一、人参皂甙和肿瘤坏死因子对小鼠脾细胞抗体依赖细胞介导的细胞毒活性的影响（论文文献综述）
刘颖[1]（2021）在《提高白血病小鼠体内NK细胞活性的研究》文中进行了进一步梳理
沙洲[2]（2021）在《松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用》文中研究说明松花粉作为传统医学中的膳食补充剂已有数百年历史,而具有广泛生物学活性的多糖（Polysaccharides,PS）是松花粉的关键活性成分之一,已经被运用到改善和调节免疫功能等方面。黏膜免疫系统是动物（尤其是家禽）整个免疫网络的重要组成部分,也是抵抗外源抗原感染的第一道防线。肠道黏膜是食物消化和营养吸收的关键部位,其中存在的肠道微生物和大量免疫细胞共同形成坚固的防御屏障,而作为免疫细胞的巨噬细胞（Macrophages,m（?））具有趋化性运动、吞噬、分泌和抗原呈递等功能,在抗感染、抗肿瘤、免疫调节等过程中扮演积极角色。本论文以从山东省泰安市的松花粉中分离纯化的松花粉多糖（Pine pollen Polysaccharides,PPPS）作为研究对象,运用分子生物学等技术在体内探究PPPS对肠道黏膜免疫的影响;通过16S高通量测序分析PPPS对肠道内菌群结构丰度的作用;在体外以鸡巨噬细胞（HD11）作为靶细胞,揭示PPPS对其的免疫调节作用并初步探究作用机制。本研究旨在为研制对黏膜免疫具有免疫增强作用的新型免疫增强制剂提供实验基础和理论依据。主要研究内容和结果如下:1、PPPS对黏膜免疫的影响本试验首先选取120只1日龄的SPF鸡,随机分为PBS组、PPPS低剂量组（LPPPS组）、PPPS中剂量组（MPPPS组）、PPPS高剂量组（HPPPS组）,分别口服PBS和3种不同剂量的PPPS（10 mg/m L,20 mg/m L和40 mg/m L）,0.2 m L/只,持续21天。在试验的第7、14和21天分别收集各组鸡的肠道组织、粪便及血液样品。通过ELISA方法、流式细胞术、CCK-8试剂、实时荧光定量PCR（q PCR）等技术分别检测免疫学相关指标,主要包括:SIg A和Ig G抗体水平、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平、T淋巴细胞转化率、细胞因子（白介素2、白介素4、干扰素γ）、黏膜免疫相关分子基因（CD80、CD86、MHC-I、MHC-II）。结果表明PPPS显着提高鸡的黏膜抗体SIg A和血清抗体Ig G水平,并有效促进细胞因子分泌及T淋巴细胞水平,上调黏膜免疫相关基因m RNA水平。通过HE染色观察PPPS对小肠绒毛结构的影响,分别采集PBS组及PPPS组鸡的小肠不同部位组织制成石蜡切片,测量并统计分析各组鸡的十二指肠、空肠和回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值（长度/深度）的变化。结果表明,PPPS能有效改善小肠绒毛发育以增强肠道黏膜抵御病原体的物理屏障。为了探究PPPS对肠道黏膜的保护作用,试验的第21天,分别对每组鸡滴鼻100μL106TCID50新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）病毒液,记录攻毒后体重变化及死亡率,并取各段小肠及肺脏采用HE染色观察病理变化,通过q PCR检测肠黏膜病毒载量。结果表明,MPPPS、HPPPS组与LPPPS、PBS组相比,显着减轻由NDV引起的体重降低、病理损伤、病毒载量及死亡率。另外通过感染H9N2病毒探究口服PPPS对呼吸道黏膜的保护作用,在口服40 mg/m L的PPPS剂量7天后,PBS组及PPPS组选取5只鸡分别滴鼻100μL 104TCID50H9N2病毒液,在攻毒后第3、5和7天采集肺脏组织HE染色,通过q PCR检测肺脏病毒量,采用免疫荧光对病毒进行定位并分析荧光强度。结果表明PPPS显着降低肺脏中病毒量,减轻肺脏病理变化。证明PPPS不仅能有效保护肠道黏膜损伤,同样对呼吸道黏膜也具有保护作用。2、PPPS对肠道菌群的影响为了探究PPPS对鸡肠道菌群的影响,在口服PPPS的第21天,收集PBS组及HPPPS组（40 mg/m L）鸡粪便样本,通过16S高通量测序对鸡肠道菌群组成、多样性等方面进行分析研究。结果表明,PBS组与PPPS组的肠道菌群组成存在较大差异,通过Venn图结果表明,PPPS组OTU值显着升高。在门水平上分析,PPPS组的Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）与PBS组相比均有较大变化。在科水平上分析,Lactobacillaceae（乳杆菌科）、Bacteroidaceae（拟杆菌科）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Rikenellaceae（理研菌科）变化较为明显。在属水平上分析,PPPS组与PBS组相比,诸如Enterococcus（肠球菌）、Bacteroides（拟杆菌属）、Alistipes（别样杆菌属）、Helicobacter（螺杆菌属）、Intestinimonas（瘤胃菌属）等均丰度上升。在种水平上分析,Lactobacillus＿reuteri（罗伊氏乳杆菌）,Enterococcus＿cecorum（盲肠链球菌）、Bacteroides＿uniformis、Bacteroides＿thetaiotaomicro（拟杆菌）,Lachnospiraceae＿bacterium＿615、Lachnospiraceae＿bacterium＿M18-1（毛螺菌）,Clostridium＿sp＿AUH-JLC140（梭状杆菌）,Alistipes＿finegoldii（别样杆菌）等丰度上升。在α多样性及UPGMA聚类树等分析发现,PPPS组的菌群物种多样性显着高于PBS组。因此说明PPPS能够改善肠道菌群结构及丰富度。3、PPPS对巨噬细胞的免疫调节作用为了探究PPPS对巨噬细胞HD11的免疫调节作用,首先用CCK-8试剂检测不同浓度的PPPS对HD11细胞的增殖作用,通过中性红及FITC-葡聚糖分析PPPS对HD11细胞的吞噬活性的影响,Griess试剂检测PPPS处理HD11细胞后分泌一氧化氮（NO）水平,荧光探针法测定活性氧（ROS）,ELISA法检测HD11细胞培养液上清液中白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。通过q PCR法检测诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、IL-1β和TNF-α的m RNA水平变化。结果表明,当PPPS浓度高于800μg/m L时,PPPS对HD11细胞增殖具有一定的抑制作用,而在低于400μg/m L时能显着促进增殖效果。因此选用50-400μg/m L浓度范围的PPPS进行后续试验。中性红及FITC-葡聚糖试验显示PPPS均能显着提高HD11细胞吞噬活性,但各浓度间的作用效果无显着差异。PPPS以剂量依赖性方式促进HD11细胞分泌NO、IL-1β、TNF-α,且上调i NOS、IL-1β、TNF-αm RNA水平。通过高通量测序技术,对以200μg/m L PPPS处理24 h的HD11细胞与PBS组细胞进行转录组测序,分析比较差异表达m RNA、mi RNA及信号通路。结果表明,PPPS组有2358个上调表达基因和2028个下调表达基因,其中富集分析与免疫相关主要通路为内吞作用、黏附连接、内质网蛋白质加工、细胞因子-细胞因子受体相互作用、转运蛋白、Toll样受体、MAPK、Notch、C型凝集素受体、NOD样受体、RIG-I样受体等信号通路。mi RNA结果显示10个mi RNA在PPPS组中高表达,21个mi RNA下调表达。KEGG通路富集分析主要通路为内吞作用、紧密连接、溶酶体、黏合连接、细胞粘附分子、内质网蛋白加工、Notch等信号通路。为了探究PPPS作用的HD11细胞的受体以及免疫调节的信号通路,根据转录组结果,我们选择分析验证Toll样受体、MAPK、NF-κB分子对HD11细胞的影响。在PPPS处理HD11细胞后,通过q PCR方法检测Toll样受体2、4（TLR 2、4）、甘露糖受体（MR）和NF-κB分子m RNA水平。TLR4、MAPK三种亚基（p38、JNK、ERK1/2）和NF-κB抑制剂预处理细胞后,Griess法检测NO水平、ELISA法检测IL-1β和TNF-α的分泌量。结果表明,PPPS在不同时间点均上调细胞表面受体TLR4和NF-κB的m RNA水平,证明TLR4是PPPS激活HD11细胞的重要受体,NF-κB是PPPS促进HD11细胞活化的关键核因子。TLR4、MAPK、NF-κB抑制剂均能显着降低HD11细胞NO、IL-1β和TNF-α的分泌量,说明TLR4、MAPK、NF-κB均参与PPPS对HD11细胞的免疫增强作用。结果表明PPPS通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活HD11细胞产生免疫应答。综上所述,PPPS显着促进肠道黏膜免疫功能及小肠绒毛发育,有效减轻由NDV和H9N2引发的肠道及肺脏组织病理损伤,改善肠道菌群丰度且通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活HD11细胞。本课题不仅探究PPPS对鸡黏膜免疫及肠道菌群的影响,而且揭示了对巨噬细胞的免疫调节作用。因此,PPPS作为天然免疫增强剂具有良好的开发潜力和应用前景。
尹起亮[3]（2021）在《IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究》文中研究表明研究背景:随着对肿瘤免疫机制的深入研究,肿瘤免疫治疗成为继手术,化疗,放疗后的又一突破性治疗策略。黑色素瘤免疫治疗是近年来研究的热点,特别是针对细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4,CTLA-4）和程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1,PD-1）的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）,已取得了良好的临床疗效。疫苗作为免疫治疗领域的重要分支,在黑色素瘤中的研究甚少,gp100肽疫苗在体外可产生高水平的循环T细胞,并能识别和杀伤黑色素瘤细胞,但临床疗效仍不理想,因此,有效的肿瘤疫苗可作为黑色素瘤免疫治疗领域的重要补充。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的概念拓宽了我们对黑色素瘤的理解,根据CSCs理论,靶向黑色素瘤干细胞（melanoma stem cells,MSCs）治疗可抑制黑色素瘤的生长并降低肿瘤复发和转移的风险,因此,以MSCs为靶点的肿瘤疫苗将改善目前免疫治疗方案的疗效。然而,利用疫苗刺激机体产生抗肿瘤免疫反应仍然具有很大挑战,单纯的MSCs疫苗尚不足以诱导强烈的抗肿瘤免疫效应,目前在黑色素瘤中的MSCs疫苗研究大多是通过MSCs致敏DCs去诱导保护性抗肿瘤免疫作用,此外,免疫佐剂可增强MSCs疫苗抗肿瘤免疫应答,通过免疫佐剂IL-21基因修饰MSCs作为疫苗免疫小鼠可增强补体依赖的细胞毒活性和NK细胞毒活性。IL-33作为一种多效性免疫效应因子在激活抗肿瘤免疫中发挥重要作用,包括刺激DCs成熟,增强CD8+T细胞和NK细胞肿瘤杀伤作用,增强体内抗原特异性效应T细胞和记忆T细胞免疫反应等,能显着抑制小鼠肿瘤生长和肺转移,同样,IL-33可作为一种有效的免疫佐剂。而利用IL-33修饰的MSCs作为疫苗对黑色素瘤的影响目前尚无报道,其抗肿瘤免疫机制也有待进一步阐释。研究目的:本研究通过制备IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗,旨在研究其抑制黑色素瘤生长和转移的效果,并探索其抗肿瘤的免疫效应机制,为黑色素瘤干细胞疫苗在黑色素瘤免疫治疗中的应用奠定理论和实验基础。研究方法:1.黑色素瘤干细胞疫苗的制备（1）利用免疫磁珠技术分选细胞:利用免疫磁珠从B16F10细胞中分选出B16F10-CD44+CD133+细胞（即黑色素瘤干细胞）和B16F10-CD44-CD133-细胞。（2）分选后黑色素瘤干细胞的鉴定:通过流式细胞术测定分选前后细胞表面CD44,CD133和MHC I的表达;测定细胞克隆形成能力:将分选前后的B16F10和B16F10-CD44+CD133+细胞进行普通的二维（two dimension,2D）和三维（three dimension,3D）培养,观察细胞克隆形成能力;提取分选前后细胞的总RNA,进行RT-q PCR测定干性基因SOX-2,OCT-4和KLF-4的表达。（3）IL-33过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44+CD133+:将状态良好的B16F10-CD44+CD133+接种到6孔盘,第2天加入适当体积的病毒（HBAD-EGFP过表达对照或HBAD-IL33-EGFP）,感染8 h。（4）肿瘤细胞灭活及灭活后鉴定:（1）利用丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）50μg/ml作用肿瘤细胞4 h对其进行灭活,利用MTT法测定不同时间点细胞增殖率;（2）肿瘤细胞经MMC作用后收集细胞上清液,进行酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定IL-33的表达。2.黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价（1）建立预防性动物模型:荷瘤小鼠模型:将不同实验组灭活后的肿瘤细胞（包括等体积PBS）5×105个/次接种于C57BL/6小鼠腹股沟皮下,共免疫3次,每次间隔7天,末次免疫7天后,所有小鼠于背部皮下注射B16F10细胞5×105个,定期测量肿瘤大小;肺转移模型:免疫方式同上,末次免疫7天后,所有小鼠经尾静脉注射5×105个B16F10细胞,观察并记录肺转移情况,记录生存期。（2）肿瘤病理组织学检测:末次免疫后3周,取不同组小鼠肿瘤组织进行病理组织学检测,包括苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,CD8,Ki-67和Caspase-3的免疫组织化学染色。3.黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究（1）疫苗对DCs成熟能力的影响:将小鼠骨髓来源的DCs与不同实验组灭活后的肿瘤细胞（包括等体积PBS）利用悬挂式细胞培养小室间接共培养,共培养4天后,观察DCs形态变化并利用流式细胞术测定细胞表面成熟标志物CD11c,CD80,CD86和MHC II的表达;然后收集DCs并与CFSE标记的脾淋巴细胞以1:10的比例直接共培养6天,通过流式细胞术测定CD8+T细胞CFSE的表达,利用ELISA测定各组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α的分泌。（2）疫苗对脾脏CD8+T细胞的影响:在末次免疫后3周,取不同组小鼠脾脏淋巴细胞,进行流式细胞术,通过测定脾淋巴细胞表面CD3,CD8和CD69的表达检测疫苗对脾脏CD8+T细胞比例及活性的影响;通过测定PD-1,CTLA-4和Tim-3及中心记忆性表型CD44,CD62L和CD127的表达检测疫苗对CD8+T细胞免疫检查点及CD8+中心记忆性T细胞的影响;通过测定细胞内IFN-γ和Gzm B的表达检测疫苗对CD8+T细胞抗肿瘤效应分子表达的影响。（3）疫苗对小鼠脾淋巴细胞杀伤能力的影响:在末次免疫后3周,取不同组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,体外培养的B16F10细胞作为靶细胞;同样,取疫苗组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,B16F10和分选后的B16F10-CD44+CD133+及B16F10-CD44-CD133-细胞作为靶细胞,利用Calcein-AM释放实验测定脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。（4）黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133及MHC I的表达:末次免疫后3周,利用流式细胞术测定不同组小鼠黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133及MHC I的表达。（5）检测小鼠血清细胞因子水平:在末次免疫后3周,取不同组小鼠血清,利用ELISA检测不同组小鼠血清IFN-α,IL-2,TNF-α和IFN-γ的水平。研究结果:利用免疫磁珠技术成功分选出B16F10-CD44+CD133+细胞,其纯度可达到96.14%,并且B16F10-CD44+CD133+细胞的克隆形成能力较强,其干性相关基因SOX-2,OCT-4和KLF-4的表达明显增强,细胞表面MHC I的表达下降。通过IL-33过表达基因腺病毒成功感染B16F10-CD44+CD133+细胞后,利用MMC对其灭活,并测定细胞活性和IL-33的分泌,同时将灭活后的细胞接种到小鼠腹股沟皮下发现未成瘤,最后得到细胞增殖活性受到抑制但仍可分泌IL-33的B16F10-IL-33 CD44+CD133+细胞株,即黑色素瘤干细胞疫苗（以下简称“疫苗”）。在预防性小鼠模型中,疫苗可明显抑制小鼠黑色素瘤生长及肺转移,并诱导黑色素瘤细胞凋亡,荷瘤小鼠模型中疫苗组小鼠中位生存期和总生存期均明显延长（分别为40天和55天）,而在肺转移模型中疫苗组小鼠中位生存期和总生存期的延长时间更加显着（分别为55天和70天）。进一步研究疫苗抗肿瘤的免疫效应机制,我们发现:（1）疫苗可促进小鼠骨髓来源的DCs成熟,诱导DCs成熟标志物表达上调,并且疫苗作用后的DCs可激活CD8+T细胞,包括刺激CD8+T细胞增殖和促进CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α;（2）疫苗免疫小鼠3周后,发现疫苗可增加小鼠脾脏CD8+T细胞比例及活性,并降低免疫检查点的表达,此外,疫苗可诱导脾脏CD8+中心记忆性T细胞的形成并增加CD8+T细胞抗肿瘤效应分子的表达;（3）疫苗免疫小鼠3周后可明显增强小鼠脾脏淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,并且这种杀伤作用特异性强,可靶向杀伤B16F10-CD44+CD133+细胞;（4）疫苗组荷瘤小鼠肿瘤细胞CD44和CD133的表达降低,而MHC I表达增加,并且黑色素瘤组织中CD8+T细胞浸润增加;（5）疫苗可增加免疫后小鼠血清抗肿瘤细胞因子IL-2,IFN-α,TNF-α和IFN-γ的分泌。研究结论:1.从B16F10黑色素瘤细胞成功分选出高纯度、具有干细胞性质的B16F10-CD44+CD133+细胞,并制备出增殖活性受到抑制但仍可分泌IL-33的B16F10-IL-33 CD44+CD133+全细胞疫苗。2.疫苗能明显抑制小鼠黑色素瘤生长和肺转移,诱导肿瘤细胞凋亡,并延长小鼠中位生存期和总生存期。3.疫苗诱导抗肿瘤免疫作用是通过刺激DCs成熟而启动并促进CD8+T细胞增殖,同时抑制CD8+T细胞在体内分化耗竭,诱导记忆性T细胞形成。4.疫苗通过激活宿主体内细胞免疫,增加黑色素瘤组织中CD8+T细胞的浸润,启动细胞毒性T淋巴细胞免疫反应,进而特异性靶向杀伤黑色素瘤干细胞。
王玲[4]（2020）在《下调ROR1对黑色素瘤苗抗瘤效应的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理黑色素瘤（Melanoma）是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤,多发生于皮肤体表,如背部、胳膊和腿等处。在每年确诊的皮肤癌患者中,只有一小部分（3%）患有黑色素瘤,但却造成了绝大数（65%）的死亡。一个世纪前黑色素瘤还是一种罕见的癌症,而目前在许多西方国家,罹患黑色素瘤的风险已达到1/50。近年来,我国黑色素瘤的发病率,死亡率呈不断上升趋势,发病年龄也愈来愈早。据分析,与其他实体瘤不同的是,黑色素瘤的发病率在25-50岁的年轻及中年人之间呈线性增长,然后减缓,黑色素瘤手术切除后由于复发和转移而导致患者死亡,已受到人们的广泛关注。目前,黑色素瘤的治疗手段包括手术,放疗,化疗,靶向治疗等,虽然手术仍然是目前治疗的金标准,但免疫治疗和靶向分子治疗也在转移性黑色素瘤中展现出良好的治疗效果。肿瘤免疫治疗,如免疫检测点阻断、过继性免疫、CAR-T、肿瘤疫苗等,实验和临床研究,已显示出良好的治疗效应。其中,黑色素瘤疫苗研究,多年来也一直在探讨和研制之中。疫苗可以激活机体的特性性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应以及特异性抗体,发挥抑制和杀伤肿瘤细胞的作用。但由于肿瘤细胞免疫原性弱,肿瘤的免疫逃逸机制复杂等原因,疫苗的实际效应和预期结果有很大的差距。为了提高黑色素瘤疫苗的免疫效应,筛选有效的靶抗原,研究者们也在不断努力解决这一关键的科学问题。近来研究显示,受体酪氨酸激酶孤儿样受体1（receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1）分子,是癌症治疗的理想靶点。本实验室在卵巢癌疫苗研究中发现,ROR1是重要的靶抗原,肿瘤细胞疫苗的免疫原性与ROR1表达高低显着相关,但在黑色素瘤疫苗研究中,ROR1分子对疫苗免疫原性影响的相关报道还不深入。为此,本研究从ROR1分子对黑色素瘤苗免疫原性及抗瘤效应的影响及其相关机制进行了初步探讨。目的:探讨下调ROR1表达对小鼠黑色素瘤苗抗瘤效应的影响,并对其分子机制进行初步研究,为验证ROR1作为有效的候选瘤苗靶抗原提供实验依据。方法:1.用构建好的 pHBLV-U6-shROR1-ZSGreen 和 pHBLV-U6-shNC-ZSGreen 重组质粒,分别与辅助质粒psPAX2和PMD2.G共转染HEK293T细胞,包装慢病毒,收集病毒上清并过滤,经高速离心法浓缩慢病毒,用倍比稀释法测定病毒滴度,再用pLV-shROR1和pLV-shNC病毒感染鼠源黑色素瘤B16F10细胞,然后用极限稀释法筛选出稳定下调ROR1分子的阳性单克隆细胞。采用实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blot）在mRNA和蛋白水平上检测ROR1分子的表达。2.探究下调ROR1分子后对B16F10细胞若干生物学特性的影响:CCK8法检测下调ROR1表达后B16F10细胞的增殖情况;Transwell实验和划痕实验检测下调ROR1表达后B16F10细胞的迁移能力;qRT-PCR检测上皮间质转换（EMT）相关蛋白E-cadherin,N-cadherin 和 vimentin 的表达情况。分别将 B16F10 细胞、Scrambled 细胞及Lv-shROR1-B16F10细胞,以1×106细胞/鼠,经左侧腹股沟皮下注射至C57BL/6小鼠体内,实时监测小鼠的生存状态、无瘤生存期、瘤体生长曲线及体重变化等。然后用qRT-PCR和Western Blot在mRNA和蛋白水平上检测黑色素瘤组织中ROR1分子表达;并用 qRT-PCR 检测 E-cadherin,N-cadherin 和 vimentin 的表达。3.分别将 B16F10 细胞、Scrambled 细胞及 Lv-shROR1-B16F10 细胞,以 5×106/mL进行重悬,再反复冻融三次,将其制备成肿瘤疫苗后免疫C57BL/6小鼠三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,用1×106野生型B16F10细胞于背部皮下攻击免疫小鼠。实时观察不同免疫鼠生存状态、出瘤时间、肿瘤体积以及体重变化,评价不同组瘤苗抗瘤效果。并用qRT-PCR和Western Blot在mRNA和蛋白水平上检测瘤组织中ROR1分子的表达;通过流式细胞仪（FCM）分析免疫鼠脾细胞中CD4/CD8 T细胞亚群数量;双抗夹心酶联免疫吸附实验（ELISA）检测瘤苗免疫鼠血清IFN-γ和TGF-β细胞因子水平;台盼蓝染色法计数各瘤苗免疫鼠血清与野生型B16F10细胞共同孵育后活细胞的数量（补体依赖的细胞毒活性,CDC）;FCM检测脾细胞的细胞毒活性和自然杀伤（NK）细胞的杀伤能力。结果:1.经慢病毒包装后得到的慢病毒（将其命名为pLV-shROR1和pLV-shNC）去感染B16F10细胞,再用极限稀释法筛选出pLV-shROR1稳定感染株（将其命名为Lv-shROR1-B16F10 细胞）。qRT-PCR 和 Western Blot 检测结果显示,pLV-shROR1 慢病毒感染B16F10细胞后,ROR1分子表达量显着降低,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。pLV-shNC慢病毒感染B16F10细胞后（将其命名为Scrambled细胞）,ROR1分子表达量与未感染组无明显差异（P>0.05）。2.体外实验结果显示:与野生型B16F10细胞和Scrambled细胞相比,Lv-shROR1-B16F10细胞增殖和迁移能力均有所降低;qRT-PCR结果显示,Lv-shROR1-B16F10细胞中E-cadherin的mRNA表达升高,而N-cadherin和vimentin的mRNA表达降低,差异有统计学意义（P<0.05）。3.体内成瘤实验结果显示:与野生型B16F10细胞和Scrambled细胞相比,Lv-shROR1-B16F10细胞攻击的C57BL/6鼠出瘤时间延迟、肿瘤生长慢且体积小。肿瘤组织中ROR1分子的mRNA和蛋白水平均较低。E-cadherin mRNA含量较高,N-cadherin和vimentin含量较低,差异均有统计学意义（P<0.05）。4.体内瘤苗免疫鼠瘤细胞攻击实验结果显示:经野生型B16F10细胞、Scrambled细胞和Lv-shROR1-B16F10细胞疫苗免疫的小鼠,在B16F10细胞攻击后,B16F10细胞疫苗组和Scrambled细胞疫苗组的抗肿瘤生长效果好,无瘤生存期最长,小鼠肿瘤生长最慢,体积小,而Lv-shROR1-B16F10细胞疫苗组抗瘤效果最差,差异有统计学意义（P<0.05）。在Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠中,血清IFN-γ水平在三组疫苗中最低,脾细胞中NK杀伤能力和脾细胞毒活性最弱;将免疫鼠血清与B16F10细胞共孵育24小时后,CDC活性也最弱,但疫苗免疫鼠血清中TGF-β水平最高。FCM分析结果显示,Lv-shROR1-B16F10免疫鼠脾细胞中CD4/CD8 T细胞亚群的数量显着降低。以上结果与B16F10细胞疫苗组和Scrambled细胞疫苗组相比,差异有显着性意义（P<0.05）。qRT-PCR和Western Blot结果显示,Lv-shROR1-B16F10细胞疫苗组,小鼠肿瘤组织中ROR1 的 mRNA和蛋白水平均较高;E-cadherin的 mRNA水平降低,而N-cadherin和Vimentin的mRNA水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.ROR1分子与促进B16F10细胞增殖、迁移及小鼠致瘤能力相关,下调ROR1分子后,上述生物学特性均有所减弱。2.B16F10细胞疫苗和Scrambled细胞疫苗能诱导免疫鼠产生较强的抗瘤效应,拮抗黑色素瘤生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原诱导强免疫反应相关。下调ROR1分子后,可影响疫苗的免疫效应和抗黑色素瘤效应。以上发现表明:ROR1分子可能是黑色素瘤苗的有效候选靶抗原,在B16F10细胞疫苗中发挥关键的免疫原性作用。
吴迪[5]（2019）在《卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究》文中认为卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占85%-90%。尽管化疗方案不断优化,但是EOC治疗效果却不尽人意,5年生存率仍徘徊于30%-40%,复发率超过60%,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。EOC已成为严重威胁女性生命和健康的恶性肿瘤。癌干细胞（cancer stem cell,CSC）是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、分化、无限增殖等干细胞特性的肿瘤细胞,是肿瘤发生发展的根源,与肿瘤的化疗耐药、转移侵袭以及复发密切相关。所以,探究EOC CSC的特性,寻找针对靶向CSC治疗EOC有效方法,是控制并根治卵巢癌的关键。近年来肿瘤免疫治疗受到高度关注,在基础研究和临床应用研究方面都取得了一些可喜的进展,而针对靶向CSC的免疫治疗目前主要倾向于:靶向CSC表型的免疫治疗、靶向CSC的T细胞过继免疫、靶向CSC的DC疫苗、靶向CSC憩室的免疫治疗、免疫检查点、CSC疫苗等,特别是疫苗研究,因其能激活机体的自然杀伤细胞（NK）和特异性细胞毒性T细胞（CTL）、产生抗肿瘤的保护性抗体等免疫应答,是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗方法。然而,由于肿瘤抗原免疫原性较弱、肿瘤的异质性、肿瘤免疫逃逸机制的复杂性等原因,尽管有众多的可喜研究报道,但肿瘤疫苗的实际疗效与预期效果仍有很大的差距,要作为治疗性肿瘤疫苗用于临床,仍有一些障碍需要克服,关键是如何提高肿瘤疫苗免疫原性,激发宿主免疫反应对瘤细胞免疫攻击。最新研究显示,CSC疫苗因其高表达优势抗原,可引发有效的靶向CSC免疫反应,达到抑制肿瘤生长和转移的效应,更引人关注。本课题组前期研究已发现,CD44+CD117+的EOC SKOV3/HO8910细胞具有CSC特性。因此,本研究将EOC CSC分离出来,采用简捷的工艺方法直接制备溶解完整的CSC疫苗,探究该疫苗抗卵巢癌效应及其机制。目的:探究EOC CSC疫苗在动物体内诱发抗肿瘤效应及其可能机制,为今后临床上使用该疫苗防治卵巢癌提供实验和理论依据。方法:1.通过免疫磁珠分选系统（MACS）从人EOC SKOV3/HO8910两种细胞系中分离出CD117+CD44+CSC,经反复冻融三次将其制备成CSC疫苗再接种到免疫缺陷的裸鼠体内（4×105CD117+CD44+CSC/鼠）,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用5×106个野生型SKOV3/HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。通过观察体内肿瘤生长及各免疫小鼠生存情况,初步评价SKOV3和HO8910 CSC疫苗的抗癌效果。通过流式细胞仪（FCM）分析免疫鼠肿瘤细胞的CD117+CD44+亚群以及I型乙醛脱氢酶高表达(ALDH-1high)细胞群比例;此外,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠外周血清IFN-γ和TGF-β细胞因子水平,细胞杀伤实验测定NK细胞杀伤能力,实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blotting）检测小鼠肿瘤组织中颗粒酶和穿孔素以及NKG2D和MICA的表达水平,初步分析抗瘤效应及其分子机制。同时,经NOD/SCID鼠模型反向验证CSC疫苗的免疫效应。2.因受体酪氨酸激酶孤儿样受体1（ROR1）分子可能是EOC CSC的一种优势抗原,在CSC疫苗激发机体免疫反应中具有重要作用。本研究分别设计针对ROR1基因序列短发夹RNA（shROR1）以及采用Gateway位点专一性重组方法,扩增ROR1序列,分别构建下调或上调ROR1的慢病毒重组质粒（pLV-shROR1或pLV-ovROR1）,进行慢病毒包装,利用倍比稀释法测定病毒滴度,再将含有pLV-shROR1和pLV-ovROR1慢病毒感染细胞,筛选出稳定表达ROR1的细胞克隆并扩大培养。用MACS分离出HO8910-pLV-shROR1 CD117+CD44+CSC（简称HO8910-shROR1 CSC）和HO8910-pLV-ovROR1CD117+CD44+CSC（HO8910-ovROR1 CSC）,用上述同样方法制备成疫苗后接种到免疫缺陷的裸鼠体内,再用5×106个野生型HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。经体内致瘤实验分别评价下调或上调ROR1的HO8910 CSC疫苗的抗癌效果;FCM、ELISA、NK杀伤实验、qRT-PCR、Western blotting等实验进一步分析优势抗原ROR1对HO8910 CSC疫苗抗瘤效应的影响。3.用无血清培养法（SFM）,筛选出鼠源性EOC细胞株ID8卵巢癌干样细胞（OCSC）,取2×105OCSC经反复冻融三次将其制备成疫苗,接种到C57BL/6小鼠体内,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用2×106个野生型ID8细胞皮下攻击免疫小鼠,观察免疫小鼠生存和肿瘤生长情况。继而构建下调ROR1的重组质粒,进行慢病毒包装并使用倍比稀释法测定病毒滴度,将含有pLV-shROR1的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8细胞,用qRT-PCR和Western bloting分析ID8细胞中ROR1分子下调表达情况。再用上述同样方法,在C57BL/6小鼠体内评价ID8-OCSC和ID8-OCSC-shROR1疫苗抗癌效果。采用FCM、ELISA、NK杀伤实验、CD4+T和CD8+T细胞杀伤实验、补体依赖的细胞毒活性（CDC）,qRT-PCR和Western blotting进一步分析疫苗诱发的免疫反应以及抗瘤效应与机制。此外,本研究还进行了用树突状细胞（DC）负载OCSC裂解物用于疫苗实验,试图比较两种方法制备的疫苗在诱导免疫鼠抗EOC效应是否有明显差异。结果:1.疫苗免疫鼠肿瘤体积大小、瘤体生长曲线及小鼠无瘤生存期显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能在无胸腺裸鼠体内中诱导免疫反应,体现在接种CD117+CD44+CSC疫苗的小鼠,与non-CD117+CD44+CSC疫苗组和SKOV3/HO8910细胞疫苗组及PBS组相比,肿瘤形成时间延迟、肿瘤体积较小、荷瘤鼠生存时间延长;血清中IFN-γ水平升高,TGF-β水平降低,且具有较强的NK杀伤活性。这些结果与不同对照组相比,差异有显着性意义（p（27）0.05）。另外,qRT-PCR结果显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗免疫的小鼠肿瘤组织中,具有更高水平的穿孔素和颗粒酶表达;同时,qRT-PCR和Western blotting结果显示,肿瘤组织中具有高水平的NKG2D和MIC A表达（p（27）0.05）。此外,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能够显着地减少小鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC细胞群以及ALDH-1high细胞群比例。结果提示:SKOV3/HO8910CSC疫苗能靶向杀伤EOC CSC,抑制裸鼠体内肿瘤生长;而在NOD/SCID鼠模型因其T和B淋巴细胞严重缺乏,却没有明显抑瘤效应,从而反向证明了CSC疫苗的抗瘤效应是因其诱发免疫效应所致。2.分别筛选出感染pLV-shROR1的HO8910-pLV-shROR1细胞（简称HO8910-shROR1）和过表达ROR1分子的HO8910-pLV-ROR1细胞（简称HO8910-ovROR1）。qRT-PCR和Western blotting分析显示,ROR1分子分别被有效地下调和上调,表明从基因和蛋白水平证实,在HO8910细胞调控ROR1表达成功。HO8910-shROR1或HO8910-ovROR1细胞扩大培养后,经MACS分选出CD117+CD44+CSC,制备疫苗免疫裸鼠结果显示,HO8910-shROR1和HO8910-ovROR1以及HO8910三组CD117+CD44+CSC疫苗,在免疫鼠激发的抗HO8910卵巢癌效应中,HO8910-ovROR1 CSC疫苗抗瘤效果最强,小鼠肿瘤生长最慢,体积最小,无瘤生存期最长,HO8910 CSC疫苗次之（p（27）0.05）,HO8910-shROR1疫苗最低（p（27）0.05）。ROR1高表达的HO8910-ovROR1 CSC疫苗免疫鼠,在三组疫苗免疫鼠中,血清IFN-γ和抗ROR1水平最高,而TGF-β水平最低;同时,NK杀伤能力也最强。qRT-PCR结果显示HO8910-ovROR1 CSC疫苗组,小鼠肿瘤组织中含有较高水平的颗粒酶和穿孔素,qRT-PCR和Western blotting显示,表达高水平NKG2D和MIC A（p（27）0.05）。此外,以HO8910-ovROR1 CSC为基础的疫苗能够更明显地下调裸鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC亚群以及ALDHhigh细胞群的比例。以上结果证实:ROR1分子可能是EOC CSC疫苗的优势抗原,在HO8910 CSC疫苗中发挥关键的免疫原性作用。3.ID8-OCSC疫苗在C57BL/6小鼠体内抗肿瘤实验结果显示,从肿瘤生长速度、肿瘤大小以及无瘤生存期显示方面,明显优于非ID8-OCSC疫苗组,差异有统计学意义（p<0.05）。将ROR1分子下调后,ID8-OCSC-shROR1疫苗组小鼠的抗肿瘤效应显着弱于ID8-OCSC疫苗组（p<0.05）,且NK细胞和脾细胞杀伤能力、抗体水平、CDC活性、血清IFN-γ水平等均显着下降（p<0.05）,但TGF-β水平则升高（p（27）0.05）。对ID8-OCSC疫苗激发免疫鼠脾脏T细胞功能检测显示,分离的CD4+T和CD8+T细胞对靶细胞杀伤实验与与ID8-OCSC-shROR1疫苗相相比,ID8-OCSC疫苗免疫鼠的CD4+T和CD8+T杀伤能力最强,特别是CD8+T的杀伤能力更为明显。qRT-PCR分析显示,ID8-OCSC疫苗组瘤组织中颗粒酶和穿孔素分子表达高于ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组;同时,NKG2D和MIC A的水平也高于其他对照组,差异有显着性意义（p（27）0.05）。此外,FCM分析肿瘤组织中ALDHhigh细胞群比例明显减少,而ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组依次增高,提示ID8-OCSC疫苗能诱导免疫鼠靶向杀伤OCSC。该结果不仅说明ID8 OCSC疫苗有较强的抗肿瘤免疫效应,而且进一步证实ROR1分子可能是ID8 OCSC疫苗的优势抗原,当其下调后,在C57BL/6小鼠诱发抗肿瘤免疫效应也随之减弱。此外,反复冻融OCSC制备的疫苗与反复冻融OCSC负载DC制备的疫苗诱导小鼠的抗EOC效应相似,虽略有差异,但无统计学意义。结论:1.人源性EOC SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能诱导免疫鼠产生抗肿瘤效应,拮抗卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原诱导强免疫反应相关,下调或上调ROR1分子表达,可影响CSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。2.鼠源性ID8 OCSC疫苗能诱发C57BL/6免疫鼠产生免疫效应而抑制卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原相关,下调ROR1分子表达,可影响ID8 OCSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。3.本研究制备的EOC CSC疫苗有效地增强免疫鼠产生抗肿瘤效应,这为临床上应用CSC疫苗免疫防治EOC提供了科学的实验依据。
龚桂萍[6]（2018）在《枸杞多糖的分步沉淀法纯化及各组分理化性质和生物活性研究》文中进行了进一步梳理枸杞是我国传统的药食两用植物,主要分布于我国西北地区。现代药理研究表明,多糖是枸杞主要的活性成分之一,具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、免疫调节等生物活性。传统的枸杞多糖分离纯化方法为柱层析色谱法,操作复杂、得率低、部分糖组分丢失。现有的枸杞多糖活性研究以粗多糖活性为主,很难确定主要的活性成分,限制构效关系研究。本研究首次采用分步沉淀法分离纯化枸杞多糖,得到枸杞多糖所有组分,系统地评价枸杞多糖各组分的理化性质和生物活性,为进一步全面研究枸杞多糖的构效关系奠定基础,并为枸杞的综合开发利用提供科学依据。主要研究结果如下:1.枸杞经水提、醇沉、除蛋白透析、冷冻干燥得枸杞粗多糖,再经(8-14 kDa MWCO透析得到大分子LBP-I和小分子LBP-O。LBP-I经分步沉淀得到LBP-I-1、LBP-I-2和LBP-I-3三个多糖组分。LBP-I-1、LBP-I-2和LBP-I-3分别经分子筛柱层析分离纯化,得到三个较纯枸杞多糖组分LBGP-I-1、LBGP-I-2和LBGP-I-3。2.运用气相色谱法、高效凝胶渗透色谱法、红外光谱法等技术手段分析枸杞多糖各组分理化性质。研究结果表明:LBP-O单糖组成主要为葡萄糖（72.8%）;LBGP-I-1（分子量3.19 × 104 Da）单糖组成主要为阿拉伯糖（21.95%）,葡萄糖（51.22%）和半乳糖（17.07%）;LBGP-I-2（分子量2.92 × 104 Da）单糖组成主要为阿拉伯糖（19.35%）,葡萄糖（32.26%）和半乳糖（35.48%）;LBGP-I-3（分子量9.12 × 104 Da）单糖组成主要为阿拉伯糖（48.15%）和半乳糖（44.44%）,属于阿拉伯半乳聚糖型多糖。苯酚硫酸法测得糖含量依次为71.56%、36.23%、55.52%和81.42%,考马斯亮蓝法测得蛋白含量依次为1.56%、60.54%、40.1%和18.5%。3.通过还原力、自由基清除能力和对H2O2诱导HepG2损伤的抑制作用三方面考察枸杞多糖各组分抗氧化活性。结果显示,枸杞多糖抗氧化活性最强组分为小分子LBP-O,还原力为1.23,DPPH·自由基清除能力为95.34%,O2-·自由基清除能力为74.65%,H2O2诱导HepG2细胞经LBP-O处理,细胞活力为96.32%。表明LBP-O是抗氧化活性主要活性成分。4.采用脾淋巴细胞巨噬细胞评价枸杞多糖各组分的免疫活性。结果显示,枸杞多糖促进体外脾淋巴细胞和LPS或ConA诱导的脾淋巴细胞增殖作用最强组分为阿拉伯半乳聚糖组分,脾细胞增殖指数分别为1.56、1.94、2.3;枸杞多糖对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力,酸性磷酸酶活力和NO释放量作用最强组分为阿拉伯半乳聚糖组分,阿拉伯半乳聚糖处理的RAW264.7吞噬指数、酸性磷酸化酶活力、NO释放量分别1.9、1.55和22.85μM。表明阿拉伯半乳聚糖组分（LBGP-I-3）是免疫调节主要活性成分。5.枸杞多糖对癌细胞生长的抑制作用最强组分为阿拉伯半乳聚糖,阿拉伯半乳聚糖对MCF-7细胞生长的抑制率为53.21%,进一步研究阿拉伯半乳聚糖抑制MCF-7生长的作用机制,结果表明阿拉伯半乳聚糖抑制MCF-7生长是通过阻滞MCF-7细胞周期于G0/G1期,改变线粒体功能,激活氧化应激,调节MAPKs信号通路实现的。
宋成程[7]（2017）在《基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究》文中研究表明肿瘤的发生常伴随糖基化的改变。肿瘤相关糖抗原（Tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs）广泛表达于多种肿瘤细胞,是治疗及预防肿瘤的优选靶标。但其容易被免疫系统识别为自身抗原,诱发免疫耐受。因此,本论文通过抗原结构修饰提高抗原的免疫原性及内源佐剂疫苗促进免疫应答两种策略,对结构修饰的TACA缀合物疫苗及构建的内源佐剂疫苗进行了抗肿瘤活性及免疫活性的研究。基于交叉反应的结构修饰策略是将天然糖抗原进行结构修饰,其诱导的抗体,不仅识别修饰的抗原,同时可以识别天然抗原,从而提高免疫原性,打破免疫耐受。因此本论文第一部分研究了结构修饰的TACAs的免疫活性及抗肿瘤活性。佐剂具有促进肿瘤疫苗提高免疫原性、打破自身对肿瘤细胞的免疫耐受的特征。将抗原与佐剂两部分共价偶联成为一个分子,能够提高抗原提呈细胞的利用率,避免高毒性佐剂的使用,同时能引起有效的免疫应答。合成内源佐剂疫苗是一种很好的提高抗肿瘤糖疫苗免疫应答的策略。因此,本文第二部分构建了几种内源佐剂疫苗并研究了其免疫活性。具体研究内容及结果如下:第一部分:通过还原胺化法将肿瘤相关糖抗原Tn及修饰的Tn抗原与载体蛋白白喉毒素突变体（Cross reactive material of diphtheria toxin,CRM197）共价偶联,在C34佐剂辅助下免疫健康小鼠。结果显示N-氟乙酰基修饰的Tn-CRM197（S6-CRM197）可以诱发机体产生更高的针对Tn的IgG抗体,且血清抗体能够更好的与肿瘤细胞结合;能促进小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ。在Tn上验证了氟修饰对于抗肿瘤糖疫苗的潜在应用价值,接下来我们研究了基于氟修饰的三种STn衍生物（Y2、Y3、Y4）与蛋白的缀合疫苗的抗肿瘤活性及机理。首先构建小鼠CT-26结肠癌肺转移模型,免疫糖蛋白缀合疫苗Y1-KLH（STn-KLH）、Y2-KLH、Y3-KLH、Y4-KLH。结果显示Y4-KLH在佐剂辅助下可以有效的抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期。抗肿瘤机制研究显示:Y4-KLH可以诱导强烈的抗STn的IgG抗体,能够识别STn抗原阳性的肿瘤细胞,并且可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒及补体依赖的细胞毒裂解STn抗原阳性的肿瘤细胞。Y4-KLH可以刺激抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN-γ,促进细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）的免疫应答。Y4-KLH产生混合的Th1/Th2型应答,并且比Y1-KLH更早的产生Th1型应答。免疫Y2-KLH能够诱发机体产生强烈的体液免疫应答及较弱的细胞免疫应答;免疫Y3-KLH能够诱导弱的细胞免疫应答但不能引起强的STn特异性抗体免疫应答。不加佐剂辅助或在构建的小鼠腋下荷瘤模型上,疫苗Y4-KLH都呈现一定程度的抗肿瘤效果。接下来选用CRM197作为载体蛋白,研究Y4-CRM197结合不同佐剂在健康小鼠上引发的免疫应答。结果显示在无佐剂辅助或C34佐剂辅助疫苗应答的情况下,用Y4-CRM197免疫健康小鼠可以提高机体的体液免疫应答。在弗氏佐剂存在的情况下,免疫Y4-CRM197能够提高机体的细胞和体液免疫应答。在小鼠结肠癌肺转移模型上,C34作为佐剂,疫苗Y4-CRM197与Y1-CRM197相比,虽然抗肿瘤效果没有明显差别,但疫苗Y4-CRM197能够提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力,提高Th1型免疫应答,同时促进体液免疫应答。第二部分:α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide,αGC）是NKT细胞的快速激活剂,MUC1是肿瘤相关的糖肽抗原。本文首次将αGC与MUC1共价偶联,进行免疫活性研究。结果显示αGC-MUC1可以活化DC及iNKT细胞,释放大量的IFN-γ及IL-4;提高CD4+T细胞的含量且提高CTL活性;活化B细胞,促进机体产生快速且强烈的抗原特异性的抗体应答,产生多种抗原特异性的IgG亚型,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。寡核苷酸CPG1826是Toll样受体9（Toll like receptor 9,TLR9）的激动剂,将MUC1与CPG1826共价偶联同样可以激活DC及iNKT细胞;促进CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量;可以促进机体产生快速且强烈的抗体应答;提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。首次将αGC及CPG1826同时与MUC1共价偶联,免疫活性结果显示其可以激活DC及iNKT细胞,促进机体释放IFN-γ及IL-4。能够提高CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量,促进脾淋巴细胞释放细胞因子IFN-γ。可以促进机体产生快速的抗体应答,活化B细胞,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。综上所述,本文基于具有交叉反应的抗原修饰策略,在肿瘤模型上证明了氟修饰的STn作为候选抗肿瘤疫苗的应用价值,为抗肿瘤糖疫苗提供了候选分子,为氟修饰TACA作为候选抗肿瘤疫苗的应用奠定了基础;首次将αGC与肿瘤相关的糖肽抗原表位共价偶联,应用在抗肿瘤内源佐剂疫苗中;也首次将αGC及CPG1826同时与抗原表位共价偶联,为基于内源佐剂抗肿瘤疫苗策略的研究提供了新的思路。
白雪[8]（2017）在《常春藤皂甙元抗肝癌作用研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（Hepatocellμlar Carcinoma,HCC）（简称肝癌）的发病率在所有恶性肿瘤中排在第二位,仅次于肺癌,其发病率因地区不同而有所差异,发达国家明显低于发展中国家,亚洲国家的发病率高于美国和西欧国家,在我国其发病率已超过25/10万,其中高发区之肝癌标准化发病率达49.17/10万人口。据统计,我国每年新增近30余万肝癌患者,占全世界每年新增肝癌患者的一半。另外,我国每年死于肝癌的病人约为30万人,患者5年生存率仅为2.7%。肝癌患病一般不易察觉、且发展迅速,患者的生存期短、后期生存质量较差。早期肝癌的治疗以手术治疗为首选并辅以放射疗法和或化学疗法;中晚期肝癌及转移性肝癌以放射疗法和或化学疗法为主,一般不建议手术。近年来,随着中药抗肿瘤研究的兴起,天然植物药在癌症治疗中受到了广泛的关注。在前期研究工作中,笔者曾对八月札水提物的抗肝癌作用进行了初步的研究,发现其能够明显降低H22荷瘤小鼠体内肿瘤的重量,对肝癌细胞的生长和增殖具有显着的抑制作用。同时,八月札水提物还能够显着提高H22荷瘤小鼠的免疫水平,提高机体抗氧化应激、清除自由基和维持内环境活性氧动态平衡的能力。由此推测,八月札水提物可能通过诱导肝癌细胞凋亡和上调机体免疫水平而发挥抗肿瘤作用。本研究将八月札的主效成份常春藤皂甙元（Hederagenin,HD）作为研究对象,并通过H22荷瘤小鼠体内试验和Hep G2细胞体外培养试验,应用MTT、RT-PCR、免疫荧光、Western Blot、AO/EB凋亡染色、Hoechst33342凋亡染色、酶联免疫吸附试验、NK细胞活性检测以及流式细胞术等方法,试图探讨HD抗肝癌作用及在肿瘤细胞调控、诱导细胞凋亡和免疫调节等方面的作用及相关机制,并获得如下结果。1.在HD对H22荷瘤小鼠抗肝癌作用的研究中,首先建立H22荷瘤小鼠模型,随机分为5组,每组12只,即对照组、环磷酰胺（CTX）阳性对照组、HD低剂量组（100mg/Kg）、HD中剂量组（200 mg/Kg）和HD高剂量组（400 mg/Kg）。经不同剂量的HD连续干预H22荷瘤小鼠14 d后,可观察到H22荷瘤鼠肿瘤组织的生长和增殖受到明显的抑制,小鼠的生存状态和生命体征与对照组比较得到明显的改善。HD各试验组（100mg/Kg、200 mg/Kg和400 mg/Kg）均能显着地抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长（P<0.01）,肿瘤抑制率分别为29.67%、42.75%和40.26%。通过HE染色观察H22荷瘤小鼠肝脏和肾脏的组织结构,以及对肝和肾功能相关指标的检测,发现HD对小鼠无明显的毒副作用。通过免疫荧光法检测各试验组H22荷瘤小鼠肿瘤组织中突变型P53、P21和Bcl-2蛋白的表达情况,研究结果显示,对照组小鼠的肿瘤组织中突变型P53和Bcl-2蛋白呈高表达,而P21蛋白则相反呈现低表达。经HD和CTX处理后的小鼠肿瘤组织中突变型P53和Bcl-2蛋白的表达显着降低（P<0.01）,而P21蛋白的表达则显着升高（P<0.01）。以上结果揭示HD可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。2.在HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡作用研究中,应用免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术,对肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8基因在转录和翻译水平的表达进行了研究。与对照组比较,HD各试验组H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中Bcl-2在转录和翻译水平的表达均显着降低（P<0.01）,而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3、Caspase-8在转录和翻译水平的表达均显着升高（P<0.01）。以上结果揭示HD可能通过激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。3.在HD对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响研究中,通过分析HD治疗前后小鼠免疫器官组织结构和功能的变化,发现HD各试验组均可以明显的改善H22荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数（P<0.05）,初步判定HD能够促进H22荷瘤小鼠胸腺和脾脏两大免疫器官的修复。同时,HD能够显着提高H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖能力（P<0.01）,显着提高小鼠免疫器官中的NK细胞的杀伤能力（P<0.05）;HD能够显着增加CD4+T淋巴细胞的数量,提升CD4+/CD8+的比值（P<0.05）,表明HD能通过调节T淋巴细胞亚群的数目和比例进而改善细胞免疫应答。另外,HD还能够调节H22荷瘤小鼠外周血中IL-2和TNF-α的表达水平,尤其HD 200 mg/Kg和400 mg/Kg组作用显着（P<0.05）。以上结果揭示HD可能通过修复免疫器官、调控细胞免疫应答和改善细胞因子水平而发挥抗肿瘤作用。4.在HD体外抑制Hep G2细胞作用的研究中,经不同浓度的HD（浓度为0、30、60、90、120和180μg/m L）干预Hep G2细胞24 h和48 h后,HD对Hep G2细胞增殖的抑制作用不断增强,并呈剂量时间依赖关系。HD各试验组对Hep G2细胞的生长和增殖均表现出显着的抑制作用,差异具有统计学意义（P<0.01）;24 h的抑制率分别为5.26%、8.73%、11.00%、16.44%和27.72%;48 h的抑制率分别为1.80%、11.01%、19.38%、27.76%和42.01%。经HE染色和激光共聚焦检测,HD干预48 h后,Hep G2细胞呈煎蛋样改变,出现膜小泡和凋亡小体,核染色质分布不均匀,并且核膜破损,呈典型的细胞凋亡形态学改变。另外,通过Annexin V–FITC双染观察,经HD处理48 h后,Hep G2细胞出现明显的细胞凋亡现象,进一步证明了HD能够诱导Hep G2细胞发生凋亡。当浓度为120和180μg/m L时,HD诱导Hep G2细胞的发生凋亡的百分比分别为12.10%和17.90%,显着高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果揭示HD可能是通过诱导Hep G2细胞凋亡而发挥其抗肝癌作用。5.在HD体外诱导Hep G2细胞凋亡机制的研究中,应用免疫荧光和Western blot技术,对Hep G2细胞中突变型P53、Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8的表达变化情况进行研究。与对照组比较,经HD处理的Hep G2细胞中突变型P53和Bcl-2蛋白的表达水平明显降低（P<0.01）,而Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达显着升高（P<0.01）,进一步表明HD诱导Hep G2凋亡作用可能与其激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关。本研究通过动物模型体内试验和细胞培养体外试验两个途径,探讨了HD对H22荷瘤小鼠和Hep G2细胞的抗肿瘤作用及相关机制,通过药理学、病理学、生物化学和分子生物学等相关技术和方法,对与肿瘤发生和发展密切相关的细胞因子、m RNA、蛋白和细胞凋亡（细胞凋亡相关调控通路）等指标进行了系统的检测和分析,证实HD在体内和体外均具有明显的抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用,这可能与HD能够激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关,通过本研究可以为临床使用HD协助治疗肝癌提供理论和试验依据。
黄招琴[9]（2016）在《卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响》文中研究说明恶性肿瘤严重危害人类健康,目前常规的手术和放化疗等治疗方法均不能彻底清除体内的癌细胞,体内回输免疫活性细胞的过继免疫治疗法可以直接杀伤肿瘤细胞,还可调节和增强机体免疫力,从而成为肿瘤治疗的重要辅助手段。其中,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）是近年来发现的一种新型过继免疫抗肿瘤细胞,它是从人血液分离出来的单核淋巴细胞经IL-2、CD3单抗等细胞因子诱导培养产生的以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群,兼具T淋巴细胞强大抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤功能。CIK细胞的增殖和杀瘤活性依赖于多种细胞因子及外源因子的刺激,何种因子组合为最佳还有待研究。卡介菌多糖核酸是一种新型免疫调节剂,它能提高机体免疫力,诱导多种免疫细胞的活化,并且辅助提高肿瘤治疗。目前国内外还没有BCG-PSN联合CIK进行研究的相关报道,因此本论文将两者结合起来研究。在CIK细胞的培养过程中加入卡介菌多糖核酸,研究其对CIK细胞体外增殖及杀瘤活性方面的影响,并且初步探讨了卡介菌多糖核酸可能从哪些方面改变CIK细胞毒活性。首先,本研究采用CCK-8法检测了不同浓度的卡介菌多糖核酸对CIK细胞增殖以及对CIK杀伤肝癌细胞系SMMC-7721效果的影响,结果发现,10μL/m L的卡介菌多糖核酸能够显着促进CIK细胞的体外增殖活性及杀瘤活性,且杀伤效果随着效应细胞/靶细胞比例的增加也逐渐增强。然后,运用荧光定量PCR检测了Perforin、Granzyme B、INF-γ、TNF-a、TNF-β、Fas这几种重要的CIK毒活性因子m RNA的表达,结果显示卡介菌多糖核酸处理后的CIK细胞Perforin、Granzyme B、INF-γ、TNF-a、TNF-β、Fas m RNA的表达相比对照组都有明显提高。接着,我们用ELISA检测了CIK细胞INF-γ、TNF-a的分泌量,结果表明卡介菌多糖核酸处理后的CIK细胞INF-γ、TNF-a释放量相比对照组有增加。最后,采用流式细胞术检测了CIK不同淋巴亚群的含量,发现卡介菌多糖核酸处理后的CIK细胞表面CD3+CD4+、CD3+CD56+抗原分子含量显着提高。总之,本研究证实卡介菌多糖核酸能剂量依赖性促进CIK细胞增殖,又能提高CIK的杀瘤效果,说明卡介菌多糖核酸可以作为一种较好的免疫佐剂来辅助提高CIK过继免疫治疗。另外CIK细胞杀瘤效率提高的同时其相关毒活性因子的表达与释放都增加,揭示其可能是杀伤肿瘤细胞的途径之一,这也可以为进一步研究CIK杀伤肿瘤细胞机制奠定基础。这些结果可为探讨如何培养出更具有高效杀瘤活性又能大量扩增的CIK细胞提供参考,为抗肿瘤过继免疫治疗提供一些新的思路。
吕爽[10]（2014）在《人参皂苷Rh2衍生物体外促进IFN-γ分泌及CTLL-2细胞增殖的作用研究》文中研究表明背景：人参皂苷Rh2是中国传统中药人参中的主要活性成分，具有优异的免疫调节、抗炎、抗疲劳、抗肿瘤等药理作用。然而因其难溶于水,限制了体外实验中可应用的最大浓度，人参皂苷Rh2的生物活性在实际应用和生产研究中受到严重的制约。为了提高Rh2的水溶性和生物活性，本室制备了人参皂苷Rh2的硫酸化修饰产物Rh2-B1和Rh2-B2。两种衍生物的水溶性都获得大幅提高。在本论文中，我们研究了Rh2-B1对细胞毒性T细胞系CTLL-2细胞的作用，细胞毒性T细胞因其能够保护机体免受病毒感染而成为近年来研究的热点，此外，我们还探讨了Rh2影响CTLL-2细胞增殖和发挥免疫功能的分子机制。目标：我们的目标是调查Rh2-B1对干扰素-（γInterferon-γ, IFN-γ）的分泌和细胞增殖的影响，并研究其可能的机制。材料与方法：酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,ELISA）被用于检测IFN-γ在全血培养上清和CTLL-2细胞培养上清液中的浓度。噻唑蓝染色法（MTT Cell Proliferation Assay，MTT）被用来检测CTLL-2细胞的增殖情况。蛋白免疫印迹试验（Western blot）被用来评价CTLL-2细胞中信号转导通路相关蛋白表达量及其活化程度的变化。结果：我们的研究证明，Rh2-B1能够显着提高Balb/c小鼠全血培养上清中IFN-γ的水平。在此之后，我们评估了Rh2-B1对CTLL-2这种细胞毒性T细胞的增殖、IFN-γ的分泌情况的影响，并研究了其作用机制。Rh2-B1刺激了CTLL-2细胞的增殖和IFN-γ的分泌，还能够介导丝裂原活化蛋白激酶p38（p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）和胞外信号调节激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）的表达和活化，但对淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck or p56Lck）和信号转导及转录激活因子（Signal transducers and activators oftranscription5，STAT5）的表达呈现抑制作用。这种作用能够被特异性的p38MAPK抑制剂SB203580和特异性ERK抑制剂U0126阻断。结论：Rh2-B1能够通过激活p38MAPK和ERK依赖的信号通路进而刺激细胞毒性T细胞的增殖和IFN-γ的分泌。这可能成为一种新的病毒感染治疗潜在药物。
二、人参皂甙和肿瘤坏死因子对小鼠脾细胞抗体依赖细胞介导的细胞毒活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人参皂甙和肿瘤坏死因子对小鼠脾细胞抗体依赖细胞介导的细胞毒活性的影响（论文提纲范文）
（2）松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 松花粉及多糖概述 |
| 2 多糖的生物活性 |
| 2.1 多糖的免疫调节活性 |
| 2.2 多糖的抗病毒活性 |
| 2.3 多糖的抗肿瘤活性 |
| 2.4 多糖的其他生物学活性 |
| 3 黏膜免疫 |
| 3.1 肠道黏膜免疫屏障 |
| 3.2 多糖对肠道黏膜免疫的影响 |
| 4 肠道菌群 |
| 4.1 肠道菌群高通量测序 |
| 4.2 多糖对肠道菌群的影响 |
| 5 巨噬细胞 |
| 5.1 多糖对巨噬细胞的免疫调节活性 |
| 5.2 巨噬细胞表面受体 |
| 5.3 多糖对巨噬细胞的免疫调节信号转导途径 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 松花粉多糖对黏膜免疫的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖 |
| 1.1.2 实验动物及毒株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 多糖溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组及处理 |
| 1.2.2 体重及免疫器官称重 |
| 1.2.3 外周血淋巴细胞转化率测定 |
| 1.2.4 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量检测 |
| 1.2.5 SIg A含量测定 |
| 1.2.6 血清中IgG含量的检测 |
| 1.2.7 qPCR检测肠道黏膜细胞因子 |
| 1.2.8 qPCR检测肠道黏膜免疫相关分子 |
| 1.2.9 PPPS对肠绒毛结构的影响 |
| 1.2.10 PPPS的攻毒保护作用 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PPPS对体重及免疫器官的影响 |
| 2.2 PPPS对外周血淋巴细胞转化率的影响 |
| 2.3 PPPS对外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞含量变化的影响 |
| 2.4 PPPS对肠道黏膜SIgA和血清IgG的影响 |
| 2.5 PPPS对肠道黏膜细胞因子的影响 |
| 2.6 PPPS对肠道黏膜免疫相关分子mRNA的影响 |
| 2.7 PPPS对肠绒毛结构的影响 |
| 2.7.1 PPPS对十二指肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.7.2 PPPS对空肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.7.3 PPPS对回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.8 PPPS对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.1 口服PPPS7 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.2 口服PPPS14 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.3 口服PPPS21 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.9 PPPS对 NDV攻毒保护作用 |
| 2.9.1 攻毒后PPPS对体重及存活率的影响 |
| 2.9.2 攻毒后PPPS对肠道黏膜中病毒载量的影响 |
| 2.9.3 攻毒后肠道黏膜及肺脏组织学观察 |
| 2.10 PPPS对 H9N2 攻毒保护作用 |
| 2.10.1 攻毒后PPPS对肺脏病理变化影响 |
| 2.10.2 攻毒后PPPS对肺脏中病毒载量的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 第三章 松花粉多糖对鸡肠道菌群的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖及溶液配制 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 样本DNA提取 |
| 1.2.3 PCR扩增与产物纯化 |
| 1.2.4 生物信息学和统计分析 |
| 1.2.5 测序数据质量优化 |
| 1.2.6 OTU聚类及Venn图绘制 |
| 1.2.7 物种相对丰度图及热图 |
| 1.2.8 α多样性及UPGMA聚类树分析 |
| 1.2.9 qPCR验证测序结果 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 数据质量分析 |
| 2.2 基于OTU的 Venn图 |
| 2.3 物种相对丰度图 |
| 2.4 α多样性指数分析 |
| 2.5 等级聚类曲线 |
| 2.6 稀释曲线 |
| 2.7 UPGMA聚类树 |
| 2.8 qPCR验证 |
| 3 分析与讨论 |
| 第四章 松花粉多糖对巨噬细胞的免疫调节作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖及溶液配制 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 巨噬细胞的复苏与培养 |
| 1.2.2 PPPS对 HD11 细胞增殖的影响 |
| 1.2.3 PPPS对 HD11 细胞吞噬作用的影响 |
| 1.2.4 PPPS对 HD11 细胞活性氧水平的影响 |
| 1.2.5 PPPS对 HD11 细胞分泌NO的影响 |
| 1.2.6 PPPS对 HD11 细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响 |
| 1.2.7 细胞总RNA提取及质量检测 |
| 1.2.8 mRNA测序及数据分析 |
| 1.2.9 miRNA测序及数据分析 |
| 1.2.10 PPPS对 HD11 细胞受体的影响 |
| 1.2.11 MAPK抑制剂对HD11 细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β的影响 |
| 1.2.12 PPPS对 HD11 细胞NF-κB分子的影响 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PPPS对 HD11 细胞的免疫增强作用 |
| 2.1.1 PPPS对 HD11 细胞增殖作用 |
| 2.1.2 PPPS对 HD11 细胞吞噬作用的影响 |
| 2.1.3 PPPS对 HD11 细胞释放ROS的影响 |
| 2.1.4 PPPS对 HD11 细胞释放NO和 i NOS mRNA水平的影响 |
| 2.1.5 PPPS对 HD11 细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.2 PPPS对 HD11 细胞免疫调节作用转录组分析 |
| 2.2.1 测序数据与参考序列比对结果 |
| 2.2.2 皮尔逊相关系数和PCA分析结果 |
| 2.2.3 DEGs的鉴定和分析 |
| 2.2.4 DEGs的 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.5 差异表达mRNA qPCR验证 |
| 2.2.6 miRNA测序分析及测序数据质量 |
| 2.2.7 miRNA差异表达鉴定和分析 |
| 2.2.8 miRNA靶基因的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.9 差异表达miRNA的 qPCR验证 |
| 2.3 PPPS对 HD11 细胞受体的影响 |
| 2.3.1 PPPS对 HD11 细胞受体TLR2、4、MR的影响 |
| 2.3.2 TLR4 抑制剂抑制HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 2.4 MAPK抑制剂抑制PPPS诱导HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 2.5 PPPS对 HD11 细胞NF-κB分子的影响 |
| 2.5.1 PPPS上调HD11 细胞NF-κB分子mRNA水平 |
| 2.5.2 NF-κB抑制剂抑制HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 3 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑色素瘤 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 治疗现状 |
| 1.1.3 免疫治疗 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.2.1 肿瘤干细胞一般特征 |
| 1.2.2 黑色素瘤中的肿瘤干细胞研究 |
| 1.2.3 肿瘤干细胞——肿瘤免疫治疗的新靶点 |
| 1.2.4 肿瘤干细胞疫苗——靶向肿瘤干细胞免疫治疗 |
| 1.2.5 靶向肿瘤干细胞多种免疫治疗潜在机制 |
| 1.2.6 肿瘤干细胞疫苗潜在的抗肿瘤免疫机制 |
| 1.2.6.1 树突状细胞的作用 |
| 1.2.6.2 抗肿瘤特异性T细胞的作用 |
| 1.3 IL-33 |
| 1.3.1 IL-33 的免疫调节作用 |
| 1.3.2 IL-33 在肿瘤免疫中的作用 |
| 1.3.2.1 IL-33 对DCs的作用 |
| 1.3.2.2 IL-33 对CD8~+T细胞的作用 |
| 1.3.2.3 IL-33 在肿瘤疫苗中的潜在作用 |
| 1.3.3 IL-33 在黑色素瘤中的研究 |
| 第2章 研究方案 |
| 2.1 黑色素瘤干细胞疫苗的制备 |
| 2.2 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价 |
| 2.3 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要试剂的配制 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.1.5 实验相关细胞株 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞复苏、培养及冻存 |
| 3.2.2 利用免疫磁珠技术分选细胞 |
| 3.2.3 测定细胞克隆形成能力 |
| 3.2.4 总RNA的提取与逆转录 |
| 3.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-q PCR)检测细胞的干性 |
| 3.2.6 流式细胞术测定细胞表面MHC I的表达 |
| 3.2.7 IL-33 过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44~+CD133~+ |
| 3.2.8 肿瘤细胞灭活及细胞灭活后鉴定 |
| 3.2.9 酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)测定IL-33 的表达 |
| 3.2.10 建立预防性动物模型 |
| 3.2.11 肿瘤病理组织学检测 |
| 3.2.12 DCs的诱导及鉴定 |
| 3.2.13 检测疫苗促DCs成熟能力 |
| 3.2.14 小鼠脾脏淋巴细胞的分离及脾脏中CD8~+T细胞比例及活性测定 |
| 3.2.15 小鼠脾脏淋巴细胞CFSE染色 |
| 3.2.16 检测疫苗对DCs激活CD8~+T细胞能力的影响 |
| 3.2.17 测定疫苗对CD8~+T细胞免疫检查点及CD8~+记忆性T细胞的影响 |
| 3.2.18 检测疫苗对CD8~+T细胞抗肿瘤效应分子的影响 |
| 3.2.19 测定小鼠脾淋巴细胞的杀伤能力 |
| 3.2.20 测定黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133的表达 |
| 3.2.21 检测小鼠血清细胞因子水平 |
| 3.2.22 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 黑色素瘤干细胞疫苗的制备 |
| 4.1.1 B16F10-CD44~+CD133~+黑色素瘤干细胞的鉴定 |
| 4.1.2 IL-33 过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44~+CD133~+细胞 |
| 4.1.3 黑色素瘤干细胞的灭活 |
| 4.1.4 B16F10-IL-33 CD44~+CD133~+细胞灭活后鉴定及抗肿瘤疫苗制备 |
| 4.2 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价 |
| 4.2.1 疫苗对荷瘤小鼠肿瘤大小的影响 |
| 4.2.2 疫苗对小鼠肺转移的影响 |
| 4.2.3 荷瘤小鼠肿瘤组织病理学及免疫组织化学分析 |
| 4.2.4 小鼠生存期分析 |
| 4.3 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究 |
| 4.3.1 疫苗促进小鼠骨髓来源的DCs成熟 |
| 4.3.2 疫苗增强DCs刺激CD8~+T细胞增殖的能力 |
| 4.3.3 疫苗增强DCs启动CD8~+T细胞的能力 |
| 4.3.4 疫苗对小鼠脾脏中CD8~+T细胞比例及活性的影响 |
| 4.3.5 疫苗降低CD8~+T细胞免疫检查点的表达 |
| 4.3.6 疫苗诱导脾脏CD8~+中心记忆性T细胞的形成 |
| 4.3.7 疫苗增加脾脏CD8~+T细胞抗肿瘤效应分子的表达 |
| 4.3.8 疫苗增强小鼠脾淋巴细胞的杀伤能力 |
| 4.3.9 疫苗降低荷瘤小鼠肿瘤组织细胞CD44和CD133的表达 |
| 4.3.10 疫苗对荷瘤小鼠肿瘤组织细胞MHC I表达的影响 |
| 4.3.11 疫苗促进小鼠血清抗肿瘤细胞因子的分泌 |
| 4.3.12 疫苗增加小鼠肿瘤组织CD8~+T细胞的浸润 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）下调ROR1对黑色素瘤苗抗瘤效应的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 综述 ROR1在肿瘤的发生发展及治疗中的作用 |
| 第一章 慢病毒pLV-shROR1 的包装与稳定感染B16F10 细胞株的筛选 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 下调ROR1 分子后对B16F10 细胞增殖、转移和致瘤性的影响 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、试验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 下调ROR1分子后对B16F10细胞瘤苗抗肿瘤效应的影响及分子机制研究 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究的创新点和意义 |
| 三、参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 人源性卵巢癌干细胞疫苗的抗肿瘤效应及机制 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 人源性卵巢癌干细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 鼠源性卵巢癌干样细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）枸杞多糖的分步沉淀法纯化及各组分理化性质和生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 多糖的研究现状 |
| 1.1.1 多糖的概述 |
| 1.1.2 多糖的提取 |
| 1.1.3 多糖的分离纯化 |
| 1.1.4 多糖的生物活性研究 |
| 1.2 枸杞多糖研究进展 |
| 1.2.1 枸杞多糖分离纯化 |
| 1.2.2 枸杞多糖生物活性研究 |
| 1.3 本课题的立题依据、研究意义 |
| 第二章 分步沉淀法纯化枸杞多糖及各组分理化性质分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验耗材和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 枸杞多糖组分的制备 |
| 2.3.1.1 枸杞多糖的提取 |
| 2.3.1.2 枸杞多糖的分离纯化 |
| 2.3.2 枸杞多糖各组分理化性质测定 |
| 2.3.3 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 枸杞多糖的提取及分离纯化 |
| 2.4.2 枸杞多糖的理化性质 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 枸杞多糖各组分的抗氧化活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 还原力测定 |
| 3.3.2 DPPH·自由基清除能力测定 |
| 3.3.3 超氧阴离子清除能力测定 |
| 3.3.4 羟自由基清除能力测定 |
| 3.3.5 体外细胞水平抗氧化活性的测定 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 实验结果分析 |
| 3.4.1 枸杞多糖各组分还原力测定 |
| 3.4.2 枸杞多糖各组分对DPPH·自由基的清除能力 |
| 3.4.3 枸杞多糖各组分对超氧阴离子的清除能力 |
| 3.4.4 枸杞多糖各组分对羟自由基的清除能力 |
| 3.4.5 枸杞多糖各组分体外细胞抗氧化活性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 枸杞多糖各组分的免疫活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验耗材及仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 主要试剂的配制 |
| 4.3.1 1%(w/w)Triton X-100溶液配制 |
| 4.3.2 红细胞裂解液 |
| 4.3.3 1mg/mL硝基苯磷酸 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 枸杞多糖各组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7功能的影响 |
| 4.4.2 枸杞多糖各组分对小鼠体外脾细胞细胞活力的影响 |
| 4.4.3 统计学分析 |
| 4.5 实验结果分析 |
| 4.5.1 枸杞多糖各组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7功能的影响 |
| 4.5.2 枸杞多糖各组分对体外小鼠脾细胞细胞增殖的影响 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 枸杞多糖各组分对癌细胞生长的抑制作用及机制研究 |
| 5.1 仪器与材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 主要配制试剂 |
| 5.2.1 30%丙烯酰胺溶液的配制 |
| 5.2.2 电泳缓冲液配制 |
| 5.2.3 Western blot上样缓冲液配制 |
| 5.2.4 Western blot转印缓冲液配制 |
| 5.2.5 1×TBST溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 细胞活力测定 |
| 5.3.3 集落形成实验 |
| 5.3.4 细胞周期分析 |
| 5.3.5 细胞形态观察 |
| 5.3.6 AO-EB和DAPI染色 |
| 5.3.7 线粒体膜电位检测 |
| 5.3.8 细胞内活性氧测定 |
| 5.3.9 抗氧化酶活力测定 |
| 5.3.10 实时荧光定量PCR |
| 5.3.11 免疫印迹实验(Western blot assay) |
| 5.3.12 统计学分析 |
| 5.4 实验结果分析 |
| 5.4.1 枸杞多糖各组分对癌细胞活力影响 |
| 5.4.2 LBGP-I-3对MCF-7细胞增殖的影响 |
| 5.4.3 LBGP-I-3对MCF-7细胞周期的影响 |
| 5.4.4 LBGP-I-3诱导MCF-7细胞凋亡 |
| 5.4.5 LBGP-I-3对MCF-7线粒体的影响 |
| 5.4.6 LBGP-I-3对MCF-7细胞内抗氧化酶的影响 |
| 5.4.7 LBGP-I-3对MCF-7细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 5.4.8 LBGP-I-3对MCF-7细胞MAPKs信号通路的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论、创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词及中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1 肿瘤疫苗 |
| 1.1 肿瘤相关抗原 |
| 1.2 抗肿瘤疫苗免疫应答途径 |
| 2 肿瘤疫苗策略 |
| 2.1 肿瘤细胞疫苗 |
| 2.2 DC疫苗 |
| 2.3 基因疫苗 |
| 2.4 基于蛋白/肽的肿瘤疫苗 |
| 2.5 基于糖抗原的肿瘤疫苗 |
| 3 肿瘤糖疫苗概况 |
| 3.1 肿瘤相关糖抗原 |
| 3.2 基于TACAs开发的肿瘤疫苗的难点 |
| 4 肿瘤糖疫苗策略 |
| 4.1 基于载体开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.2 基于TACAs结构修饰开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.3 基于内源性佐剂开发的全合成肿瘤糖疫苗 |
| 5 本论文立体依据、研究内容及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于Tn-CRM197设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 免疫方案 |
| 2.5 脾淋巴细胞分离 |
| 2.6 酶联免疫吸附斑点实验 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Tn-CRM197 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 血清学评价 |
| 3.3 T细胞免疫应答评价 |
| 3.4 FACS分析小鼠血清识别肿瘤细胞表面Tn抗原 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于STn设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 间苯二酚法测唾液酸含量 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.5 免疫方案 |
| 2.6 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 2.7 ELISPOT实验 |
| 2.8 CTL分析 |
| 2.9 血清效价分析 |
| 2.10 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.11 ADCC分析 |
| 2.12 CDC分析 |
| 2.13 统计学处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 流式细胞术分析肿瘤细胞表面表达STn情况 |
| 3.3 疫苗在佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.4 疫苗在无佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.5 疫苗在佐剂辅助时对腋下荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.6 疫苗Y4-CRM197在健康小鼠中的免疫学活性评价 |
| 3.7 疫苗Y4-CRM197对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 疫苗αGC-MUC1的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.9 体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.10 血清中细胞因子检测 |
| 2.11 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 疫苗MUC1-CPG1826 的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.8 体内DC细胞及B细胞的激活 |
| 2.9 血清中细胞因子检测 |
| 2.10 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.11 血清效价分析 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗MUC1-CPG1826对DC细胞的影响 |
| 3.3 疫苗MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 3.5 疫苗MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞及B细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.8 血清中细胞因子检测 |
| 2.9 ELISA检测血清及细胞上清液中的细胞因子 |
| 2.10 血清效价分析 |
| 2.11 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及着作情况 |
（8）常春藤皂甙元抗肝癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 肝癌的病因及发病机制 |
| 1.3 肝癌的治疗 |
| 1.4 八月札的药理作用 |
| 1.5 常春藤皂甙元的药理作用及研究进展 |
| 1.6 主要研究内容 |
| 第二章 常春藤皂甙元对H22荷瘤小鼠抗肝癌作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 试验数据的统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 H22瘤源鼠的制备 |
| 2.3.2 H22荷瘤小鼠模型的建立 |
| 2.3.3 H22荷瘤小鼠生存状态观察 |
| 2.3.4 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 2.3.5 HD对H22荷瘤小鼠肝脏和肾脏的组织结构和功能的影响 |
| 2.3.6 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤组织的病理学影响 |
| 2.3.7 免疫荧光法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中相关蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 H22荷瘤小鼠模型的评价 |
| 2.4.2 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 2.4.3 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞形态学的影响 |
| 2.4.4 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中相关蛋白表达的影响 |
| 2.4.5 HD对H22荷瘤小鼠的毒副作用 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 常春藤皂甙元诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 试验数据的统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HD对H22荷瘤小鼠体重和肿瘤生长的影响 |
| 3.3.2 HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的形态学变化 |
| 3.3.3 RT-PCR法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡相关基因mRNA表达 |
| 3.3.4 免疫荧光法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.3.5 Western blot法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞发生凋亡的形态学变化 |
| 3.4.2 HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞发生凋亡的分子机制 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 常春藤皂甙元对H22荷瘤小鼠免疫功能影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 试验数据的统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 |
| 4.3.2 H22荷瘤小鼠生存状态观察 |
| 4.3.3 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 4.3.4 HD对H22荷瘤小鼠免疫器官免疫功能的调节作用 |
| 4.3.5 HD对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 |
| 4.3.6 HD对H22荷瘤小鼠NK细胞活性的影响 |
| 4.3.7 HD对H22荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.3.8 HD对H22荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HD对H22荷瘤小鼠生存状态的影响 |
| 4.4.2 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 4.4.3 HD对H22荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的调节作用 |
| 4.4.4 HD对H22荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响 |
| 4.4.5 HD对H22荷瘤小鼠非特异性免疫功能的影响 |
| 4.4.6 HD对H22荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 常春藤皂甙元对HEPG2细胞抑制作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.2.3 试验数据的统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HD对HepG2细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 HD诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化 |
| 5.3.3 免疫荧光检测HD诱导HepG2细胞凋亡 |
| 5.3.4 流式细胞仪检测HD诱导HepG2细胞凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 HD对HepG2细胞增殖能力的抑制作用 |
| 5.4.2 HD诱导HepG2细胞凋亡形态学变化 |
| 5.4.3 Annexin V-FITC凋亡检测结果评价 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 常春藤皂甙元诱导HEPG2细胞凋亡机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.2.3 试验数据的统计分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 HD对HepG2细胞增殖的影响 |
| 6.3.2 HD诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化 |
| 6.3.3 免疫荧光法检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达 |
| 6.3.4 Western blot法检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 HD对HepG2细胞增殖能力的影响 |
| 6.4.2 HD诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化 |
| 6.4.3 HD诱导HepG2细胞凋亡的分子机制 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间承担的科研任务与主要成果 |
（9）卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 CIK研究概述 |
| 1.1.1 CIK研究背景及特性 |
| 1.1.2 CIK的临床应用 |
| 1.1.3 CIK的抗肿瘤机制 |
| 1.1.4 CIK表达的几类重要毒活性因子 |
| 1.2 卡介菌多糖核酸研究概况及生物学功能 |
| 1.2.1 卡介菌多糖核酸简介 |
| 1.2.2 卡介菌多糖核酸的免疫调节功能 |
| 1.2.3 卡介菌多糖核酸的辅助抗癌功能 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 试剂(盒) |
| 2.1.5 流式抗体 |
| 2.1.6 所需溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血液采集 |
| 2.2.2 CIK细胞分离及原代培养 |
| 2.2.2.1 人外周血单核细胞(PBMC)分离 |
| 2.2.2.2 PBMC诱导培养成CIK |
| 2.2.3 肿瘤细胞培养 |
| 2.2.3.1 细胞复苏 |
| 2.2.3.2 SMMC-7721细胞培养 |
| 2.2.3.3 细胞传代培养 |
| 2.2.3.4 细胞的冻存 |
| 2.2.4 CCK-8 试剂盒检测CIK细胞增殖活性 |
| 2.2.5 CCK-8 试剂盒检测CIK细胞杀瘤活性 |
| 2.2.6 总RNA的提取及c DNA合成及实时定量PCR |
| 2.2.6.1 卡介菌多糖核酸处理CIK细胞 |
| 2.2.6.2 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.6.3 cDNA的合成 |
| 2.2.6.4 实时定量PCR |
| 2.2.7 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.7.1 卡介菌多糖核酸处理CIK细胞 |
| 2.2.7.2 ELISA检测CIK细胞TNF-a、IFN-γ释放量 |
| 2.2.8 流式细胞术检测CIK细胞亚群变化 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CIK细胞形态观察 |
| 3.2 卡介菌多糖核酸促进CIK细胞增殖 |
| 3.3 卡介菌多糖核酸提高了CIK的杀瘤活性 |
| 3.4 卡介菌多糖核酸促进CIK细胞毒活性相关因子表达及分泌 |
| 3.4.1 BCG-PSN提高了CIK细胞毒活性相关因子m RNA表达 |
| 3.4.2 BCG-PSN促进CIK细胞TNF-α、IFN-γ的分泌 |
| 3.5 卡介菌多糖核酸改变CIK细胞淋巴亚群状态 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 附录1 中英文对照表 |
| 附录2 研究生期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）人参皂苷Rh2衍生物体外促进IFN-γ分泌及CTLL-2细胞增殖的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 人参皂苷免疫活性的分子机制研究进展 |
| 1.1 人参皂苷的化学结构、药理作用、免疫活性 |
| 1.2 人参皂苷的免疫调节机制 |
| 1.3 人参皂苷的抗骨质疏松和脂代谢调节机制 |
| 1.4 人参皂苷的抗炎机制 |
| 1.5 人参皂苷促凋亡机制通路介导的肿瘤细胞凋亡作用 |
| 第2章 人参皂苷Rh2化学结构修饰的研究进展 |
| 2.1 对人参皂苷 Rh2 进行化学结构修饰的必要性 |
| 2.2 对人参皂苷 Rh2 进行化学修饰的主要方法及其研究进展 |
| 第3章 细胞毒性T细胞的免疫功能研究进展 |
| 3.1 细胞毒性 T 细胞概述 |
| 3.2 CTL 细胞的杀伤机制 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 人参皂苷Rh2-B1对小鼠全血和脾细胞分泌IFN-γ功能的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 人参皂苷Rh2-B1 体外促进CTLL-2 细胞IFN-γ分泌和细胞增殖作用的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 人参皂苷Rh2-B1 促诱生IFN-γ分泌和CTLL-2细胞增殖的分子机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、人参皂甙和肿瘤坏死因子对小鼠脾细胞抗体依赖细胞介导的细胞毒活性的影响（论文参考文献）
- [1]提高白血病小鼠体内NK细胞活性的研究[D]. 刘颖. 内蒙古医科大学, 2021
- [2]松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用[D]. 沙洲. 山东农业大学, 2021
- [3]IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究[D]. 尹起亮. 吉林大学, 2021
- [4]下调ROR1对黑色素瘤苗抗瘤效应的影响及其机制研究[D]. 王玲. 东南大学, 2020(01)
- [5]卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究[D]. 吴迪. 东南大学, 2019(05)
- [6]枸杞多糖的分步沉淀法纯化及各组分理化性质和生物活性研究[D]. 龚桂萍. 西北大学, 2018
- [7]基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究[D]. 宋成程. 东北师范大学, 2017(05)
- [8]常春藤皂甙元抗肝癌作用研究[D]. 白雪. 西北农林科技大学, 2017(11)
- [9]卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响[D]. 黄招琴. 湖南师范大学, 2016(04)
- [10]人参皂苷Rh2衍生物体外促进IFN-γ分泌及CTLL-2细胞增殖的作用研究[D]. 吕爽. 吉林大学, 2014(09)