谱质谱联用（shotgun LC-MS/MS）技术,使用旋毛虫感染小鼠及病人的早期血清从成虫的排泄分泌（ES）蛋白中筛选出了旋毛虫成虫特异性DNase II-1（TsDNase Ⅱ-1）/DNase II-7（TsDNase Ⅱ-7）。脱氧核糖核酸酶II（DNase II）是一种广泛存在的核内切酸酶,可以通过水解DNA的磷酸二酯键降解DNA而发挥其生化功能,并且在逃避宿主免疫防御和病原体入侵过程中发挥重要作用。DNA疫苗利用真核表达载体,所表达蛋白经过折叠和修饰,比原核表达的蛋白更近似于天然构象。利用减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体,通过口服的方式进行免疫可以更有效地诱导粘膜免疫应答,更有利于杀伤和排出寄生于宿主肠道的虫体。本研究克隆表达、纯化了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7,免疫小鼠获得了免疫血清,通过Real-time PCR、Western blot和间接免疫荧光试验（IIFT）鉴定了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫不同发育时期的转录、表达及定位;观察了抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫血清对旋毛虫体外侵入肠上皮细胞（IEC）单层的抑制作用及抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7特异性抗体介导的巨噬细胞对旋毛虫新生幼虫的杀伤作用;构建了减毒沙门氏菌为载体的TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7DNA疫苗,检测了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7皮下接种免疫及口服DNA疫苗免疫小鼠的免疫应答类型和对小鼠的免疫保护效果,证实了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7可作为抗旋毛虫感染疫苗的候选靶标蛋白。材料与方法1.实验动物、旋毛虫虫种、菌株及细胞系本研究使用的实验动物为6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。旋毛虫虫种（T1,ISS534）是由本实验室小鼠每6个月传代保种。鼠伤寒沙门氏菌⊿cyaSL1344株来自河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重点实验室。实验所用小鼠小肠上皮细胞IEC由本课题组前期分离获得;乳仓鼠肾细胞BHK-21来自河南省疾控中心细胞资源中心。2.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息学分析及表达与鉴定利用NCBI、ExPasy、BepiPred等在线软件对TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的结构域、理化性质及抗原位点进行生物信息学分析;从3d成虫cDNA中扩增TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因并构建原核表达质粒对rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7进行表达和纯化,通过Real-time PCR、Western blot和IIFT分析了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫（IIL）、成虫和新生幼虫时期的转录、表达及定位。通过体外侵入IEC单层和ADCC实验观察TsDNase Ⅱ特异性抗体对旋毛虫侵入中的作用。3.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠诱导的免疫应答将纯化的重组蛋白rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7、rTsDNase Ⅱ-1+7混合蛋白、佐剂及PBS分别皮下注射免疫小鼠。初次免疫后0、10、20和30d尾静脉采血收集小鼠血清,运用间接ELISA方法检测并分析rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠后引起IgG、IgG1和IgG2a水平的变化。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重组沙门氏菌DNA疫苗的构建及鉴定构建真核重组质粒pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7,用脂质体法将其转入BHK-21细胞中,用RT-PCR和IIFT鉴定质粒在体外的转录和表达。将重组质粒用电转法转化进入减毒沙门氏菌后口服免疫小鼠,免疫后1周采集小鼠脾脏和肠系膜淋巴结,用RT-PCR和IIFT鉴定质粒在小鼠体内的转录和表达。5.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答收集DNA疫苗初次免疫后0、10、20和30d的小鼠血清、肠道冲洗液、脾细胞和肠系膜淋巴结细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a的水平和肠液中总IgA、特异性IgA水平。将脾细胞和肠系膜淋巴结细胞分别用rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7刺激72h,收集细胞培养上清,采用双抗体夹心ELISA法检测细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-10）的水平。此外,应用IIFT检测免疫小鼠血清IgG和肠道冲洗液IgA对旋毛虫不同发育时期虫体的识别,进一步验证DNA疫苗所引起的免疫应答。6.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫对小鼠的免疫保护作用分别用皮下注射rTsDNase Ⅱ和口服DNA疫苗2种途径免疫小鼠,末次免疫后10d,每只小鼠经口感染300条旋毛虫肌幼虫。攻击感染后5d剖杀小鼠,收集肠道成虫并计算成虫减虫率;感染后42 d剖杀小鼠收集肌幼虫并计算肌幼虫减虫率,以观察免疫保护效果。7.统计学处理使用SPSS 17.0统计分析软件对实验数据进行分析统计。数值的表述方式为平均值±标准差。多个实验组之间的比较运用单因素方差分析,两组间比较使用t检验和卡方检验,检验显着性水平:α=0.05。结果1.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息学分析及表达与鉴定测序结果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的完整cDNA序列分别为1221 bp和1161bp,预测的开放阅读框分别编码347和348个氨基酸,分子量大小分别为38.06 kDa和38.22 kDa,等电点分别为7.58和7.56。Western blot分析结果显示,IIL、成虫、新生幼虫粗提蛋白和成虫ES蛋白中的天然TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7可以被抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7的血清识别。Real-time PCR结果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫各发育期虫体均有转录;IIFT结果显示,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在成虫和新生幼虫虫体表面均有表达,并且主要位于虫体组织切片的表皮和杆状体。经抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清孵育的IIL,体外对肠上皮细胞的侵入率分别为40.13%和32.65%,明显低于免疫前血清组（4.01%,χ12=105.012,χ22=70.118,P<0.01）;ADCC结果显示,抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清组的新生幼虫死亡率（66.84%和63.39%）明显高于免疫前血清组（15.30%,t1=26.420,t2=22.599,P<0.01）,对新生幼虫的这种细胞毒性具有抗体剂量依赖性（F1=69.569,F2=68.231,P<0.01）。2.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠诱导的免疫应答rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7和2种蛋白混合免疫小鼠均可产生高滴度的血清特异性抗体,且rTsDNase Ⅱ-1(t20d=13.318,t30d=56.608,P<0.01)、rTsDNase Ⅱ-7(t20d=17,507,t30d=22.466,P<0.01)和2种蛋白混合(t20d=7.821,t30d=24.942,P<0.01)免疫小鼠后20和30 d,血清IgG1水平均明显高于IgG2a水平,表明rTsDNase Ⅱ免疫小鼠后引起了以Th2型为主的Th1/Th2混合型免疫应答。3.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重组沙门氏菌DNA疫苗的构建及鉴定双酶切和测序验证结果证明成功构建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗。体外转染BHK-21细胞后,RT-PCR和IIFT检测结果显示转染细胞中存在TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因转录和蛋白表达。对DNA疫苗免疫1周后的小鼠脾脏和肠系膜淋巴结进行RT-PCR和IIFT实验,结果表明经口免疫TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗,TsDNase Ⅱ在脾脏和肠系膜淋巴结中成功转录和表达。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答小鼠经ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7第2次和第3次免疫后,血清特异性IgG水平均有明显升高,且IgG1水平明显高于IgG2a水平（P<0.01）;肠道冲洗液中总IgA和特异性IgA也均有明显的升高。在初次免疫后10d、20d和30d,小鼠脾细胞和肠系膜淋巴结细胞经rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7刺激后,IFN-γ、IL-4和IL-10水平明显高于空质粒组和PBS组（P<0.01）,表明TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠后引起了Th1/Th2免疫应答,并诱导了粘膜免疫应答。5.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫对小鼠的免疫保护作用rTsDNase Ⅱ-1免疫组的成虫减虫率（40.36%）明显高于rTsDNase Ⅱ-7免疫组（34.86%）（t=2.480,P<0.05）;2个免疫组的肌幼虫减虫率（50.43%vs 42.33%）的差异无统计学意义（t=1.008,P>0.05）。TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗组的成虫减虫率（53.85%）亦明显高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗组（46.15%）（t=3.253,P<0.05）,2个免疫组的肌幼虫减虫率（59.26%vs53.41%）的差异也无统计学意义（t=1.685,P>0.05）。结果表明,rTsDNase Ⅱ蛋白和DNA疫苗免疫接种均对小鼠产生了部分免疫保护效果。TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫的小鼠,肠道成虫减虫率明显高于rTsDNase Ⅱ蛋白免疫组（t1=2.670,t2=2.812,P<0.05）;TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗口服免疫小鼠的肌幼虫减虫率与rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7蛋白免疫组相比差异无统计学意义（t1=1.641,t2=1.429,P>0.05）。结论1.成功构建了pQE-80L-TsDNase Ⅱ-1/7重组表达质粒,并表达了rTsDNase Ⅱ-1/7蛋白;TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛虫不同发育时期均有转录,在除肌幼虫外的各发育时期均有表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和胚胎。2.构建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗,2种DNA疫苗免疫小鼠均引起了以Th2型为主的Th1/Th2混合型免疫应答以及特异性的黏膜免疫应答。3.TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗口服或rTsDNase Ⅱ皮下注射免疫小鼠均可产生对旋毛虫感染的部分免疫保护作用,各免疫组间肌幼虫减虫率的差异无统计学意义,但TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗免疫小鼠后成虫的减虫率明显高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗组及rTsDNase Ⅱ蛋白免疫组。4.TsDNase Ⅱ为旋毛虫侵入相关蛋白并可作为旋毛虫疫苗的候选靶向分子。
徐静[4]（2017）在《旋毛虫不同发育期抗原基因克隆及其对猪的保护作用研究》文中研究指明旋毛虫是一种雌雄异体的线虫,可感染所有的哺乳动物（包括人类）、一些食肉鸟类和爬行动物。猪是旋毛虫感染的最重要的宿主之一,人感染旋毛虫的报道中很大比例是由于患者曾食用了感染有旋毛虫肌幼虫的生的或未完全熟的猪肉制品。因此,预防猪感染旋毛虫意义重大。本实验室前期实验中利用感染旋毛虫26天和60天的猪血清分别筛选旋毛虫不同发育时期的cDNA文库,得到了多条强反应原性的抗原基因,并初步研究了这些基因在小鼠旋毛虫感染模型中的免疫保护性。本实验根据上述研究结果选取了5条（Ts-zh68、Ts-clp、Ts-T668、Ts-serpin和Ts-p45）在小鼠模型中表现出抗旋毛虫保护性且疑似参与旋毛虫存活、寄生或免疫逃避的重要功能基因,另选取Ts-p43和Ts-p53这两条被报道在小鼠旋毛虫感染模型中保护性效果突出的基因,利用长白猪作为动物模型,开展这七条抗原基因对猪的免疫保护作用的研究。从而为旋毛虫疫苗的开发筛选高效的候选抗原和提供有价值的数据。本实验利用大肠杆菌原核表达系统分别诱导表达带有His标签的上述七种重组蛋白,利用镍柱进行亲和层析纯化,之后经大型垂直板SDS-PAGE电泳分离、切胶回收目的条带,用PBS溶出胶粒中的目的蛋白,最后对蛋白进行超滤管浓缩,经SDS-PAGE电泳鉴定得到高纯度的目的蛋白。七种目的蛋白纯化产物分别与旋毛虫感染60天猪血清进行免疫印迹实验,确认了它们的反应原性。佐剂的筛选对于重组蛋白疫苗的研发十分关键,弗氏佐剂是实验研究中应用最广泛的佐剂,但由于其本身的毒性以及对肉制品品质的影响,限制其在动物疫苗中的临床应用。一些新型疫苗佐剂在以旋毛虫感染小鼠为模型的疫苗研究中表现突出,但鉴于这些研究中所使用抗原的多样性,无法确定最佳佐剂。因此,本研究中以rTs-Serpin为代表性重组抗原,比较了三种不同类型的佐剂（Montanide ISA201,Montanide IMS 1313 N PR VG和弗氏完全及不完全佐剂）在以旋毛虫感染小鼠为模型的疫苗研究中的表现,具体包括评估佐剂促进体液免疫应答和细胞免疫应答的能力。佐剂筛选实验结果显示,与其他两种佐剂添加组相比,ims1313佐剂添加后的疫苗能够诱导最好的和最持久的igg抗体,诱导igm的最高峰值要比其他两种佐剂添加组提前两周出现,此外,ims1313佐剂添加组诱导小鼠血清中产生高水平的th1和th2型细胞因子。总之,结合有免疫刺激复合物的水分散性的液态纳米颗粒佐剂montanideims1313nprvg,展现出与弗氏佐剂相当的保护性和优于弗氏佐剂的免疫增强效果,是旋毛虫疫苗研究可选用的理想的佐剂。且该佐剂具有无需乳化、使用方法简便等优点。因此,montanideims1313nprvg被选用为后续研究中的佐剂。本研究中以长白猪为实验动物评估以上七种重组蛋白抗旋毛虫感染的保护性。实验共分为10个组,七个重组蛋白组、pbs组、pbs+ims1313佐剂组以及空白猪对照组,每组6头两月龄长白仔猪。共进行两次免疫接种,间隔4周,每头猪每次接种1mg重组蛋白,二免3周后各实验组（除空白猪对照组）均灌胃感染旋毛虫肌幼虫（t.spiralis）,每头感染5000条肌幼虫。攻虫感染六周后处死实验动物,每头猪分别采集15个部位的肌肉,每个部位肌肉采集50g,最低不少于5g,用于消化收取旋毛虫肌幼虫,计算各实验组的平均lpg（每克肌肉中的幼虫数）,以及比较各实验组相对于pbs对照组的肌幼虫减虫率。实验结果显示,以上七种重组蛋白在旋毛虫猪感染模型中保护性与在小鼠感染模型中存在很大差异。rts-t668、rts-clp、rts-zh68、rts-serpin、rts-p45、rts-p43和rts-p53在旋毛虫猪感染模型中表现出的肌幼虫减虫率分别为51.31%、31.03%、45.21%、4.79%、3.66%、38.92%和2.39%。实验中表现出保护力的四种蛋白中,肌幼虫减虫率超过40%的两种蛋白分别来源于旋毛虫成虫期和新生幼虫期,均为旋毛虫发育早期,这提示旋毛虫发育早期的关键蛋白质分子可作为较好的旋毛虫疫苗候选抗原。此外,研究中还采集所有实验动物膈肌,经甲醛固定、石蜡包埋、切片后进行he染色,观察和比较各实验组膈肌中旋毛虫包囊形态变化,结果发现各重组蛋白免疫组的膈肌旋毛虫包囊出现不同程度的形态变化,包囊周围炎细胞侵润的强度也存在差异,而pbs+ims1313组的旋毛虫包囊形态和周围炎细胞侵润情况与pbs组相比无明显差异。rts-t668和rts-clp组中观察到部分旋毛虫包囊形态变得相对其他各组更圆润,胶原层结构无明显变化;rts-zh68、rts-p45、rts-p53和rTs-p43中旋毛虫包囊的胶原囊不同程度的出现边缘不整齐或胶原层变薄;而rTs-serpin组旋毛虫包囊形态完整,无明显变化。此外,rTs-zh68、rTs-T668和rTs-p43组旋毛虫包囊周围炎细胞侵润相对剧烈,提示这些组中旋毛虫的胶原囊受损情况较严重。而rTs-clp、rTs-serpin、rTs-p45和rTs-p53组旋毛虫包囊周围炎细胞侵润情况较轻微。为了深入理解重组蛋白的免疫保护作用,评价这七种重组蛋白抗原诱导实验动物产生针对旋毛虫的保护性免疫应答的能力。本研究评估了各实验组重组蛋白免疫接种后体液免疫和细胞免疫应答的情况,具体包括血清中相应蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2和IgM抗体水平变化趋势,Th1（IFN-γ、IL-2）和Th2（IL-10、IL-4）型细胞因子水平变化,以及二免两周后T、B淋巴细胞变化情况,旋毛虫感染后第六天天然免疫细胞（巨噬细胞和中性粒细胞）的变化情况。结果显示重组蛋白rTs-T668、rTs-clp和rTs-zh68免疫后均能使实验动物在感染旋毛虫后始终或者某一段时期内处于Th1型免疫应答占优势的Th1/Th2混合免疫应答状态。各重组蛋白组二免后两周均能诱导Th1（IFN-γ、IL-2）和Th2（IL-10、IL-4）型细胞因子水平显着升高（p<0.05）。重组蛋白rTs-clp和rTs-p43免疫组与PBS对照组相比,巨噬细胞水平显着升高（p<0.05）,均能够消除旋毛虫感染后（Ad6）对巨噬细胞的抑制作用。与未感染旋毛虫的空白对照组相比,在感染旋毛虫后（Ad6）,PBS组、佐剂+PBS组、rTs-p45组和rTs-p53组中性粒细胞水平显着下降（p<0.05）,这说明旋毛虫对中性粒细胞存在显着的免疫抑制作用,而rTs-clp和rTs-p43两组在感染旋毛虫后（Ad6）诱导了中性粒细胞水平略升高,虽不显着,但提示这两组中旋毛虫对中性粒细胞的抑制作用被消除。综合保护性实验和保护性免疫应答能力评估结果,推测重组蛋白诱导产生的抗旋毛虫保护性效果可能与多个保护性免疫应答因素有关,诱导Th1型占优势的Th1/Th2混合免疫应答,同时促进维持正常水平的天然免疫应答能力,可能是预防猪感染旋毛虫的免疫应答的关键。
孙召金[5]（2015）在《旋毛虫排泄分泌物抗原在鼠和猪免疫学诊断中的应用研究》文中指出旋毛虫病是一种重要的食源性人畜共患寄生虫病，呈世界性分布，由组织栖线形旋毛虫引起。人类通过生食或半生食含旋毛虫肌幼虫的肉类（主要是猪肉）而感染旋毛虫病。此病目前在一些发展中国家（如泰国、阿根廷及中国等）仍常有暴发，究其原因除了缺少有效的预防控制措施外，关键在于至今没有良好的诊断方法。旋毛虫病的临床症状表现一般不具明显特征，且易与其它传染病相混淆，因此临床诊断较为困难。虽然肌肉活检发现幼虫或包囊即可确诊，但在轻度感染早期往往不易检出，即使是感染后期，因受组织局限性影响，活检阳性率也仅有50%左右。为此，寻找一种敏感性高、特异性强的检测诊断方法对于旋毛虫病的诊、防、治具有十分重要的意义，其关键是筛选到有效的免疫学检测诊断抗原。本研究拟以小鼠为实验动物模型，并应用于临床出栏猪的诊断研究，利用中国河南猪旋毛虫T1分离株（ISS534）分别感染小鼠和猪，采用旋毛虫不同发育时期的排泄分泌物抗原（ES）作为诊断抗原，应用ELISA方法检测感染小鼠和猪60天内不同天数的血清抗旋毛虫IgM和IgG抗体水平，并采用Excel软件绘制其抗体消长规律曲线并进行数据分析。结果表明：对于小鼠模型，三种抗原检测到抗旋毛虫抗体IgM均成“波峰波谷”形式的变化曲线，可以利用旋毛虫三个发育时期ES抗原的混合物来检测旋毛虫45天前的感染（即5-14天的感染检测IgM、15-45天检测IgG），感染45天之后可以利用单一肌幼虫时期ES抗原检测IgG，最有意义的发现是利用旋毛虫成虫期和新生幼虫期的ES抗原可以有效检测旋毛虫的早期感染；对于猪的应用研究，低剂量感染最好利用旋毛虫不同发育时期的3至5种分泌物抗原的混合物来检测旋毛虫2个月前的感染；中高剂量感染可利用单一感染后10小时肠道期肌幼虫ES抗原来检测感染60天内血清抗旋毛虫IgM抗体。本研究成功获悉旋毛虫感染宿主后不同发育时期刺激机体产生抗旋毛虫抗体的消长规律，确定了旋毛虫不同发育时期的免疫学诊断抗原，为进一步合理利用旋毛虫不同发育时期的排泄分泌物抗原建立起有效检测旋毛虫感染的诊断制剂的研制提供了重要的理论基础和科学依据。
王亚丽[6]（2012）在《CpG ODN作为重组乳酸乳球菌佐剂对小鼠免疫应答的影响》文中研究说明黏膜免疫作为机体的第一道屏障阻止经口腔、呼吸道、生殖道等途径感染的病原微生物入侵。乳酸乳球菌作为外源蛋白的传递系统,能将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面,继而同时诱导黏膜免疫和系统免疫。在本课题组制备的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vius, PRRSV） M蛋白的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS基础上,配以佐剂以开发一种能诱导机体产生黏膜免疫反应和系统免疫反应的黏膜疫苗。胞嘧啶-鸟嘌呤寡聚核苷酸（CpG ODNs）是一种高效的免疫佐剂,既能增强抗原诱导的粘膜免疫应答,又能增强抗原诱导的系统免疫,即体液免疫和细胞免疫应答。本课题旨研究CPG ODN作为佐剂对重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS的免疫原性的影响。试验选取120只健康雌性BALB/c小白鼠（6-8周龄,体重22～25g）随机分为4组,每组30只。组Ⅰ鼻腔免疫PBS为空白对照组；组Ⅱ鼻腔免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS菌株为重组菌组；组Ⅲ鼻腔免疫佐剂CpG ODN+重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS菌株为佐剂CpG ODN+重组菌组；组Ⅳ鼻腔免疫佐剂CpG ODN,为CpG ODN对照组。所有动物连续,即在第1d、2d、3d;11d、12d、13d;21d、22d、23d鼻腔免疫小鼠（免疫当天记为1d）,免疫剂量为每只小鼠50ul悬浮菌液／天（细菌含量为1×1011CFU/mL）,其中佐剂免疫剂量为每只小鼠为10ug/天。试验动物于第23d、30d、37d、44d、51d分别被处死,每次每组处死6只,取肠粘液、肺脏冲洗液、血液样品,以检测小鼠呼吸道和消化道黏膜s-IgA及血清特异性抗体IgG抗体,并在第37d时取脾脏以检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-y的含量。本研究所得结果如下：1、CpG ODN+重组菌组小鼠血清肠黏膜中的特异性s-IgA抗体含量显着高于重组菌组（P<0.01）,重组菌组也显着高于佐剂组和空白对照组（P<0.01）。2、CpG ODN+重组菌组和重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量均显着高于佐剂组和空白对照组（P<0.01）,CpG ODN+重组菌组和重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量尽管差异不显着,但CpG ODN+重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量高于重组菌组。3、CpG ODN+重组菌组和重组菌组小鼠血清中IgG抗体含量均显着高于空白对照组和佐剂组（P<0.01）。CpG ODN+重组菌组小鼠血清中特异性IgG抗体含量比重组菌组高,CpG ODN+重组菌组小鼠血清中IgG抗体含量在23d、30d、37d、44d、51d内-直呈上升趋势,重组菌组小鼠血清中特异性IgG抗体在第30d达到最高水平,以后保持稳定状态；4.CpG ODN+重组菌组小鼠脾脏细胞悬液中IL-2、IL-5和IFN-γ含量高于重组菌组,显着高于佐剂组和对照组（P<0.01）;CpG ODN+重组菌组IL-4含量高于重组菌组、佐剂组和空白对照组,每组间无显着差异（p>0.05）。结果表明,重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS通过鼻腔免疫后能够诱导小鼠产生良好的黏膜免疫反应和系统免疫反应。CpG ODN作为重组乳酸菌佐剂免疫小鼠后,提高了小鼠黏膜s-IgA和血清中IgG抗体含量,增强了Thl型细胞免疫反应,为研究安全高效的重组菌黏膜疫苗奠定了理论基础。
刘燕瑜[7]（2012）在《Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察》文中指出Quil A是从南美Quillaja皂莫利纳的树皮中提取的三萜皂苷，通过高效液相色谱分析包含至少5种不同的皂苷，是一种表面活性剂，易溶于水、稳定、表面活性较好，是具有辅助属性的皂苷。1936年，第一次作为佐剂由Thibaulu和Richou部署在兽用疫苗，随之被发展起来。PICKCa是一种改进的佐剂，是复杂的基于聚肌胞核苷酸制定的，聚肌胞本身对人体有毒性作用，但同时也具有强烈的佐剂作用，卡那霉素和氯化钙能迅速水解于其中。作为一个带正电的分子，卡那霉素能够中和聚肌胞的负电荷，使聚肌胞更稳定，抗水解。添加氯化钙则有利于聚肌胞进入细胞。总之，PICKCa是一种稳定安全的佐剂。探讨QuilA、PICKCa及二者联合使用对实验动物免疫应答的调节作用，分别给小鼠、猪注射QuilA、PICKCa及二者混合物，于注射后不同时间采血，检测细胞因子水平；注射后第7d检测猪T淋巴细胞的体外增殖反应。实验结果表明小鼠和猪在注射药物之后均未出现任何不良反应；实验组动物的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均显着高于对照组；猪T淋巴细胞体外增殖能力也显着高于对照组。说明QuilA、PICKCa对小鼠和猪具有良好的免疫调节作用，是具有良好应用前景的免疫佐剂。为研究Quil A对O型口蹄疫DNA疫苗的免疫增强作用，在FMD核酸疫苗pVIRIL18P1中加入Quil A，经肌肉注射免疫猪，检测猪VP1结构蛋白抗体及细胞因子水平，观察T淋巴细胞增殖情况，并与无佐剂组进行比较。结果表明，首免用猪口蹄疫核酸疫苗pVIRIL18P1及二免用重组鸡痘疫苗vUTAL3CP1中加入Quil A，两次免疫后抗体水平、细胞因子水平及T淋巴细胞增殖率都显着升高，与空白对照组比较差异显着（P<0.05）甚至极显着（P<0.01），与未加佐剂组及商品化疫苗比较有显着差异。表明Quil A对O型口蹄疫DNA疫苗具有较好的免疫增强作用。为研究PICKCa对猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的免疫增强效果，在二联核酸疫苗pIRES-ORF2-ORF5m-ORF6a中加入PICKCa，经肌肉注射免疫猪，检测猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病病毒抗体及细胞因子水平，观察T淋巴细胞增殖情况，并与无佐剂组进行比较。猪体免疫试验结果证明，构建的重组核酸疫苗加以PICKCa均能刺激实验猪产生PRRSV、PCV2抗体。细胞免疫检测结果表明PRRSV、PCV2特异性T淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-2分泌水平显着提高、CTL杀伤活性增强，表明其能够介导较好的Th1类免疫反应。重组核酸疫苗免疫猪的组织器官无病理损伤，可以防止猪体病毒血症的出现。攻毒保护实验证明，添加PICKCa佐剂的重组核酸疫苗对实验猪起到明显的免疫保护提升作用。
赵光伟[8]（2012）在《四株不同动物来源弓形虫感染小鼠和鸡免疫病理变化的比较研究》文中研究表明弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病,在世界上分布广泛,大约有25%-50%的人受到感染。弓形虫的宿主非常广泛,猫科动物是其唯一的终末宿主,绝大多数温血动物均可作为该病原的中间宿主,然而不同宿主对弓形虫的易感性及转归均有不同。小鼠对其极为敏感,可引起急性的致死性感染因而常常作为弓形虫急性感染的动物模型；而鸡由于对弓形虫的感染不表现任何临床症状,被认为是不敏感的中间宿主。为了探寻这两种动物感染弓形虫后免疫病理学变化的差异,同时针对同一宿主对不同动物来源的弓形虫虫株感染后的免疫病理变化进行比较研究,特进行了如下工作：1.猫源弓形虫虫株的分离及其与鸡源、猪源和人源虫株基因型的鉴定对江苏南京地区11只家猫进行弓形虫抗体IgG的检测,筛选抗体阳性猫进行虫株的分离。利用盐酸-胃蛋白酶消化法处理阳性猫的心、脑、舌等组织,制成组织悬液腹腔接种小鼠,通过连续传代,分离到2株弓形虫虫株,分别命名为CAT2和CAT3。进而利用PCR-RFLP方法,对分离到的猫源虫株以及实验室保存的鸡源（JS）、猪源（CN）和人源（RH）共5株弓形虫虫株进行了基因型的鉴定,通过对7个等位基因5’-SAG2,3’-SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, cB21-4和L358的扩增和酶切,证明此5株弓形虫虫株均为基因Ⅰ型。2.四种不同来源弓形虫虫株对小鼠和鸡致病力的比较小鼠对弓形虫非常敏感,而鸡通常不敏感。本研究对四种不同来源的5个虫株RH, CN, JS, CAT2和CAT3对鸡和小鼠的致病力分别进行比较,同时建立弓形虫感染雏鸡的动物模型。210只10日龄雏鸡分为21个组,每组10只,5个虫株RH,CN,JS,CAT2和CAT3按照5×108,1×108,1×107,和1×106不同剂量腹腔感染10日龄雏鸡,同时设阴性对照组,仅注射生理盐水；感染后每日观察实验鸡的临床症状,逐只测量直肠温度,记录每组鸡的死亡情况；利用PCR方法对53天未死亡的鸡进行检测,对急性死亡和53天未死亡的鸡进行病理组织切片,观察病理变化。对小鼠致病力的对比试验选用腹腔感染和灌胃感染两种途径,分别选用260只ICR小鼠,随机分为26个组,每组10只,按照不同的虫株选择1×105,1×104,1×103,1×102和1×101剂量进行感染,记录每只小鼠的存活时间；根据实验动物的存活时间对5个虫株的致病力进行比较。结果发现RH,CN, CAT2和CAT3四个虫株对小鼠和鸡的致病力无显着差异,而JS株对小鼠的致病力较弱,但对鸡的致病力较强,这说明虫株的来源对弓形虫的致病性具有重要的影响。同时发现1×107剂量的速殖子腹腔感染10日龄雏鸡,既能产生适度的临床症状,又能够使实验动物避免死亡,可作为弓形虫体内感染雏鸡的动物模型。综合考虑小鼠的感染率、存活时间以及感染过程中的偶然因素,发现1×102腹腔感染和1×104灌胃感染是小鼠模型的最佳感染剂量。3.四种不同来源弓形虫虫株腹腔感染小鼠免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株腹腔感染小鼠,对小鼠感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。200只小鼠（18。22g）随机分成5个组,每组40只,分别命名为JS, CAT, CN, RH和阴性对照组,四个虫株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×102的剂量腹腔感染小鼠,阴性对照组仅注射PBS。感染后分别在第0天,3天,6天和8天采血和脾脏用于分离血清和脾脏淋巴细胞,每组10只。弓形虫循环抗原和特异性抗体（IgA,IgG, IgM和IgG的亚型IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3）利用ELISA方法进行检测；脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子的变化利用流式技术进行检测；细胞因子IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测；血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测。感染后第6天能够检测到IgM并持续至第8天；感染后第8天能检测到IgA,而IgG及其亚型均未检测到；CD4+, CD8+T和NK细胞分别在第6天、第3天和第3天显着上升,均在第8天时显着下降,在此时间点仅CN组CD4+T细胞显着高于阴性对照组,4个感染组CD8+T细胞虽下降但仍显着高于阴性对照组,RH、CN和CAT组NK细胞显着高于阴性对照组；MHC Ⅰ分子第6天显着上升但在第8天时下降,仅CAT组显着高于阴性对照组；MHC Ⅱ分子从第3天显着下降并持续至第8天仍显着低于阴性对照组；IFN-γ和IL-12在第6天显着上升均在第8天时下降,4个感染组IFN-γ在第8天仍显着高于阴性对照组,但JS组IL-12与阴性对照组无差异；IL-10和IL-4在第3天显着上升均在第6天时显着下降,4个感染组IL-10仍显着高于阴性对照组,但IL-4与阴性对照组无差异；IL-17在第6天显着上升并持续至第8天仍高于阴性对照组；感染后第3天可检测到高浓度的NO、血清铁以及高活力的iNOS,均在第6天达到最高峰而后下降,第8天时,仅CAT组NO显着高于阴性对照组,4个感染组的iNOS与阴性对照组之间差异不显着,但血清铁仍显着高于阴性对照组。这些结果反应了小鼠抗弓形虫腹腔感染而引起的免疫病理学变化,而不同来源虫株之间存在的差异可能与虫株的生物学特性有关,说明虫株的来源对弓形虫免疫病理变化也具有重要的影响。4.四种不同来源弓形虫虫株灌胃感染小鼠免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株灌胃感染小鼠,对小鼠感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。250只小鼠（18-22g）随机分成5个组,每组50只,分别命名为JS、CAT、CN、RH和阴性对照组,四个虫株JS、XAT、CN和RH的速殖子按1×104的剂量灌胃感染小鼠,阴性对照组仅灌服等量PBS。感染后分别在第0天,3天,6天,8天和10天采血和脾脏用于分离血清和脾脏淋巴细胞,每组10只。弓形虫循环抗原和特异性抗体（IgA、IgG、IgM和IgG的亚型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）利用ELISA方法进行检测；脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及MHCI和MHCⅡ类分子的变化利用流式技术进行检测；细胞因子IFN-γ， IL-12, IL-4, IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测；血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测。感染后第6天TCA阳性并持续至第10天；第10天时IgG显着上升并以IgG2a和IgG2b为主；IgA和IgM第6天时显着上升并持续至第10天；CD4+和CD8+T细胞第6天时开始显着上升,第8天达到高峰,各组CD4+T细胞在第10天下降,与阴性对照组无差异,而CD8+T细胞虽下降,但CN、CAT和JS仍显着高于阴性对照组；弓形虫感染后第3天,JS和CAT组NK细胞水平显着上升,第8天时,四个感染组均上升并持续至第10天；CAT组MHCI水平第3天显着上升,其余三个感染组无显着变化,第8天,四个感染组均显着上升,第10天时开始下降,但除JS组外,其余三个感染组仍显着高于阴性对照组；MHC Ⅱ分子在第3天显着下降并持续至第10天；感染后第6天,JS和CAT感染组组IFN-γ显着上升,第8天时,RH、CN和JS三个组显着上升,但CAT组下降,第10天时4个感染组均下降与阴性对照组无差异；RH和CAT组IL-12在感染后第3天显着上升,第6天时四个感染组均显着上升并持续至第8天,第10天时开始下降仅CAT组显着高于阴性对照组；RH和CAT组IL-4仅在第6天时显着上升；CN、JS和CAT组IL-17在第8天时显着上升而后开始下降,第10天时仅JS组显着高于阴性对照组；NO、血清铁和iNOS勺活力均在第3天开始显着上升并持续至第8天,第10天时下降与阴性对照组之间无差异。这些结果反应了小鼠弓形虫灌胃感染所引起的免疫病理变化。与腹腔感染小鼠相比,较晚出现的TCA,较早出现并且较高滴度的IgA以及产生的IgG说明腹腔感染和灌胃感染两种不同的感染途径影响免疫病理变化的产生。5.四种不同来源弓形虫虫株腹腔感染鸡免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株腹腔感染雏鸡,对鸡感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。300只10日龄雏鸡随机分成5个组,每组60只,分别命名为JS,CAT, CN, RH和阴性对照组,JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×107的剂量腹腔感染雏鸡,阴性对照组仅注射PBS。感染后分别在第0天,4天,11天,25天,39天和53天采血和脾脏,分离血清和脾脏淋巴细胞,每组取10只。弓形虫循环抗原和特异性的抗体（IgA,IgG和IgM）利用ELISA方法进行检测；脾脏淋巴细胞中CD4+,CD8+以及MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子的变化利用流式技术进行检测；细胞因子IFN-γ,IL-12,IL-4,IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测；血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测；血细胞包括中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞利用血细胞分析仪直接测定。感染组高水平的IgM,IgG和IgA分别在感染后第4天,第11天和第11天出现,并持续至39、53和39天；不同感染组CD4+T细胞分别在第4天和第11天显着上升,至53天时与阴性对照组无显着差异；CD8+T细胞和MHC Ⅰ类分子在第4天显着上升,至53天时,CD8+T细胞仍显着高于阴性对照组,而MHC Ⅰ类分子在39天时与阴性对照组差异不显着；MHC Ⅱ类分子在第4天显着上升又在25天时显着下降,至53天时与阴性对照组差异不显着；IFN-γ, IL-12, IL-10和IL-17分别在感染后第4天显着上升,25天时,感染组IFN-γ和IL-10与阴性对照组差异不显着,而感染组IL-12至53天时仍显着高于阴性对照组,IL-17则无显着差异；4个感染组IL-4自始至终均无显着变化；感染组NO,血清铁以及iNOS的活力在第4天显着上升,又在第39天后与阴性对照组无显着差异。这些都反应了鸡感染弓形虫后的免疫病理学变化。与另外三个感染组相比,JS组具有更高水平的CD4+, CD8+T细胞,IFN-γ, IL-12, IL-10,NO和更高活力的iNOS,这说明其差异可能与虫株的来源有关。与腹腔感染小鼠的结果相比,IgG抗体的产生,感染早期显着上升的MHC Ⅱ,较早产生的IFN-γ, IL-12和IL-17以及无显着变化的IL-4有可能是造成鸡和小鼠对弓形虫易感性差异的原因,其确切机制仍需进一步研究。
王金凤[9]（2011）在《河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪发热、流产,断奶前、后的仔猪死亡率升高,不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病,它能引起免疫抑制、继发感染及其他疾病的免疫失败等。目前PRRS作为世界性流行病广泛传播于许多国家,已经成为全球兽医界关注的热点问题。我国1996年首次报道本病,关于该病发生、流行以及研究的报告日趋增多。PRRSV基因组易于变异的特性可导致病毒某些生物学特性发生改变,从而增加了该病的控制难度。因此,掌握PRRSV的流行变异趋势对于该病的防治将是十分有意义的。在PRRSV整个基因组中,非结构蛋白Nsp2和结构蛋白ORF5的变异最大,是进行PRRSV分子流行病学研究和病毒遗传变异分析的靶基因。因此,研究PRRSV的Nsp2、ORF5基因的变异具有十分重要的意义。本研究采集河北省2007～2011年间不同地区猪场的临床样本,选取肺脏、脾脏、淋巴结等组织和血清为材料,利用RT-PCR对PRRSV阳性病料中的Nsp2、ORF5基因进行扩增、克隆和序列测定,籍此分析我省近年来PRRSV的变异情况。通过RT-PCR方法,从样本中共获得16个Nsp2和ORF5基因。序列比较结果显示,所获得的16个Nsp2基因之间的核苷酸同源性为94.4%～99.8%,推导氨基酸同源性为88.3%～99.4%；与VR2332株的核苷酸同源性为73%～74.8%,推导氨基酸同源性为62.3%～68.5%；与2005年以前国内PRRSV流行毒株BJ-4、CH-1a、HB-1（sh）/2002、HB-2（sh）/2002相比,所获Nsp2基因与HB-1株的推导氨基酸同源性最高,为87.7%～93.2%。同时,获得的16个ORF5基因序列的核苷酸同源性为97%～99.8%,推导的氨基酸同源性在95%～99.5%之间；与VR2332和LV株的核苷酸同源性分别是87.1%～88.6%和55.2%～57.7%,推导编码氨基酸的同源性为87.9%～89.1%和62.5%～63.8%；结果表明,所获河北省PRRSV基因序列均属于北美洲型PRRSV,其Nsp2和ORF5基因变异很大。依据所获基因序列及GenBank中国内外代表性毒株相应基因序列推导的氨基酸序列分别绘制PRRSV的遗传进化树。结合Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析显示,全国流行的PRRSV毒株分属于3个亚群,其代表分别为BJ-4株、CH-1a株和HB-1株,我省流行的PRRSV毒株完全属于同一个亚群Ⅲ,与2002年分离到的HB-1株亲缘关系最近。
黄菁[10]（2011）在《猪PRV感染PK15差异表达miRNAs的功能探索及3个免疫相关基因的分子特征研究》文中进行了进一步梳理各种病原引起的传染性疾病给现代养猪生产造成了巨大损失,本研究应用在猪生产中传染性强、死亡率高、危害大的伪狂犬病毒为模型,利用microRNA芯片技术,筛选与伪狂犬病毒感染相关的miRNAs,并探索其对病毒复制的影响及对宿主基因的调控作用,期望鉴定新的抗病候选miRNA和基因,为抗病育种工作提供有力的素材。获得了如下的研究结果：1.用伪狂犬病毒（PRV）感染PK15细胞并进行microRNA芯片杂交,筛选得到持续上调表达的miR-21,并通过QPCR得到验证；利用生物信息学预测及stem-loop RT-PCR方法克隆了miR-21。通过绝对定量PCR和免疫荧光检测发现过表达猪miR-21的PK15细胞中PRV病毒在核酸水平和蛋白水平均显着高于对照组。2.以小鼠肝癌细胞Hepal-6为模型,通过双荧光素酶报告基因实验结合ELISA方法验证了IP10是miR-21的靶基因.PolyI:C刺激小鼠巨噬细胞后,IP10基因mRNA先上调表达,4h后迅速下调,而miR-21表达水平持续上调,推测miR-21可能对IP10基因的mRNA水平存在负调控作用。对猪IP10基因进行了克隆,检测了其在成年通城猪各组织中的表达情况,结果表明猪IP10基因在脾脏中高表达。3.利用PCR-RFLP方法鉴定了猪IP10基因3’UTR存在C/T突变的SNP位点,与免疫性状关联分析结果表明该SNP位点与20日龄淋巴细胞百分数（LY%）,80日龄红细胞压积（HCT）、平均红细胞容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）及80日龄血红蛋白含量（HGB）存在显着相关。4.通过比较基因组学和RT-PCR的方法克隆了猪3个免疫相关基因BCL10、PBD-108和STAT6的完整编码区（CDS）；分析了其基因结构,BCL10有3个外显子2个内含子,PBD-108有1个外显子,STAT6含22个外显子和21个内含子。5.利用猪仓鼠辐射杂种板将猪BCL10基因定位于4号染色体,与微卫星标记S0161紧密连锁；猪STAT6基因定位于5号染色体,与微卫星标记DK紧密连锁。利用分别构建的BCL10,STAT6-pEGFP-N1融合表达载体转染细胞,发现猪BCL10在PK15细胞质中呈弥散广泛表达；STAT6在PIEC细胞整个细胞中呈广泛表达。6.用RT-PCR方法检测猪BCL10和STAT6在成年大白猪脑、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、胃、小肠、脂肪和淋巴结各组织中的表达情况,结果表明BCL10,STAT6基因在检测的组织中广泛表达,BCL10在脾脏中表达量最高,其次为淋巴结、肾脏、肺脏和肌肉；STAT6基因在小肠中表达量最高,其次为肝脏、脾脏、肺脏和肾脏。7.通过PCR-RFLP方法检测到BCL10、PBD-108和STAT6的3’UTR均存在SNP。在国内外不同猪品种中进行基因频率分析,发现BCL10的T/C突变、PBD-108的A/T突变和STAT6的A/G突变,其等位基因频率在国内外猪种中存在显着差异。性状关联分析结果表明,BCL10基因SNP位点与0目龄平均红细胞体积、中间白细胞百分数、中间白细胞绝对值及17日龄红细胞总数存在显着相关（p<0.05）,与32日龄红细胞数和血红蛋白含量存在极显着相关（p<0.01）；PBD-108基因SNP位点与17日龄平均血红蛋白浓度极显着相关（p<0.01）。
二、猪免疫旋毛虫抗原和感染后的抗体应答（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪免疫旋毛虫抗原和感染后的抗体应答（论文提纲范文）
（1）猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪圆环病毒病的概述 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 猪圆环病毒病的流行病学 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 症状 |
| 1.1.5 猪圆环病毒病的诊断方法 |
| 1.2 猪圆环病毒cap蛋白研究进展 |
| 1.2.1 圆环cap蛋白的简介 |
| 1.2.2 圆环cap蛋白的检测方法、疫苗研究 |
| 1.3 荧光微球为标记物的免疫层析试纸条 |
| 1.3.1 免疫层析试纸条 |
| 1.3.2 荧光微球 |
| 1.3.3 荧光微球在免疫层析技术中的应用 |
| 1.3.4 胶体金免疫层析方法比较 |
| 1.3.5 检测原理及结果判断 |
| 1.4 研究的意义及目的 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 重组菌种 |
| 2.1.2 荧光微球免疫层析材料等试验材料 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 试剂制备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪圆环Cap基因克隆及原核表达方法 |
| 2.2.2 猪圆环病毒2 型抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 2.2.3 猪圆环病毒2 型抗原荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Cap基因克隆及重组表达质粒构建 |
| 3.2 Cap重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3.3 蛋白表达条件的优化 |
| 3.4 PCV2 抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 3.5 PCV2 抗原荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪圆环cap蛋白表达 |
| 4.2 PCV2 抗体荧光微球免疫层析快速检测试纸条的建立与应用 |
| 4.3 PCV2 抗原荧光微球免疫层析快速检测试纸条的建立与应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 第一部分 旋毛虫成虫排泄分泌抗原的血清学诊断 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂的配方 |
| 1.4 寄生虫和实验动物 |
| 1.5 血清样本的收集和制备 |
| 1.6 旋毛虫肌幼虫,肠道感染性幼虫和成虫的收集 |
| 1.7 ELISA法检测旋毛虫感染血清 |
| 1.8 SDS-PAGE蛋白分析和Western-blot鉴定 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 检测成虫ES和可溶最佳包被条件及Cut-off值 |
| 2.2 成虫ES和成虫可溶检测感染不同旋毛虫虫种小鼠感染血清 |
| 2.3 成虫ES和成虫可溶检测不同寄生虫感染小鼠血清抗体结果 |
| 2.4 成虫ES和成虫可溶检测旋毛虫感染不同剂量不同天数小鼠血清抗体结果 |
| 2.5 检测旋毛虫和其他寄生虫染的病人血清中抗旋毛虫抗体水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 旋毛虫丝氨酸蛋白酶(TsSP)的克隆表达及功能鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配方 |
| 1.4 旋毛虫种、实验动物、菌体 |
| 1.5 在线预测TsSP蛋白的理化性质 |
| 1.6 TsSP序列比对及进化树的构建 |
| 1.7 设计TsSP的 PCR扩增引物 |
| 1.8 收集旋毛虫不同虫期的虫体 |
| 1.9 旋毛虫不同虫期总RNA的提取 |
| 1.10 RNA反转录制备各个虫期cDNA |
| 1.11 内参基因(GAPDH)检测cDNA质量 |
| 1.12 TsSP目的基因扩增 |
| 1.13 TsSP基因与克隆载体pGEM-T |
| 1.14 制备BL21感受态 |
| 1.15 重组质粒转化入感受态中 |
| 1.16 重组菌落PCR鉴定 |
| 1.17 质粒提取步骤 |
| 1.18 重组质粒pGEM-TsSP的双酶切和测序鉴定 |
| 1.19 目的基因TsSP与表达载体的连接 |
| 1.20 菌种冻存 |
| 1.21 重组菌的诱导表达及可溶性分析 |
| 1.22 rTsSP蛋白的亲和纯化 |
| 1.23 rTsSP免疫血清的制备及效价的测定 |
| 1.24 Western-blot检测rTsSP的抗原性和免疫原性 |
| 1.25 旋毛虫TsSP基因在各个虫期核酸水平的表达 |
| 1.29 旋毛虫TsSP蛋白在各个虫期的表达及定量 |
| 1.30 检测TsSP在旋毛虫各个虫体的表达和定位 |
| 1.31 ADCC-抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[9-11] |
| 1.32 体外侵入实验 |
| 1.33 rTsSP与肠上皮细胞的特异性结合作用 |
| 1.34 rTsSP免疫保护 |
| 1.35 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsSP生物信息学分析 |
| 2.2 旋毛虫TsSP基因引物设计 |
| 2.3 扩增TsSP基因 |
| 2.4 重组质粒PGEM-T-TSsp的测序及序列分析 |
| 2.5 重组表达载体的PCR鉴定及双酶切鉴定 |
| 2.6 重组质粒pQE80L-TsSP诱导表达及可溶性分析 |
| 2.7 rTsSP的亲和纯化 |
| 2.8 ELISA检测rTsSP免疫血清的效价 |
| 2.9 Western-blot分析rTsSP重组蛋白的抗原性 |
| 2.10 旋毛虫TsSP基因转录水平的表达 |
| 2.11 TsSP蛋白在旋毛虫不同发育虫期蛋白表达水平的鉴定 |
| 2.12 IFA检测TsSP蛋白在旋毛虫不同虫期虫体表面的表达及定位 |
| 2.13 IFA检测TsSP在旋毛虫不同发育期虫体内部的表达 |
| 2.14 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC) |
| 2.15 体外侵入 |
| 2.16 rTsSP与 IEC的结合作用 |
| 2.17 rTsSP诱导免疫类型的鉴定 |
| 2.18 rTsSP的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 rTsSP在旋毛虫病早期诊断及免疫保护中的应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 蛋白的制备 |
| 1.3 不同感染血清的制备 |
| 1.4 Western-blot检测 |
| 1.5 ELISA检测 |
| 1.6 滴鼻免疫实验方案 |
| 1.7 ELISA检测抗体反应 |
| 1.8 肠道冲洗液中sIgA的检 |
| 1.9 免疫荧光分析肠道分泌IgA细胞的数量 |
| 1.10 肠道杯状细胞及粘蛋白的鉴定 |
| 1.11 细胞因子检测 |
| 1.12 旋毛虫攻击感染小鼠及免疫保护评估 |
| 1.13 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western-blot检测rTsSP对早期旋毛虫感染血清的识别 |
| 2.2 Western-blot分析对rTsSP的敏感性 |
| 2.3 rTsSP-ELISA检测其他旋毛虫种属感染小鼠血清结果 |
| 2.4 rTsSP-ELISA检测其他寄生虫感染小鼠血清结果 |
| 2.5 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染不同剂量不同时间的小鼠血清 |
| 2.6 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染猪血清 |
| 2.7 rTsSP检测旋毛虫和其他寄生虫感染的病人血清 |
| 2.8 rTsSP滴鼻免疫所引起的体液免疫应答 |
| 2.9 肠道粘膜sIgA应答 |
| 2.10 IFA检测旋毛虫天然TsSP在不同期的表达 |
| 2.11 肠道杯状细胞及粘蛋白的检测 |
| 2.12 小肠分泌IgA细胞的荧光鉴定 |
| 2.13 rTsSP滴鼻免疫后细胞因子的变化 |
| 2.14 rTsSP滴鼻免疫后所产生的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 寄生虫丝氨酸蛋白酶功能与旋毛虫病免疫保护的研究 |
| 1 丝氨酸蛋白酶和酶的作用机制 |
| 2 寄生线虫的丝氨酸蛋白酶 |
| 2.1 鞭虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.2 简单异尖线虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.3 猪蛔虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.4 丝虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.5 犬钩虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.6 小卷蛾斯氏线虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.7 绦虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.8 吸虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.9 旋毛虫丝氨酸蛋白酶 |
| 3 旋毛虫病的免疫生物学 |
| 4 抗旋毛虫感染疫苗的发展 |
| 4.1 虫体提取物和分泌物诱导的保护免疫 |
| 4.2 用于诱导保护预防旋毛虫的免疫途径和佐剂 |
| 4.3 重组蛋白和亚型表位所诱导的抗旋毛虫的保护应答 |
| 4.4 抗旋毛虫的DNA疫苗 |
| 4.5 旋毛虫疫苗的远景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表论文 |
| 1 个人基本信息 |
| 2 教育背景 |
| 3 发表论文情况 |
| 4 获奖荣誉 |
| 5 参加国际会议 |
| 致谢 |
（3）旋毛虫成虫特异性DNaseⅡ-1和DNaseⅡ-7的表达鉴定及其免疫保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 旋毛虫成虫特异性DNase Ⅱ-1和DNase Ⅱ-7原核表达与鉴定 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验动物、旋毛虫虫种 |
| 1.5 主要方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 TsDNase Ⅱ-1/7特异性引物设计 |
| 2.3 TsDNase Ⅱ-1/7基因的PCR扩增 |
| 2.4 TsDNase Ⅱ-1/7重组质粒的构建 |
| 2.5 rTsDNase Ⅱ-1/7蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.6 ELISA检测rTsDNase Ⅱ-1/7特异性免疫血清的抗体效价及抗体反应 |
| 2.7 旋毛虫TsDNase Ⅱ-1/7的westernblot分析 |
| 2.8 旋毛虫不同虫期TsDNase Ⅱ-1/7的转录水平鉴定 |
| 2.9 TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛虫不同发育时期虫体表面的表达与定位 |
| 2.10 TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛虫不同发育时期虫体内部的表达 |
| 2.11 rTsDNase Ⅱ-1/7免疫血清对肠道感染性幼虫体外侵入IEC的抑制作用 |
| 2.12 rTsDNase Ⅱ-1/7免疫血清介导的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC) |
| 2.13 小鼠经rTsDNase Ⅱ-1/7免疫后的旋毛虫肌幼虫攻击感染实验 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 旋毛虫TsDNase ⅡDNA疫苗的构建及其诱导的保护性免疫 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要试剂及试剂配制 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验动物、旋毛虫虫种、菌株和细胞系 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 真核表达质粒pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7的双酶切鉴定 |
| 2.2 重组表达载体pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7电转减毒沙门氏菌鉴定 |
| 2.3 重组沙门氏菌ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7稳定性鉴定 |
| 2.4 pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7重组质粒的体外表达验证 |
| 2.5 小鼠体内TsDNase Ⅱ-1/7基因转录检测 |
| 2.6 小鼠体内rTsDNase Ⅱ-1/7蛋白表达检测 |
| 2.7 TsDNase Ⅱ-1/7DNA疫苗免疫血清的抗体效价及免疫后血清抗体变化 |
| 2.8 间接ELISA法检测肠道冲洗液中的IgA |
| 2.9 DNA疫苗免疫小鼠的细胞因子测定 |
| 2.10 TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛虫不同发育时间虫体的表达与定位 |
| 2.11 小鼠TsDNase Ⅱ-1/7DNA疫苗免疫后旋毛虫肌幼虫攻击感染实验 |
| 2.12 旋毛虫雌虫72h新生幼虫产量测定 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脱氧核糖核酸酶Ⅱ研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）旋毛虫不同发育期抗原基因克隆及其对猪的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫对宿主免疫应答的调节及应用研究进展 |
| 1 蠕虫感染及免疫调节作用 |
| 2 旋毛虫的寄生及免疫调节特点 |
| 3 半成熟DCs及体内免疫平衡 |
| 4 调节性T细胞及相关免疫调节网络 |
| 5 旋毛虫对自身免疫性疾病的调节 |
| 6 旋毛虫对过敏性疾病的抑制作用 |
| 7 旋毛虫对肿瘤抑制作用 |
| 8 展望 |
| 第二章 旋毛虫病流行性及疫苗研究进展 |
| 1 旋毛虫的感染与分布 |
| 2 旋毛虫疫苗的研究成果及现状 |
| 3 旋毛虫疫苗的瓶颈 |
| 4 旋毛虫疫苗研究新思路 |
| 5 研究前景及展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 疫苗佐剂的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 旋毛虫重组蛋白抗原的制备及对猪的免疫保护性分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 重组蛋白抗原诱导猪的保护性免疫应答水平分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）旋毛虫排泄分泌物抗原在鼠和猪免疫学诊断中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 旋毛虫病 |
| 1.1 旋毛虫 |
| 1.2 旋毛虫病 |
| 1.3 中国旋毛虫病的爆发 |
| 1.4 在中国人体旋毛虫病的的血清流行病学 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 旋毛虫病的检测方法 |
| 2.1 旋毛虫诊断的直接方法 |
| 2.2 旋毛虫病的免疫学诊断方法 |
| 2.3 DNA 检测技术 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 旋毛虫不同发育时期 ES 抗原检测 T1 感染小鼠血清中抗旋毛虫抗体的变化情况 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 旋毛虫不同发育时期 ES 抗原在猪感染旋毛虫的免疫学诊断方法中的应用研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（6）CpG ODN作为重组乳酸乳球菌佐剂对小鼠免疫应答的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 黏膜免疫佐剂及其种类 |
| 1.1.1 Toll样受体 |
| 1.1.2 ADP-核糖基化肠毒素 |
| 1.1.3 黏膜免疫载体 |
| 1.1.4 细胞因子 |
| 1.2 CPG ODN |
| 1.2.1 CpG ODN结构及分类 |
| 1.2.2 CpG ODN佐剂作用机理 |
| 1.2.3 CpG ODN的应用 |
| 1.3 黏膜免疫 |
| 1.3.1 黏膜及黏膜免疫系统 |
| 1.3.2 黏膜免疫疫苗 |
| 1.4 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 1.4.1 猪繁殖与呼吸综合征免疫现状 |
| 2 试验的目的和意义 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 表达菌株 |
| 3.1.2 主要试剂(盒) |
| 3.1.3 试验仪器殴备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 PNZ8149/NZ3900-M/PRRS表达载体的诱导表达 |
| 3.2.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.2.1 待测样品的处理 |
| 3.2.2.2 SDS聚丙稀酰胺凝胶的配制及电泳 |
| 3.2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶染色和脱色 |
| 3.2.3 诱导表达后菌液细菌计数 |
| 3.2.4 免疫用试验材料的制备 |
| 3.2.5 试验动物分组及处理 |
| 3.2.6 抗体采集及检测 |
| 3.2.7 细胞因子(Cytokines) |
| 4. 结果与分析 |
| 4.1 重组菌的鉴定 |
| 4.2 肠黏膜S-lgA含量 |
| 4.3 呼吸道黏膜S-lgA含量 |
| 4.4 血清IgG抗体含量 |
| 4.5 小鼠脾细胞悬液细胞因子含量 |
| 4.5.1 细胞免疫评价因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)含量 |
| 4.5.2 黏膜淋巴因子(IL-5)含量 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 佐剂的研究进展 |
| 1.1 佐剂的简介 |
| 1.2 最新进展和未来的科学挑战 |
| 1.3 展望 |
| 2 DNA 疫苗的研究进展 |
| 2.1 DNA 疫苗简介 |
| 2.2 DNA 疫苗佐剂 |
| 2.3 前景与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 QuilA 与 PICKCa 对试验动物的免疫调节作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Quil A 对 O 型口蹄疫 DNA 疫苗的免疫增强作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 PICKCa 对 PCV2-PRRSV DNA 疫苗免疫增强作用的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）四株不同动物来源弓形虫感染小鼠和鸡免疫病理变化的比较研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一编 文献综述 |
| 第一章 弓形虫与弓形虫病 |
| 1 病原学 |
| 1.1 弓形虫在生物界的分类地位 |
| 1.2 弓形虫生活史中出现的不同形态 |
| 1.3 弓形虫的生活史 |
| 2 弓形虫流行病学概况 |
| 2.1 传染源 |
| 2.2 传播途径 |
| 2.3 弓形虫病在家禽上的流行概况 |
| 2.4 弓形虫病流行的新特点 |
| 3 弓形虫病诊断技术 |
| 3.1 病原学诊断方法 |
| 3.2 免疫学诊断方法 |
| 3.3 分子生物学诊断方法 |
| 4 弓形虫病的治疗 |
| 4.1 抗生素类 |
| 4.2 生物制剂 |
| 4.3 中药 |
| 4.4 其他药物 |
| 4.5 药物靶点 |
| 参考文献 |
| 第二章 宿主抗弓形虫感染的先天性免疫 |
| 1 宿主抗弓形虫感染的免疫分子 |
| 1.1 促炎性反应免疫分子与弓形虫感染 |
| 1.2 抗炎性反应免疫分子与弓形虫感染 |
| 2 宿主抗弓形虫感染的免疫细胞 |
| 2.1 小肠上皮细胞是抵抗弓形虫感染的第一道屏障 |
| 2.2 中性粒细胞在抗弓形虫感染过程中发挥着重要的作用 |
| 2.3 巨噬细胞在抗弓形虫感染过程中发挥着关键的作用 |
| 2.4 NK细胞在抗弓形虫感染过程中的作用 |
| 3 总结 |
| 参考文献 |
| 第三章 宿主抗弓形虫感染的获得性免疫 |
| 1 抗体的类型和产生的规律 |
| 1.1 IgM |
| 1.2 IgG |
| 1.3 IgA |
| 1.4 IgE |
| 2 B细胞抗弓形虫感染作用 |
| 3 T细胞抗弓形虫感染的协同作用 |
| 4 抗体的保护作用 |
| 5 抗体对弓形虫杀伤的调理作用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 江苏地区猫源弓形虫虫株的分离与鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂及其配制 |
| 1.3 主要的仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 血清的采集和分离方法 |
| 2.2 猫血清抗体IgG的检测 |
| 2.3 弓形虫虫株的分离 |
| 2.4 瑞氏染色鉴定小鼠腹水中弓形虫 |
| 2.5 特异PCR鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗体检测结果 |
| 3.2 猫源弓形虫分离结果 |
| 3.3 分离虫株的PCR鉴定 |
| 4 讨论 |
| Abstract |
| 参考文献 |
| 第五章 猫源、鸡源和猪源弓形虫虫株基因型的鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 虫株 |
| 1.3 工具酶和主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 虫株的复苏与扩增 |
| 2.2 弓形虫基因组的提取 |
| 2.3 PCR扩增引物的设计与合成 |
| 2.4 PCR扩增反应体系及条件 |
| 2.5 目的DNA的酶切鉴定 |
| 2.6 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增结果 |
| 3.2 酶切鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| Abstract |
| 参考文献 |
| 第六章 四种不同来源弓形虫虫株对鸡和小鼠致病力的比较 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 虫株 |
| 2 方法 |
| 2.1 虫株的扩增与计数 |
| 2.2 对鸡致病力对比试验 |
| 2.3 对小鼠致病力对比试验 |
| 2.4 试验动物的存活时间 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 对鸡致病力试验结果 |
| 3.2 对小鼠致病力结果 |
| 4 讨论 |
| Abstract |
| 参考文献 |
| 第七章 四株不同动物来源弓形虫腹腔感染小鼠免疫病理变化的比较研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 虫株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 虫株的扩增与计数 |
| 2.2 实验分组及感染 |
| 2.3 弓形虫循环抗原(TCA)的检测 |
| 2.4 弓形虫特异性抗体的检测 |
| 2.5 流式技术检测T细胞亚类、MHC分子和NK细胞 |
| 2.6 血清细胞因子浓度的检测 |
| 2.7 NO浓度和NO诱生酶(iNOS)活性的检测 |
| 2.8 血清铁的检测 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠血清中TCA检测结果 |
| 3.2 小鼠抗弓形虫特异性抗体的检测结果 |
| 3.3 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+ T和NK细胞的检测结果 |
| 3.4 小鼠脾脏淋巴细胞中MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子的检测结果 |
| 3.5 小鼠血清中细胞因子的检测结果 |
| 3.6 小鼠血清中NO和NO诱生酶(iNOS)的检测结果 |
| 3.7 小鼠血清铁的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第八章 四株不同动物来源弓形虫灌胃感染小鼠免疫病理变化的比较研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 虫株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 虫株的扩增与计数 |
| 2.2 实验分组及感染 |
| 2.3 弓形虫循环抗原(TCA)的检测 |
| 2.4 弓形虫特异性抗体的检测 |
| 2.5 流式技术检测T细胞亚类、MHC分子和NK细胞 |
| 2.6 血清细胞因子浓度的检测 |
| 2.7 NO浓度和NO诱生酶(iNOS)活性的检测 |
| 2.8 血清铁的检测 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠血清中TCA检测结果 |
| 3.2 小鼠抗弓形虫特异性抗体的检测结果 |
| 3.3 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T和NK细胞的检测结果 |
| 3.4 小鼠脾脏淋巴细胞中MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子的检测结果 |
| 3.5 小鼠血清中细胞因子的检测结果 |
| 3.6 小鼠血清中NO和NO诱生酶(iNOS)的检测结果 |
| 3.7 小鼠血清铁的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第九章 四株不同动物来源弓形虫腹腔感染鸡免疫病理变化的比较研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 虫株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 虫株的扩增与计数 |
| 2.2 实验分组及感染 |
| 2.3 弓形虫循环抗原(TCA)的检测 |
| 2.4 弓形虫特异性抗体IgG、IgA和IgM的检测 |
| 2.5 流式技术检测T细胞亚类和MHC分子 |
| 2.6 血清细胞因子浓度的检测 |
| 2.7 NO浓度和NO诱生酶(iNOS)活性的检测 |
| 2.8 血清铁的检测 |
| 2.9 血细胞的检测 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清中TCA检测结果 |
| 3.2 血清中IgG，IgA和IgM的检测结果 |
| 3.3 脾脏淋巴细胞中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的检测结果 |
| 3.4 脾脏淋巴细胞中MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子的检测结果 |
| 3.5 血清中细胞因子的检测结果 |
| 3.6 血清中NO和NO诱生酶(iNOS)的检测结果 |
| 3.7 血清铁的检测结果 |
| 3.8 外周血血细胞计数结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（9）河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒的特性 |
| 1.1.2 病毒的基因组结构特点 |
| 1.2 PRRS流行病学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 PRRSV的持续性感染与继发感染 |
| 1.3 PRRS的发病机理 |
| 1.4 基因组的遗传变异研究 |
| 1.4.1 非结构蛋白编码基因的遗传变异研究 |
| 1.4.2 结构蛋白编码基因的遗传变异研究 |
| 1.5 PRRS的诊断和检测技术 |
| 1.6 PRRS疫苗研究进展 |
| 1.6.1 灭活疫苗 |
| 1.6.2 减毒活疫苗 |
| 1.6.3 亚单位疫苗 |
| 1.6.4 核酸疫苗 |
| 1.6.5 重组疫苗 |
| 1.6.6 活载体疫苗 |
| 1.6.7 表位疫苗 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 1.8 研究内容与技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 组织样本 |
| 2.2 病毒分离用细胞、载体与菌株 |
| 2.3 试验所需主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 试验所需主要溶液及其配制 |
| 2.5.1 RNA提取用溶液 |
| 2.5.2 细胞培养用溶液 |
| 2.5.3 琼脂糖凝胶电泳所用溶液 |
| 2.5.4 转化用溶液 |
| 2.6 PRRSV毒株核苷酸序列 |
| 2.7 分子生物学分析软件 |
| 3 方法 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 组织材料中总RNA的提取 |
| 3.3 反转录合成cDNA |
| 3.4 PCR扩增PRRSV NSP2和ORF5 |
| 3.5 PCR产物的凝胶回收纯化 |
| 3.6 PCR产物的克隆 |
| 3.6.1 PCR产物与pMD~(TM)19-T载体的连接 |
| 3.6.2 Top10感受态细胞的制备 |
| 3.6.3 转化平板的制备 |
| 3.6.4 连接产物转化Top10感受态细胞 |
| 3.7 重组克隆载体的鉴定 |
| 3.7.1 重组质粒的提取 |
| 3.7.2 PCR方法筛选阳性克隆 |
| 3.8 目的基因的序列测定及变异分析 |
| 3.9 遗传变异分析 |
| 3.10 推导编码氨基酸序列分析 |
| 3.11 PRRSV的分离与细胞培养 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 NSP2、ORF5基因的RT-PCR扩增 |
| 4.2 NSP2和ORF5基因的克隆与测序 |
| 4.3 NSP2基因的遗传变异分析 |
| 4.3.1 Nsp2基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析 |
| 4.3.2 依据Nsp2基因推导编码的氨基酸序列绘制遗传进化树 |
| 4.3.3 Nsp2基因推导编码氨基酸序列的变异分析 |
| 4.4 ORF5基因的遗传变异分析 |
| 4.4.1 ORF5基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析 |
| 4.4.2 依据ORF5基因推导氨基酸序列绘制遗传进化树 |
| 4.4.3 GP5蛋白的氨基酸序列分析 |
| 4.5 病毒分离 |
| 5 讨论 |
| 5.1 NSP2基因的变异 |
| 5.2 ORF5基因的变异 |
| 5.3 细胞分离 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）猪PRV感染PK15差异表达miRNAs的功能探索及3个免疫相关基因的分子特征研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 主要性状的中英文名称和缩写 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 猪抗病育种的研究进展 |
| 1.3 免疫与猪的抗病育种 |
| 1.3.1 免疫的概述 |
| 1.3.2 免疫与抗病力选择 |
| 1.4 干扰素及其诱导蛋白 |
| 1.4.1 干扰素的简介 |
| 1.4.2 干扰素的分类和诱生特性 |
| 1.4.3 干扰素的生物学作用 |
| 1.4.4 干扰素诱导蛋白 |
| 1.5 猪伪狂犬病毒的结构、特性及感染宿主的免疫反应 |
| 1.5.1 伪狂犬病毒的结构、增殖和特性 |
| 1.5.2 伪狂犬病毒感染宿主的免疫反应 |
| 1.6 MIRNA的发现、分子特征、生物发生过程及功能简介 |
| 1.6.1 miRNA的发现和命名方式 |
| 1.6.2 miRNA的分子特征 |
| 1.6.3 miRNA的生物发生过程 |
| 1.6.4 miRNA的基本功能 |
| 1.6.5 与免疫相关的miRNAs |
| 1.7 免疫相关基因和MIRNAs分离方法 |
| 1.8 猪中免疫相关基因与MIRNAs研究进展与不足 |
| 1.9 3个免疫相关基因的研究进展 |
| 1.9.1 BCL10基因的研究进展 |
| 1.9.2 防御素基因的研究进展 |
| 1.9.3 STAT6基因的研究进展 |
| 1.10 本研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验样品 |
| 2.1.2 microRNA芯片 |
| 2.1.3 载体和菌株 |
| 2.1.4 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要分子生物学软件、数据库和网站 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 本研究的技术路线 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 病毒感染 |
| 2.2.4 RNA提取与芯片杂交设计 |
| 2.2.5 microRNA芯片图像的采集与数据处理 |
| 2.2.6 miRNA的分离和克隆 |
| 2.2.7 基因的定量表达分析 |
| 2.2.8 microRNA靶基因的预测和验证 |
| 2.2.9 猪伪狂犬病毒绝对定量PCR检测方法 |
| 2.2.10 猪伪狂犬病毒免疫荧光染色 |
| 2.2.11 猪免疫相关基因的分离和克隆 |
| 2.2.12 猪免疫相关基因的SCHP和RH法染色体定位 |
| 2.2.13 猪免疫相关基因亚细胞定位研究 |
| 2.2.14 猪免疫相关基因组织表达谱分析 |
| 2.2.15 猪免疫相关基因的多态性检测与关联分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪伪狂犬病毒感染PK15细胞差异表达MICRORNA筛选 |
| 3.1.1 感染前后差异表达microRNA筛选结果 |
| 3.1.2 real-time PCR验证差异表达microRNA结果 |
| 3.1.3 芯片数据聚类结果 |
| 3.2 MIR-21超表达载体构建及MINICS合成 |
| 3.3 MIR-21靶基因预测与验证结果 |
| 3.3.1 miR-21靶基因预测结果 |
| 3.3.2 双荧光素酶报告基因结果 |
| 3.3.3 ELISA验证结果 |
| 3.4 MIR-21与IP10在POLYI:C刺激后表达变化 |
| 3.5 靶基因IP10在猪各组织的表达情况 |
| 3.5.1 猪组织总RNA的提取和检测结果 |
| 3.5.2 IP10的组织表达谱 |
| 3.6 靶基因IP10 3'UTR SNP检测和性状关联分析 |
| 3.6.1 靶基因IP10-3'UTR SNP检测 |
| 3.6.2 靶基因3'UTR SNP与免疫性状的关联分析结果 |
| 3.7 超表达MIR-21对猪伪狂犬病毒在细胞中增殖的影响 |
| 3.7.1 绝对定量PCR检测伪狂犬病毒增殖的结果 |
| 3.7.2 免疫荧光染色法检测伪狂犬病毒增殖的结果 |
| 3.8 猪3个免疫相关基因分子特征的研究 |
| 3.8.1 猪BCL10基因分子特征的研究 |
| 3.8.2 猪PBD-108基因分子特征的研究 |
| 3.8.3 猪STAT6基因分子特征的研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于筛选差异表达MIRNAs的方法 |
| 4.2 关于MIR-21对靶基因的调控作用 |
| 4.2.1 miRNAs的靶基因预测 |
| 4.2.2 miR-21对靶基因IP10的调控 |
| 4.3 IP10基因与免疫性状存在一定程度的关联 |
| 4.3.1 IP10基因的组织表达特点 |
| 4.3.2 IP10基因3'UTR的SNP与免疫性状的关联 |
| 4.4 关于MIR-21调节伪狂犬病毒的复制 |
| 4.5 关于猪BCL10基因的定位、表达和性状关联 |
| 4.6 关于猪PBD-108基因的SNP检测和红细胞性状的关联 |
| 4.7 关于猪STAT6基因的定位、表达和SNP多态性检测 |
| 5 小结 |
| 5.1 主要结果与结论 |
| 5.2 本研究的创新点与特色 |
| 5.3 值得进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、猪免疫旋毛虫抗原和感染后的抗体应答（论文参考文献）
- [1]猪圆环病毒2型抗原抗体荧光微球免疫层析快速检测方法的建立与应用[D]. 柳亚茹. 山东农业大学, 2019(01)
- [2]旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究[D]. 孙阁阁. 郑州大学, 2019(07)
- [3]旋毛虫成虫特异性DNaseⅡ-1和DNaseⅡ-7的表达鉴定及其免疫保护作用[D]. 祁欣. 郑州大学, 2018(03)
- [4]旋毛虫不同发育期抗原基因克隆及其对猪的保护作用研究[D]. 徐静. 吉林大学, 2017(12)
- [5]旋毛虫排泄分泌物抗原在鼠和猪免疫学诊断中的应用研究[D]. 孙召金. 吉林大学, 2015(08)
- [6]CpG ODN作为重组乳酸乳球菌佐剂对小鼠免疫应答的影响[D]. 王亚丽. 四川农业大学, 2012(06)
- [7]Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察[D]. 刘燕瑜. 吉林大学, 2012(09)
- [8]四株不同动物来源弓形虫感染小鼠和鸡免疫病理变化的比较研究[D]. 赵光伟. 南京农业大学, 2012(12)
- [9]河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查[D]. 王金凤. 河北农业大学, 2011(08)
- [10]猪PRV感染PK15差异表达miRNAs的功能探索及3个免疫相关基因的分子特征研究[D]. 黄菁. 华中农业大学, 2011(05)