一、不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合培养相互作用研究（论文文献综述）
林志娴[1]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高度接触性病毒性传染病。主要引起雏鸡死亡,肉鸡饲料报酬低,产蛋鸡产蛋下降。由于其病原易于突变、并可重组产生新的基因型导致该病防控难度加大。国内目前还没有IBV抗原抗体标准参考品,有关S蛋白的生物学特性研究还不深入。该病主要通过接种疫苗进行防控,但由于疫苗交叉保护性差导致该病在免疫鸡群中仍时有发生。本研究通过扩增IBV经典毒株IBV-M41株以及当下流行毒株IBV-CK/CH/2014/FJ14株的尿囊液作为备用抗原,将病毒接种14日龄雏鸡制备多抗血清作为备用抗体。上述制备的抗原抗体通过一系列标定后研制了IBV抗原抗体参考品。同时,通过真核载体表达系统表达了 IBV-CK/CH/2014/FJ14株的S蛋白,利用杂交瘤技术研制获得3株单克隆抗体,以期为该病的防控与诊断提供相应的生物材料。1.鸡传染性支管炎病毒抗原抗体参考品的制备本研究通过SPF鸡胚尿囊腔接种IBV-M41株和IBV-CK/CH/2014/FJ14株扩增病毒。对收集的尿囊液通过接种鸡胚、气管环和细胞等进行定值,结果显示IBV-M41株和 IBV-CK/CH/2014/FJ14 株 EID50 值为 105.8EID50/mL。IBV-M4 1 株 TOC-ID50 值为105.25TOC-ID50/mL,TCID50 值为 104.5TCID50/mL。IBV-CK/CH/2014/FJ14 株病毒 TOC-ID50值为105.5TOC-ID50/mL,TCID50值为104.75TCID50/mL。特异性鉴定结果表明,制备的抗原不含禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）、小鹅瘟病毒（Gooseparvoviruses,GPV）、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、禽传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）、马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、禽网状内皮组织增生病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）、鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）等外源病毒。所制备的样品经无菌检验和支原体检测,结果均为阴性。经分析备用抗原的物理性状、装量差异、均一性、稳定性、长期保存性等结果均良好,因此制备的抗原可以作为IBV抗原标准参考品。使用制备的IBV-M41株、IBV-CK/CH/2014/FJ14株病毒分别免疫14日龄SPF鸡,之后每间隔7天加强免疫一次,并检测抗体效价,直至第三次免疫28天后采集血清,进行抗体相关特性定值。结果:IBV-M41株多抗血清经测定,间接免疫荧光（IFA）效价为1:800,中和效价为1:1722,酶联免疫吸附试验（ELISA）效价为1:1600,血凝抑制（HI）效价为1:27。IBV-CK/CH/2014/FJ14株多抗血清经测定,IFA效价为1:800,中和效价为1:1488,ELISA效价为1:1600。进一步特异性鉴定表明该批次获得的多抗血清未检测到REV、MDV、ALV、AIV等禽类传染病病毒的抗体。分装冻干后进行无菌检测和支原体检测表明该抗体血清中细菌、霉菌和支原体均为阴性。经分析多抗血清的物理性状、装量差异、均一性、稳定性、长期保存性等结果均良好,即制备的抗体血清可作为IBV抗体标准参考品。2.鸡传染性支气管炎病毒S蛋白在真核系统中的表达本研究首先通过PCR扩增IBV-CK/CH/2014/FJ14株病毒S基因胞外域,并克隆到pFast-Bac-HTA载体中进行酶切和测序鉴定,鉴定后转座到大肠杆菌DH1OBacTM感受态细胞中,构建重组杆粒rBacmid-FJ14-S,再通过脂质体介导转染到Sf9细胞中,获得重组杆状病毒rBac-FJ14-S。IFA鉴定表明重组病毒能与IBV阳性鸡血清反应,Western blot分析发现在140 kDa附近有一条目的条带,与预期大小一致,证明IBVS蛋白胞外域获得成功表达。与此同时,将构建好的pCAGGS-FJ14SI-IgGFc真核表达载体转染到293T细胞中,通过IFA鉴定证明,融合蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。通过Proten G纯化柱纯化,获得纯化融合蛋白FJ14Sl-IgGFc,SDSA-PAGE、Western blot分析结果表明,纯化蛋白大小符合预期,SI融合蛋白得以正确表达。3.鸡传染性支气管炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备本研究用超速离心浓缩的IBV-CK/CH/2014/FJ14尿囊液病毒免疫6-8周龄BALB/C小鼠,每七天免疫一次,三免7天后对小鼠进行尾静脉采血,使用研究内容二获得的转染pCAGGS-FJ14S1-IgGFc载体的293T细胞测定效价,其IFA效价为1:800。通过细胞融合,借助研究内容二构建得到的pCAGGS-FJ14S1-IgGFc载体转染293T细胞进行IFA筛选。最终获得三株单克隆抗体,分别命名为Mab-IBV-S1-1H9,Mab-IBV-S1-5D3,Mab-IBV-S 1-5G11。Western blot实验表明三株单抗均能与纯化的重组蛋白FJ14S1-IgGFc良好反应。
陈顺[2]（2021）在《重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价》文中进行了进一步梳理新城疫（ND）和鸡传染性支气管炎（IB）是世界动物卫生组织规定须通报的动物传染病和我国农业部规定的分别为一类和二类的动物疫病,疫病的流行会造成生产性能的降低和鸡群死亡等严重后果,直接造成巨额的经济损失,已俨然成为制约水禽养殖的重大威胁。然而发展到目前为止,对于这两类疫病最高效经济的防控方式无疑是使用疫苗免疫;传统疫苗的种类主要包括:灭活疫苗和减毒的活疫苗,但是面对像IB这种血清型众多的病毒株,传统疫苗的保护就显得有些力不从心,况且传统疫苗病毒株稳定性差,常出现毒力返强现象,生产成本高、制备工艺复杂、免疫程序繁琐也导致了商品化疫苗的水平参差不齐;诸多问题的叠加放大加快了新型疫苗的研究脚步,基因工程疫苗首当其冲,逐步成为了疫苗研究中的新宠。能够同时表达多个与目标抗原相关及辅助性表位的疫苗被称为鸡尾酒式疫苗,也就是多表位疫苗。作为基因工程疫苗研究领域的翘楚,它能够被多种遗传背景的MHC分子特异性识别结合,诱导高效的递呈反应,增强免疫应答反应,在应对病原微生物的基因突变方面及克服免疫反应中的不良因素中具有得天独厚的优势。此次研究所用本团队已构建完成的重组新城疫病毒表达传染性支气管炎病毒的多表位疫苗rNDV-IBV-T/B株,它是以NDV的La Sota株作为载体,首先将NDV-TS09-C株的耐热性HN基因替换至La Sota株,增强了其热稳定性,然后应用基因工程技术,将IBV-S1蛋白的T、B淋巴细胞功能性表位插入到NDV的F和M基因之间,并通过反向遗传技术将重组病毒进行体外拯救,获得了重组病毒rNDV-IBV-T/B株,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够有效抵抗新城疫病毒以及多种亚型IBV感染。作为转基因微生物,基因安全问题一直以来是基因工程疫苗研究中所面临的重点,为防止对周围环境及人造成不必要的损害,《农业部转基因生物安全管理条例》对转基因生物的生产应用也做出了明确的规定,一般在通过小规模的中间实验、中规模的环境释放实验、大规模的生产性实验三个阶段,经验收合格后方能获得转基因生物安全证书并开展下一阶段的研究,作为基因工程疫苗在生产应用中必须要经历且重要的一环。为此,本研究针对重组病毒rNDV-IBV-T/B株安全性进行评估,为疫苗的生产应用提供了数据支持和保证,同时大力推动了基因工程疫苗的发展进程。本研究对构建保存的重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因表达及遗传稳定性进行了分析。利用鸡胚传代的方法将重组病毒不断复制扩增,在传代25次后收取鸡胚尿囊液,对重组病毒进行RT-PCR检测并送检测序分析基因突变情况;同时,针对重组病毒外源性插入基因进行特异性检测以及灵敏性分析。结果表明,当重组病毒利用鸡胚传代若干代后无基因突变现象且能够扩增出两条大小为1592bp和977bp的特异性条带,初步说明了重组病毒具有良好的遗传稳定性。当重组病毒的c DNA模板稀释度至10-4时仍能扩增出两条特异性条带,用其他病毒配合特异性引物进行PCR扩增无任何目的条带,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够扩增出两条目的条带,母本La sota株能得到一条目的条带,利用鸡胚还检测出重组病毒具有高水平病毒滴度。这些结果说明重组病毒在多次传代仍具有较强复制能力与毒力水平,插入基因稳定表达且特异。对1日龄的雏鸡进行滴鼻点眼免疫接种,免疫剂量大小为106EID50/0.2m L,在免疫后每日观察鸡群的精神状态及发病死亡情况,免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天进行剖检观察,并取鸡只组织脏器及环境中的饮水、饲料等进行RT-PCR检测。结果发现在整个实验进程中未发生鸡只死亡情况,鸡群采食及精神状态良好,鸡只组织脏器剖检观察均正常,RT-PCR结果显示,在整个免疫观察期内未在免疫鸡体内各脏器中及周围环境饮水、饲料中检测到重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因;为进一步检测证实PCR结果的可靠性,对重组病毒rNDV-IBV-T/B的安全性进行进一步评估,我们利用间接免疫荧光技术（IFA）,通过细胞水平的检测重新划定重组病毒在机体及环境中的留存情况。在免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天取靶动物鸡的组织器官和周围环境中饮水、饲料等处理后去感染Hela细胞,同时也用重组病毒rNDV-IBV-T/B和NDV强毒Herts33感染Hela细胞作为两个阳性对照。经过检测我们可以发现,在免疫后的56d内,组织脏器及周围环境样品中没有检测到绿色荧光信号,阳性组有明亮的绿色荧光信号标记,即在组织和周围环境中没有检测到重组病毒,说明了重组病毒对靶动物鸡和环境是安全的。综上所述,本实验对表位疫苗株rNDV-IBV-T/B安全性进行了客观性评价,证实了其安全性,为推动疫苗发展进程提供了数据支撑。
盛洁[3]（2021）在《表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价》文中提出鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性上呼吸道传染病,对全球家禽养殖业危害严重,是目前养禽业面临的最重要疫病之一。有必要基于IBV流行病学研究结果,针对目前我国主要流行的毒株类型研制新型疫苗。纤突（Spike,S）蛋白是IBV病毒粒子表面重要的糖蛋白,在病毒入侵以及受体结合等方面发挥重要作用。纤突蛋白在成熟过程中进一步裂解为S1亚基和S2亚基,其中S1亚基含有病毒主要的中和表位,是IBV重要的免疫原基因,往往将其作为IBV型特异性疫苗设计的主要靶点。鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的影响家禽生产的另一大病毒性呼吸道传染病。该病往往呈地方性散发,但近年来国内鸡群频繁暴发ILT,造成较大的经济损失,弱毒疫苗作为防控该病的有效手段,引起养禽业界的重视。ILTV和IBV作为两种重要呼吸道病毒,由于两者对宿主的感染部位和免疫机理相似,研制联合疫苗成为同时防控这两种疫病的迫切需求,ILTV具备作为疫苗载体表达其他病原保护性抗原的潜质。鉴于此,基于ILT弱毒株来构建表达IB重要免疫原基因的重组ILT基因工程载体联合疫苗便成为同时防控IB和ILT两种疫病的最优选择。本研究以ILTV弱毒株CK/CH/LHLJ/120305株为亲本毒株,将其US9基因缺失并插入增强型绿色荧光蛋白表达盒（EGFP）后获得的ILTV突变体ILTV-ΔUS9-G株作为中间病毒,采用基因同源重组技术,将ILTV-ΔUS9-G株病毒的EGFP基因分别替换为IBV GI-19（QX）型强毒株CK/CH/LDL/091022株的S基因和S1基因,获得表达IBV S蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及表达IBV S1蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株。两株重组病毒插入的外源基因S基因和S1基因不影响其体外复制能力,且ILTV-ΔUS9-S1株较亲本弱毒CK/CH/LHLJ/120305株复制滴度更高。两株重组病毒在LMH（Leghorn male hepatocellular cell,鸡肝癌细胞系）上连续传代15代,并以本研究制备的抗IBV S1蛋白的单克隆抗体对重组病毒进行间接免疫荧光检测,结果显示,IBV S蛋白和S1蛋白分别在两株重组病毒中能稳定表达,但表达量较低。两株重组病毒接种SPF鸡后,无不良临床反应,说明重组病毒对鸡是安全的。为评价两株重组病毒对ILTV强毒的免疫保护效果,采用间接ELISA对免疫鸡的血清抗体进行检测,结果显示,免疫后7 d两株重组病毒即能诱导鸡只产生高水平的血清抗体,其中ILTV-ΔUS9-S1株诱导产生的抗体水平更高。从ILTV WG株攻毒后的临床表现来看,两株重组病毒免疫组鸡只不表现呼吸道症状,喉头、气管中的病毒载量远低于对照组鸡只,且ILTV-ΔUS9-S株免疫组鸡只的咽拭子攻毒后8 d不再排毒,ILTV-ΔUS9-S1株免疫组攻毒后12 d不再排毒,显示两株重组病毒均能提供针对ILTV强毒株的完全保护。对于重组病毒针对IBV CK/CH/LDL/091022强毒株的免疫保护效果,s Ig A及IFN-γELISpot检测结果显示,两株重组病毒仅能诱导部分鸡只产生有限的特异性粘膜免疫及细胞免疫反应,对免疫后鸡只进行血清抗体检测,显示免疫后两个免疫组仅有部分鸡血清抗体转阳。两株重组病毒免疫组与对照组在IBV强毒攻毒后5 d时气管和肾脏内均可检测到病毒,各组病毒载量无显着差异,但攻毒后8 d重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株免疫组的咽拭子排毒率分别为50%,60%;攻毒后12 d分别为10%,0;相对于对照组在攻毒后8 d和12 d排毒率为80%和20%而言,两株重组病毒免疫后能够在一定程度上加速免疫鸡呼吸道内病毒的清除,但总体而言所激发的免疫保护作用较弱。综上所述,本研究成功构建了分别表达GI-19（QX）型IBV S蛋白和S1蛋白基因的重组ILTV,ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株,两株重组病毒都能对ILTV强毒株攻击提供完全保护,也能够激发针对IBV GI-19（QX）型强毒株S1蛋白的免疫反应,但并不能提供针对IBV强毒的完全免疫保护作用,有待进一步改进和优化外源免疫原基因的表达水平,提升ILTV作为重组基因工程载体的潜在价值。
闫彩虹[4]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中认为免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
乔清华[5]（2020）在《泰安及周边地区规模化蛋鸡场主要病毒性疾病临床诊断调查及免疫程序调整优化》文中进行了进一步梳理近年来随着蛋鸡养殖业的快速发展,蛋鸡场养殖规模越来越大,养殖密度不断增加,饲养周期也有所延长,疫病防控压力有增无减,尤其是多种血清型禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征等新老病毒性传染病在蛋鸡场广为流行,规模化蛋鸡场科学合理免疫程序制定显得尤为重要。科学合理免疫程序制定的依据主要基于相关疾病的流行病学调查和免疫效果的评估,在此基础上对免疫程序进行调整优化。本研究通过血清学、病理学及病原学检测方法,对泰安及周边地区的部分规模化蛋鸡场禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征等病毒性传染病的流行情况进行了调查分析。调查结果显示,泰安及周边地区的大多数规模化蛋鸡场上述疫病的免疫防控效果较好,但H9亚型禽流感、非典型新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征等传染性疾病尚有较高的发病率,有的鸡场由此造成了较大的经济损失。结合鸡群发病特点、临床剖检、病理组织学检查,并使用PCR或RT-PCR方法进行检测,对常见病毒性疾病的阳性检出率进行统计。结果显示在临诊疑似病例中FAdV检出率最高,阳性率为86.60%（84/97）,其次为ILTV和IBV,阳性率分别55.56%（15/27）和48.28%（14/29）,低致病性禽流感和非典型新城疫临床疑似病例较多,对病鸡进行剖检时也常见明显的特征病变,但核酸检出率较低,H9N2亚型AIV阳性率为19.72%（19/106）,NDV阳性率为10.59%（9/85）。2018-2019年对泰安及周边部分地区规模化蛋鸡场采集血清进行禽流感（H5、H7、H9）、新城疫抗体水平检测及抗体合格率统计分析,结果显示部分鸡场抗体水平偏低或离散度过大,可能存在H9AIV和NDV野毒感染,疫病风险较大。分析其原因主要与免疫程序不合理或疫苗选择不当,缺乏科学的免疫效果评估有关。将2018-2019年检测的禽流感、新城疫抗体滴度按照季度进行抗体合格率统计,统计结果显示,不同季度的抗体合格率略有所不同。其中,H5、H7抗体在第二季度合格率最低分别为92.57%、87.32%,第四季度合格率最高分别为98.42%、95.02%;H9抗体第二季度合格率最低为82.49%,第一季度合格率最高为94.11%;ND抗体第三季度合格率最低为89.67%,第一季度合格率最高为94.64%。整体分析可知,禽流感抗体合格率由高到低依次为:一季度>四季度>三季度月>二季度。新城疫抗体合格率由高到低依次为:一季度>二季度>四季度>三季度。基于流行病学调查及抗体检测结果,以泰安市某规模化蛋鸡场为试验场,根据该场养殖情况对禽流感与新城疫的免疫程序进行了调整优化,制定了免疫效果检测评估方案和生物安全防控措施,跟踪检测显示,免疫程序调整之后,未再出现传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征疑似病例;禽流感、新城疫免疫效果得到明显改善,未见H9亚型禽流感和非典型新城疫的发生,H7合格率由调整前的80%升高至100%,H9合格率由调整前的66.67%升高至93.33%,同时所有抗体水平的离散度明显降低,抗体水平合格率、保护力增加,鸡群的群体免疫力增强,有效化解主要病毒病的发生风险,具有一定的示范推广价值。本研究进一步丰富了泰安及周边地区规模化蛋鸡场流行病学调查资料,初步摸清了规模化蛋鸡场禽流感、新城疫疫苗免疫状态,免疫程序的调整优化及免疫效果检测评估方法将有助于蛋鸡场传染性疾病的有效防控。
周琦[6]（2020）在《河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立》文中研究指明鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起鸡的一种高度接触性、急性呼吸道传染病。该病传播速度快、发病率高,对养禽业的效益产生严重影响。IBV的基因组易发生变异和重组,导致其基因型和血清型众多,且交叉保护力弱,对养鸡业造成严重打击。不同地区或者同一地区的基因型都可能出现较大差别,及时了解本地流行毒株情况,对于该病的防控有重要意义。本研究通过对临床样本的检测,围绕IBV的同源性及变异分析,展开了相关研究,具体内容如下:1.河北部分地区IBV分离鉴定及序列分析:收集河北部分地区的疑似IB样本进行检测,对阳性样本进行测序分析,通过对14份阳性样本的S1基因与N基因的序列分析,发现有6株毒株与LX4株更为接近,约占到阳性样本的43%,同时分离到的14个毒株之间的S1基因相似性在69.799.8%。而同源性分析结果表明14个分离毒株的N基因之间的相似性为91.599.8%。2.IBV N蛋白的原核表达及纯化:通过设计特异性引物扩增了HB-ZD1909株S1基因和N基因,并成功构建了其重组质粒pGEX-6P-1-S1和pGEX-6P-1-N,通过IPTG诱导,获得了原核表达的S1蛋白和N蛋白。因S1蛋白纯化效果不理想,故选用可溶性表达且纯化效果好的的N蛋白作为后续实验的基础。3.间接ELISA检测方法的建立:通过原核表达并纯化的N蛋白,成功建立了IBV N蛋白的间接ELISA方法,经过一系列摸索和条件优化,该方法的最佳抗原包被条件为0.5μg/mL,最适合的包被条件为4℃包被过夜,阴阳性临界值确定为0.0996,最佳封闭液条件为5%脱脂乳封闭2 h,血清稀释倍数为1:100,最佳血清作用时间30 min,最佳二抗作用时间为60 min,底物作用时间为10min。重复性及特异性试验结果表明本试验获得的N蛋白可以替代IBV病毒来检测抗体,具有较好的应用价值,可作为快速诊断和免疫监测IBV的重要手段。
李佳楠[7]（2020）在《传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选》文中研究指明传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是家禽产业中具有高度传染性的一种病原体,易感染呼吸道,也可引起禽类肾脏和生殖道等疾病,给养禽业造成了严重的经济损失。IBV变异率高且存在多种血清型,各血清型之间几乎没有交叉保护作用,给IBV的诊断和治疗带来了巨大的挑战。S1蛋白作为主要的结构蛋白,负责病毒与宿主细胞膜的结合,能够引起机体产生中和性抗体。因此,抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）的制备和模拟表位的筛选,为IBV的检测打下基础,并为分析S1蛋白抗原表位提供参考。本研究将IBV M41毒株接种鸡胚进行扩繁,从而获得含有病毒的尿囊液。经提取病毒总RNA,RT-PCR方法扩增选定的S1基因,构建重组载体p ET-28a-S1并导入E.coli BL21（DE3）细胞中。诱导表达产物通过SDS-PAGE分析,重组S1蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 k Da。复性后的重组S1蛋白经Western-blot验证可以与鸡阳性血清发生反应,表明重组S1蛋白具有反应原性。将重组S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,获得能稳定分泌抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体的细胞株3D9。间接ELISA方法测定腹水抗体效价可达1:2.56×105,亲和常数为1.7×109L/mol。免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）结果显示单克隆抗体3D9可以与IBV M41毒株进行反应。以单克隆抗体3D9为靶标,利用噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选。通过3轮淘选,对与单克隆抗体3D9特异结合的噬菌体进行测序、鉴定,最终获到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。本研究成功制备抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体,且可以与IBV M41毒株进行结合,并通过噬菌体展示技术最终筛选到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。
赵大杰[8]（2020）在《NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响》文中指出新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是副黏病毒科、副黏病毒属代表种,新城疫（Newcastle disease,ND）是由NDV强毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病,禽感染NDV常呈败血症经过,主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血,其发病率和死亡率极高。H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒,可引起家禽呼吸道症状、产蛋率下降和免疫抑制,使感染禽继发感染其它病原体,造成家禽发病率和死亡率上升。由于NDV与AIV共同感染情况在家禽养殖或野禽中时有发生,导致被感染禽病毒传播扩散和致病性更加复杂。近年研究只初步探讨NDV与H9N2亚型AIV共感染宿主后两种病毒之间相互干扰的影响,对病毒致病机制和相互干扰机制尚未明确,对宿主致病性影响也未见深入报道。为了解NDV和H9N2亚型AIV单独感染和共感染SPF鸡胚后对病毒增殖和鸡胚致病性影响,本实验采用血凝试验和血凝抑制试验（HA-HI）、RT-PCR、1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）、最小致死量鸡胚平均死亡时间（MDT）、ELISA、RT-qPCR以及组织切片等方法,检测病毒增殖情况和病毒对鸡胚致病性影响,以期为临床防制NDV和H9N2亚型AIV共感染提供新思路和新方向。1、基因Ⅶd亚型NDV-DQ株病毒增殖和致病性测定为了解基因Ⅶd亚型NDV-DQ株致病性和单独感染SPF鸡胚后对病毒增殖影响,本研究采用HA-HI、ICPI、MDT、ELISA等方法,检测病毒HA效价和血清HI效价、计算NDV的ICPI和MDT、并测定7个时段（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72h和96h）收集的鸡胚尿囊液和胚体在蛋白水平上病毒增殖情况,结果显示:基因Ⅶd亚型NDVDQ株HA效价平均在8log2左右,其病毒血凝性可被NDV阳性血清抑制,ICPI为1.80,MDT为56.6 h,根据强毒力型新城疫判定指标,可判定该NDV为强毒株;NDV单独感染鸡胚后,NDV病毒含量在鸡胚尿囊液和胚体中提升情况基本一致,病毒含量在24 h～48 h提升最快,在24 h～72 h稳定提升,在72 h时病毒含量达到最高,且尿囊液中NDV病毒含量比胚体高。2、H9N2亚型AIV-AS株病毒增殖和致病性测定为了解H9N2亚型AIV-AS株致病性和感染SPF鸡胚后对病毒增殖影响,本研究采用HA-HI、MDT和ELISA等方法,测定病毒HA效价和血清HI效价、计算AIV的MDT、并测定7个时段（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h）收集鸡胚尿囊液和胚体在蛋白水平上病毒增殖情况,结果显示:H9N2亚型AIV-AS株HA效价平均在7log2左右,其病毒血凝性可被AIV H9阳性血清抑制,MDT为74.4 h,可判定该AIV为弱毒株;AIV单独感染鸡胚后,AIV病毒含量在鸡胚尿囊液和胚体中提升情况基本一致,病毒含量在48 h～72 h提升最快,在48 h～96 h稳定提升,在96 h时病毒含量达到最高,且尿囊液中NDV病毒含量比胚体高。3、NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响为了解基因Ⅶd亚型NDV-DQ强毒株和H9N2亚型AIV-AS弱毒株共感染SPF鸡胚后对病毒增殖和鸡胚致病性影响,本实验设计NDV（AIV）提前12 h、6 h和3h感染鸡胚,之后于0 h感染AIV（NDV）,并设定0 h同时感染组合、NDV（AIV）单独感染组和对照组,于共感染24 h和48 h收集鸡胚尿囊液和胚体,采用RT-PCR、RTqPCR、ELISA、HA-HI和组织切片等方法对收集样本做试验检测。RT-PCR结果显示:对收集样本作NDV和AIV核酸RT-PCR扩增,可见亮度不一359 bp和377 bp大小的特异性目的条带。RT-qPCR和ELISA结果显示:AIV在鸡胚尿囊液和胚体中均抑制NDV增殖,抑制程度随时间而增加;共感染24 h时NDV在鸡胚尿囊液中促进AIV增殖,在48 h时抑制AIV增殖;而共感染24 h和48 h时NDV在胚体中抑制AIV增殖。HA-HI结果表明NDV和AIV之间存在干扰现象,AIV严重干扰NDV增殖。NDV和AIV共感染鸡胚后造成整个胚体充血,在头、腹、背、翅和趾部有出血点。病理组织切片观察可知,鸡胚肝脏和心脏因病毒增殖影响而受到程度不一的病理损伤。综上所述,本研究证明NDV-DQ株是强毒株,H9N2亚型AIV-AS株是弱毒株,两种病毒单独感染鸡胚均能致死鸡胚,均可在鸡胚尿囊液和胚体中增殖,且尿囊液中病毒含量比胚体中高。NDV强毒株和H9N2亚型AIV弱毒株共感染鸡胚可引起病毒增殖的相互干扰,干扰程度受感染先后顺序以及感染时间影响,AIV对NDV干扰作用较NDV对AIV干扰作用显着,AIV一直抑制NDV增殖,NDV在共感染鸡胚后24 h可促进AIV增殖,之后出现抑制AIV增殖。NDV和H9N2亚型AIV共感染对鸡胚胚体、肝脏和心脏组织均有致病作用,可引起肝脏出血、纤维蛋白渗出和细胞颗粒变性等病理变化,引起心脏组织出血和颗粒变性等病理变化,共感染提高了病毒致病性,共感染时间越长鸡胚病变越严重。
孟令宅[9]（2020）在《基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救》文中研究指明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存在多种基因型,目前我国主要流行的是Class Ⅱ类型中基因Ⅶ毒株,常规疫苗株B1、Clone30、La Sota及V4疫苗株属于基因Ⅰ型和Ⅱ型,不能有效防控基因Ⅶ型毒株。因此,应迫切研发与当前流行株基因型一致的新型疫苗。基于此,本研究对一株NDVHB株进行了全基因组测序,以此为基础建立了HB株的反向遗传操作平台,并对其F蛋白进行改造,旨在为研发基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗提供科学依据。从河北省某发病鸡场的临床样本中检测到一株新城疫病毒,命名为HB,采用RT-PCR方法对HB株的全基因组序列进行分段扩增,并对其基因序列进行结构特性分析及同源进化分析。结果表明HB株基因组全长为15192 bp,基因组3’端存在长为55 nt的引导序列,5’端存在长为114 nt的尾随序列,主要编码的6种结构蛋白,包括基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）、核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、以及RNA依赖性RNA聚合酶蛋白（L）,基因组排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。全基因组遗传进化分析表明,HB株属于Class Ⅱ中的基因Ⅶ型毒株,与鸭源新城疫毒株BP01、Fujian/FP/02、MMd/CH/LGD/1/2005核苷酸的同源性最高（99.1%～99.2%）,进化树上处于同一分支;与中国广泛使用的V4,Mukteswar和La Sota等疫苗株核苷酸的同源性较低（82.9%～85.6%）,进化树上处于不同分支。基于F基因的系统进化树显示,HB株属于基因Ⅶd亚型,是目前我国流行毒株中的优势亚型毒株。通过与其它毒株的序列进行比对,发现在F蛋白的信号肽,七肽重复区和跨膜结构域中出现了 4、16和2个氨基酸突变,在HN蛋白的功能结构域和中和表位分别出现1和5个氨基酸突变,这些关键位点的突变与病毒的吸附性及免疫逃避有关。应用反向遗传操作技术将HB株全长cDNA分为外部基因质粒（M、F及HN）和内部基因质粒（NP、P及L）两部分构建,通过同义突变将L蛋白的3100位点处的碱基A突变为T作为遗传标记,用以与野毒进行区分;利用融合PCR技术将F蛋白的112～117裂解位点的氨基酸序列突变为弱毒株La Sota裂解位点序列,同时构建了三个辅助质粒PCI-NP,PCI-P,PCI-L,将内部基因质粒、外部基因质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞进行病毒拯救,并通过细胞病变、遗传标记检测、基因测序及间接免疫荧光等试验技术对拯救病毒进行鉴定,结果表明,rHB株能在BHK-21细胞上引起典型的细胞病变（CPE）,引入的遗传标记在传代过程中可以稳定遗传,F蛋白裂解位点处氨基酸序列突变成功,病毒拯救成功。对拯救病毒的生长特性进行分析,表明rHB株与HB株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性。NDV HB株感染性克隆的成功构建可为进一步研究NDV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供技术平台。
姬阿美[10]（2020）在《BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒》文中认为新城疫（Newcastle disease,ND）因其高发病率和高死亡率给世界各地的家禽养殖业造成了巨大威胁,接种疫苗是防控ND最有效的措施。采用传统的鸡胚工艺生产新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）疫苗,存在SPF鸡胚供应不足、质量控制困难及规模放大受限等问题;基于细胞的贴壁培养工艺存在成本高、操作复杂和过程控制困难等缺点;而应用无血清悬浮培养工艺虽可克服上述缺陷,但存在缺乏对NDV敏感的悬浮细胞系、适于NDV扩增的无血清维持培养基及工艺不成熟等问题。针对上述问题,亟需开发基于动物细胞的NDV悬浮培养工艺及适于NDV增殖的无血清维持培养基。本文首先以实验室自主研发的无血清培养基SF201为生长及维持培养基,通过敏感细胞株筛选、病毒适应及细胞毒种制备、病毒接种条件优化,建立了无血清悬浮培养生产NDV工艺。当BHK-v002细胞生长至约9.0×106cells/mL时,用新鲜培养基将活细胞密度稀释至6.0×106 cells/mL,在MOI为0.005、TPCK-胰酶浓度为5 μg/mL条件下接种病毒,继续培养96 h后收获病毒,收获病毒液的血凝效价（HA效价）为8.5 log2HAU/25 μL,单细胞产毒量（Svy）达到1685.9virions/cell。为进一步优化培养过程,提高病毒产量,应用Design Expert软件对6种无血清培养基进行混料设计,成功筛选出无血清维持培养基BMM11,培养后收获的病毒上清液中HA效价和Svy分别达到9.5 log2HAU/25μL和3185.1 virions/cell。以8 g/L浓度的F水解物添加至BMM11培养基（BMM11-F）,HA效价和Svy分别达到10.4 log2HAU/25μL和6981.5 virions/cell。为指导成分明确的无血清维持培养基的研制,考察了维持培养基BMM11及关键组分葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长、代谢和病毒增殖的影响。在维持培养基BMM11中病毒增殖后期葡萄糖和Gln耗竭不利于病毒的增殖和细胞活性的维持;高浓度葡萄糖所致的酸性pH环境降低病毒滴度,故应控制葡萄糖补加量;当Gln添加量为4.088 g/L时,病毒HA效价和Svy分别为 10.5 log2HAU/25 μL 和 6704.4 virions/cell,与 BMM11-F 培养基相当。本研究建立了 BHK-21细胞无血清悬浮培养生产NDV的工艺,并成功开发出适于NDV高效扩增的无血清维持培养基,为建立基于动物细胞无血清规模化悬浮培养技术的NDV生产工艺、替代目前鸡胚生产工艺提供了方案。
二、不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合培养相互作用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合培养相互作用研究（论文提纲范文）
（1）鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 概述 |
| 2. 流行病学 |
| 3. 临床症状与病理变化 |
| 4. 病原学 |
| 5. 致病机理 |
| 6. 诊断 |
| 7. 防控 |
| 8. 标准物质研究进展 |
| 9. 杆状病毒表达系统介绍 |
| 10. 单克隆抗体研究现状 |
| 11. 研究目的与意义 |
| 研究内容一 鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 IBV抗原参考品的制备 |
| 2.2 IBV抗体参考品的制备 |
| 3. 结果 |
| 3.1 IBV抗原标定结果 |
| 3.2.IBV血清抗体标定结果 |
| 4. 小结与讨论 |
| 研究二: 鸡传染性支气管炎病毒S蛋白在真核表达系统中的表达与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 设计PCR引物 |
| 2.2 PCR扩增IBV-S基因 |
| 2.3 构建和鉴定重组质粒pGEM-T-FJ14-S |
| 2.4 构建和鉴定重组质粒pFastBacHTA-FJ14-S |
| 2.5 构建和鉴定重组杆状病毒穿梭载体 |
| 2.6 制备重组杆状病毒rBac-FJ14-S |
| 2.7 重组载体pCAGGS-FJ14S1-IgGFc的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增结果 |
| 3.2 阳性重组质粒的筛选及酶切鉴定结果 |
| 3.3 杆状病毒转移载体的构建与鉴定结果 |
| 3.4 PCR鉴定重组杆粒 |
| 3.5 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.6 WB验证S蛋白的表达 |
| 3.7 IFA鉴定重组载体pCAGGS- FJ14S1-IgGFc表达结果 |
| 3.8 SDS-PAGE鉴定纯化重组蛋白FJ14S1-IgGFc结果 |
| 3.9 WB鉴定纯化重组蛋白FJ14S1-IgGFc结果 |
| 4. 小结与讨论 |
| 研究三: 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 动物的免疫 |
| 2.3 单抗筛选方法的构建 |
| 2.4 杂交瘤细胞的制备 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的间接免疫荧光筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆和建株 |
| 2.7 单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠血清效价 |
| 3.2 单克隆抗体细胞建株 |
| 3.3 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.4 WB分析 |
| 3.5 单抗特异性鉴定 |
| 4. 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫的研究概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 病理变化 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.1.5 新城疫疫苗的研究进展 |
| 1.2 传染性支气管炎的研究概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 临床症状及病理变化 |
| 1.2.3 诊断方法 |
| 1.2.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 伦理性声明 |
| 2.1.2 毒株及细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要溶液的配制 |
| 2.1.7 主要软件的使用 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组病毒rNDV-IBV-T/B株遗传稳定性分析 |
| 2.2.2 重组病毒rNDV-IBV-T/B株灵敏性及特异性分析 |
| 2.2.3 重组病毒rNDV-IBV-T/B株的毒力测定 |
| 2.2.4 重组病毒疫苗对靶动物鸡的体内残留实验及环境影响 |
| 2.2.5 间接免疫荧光检测鸡只组织脏器及环境中重组病毒的存在 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组病毒rNDV-IBV-T/B株遗传稳定性分析 |
| 3.2 重组病毒rNDV-IBV-T/B株特异性及灵敏性分析 |
| 3.3 重组病毒rNDV-IBV-T/B株病毒滴度测定 |
| 3.4 重组病毒疫苗对靶动物鸡的体内残留实验及环境影响 |
| 3.4.1 免疫后临床及剖检变化 |
| 3.4.2 主要脏器及环境中重组病毒基因PCR检测 |
| 3.4.3 主要脏器及环境中重组病毒间接免疫荧光检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（3）表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎流行病学特征 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒生物学特性 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白概述 |
| 1.1.4 鸡传染性支气管炎疫苗研究进展 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒及其作为疫苗载体的应用 |
| 1.2.1 疱疹病毒作为疫苗载体的优点 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.2.3 疱疹病毒的US9 基因 |
| 1.2.4 鸡传染性喉气管炎病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒与鸡胚 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 酶及主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转移质粒的构建 |
| 2.2.2 重组病毒的构建及鉴定 |
| 2.2.3 重组病毒的生长特性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转移质粒p ILTΔUS9-S、p ILTΔUS9-S1 的构建 |
| 2.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株的构建及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 IBV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及实验动物 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 酶及主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组蛋白的构建 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.3 单克隆抗体的制备及效价检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IBV CK/CH/LDL/091022 毒株S1 蛋白的真核表达 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞的制备及单克隆抗体鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒、鸡与鸡胚 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒对ILTV WG株的免疫保护评价 |
| 4.2.2 重组病毒对IBV CK/CH/LDL/091022 分离株的免疫保护评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对ILTV的免疫保护作用评价 |
| 4.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对IBV的免疫保护作用评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）泰安及周边地区规模化蛋鸡场主要病毒性疾病临床诊断调查及免疫程序调整优化（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽流感 |
| 1.1.1 病原学及致病机制 |
| 1.1.2 病理学变化 |
| 1.1.3 免疫防控 |
| 1.2 鸡新城疫 |
| 1.2.1 病原学及致病机制 |
| 1.2.2 临床症状 |
| 1.2.3 病理学变化 |
| 1.2.4 免疫防控 |
| 1.3 传染性支气管炎 |
| 1.3.1 病原学及致病机制 |
| 1.3.2 临床症状及病理变化 |
| 1.3.3 免疫防控 |
| 1.4 传染性喉气管炎 |
| 1.4.1 流行病学 |
| 1.4.2 临床症状及其病理变化 |
| 1.4.3 免疫防控 |
| 1.5 心包积液综合征 |
| 1.5.1 病原学及致病机制 |
| 1.5.2 临床症状 |
| 1.5.3 病理学变化 |
| 1.5.4 免疫防控 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 试验方法与步骤 |
| 2.2.1 常规石蜡切片方法 |
| 2.2.2 病料DNA/RNA的提取 |
| 2.2.3 引物设计与合成 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 血清采集与处理 |
| 2.2.6 血凝试验与血凝抑制实验 |
| 2.2.7 泰安某示范鸡场疫病综合防控能力提升 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 典型病例剖检及病理组织学检查结果 |
| 3.1.1 禽流感 |
| 3.1.2 新城疫 |
| 3.1.3 传染性支气管炎 |
| 3.1.4 传染性喉气管炎 |
| 3.1.5 腺病毒 |
| 3.2 临床发病情况统计 |
| 3.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 临床发病率统计结果 |
| 3.3 血清学检测结果 |
| 3.3.1 禽流感、新城疫免疫情况调查结果 |
| 3.3.2 禽流感、新城疫抗体滴度检测结果 |
| 3.3.3 各季度禽流感、新城疫抗体分布情况 |
| 3.4 泰安市某蛋鸡场禽流感免疫程序调整优化试验结果 |
| 3.4.1 免疫程序调整前禽流感发病情况及抗体水平检测 |
| 3.4.2 免疫程序调整前其他病毒性疾病发病情况调查 |
| 3.4.3 免疫程序调整优化及免疫效果检测评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 IBV概述 |
| 1.1.1 IBV病原学简介 |
| 1.1.2 IBV结构蛋白及其生物学特性 |
| 1.1.3 IBV分型 |
| 1.2 IBV流行病学 |
| 1.2.1 IBV的流行与传播 |
| 1.2.2 IBV主要临床分型 |
| 1.2.3 IBV的防控 |
| 1.3 IBV疫苗研究进展 |
| 1.3.1 IBV灭活疫苗 |
| 1.3.2 IBV弱毒疫苗 |
| 1.3.3 IBV基因工程苗 |
| 1.3.4 活病毒载体疫苗 |
| 1.4 IBV检测方法研究进展 |
| 1.4.1 RT-PCR检测 |
| 1.4.2 ELISA检测 |
| 1.4.3 胶体金试纸条 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 河北部分地区IBV分离鉴定与基因序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂、材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其它生物材料和试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料来源 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 病毒总RNA提取及逆转录 |
| 2.2.4 基因扩增 |
| 2.2.5 鸡胚接毒 |
| 2.2.6 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 纯化回收产物的连接 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 重组质粒的转化、鉴定及序列测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床样本PCR鉴定 |
| 2.3.2 鸡胚病变 |
| 2.3.3 扩增结果 |
| 2.3.4 T载体构建 |
| 2.3.5 构建进化树 |
| 2.3.6 同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白和N蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、载体及基因工程菌 |
| 3.1.2 主要生化试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 原核蛋白的克隆与鉴定 |
| 3.2.3 原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 重组质粒的表达及纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因片段的克隆与鉴定 |
| 3.3.2 原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 重组质粒的表达及鉴定 |
| 3.3.4 原核蛋白的纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 IBV N蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂、材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.2 阴阳临界值的确定 |
| 4.2.3 确定抗原最佳包被条件 |
| 4.2.4 最佳封闭液的选择 |
| 4.2.5 确定最佳封闭时间 |
| 4.2.6 确定血清孵育时间 |
| 4.2.7 确定二抗孵育时间 |
| 4.2.8 确定底物作用时间 |
| 4.2.9 特异性试验 |
| 4.2.10 重复性试验 |
| 4.2.11 敏感性试验 |
| 4.2.12 临床样本检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4.3.2 阴阳临界值的确定 |
| 4.3.3 确定抗原最佳包被条件 |
| 4.3.4 最佳封闭液的选择 |
| 4.3.5 确定最佳封闭时间 |
| 4.3.6 确定血清孵育时间 |
| 4.3.7 确定二抗孵育时间 |
| 4.3.8 确定底物作用时间 |
| 4.3.9 特异性试验 |
| 4.3.10 重复性试验 |
| 4.3.11 敏感性试验 |
| 4.3.12 临床样本检验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 N蛋白的选择 |
| 4.4.2 间接ELISA检测方法各项条件的优化 |
| 4.4.3 间接ELISA检测方法的特性 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（7）传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 IBV感染临床症状及流行概况 |
| 1.1.1 临床症状 |
| 1.1.2 流行概况 |
| 1.2 IBV病原学概述 |
| 1.2.1 IBV的结构特征 |
| 1.2.2 IBV的理化特性 |
| 1.2.3 IBV的体外培养 |
| 1.2.4 IBV基因组结构 |
| 1.3 IBV结构蛋白及生物学功能 |
| 1.3.1 S(纤突)蛋白 |
| 1.3.2 M蛋白 |
| 1.3.3 N蛋白 |
| 1.3.4 E蛋白 |
| 1.4 IBV的诊断 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 IBVS1蛋白单克隆抗体制备及表位研究进展 |
| 1.5.1 单克隆抗体技术研究进展 |
| 1.5.2 IBVS1蛋白的表位研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 IBVM41S1蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒株和鸡胚 |
| 2.1.2 实验主要仪器及设备 |
| 2.1.3 实验主要试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 IBVM41毒株的扩繁 |
| 2.2.2 IBV M41总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.2.4 引物设计 |
| 2.2.5 PCR扩增S1基因 |
| 2.2.6 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 pMD19-T-S1的构建 |
| 2.2.8 重组载体pET-28a-S1的构建 |
| 2.2.9 重组S1蛋白的表达 |
| 2.2.10 重组S1蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.11 SDS-PAGE |
| 2.2.12 纯化重组S1蛋白 |
| 2.2.13 Western-blot |
| 2.2.14 重组S1蛋白的浓度测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 S1基因的扩增 |
| 2.3.2 pMD19-T-S1载体的构建 |
| 2.3.3 表达载体pET-28a-S1的构建 |
| 2.3.4 S1重组蛋白的表达与可溶性分析 |
| 2.3.5 重组S1 蛋白的复性及Western-blot验证 |
| 2.3.6 重组S1蛋白的浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 S1蛋白抗原区的选择 |
| 2.4.2 表达载体的选择 |
| 2.4.3 蛋白的变性和复性 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 抗IBVM41S1蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物和细胞 |
| 3.1.2 实验主要仪器及设备 |
| 3.1.3 实验主要试剂及耗材 |
| 3.1.4 试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 小鼠血清效价的测定 |
| 3.2.3 SP2/0细胞的培养 |
| 3.2.4 饲养细胞的制备 |
| 3.2.5 脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.10 单抗腹水制备与纯化 |
| 3.2.11 单抗浓度及纯度的测定 |
| 3.2.12 单抗效价及亲和力的测定 |
| 3.2.13 单抗与IBVM41毒株的反应 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清效价的测定 |
| 3.3.2 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 单抗浓度与纯度的鉴定 |
| 3.3.4 单抗效价的测定 |
| 3.3.5 单抗亲和力的测定 |
| 3.3.6 单抗与IBVM41毒株的反应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 IBVM41S1蛋白模拟表位的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验主要仪器及设备 |
| 4.1.2 实验主要试剂及耗材 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 第一轮亲和淘选 |
| 4.2.2 噬菌体的扩增与纯化 |
| 4.2.3 测定洗脱产物和扩增产物的滴度 |
| 4.2.4 第二、三轮噬菌体的淘选 |
| 4.2.5 噬菌斑的扩增与纯化 |
| 4.2.6 阳性噬菌体的鉴定 |
| 4.2.7 阳性噬菌体测序及序列分析 |
| 4.2.8 间接竞争ELISA |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 亲和淘选噬菌体的富集 |
| 4.3.2 阳性噬菌体的鉴定 |
| 4.3.3 噬菌体模拟表位分析 |
| 4.3.4 间接竞争ELISA |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 去污剂浓度、单抗纯度和包被浓度 |
| 4.4.2 模拟表位分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.2 新城疫病毒流行历史和现状 |
| 1.3 新城疫病毒基因组结构和功能 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒研究进展 |
| 2.1 H9N2亚型禽流感病毒概述 |
| 2.2 H9N2亚型禽流感病毒流行历史和现状 |
| 2.3 AIV基因组编码的功能蛋白 |
| 3 新城疫病毒与禽流感病毒共感染研究进展 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第一章 基因Ⅶd亚型NDV-DQ株病毒增殖和致病性测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鸡胚和鸡 |
| 1.2 实验毒株和细胞 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 NDV-DQ株复壮 |
| 2.2 NDV-F4株鉴定 |
| 2.2.1 NDV-F4株RT-PCR鉴定 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 病毒RNA提取 |
| 2.2.1.3 cDNA合成 |
| 2.2.1.4 病毒核酸PCR扩增 |
| 2.2.2 NDV-F4株TCID_(50) 测定 |
| 2.2.2.1 CEF制备 |
| 2.2.2.2 病毒感染CEF |
| 2.2.2.3 TCID_(50)计算 |
| 2.3 NDV增殖和致病性测定 |
| 2.3.1 NDV-F4株HA-HI测定 |
| 2.3.1.1 鸡红细胞悬液配置 |
| 2.3.1.2 HA效价测定 |
| 2.3.1.3 HI效价测定 |
| 2.3.2 NDV-F4株ICPI测定 |
| 2.3.3 NDV-F4株MDT测定 |
| 2.3.4 NDV-F4 株感染鸡胚HA-HI效价测定 |
| 2.3.5 NDV-F4 株感染鸡胚RT-PCR鉴定 |
| 2.3.6 NDV-F4 株感染鸡胚NDV NP基因表达蛋白测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV-DQ株复壮结果 |
| 3.2 NDV-F4株鉴定结果 |
| 3.2.1 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.2.2 NDV-F4株TCID_(50) 测定结果 |
| 3.3 NDV增殖和致病性测定结果 |
| 3.3.1 NDV-F4株HA-HI测定结果 |
| 3.3.2 NDV-F4株ICPI测定结果 |
| 3.3.3 NDV-F4株MDT测定结果 |
| 3.3.4 NDV-F4 株感染鸡胚HA-HI测定结果 |
| 3.3.5 NDV-F4 株感染鸡胚RT-PCR鉴定结果 |
| 3.3.6 NDV-F4 株感染鸡胚NDV NP基因表达蛋白检测结果 |
| 3.3.6.1 标准曲线绘制结果 |
| 3.3.6.2 NDVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 H9N2 亚型AIV-AS株病毒增殖和致病性测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鸡胚和鸡 |
| 1.2 实验毒株和细胞 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AIV-AS株复壮 |
| 2.2 AIV-F4株鉴定 |
| 2.2.1 AIV-F4株RT-PCR鉴定 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 AIV RNA提取 |
| 2.2.1.3 cDNA合成 |
| 2.2.1.4 AIV病毒核酸PCR扩增 |
| 2.2.2 AIV-F4株TCID_(50) 测定 |
| 2.3 AIV增殖和致病性测定 |
| 2.3.1 AIV-F4株HA-HI测定 |
| 2.3.2 AIV-F4株MDT测定 |
| 2.3.3 AIV-F4 株感染鸡胚HA-HI测定 |
| 2.3.4 AIV-F4 株感染鸡胚RT-PCR检测 |
| 2.3.5 AIV-F4 株感染鸡胚AIV NP基因表达蛋白检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 AIV-AS株复壮结果 |
| 3.2 AIV-F4株鉴定结果 |
| 3.2.1 AIV-F4株RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 AIV-F4株TCID_(50) 测定结果 |
| 3.3 AIV增殖和致病性测定结果 |
| 3.3.1 AIV-F4株HA-HI测定结果 |
| 3.3.2 AIV-F4株MDT测定结果 |
| 3.3.3 AIV-F4 株感染鸡胚HA-HI测定结果 |
| 3.3.4 AIV-F4 株感染鸡胚RT-PCR检测结果 |
| 3.3.5 AIV-F4 株感染鸡胚AIV NP基因表达蛋白检测结果 |
| 3.3.5.1 标准曲线绘制结果 |
| 3.3.5.2 AIVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 NDV和 AIV共感染对病毒增殖和致病性影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鸡胚 |
| 1.2 实验毒株 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验设计与分组 |
| 2.2 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒增殖测定 |
| 2.2.1 病毒核酸RT-PCR检测 |
| 2.2.2 病毒NP基因mRNA测定 |
| 2.2.2.1 鸡胚尿囊液和胚体总mRNA提取 |
| 2.2.2.2 鸡胚尿囊液和胚体总mRNA反转录成cDNA |
| 2.2.2.3 qPCR扩增 |
| 2.2.3 病毒NP基因表达蛋白检测 |
| 2.3 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒致病性测定 |
| 2.3.1 病毒HA效价和血清HI效价测定 |
| 2.3.2 眼观大体观察 |
| 2.3.3 组织变化观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒增殖测定结果 |
| 3.1.1 病毒核酸RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1.1 NDV核酸RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1.2 AIV核酸RT-PCR检测结果 |
| 3.1.2 病毒NP基因mRNA测定结果 |
| 3.1.2.1 引物特异性验证结果 |
| 3.1.2.2 NDV NP基因mRNA检测结果 |
| 3.1.2.3 AIV NP基因mRNA检测结果 |
| 3.1.3 病毒NP基因表达蛋白检测结果 |
| 3.1.3.1 标准曲线绘制结果和病毒表达含量结果 |
| 3.1.3.2 NDVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 3.1.3.3 AIVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 3.2 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒致病性测定结果 |
| 3.2.1 病毒HA效价和血清HI效价测定结果 |
| 3.2.2 大体观察结果 |
| 3.2.3 组织变化观察结果 |
| 3.2.3.1 试验Ⅰ组、CG-0组和对照组肝脏组织切片结果 |
| 3.2.3.2 试验Ⅱ组肝脏组织切片结果 |
| 3.2.3.3 试验Ⅰ组、CG-0组和对照组心脏组织切片结果 |
| 3.2.3.4 试验Ⅱ组心脏组织切片结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 基因组特征 |
| 1.1.2 编码蛋白及其功能 |
| 1.1.3 病毒分类及理化性质 |
| 1.1.4 分子流行病学 |
| 1.2 新城疫疫苗研究概况 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3 反向遗传学 |
| 1.3.1 RNA病毒的反向遗传学研究 |
| 1.3.2 反向遗传学在新城疫病毒上的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 多克隆抗体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 主要设备及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的检测 |
| 2.2.2 病毒全基因组序列的测定 |
| 2.2.3 辅助质粒的构建 |
| 2.2.4 POK12载体的改造 |
| 2.2.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 2.2.6 内部基因的构建 |
| 2.2.7 外部基因的构建 |
| 2.2.8 BSR-T7/5细胞的培养 |
| 2.2.9 病毒的拯救 |
| 2.2.10 拯救病毒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR鉴定 |
| 3.2 全基因组扩增 |
| 3.3 全基因组序列分析 |
| 3.3.1 HB株基因组特征 |
| 3.3.2 编码区序列分析 |
| 3.3.3 非编码区序列分析 |
| 3.3.4 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.5 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.3.6 遗传进化分析 |
| 3.4 辅助质粒的构建 |
| 3.5 全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 3.5.1 POK12载体的改造结果 |
| 3.5.2 内部基因和外部基因扩增 |
| 3.6 F蛋白的改造结果 |
| 3.7 拯救病毒的鉴定 |
| 3.7.1 鸡胚病变 |
| 3.7.2 遗传标记检测 |
| 3.7.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.7.4 拯救病毒在细胞上的病变 |
| 3.7.5 拯救病毒的TCID50 |
| 3.7.6 拯救病毒的生长特性分析 |
| 3.7.7 F蛋白裂解位点测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HB株全基因组序列分析 |
| 4.2 NDV弱毒株感染性克隆的构建 |
| 4.3 F蛋白裂解位点的改造 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新城疫概述 |
| 1.1.1 新城疫及其危害 |
| 1.1.2 新城疫流行状况 |
| 1.2 新城疫病毒概述 |
| 1.2.1 新城疫病毒分类 |
| 1.2.2 新城疫病毒结构 |
| 1.2.3 新城疫病毒增殖过程 |
| 1.3 新城疫病毒疫苗及生产 |
| 1.3.1 鸡胚工艺生产病毒疫苗 |
| 1.3.2 细胞工艺生产病毒疫苗 |
| 1.4 BHK-21细胞在病毒疫苗生产上的应用 |
| 1.5 无血清维持培养基 |
| 1.5.1 无血清生长培养基和维持培养基 |
| 1.5.2 无血清维持培养基中各组分的作用 |
| 1.5.3 无血清维持培养基的开发方法 |
| 1.6 基于动物细胞培养技术生产NDV的关键环节 |
| 1.6.1 细胞株筛选 |
| 1.6.2 细胞毒种获得 |
| 1.6.3 病毒接种过程的参数控制 |
| 1.7 本文的研究内容、目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 病毒株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 悬浮BHK-21细胞复苏与培养 |
| 2.2.2 贴壁BHK-21细胞复苏与传代培养 |
| 2.2.3 病毒感染 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 活细胞密度和活率检测 |
| 2.3.2 病毒HA效价检测 |
| 2.3.3 病毒TCID_(50)效价检测 |
| 2.3.4 细胞营养物和代谢物浓度检测 |
| 2.4 数据处理 |
| 2.4.1 比生长速率计算 |
| 2.4.2 MOI计算 |
| 2.4.3 Svy计算 |
| 2.4.4 IVCC计算 |
| 2.4.5 代谢速率计算 |
| 2.4.6 统计学分析 |
| 第3章 基于BHK-21细胞无血清悬浮培养生产NDV的工艺优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方案 |
| 3.2.1 BHK-21单克隆细胞株筛选 |
| 3.2.2 鸡胚毒种在细胞中传代适应 |
| 3.2.3 病毒接种过程的参数优化 |
| 3.2.4 无血清悬浮培养生产NDV工艺建立 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 高产NDV的BHK-21单克隆细胞株筛选 |
| 3.3.2 BHK-v002细胞无血清悬浮培养 |
| 3.3.3 细胞适应的种毒制备 |
| 3.3.4 病毒接种过程的参数优化 |
| 3.3.5 无血清悬浮培养生产NDV工艺建立 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章总结 |
| 第4章 BHK-21细胞悬浮培养生产NDV的无血清维持培养基的开发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方案 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Mixture-Simplex Lattic实验设计及维持培养基筛选 |
| 4.3.2 BMM11维持培养基对病毒产量的影响 |
| 4.3.3 蛋白水解物对细胞增殖和病毒产量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章总结 |
| 第5章 维持培养基BMM11中葡萄糖和谷氨酰胺对NDV扩增的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方案 |
| 5.2.1 维持培养基BMM11中NDV增殖 |
| 5.2.2 缺失葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长和病毒增殖的影响 |
| 5.2.3 葡萄糖和谷氨酰胺浓度对细胞生长和病毒增殖的影响 |
| 5.2.4 pH对病毒HA效价影响的冷模实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 维持培养基BMM11中细胞生长和NDV增殖 |
| 5.3.2 产毒期细胞的葡萄糖代谢 |
| 5.3.3 产毒期细胞的氨基酸代谢 |
| 5.3.4 缺失葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长和病毒增殖的影响 |
| 5.3.5 葡萄糖浓度对细胞生长和NDV增殖的影响 |
| 5.3.6 谷氨酰胺浓度对细胞生长和NDV增殖的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章总结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士在读期间发表论文 |
四、不同毒株鸡传染性支气管炎病毒与鸡新城疫病毒接种鸡胚联合培养相互作用研究（论文参考文献）
- [1]鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备[D]. 林志娴. 扬州大学, 2021
- [2]重组新城疫病毒嵌合表达传染性支气管炎表位疫苗安全性评价[D]. 陈顺. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价[D]. 盛洁. 中国农业科学院, 2021
- [4]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [5]泰安及周边地区规模化蛋鸡场主要病毒性疾病临床诊断调查及免疫程序调整优化[D]. 乔清华. 山东农业大学, 2020(01)
- [6]河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立[D]. 周琦. 河北科技师范学院, 2020(12)
- [7]传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选[D]. 李佳楠. 郑州大学, 2020(02)
- [8]NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响[D]. 赵大杰. 贵州大学, 2020(04)
- [9]基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救[D]. 孟令宅. 河北农业大学, 2020(01)
- [10]BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒[D]. 姬阿美. 华东理工大学, 2020(01)