一、穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化（论文文献综述）
顾伟[1]（2018）在《中华绒螯蟹螺原体侵染小鼠3T6细胞的机制研究》文中研究表明螺原体隶属于柔膜体纲,是一类无细胞壁、具有螺旋外形和运动能力、基因组精简的细小微生物。中华绒螯蟹螺原体Spiroplasma eriocheiris已经被证实是导致中华绒螯蟹颤抖病的病原,是第一个在水生甲壳动物体内发现的螺原体类微生物,基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该病原与非凡螺原体Spiroplasma mirum有高达98%的相似度,S.mirum最初从兔虱蜱上分离得到,后被证实能感染脊椎动物刚出生幼体并诱发白内障,还能利用鸡胚增殖并最终导致鸡胚死亡。与S.mirum相似的是,S.eriocheiris也具有感染乳鼠并导致白内障病症的能力（不能感染成年小鼠）,感染鸡胚时S.eriocheiris能通过鸡胚卵黄囊传播至体内各组织,随后出现在鸡胚脑部。虽然螺原体感染脊椎动物的组织病理学证据很明显,但其感染机制方面的报道却很少。基于课题组前期建立的S.eriocheiris感染小鼠胚胎成纤维细胞3T6的细胞感染模型,运用表达谱芯片和microRNA芯片技术筛选3T6细胞被S.eriocheiris感染前后mRNA和miRNA的差异表达,并用生物信息学方法及实验手段对芯片结果进行联合分析和功能验证。另一方面,应用酵母双杂交技术来筛选S.eriocheiris黏附蛋白ALP的互作蛋白,探讨其在病原入侵宿主细胞过程中的作用,这些都将为阐述S.eriocheiris对宿主感染的分子机制奠定基础。1.基于表达谱芯片技术研究S.eriocheiri 侵染3T6细胞的机制为深入研究螺原体侵染3T6细胞的分子机制,我们进行了表达谱芯片实验,选取未感染和螺原体感染6 h后的3T6细胞,分两组,每组3个平行,共6个实验样本,按表达谱芯片RNA质控标准,提取了细胞的总RNA,用Agilent小鼠GE 4×44K v2芯片（包含39430个探针）进行基因表达分析,按照表达谱芯片操作流程,对总RNA进行了 cDNA反转录、荧光标记、探针杂交及数据扫描等,采用MeV可视化软件检测差异表达探针确认显着差异表达基因,实验最终筛选出619个差异表达基因（183个上调,436个下调）,随后使用DAVID在线数据库对显着差异表达基因进行功能富集分析,并利用STING在线数据库研究差异表达基因在蛋白质相互作用网络中的分布情况,GO和KEGGpathway分析发现差异表达基因集中在神经营养因子信号通路、阿尔茨海默病、胰岛素信号通路、黏着斑、轴突导向等14条信号通路上。2.S.eriocheiris侵染3T6细胞过程中差异microRNA的筛选miRNA芯片实验在杭州联川生物公司完成,选用的是MRA-1002 miRmouse v20芯片,基于Sanger miRBase 20数据库进行数据分析。每个芯片都包含多个控制探头,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B是单基匹配检测探头。RNA样本为表达谱芯片同批的6个细胞总RNA,杂交前6组样品分别添加了 20个碱基的阳性对照序列,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B的强度比值大于20的列为差异条带,用单因素方差分析计算P值,用Cluster 3.0和TreeView软件来进行聚类和主成分分析（PCA）。miRNA芯片共检测出1982个3T6细胞miRNA,相较于对照组,被感染组3T6细胞有22个差异显着的miRNA（8个上调,14个下调）,依据“种子”序列原则,我们用TargetScan、miRanda和PicTar三种软件来预测差异miRNA的靶基因,综合软件分析结果,共获得靶基因数量3781个。在这22个差异miRNA中,5个miRNA（2个上调,3个下调）信号强度小于500,以上结果说明螺原体侵染3T6细胞状况下,宿主3T6细胞表现出一个独特的miRNA表达模式。3.S.eriocheiris侵染3T6细胞RNA联合分析及功能验证结合上述表达谱芯片和miRNA芯片结果进行联合分析,对比差异表达的miRNA靶基因和mRNA微阵列的差异表达基因,筛选出177个共同基因,并重点关注其中miRNA和mRNA变化负相关的共同基因进行KEGG通路分析,结果表明,相关基因大量集中于黏附和MAPK信号通路,说明这两个通路是螺原体感染宿主细胞的重要途径。为了验证基因芯片的结果,从以上两个通路中选取了 8个mRNA进行实时荧光定量PCR和Western blotting验证实验:黏附（β-Catenin、Parvin、Grb2 和 ERK）;MAPK 信号通路（FGFR、Grb2、ERK、MKK3、p38和JNK）,看家基因GAPDH作为对照。验证实验得到的变化趋势是β-Catenin（上调）、Parvin（上调）、FGFR（下调）,ERK（下调）,MKK3（下调）、p38（下调）芯片和RT-PCR结果趋势是一致的,Grb2在微阵列分析中结果是下调,但RT-PCR结果是没有显着变化,各基因免疫印迹结果与RT-PCR结果相吻合。同时也选取了 8 个 miRNA（mir-143-3p,mir-214-5p,mir-322-3p,mir-328-5p,mir-351-5p,mir-466h-5p,mir-503-5p 和 mir-30c-1-3p）进行 qPCR 验证,管家基因U6 miRNA作为对照,其中5个来自MAPK信号通路的miRNA均显示上调,其芯片和qPCR的结果得到了相互佐证。我们推测,当3T6细胞被螺原体感染后MAPK信号通路被抑制,细胞正常代谢遭到破坏,使得病原更易感染细胞。4.S.eriochei i 黏附蛋白ALP在侵染3T6细胞过程中的作用利用免疫胶体金及Western blotting技术来对S.eriocheiris黏附蛋白ALP进行定位,免疫电镜观察结果显示ALP在螺原体的膜表面;将S.eriocheiris全蛋白、膜蛋白及胞质蛋白分别与ALP多抗血清孵育后进行免疫印迹实验,结果显示全蛋白及膜蛋白有印迹条带而胞质蛋白则没有,这与免疫电镜结果相吻合。研究还发现ALP参与了螺原体侵染小鼠3T6细胞的过程,抗体中和实验显示螺原体经ALP多抗血清30 ℃孵育1 h后,再感染3T6细胞,36 h后进入3T6细胞的螺原体显着少于对照组,其侵染能力明显减弱,说明黏附蛋白ALP这一螺原体表面蛋白,在螺原体入侵宿主细胞过程中起着关键作用。5.S.eriochei i 黏附蛋白ALP互作蛋白的筛选及功能鉴定利用酵母双杂交技术筛选了能与螺原体黏附蛋白ALP相互作用的小鼠蛋白,结果显示ALP可以与小鼠中的137个基因片段互作,选择其中的纤连蛋白7（Fibulin7）进行验证,原核重组表达后利用Far-western blotting确认了 ALP与Fibulin7片段（含有两个EGF结构域）的相互作用,激光共聚焦确认ALP与Fibulin7片段可以共定位。人工合成了 Fibulin7的另外两个结构域（EGF结构域:136-172AA和补体控制蛋白CCP结构域:81-134AA）,结果显示仅Fibulin7的EGF结构域能与ALP结合,由于EGF结构域与EGF有高度同源性,而EGF是EGFR信号通路重要的上游信号分子,当ALP重组蛋白刺激3T6细胞后,ALP与EGF竞争性结合而使得EGFR通路被抑制。未出生的小鼠、新生乳鼠和乳鼠期接种螺原体后成年患白内障的小鼠体内都检测出Fibulin7基因的表达,而正常成年小鼠则没有,新生乳鼠大脑部位含有丰富的EGF,ALP通过与EGF的互作促成了 S.eriocheiris对乳鼠的感染。本实验证实S.eriocheiri 外膜蛋白ALP在其侵染哺乳动物细胞中起关键作用。FBLN7蛋白的EGF结构域是ALP作用的识别位点,ALP通过与EGF结构域结合进而与宿主细胞相结合,ALP促进了病原菌与宿主细胞的黏附及后续的侵染过程。
江雪梅[2]（2016）在《基于pM蛋白的IgY亲和纯化研究》文中指出卵黄抗体（IgY）是禽体内最主要的免疫球蛋白,在禽类动物体内发挥着与哺乳动物IgG相似的作用。而且,与IgG相比,IgY还具有理化性质稳定和种系间距大的优势。但是,IgY落后的纯化手段一直是阻碍其得到广泛应用的瓶颈所在。所以,IgY亲和层析方法的建立是决定IgY技术发展的关键环节。通过从人生殖支原体基因组中克隆获取pM基因序列,与pMD-19T Simple连接构建重组载体,转化大肠杆菌DH5α,构建克隆重组菌。经酶切鉴定正确以后,将pM基因序列与pET 32a表达载体连接,连接产物转化至大肠杆菌BL21,构建重组表达菌株。在0.4mM的IPTG,20℃过夜诱导条件下诱导pM蛋白表达,SDS-PAGE分析鉴定pM蛋白在此条件下以可溶性的形式大量表达。随后,通过pull-down和蛋白免疫印记实验证明pM蛋白与鸡形目IgY、雁形目IgY、IgY-scFv和IgYΔFc均能结合,并证明pM蛋白与IgY的结合具有Fab片段依赖性。表面等离子实验验证pM蛋白与IgY的scFv的亲和力为1.922E-10M。随后,将pM蛋白与N-羟基琥珀酸亚胺活化的琼脂糖4FF偶联制备得到简易的重力纯化柱,使用此重力纯化柱在pH 3.2的条件下能够纯化出最多的高纯度IgY。SDS-PAGE将亲和纯化得到的IgY与传统方法提取的IgY纯度对比发现,与传统方法纯化获得的IgY相比,利用pM蛋白亲和纯化获得的IgY抗体的纯度有显着提高,Bandscan分析pM蛋白亲和纯化后的IgY纯度可以达到98.7%。通过间接酶联免疫反应发现,在纯化后的IgY中,IgY的浓度提升了125倍。证明pM蛋白可以作为IgY亲和纯化的配体使用。这一发现为非哺乳动物抗体及其抗体片段的纯化奠定了坚实的理论基础。
张凡庆[3]（2014）在《鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究和随机转座突变方法的建立》文中进行了进一步梳理鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum,MG）属于支原体目、支原体科、支原体属,是禽类重要病原体之一。鸡毒支原体可感染鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、家雀等多种禽类,主要表现为呼吸道症状。鸡群感染鸡毒支原体后除表现咳嗽、流鼻涕、流泪、哕音、呼吸困难等症状外,还可导致蛋鸡产蛋率下降,种蛋孵化率降低,肉鸡生长发育受阻,饲料转化率降低。该病发病率极高,几乎100%的鸡场都有此病,鸡场一旦感染就很难彻底清除,给养禽业带来巨大的损失。并且,鸡毒支原体的感染可使鸡群对其它病原微生物如大肠杆菌、禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等的易感性增加,导致混合或继发感染,引起更为严重的呼吸道综合征,从而使损失加剧。丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase）是丙酮酸脱氢酶复合体的其中的一个酶,是关键的限速酶。已经有研究表明,支原体参与代谢的酶类如烯醇化酶（enolase）,甘油醛-3一磷酸脱氢酶（GAPDH）,丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）,除了自身的催化功能外,还可以作为毒力因子参与致病的作用。目前在鸡毒支原体中的的丙酮酸脱氢酶的功能尚不清楚,本文将开展其生物学功能研究。另外本研究成功构建了鸡毒支原体随机插入转座载体,利用该载体进行了随机突变,建立了随机突变库。1.丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究根据GenBank中鸡毒支原体Rlow株的序列分别设计两对引物,通过PCR方法获得了鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶α亚基和β亚基的基因。将其克隆至pGEM-T easy,测序并完成点突变后,将pdha和pdhb分别克隆至pET28a（+）载体,构建重组表达质粒pET-pdha和pET-pdhb。分别将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白His-PDHA和His-PDHB,大小分别为34kDa和41kDa。纯化蛋白后对其进行酶活性检测,结果显示该酶的单个亚基不具有酶活性,将两种酶混合后再体外具有催化功能,活性稍低于标准品。将纯化后的表达产物（His-PDHA和His-PDHB）免疫小鼠制备了PDHA和PDHB抗血清,并通过Western-blot和ELISA验证了表达蛋白的免疫原性。Western-blot显示PDHA和PDHB多抗血清可与提取的鸡毒支原体膜蛋白发生特异性结合；说明鸡毒支原体膜表面有PDHA和PDHB。同时展示在大肠杆菌膜表面的PDHA和PDHB的重组菌株可以黏附禽DF1细胞。细胞黏附试验表明His-PDHA和His-PDHB鼠多抗对DF1细胞的黏附阻断率为30.8%和45%。补体杀菌试验结果表明His-PDHB和His-PDHB多抗血清具有良好的杀菌作用。2.鸡毒支原体随机转座突变载体的构建为研究鸡毒支原体中重要蛋白与毒力的关系。本研究拟构建mini-Tn4001SpGm随机转座插入载体。该转座子具备以下特征：含庆大霉素抗性基因,由螺原体螺旋启动子启动抗性基因的表达；抗性基因两侧为含Inner和Outer的IS256插入重复区；重复区之外为金黄色葡萄球菌转座酶基因。通过对随机缺失株的抗性筛选和基因组PCR方法检测,成功获得了738株随机缺失株。Southern blot验证抗性基因在支原体基因中随机插入。运用测序方法,最终确定了插入位点。这一转座子载体的成功构建为发现鸡毒支原体毒力相关蛋白奠定了基础,对下一步在鸡毒支原体中插入外源基因表达异源蛋白提供了有效的基因操作工具.
曾燚华[4]（2012）在《生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察》文中研究表明研究背景生殖支原体（Mycoplasma genitalium, Mg）是近年新明确的一种性病病原体，研究表明，Mg可能引起泌尿生殖道感染，与盆腔炎、呼吸道感染、关节炎等疾病有关，并可导致不育。另外，Mg还是引起艾滋病患者发生机会感染的主要病原体之一，被称为AIDS相关支原体。对于Mg的感染，目前仍然没有满足临床需要的疫苗可供使用，临床上急需安全、有效的疫苗以用于预防Mg的感染。生殖支原体粘附素蛋白（MgPa）是位于其尖形结构的一种主要的粘附素，其C端具有很强的免疫原性（最强区位于第1248～1364aa）。因此，MgPa是一种重要的中和抗原，在Mg的诊断和预防中起着重要的作用。本研究拟利用噬菌体展示随机肽库技术筛选MgPa的模拟表位，采用多抗原肽（MAP）的设计方案，制备并纯化含有模拟表位的八分枝MAP，并对其免疫原性进行研究。研究目的表达并纯化含生殖支原体MgPa优势表位(1075～1364aa的重组蛋白（rMgPa），制备并纯化rMgPa的多克隆抗体（pAb），以此pAb为靶分子，利用噬菌体展示随机12肽库筛选并鉴定MgPa的模拟表位，为研究MgPa的抗原表位结构提供实验依据；制备含有多个模拟表位的多抗原肽（MAP），检测其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答水平，为研制安全、有效的基于多个抗原表位的Mg表位肽疫苗奠定实验基础。研究方法（1）利用构建好的原核表达载体PET-30a（+）/MgPa在大肠杆菌中诱导表达MgPa的重组蛋白，并用ELISA、SDA-PAGE和Western blot等方法对其进行鉴定，再用Ni-NAT亲和层析柱纯化重组蛋白，用BCA法测定重组蛋白的浓度。（2）将经纯化的重组蛋白免疫新西兰兔以制备其相应的pAb，用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B亲和层析柱纯化pAb，用间接ELISA法检测免疫兔血清中pAb的效价，再用Western blot鉴定pAb的特异性和免疫原性。（3）以此pAb为靶分子对噬菌体展示随机12肽库进行4轮生物淘洗，随机挑取经淘洗后的噬菌体克隆进行扩增培养，提取并纯化其单链DNA进行DNA测序分析，推导出噬菌体表面展示的外源性氨基酸序列，并用MIMOX工具进行生物信息学分析。用ELISA、竞争性结合试验和Western blot等方法检测噬菌体与pAb结合的特异性。（4）以多聚赖氨酸为核心基质，人工合成含有筛选到的模拟表位的八分枝MAP，用反向高效液相色谱（RP-HPLC）分析MAP的纯度，再用质谱分析仪测定MAP的分子量以期对其进行鉴定。（5）将30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组、WP组、AS组、KH组和混合组，将100L PBS或100g各种合成的MAP或其混合物分别经皮下多点注射免疫小鼠，共免疫4次，每间隔2w免疫1次。每次于免疫前1天剪尾取血，末次免疫后第14d摘眼球放血收集小鼠血清，无菌制备脾细胞悬液。（6）间接ELISA测定小鼠血清中的特异性IgG抗体及其亚类的水平；ELISA检测脾细胞培养上清中的IL-4和IFN-γ水平；MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖反应。研究结果（1）SDS-PAGE显示，IPTG诱导转化有PET-30a（+）／MgPa的大肠杆菌成功表达了一分子量约为37kD的含6×His的融合蛋白rMgPa，经Ni-NAT亲和纯化获得了较高纯度的目的蛋白，目的蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，BCA法测定经纯化的目的蛋白浓度达到1160μg/mL。（2）利用纯化的经复性后的rMgPa免疫新西兰兔后获得了相应的pAb，间接ELISA结果显示血清中特异性pAb的效价为1∶25600；Western blot的结果表明rMgPa能与免疫血清发生特异性结合；免疫血清经饱和硫酸铵法初步纯化，随后经亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的抗rMgPa的pAb，SDS-PAGE分析的结果表明所制备的pAb的轻链分子量约为25kD，重链分子量约为50kD，因此，该pAb的分子量约为150kD。（3）以经纯化的抗rMgPa的pAb抗体为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行了4轮生物淘洗，第一轮和第四轮生物淘洗的产率分别为1.45×10-6和9.25×10-4，说明特异性噬菌体克隆得到了明显富集；经对45种不同的肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析，结果表明45个肽序列中的3组一致性的核心序列分别为： P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I。（4）ELISA实验的结果显示：45个含不同肽序列的噬菌体克隆中，共有36个为阳性噬菌体克隆，其中23个噬菌体克隆有较高的结合力，其A450值均高于1.5；竞争性结合试验的结果表明，这些噬菌体与pAb的特异性结合能被不同浓度的rMgPa部分抑制，且随着其浓度的增加其抑制效果也相应的增加；Western blot方法检测的结果表明A450值高于1.5的23个阳性噬菌体能与pAb发生特异性结合。（5）反向高效液相色谱分析的结果表明合成的3个MAP的纯度都在90%以上，质谱分析的结果说明所合成的MAP的分子量与预期的理论分子量基本一致，因此，成功地合成了较高纯度的3个模拟表位的MAP。（6）小鼠经4次免疫后，WP组、AS组、KH组和混合免疫组血清中IgG抗体的A450值分别为0.935±0.028、0.640±0.022、0.841±0.103和1.326±0.025，与PBS对照组（0.118±0.023）比较，均具有统计学意义（p<0.01）；与WP组、AS组和KH组相比，混合免疫组小鼠血清中IgG抗体的A450值升高更为明显（p<0.05）。（7）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的IgG抗体效价分别为1∶2560、1∶640、1∶2560和1∶5120。WP组、AS组、KH组和混合免疫组小鼠血清中的IgG抗体以IgG2a型为主，其相应的IgG2a/IgG1分别为1.835±0.125、1.708±0.180、1.690±0.202和2.095±0.179，均显着高于PBS组（0.967±0.142）（p<0.01）。（8）WP组、AS组、KH组和混合组的IL-4含量分别为55.588±2.407、42.996±1.935、54.754±2.270和81.598±2.649pg/mL，与PBS组（16.673±1.662）相比，具有统计学意义（p<0.01）。与WP、AS、KH组相比，混合组产生的IL-4水平具有显着性差异（p＜0.01）。（9）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的刺激指数（SI）分别为1.560±0.036、1.353±0.131、1.424±0.041和1.874±0.060，明显高于PBS组（1.107±0.032，p<0.01）；混合免疫组的刺激指数（SI）显着高于WP组、AS组和KH组（p<0.01）。（10）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的IFN-γ含量分别为168.496±7.919、98.327±5.030、111.437±5.243和235.815±8.430pg/mL，显着高于PBS组（31.476±1.717，p<0.01）；且与WP组、AS组、KH组相比，混合免疫组的脾淋巴细胞产生了更多的IFN-γ（p<0.01），差异具有统计学意义。结论（1）成功表达并纯化了分子量为37kD的重组蛋白rMgPa；（2）成功制备并纯化了高效价、高特异性的兔抗rMgPa的pAb；（3）成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位：P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I；（4）成功制备并纯化了3个模拟表位相应的MAP——WP、AS和KH；（5）WP、AS和KH均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，且混合免疫组诱导的免疫应答效果比单个MAP组更好。
蔡恒玲[5]（2005）在《SARS相关冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其免疫活性测定》文中认为目的:根据GeneBank登录的BJ01株SARS-CoV核酸序列合成801bp S1基因片段（22382bp～23182bp）,构建SARS-CoV相关冠状病毒S1基因片段真核表达载体,并肌注免疫BALB/c小鼠,观察小鼠所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,从而为SARS-CoV生物学活性的研究及核酸疫苗的研制提供实验依据。 方法:用PRIMER5.0引物设计软件设计引物,聚合酶链反应（PCR）扩增S1基因片段801bp。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后,亚克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体中;阳性克隆经双酶切鉴定后转染HeLa细胞,免疫细胞化学法与Western-Blotting鉴定其在真核细胞中的表达;以pcDNA3.1（+）/S1肌注免疫6周龄BALB/C小鼠,PCR与免疫组化法检测SARS相关冠状病毒S1基因在小鼠股四头肌的表达,ELISA法检测抗SARS-CoV IgG,MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,并检测免疫小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ水平。 结果:扩增的SARS-CoVS1基因片段801bp亚克隆至pcDNA3.1（+）/S1后,免疫细胞化学试验与Western-Blotting结果表明pcDNA3.1（+）/S1可以在HeLa细胞中表达大小约为32KD的S1蛋白。免疫组织化学结果显示pcDNA3.1（+）/S1免疫组小鼠股四头肌细胞内表达了SARS-CoV S1蛋白。免疫后小鼠的体液与细胞免疫应答水平均随免疫时间增强。随着免疫次数的增加和接种时间的延续,pcDNA3.1（+）/S1免疫组小鼠体内抗SARS-CoV IgG量明显升高,抗体滴度达1∶2000。T淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1（+）/S1注射组细胞加入刺激物后,细胞成团生长,pET-22b/S1重组蛋白刺激组较PHA刺激组细胞增殖明显活跃,各组间有显着性差异（采用方差分析,F=12.045,P=0.000,P<0.05）;细胞因子IFN-γ检测
陈丽丽[6]（2005）在《沙眼衣原体基因分型及omp1基因多态性研究》文中指出目的 研究从中国部分城市分离的沙眼衣原体临床株的基因型,通过测序及进化树分析Omp1基因的多态性,掌握中国Ct感染的流行病学特征,为Ct疫苗的研制及Ct感染的防治提供实验依据。 方法 从不同城市收集可疑的临床标本,用McCOY细胞培养,Ct阳性标本用于研究。按文献设计特异性引物,巢式PCR扩增MOMP约980bp的基因片段（包括四个变异区）,用内切酶Alu Ⅰ、Msp Ⅰ、EcoR Ⅰ、Dde Ⅰ酶切相应PCR产物,用3%琼脂糖凝胶及18%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。同时从GENEBANK中获得Ct各参考株的Omp1基因序列,用DNA star软件分析目的片段的酶切位点,得到各参考株上述四种内切酶的酶切图谱。根据各参考株与临床株的酶切图谱,将临床株分型。随机选择部分临床株PCR产物双向测序,用Mega3软件构建进化树分析临床株与各参考株之间的亲缘关系。 结果 细胞培养301份阳性标本,PCR扩增出286份,其中湖南衡阳48例、上海32例、广州52例、广东江门154例。RFLP分型检测,共检出10个基因型,分别为E（30.8%）、J（23.8%）、D（17.5%）、F（10.5%）、G（6.2%）、H（3.5%）、K（2.8%）、Ba（2.1%）、Da（1.4%）和I（1.4%）型,并且不同城市间基因型的分布没有明显区别（P>0.05）。 对其中86份标本测序,BLAST及进化树分析发现,测序分型结果与RFLP结果完全吻合,且发现28种基因变体,其中E、F型Omp1基因高度保守,而其它基
陈丽丽,吴移谋,蔡恒玲,阮卫,张文波,邓仲良[7]（2004）在《穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化》文中提出目的 探讨穿透支原体对宿主细胞的黏附机制。方法 用去污剂Triton X-100提取穿透支原体蛋白,用配体免疫印迹试验鉴定纤连蛋白结合蛋白（FnBP）;然后制备纤连蛋白Sepharose 4B亲和柱,运用亲和层析技术从制备的样品中分离纯化FnBP,在非还原状态下进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。结果 配体免疫印迹试验鉴定出一65kDa的蛋白条带,可特异性地结合Fn;亲和层析技术得到相应的FnBP的纯化产物。结论FnBP与穿透支原体对宿主细胞的黏附过程有关。
二、穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化（论文提纲范文）
（1）中华绒螯蟹螺原体侵染小鼠3T6细胞的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 螺原体的研究进展 |
| 1.1.1 螺原体类微生物的生物学特性及致病性 |
| 1.1.2 螺原体致病机制的研究进展 |
| 1.2 中华绒螯蟹螺原体S.eriocheiris的研究现状 |
| 1.2.1 S. eriocheiris的发现与命名 |
| 1.2.2 S. eriocheiris的比较基因组学研究 |
| 1.2.3 S. eriocheiris侵染靶细胞模型的建立 |
| 1.2.4 S. eriocheiri类黏附蛋白ALP (adesin-like protein)的序列分析、克隆、表达 |
| 1.2.5 S.eriocheiri侵染机理研究 |
| 1.3 基因芯片技术研究进展 |
| 1.3.1 基因芯片技术简介 |
| 1.3.2 表达谱芯片技术 |
| 1.3.3 miRNA芯片技术 |
| 1.3.4 其他类型基因芯片 |
| 1.4 基因芯片数据处理 |
| 1.5 RNA芯片联合分析 |
| 1.6 本论文的研究目的、意义、内容和技术路线 |
| 第2章 基于表达谱芯片技术研究中华绒螯蟹螺原体侵染3T6细胞的机制 |
| 2.1 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 菌株及细胞株 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配方 |
| 2.1.4 数据库和分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠3T6细胞细胞培养与S.eriocheiris的侵染 |
| 2.2.2 表达谱芯片分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 S.eriocheiris诱导3T6细胞凋亡及对细胞活力的影响 |
| 2.3.2 S.eriocheiris侵染3T6细胞后mRNA的差异表达 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 第3章 中华绒螯蟹螺原体侵染3T6细胞过程中差异microRNA的筛选 |
| 3.1 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 3.1.1 菌株及细胞株 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂配方 |
| 3.1.4 数据库和分析软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠3T6细胞细胞培养与S.eriocheiris的侵染 |
| 3.2.2 3T6细胞Total RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA纯化 |
| 3.2.4 microRNA芯片实验 |
| 3.2.5 数据分析方法及过程 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RNA样品质控 |
| 3.3.2 microRNA芯片实验原始数据处理 |
| 3.3.3 生物信息数据分析 |
| 3.3.4 GO的富集性分析 |
| 3.3.5 KEGG的富集分析 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 第4章 中华绒螯蟹螺原体侵染3T6细胞RNA联合分析及功能验证 |
| 4.1 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 4.1.1 菌株及细胞株 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 S.eriocheiris的侵染3T6细胞RNA联合分析 |
| 4.2.2 差异mRNA和miRNA的RT-PCR验证 |
| 4.2.3 Western blotting实验验证 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 表达谱芯片及micro RNA芯片联合分析结果 |
| 4.3.2 S.eriocheiris感染3T6细胞的Realtime-PCR实验验证 |
| 4.3.3 microRNA定量分析结果 |
| 4.3.4 Western blotting实验验证基因芯片结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第5章 中华绒螯蟹螺原体黏附蛋白ALP在侵染3T6细胞过程中的作用 |
| 5.1 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 5.1.1 菌株和细胞株 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 主要试剂配方 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠3T6细胞细胞培养与S.eriocheiris侵染 |
| 5.2.2 S.eriocheiris基因组的提取 |
| 5.2.3 S.eriocheirisALP基因克隆 |
| 5.2.4 免疫电镜实验 |
| 5.2.5 膜蛋白和胞质蛋白的制备 |
| 5.2.6 ALP多抗中和实验 |
| 5.2.7 MTT法检测细胞活力 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 S.eriocheiris ALP蛋白定位 |
| 5.3.2 ALP抗体能抑制S.eriocheiris感染 |
| 5.3.3 MTT法测定3T6细胞活力结果 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 第6章 中华绒螯蟹螺原体黏附蛋白ALP互作蛋白的筛选及功能鉴定 |
| 6.1 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器设备 |
| 6.1.3 主要试剂配方 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 酵母双杂交实验 |
| 6.2.2 重组蛋白的表达及多肽片段的合成 |
| 6.2.3 Far-Western Blotting分析 |
| 6.2.4 荧光共定位分析 |
| 6.2.5 Western Blotting分析 |
| 6.2.6 FBLN7蛋白表达趋势 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 酵母双杂交系统筛选S. eriocheiris ALP互作蛋白 |
| 6.3.2 重组蛋白表达和纯化 |
| 6.3.3 ALP互作蛋白的确定与分析 |
| 6.3.4 ALP重组蛋白刺激3T6细胞结果 |
| 6.3.5 ALP重组蛋白通过与EGF相互作用抑制EGFR通路 |
| 6.3.6 FBLN7在小鼠发育过程中的表达 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 第7章 全文总结 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 问题与不足 |
| 7.4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录A: 本论文中所用的缩略语 |
| 附录B: 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（2）基于pM蛋白的IgY亲和纯化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 禽类IgY概述及pM蛋白与抗体互作研究进展 |
| 1.1 禽类IgY概述 |
| 1.1.1 IgY的分子结构研究进展 |
| 1.1.2 禽免疫球蛋白IgY的特性 |
| 1.1.3 禽IgY的应用 |
| 1.2 抗体结合蛋白概述 |
| 1.2.1 抗体结合蛋白的理化性质 |
| 1.2.2 抗体结合蛋白的生物学性质 |
| 1.3 pM蛋白与抗体互作研究进展 |
| 1.3.1 pM蛋白的发现 |
| 1.3.2 pM蛋白的理化性质 |
| 1.3.3 pM蛋白的生物学特性 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 pM蛋白的可溶性表达及纯化 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂与材料 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pM蛋白基因的克隆 |
| 2.2.2 表达载体pET 32a-pM蛋白的构建 |
| 2.2.3 pM蛋白的表达和可溶性鉴定 |
| 2.2.4 pM蛋白的纯化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 pM蛋白基因的扩增 |
| 2.3.2 pMD19T-pM蛋白酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.4 pM蛋白诱导表达条件的确定 |
| 2.3.5 pM蛋白IPTG诱导浓度的确定 |
| 2.3.6 pM蛋白蛋白表达的可溶性分析及纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 以pM蛋白亲和层析柱纯化IgY及结合机理探索 |
| 3.1 材料和实际 |
| 3.1.1 仪器和设备 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 鸡的免疫和抗体的粗提 |
| 3.2.2 可溶性单链抗体SUMO-scFv的表达及纯化 |
| 3.2.3 禽源抗体与pM蛋白的互作研究 |
| 3.2.4 以pM蛋白为配体的层析柱亲和纯化IgY |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IgY抗体的粗提 |
| 3.3.2 pET 32a-SUMO-scFv重组质粒的构建 |
| 3.3.3 SUMO-scFv重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.4 pM蛋白和禽源IgY的结合能力验证 |
| 3.3.5 pM蛋白亲和层析柱对IgY的纯化 |
| 3.3.6 纯化后IgY的生物活性验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究和随机转座突变方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第—篇 文献综述 |
| 第—章 丙酮酸脱氢酶研究进展 |
| 1.1 丙酮酸脱氢酶的概述 |
| 1.2 丙酮酸脱氢酶的结构 |
| 1.3 丙酮酸脱氢酶复合体的催化机理 |
| 1.4 丙酮酸脱氢酶的功能 |
| 1.5 研究鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的意义 |
| 第二章 支原体基因工程研究工具 |
| 2.1 转座子 |
| 2.2 目的基因的敲除 |
| 2.3 报告基因 |
| 2.4 鸡毒支原体随机插入突变的研究意义 |
| 第二篇 丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究 |
| 第三章 丙酮酸脱氢酶E1和E2亚基的原核表达及多抗制备 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌种、载体、抗体及动物 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 鸡毒支原体Rlow株基因组的提取 |
| 1.5 pdha和pdhb基因的overlap PCR扩增 |
| 1.6 重组表达载体的构建 |
| 1.7 目的基因的原核表达和蛋白纯化 |
| 1.8 多克隆抗体的制备及免疫原性的分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Overlap PCR扩增目的基因 |
| 2.2 重组表达载体的构建 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.4 多抗的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的酶活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 二氯吲哚酚法测定丙酮酸脱氢酶活性 |
| 1.4 标准曲线测定 |
| 1.5 DCPIP的稳定性 |
| 1.6 His-PDHA和His-PDHB的相对比活性测定 |
| 1.7 不同DCPIP浓度对反应速率的影响 |
| 1.8 pH对His-PDH活性影响 |
| 1.9 温度对His-PDH活性的影响 |
| 1.10 金属离子对His-PDH活性的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 DCPIP标准曲线的制作 |
| 2.2 DCPIP稳定性试验 |
| 2.3 His-PDH的比活力测定 |
| 2.4 米氏常数的测定 |
| 2.5 温度对His-PDH酶活性的影响 |
| 2.6 pH值对His-PDH的影响 |
| 2.7 金属离子对反应的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1和E2亚基的亚细胞定位及其生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、细胞株和载体 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 鸡毒支原体膜蛋白的提取 |
| 1.5 Western-blot试验 |
| 1.6 间接免疫荧光试验 |
| 1.7 纤连蛋白结合试验 |
| 1.8 配体结合试验 |
| 1.9 黏附及其黏附抑制试验 |
| 1.10 膜表面展示载体的构建和表达 |
| 1.11 重组菌对DF-1细胞的黏附和黏附抑制试验 |
| 1.12 多抗血清体外杀菌试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western-blot检测 |
| 2.2 悬浮法免疫荧光检测 |
| 2.3 纤连蛋白结合试验 |
| 2.4 配体结合试验 |
| 2.5 鸡毒支原体黏附细胞及其黏附抑制试验 |
| 2.6 膜表面展示载体的构建和表达 |
| 2.7 PDHA和PDHB介导的大肠杆菌黏附DF1细胞 |
| 2.8 His-PDHA和His-PDHB多抗血清的体外杀菌实验 |
| 3 讨论 |
| 第三篇 随机缺失转座载体的构建 |
| 第六章 鸡毒支原体随机缺失转座载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与载体 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 药敏试验 |
| 1.5 mini-Tn4001SpGm转座子的构建策略 |
| 1.6 mini-Tn4001SpGm载体的构建 |
| 1.7 随机转座载体电转化 |
| 1.8 随机突变株筛选方法 |
| 1.9 突变株的Southern杂交鉴定 |
| 1.10 插入位置的确认 |
| 2 结果 |
| 2.1 药敏试验 |
| 2.2 液体药敏试验 |
| 2.3 随机缺失转座载体的构建 |
| 2.4 随机缺失转座载体的构建 |
| 2.5 重组子筛选鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 |
（4）生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察（论文提纲范文）
| 常用英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 生殖支原体MgPa的表达、纯化及其多克隆抗体制备与纯化 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于生殖支原体 MgPa 模拟表位的 MAP 免疫效果观察 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一：PCR 产物 DNA 测序图谱 |
| 附录二：MgPa 测序结果的 BLAST 分析 |
| 附录三：45 个阳性噬菌体 DNA 测序图谱 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要成果目录 |
| 致谢 |
（5）SARS相关冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其免疫活性测定（论文提纲范文）
| 主要英文缩略语索引 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 研究成果及发表论文 |
| 致谢 |
（6）沙眼衣原体基因分型及omp1基因多态性研究（论文提纲范文）
| 一 主要英文缩写词索引 |
| 二 中文摘要 |
| 三 英文摘要 |
| 四 正文 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 五 参考文献 |
| 六 文献综述 |
| 七 读硕期间业绩 |
| 八 致谢 |
四、穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化（论文参考文献）
- [1]中华绒螯蟹螺原体侵染小鼠3T6细胞的机制研究[D]. 顾伟. 南京师范大学, 2018(01)
- [2]基于pM蛋白的IgY亲和纯化研究[D]. 江雪梅. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [3]鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究和随机转座突变方法的建立[D]. 张凡庆. 南京农业大学, 2014(05)
- [4]生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察[D]. 曾燚华. 南华大学, 2012(08)
- [5]SARS相关冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其免疫活性测定[D]. 蔡恒玲. 南华大学, 2005(07)
- [6]沙眼衣原体基因分型及omp1基因多态性研究[D]. 陈丽丽. 南华大学, 2005(07)
- [7]穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化[J]. 陈丽丽,吴移谋,蔡恒玲,阮卫,张文波,邓仲良. 南华大学学报(医学版), 2004(04)