一、生物信息学及其在菌物学研究上的应用（论文文献综述）
吕斌娜[1]（2021）在《MAPK蛋白激酶基因和磷酸酶基因参与粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生作用的研究》文中研究说明粉红螺旋聚孢霉可寄生多种植物病原真菌,具有巨大的生防潜力,目前已完成全基因测序。课题组前期通过对高效菌株67-1寄生核盘菌转录组测序分析,获得显着上调表达的MAPK蛋白激酶基因Crmapk和细胞壁合成磷酸酶基因Cr Ssd1。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是真菌细胞信号转导过程中一类重要的蛋白激酶,可通过磷酸化级联反应调控真菌生长、产孢、致病等过程,我们前期研究也发现Crmapk在粉红螺旋聚孢霉寄生核盘菌过程中发挥了重要作用。为揭示Crmapk参与菌寄生作用的机制,本研究构建了粉红螺旋聚孢霉酵母双杂交文库,利用酵母双杂和Bi FC技术筛选、鉴定和验证了Crmapk互作蛋白,并对其中的6-磷酸葡萄糖差向异构酶CIP2和蛋白水解酶CIP11进行了功能分析。而蛋白磷酸酶主要是催化已经磷酸化的蛋白质分子去磷酸化的过程,本文通过基因敲除与回补和生物学测定,研究了细胞壁合成磷酸酶基因Cr Ssd1在粉红螺旋聚孢霉寄生菌核过程中的作用。具体结果如下:（1）明确了促分裂原活化蛋白激酶Crmapk在粉红螺旋聚孢霉67-1菌株中的亚细胞定位。通过原生质体转化方法将构建的Crmapk-GFP融合表达载体转入野生型菌株中,利用G418抗性筛选及PCR鉴定,获得Crmapk-GFP融合表达菌株。激光共聚焦显微镜观察发现,Crmapk蛋白定位于粉红螺旋聚孢霉细胞质中。（2）构建了粉红螺旋聚孢霉67-1菌株酵母双杂交文库。文库的总克隆数为1.6×107 CFU/m L,重组率为96%,平均插入片段长度>1 kb,质量较高,可用于67-1菌株互作蛋白和菌寄生机制的研究。（3）筛选和鉴定了Crmapk互作蛋白。构建了Crmapk-BD诱饵载体,检测证明该载体无自激活能力,筛库并一对一验证得到60个候选互作基因。通过生信分析结合寄生转录组数据库分析,预测到42个差异表达基因可能是Fus3/Kss1-MAPK通路的靶标基因。进而利用酵母双杂和双分子荧光互补（Bi FC）技术证明6-磷酸葡萄糖差向异构酶CIP2、信号复合体蛋白CIP3、蛋白水解酶CIP11与Crmapk存在互作。（4）明确了Crmapk互作蛋白6-磷酸葡萄糖差向异构酶CIP2和蛋白水解酶CIP11在粉红螺旋聚孢霉67-1寄生菌核过程中的功能。荧光定量PCR检测发现,CIP2和CIP11基因在寄生核盘菌的不同阶段均上调表达。分别敲除2个基因后,突变株ΔCIP2和ΔCIP11菌落均较为平坦,菌丝稀疏,产孢量显着下降,但对不同胁迫压力的敏感性无显着变化。基因缺失后生防菌株的拮抗能力和寄生能力下降,对大豆菌核病的防效分别为36.3%和31.6%,显着低于野生型水平（71.5%）,基因回补后生防作用恢复。（5）明确了细胞壁合成磷酸酶基因Cr Ssd1在粉红螺旋聚孢霉67-1寄生过程中的功能。本研究利用基因敲除和回补技术发现,敲除突变株ΔCrSsd1的菌丝稀薄,生长减缓,产孢量显着下降,并且几乎丧失产孢能力。突变株对灰霉菌的拮抗作用降低,寄生能力减弱,由3级降为1级,并且对大豆菌核病的防效降低60%。在多种压力胁迫的实验中,突变株对山梨醇和刚果红的敏感性上升。而回补菌株的各项能力均恢复到野生型水平。研究结果为揭示蛋白质磷酸化参与粉红螺旋聚孢霉菌寄生作用的分子机制奠定了理论基础,对进一步挖掘利用高效生防功能基因、提高病害防治水平具有重要的指导意义。
李方东[2]（2021）在《茶树转录组组装评估与多组学生物信息平台开发》文中提出茶树是我国最重要的传统经济作物,其叶制成的茶叶是世界上最受欢迎的仅次于水的第一大非酒精饮品,具有巨大的经济、健康和文化价值。近年来,随着高通量转录组测序技术的广泛应用,有力推进了茶树生物学基础研究进程。然而目前大部分组装软件及其分析流程均依据于模式植物的转录组数据设计的,其在非模式植物如茶上的应用存在诸多问题,因此急需开发适宜茶树转录组组装和分析的方法与策略。同时,随着茶树基因组和代谢组数据的增加,亟待构建能够整合大量不同类型组学信息与分析方法的综合数据分析平台。为此,本研究基于茶树基因组学、转录组学、代谢组学等数据资源,借助通用计算机系统、开放的数据库平台架构、高效的数据库存储系统,并结合智能的搜索引擎、友好多样的数据展示方式和简便易用的生物信息分析工具,优化茶树转录组数据组装策略,构建茶树基因组数据库分析平台,以促进茶树生物学大数据的共享和各类组学的挖掘研究。本研究的主要研究结果如下:（1）利用的茶树八个代表性组织的高深度二代转录组测序数据,通过随机抽取数据法进行全组织混合组装模拟,抽取的测序数据量为32 Gb,然后使用五种主流的转录组从头组装软件（SOAPdenovo、Trans-ABy SS、Trinity、Bridger和Bin Packer）分别进行茶树转录本重构组装,利用植物直系同源单拷贝基因库比对、公共数据库注释和转录本表达模式的分析等统计学方法进行评价。结果发现在使用32 Gb模拟测序数据量进行转录组组装时,Bin Packer组装软件和Bridger组装软件的各项评估指标均优于其他三个软件。进一步比较得出,Bridger软件在转录本N50长度、平均序列长度和序列完整性指标上略优于Bin Packer软件,同时组装的完整性也和茶树三代转录组测序相当,说明这两个软件尤其是Bridger可能更加适合茶树转录本的从头组装。（2）通过随机抽取序列进行不同数据量全组织混合和单组织组装,模拟茶树4-84 Gb测序量下使用上一步已评价较适合的Bridger组装软件分别进行组装,然后评估数据量对茶树转录组组装的影响。通过对组装结果基本指标进行统计和BUSCO评价分析得出,当茶树全组织混合组装的数据量为48 Gb时各项指标均较优,说明48Gb是茶树全（多）组织组装的优先选择的测序量。进一步进行单组织和多个组织不同数据量的组转评估得出:1)随着单组织测序数据量的增加,组装出转录本的数量也在增加,同时BUSCO评估的缺失率也在降低。当数据量达到6 Gb时,8个组织中6个组织的组装BUSCO缺失低于20%;继续增加至数据量至9 Gb时,8个组织组装的BUSCO缺失均低于20%,甚至嫩叶样本的完整性超过90%。2)对多个组织进行不同数据量组装时,其变化规律和单组织组装相似;同时两个以上组织的混合组装得到的转录本数量和完整性也优于单个组织的组装。这些结果说明,单组织组装数据量在6至9 Gb时可以获得较好的结果,性价比较高,但继续增加单组织组装的数据量或者进行多个组织混合组装均可提高转录本的数量和组装完整性。（3）本研究通过广泛收集和自主测序,整理并获得了茶树基因组图谱、24种山茶属植物共计97个转录组、代谢组、甲基化组、种质资源及大量生物和非生物胁迫基因表达谱数据,利用基因表达和代谢物分布模式的相关性等建立起各数据之间的联系;通过Mysql数据库存储、网页服务器工具和基于JAVA语言等各类计算扩展包,构建了以茶树基因图谱为框架的茶树基因组数据库平台。平台通过前端HTML5网页设计数据库整体界面,集成高性能的搜索引擎和友好的可视化工具,为用户提供基本的检索和结果的展示,以及批量下载各类丰富的数据信息。通过集成各类生物信息分析工具（如BLAST,GO和KEGG功能聚类,相关性分析,同源基因搜索,ORF搜寻,多态性SSR位点鉴定和引物设计等）,有助于研究者快速检索以及深度挖掘数据库中丰富的组学数据并实现批量数据获取和可视化。以TPIA收集的不同种茶组植物的转录组和基因组数据为应用实例,本研究初步构建了代表性茶组植物的系统发育框架,结果表明,这些茶组植物物种可分为三组,其中栽培茶树聚集在一起并和C.makuanica、C.tachangensis等构成姐妹组,大理茶是该系统进化关系的基部类群。我们进一步检索了茶组植物叶片中儿茶素和咖啡因的代谢积累数据,然后根据物种分类关系将其映射到构建的系统发育关系上。结果表明,茶叶品质相关代谢物（如儿茶素）的含量随着物种进化轨迹而增加,最近分化的茶树积累的儿茶素和咖啡因比古老分支的物种多。这些数据全面揭示了茶组植物茶叶品质相关特征代谢产物的动态演化,为未来茶树功能基因组学研究和育种提供新的见解和重要线索。综上所述,本研究通过对茶树转录组装策略的研究和优化,探索了适宜茶树二代转录组组装的软件和测序量;同时对基因组学等相关组学数据进行广泛收集和分析,构建了茶树目前最全面的基因组数据库平台,为茶树分子生物学研究提供了丰富的数据和理论基础,将有助于推动茶树功能基因组学、进化生物学和群体遗传学等研究以充分发掘利用茶树优质基因资源,进而指导茶树遗传育种和品种改良,进而促进茶产业的可持续发展。
张雨[3]（2021）在《金针菇采后菌柄伸长调控及复合保鲜技术研究》文中指出金针菇（Flammulina filiformis）采后呼吸代谢旺盛,表层缺乏明显的保护组织,极易发生感官和营养品质的双重劣变。菌柄伸长作为感官劣变的主要表现,在金针菇贮藏中后期表现地尤为严重,直接降低了金针菇的商品价值。但是,目前对于金针菇采后菌柄伸长的研究较少,不同保鲜调控技术对菌柄伸长的调控效果尚不明确,其确切的调控机理也未被证实。为了明确菌柄伸长的采后调控,本文以白色品系的金针菇为试验材料,研究了金针菇采后菌柄伸长的具体位置,筛选构建了菌柄伸长的调控模型,并采用转录组学技术探究了菌柄伸长的调控机理。同时,本文通过对多种金针菇保鲜技术进行试验研究,提出了乳酸钙结合纳米包装的复合保鲜新方法,其可以提升金针菇贮藏品质,延长货架时间。本文的具体研究结果如下:1、采用划线标记法确定出金针菇采后菌柄的伸长部位为菌柄顶端的0-6 mm,其中的0-2 mm伸长较快,2-6 mm伸长较慢。通过筛选多种保鲜技术,试验发现复合膜包装抑制金针菇采后菌柄伸长的效果最好,可以作为延缓菌柄伸长的调控模型,而PE保鲜膜包装效果最差,可以作为相应的对照组。2、通过对延缓组和对照组的菌柄伸长组织进行测序,结果得到上调基因1292个,下调基因1427个。GO和KEGG分析显示,大量差异表达基因在核糖体、蛋白酶体、细胞周期等通路中下调表达;转录因子鉴定得到46类1011个差异表达基因,其中,与菌柄伸长相关的b ZIP家族共检测到15个基因下调,5个基因上调;RT-PCR与转录组测序结果基本一致,验证了转录组测序的准确性,其中检测的葡聚糖合酶（g5946）、葡聚糖酶（g7565）、几丁质合酶（g5217）、γ-淀粉酶（g3457）均出现下调表达。由此推测,复合膜抑制金针菇菌柄伸长的分子机理可能有两方面原因组成,一方面为细胞分裂相关通路的基因表达被下调,使菌柄伸长区细胞分裂缓慢,另一方面为细胞壁扩张的相关基因表达被下调,影响细胞壁扩张,进而抑制了细胞生长。3、通过乳酸钙处理、纳米膜包装以及两者复合处理新鲜金针菇,进行20 d的低温贮藏试验,分析贮藏期间不同处理方式对金针菇主要品质指标的影响。结果表明,乳酸钙处理在抑制开伞和菌柄伸长、延缓可溶性固形物和可溶性蛋白含量下降方面均优于纳米包装,而纳米包装在延缓白度值下降、降低丙二醛积累及抑制风味劣变的效果优于乳酸钙处理;在保持总酚含量方面,两者没有明显的差异。复合处理能够结合乳酸钙处理和纳米膜包装的保鲜优势,有效地保持可溶性蛋白、总酚等营养物质含量,降低呼吸强度和膜脂过氧化程度,更好地提升金针菇贮藏品质。综上所述,本文通过构建金针菇采后菌柄伸长的延缓模型,采用转录组学的研究手段,分析了复合保鲜膜延缓金针菇采后菌柄伸长的机理,并提出了乳酸钙处理结合纳米包装提升金针菇贮藏品质的复合保鲜方法。研究结果可为金针菇采后菌柄伸长调控和减损保质提供理论依据。
刘媛[4]（2021）在《长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究》文中研究指明背景:恶性肿瘤是严重危害我国居民生命健康的主要慢性疾病。根据组织来源的不同,将上皮组织来源的恶性肿瘤统称为癌,而间叶组织来源的则统称为肉瘤,其中骨肉瘤是最常见的间叶组织恶性肿瘤,胃癌则是常见的腺癌。无论是骨肉瘤还是胃癌,探究其发病原因及机制,找到新的治疗靶点和生物标志物,仍是目前研究亟需解决的问题,从而为临床诊断和治疗提供了新的思路和理论基础。lncRNA是一种非编码的RNA转录物,它涉及调控多种机制,包括转录,翻译,蛋白质修饰以及某些信号通路,其中lncRNA可以作为miRNA的海绵,进而调节miRNA的水平和下游基因表达,发挥重要病理生理作用。LBX2-AS1是新近在食管鳞状上皮癌发现的一种促癌lncRNA,作为ceRNA调控靶基因的表达,且能促进胃癌、肝癌、卵巢癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的发展和进程[1-6],但在骨肉瘤中作用却没有报道;LncRNA TUG1则在肺癌[7]、卵巢癌[8]、胰腺癌[9]等多种肿瘤中高表达,还参与调控细胞增殖、凋亡和EMT信号通路,但TUG1在胃癌中的作用还尚不清楚。本文选定恶性肿瘤两种不同组织来源的典型病理类型骨肉瘤及胃癌作为研究对象,探索lncRNAs参与骨肉瘤和胃癌的发生发展。第一部分:长链非编码RNA LBX2-AS1通过LBX2-AS1/miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移目的:（1）阐明LBX2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达水平并探究是否参与调控骨肉瘤的增殖和迁移。（2）阐明LBX2-AS1是否通过作为ceRNA竞争性吸附miR-5010-5p调控下游WNT7B表达,进而影响骨肉瘤的生物学功能。方法:首先培养人成骨细胞h FOB1.19和骨肉瘤Saos-2,143b细胞,通过荧光定量PCR检测LBX2-AS1在成骨细胞和骨肉瘤细胞的表达水平,然后在Saos-2与143b细胞中转染si-LBX2-AS1构建LBX2-AS1低表达细胞株,采用RT-PCR检测si-LBX2-AS1在细胞中的转染效率,通过CCK8实验、划痕实验和Transwell实验检测LBX2-AS1低表达细胞株增殖、迁移及侵袭能力。通过直接结合种子序列预测的方法预测LBX2-AS1调控的miRNA以及下游靶基因,通过荧光素酶报告、Western bolt和RT-PCR验证了LBX2-AS1与miR-5010-5p和WNT7B的关系。采用恢复实验分析LBX2-AS1和miR-5010-5p同时沉默对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果:（1）荧光定量PCR的结果显示,与成骨细胞相比,LBX2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达水平显着升高。（2）RT-PCR结果表明,对照组LBX2-AS1的表达量是转染si-LBX2-AS1骨肉瘤细胞株的3倍（p<0.05）,LBX2-AS1低表达细胞株构建成功。（3）CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果验证了LBX2-AS1促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。（4）预测结果显示miR-5010-5p可能是LBX2-AS1调控的miRNA,而WNT7B则是被调控的下游靶基因,荧光素酶报告实验结果显示miR-5010-5p分别与LBX2-AS1（WT）和WNT7B（WT）共转染可以影响荧光素酶的强度,证明了LBX2-AS1可以与miR-5010-5p结合,而WNT7B则是miR-5010-5p的靶标,Western bolt和RT-qPCR结果验证了LBX2-AS1作为ceRNA吸附miR-5010-5p上调WNT7B。（5）CCK-8、划痕和迁移实验结果证明,在LBX2-AS1低表达细胞中沉默miR-5010-5p,因沉默LBX2-AS1而抑制的增殖和迁移可以被恢复,即LBX2-AS1通过调控miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞增殖和迁移。结论:（1）LBX2-AS1在骨肉瘤中高表达并促进骨肉瘤的增殖和迁移。（2）LBX2-AS1作为ceRNA通过调控miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤进展。第二部分:TUG1在胃癌中作用的生物信息学分析及实验验证目的:（1）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中的表达水平、与临床特征的相关性以及诊断价值。（2）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中的潜在作用。（3）实验初步验证TUG1对胃癌多药耐药,迁移,侵袭的影响。方法:（1）下载TCGA数据库中胃腺癌相关的临床数据和RNAseq数据,分析TUG1在配对和非配对的正常组织和癌组织中的表达。（2）使用TCGA数据库中胃腺癌相关临床数据分析TUG1表达与临床特征之间的相关性。（3）使用KM plotter数据库分析TUG1对胃腺癌患者总生存率OS（n=881）、首次进展时间FP（n=645）、和无疾病进展时间PFS（n=503）的影响。（4）使用TCGA数据库中胃腺癌相关的临床数据和RNAseq数据分析TUG1在胃腺癌中的诊断价值。（5）分析TCGA数据库胃腺癌中TUG1的共表达基因,对其进行GO/KEGG富集分析。（6）将TCGA数据库中胃腺癌相关RNAseq数据按照TUG1的高低表达进行分组,GSEA分析TUG1相关的生物学过程和信号通路。（7）免疫组化验证TUG1在胃癌组织切片中的表达,同时分析其与临床病理特征的相关性及生存分析。（8）RT-PCR比较TUG1在胃癌细胞株及耐药细胞株的表达差异;（9）构建稳转的TUG1过表达的胃癌细胞株和沉默的耐药细胞株,通过流式细胞术和RT-PCR检测转染成功与否;（10）通过CCK-8、划痕和迁移实验检测TUG1过表达及沉默对胃癌细胞的增殖、迁移和耐药的影响。结果:（1）胃腺癌组织中的TUG1基因表达水平在配对样本和非配对样本中均显着高于正常组织。（2）TUG1的高表达与年龄（p=0.044）,抗反流治疗（p=0.001）,疾病特异性生存率（p=0.038）显着相关。（3）TUG1高表达与不良的总生存率,无进展生存率和首次进展率相关。（4）GO/KEGG富集分析结果表示TUG1参与调控细胞周期和DNA复制相关通路。（5）GSEA分析表示TUG1参与增殖的正向调节,底物依赖性细胞迁移以及凋亡执行阶段的调节。（6）RT-PCR结果显示TUG1在胃癌耐药株中表达高于胃癌细胞株。（7）TUG1过表达的胃癌细胞株及沉默的耐药细胞株构建成功。（8）CCK-8、划痕和迁移实验结果表明TUG1促进胃癌细胞的耐药、迁移和侵袭。结论:（1）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中可以作为诊断的分子标志物,并参与调控增殖,迁移以及DNA复制相关通路（2）实验验证结果表明TUG1上调促进了细胞增殖和迁移进而增加胃癌耐药。
王晶[5]（2021）在《中国明对虾低温胁迫的转录组分析及耐低温相关基因验证》文中提出中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国北方重要的海水虾虾类养殖品种,具有极高的经济价值,由于其放苗温度要求高于14℃,限制了它的养殖区域和养殖时间,从而影响了它的上市规格和单位产量。对中国明对虾耐低温品系的培育至关重要,能够扩增养殖区域和养殖大小。本研究通过对中国明对虾仔虾进行低温胁迫处理并进行低温胁迫组与常温对照组的转录组分析,筛选出与耐低温性状相关的基因进行生物信息学分析,并进行原核表达及耐低温验证,以期确定中国明对虾耐低温分子标记,为中国明对虾的耐低温良种培育奠定理论基础。通过对中国明对虾仔虾40日龄野生、40日龄选育、10日龄野生的常温对照组和低温胁迫组共12个样本进行转录组测序,测得576.53 M Raw Reads,过滤后得到521.39 M clean reads,占比90.43%,组装并去冗余后共得到75,905个Unigene。共有 41986 条 Unigene 获得注释,占 All-Unigene 的 55.31%,其中 KEGG数据库注释35.77%、GO数据库注释11.93%。10日龄野生组有14,618个差异基因,其中5,703个上调、8,915个下调;40日龄野生组有13,870个差异基因,其中6,821个上调、7,049个下调;40日龄选育组有22,914个差异基因,其中12,783个上调、10,131个下调。在差异基因的GO注释中,生物过程类注释有20项,富集最多的两类是代谢过程和细胞过程,根据富集气泡图可以看出,细胞过程中mRNA进程和基因表达调控富集最多;细胞组分类注释有14项,富集最多的依次是膜类、膜部分类、细胞类和细胞部分类、细胞器类;分子功能类注释有8项,富集最多的两类则是连接类和催化活性类,根据富集气泡图可以看出,连接类中染色质连接和序列特异性DNA连接富集最多,催化活性类中DNA结合转录因子活性最多。差异基因的KEGG注释主要富集在环境信息处理通路的信号转导通路、代谢及有机系统的免疫系统和内分泌系统相关途径中。以小亚基核糖体蛋白基因为内参基因,对 CL161.Contig1、CL2560.Contig1、CL2861.Contig5、CL5186.Contig2四个基因的real time RT-PCR验证与测序结果相同,表明转录组数据的可靠性。通过转录组数据分析,得到在7个以上比较组中上调的高表达量显着差异基因9个,包括:含bZIP的转录因子、rRNA、RRM域蛋白质、细胞色素b5样蛋白、肌钙蛋白C、胞外蛋白、微管蛋白亚型、lncRNAs。其中,rRNA、细胞色素b5样蛋白及lncRNAs在低温条件下上调表达,在响应低温的相关表达中属于新发现。选择显着上调差异表达基因生物信息学分析为细胞色素b5样蛋白的CL2861.Contig5序列进行了开放阅读框预测和蛋白序列分析,得到一个开放阅读框ORF2861,预测出ORF2861的分子量为16.7kDa,无信号肽、无跨膜区、亚细胞定位可能为内质网,二级结构预测为螺旋有21.33%、β-链有6%、环有72.67%。以大肠杆菌BL21为宿主,利用同源重组方法构建了 pET28a-2861、pET29b-MBP-2861两个重组表达载体,形成表达菌株。16℃ IPTG诱导表达时,pET29b-MBP-2861可溶性表达。通过对是否表达重组蛋白的菌株在0℃和-20℃低温处理12小时及0℃低温处理0-17天的存活率比较,结果表明,重组蛋白的表达明显提高了菌株在低温条件下的存活率。分离纯化后的重组蛋白在体外不能发挥耐低温作用。
邱超[6]（2021）在《发展rpoC基因为肠道菌群调查的新分子标记及其在中医药微生态研究中的应用》文中认为目的:肠道微生物群可以被视为一种代谢“器官”,参与着宿主的生命活动。目前在肠道菌群的分离、鉴定及分类中,16S rRNA基因技术为黄金标准。然而,16S rRNA基因技术存在局限性。本文旨在发展新方法对16S rRNA基因技术进行补充,并对其在中医药微生态中的应用进行分析。方法:1、基于perl语言对16S rRNA基因技术的局限性进行理论上的分析,并从NCBI数据库中典型肠道菌全基因组进行获取,比对找到同源性高的片段设计通用引物,测试找到能稳定扩增的通用引物。2、通过人工模拟肠道菌群总DNA,并利用rpoC基因引物与16S rRNA基因的不同引物对其进行扩增,基于一代sanger测序获得多样性特征,进行全面对比。3、获取模拟肠道菌群总DNA、正常大鼠肠道菌群总DNA、正常人类肠道菌群总DNA,并利用rpoC基因引物与16S rRNA基因引物对其进行扩增,基于二代、三代测序获得多样性特征,进行全面对比。4、获得理中汤治疗AAD模型大鼠过程中的肠道菌群总DNA,并利用rpoC基因引物与16S rRNA基因引物对其进行扩增,基于二代、三代测序获得多样性特征,进行全面对比。结果:1.分别对11个典型肠道菌门（Bacteroidetes、Firmicutes、Alpha Proteobacteri a、Beta Proteobacteria、Gamma Proteobacteria、Delta Proteobacteria、Epsilon Proteo bacteria、Actinobacteria、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Spirochaetes）的大量细菌的16S rRNA基因拷贝数进行统计,肠道菌群的典型门类中,Alpha Proteob acteria、Beta Proteobacteria、Gamma Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes的16S rRNA基因平均拷贝数分别为2.55、3.8、5.19、6.57、3.46,带有多拷贝16S rRNA基因的菌株超过70%,8个拷贝以上的菌株存在16S rRNA基因序列的异化。随机提取的312条rpoC功能基因中,序列整体平均差异率集中在20-60%,远远高于16S rRNA基因的5-30%。对比门内菌株比较碱基相似性,Proteobacte ria门集中在40-44%,Firmicutes门集中在42-45%;基于蛋白质水平比较,Prote obacteria门相似性较低,只有23-30%,Firmicutes门拥有45-57%的高相似性。观察分析,有13个明显的保守区可用于设计引物和探针。理论上看:16S rRNA基因多拷贝现象普遍存在;碱基差异率功能基因高于16S rRNA基因2.基于一代sanger测序比较4对16S rRNA基因通用引物与rpoC基因对模拟肠道菌群结构的描述,其中模拟肠道菌群样中门类的实际比例为:Bacteroidetes门占8.97%,Firmicutes门62.82%,Proteobacteria门占28.21%;引物8F/518R扩增获得的多样性结果:Bacteroidetes占0.52%,Firmicutes门占71.35%,Proteobacteria门占28.36%,属水平的命中率为80%;引物338F/806R扩增获得的多样性结果:Bacteroidetes门占5.38%,Firmicutes门占61.83%,Proteobacteria门占32.79%,属水平命中率为73.3%;引物515F/926R扩增获得的多样性结果:Bacteroidetes门占13.30%,Firmicutes门占59.04%,Proteobacteria门占28.36%,属水平命中率为80%;引物27F/1492R扩增获得的多样性结果:Bacteroidetes门占0.50%,Firmicutes门占60.50%,Proteobacteria门占39.00%,属水平命中率为80%;rpoC基因引物扩增获得的多样性结果:Bacteroidetes门占36.68%,Firmicutes门占35.69%,Proteobacteria门占27.63%,属水平命中率为66.67%。基于门水平的多样性调查,338F/806R和515F/926R获得了更加接近的多样性结果,rpoC偏好扩增Bacteroidetes门。基于属水平的多样性,应用比较广泛的4对16S rRNA基因通用引物在属的命中率皆高于rpoC基因,但是依然无法扩增出全部菌属,如Clostridioides属与Salmonella属,而rpoC基因却能很好的扩增出来。3.基于高通量测序比较16S rRNA基因与rpoC基因对模拟肠道菌群（M）、正常大鼠肠道菌群（R1,R2）和正常人类肠道菌群（F,Q）结构的描述,在菌群结构上,M样为已知样,基于16S rRNA基因高通量测序获得了多样性结果如下:Bacteroidetes门占9.03%,Firmicutes门占58.49%,Proteobacteria门占32.48%,基于rpoC基因的高通量测序获得了多样性结果如下:Bacteroidetes门占18.60%,Firmicutes门占57.24%,Proteobacteria门占24.09%。模拟肠道菌群（M）与普通肠道菌群（R1,R2,F,Q）5个样品中,OTU计数结果:基于rpoC基因分子标记,模拟肠道菌群（M）获得了115个OTU,正常大鼠肠道菌群（R1,R2）分别获得了437与307个OTU,正常人类肠道菌群（F,Q）分别获得了392与309个OTU;基于16S rRNA分子标记,模拟肠道菌群（M）获得了29个OTU,正常大鼠肠道菌群（R1,R2）分别获得了628与552个OTU,正常人类肠道菌群（F,Q）分别获得了148与165个OTU。稀释曲线上,16S rRNA基因在20000reads时就已经趋于平稳,而rpoC基因曲线并未趋于平稳。OTU计数结果rpoC基因在模拟肠道菌群样M、正常人类肠道菌群样F、Q在OTU数量上存在优势,而16S rRNA基因在正常大鼠肠道菌群样R1、R2上存在优势。在属水平上,无论是16S rRNA基因还是rpoC基因都无法命中全部的属。在属的命中率上,rpoC基因要低于16S rRNA基因。4.基于两种分子标记对理中汤治疗AAD模型大鼠过程中（DML1:正常喂养大鼠肠道粪便取样;DML2:抗生素灌胃一周后粪便取样;DML3:艰难梭菌灌胃一周后粪便取样;DML4:理中汤治疗后粪便取样）的肠道菌群结构变化进行调查,发现OTU变化趋势,α多样性指数变化趋势及治疗过程AAD大鼠F/B比值变化趋势相同。在属的水平,正常大鼠肠道菌群样DML1中,rpoC基因与16S rRNA基因分别命中65与129个属,两种方法共同命中24个属,rpoC方法获得的优势菌属为Lactobacillus属、Campylobacter属、Bacteroides属、Prevotella属和Barnesiella属,16S rRNA基因方法获得的优势菌属为Bacteroidales属、Lactobacillus属和Bacteroides属;抗生素灌胃后样本DML2中,rpoC基因与16S rRNA基因分别命中11与67个属,两种方法共同命中8个属,rpoC方法获得的优势菌属为Bacteroides属、Escherichia属,16S rRNA基因方法获得的优势菌属为Bacteroides属、Escherichia属和Bacteroidales属;艰难梭菌灌胃后样本DML3中,rpoC基因与16S rRNA基因分别命中28与71个属,两种方法共同命中12个属,rpoC基因方法获得的优势菌属为以Bacteroides属、Lachnoclostridium属、Parabacteroides属,16S rRNA基因方法获得的优势菌属为Bacteroides属、Bacteroidales属、Ruminococcaceae属;理中汤汤剂治疗后中rpoC基因与16S rRNA基因分别命中63与110个属,两种方法共同命中30个属,rpoC基因方法获得的优势菌属为Barnesiella属、Mordavella属、Francisella属、Prevotella属,16S rRNA基因方法获得的优势菌属为Bacteroidales属、Lactobacillus属、Prevotella属和Bacteroides属。不难看出,无论是16S rRNA基因还是rpoC基因在属水平上都无法获得全部的属。在属的命中率上,rpoC基因要低于16S rRNA基因。无论是基于rpoC基因的属的数量,还是16S rRNA基因的属的数量,都呈现同样的趋势。结论:（1）通过perl编程,对肠道主要的几大细菌门基因组分析,发现近70%的基因组16S rRNA基因存在多拷贝现象,而rpoC基因为单拷贝基因;不同门水平的16S rRNA基因的碱基差异率为5-30%（DNA水平）,而rpoC基因序列的碱基差异率为20-60%,具更高的碱基突变率,基因组的生物信息学分析显示rpoC基因是极具潜力的分子标记基因;（2）无论是对不同的环境样、还是采用不同的测序技术（一、二、三代测序技术）,基于16S rRNA基因的菌群检测技术均无法全部获得菌群的真实多样性,需要其它分子标记（如rpoC基因的分子标记的补充和验证）;（3）在本论文的中药模拟治疗AAD动物模型菌群多样性变化的研究中,基于rpoC基因为分子标记的技术获得了和16S rRNA基因技术相近的结果,但在菌群丰度检测和近缘菌分辨等方面,rpoC基因技术可以补充16S rRNA基因技术的缺点;（4）二三代测序技术测序深度高的优点无法弥补16S rRNA基因固有的缺陷“分辨率相对较低/无法穷尽所有多样性”,而rpoC基因分子标记可以对16S rRNA基因技术起补充作用。
谭占坤[7]（2021）在《藏猪耐粗饲特性与肠道微生态环境的相关性研究》文中研究说明藏猪是青藏高原特有的地方型猪种,主要生活在高山、峡谷、草地、森林及乡村的田间地头,千百年来为藏区同胞提供了必需的肉类食物。藏猪常年放牧养殖,生活环境多样,食物来源广泛,也面对恶劣的自然环境,因此形成了抗高寒、耐缺氧、耐粗饲、抗逆性强以及肉质鲜美等优良特性。国家十分重视优良地方种质资源的保护与开发,西藏于2017年提出了藏猪产业规划,适度规模化藏猪养殖势在必行。藏猪生长速度较慢,营养需求与瘦肉型猪明显不同,能够消化较高的饲粮纤维。藏猪本身并不能分泌消化饲粮纤维的酶类,一般认为,饲粮纤维的消化主要依靠大肠中的微生物来完成。目前,藏猪的耐粗饲能力还未见到数据来支撑,其耐粗饲机理研究也很有必要。本研究,以饲喂在林芝市典型放牧养殖基地的放牧藏猪为研究对象,舍饲藏猪和瘦肉型商品猪（杜长大三元杂交猪,DLY猪）为对照,比较了在原始状态下3个类型猪大肠（盲肠和结肠）中细菌群落的结构和多样性,研究细菌群落间的相关性,获取3个类型猪大肠内的特异细菌群落;同时,以相同背景群体的150日龄左右放牧藏猪、舍饲藏猪和DLY猪各10头为对象,饲喂10%粗纤维水平玉米-豆粕型饲粮,试验期共15 d,采用指示剂法收集5 d粪便,比较3个类型猪对饲粮营养物质特别是纤维类物质的表观消化率,获取放牧藏猪耐粗饲特性的数据,并测定生产性能与血液生理生化指标;收粪期结束后,将试验猪屠宰,测定盲肠与结肠形态,以及盲肠、结肠和粪便中纤维消化酶活、挥发性脂肪酸与p H值,采集消化道（胃、小肠、大肠、直肠）食糜,通过16S r RNA高通量测序技术测定细菌V3-V4区域序列,比较细菌在门、纲、目、科、属水平下的结构与组成,进行差异显着性分析,与饲粮纤维表观消化率进行Pearson相关性分析,获取关键细菌群落;采用单分子实时测序技术（SMRT）,测定粪便中细菌与真菌群落的结构及多样性,进行单因素方差分析以及与饲粮纤维表观消化率进行Pearson相关性分析,获取粪便中关键微生物物种。采用转录组学研究了3个类型猪盲肠与结肠肠段中与挥发性脂肪酸吸收利用显着相关的差异表达基因（DEGs）和通路,从转录水平来初步探索了藏猪的耐粗饲特性。结果如下:1、天然状态下,放牧藏猪盲肠与结肠细菌具有更高的丰富度与多样性,厚壁菌门（Firmicutes）是相对丰度共同最高的门,放牧藏猪放线菌门（Actinobacteria）（盲肠与结肠）与疣微菌门（Verrucomicrobia）（盲肠）相对丰度显着高于其他2个类型猪（P<0.05）。放牧藏猪盲肠中双歧杆菌属（Bifidobacterium）、Dehalobacterium、YRC22、萨特氏菌属（Sutterella）、费氏刺骨鱼菌属（Epulopiscium）、Shuttleworthia、艰难杆菌属（Mogibacterium）、Allobaculum、贪铜菌属（Cupriavidus）、草酸杆菌属（Oxalobacter）与丛毛单胞菌属（Comamonas）,结肠中双歧杆菌属（Bifidobacterium）、Dehalobacterium、萨特氏菌属（Sutterella）、YRC22的相对丰度显着高于舍饲藏猪与DLY猪（P<0.05）。2、150 d DLY猪体重、增重、采食量与料肉比均显着优于藏猪。放牧藏猪饲粮粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素和半纤维素表观消化率显着高于舍饲藏猪与DLY猪（P<0.05）;DLY猪粗脂肪、粗蛋白质与总能表观消化率最高,放牧藏猪最低（P<0.05）。血液生理生化指标表明,放牧藏猪具有与高原低氧相适应的血液细胞（P<0.05）,DLY猪的血液代谢更佳（P<0.05）。3、放牧藏猪盲肠、结肠与粪便中纤维素酶与半纤维素酶活力均显着高于舍饲藏猪与DLY猪（P<0.05）。盲肠、结肠与粪便p H值中性略偏酸,但3个类型猪差异未达到显着水平（P>0.05）。DLY盲肠、结肠与粪便中含有丰富的乙酸、丙酸和丁酸,放牧藏猪乙酸以及盲肠、结肠、粪便丁酸含量、结肠丁酸含量显着高于舍饲藏猪（P<0.05）。纤维素酶与饲粮纤维类物质的表观消化率呈显着的正相关（P<0.05）,盲肠和粪便半纤维素酶与饲粮粗纤维和半纤维素表观消化率呈显着的正相关（P<0.05）,盲肠乙酸含量与饲粮半纤维素表观消化率呈显着的正相关（P<0.05）。4、从胃到直肠,消化道微生物发生了明显的改变。胃中微生物由于受到环境因素的影响与小肠中微生物明显不同,小肠中聚集了大量与碳水化合物、蛋白质和脂肪消化相关的微生物,大肠中的微生物主要与剩余营养物质的酵解有关。纤维杆菌门（Fibrobacteres）和纤维杆菌属（Fibrobacter）与饲粮纤维类物质的表观消化率呈显着的正相关关系（P<0.05）,放牧藏猪盲肠与结肠中的相对丰度显着高于舍饲藏猪与DLY猪（P<0.05）。5、通过三代测序技术,在18个粪便样品中共鉴定出细菌15个门、26个纲、48个目、87个科、190个属、419个种,鉴定出真菌4个门、13个纲、23个目、39个科、55个属、58个种。粪便细菌中纤维杆菌门（Fibrobacteres）、变形菌门（Proteobacteria）、琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）、Sphaerochaeta、纤维杆菌属（Fibrobacter）、Anaerovorax、Alloprevotella rava、Fibrobacter intestinalis、Succinivibrio dextrinosolvens、Papillibacter cinnamivorans,真菌中单胞瓶霉属（Phialemonium）、柄孢壳菌属（Podospora）、Lacrymaria、Phialemonium atrogriseum、Phialemonium inflatum、Lacrymaria subcinnamomea与饲粮纤维类物质表观消化率呈显着正相关（P<0.05）,以上微生物类群在放牧藏猪粪便中的相对丰度显着高于舍饲藏猪与DLY猪。6、通过转录组分析表明,共有9个差异表达基因（DEGs）ZFY（y型锌指蛋白,zinc finger protein Y-linked）、AADAT（氨基乙二酸转氨酶,aminoadipate aminotransferase）、CLDN8（紧密连接蛋白8抗体,claudin 8）、EIF1AY（真核翻译起始因子1A y链,eukaryotic translation initiation factor1A Y-linked）、KDM5D（赖氨酸脱甲基酶5D,lysine demethylase 5D）、LDHB（乳酸脱氢酶B,lactate dehydrogenase B）、MYL2（肌球蛋白轻链2,myosin light chain 2）、PLA2G2A（磷脂酶A2组IIA,phospholipase A2group IIA）、SLC22A14（溶质载体家族22成员14,solute carrier family 22member 14）可能与盲肠和结肠中纤维降解产物的利用相关。通过差异基因KEGG富集发现盲肠与结肠中丙酸代谢（Propanoate metabolism）、糖酵解和糖原异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）与丁酸甲酯代谢（Butanoate metabolism）等代谢通路是放牧藏猪饲粮纤维消化产物的重要代谢途径。综上所述,本研究的主要结论为:（1）放牧藏猪具备耐粗饲的能力。藏猪作为高原小型地方型猪种,其生长较慢,饲料报酬较低;在放牧养殖的条件下,藏猪形成了耐粗饲的良好能力,消化饲粮纤维类物质的能力比舍饲养殖的猪种要高10%以上。放牧藏猪的耐粗饲能力与其饲养环境密切相关,在相同的养殖条件下,品种（藏猪与瘦肉型猪）并不会对饲粮纤维类物质的消化造成影响。（2）盲肠与结肠微生物及其分泌的消化酶类为藏猪耐粗饲提供了消化动力。放牧藏猪耐粗饲特性的机制与其肠道微生态环境密切相关,纤维杆菌门（Fibrobacteres）及其所属的细菌是降解饲粮纤维类物质的关键细菌,肠道纤维素酶与半纤维素酶提供了降解饲粮纤维类物质的酶学动力。（3）盲肠与结肠多个基因及代谢通路为藏猪饲粮纤维的消化产物提供了吸收及代谢动力。盲肠与结肠中丙酸代谢（Propanoate metabolism）、糖酵解和糖原异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）与丁酸甲酯代谢（Butanoate metabolism）等代谢通路是放牧藏猪饲粮纤维消化产物的重要代谢途径。
彭跃进[8]（2021）在《球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX维持膜稳态及调控铁饥饿响应的生理机制》文中进行了进一步梳理球孢白僵菌（Beaueria bassiana）是一种宿主范围和生防潜力俱佳的虫生丝状病原真菌。无论在离体环境中,还是寄生在宿主体内,它适应环境所演化出的一系列机制均利于其生态位的发展。在生态系统中,铁饥饿稳态对于真菌的生长发育以及物种的传代和壮大都至关重要。在铁胁迫环境下,真菌已演化出一套保守的铁吸收和利用系统,以帮助其度过环境变化所带来的威胁。在物种演化过程中,膜稳态是细胞维持机体正常运转的必要条件之一,对于真菌物种来说尤为重要。它不仅要平衡来自内部（细胞质）和外部（细胞壁）的机械压力,还要精准完成脂质和蛋白的组装和调配。本研究通过基因功能分析发现bZIP型转录因子BbHapX下游靶标BbOle1、BbLip1、BbLec1和BbCFEM家族基因,并结合经典遗传学、细胞生物学、生物信息学和分子生物学手段验证,对BbHapX响应铁饥饿调控和膜稳态调控两方面的功能进行解析。BbHapX维持真菌分生孢子质膜稳态和细胞膜功能分生孢子萌发不仅是环境传播的基础,而且是感染的关键步骤。在昆虫病原真菌球孢白僵菌中,我们从遗传上表征了碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子HapX（BbHapX）在分生孢子养分储备和病原体-宿主相互作用中的作用。BbHapX的缺失导致体表接种和血腔注射试验中毒力几乎完全丧失。转录组学分析显示,脂肪酸（FA）/脂质代谢需要BbHapX,而生化分析表明BbHapX的损失导致分生孢子FA含量显着降低。外源油酸可以部分或完全恢复ΔBbHapX突变体受损的表型,包括萌发率、膜完整性、营养生长和毒力。BbHapX介导真菌铁的获取,这对于硬脂酸的去饱和是不需要的。另外,Δ9-脂肪酸去饱和酶基因（BbOle1）失活产生的缺陷与ΔBbHapX突变体相似。油酸还对ΔBbOle1突变体的缺陷表型具有显着的修复作用。凝胶阻滞试验显示BbHapX直接调节BbOle1的表达。脂质组学分析表明,BbHapX和BbOle1都有助于具有来自油酸的非极性尾巴的磷脂的稳态。因此,外源性磷脂可以显着恢复膜的完整性。这些数据表明,HapX-Ole1途径有助于分生孢子脂肪酸/脂质储备,并且在由球孢白僵菌引起的感染的早期阶段所涉及的脂质生物学与膜功能之间存在重要的联系。BbLip1通过调节膜脂稳态启动侵染循环脂肪酶是支持生物生长和发育的必不可少的一类酶。它们不仅催化生化反应（如酯化和酯交换）,而且在维持脂质稳态和细胞代谢方面也起着重要作用。脂肪酶负责将存储在脂滴中三酰基甘油催化降解为游离脂肪酸和甘油三酯。在球孢白僵菌中,BbLip1的缺失不仅会直接导致球孢白僵菌在生长发育和毒力方面造成生理缺陷,还引起油酸含量显着下降50%。当体外添加油酸时,能够部分恢复BbLip1缺失所造成的缺陷。凝胶阻滞结果表明,BbHapX能够转录激活BbLip1的表达。脂质组学分析表明,BbLip1的缺失直接导致真菌分生孢子内游离脂肪酸和贮存脂质的比例失衡。以上结果表明,球孢白僵菌BbHapX转录激活BbLip1参与到脂滴分解代谢,并影响丝状真菌的生长发育、氧化胁迫和毒力,最终贡献于质膜稳态。凝集素蛋白BbLec1参与细胞膜壁稳态凝集素具有碳水化合物结合能力的特征,并在真菌生理学中起着广泛作用。球孢白僵菌是一种丝状昆虫病原真菌,具有一种类似凝集素的蛋白质,其中含有一个Fruit Body＿domain（BbLec1）。BbLec1可以与真菌细胞壁中的壳二糖和几丁质结合。BbLec1蛋白显示出它们自身之间相互作用的潜能,并易位进入了分泌泡。此外,BbLec1与分泌泡蛋白PliA相互作用,这两个蛋白之间的相互依赖性对于稳定分泌泡的结构至关重要。本研究通过构建基因敲除株和回补株,对BbLec1在球孢白僵菌中的功能进行了解析。值得注意的是,BbLec1的丧失导致菌丝体和分生孢子中细胞壁的受损以及分生孢子的形成能力。此外,BbLec1的破坏导致细胞膜完整性降低和对渗透压的敏感性增强。最后,与野生型相比较,ΔBbLec1突变株表现出较弱的毒力。综上,BbLec1作为一种分泌泡成分,保持了分泌泡的结构和功能,这对于丝状昆虫病原真菌球孢白僵菌的致病性至关重要。BbCFEM家族响应铁饥饿调控的生理机制铁作为大多数原核生物和所有真核生物应激反应所必需的微量元素,它对于细胞维持必要的生长代谢至关重要。而CFEM（Cysteine-rich Fungal Extracellular Membrane）家族是真菌细胞中一类具有能够捕获生物铁的八个半胱氨酸保守残基的细胞外膜蛋白家族。在球孢白僵菌中,CFEM基因（BbCFEM）家族参与铁饥饿调控机制是非常保守的。体表侵染和血腔注射的毒力测定结果显示,BbCFEM家族基因在响应铁饥饿调控方面存在补偿效应,其补偿机制的存在取决于真菌面临的外界环境中铁水平的高低。与黄曲霉、黑曲霉和布氏白僵菌的体外铁竞争结果表明,在体外缺铁环境中,BbCFEM家族基因有助于球孢白僵菌与其它真菌竞争铁以供细胞生长。与布氏白僵菌的体内竞争结果显示,BbCFEM家族基因真菌在寄主体内与其他昆虫病原真菌竞争并获取铁。综上,球孢白僵菌BbCFEM家族在响应铁饥饿调控方面高度保守。并且,在不同铁饥饿环境下,BbCFEM家族基因在毒力方面存在着独特的补偿效应。此外,BbCFEM家族基因能够帮助真菌在体外腐生环境、昆虫体表侵染阶段、昆虫血腔增殖和腐生阶段完成生物铁的竞争和获取,并有助于真菌的分化发育和毒力。总而言之,本论文围绕球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX的生物学功能开展研究。研究结果揭示BbHapX通过调控若干生理途径参与菌体应对铁饥饿响应和维持细胞膜稳态,进而决定真菌的毒力。本研究获得的主要结果如下:（1）揭示了BbHapX通过调控硬脂酰去饱和酶基因BbOle1转录,调节油酸的生成,进而影响菌体的磷脂稳态,最终维持细胞膜的完整性;（2）证实了BbHapX通过转录酯酶基因BbLip1调控脂质分解成脂肪酸的过程,并贡献于膜脂的稳态;（3）证实了BbHapX转录激活类凝集素基因BbLec1。揭示了该凝集素通过外分泌泡转运至细胞膜壁间隙,维持细细胞膜壁的完整性;（4）证实了CFEM家族基因参与球孢白僵菌应对环境中不同的铁利用度。同时,初步揭示了CFEM家族基因介导的铁获取能力参与球孢白僵菌与其它物种的种间竞争。研究结果为进一步阐明昆虫病原真菌侵染宿主和适应环境的机制提供新的理论认识。
王凯[9]（2021）在《深海微生物酶特异性降解硒化卡拉胶的分子机制研究》文中研究说明深海微生物在多重极端的生存环境下进化出多种多样的生物酶系统,对深海微生物资源开发和利用有助于新型酶资源的挖掘。本文首次从深海冷泉泥样中分离出可降解硒化卡拉胶的细菌,采用基因工程技术对其硒化卡拉胶酶基因进行了原核表达,并对酶解产物硒寡糖进行了结构与功能的初步研究,以期为应用酶法制备技术大量绿色生产硒寡糖提供技术支撑,为硒寡糖的大范围应用奠定基础。具体研究内容如下:（1）从南海冷泉泥样中筛选到3株能够降解硒化卡拉胶的细菌,通过DNS法比较其胞外酶活,其中以芽孢杆菌Bacillus sp.N1-1活性最高,达到30.12 U/mg。（2）全基因组测序分析结果表明芽孢杆菌Bacillus sp.N1-1环状基因组大小为4,497,340 bp,预测到的编码基因有4,683个,完成其GO、KEGG、CAZy等数据库的功能注释。碳水化合物活性酶（CAZy）数据库注释结果显示,Bacillus sp.N1-1基因组包含138个编码碳水化合物活性酶的基因。（3）通过对编码基因及注释结果进行筛查,获得了硒化卡拉胶酶的候选基因,其属于糖苷水解酶第16（GH16）家族,ORF长度为2133 bp。将该基因切除信号肽后的基因序列进行了异源表达及功能验证,发现表达成功的工程菌经破碎后的上清液具有硒化卡拉胶降解功能,该基因与目前已知的卡拉胶酶基因同源性仅为27.04%-28.12%,说明该序列具有新颖性。（4）经过优化,诱导表达条件为:添加0.7 m M的IPTG在20℃下诱导。对重组硒化卡拉胶酶进行了Ni-琼脂糖亲和纯化,并对其酶学性质进行了研究,发现该酶最适反应温度为40℃,最适反应p H为7,Cu2+可使重组酶失去80%的酶活,测得酶动力学常数为0.2389 mg/m L,酶与底物亲和力较强。（5）利用质谱法分析酶解后的硒化卡拉胶寡糖,发现硒化卡拉胶酶解后主要产生聚合度为二–四的硒寡糖。红外光谱结果显示,酶解得到的硒寡糖与原本的硒化卡拉胶红外吸收曲线基本一致,说明硒化卡拉胶的基本骨架未受到较大影响。（6）将分离纯化后的硒寡糖进行了肿瘤细胞试验,发现其能在一定程度上抑制人慢性粒细胞白血病细胞K562和人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖。在作用浓度为12.5μg/m L时,硒寡糖对K562细胞增殖的抑制率要显着高于硒化卡拉胶（P<0.001）;在作用浓度为25μg/m L（P<0.01）以及50μg/m L（P<0.05）时,硒寡糖对HUVEC细胞增殖的抑制率显着高于硒化卡拉胶。（7）对硒化卡拉胶在海参养殖中的应用进行了研究,将硒化卡拉胶以2.0μg/g的含硒量添加到仿刺参饲料中,抗氧化试验结果表明,刺参体内的谷胱甘肽过氧化物酶活性（GSH-Px）和总抗氧化能力（T-AOC）显着提高（P<0.05）,刺参体内的丙二醛（MDA）含量显着降低（P<0.001）;根据肠道微生物多样性结果,饲料中添加硒化卡拉胶使刺参肠道菌群多样性显着提高,假杆菌属（Pseudophaeobacter）,热带杆菌属（Tropicibacter）,硫磺杆菌属（Sulfitobacter）等有益菌的丰度也有所提高。说明硒化卡拉胶的添加有利于仿刺参的健康养殖,其最适宜添加量有待进一步研究。本研究从深海微生物中获得了新型的硒化卡拉胶酶,既丰富了深海微生物酶资源库,又可为硒寡糖的大规模制备及其在医药与水产养殖方面的应用研究提供科学依据。
于泽洋[10]（2021）在《棘孢木霉T46的筛选、生产及诱导山新杨抗性机理研究》文中指出木霉菌（Trichoderma spp.）生长能力强,不仅能抑制多种病原真菌繁殖,同时具有促进植物生长和提升植物抗病性的作用。目前应用于农林业生产的商业化木霉产品当以哈茨木霉制剂为主,鲜有其他种的木霉。本文从东北林业大学哈尔滨实验林场人工林（126.63°E,45.72°N）及帽儿山实验林场天然林（127.57°E,45.29°N）中,采集白桦（Betula platyphylla）、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、胡桃楸（Juglans mandshurica）和黄檗（Phellodendron amurense）4 树种根围5-15cm层土样,并从土样中分离木霉菌株。依据形态学和ITS序列分子生物学鉴定,共得到木霉71株、8种:棘孢木霉（T.asperellum）,哈茨木霉（T.harzianum）,钩状木霉（T.hamatum）,深绿木霉（T.atroviride）,侧耳木霉（T.pleuroticola）,绿木霉（T.virens）,脐孢木霉（T.brevicompactum）和拟康氏木霉（T.koningiopsis）。其中分离菌株数最多的3种木霉分别为深绿木霉33株、钩状木霉10株、棘孢木霉9株。树种与木霉菌株数量分布关系为:白桦根围分布37株、水曲柳根围分布15株、胡桃楸根围分布10株、黄檗根围分布9株。以每种木霉生长速度最快菌株为目标菌株（8种8株）,分别测定其抗逆境能力和抑菌能力。结果显示,哈茨木霉T61、棘孢木霉T46和侧耳木霉T53对盐、碱胁迫和营养差异具有较强的抵抗能力和适应能力;哈茨木霉T61、棘孢木霉T46和钩状木霉T35对钟状镰刀菌（Fusarium camptosorus）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、链格孢菌（Alternaria alternata）、腐皮镰刀菌（F.solani）、胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、树舌（Ganoderma applanatum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）均具一定抑菌能力。经综合对比分析,棘孢木霉T46在抗逆境和抑菌能力等方面比较好,经棘孢木霉T46处理后山新杨幼苗叶片的过氧化氢酶与硝酸还原酶活性、可溶性糖与可溶性蛋白含量均显着提高,接种链格孢菌后病斑也明显小于对照组,表明在棘孢木霉T46诱导下山新杨提高了自身的抗性。以13种农林业废弃物为发酵底料,测定棘孢木霉T46发酵质量。结果发现,蒙古栎木屑为底料时棘孢木霉孢子产量不佳,以蒙古栎、白桦、水曲柳、胡桃楸、小黑杨的树叶为底料时棘孢木霉T46孢子产量高于木屑和秸秆（P<0.05）,其中以蒙古栎叶（初始含水率200%）和小黑杨叶（初始含水率500%）为底物棘孢木霉T46产孢量最高。以原料的数量、来源和成本等指标综合考量,以玉米秸秆为底料,通过单因素筛选实、Plackett-Burman、最陡爬坡和中心组合设计等实验,确定了棘孢木霉T46发酵的最优配方:初始含水率300%（v/w,mL/g）,可溶性淀粉含量0.4%（w/w）,硝酸铵含量0.5%（w/w）,磷酸二氢钠含量0.46%（w/w）,经该配方发酵其棘孢木霉T46产孢量最大,为5.9×109个/g。利用棘孢木霉T46孢子悬浮液处理山新杨,并从转录水平上研究棘孢木霉T46对山新杨影响的分子机制。对比不同时间点的转录组数据,挖掘到差异基因18165条,其在3个时间点的表达模式基于热图聚类可分为6个,基于H-cluster软件分为4个。对差异基因进行GO功能富集分析,发现处理7h的样本中,差异基因富集到的蛋白相关功能涉及氨基酸代谢、氨基酸分解、氨基酸糖代谢、蛋白复合物和蛋白核心复合物;处理28h的样本中,差异基因显着富集到的蛋白相关功能则为氨基酸转运、蛋白质转运、蛋白质定位到细胞器等功能。KEGG富集分析发现在不同的时间点的样本中α-亚麻酸代谢、氨基酸生物合成、酪氨酸代谢、糖酵解/糖异生和异喹啉生物碱合成等通路均被差异基因富集,确定了棘孢木霉T46诱导山新杨后其抗性提升的途径及机制,为后续研究和关键基因发掘奠定了理论基础。利用棘孢木霉T46孢子悬浮液处理山新杨后取样构建代谢组,从代谢水平上研究了棘孢木霉T46对山新杨诱导的分子机制。研究结果表明,18个样本在正负离子模式下共计得到2470个代谢物,这些代谢物基于LIPID MAPS的注释多数为多聚乙烯类、孕烯醇酮酯类和脂肪酸类化合物。比对不同组别数据发现两种离子模式下发掘到585个差异代谢物,基于热图聚类,正、负离子模式下得到的差异代谢物表达模式均有7种。KEGG通路富集分析发现,这些代谢物显着富集到氨基酸合成与降解以及蛋白的合成通路上,反映山新杨经棘孢木霉T46处理后,基于这些代谢物的变化最终实现抗性的提升。基于代谢组与转录组的综合分析,得到245条关键基因,其中244条得到了氨基酸序列,并被注释到109个保守结构域中,GST（Glutathione S-transferase）保守结构域、ADH（alcohol dehydrogenase）保守结构域和FrsA（Fermentation-respiration switch protein FrsA）保守结构域最多的氨基酸序列注释,可能是参与棘孢木霉T46诱导山新杨抗病性提升的关键蛋白家族。对转录组中所有基因进行筛选比对,去除identity大于95%的冗余基因,获得GST家族基因64个（其中31个为联合分析得到的关键基因）,ADH家族基因10个（8个为关键基因）,FrsA家族基因18个（8个为关键基因）。山新杨接种链格孢菌后,对基因PdPap-ADH-7（ADH家族）以及基因AT1进行转录分析发现这两个基因均持续显着上调,且在有棘孢木霉T46诱导的情况下,上调水平更加明显,具有深入研究的价值。转录分析显示,棘孢木霉T46通过诱导茉莉酸途径的JAR1基因、MYC2基因和水杨酸途径的NPR1基因表达提升山新杨抗性。构建了植物过表达载体pROK2-ADH-7,以农杆菌介导的方式构建能够过量表达PdPap-ADH-7基因的山新杨转化子,获得转化子PdPap-ADH-7.1和PdPap-ADH-7.2,它们的PdPap-ADH-7基因表达量分别为对照的24.26和25.91倍。受到链格孢菌的胁迫后,转化子PdPap-ADH-7.1和PdPap-ADH-7.2的水杨酸途径相关基因NPR1较对照上调更加显着,在28h处达到最大,表达量分别为对照的25.43倍和24.8倍;野生型NPR1基因的表达则为先下调后上调,表达量在28h处达到最大,上调23.18倍。但是过量表达PdPap-ADH-7基因对茉莉酸途径相关基因JAR1基因和MYC2基因的影响并不明确。综上所述,本研究从4种东北常见林木的根围获得一株生防能力较强的棘孢木霉T46,并初步研究了针对该木霉的固态发酵配方,为该株棘孢木霉的应用和生产提供了基础数据。将棘孢木霉T46接种至山新杨,测定了转录组和代谢组,对这两组数据进行了关联分析,并对挖掘到的PdPap-ADH-7基因进行了验证,为从分子层面揭示棘孢木霉诱导植物抗病机理提供依据。
二、生物信息学及其在菌物学研究上的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、生物信息学及其在菌物学研究上的应用（论文提纲范文）
（1）MAPK蛋白激酶基因和磷酸酶基因参与粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物土传病害及生物防治 |
| 1.1.1 植物土传病害 |
| 1.1.2 生物防治 |
| 1.2 粉红螺旋聚孢霉研究进展 |
| 1.2.1 生物学特性 |
| 1.2.2 生防作用 |
| 1.2.3 生防作用机制 |
| 1.2.4 生防相关基因 |
| 1.3 蛋白质磷酸化 |
| 1.3.1 蛋白激酶与磷酸酶概述 |
| 1.3.2 MAPK信号传导途径 |
| 1.3.3 蛋白磷酸酶研究进展 |
| 1.4 蛋白质互作研究及其技术 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.4.3 双分子荧光互补技术 |
| 1.4.4 Pull down技术 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 粉红螺旋聚孢霉67-1 Crmapk互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 培养基及试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 粉红螺旋聚孢霉菌丝样品的准备 |
| 2.2.2 RNA提取与质量检测 |
| 2.2.3 mRNA的分离与纯化 |
| 2.2.4 酵母双杂初级文库的构建 |
| 2.2.5 酵母双杂次级文库的构建 |
| 2.2.6 酵母转化 |
| 2.2.7 Crmapk-GFP融合表达载体及菌株的构建 |
| 2.2.8 Crmapk-BD诱饵载体的构建 |
| 2.2.9 诱饵载体自激活和毒性检测 |
| 2.2.10 酵母双杂文库的筛选与验证 |
| 2.2.11 双分子荧光互补(Bi FC)验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Crmapk的生物信息学分析 |
| 2.3.2 Crmapk的亚细胞定位 |
| 2.3.3 粉红螺旋聚孢霉酵母双杂文库的构建 |
| 2.3.4 酵母双杂文库筛选 |
| 2.3.5 互作蛋白的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 粉红螺旋聚孢霉67-1 Crmapk互作蛋白CIP2和CIP11 的功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 培养基及试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 粉红螺旋聚孢霉基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 粉红螺旋聚孢霉总RNA的提取 |
| 3.2.3 c DNA反转录 |
| 3.2.4 菌核诱导条件下CIP2和CIP11 表达量的检测 |
| 3.2.5 CIP2和CIP11 的生物信息学分析 |
| 3.2.6 CIP2和CIP11 基因敲除载体的构建 |
| 3.2.7 CIP2和CIP11 基因回补载体的构建 |
| 3.2.8 原生质体的转化 |
| 3.2.9 转化子的筛选及验证 |
| 3.2.10 突变株生长表型测定 |
| 3.2.11 胁迫压力敏感性测定 |
| 3.2.12 拮抗能力的测定 |
| 3.2.13 对大豆核盘菌菌核寄生能力测定 |
| 3.2.14 盆栽防治大豆菌核病实验 |
| 3.2.15 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CIP2和CIP11 的生物信息学分析 |
| 3.3.2 菌核诱导条件下CIP2和CIP11 表达量的检测 |
| 3.3.3 CIP2和CIP11 基因的敲除和回补 |
| 3.3.4 突变株生长表型测定 |
| 3.3.5 胁迫压力敏感性测定 |
| 3.3.6 拮抗能力测定 |
| 3.3.7 对大豆核盘菌菌核寄生能力测定 |
| 3.3.8 盆栽防治大豆菌核病实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 粉红螺旋聚孢霉67-1 细胞壁合成磷酸酶基因CrSsd1 的功能研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 培养基及试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CrSsd1 的生物信息学分析 |
| 4.3.2 菌核诱导条件下CrSsd1 表达量的检测 |
| 4.3.3 CrSsd1 基因的敲除和回补 |
| 4.3.4 突变株生长表型测定 |
| 4.3.5 胁迫压力敏感性测定 |
| 4.3.6 对灰霉菌拮抗能力测定 |
| 4.3.7 对大豆核盘菌菌核寄生能力测定 |
| 4.3.8 盆栽防治大豆菌核病实验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 引物列表 |
| 附录 B 利用酵母双杂筛选与Crmapk互作的蛋白信息列表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）茶树转录组组装评估与多组学生物信息平台开发（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 茶树概述 |
| 1.2 转录组测序 |
| 1.2.1 转录组测序技术 |
| 1.2.2 转录组组装研究进展 |
| 1.3 茶树转录组的研究进展 |
| 1.4 植物基因组数据库研究现状 |
| 1.4.1 植物基因组数据库 |
| 1.4.2 茶树数据库建设现状 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 茶树转录组组装 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的获取 |
| 2.1.2 茶树转录组组装方法 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 茶树转录组组装最优化工具研究 |
| 2.2.2 茶树转录组组装最优化数据量研究 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 茶树基因组生物信息学平台的构建与应用 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 数据材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 茶树基因组注释优化 |
| 3.2.2 茶树基因组数据库的构建 |
| 3.2.3 生物信息学分析工具集成与应用 |
| 3.2.4 利用TPIA数据研究茶组植物的化学进化模式 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 附图 |
| 附录B 附表 |
| 作者简介 |
（3）金针菇采后菌柄伸长调控及复合保鲜技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 金针菇概述 |
| 1.1.1 金针菇简介 |
| 1.1.2 金针菇食药价值 |
| 1.1.3 国内金针菇产业现状 |
| 1.2 金针菇采后品质劣变表现 |
| 1.2.1 失水 |
| 1.2.2 采后形态变化 |
| 1.2.3 褐变 |
| 1.2.4 营养和风味损失 |
| 1.3 金针菇菌柄伸长研究 |
| 1.4 金针菇保鲜调控技术 |
| 1.4.1 低温处理 |
| 1.4.2 臭氧处理 |
| 1.4.3 1-MCP处理 |
| 1.4.4 气调处理 |
| 1.4.5 生物保鲜剂处理 |
| 1.4.6 复合处理 |
| 1.5 转录组学 |
| 1.5.1 转录组学概述 |
| 1.5.2 转录组学在金针菇中的应用 |
| 1.6 本课题研究目的及意义 |
| 1.7 技术路线图 |
| 第二章 采后调控金针菇菌柄伸长的模型构建 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌柄伸长区段的确定 |
| 2.2.2 金针菇菌柄伸长速度的测定 |
| 2.2.3 金针菇采后调控处理 |
| 2.2.4 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 金针菇菌柄伸长区段的确定 |
| 2.3.2 不同温度贮藏对金针菇菌柄伸长速度的影响 |
| 2.3.3 不同保鲜膜包装对金针菇菌柄伸长速度和气体成分的影响 |
| 2.3.4 臭氧处理对金针菇菌柄伸长速度的影响 |
| 2.3.5 钙处理对金针菇菌柄伸长速度的影响 |
| 2.3.6 精油熏蒸处理对金针菇菌柄长度的影响 |
| 2.3.7 1-MCP处理对金针菇菌柄伸长速度的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 金针菇采后菌柄伸长调控模型的转录组学研究 |
| 3.1 试验材料与仪器 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器与设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 样品制备 |
| 3.2.2 转录组测序流程 |
| 3.2.3 生物信息学分析 |
| 3.2.4 RT-PCR定量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RNA质检结果 |
| 3.3.2 测序reads基因组比对结果 |
| 3.3.3 差异表达基因分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 乳酸钙处理结合纳米包装提升金针菇贮藏品质 |
| 4.1 试验材料与仪器 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器与设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样品处理方法 |
| 4.2.2 指标测定方法 |
| 4.2.3 数据统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同处理对金针菇贮藏期间感官品质的影响 |
| 4.3.2 不同处理对金针菇贮藏期间菌柄伸长度的影响 |
| 4.3.3 不同处理对金针菇贮藏期间失重率的影响 |
| 4.3.4 不同处理对金针菇贮藏期间呼吸强度的影响 |
| 4.3.5 不同处理对金针菇贮藏期间白度的影响 |
| 4.3.6 不同处理对金针菇贮藏期间丙二醛含量的影响 |
| 4.3.7 不同处理对金针菇贮藏期间总酚含量的影响 |
| 4.3.8 不同处理对金针菇贮藏期间营养成分的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（4）长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:长链非编码RNALBX2-AS1 通过LBX2-AS1/miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 LBX2-AS1 沉默 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 细胞迁移侵袭能力检测 |
| 2.2.5 生物信息学预测靶基因 |
| 2.2.6 荧光素酶报告检测 |
| 2.2.7 miRNA转染 |
| 2.2.8 实时定量PCR检测LBX2-AS1 的表达水平 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LBX2-AS1 在骨肉瘤细胞中高表达 |
| 3.2 LBX2-AS1 促进骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.2.1 构建LBX2-AS1低表达的骨肉瘤细胞株 |
| 3.2.2 沉默LBX2-AS1 抑制了骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.3 沉默LBX2-AS1 的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移 |
| 3.4 LBX2-AS1 通过miR-5010-5p调控WNT7B的表达 |
| 3.4.1 预测LBX2-AS1 可能通过结合miR-5010-5p进而调控下游基因WNT7B |
| 3.4.2 miR-5010-5p可以与LBX2-AS1和WNT7B结合 |
| 3.4.3 LBX2-AS1 调控miR-5010-5p和 WNT7B的表达 |
| 3.4.4 miR-5010-5p调控下游WNT7B的表达 |
| 3.5 抑制miR-5010-5p表达可以恢复沉默LBX2-AS1 对骨肉瘤细胞的增殖、迁移的影响 |
| 3.5.1 LBX2-AS1 低表达细胞系中抑制miR-5010-5p表达可以恢复WNT7B的表达 |
| 3.5.2 抑制miR-5010-5p的表达可以恢复沉默LBX2-AS1 所抑制的骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.5.3 抑制miR-5010-5p的表达可以恢复沉默LBX2-AS1 所抑制的骨肉瘤细胞的迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 研究结论 |
| 第二部分:TUG1 在胃癌中作用的生物信息学分析及实验验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析方法 |
| 2.2.2 湿实验实验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析结果 |
| 3.1.1 患者的基线特征 |
| 3.1.2 胃腺癌中TUG1 高表达 |
| 3.1.3 TUG1 表达与临床特征的相关性 |
| 3.1.4 TUG1 的高表达提示预后不良 |
| 3.1.5 TUG1 在胃腺癌中的诊断价值 |
| 3.1.6 GO和 KEGG富集分析TUG1 的共表达基因 |
| 3.1.7 GSEA识别与TUG1 相关的生物学过程和信号通路 |
| 3.2 湿实验结果 |
| 3.2.1 TUG1 在胃癌患者表达水平高,与淋巴结转移及Ki-67密切相关 |
| 3.2.2 TUG1 高表达患者生存分析 |
| 3.2.3 TUG1 高表达可能与耐药相关 |
| 3.2.4 TUG1 促进胃癌细胞的耐药 |
| 3.2.5 TUG1 促进胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 研究结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的研究成果 |
| 综述 非编码RNA在骨肉瘤发病、诊断和预后中的作用 |
| 参考文献 |
（5）中国明对虾低温胁迫的转录组分析及耐低温相关基因验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 对虾环境耐受相关研究进展 |
| 1.2 转录组测序及生物信息学分析 |
| 1.2.1 转录组测序技术 |
| 1.2.2 生物信息学 |
| 1.3 耐低温相关基因的研究进展 |
| 1.4 真核基因在大肠杆菌中的可溶性表达及功能验证 |
| 1.4.1 真核基因在大肠杆菌中的可溶性表达研究 |
| 1.4.2 基因的耐低温功能验证相关研究 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 中国明对虾仔虾的低温胁迫处理及转录组测序 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 中国明对虾 |
| 2.1.2 实验仪器和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 取样 |
| 2.2.2 转录组测序 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.2.4 Real time RT-PCR验证中国对虾转录组数据 |
| 2.3 实验结果及分析 |
| 2.3.1 测序数据组装 |
| 2.3.2 转录组数据注释 |
| 2.3.3 差异表达基因的初步筛选 |
| 2.3.4 差异基因GO富集分析 |
| 2.3.5 差异基因KEGG Pathway富集分析 |
| 2.3.6 Real time RT-PCR结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 高表达上调差异基因的筛选与分析 |
| 3.1 高表达水平的上调差异基因的筛选及分析方法 |
| 3.1.1 高表达水平的上调差异基因的统计 |
| 3.1.2 转录组的生物信息学鉴定 |
| 3.2 高表达水平的上调差异基因的分析结果 |
| 3.2.1 高表达水平的上调差异基因的筛选结果 |
| 3.2.2 九个高水平上调表达基因的生物信息学分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 耐低温相关基因的蛋白序列分析、原核表达及耐低温验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样品、菌株与质粒 |
| 4.1.2 实验仪器及耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 ORF2861的蛋白序列分析 |
| 4.2.2 目的基因的获得 |
| 4.2.3 重组表达载体的构建 |
| 4.2.4 目的基因的原核表达 |
| 4.2.5 耐低温验证 |
| 4.3 实验结果及分析 |
| 4.3.1 ORF2861的蛋白序列分析结果 |
| 4.3.2 引物设计及目的基因扩增 |
| 4.3.3 同源重组及转化 |
| 4.3.4 原核表达结果 |
| 4.3.5 耐低温验证结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 附录 |
| 附录一 实验仪器及试剂 |
| 附录二 实验方法 |
| 附录三 实验数据 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 资助情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）发展rpoC基因为肠道菌群调查的新分子标记及其在中医药微生态研究中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 对单拷贝基因引物的设计及测试 |
| 1 材料 |
| 1.1 药品 |
| 2 方法 |
| 2.1 生信分析及脚本开发流程 |
| 2.2 构建本地基因组数据库I核心代码(perl语言) |
| 2.3 构建本地基因组数据库II核心代码(perl语言) |
| 2.4 序列核酸碱基变化差异统计 |
| 2.5 引物设计方法 |
| 2.6 单拷贝基因通用引物的测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 本地基因组数据库Ⅰ |
| 3.2 本地基因组数据库Ⅱ |
| 3.3 利用本地数据库I对肠道主要菌群进行拷贝数统计结果 |
| 3.4 利用本地基因组数据库II对单拷贝功能基因引物的设计结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 利用SVARAP比较功能基因与16S rRNA基因序列在核酸碱基变化差异统计----以rpoC基因为例 |
| 4.2 通用引物测试 |
| 5 小结 |
| 第二章 基于一代测序与模拟肠道菌群发展rpoC基因 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验菌种 |
| 1.2 药品 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 其他 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌种的分离培养 |
| 2.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.3 聚合酶链式反应 |
| 2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5 16S rRNA基因的扩增 |
| 2.6 rpoC基因的扩增 |
| 2.7 测序及序列处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 模拟肠道菌群样实际组成结果 |
| 3.2 引物8F/518R扩增获得的多样性结果 |
| 3.3 引物338F/806R扩增获得的多样性结果 |
| 3.4 引物515F/926R扩增获得的多样性结果 |
| 3.5 引物27F/1492R扩增获得的多样性结果 |
| 3.6 引物rpoC基因扩增获得的多样性结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 门水平的多样性比较 |
| 4.2 属水平的多样性比较 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于高通量测序和模拟肠道菌群、环境菌群样品发展rpoC基因 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验样品(实验室保藏用名) |
| 1.2 药品 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 其他 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌种的分离培养 |
| 2.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.3 粪便基因组DNA的提取 |
| 2.4 聚合酶链式反应 |
| 2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.6 测序过程 |
| 2.7 Illumina MiSeq测序与PacBio测序的数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 5个混合样16S rRNA基因测序结果 |
| 3.2 5个混合样rpoC基因测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于OTU比较16S rRNA基因与rpoC基因分子标记 |
| 4.2 基于属的命中比较 |
| 5 小结 |
| 第四章 以理中汤治疗AAD模型大鼠为例发展rpoC基因 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 菌株 |
| 1.5 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AAD模型构建和治疗 |
| 2.2 粪便样品采集 |
| 2.3 粪便基因组DNA的提取 |
| 2.4 rpoC基因的扩增 |
| 2.5 Illumina MiSeq测序与PacBio测序的数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 4个阶段大鼠粪便样16S rRNA基因测序结果 |
| 3.2 4个阶段大鼠粪便样样rpoC基因测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于OTU比较16S rRNA基因与rpoC基因分子标记 |
| 4.2 基于α多样性指数比较16S rRNA基因与rpoC基因分子标记 |
| 4.3 基于样本多样性结构比较16S rRNA基因与rpoC基因分子标记 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录:模拟肠道菌群中各菌属的比对结果 |
| 综述 肠道菌群调查的单拷贝基因分子标记的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（7）藏猪耐粗饲特性与肠道微生态环境的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 藏猪生存现状 |
| 2 耐粗饲特性的研究 |
| 3 藏猪肠道微生物群落组成与耐粗饲特性 |
| 4 肠道微生态环境 |
| 5 组学技术在动物肠道上的研究进展 |
| 5.1 16S rRNA高通量测序技术 |
| 5.2 宏基因组学测序技术 |
| 5.3 转录组测序技术 |
| 5.4 代谢组学技术 |
| 6 拟解决的关键问题 |
| 7 本研究的内容、目的与意义 |
| 8 创新与特色 |
| 第二章 原始放牧状态下藏猪盲肠与结肠微生物结构和多样性的比较研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 屠宰采样 |
| 1.3 总DNA提取 |
| 1.4 PCR扩增 |
| 1.5 文库制备及测序 |
| 1.6 测序信息分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 微生物群落的丰富度及多样性分析 |
| 2.2 微生物群落分类学组成分析 |
| 2.3 微生物群落组成聚类分析 |
| 2.4 微生物群落间相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 盲肠微生物结构与多样性 |
| 3.2 结肠微生物结构与多样性 |
| 4 小结 |
| 第三章 藏猪耐粗饲能力的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 试验饲粮 |
| 1.4 饲养管理 |
| 1.5 指标测定 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生产性能 |
| 2.2 养分表观消化率 |
| 2.3 血液生理生化指标 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同品种猪间生产性能的比较 |
| 3.2 不同品种猪间养分消化率的比较 |
| 3.3 不同品种猪间血液指标的比较 |
| 4 小结 |
| 第四章 藏猪肠道因子与耐粗饲特性相关性的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 指标测定 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小肠组织学测量结果 |
| 2.2 盲肠与结肠组织学测量结果 |
| 2.3 盲肠、结肠与粪便中纤维素酶、半纤维素酶活力 |
| 2.4 盲肠、结肠食糜与粪便中p H值 |
| 2.5 盲肠、结肠与粪便中挥发性脂肪酸 |
| 2.6 肠道因子与饲粮纤维消化率间的相关性研究 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 藏猪消化道细菌与耐粗饲特性间的相关性研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 食糜样品采集 |
| 1.2 总DNA提取 |
| 1.3 PCR扩增 |
| 1.4 文库制备及测序 |
| 1.5 测序信息分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 微生物序列分析 |
| 2.2 同一消化部位不同类型猪尺度下的物种组成分析 |
| 2.3 同一类型猪不同消化部位尺度下的物种组成分析 |
| 2.4 Alpha多样性分析 |
| 2.5 细菌群落组成与饲粮纤维表观消化率的相关性研究 |
| 2.6 细菌群落组成与饲粮纤维表观消化率的RDA分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 基于三代测序技术研究藏猪粪便微生物与耐粗饲特性的相关性 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 粪样采集与制备 |
| 1.2 送样与检测 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 粪便细菌群落的结构与多样性 |
| 2.2 粪便真菌群落的结构与多样性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 盲肠和结肠转录因子与耐粗饲特性相关性的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集与保存 |
| 1.2 转录组测序流程 |
| 1.3 序列比对和差异表达分析 |
| 1.4 有参转录组分析流程 |
| 1.5 差异表达基因的GO和 pathway富集分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原始数据整理、过滤及质量评估 |
| 2.2 差异表达基因分析 |
| 2.3 差异表达基因在不同类型猪间的关系 |
| 2.4 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.5 差异表达基因KEGG富集 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（8）球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX维持膜稳态及调控铁饥饿响应的生理机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 综述 |
| 1.1 球孢白僵菌分生孢子的物质累积与侵染生物学背景 |
| 1.2 铁稳态调控的意义 |
| 1.3 HapX调控铁稳态的研究进展 |
| 1.3.1 HapX响应铁饥饿调控保守系统的研究背景 |
| 1.3.2 HapX转录调控机制的研究进展 |
| 1.3.3 真菌HapX铁饥饿调控与生物学功能的研究进展 |
| 1.4 细胞膜稳态的研究进展 |
| 1.4.1 真菌膜脂合成代谢与膜稳态的研究进展 |
| 1.4.2 真菌细胞膜与细胞壁稳态的研究进展 |
| 1.4.3 真菌膜蛋白与细胞膜稳态的研究进展 |
| 1.4.4 真菌膜蛋白CFEM家族与铁饥饿调控的研究进展 |
| 1.5 研究内容和目标 |
| 第二章 BbHapX维持分生孢子膜稳态和细胞膜功能的机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试试剂 |
| 2.1.2 菌种培养 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 BbHapX和BbOle1基因敲除株及回补株的构建和鉴定 |
| 2.2.3 根瘤农杆菌介导的真菌转化以及球孢白僵菌转化子筛选与鉴定 |
| 2.2.4 分生孢子萌发表型测定 |
| 2.2.5 菌落生长速率测定 |
| 2.2.6 生物防治潜能测定 |
| 2.2.7 配比法凝胶阻滞实验 |
| 2.2.8 真菌胞内游离脂肪酸含量测定 |
| 2.2.9 脂质组学分析 |
| 2.2.10 Southern杂交 |
| 2.2.11 转录组学分析 |
| 2.2.12 活体细胞染色 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BbHapX和BbOle1的生物信息学分析特征和分子操作 |
| 2.3.2 BbHapX对于真菌毒性至关重要 |
| 2.3.3 BbHapX参与启动脂质和FA代谢的基因 |
| 2.3.4 BbHapX对FA代谢稳态至关重要 |
| 2.3.5 外源油酸能恢复膜的完整性和毒力 |
| 2.3.6 BbHapX有助于真菌适应铁饥饿 |
| 2.3.7 BbOle1是转录因子BbHapX的直接靶标 |
| 2.3.8 磷脂稳态需要BbHapX和BbOle1 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 BbLip1参与脂滴的分解代谢以维持细胞膜脂稳态 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试试剂 |
| 3.1.2 菌株培养 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BbLip1基因敲除株和回补株构建和鉴定 |
| 3.2.2 小量基因组DNA提取 |
| 3.2.3 真菌发育表型测定 |
| 3.2.4 活细胞脂滴染色及标记 |
| 3.2.5 酶解法凝胶阻滞实验 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.2.7 其他实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 BbLip1蛋白的生物信息学特征及基因分子操作 |
| 3.3.2 BbLip1的缺失影响球孢白僵菌的毒力和生长发育 |
| 3.3.3 BbLip1参与真菌细胞膜完整性和通透性事件 |
| 3.3.4 BbHapX转录调控BbLip1参与细胞膜完整性事件 |
| 3.3.5 BbLip1参与脂滴的代谢 |
| 3.3.6 BbLip1参与真菌的营养生长和氧化胁迫 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 凝集素蛋白BbLec1参与细胞膜壁稳态的机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试试剂 |
| 4.1.2 菌种培养 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 生物信息学分析 |
| 4.2.2 突变株的构建和鉴定 |
| 4.2.3 膜系统酵母双杂 |
| 4.2.4 核系统酵母双杂 |
| 4.2.5 Pull Down |
| 4.2.6 质谱分析 |
| 4.2.7 扫描电镜 |
| 4.2.8 透射电镜 |
| 4.2.9 芽孢转化 |
| 4.2.10 Western Blotting |
| 4.2.11 几丁质提取及蛋白结合实验 |
| 4.2.12 寡糖微矩阵列分析 |
| 4.2.13 荧光载体构建与亚细胞定位 |
| 4.2.14 数据分析 |
| 4.2.15 其他方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BbLec1的生物信息学分析和分子操作 |
| 4.3.2 BbHapX转录激活BbLec1 |
| 4.3.3 BbLec1的亚细胞定位 |
| 4.3.4 BbLec1与寡糖的结合特征 |
| 4.3.5 BbLec1是外分泌泡的组成部分 |
| 4.3.6 野生型、ΔBbLec1敲除株和回补菌株的生物学表型 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 BbCFEM家族响应铁饥饿调控的生理机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试试剂 |
| 5.1.2 菌种培养 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 生物信息学分析 |
| 5.2.2 BbCFEM家族基因突变株的构建和鉴定 |
| 5.2.3 真菌RNA提取及反转录 |
| 5.2.4 BbCFEM3、7和8的亚细胞定位 |
| 5.2.5 铁饥饿条件下的毒力测定 |
| 5.2.6 BbCFEM3、7和8之间的酵母双杂交验证 |
| 5.2.7 球孢白僵菌与其他真菌物种的竞争测定 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.2.9 其他实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BbCFEM家族的系统发育树构建和分子操作 |
| 5.3.2 BbCFEM家族的亚细胞定位 |
| 5.3.3 BbCFEM家族在真菌分化和发育方面的生物学表型 |
| 5.3.4 BbCFEM家族调控铁饥饿条件下真菌的生长 |
| 5.3.5 BbCFEM家族基因在不同铁饥饿程度下的毒力存在补偿效应 |
| 5.3.6 BbCFEM家族参与响应真菌抗氧化胁迫 |
| 5.3.7 BbCFEM家族在铁饥饿条件下与其他物种的竞争 |
| 5.3.8 高铁血红素铁能恢复BbCFEM7和8基因缺失造成的毒力丧失 |
| 5.3.9 BbCFEM3/7和BbCFEM8之间存在的分子生物学机制 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结语 |
| 第七章 附记 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读博士学位期间的主要成果 |
（9）深海微生物酶特异性降解硒化卡拉胶的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 深海微生物资源研究与开发 |
| 1.2 硒多糖概述 |
| 1.2.1 硒的存在形式 |
| 1.2.2 硒多糖的来源 |
| 1.2.3 卡拉胶 |
| 1.2.4 硒化卡拉胶 |
| 1.3 卡拉胶寡糖概述 |
| 1.3.1 卡拉胶寡糖的制备方法 |
| 1.3.2 卡拉胶寡糖的生物活性 |
| 1.4 κ-卡拉胶酶研究进展 |
| 1.5 全基因组测序及生物信息学分析 |
| 1.5.1 基因组测序技术概述 |
| 1.5.2 生物信息学技术概述 |
| 1.6 碳水化合物结合模块概述 |
| 1.7 本研究技术路线、目的及意义 |
| 1.7.1 技术路线 |
| 1.7.2 研究目的及意义 |
| 第二章 可降解硒化卡拉胶深海微生物的筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 培养基及试剂配制 |
| 2.1.3 试剂及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株分离纯化 |
| 2.2.2 硒化卡拉胶降解菌株筛选与鉴定 |
| 2.2.3 硒化卡拉胶酶酶活性测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 硒化卡拉胶降解菌株的筛选 |
| 2.3.2 产硒化卡拉胶酶细菌的酶活分析 |
| 2.3.3 硒化卡拉胶酶活性菌株的系统发育分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 可降解硒化卡拉胶深海芽孢杆菌全基因组测序及生物信息学分析 |
| 3.1 试验菌种 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌体收集 |
| 3.2.2 全基因组测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 数据处理概况 |
| 3.3.2 基因组组装概况 |
| 3.3.3 基因组组分分析 |
| 3.3.4 基因功能分析 |
| 3.3.5 甲基化分析 |
| 3.3.6 基因组可视化分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 深海芽孢杆菌硒化卡拉胶酶 SeCar 生物信息学分析与异源表达 |
| 4.1 试验菌株 |
| 4.2 试剂及仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 硒化卡拉胶酶候选基因SeCar的生物信息学分析 |
| 4.3.2 芽孢杆菌Bacillus sp.N1-1 基因组DNA提取 |
| 4.3.3 引物设计 |
| 4.3.4 硒化卡拉胶酶候选基因SeCar的克隆 |
| 4.3.5 硒化卡拉胶酶候选基因PCR产物的连接与转化 |
| 4.3.6 硒化卡拉胶酶SeCar表达载体的构建 |
| 4.3.7 重组蛋白诱导表达以及酶活检测 |
| 4.3.8 表达蛋白纯化及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 |
| 4.3.9 硒化卡拉胶酶诱导表达条件的优化 |
| 4.3.10 硒化卡拉胶酶截短体SeCar_((ΔCBM_4_9))的克隆 |
| 4.3.11 硒化卡拉胶酶截短体SeCar_((ΔCBM_4_9))基因的连接与转化 |
| 4.3.12 硒化卡拉胶酶截短体基因SeCar_((ΔCBM_4_9))表达载体的构建 |
| 4.3.13 重组蛋白诱导表达以及酶活检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 硒化卡拉胶酶候选基因SeCar的生物信息学分析 |
| 4.4.2 芽孢杆菌Bacillus sp.N1-1 基因组DNA的提取 |
| 4.4.3 硒化卡拉胶酶候选基因表达载体的构建 |
| 4.4.4 硒化卡拉胶酶诱导表达及酶活验证 |
| 4.4.5 硒化卡拉胶酶表达蛋白的纯化 |
| 4.4.6 硒化卡拉胶酶诱导表达条件的优化 |
| 4.4.7 截短体基因SeCar_((ΔCBM_4_9))表达载体的构建 |
| 4.4.8 硒化卡拉胶酶诱导表达及酶活验证 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 硒化卡拉胶酶酶学性质与酶解产物性质分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试验菌株 |
| 5.1.2 试剂及仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 酶学性质研究方法 |
| 5.2.2 酶解产物分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 硒化卡拉胶酶的酶学性质分析 |
| 5.3.2 硒化卡拉胶酶酶解产物的分析 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 酶解产物—硒寡糖的肿瘤抑制活性研究 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验细胞及药物 |
| 6.1.2 试剂及仪器 |
| 6.1.3 试剂配制 |
| 6.2 试验步骤 |
| 6.2.1 硒寡糖对 K562 细胞增殖的抑制作用 |
| 6.2.2 硒寡糖对 HUVEC 细胞增殖的抑制作用 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 硒寡糖对 K562 细胞增殖的抑制作用 |
| 6.3.2 硒寡糖对 HUVEC 细胞增殖的抑制作用 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第七章 硒化卡拉胶在海参养殖中的应用研究 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 实验动物 |
| 7.1.2 基础饲料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 实验设计 |
| 7.2.2 刺参生长性能测定 |
| 7.2.3 刺参体壁和肠道内容物的收集与处理 |
| 7.2.4 刺参肠道微生物分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 硒化卡拉胶对刺参生长性能的影响 |
| 7.3.2 硒化卡拉胶对刺参体内硒含量的影响 |
| 7.3.3 硒化卡拉胶对刺参体内抗氧化能力的影响 |
| 7.3.4 硒化卡拉胶对刺参肠道微生物的影响 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 硕士期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）棘孢木霉T46的筛选、生产及诱导山新杨抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 木霉资源的分离与收集 |
| 1.2 木霉的生物防治机理 |
| 1.2.1 木霉菌与病原菌互作研究 |
| 1.2.2 木霉菌与植物互作研究 |
| 1.3 木霉固态发酵研究动态 |
| 1.4 植物抗逆转录组学研究 |
| 1.5 植物抗逆代谢组学研究 |
| 1.6 研究目的意义 |
| 2 4种林木根围木霉菌株的分离与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试试剂 |
| 2.1.3 仪器设备和材料 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 土样采集 |
| 2.2.2 菌种分离与纯化 |
| 2.2.3 木霉形态学鉴定 |
| 2.2.4 木霉的分子生物学鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 木霉菌株的分离及形态学鉴定 |
| 2.3.2 木霉菌的分子生物学鉴定 |
| 2.3.3 木霉菌的分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 木霉分离株生物活性测定与分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试菌株及植株 |
| 3.1.2 供试试剂 |
| 3.1.3 仪器设备和材料 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 木霉分离株生长速度的筛选 |
| 3.2.2 木霉及病原菌培养 |
| 3.2.3 木霉分离株生物活性测定 |
| 3.2.4 木霉对山新杨抗病性的影响 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 木霉分离株生长速率测定 |
| 3.3.2 非生物逆境胁迫 |
| 3.3.3 木霉菌株与8株病原真菌对峙培养 |
| 3.3.4 木霉分离株生防潜力综合分析 |
| 3.3.5 棘孢木霉T46诱导山新杨抗性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 棘孢木霉T46菌株的固态发酵 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 供试试剂 |
| 4.1.3 仪器设备和材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 孢子悬浮液制备 |
| 4.2.2 发酵底物及含水率设置 |
| 4.2.3 单因素实验 |
| 4.2.4 营养配比优化实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 发酵底物及含水率的优化 |
| 4.3.2 单纯以底物为营养的木霉发酵 |
| 4.3.3 单因素实验 |
| 4.3.4 营养配比优化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗转录组构建及分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 供试菌株和植株 |
| 5.1.2 供试试剂 |
| 5.1.3 仪器设备和材料 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1样本准备与处理 |
| 5.2.2 提取样本RNA及clean reads的获得 |
| 5.2.3 测序结果初步校验和分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 转录组测序质量分析 |
| 5.3.2 转录本组装及注释 |
| 5.3.3 基因表达定量分析 |
| 5.3.4 差异表达基因分析 |
| 5.3.5 表达模式聚类分析 |
| 5.3.6 差异基因的功能富集分析 |
| 5.3.7 可变剪接分析 |
| 5.4 关于棘孢木霉T46诱导山新杨后转录组分析的讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 棘孢木霉T46诱导山新杨幼苗代谢组构建及分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 供试菌株和植株 |
| 6.1.2 供试试剂 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 样本准备与处理 |
| 6.2.2 山新杨幼苗代谢物提取 |
| 6.2.3 山新杨幼苗代谢物检测 |
| 6.2.4 检测结果初步校验 |
| 6.2.5 数据分析 |
| 6.3 研究结果与分析 |
| 6.3.1 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢物测定 |
| 6.3.2 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢组测序质量 |
| 6.3.3 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢物功能注释 |
| 6.3.4 差异显着代谢物的筛选 |
| 6.3.5 差异显着代谢物分析 |
| 6.3.6 差异显着代谢物KEGG富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 转录组和代谢组联合分析及关键基因挖掘 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 供试菌株和植株 |
| 7.1.2 供试试剂和数据 |
| 7.1.3 仪器设备 |
| 7.1.4 培养基 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 转录组代谢组联合分析 |
| 7.2.2 联合分析所得到的关键基因生物信息学分析 |
| 7.2.3 GST、ADH和FrsA家族基因生物信息学分析 |
| 7.2.4 接种链格孢菌后山新杨相关基因表达分析 |
| 7.3 试验结果 |
| 7.3.1 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢物测定 |
| 7.3.2 联合分析后得到的基因生物信息学分析 |
| 7.3.3 GST、ADH和FrsA家族基因生物信息学分析 |
| 7.3.4 接种链格孢菌后山新杨幼苗部分基因表达分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 8 山新杨转化子PdPap-ADH-7的获得及抗病性检测 |
| 8.1 试验材料 |
| 8.1.1 供试菌株和植株 |
| 8.1.2 供试试剂和数据 |
| 8.1.3 仪器设备 |
| 8.1.4 培养基 |
| 8.2 试验方法 |
| 8.2.1 目标基因的克隆 |
| 8.2.2 重组载体pROK2-ADH-7的构建 |
| 8.2.3 重组大肠杆菌TOP10-ADH-7的构建 |
| 8.2.4 重组根癌农杆菌EHA105-ADH-7的构建 |
| 8.2.5 转化子的获得 |
| 8.2.6 转化子的抗病性检测 |
| 8.3 试验结果 |
| 8.3.1 基因PdPap-ADH-7的克隆 |
| 8.3.2 重组大肠杆菌TOP10-pROK2-ADH的构建 |
| 8.3.3 山新杨转化子PdPap-ADH-7的获得 |
| 8.3.4 山新杨转化子PdPap-ADH-7抗病性检测 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、生物信息学及其在菌物学研究上的应用（论文参考文献）
- [1]MAPK蛋白激酶基因和磷酸酶基因参与粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生作用的研究[D]. 吕斌娜. 中国农业科学院, 2021
- [2]茶树转录组组装评估与多组学生物信息平台开发[D]. 李方东. 安徽农业大学, 2021(01)
- [3]金针菇采后菌柄伸长调控及复合保鲜技术研究[D]. 张雨. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [4]长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究[D]. 刘媛. 南昌大学, 2021(01)
- [5]中国明对虾低温胁迫的转录组分析及耐低温相关基因验证[D]. 王晶. 山东大学, 2021(11)
- [6]发展rpoC基因为肠道菌群调查的新分子标记及其在中医药微生态研究中的应用[D]. 邱超. 江西中医药大学, 2021(01)
- [7]藏猪耐粗饲特性与肠道微生态环境的相关性研究[D]. 谭占坤. 西藏大学, 2021
- [8]球孢白僵菌bZIP型转录因子BbHapX维持膜稳态及调控铁饥饿响应的生理机制[D]. 彭跃进. 浙江大学, 2021
- [9]深海微生物酶特异性降解硒化卡拉胶的分子机制研究[D]. 王凯. 自然资源部第一海洋研究所, 2021
- [10]棘孢木霉T46的筛选、生产及诱导山新杨抗性机理研究[D]. 于泽洋. 东北林业大学, 2021