一、利用酵母生产人造血液（论文文献综述）
杨刚刚[1]（2012）在《毕赤酵母表达重组人血清白蛋白（rHSA）的条件优化试验研究》文中进行了进一步梳理人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）占人血浆总蛋白的60%，具有抗凝血、清除自由基、维持血液正常的渗透压等功能，广泛用于抗休克与治疗烧伤、手术或意外大出血造成的急性血容量减少。目前市售HSA均来源于人源血浆的提纯，存在产量不足以及纯化过程难以避免血源病毒两大问题。因此，利用基因工程技术来生产重组人血清白蛋白（recombinant HSA，rHSA）代替人源HSA已经成为一种趋势。目前的难点主要集中于提高rHSA的表达水平及其纯度。本文针对毕赤酵母（Pichia pastoris）在表达rHSA过程中常用的载体-菌株组合及不同规模下影响蛋白表达水平的条件进行了初步优化试验研究。本文研究不同载体-菌株组合对rHSA表达水平的影响时发现：在表达rHSA时，pPICZα系列载体作为表达载体；而选用X-33菌株的rHSA表达水平要优于GS115和SMD1168菌株，说明选用X-33作为宿主菌有利于提高rHSA的表达量。本文研究1L摇瓶规模下不同因素对rHSA表达水平的影响时发现，不同装液量、转速、温度、pH、甲醇浓度和添加次数以及不同离子对rHSA表达水平均有影响。最佳表达条件为1L三角瓶中装入100mLBMGY培养基，接种量1%，转速200rpm，pH=5.5，温度22℃，甲醇每24h添加2次，每次添加量为总体积的1%，磷酸盐浓度100mM/L，硫酸铵浓度0.5%。最佳表达条件下，诱导240h后rHSA的表达量可达到0.5g/L。此一系列条件可以作为发酵罐规模培养条件的参考。本文研究3L发酵罐规模下不同因素对rHSA表达水平的影响时发现，不同的基础盐培养基、起始诱导密度、溶解氧体积分数（DO）、pH、温度、甲醇浓度等培养条件以及诱导过程中添加额外碳源、油酸等影响因素对rHSA表达水平均有影响。最佳表达条件为一级种子以10%的接种量接入基础盐培养基中，起始诱导密度为400，发酵过程中保持DO在30%，诱导温度22℃，pH=5.75，甲醇电极控制甲醇浓度在1%，诱导过程中添加甘油2g/L/h，油酸添加量为0.1%，发酵全过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。最佳表达条件下，诱导288h后rHSA表达量接近5g/L。
孟凡红[2]（2006）在《重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化》文中研究指明人血清白蛋白（HSA）在临床上扮演着重要角色，目前，人血清白蛋白主要在人血浆中提取制备。一方面由于血液供应有限，另一方面，由于供血人群的关系，血液来源的白蛋白有潜在的传播传染性疾病的可能。因此，利用基因工程方法生产重组人血清白蛋白，杜绝血液制品的污染源，具有极大的社会经济意义。 汉逊酵母同毕赤酵母一样都能够在以甲醇为唯一碳源、能源的培养基中生长。根据汉逊酵母遗传密码的偏爱性将HSA基因进行优化，并将人工合成的人血清白蛋白基因克隆到汉逊酵母表达载体pDGXMPT1.0上，构建了汉逊酵母HSA重组表达质粒，电转化入酵母细胞后，转化子经选择培养基（MD）中筛选出URA3+表型转化子。采用小摇瓶培养、PCR、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和ELISA等手段筛选相应高表达株。利用30L发酵罐进行发酵工艺开发，实现了工程细胞在发酵罐中的高密度培养，诱导61个小时rHSA表达量达到1.033g／L，此后蛋白酶的降解作用开始变得明显，诱导150个小时后rHSA的量呈较低水平。表达产物经Streamline SP离子交换层析、疏水层析和DEAE阴离子交换层析等步骤得到了纯化，最终得到电泳级纯度蛋白。将纯化得到的蛋白稀释成合适的浓度并除菌过滤，用于几组小鼠的免疫原性分析实验，免疫结束后，分离血清进行免疫双扩散和酶联免疫反应实验测定抗体，与市售人血清白蛋白相比，具有相同的免疫原性。
张帆[3]（2011）在《双水相萃取偶联柱层析分离纯化重组白蛋白》文中进行了进一步梳理人血清白蛋白为人体血浆中含量最丰富的蛋白,具有很多重要的生理功能。临床上可作为很多疾病的药品治疗剂,还可作为生物产品的保护剂和赋形剂及细胞培养的添加成分,得到了广泛应用。近年来大规模生产重组人血清白蛋白作为血源白蛋白替代品。针对从高密度发酵液中分离纯化重组人血清白蛋白中存在的固液分离困难、工艺复杂、杂质难去除等问题,本论文从以下方面做了探索性研究。首先,考察了不同乙醇/无机盐双水相体系对重组人血清白蛋白的萃取能力,其中乙醇/磷酸氢二钾双水相体系的回收率最高,且在4-30℃的温度和1-30g/L的重组人血清白蛋白浓度均能保持较高萃取收率。该双水相体系能够直接从发酵液中萃取重组人血清白蛋白,当操作条件为乙醇20%（w/w）/磷酸氢二钾18%（w/w）时,重组人血清白蛋白回收率达到108.13%。综合考虑回收率和相比因素,选择乙醇18%（w/w）/磷酸氢二钾20%（w/w）体系放大实验,0.01-73L规模的平均回收率为100.4%,菌体的平均去除率达到99%。同时该双水相体系能够有效去除发酵液中的部分杂蛋白,还可以去除87.2%的多糖,并使上相的蛋白酶A活性降低了24.4%,部分抑制了蛋白酶B的活性,提高了重组人血清白蛋白的稳定性。双水相萃取将固液分离、萃取、浓缩、初级纯化整合为一步进行。通过研究成相物质的回收,上相中的乙醇和下相中的磷酸氢二钾回收率均在80%以上。其次,根据双水相上相的特点,建立了与之相适应的纯化方法：包括减压蒸馏去除乙醇、Phenyl SepharoseTM疏水层析纯化、DEAE阴离子交换层析去除多聚体等步骤。其中向平衡液中添加含1.2mol/L的磷酸氢二钾,为疏水层析的最优条件,此时收率为74.94%,还原SDS-PAGE电泳结果表明纯化的重组人血清白蛋白达到了电泳纯。而且纯化的重组人血清白蛋白能够长期保存,其中蛋白酶A活性降至上清液的9.18%,蛋白酶B可能被去除。最后,对上述方法分离纯化得到的重组人血清白蛋白纯度、杂质含量、二级结构及分子量进行了分析。高效液相色谱检测其纯度达到了99.77%,色素比值A350/A280为0.028。同时,其多糖含量为2.98μg/mg,蛋白酶A活性降为上清液的2.93%。而且,纯化的重组人血清白蛋白分子量及二级结构与血源白蛋白具有一致性。双水相萃取耦合柱层析技术提供了一种简便的、分离纯化得到高纯度重组人血清白蛋白的方法,具有分离时间短、收率高、杂质去除效果好的优点,具有产业化的前景。
樊晶,温志刚[4]（2001）在《人工血液前瞻性研究》文中研究说明本文以国内外前人对人工血液的研究为基础 ,通过概述人工血液研究的进展 ,和几代制品的发展情况 ,重点从人工血液的最新研究热点 脂质体微囊包埋技术和基因工程的前沿科研角度 ,围绕人造血红蛋白的稳定性、制备工艺、临床毒副作用进行了综述。
孙慧碧[5]（2008）在《人血清白蛋白/人白介素-11在毕赤酵母中的克隆与表达》文中研究说明人白介素-11（Interleukin-11,IL-11）在体内由PU-34细胞产生,具丝裂原活性、能支持IL-6依赖的浆细胞瘤细胞系T1165生长。最基本的功能在于造血调控作用,在体外对不同阶段的巨核细胞和血小板生成都具有特异的促进作用。体内注射hIL-11可显着刺激巨核细胞集落（CFU-MK）生长和增加血小板计数,还具有促进消化道上皮损伤恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性。但是天然的白介素-11在在体内的半衰期较短,为了达到延长其在体内的半衰期,本研究采用了把白介素-11和人血清白蛋白以无连接肽的方式融合。取人胎肺成纤维细胞,以DMEM刺激培养,提取总RNA,通过反转录得到编码人白介素-11的cDNA,克隆到T载体pMD19-Simple上,构建含有IL-11编码基因的重组质粒pMD19/IL-11,DNA序列测定结果证明插入序列与IL-11编码序列完全一致。分别以pMD19/IL-11和含有编码HSA编码基因的重组质粒pBlue/HSA为模板,利用重叠PCR的办法,扩增得到HSA-IL-11融合基因,连接到载体上得到重组质粒pBlue/HI;对pBlue/HI和穿梭质粒pPIC9K分别用EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切,将HSA-IL-11融合基因克隆到表达质粒pPIC9K中构建重组表达质粒pPHI11;经测序验证,所得到的表达载体中目的片段碱基序列和预期一致,读框正确。将SalⅠ线性化的pPHI11电转化巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,通过组氨酸缺陷型标记和G418抗性筛选,得到抗0.75 mg/mL的G418的毕赤酵母转化子,经过PCR验证,转化子中含有HSA-IL-11融合基因。BMGY种子培养基培养细胞,经离心收集后,于BMMY诱导表达培养基在30℃,200 r/min条件下,以甲醇为唯一碳源诱导3 d,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测,重组子表达出相应分子量的目标蛋白,HSA及IL-11抗体的Western-blot免疫杂交实验检测结果表明,融合蛋白中含有HSA和IL-11,说明HSA-IL-11融合蛋白得以表达。定量测定结果表明,融合蛋白在诱导上清液中的表达量约为120 mg/L。对重组菌在摇瓶转速、诱导甲醇浓度、诱导时间、诱导pH、诱导温度等条件下进行优化,得到的诱导条件为:诱导温度30℃,甲醇浓度5%,pH6,诱导细胞密度O.D.600=60,在上述优化条件下HSA-IL-11的表达量为198 mg/L。B9-11/MTT法检测诱导上清液生物学活性的结果表明,融合蛋白HSA-IL-11可以有效刺激B9-11细胞增殖,其IL-11生物学活性约为6.2×104 U/mg。
刘敏[6]（2011）在《脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性研究》文中研究表明蔗糖6-乙酯是选择性氯化合成三氯蔗糖的重要中间体。相较于传统化学合成方法,脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯具有区域选择性高,制备过程简单,反应条件温和等优点。本文是基于介质工程,研究了有机相,微水相和两相三种介质体系中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性。首先,考察了固定化脂肪酶Lipozyme TL IM（T）和Novo 435（N435）与游离脂肪酶假丝酵母脂肪酶（CRL）和猪胰脂肪酶（PPL）在12种有机溶剂中催化合成蔗糖-6-乙酯的反应。确定了三种有机介质反应体系：1)仲丁醇为反应介质,Lipozyme TL IM为催化剂,蔗糖与乙酸乙烯酯转酯化合成蔗糖-6-乙酯反应；2)叔戊醇为反应介质,Lipozyme TL IM为催化剂,蔗糖-6-乙酯的合成反应；3)叔戊醇为反应介质,假丝酵母脂肪酶为催化剂,蔗糖-6-乙酯的合成反应。其次,考察缓冲溶液类型及含水量对脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的影响,并确定了三种微水相反应介质：1)0.6%H2BO3-Na2B4O7·10H2O缓冲溶液与仲丁醇组成的反应介质,2)1.0%Tris-HCl缓冲溶液与叔戊醇组成的反应介质,3)0.8%Tris-HCl缓冲溶液与叔戊醇组成的反应介质。微水相和有机相中脂肪酶催化活性和选择性有明显的差异。由0.6%H2BO3-Na2B4O7·10H2O缓冲溶液和仲丁醇组成的微水相中Lipozyme TL IM催化活性是仲丁醇有机相中的10倍左右；由1.0%Tris-HCl缓冲溶液和叔戊醇组成的微水相中LipozymeTL IM催化活性是有机相中的5.6倍左右,且选择性巨大提高。由0.8%Tris-HCl缓冲溶液和叔戊醇组成的微水相中假丝酵母脂肪酶催化活性是有机相中的5.7倍左右。最后,考察了缓冲溶液/叔戊醇两相体系中假丝酵母脂肪酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯的转酯化反应。通过单因素实验确定反应最优条件：Tris-HCl缓冲体系,0.lmmol/ml Tris离子浓度,乙酸乙烯酯与蔗糖摩尔比3：1,初始pH 7.0,叔戊醇体积比30%,反应温度35℃,反应时间4h.蔗糖-6-乙酯的产率和选择性分别为35.3%,55.6%。Tris缓冲溶液/叔戊醇两相体系中假丝酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的活性是微水相中的10倍,但选择性明显下降。
殷艺伟,陈建华[7]（2006）在《重组人血清白蛋白的药学应用研究进展》文中研究表明综述了重组人血清白蛋白的性质、结构和功能,及常用表达系统。重点介绍了重组人血清白蛋白在药学上的应用。人血清白蛋白是人血浆中最丰富的蛋白质,具有许多重要的生理特性,用途广泛。
张家菁,王常民[8]（2014）在《论基因工程对人类社会的影响》文中提出基因工程技术对人类社会产生了非常重要的影响,在农业生产、医药卫生、食品工业、环境保护等方面都起了非常重要的作用,但同时也带来了不少问题。我们应正确看待基因工程技术,通过更深入的研究,让基因工程为人类社会创造更高的价值。
侯维志,杨凤华,胡怀明[9]（1998）在《烟草的营养及药用价值》文中提出
杨凤华,谷红梅,李季秋[10]（1998）在《浅谈烟草的食用及药用价值》文中指出
二、利用酵母生产人造血液（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用酵母生产人造血液（论文提纲范文）
（1）毕赤酵母表达重组人血清白蛋白（rHSA）的条件优化试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 天然人血清白蛋白(HSA)性质与药理作用 |
| 1.1.1 HSA 的合成 |
| 1.1.2 HSA 的结构 |
| 1.1.3 HSA 的理化性质 |
| 1.1.4 HSA 的药理作用 |
| 1.1.5 HSA 的应用和意义 |
| 1.2 重组人血清白蛋白(rHSA)的表达与药理作用 |
| 1.2.1 rHSA 的原核表达 |
| 1.2.2 rHSA 的酵母表达 |
| 1.2.3 rHSA 的其他系统表达 |
| 1.2.4 rHSA 的药理作用 |
| 1.2.5 rHSA 的应用前景和意义 |
| 1.3 rHSA 的临床应用 |
| 1.3.1 人造血液替代品 |
| 1.3.2 促进药物的靶向作用 |
| 1.3.3 作为辅助药剂 |
| 1.3.4 与其他蛋白融合 |
| 1.4 rHSA 的产业化研究进展 |
| 1.5 本论文的意义和创新性 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂盒及试剂 |
| 2.1.3 贮存液和培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HSA 基因序列的设计 |
| 2.2.2 重组表达质粒 pPIC9K-HSA 的构建及鉴定 |
| 2.2.3 重组表达质粒 pPICZa-A-HSA 的构建及鉴定 |
| 2.2.4 毕赤酵母 X-33、GS115 及 SMD1168 的转化 |
| 2.2.5 基因组 PCR 法鉴定阳性重组子 |
| 2.2.6 不同 rHSA 工程菌表达情况检验及产物鉴定 |
| 2.2.7 rHSA 酵母菌在摇瓶中的最佳表达条件试验 |
| 2.2.8 rHSA 酵母菌的中试规模诱导表达 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 菌体密度的测定 |
| 2.3.2 菌体湿重、干重的测定 |
| 2.3.3 甲醇浓度的测定 |
| 2.3.4 SDS-PAGE 凝胶电泳 |
| 2.3.5 蛋白浓度的测定 |
| 2.3.6 蛋白鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒 pPIC9K-HSA 鉴定结果 |
| 3.2 重组表达质粒 pPICZa-A-HSA 鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒转入毕赤酵母验证结果 |
| 3.4 不同 rHSA 工程菌的表达结果及重组蛋白的鉴定结果 |
| 3.4.1 不同 rHSA 工程菌的表达结果 |
| 3.4.2 表达产物鉴定结果 |
| 3.5 rHSA 酵母菌在摇瓶中条件优化结果 |
| 3.5.1 体积、转速优化结果 |
| 3.5.2 pH 优化结果 |
| 3.5.3 温度优化结果 |
| 3.5.4 甲醇浓度及添加次数优化结果 |
| 3.5.5 不同盐离子浓度优化结果 |
| 3.6 rHSA 酵母菌中试规模的条件优化结果 |
| 3.6.1 培养基选择结果 |
| 3.6.2 起始诱导菌体密度优化结果 |
| 3.6.3 溶氧优化结果 |
| 3.6.4 pH 优化结果 |
| 3.6.5 温度优化结果 |
| 3.6.6 甲醇浓度优化结果 |
| 3.6.7 添加剂优化结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表论文 |
| 致谢 |
（2）重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 人血清白蛋白的结构、性质与应用 |
| 1.1.1 HSA的结构 |
| 1.1.2 理化性质 |
| 1.1.3 人血清白蛋白的体内合成 |
| 1.1.4 人血清白蛋白的药理作用 |
| 1.2 表达重组人血清白蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 rHSA在原核表达系统中的表达 |
| 1.2.2 rHSA在酵母真核细胞表达系统中的表达 |
| 1.2.3 rHSA在动、植物表达系统中的表达 |
| 1.3 重组人血清白蛋白在药学中的应用研究进展 |
| 1.3.1 人造血液替代品 |
| 1.3.2 通过微球体化和化学修饰促进药物的靶向作用 |
| 1.3.3 与治疗剂直接结合 |
| 1.3.4 白蛋白融合蛋白 |
| 1.3.5 血脑屏障运输和非入侵性基因转运载体 |
| 1.4 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)表达系统 |
| 1.4.1 汉逊酵母的基本特征 |
| 1.4.2 汉逊酵母作为表达宿主的菌株 |
| 1.4.3 表达载体的主要元件 |
| 1.4.4 汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母表达系统的比较 |
| 1.5 高密度发酵生产重组人血清白蛋白 |
| 1.5.1 提升高密度发酵生产重组人血清白蛋白的策略 |
| 1.5.2 高密度发酵生产重组人血清白蛋白碳源供给方式的研究 |
| 1.5.3 高密度发酵生产重组人血清白蛋白过程中降低蛋白酶活性的策略 |
| 1.6 重组人血清白蛋白的分离纯化 |
| 1.7 课题的内容和意义 |
| 参考文献 |
| 2 rHSA表达质粒的构建与重组菌株的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 材料、培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 设计重组人血清白蛋白的基因序列 |
| 2.3.2 重组质粒的构建 |
| 2.3.3 表达质粒的转化 |
| 2.3.4 表达菌株的筛选 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 HSA基因序列优化 |
| 2.4.2 重组质粒的获得及目的基因的检测 |
| 2.4.3 重组质粒转化汉逊酵母及阳性克隆的筛选 |
| 2.5 小结 |
| 3. 发酵 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 菌种 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.3 试验操作及方法 |
| 3.3.1 培养一、二级种子 |
| 3.3.2 发酵罐培养 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 发酵过程曲线 |
| 3.4.2 SDS-PAGE分析发酵液上清蛋白质 |
| 3.4.3 ELISA法检测发酵液上清中rHSA的表达量 |
| 参考文献 |
| 4 重组人血清白蛋白的分离纯化与免疫原性分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试验仪器 |
| 4.2.2 试验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白组分的制备 |
| 4.3.2 Streamline SP离子交换层析 |
| 4.3.3 疏水层析 |
| 4.3.4 阴离子交换层析 |
| 4.3.5 蛋白浓度的确定 |
| 4.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 4.3.7 小鼠免疫原性初步实验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Streamline SP离子交换层析 |
| 4.4.2 疏水层析 |
| 4.4.3 DEAE离子交换层析 |
| 4.4.4 酶联免疫分析 |
| 4.4.5 抗原性分析 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 I 缩略语表 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 大连理工大学学位论文版权使用授权书 |
（3）双水相萃取偶联柱层析分离纯化重组白蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 人血清白蛋白简介 |
| 1.1.1 人血清白蛋白结构及体内合成过程 |
| 1.1.2 人血清白蛋白的生理功能 |
| 1.1.3 人血清白蛋白的应用 |
| 1.1.4 人血清白蛋白的市场 |
| 1.1.5 人血清白蛋白来源 |
| 1.1.6 血源白蛋白的提取 |
| 1.2 重组人血清白蛋白 |
| 1.2.1 重组人血清白蛋白的表达系统 |
| 1.2.2 国内外重组人血清白蛋白的开发 |
| 1.2.3 重组人血清白蛋白的分离纯化 |
| 1.3 毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白 |
| 1.3.1 毕赤酵母发酵液的特点 |
| 1.3.2 毕赤酵母蛋白酶 |
| 1.4 双水相萃取技术 |
| 1.4.1 传统双水相萃取技术 |
| 1.4.2 亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取技术 |
| 1.4.3 双水相萃取的特点 |
| 1.4.4 亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取技术的应用 |
| 1.5 疏水层析 |
| 1.5.1 疏水层析原理 |
| 1.5.2 疏水层析分离过程 |
| 1.5.3 疏水层析缓冲液中盐的选择 |
| 1.5.4 疏水层析介质 |
| 1.5.5 纯化策略中的疏水层析 |
| 1.6 本课题的研究内容及意义 |
| 1.6.1 本课题的研究内容 |
| 1.6.2 本课题的研究方案 |
| 1.6.3 本课题的研究意义 |
| 2 重组人血清白蛋白在亲水性有机溶剂/无机盐双水相体系中的分配规律 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 发酵上清液的制备 |
| 2.3.2 不同双水相体系萃取能力测定 |
| 2.3.3 亲水性有机溶剂/无机盐双水相体系相图的绘制 |
| 2.3.4 重组人血清白蛋白在双水相体系中分配行为的研究 |
| 2.3.5 分析方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 不同双水相体系萃取能力测定 |
| 2.4.2 乙醇/磷酸氢二钾双水相体系相图的绘制 |
| 2.4.3 重组人血清白蛋白在磷酸氢二钾/乙醇双水相体系中的分配规律 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 双水相萃取发酵液中重组人血清白蛋白的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离发酵液中的重组人血清白蛋白 |
| 3.3.2 乙醇/磷酸氢二钾双水相萃取对发酵液中杂质的去除效果 |
| 3.3.3 重组人血清白蛋白在双水相上相中稳定性分析 |
| 3.3.4 双水相上相中蛋白酶性质分析及活性测定 |
| 3.3.5 双水相体系中盐回收方法的研究 |
| 3.3.6 分析方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 乙醇/磷酸氢二钾双水相萃取发酵液中重组人血清白蛋白条件研究 |
| 3.4.2 乙醇/磷酸氢二钾双水相萃取对发酵液中杂质的去除 |
| 3.4.3 双水相萃取对发酵液中蛋白酶的去除作用 |
| 3.4.4 乙醇/磷酸氢二钾体系中盐回收方法的研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 重组人血清白蛋白纯化方法研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 减压蒸馏回收乙醇 |
| 4.3.2 添加不同种类盐的疏水层析 |
| 4.3.3 添加不同盐疏水层析后的重组人血清白蛋白稳定性 |
| 4.3.4 添加不同盐的疏水层析,得到重组人血清白蛋白中的蛋白酶分析 |
| 4.3.5 添加磷酸氢二钾的疏水层析对杂质的去除效果 |
| 4.3.6 pH对添加磷酸氢二钾疏水层析的影响 |
| 4.3.7 DEAE阴离子层析条件的优化 |
| 4.3.8 分析方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 减压蒸馏后乙醇含量 |
| 4.4.2 添加盐种类和浓度对疏水层析收率的影响 |
| 4.4.3 添加盐种类和浓度对疏水层析后重组人血清白蛋白纯度的影响 |
| 4.4.4 添加不同盐疏水层析后的重组人血清白蛋白稳定性 |
| 4.4.5 添加不同盐疏水层析,得到的重组人血清白蛋白中蛋白酶分析 |
| 4.4.6 pH对添加磷酸氢二钾疏水层析的影响 |
| 4.4.7 添加磷酸氢二钾疏水层析对多糖、色素的去除效果 |
| 4.4.8 DEAE阴离子层析条件优化 |
| 4.4.9 DEAE阴离子层析对多糖及色素的去除效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 重组人血清白蛋白鉴定分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 纯化方法各步对多糖、色素及蛋白酶A的去除效果 |
| 5.3.2 重组人血清白蛋白鉴定分析 |
| 5.3.3 分析方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 纯化过程各步重组人血清白蛋白收率及杂质含量 |
| 5.4.2 色素水平测定 |
| 5.4.3 HPLC分析重组人血清白蛋白纯度 |
| 5.4.4 质谱测定重组人血清白蛋白分子量 |
| 5.4.5 圆二色光谱分析重组人血清白蛋白二级结构 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（5）人血清白蛋白/人白介素-11在毕赤酵母中的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 人白介素-11 的发现 |
| 1.1.2 IL-11 的分子生物学特性 |
| 1.1.3 IL-11 的生物学作用 |
| 1.1.4 IL-11 的临床作用 |
| 1.2 人血清白蛋白的研究 |
| 1.2.1 人血清白蛋白的分子生物学特性 |
| 1.2.2 重组人血清白蛋白在药学中的应用 |
| 1.2.3 重组人血清白蛋白的表达系统 |
| 1.3 长效药物研究 |
| 1.3.1 我国生物技术药物研究概况 |
| 1.3.2 国际生物技术药物概况 |
| 1.3.3 长效药物研究途径 |
| 1.3.4 长效药物应用前景 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.4.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 |
| 1.4.2 表达型巴斯德毕赤酵母宿主菌株 |
| 1.4.3 巴斯德毕赤酵母表达载体 |
| 1.4.4 影响外源蛋白表达的主要因素 |
| 1.4.5 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用前景 |
| 1.5 本课题的研究思路与内容 |
| 1.5.1 课题研究思路 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 人血清白蛋白和白介素-11 编码基因融合载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 人胎肺细胞、菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 工具酶、试剂和缓冲液 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 XL-1-Blue 感受态细胞的制备以及转化 |
| 2.2.6 原代胎肺成纤维细胞的制备及诱导 |
| 2.2.7 总RNA 的提取及RT-PCR 合成IL-11cDNA |
| 2.2.8 IL-11 编码基因的克隆 |
| 2.2.9 获得编码HSA-IL-11 的基因及其克隆 |
| 2.2.10 重组表达质粒pPH111 的构建及其序列测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 融合蛋白HSA-IL-11 表达载体pPH111 构建 |
| 2.3.2 含有IL-11cDNA 序列的重组载体pMD19/IL-11 的构建 |
| 2.3.3 融合基因HSA-IL-11 的拼接 |
| 2.3.4 重组质粒pBlue/HI 的构建 |
| 2.3.5 表达质粒pPH111 的构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组酵母P. PASTORIS G5115/PPH111 的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、质粒和培养基 |
| 3.2.2 工具酶、试剂与缓冲液 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 线性化融合表达质粒pPH111 和pPIC9K |
| 3.2.5 重组菌P. pastoris GS115/pPH111 的构建 |
| 3.2.6 高拷贝重组子P. pastoris GS115/pPH111 的筛选 |
| 3.2.7 重组子P. pastoris GS115/pPH111 的PCR 鉴定 |
| 3.2.8 重组子的Mut 表型鉴定 |
| 3.2.9 重组子P. pastoris GS115/pPH111 的诱导表达 |
| 3.2.10 表达产物的Western-blot 鉴定 |
| 3.2.11 融合蛋白测定方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 重组毕赤酵母P. pastoris GS115/pPH111 的构建与筛选 |
| 3.3.2 重组毕赤酵母P. pastoris GS115/pPH111 的鉴定 |
| 3.3.3 重组菌的Mut 表型鉴定 |
| 3.3.4 高表达P. pastoris GS115/pPH111 的筛选 |
| 3.3.5 融合蛋白的Western-blot 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 P. PASTORIS GS115/PPH111 诱导条件的初步优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种与细胞 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试剂 |
| 4.2.5 摇瓶诱导条件的优化 |
| 4.2.6 融合蛋白HSA-IL-11 的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 菌体生长阶段溶氧对表达的影响 |
| 4.3.2 甲醇浓度对表达的影响 |
| 4.3.3 pH 对表达的影响 |
| 4.3.4 诱导时间对表达的影响 |
| 4.3.5 诱导温度对表达的影响 |
| 4.3.6 初步优化后融合蛋白的表达 |
| 4.3.7 融合蛋白的生物活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 主要结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 脂肪酶的概述 |
| 1.2.1 脂肪酶的结构 |
| 1.2.2 脂肪酶催化酯交换反应机理 |
| 1.2.3 脂肪酶的应用 |
| 1.2.3.1 脂肪酶在食品加工中的应用 |
| 1.2.3.2 脂肪酶在纺织物中的应用 |
| 1.2.3.3 脂肪酶的医学应用 |
| 1.2.3.4 脂肪酶在生物柴油中的应用 |
| 1.2.3.5 脂肪酶在生物传感器中的应用 |
| 1.3 脂肪酶催化体系 |
| 1.3.1 底物优化 |
| 1.3.2 反应介质体系的优化 |
| 1.3.2.1 有机溶剂体系 |
| 1.3.2.2 无溶剂体系 |
| 1.3.2.3 超临界流体体系 |
| 1.3.2.4 离子液体体系 |
| 1.3.2.5 含水和盐体系 |
| 1.3.2.6 助溶剂和“仿水”溶剂 |
| 1.3.3 催化剂脂肪酶的优化 |
| 1.4 论文研究内容 |
| 第二章 有机溶剂体系中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.2.2 蔗糖乙酸酯合成方法 |
| 2.2.3 反应初始水活度aw的控制 |
| 2.2.4 蔗糖-6-乙酯的鉴定 |
| 2.2.5 产物定量分析方法 |
| 2.2.6 蔗糖-6-乙酯溶液标准曲线的绘制 |
| 2.2.7 脂肪酶酶活测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 有机溶剂的筛选 |
| 2.3.2 脂肪酶的筛选 |
| 2.3.3 酰基供体的影响 |
| 2.3.4 初始水活度的影响 |
| 2.3.5 乙酸乙烯酯量的影响 |
| 2.3.6 蔗糖量的影响 |
| 2.3.7 酶量的影响 |
| 2.3.8 反应温度的影响 |
| 2.3.9 反应进程 |
| 2.3.10 产物的高效液相和液质联用分析结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 微水相体系中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂及仪器 |
| 3.2.2 蔗糖乙酸酯合成方法 |
| 3.2.3 蔗糖-6-乙酯的鉴定 |
| 3.2.4 产物分析方法(HPLC-ELSD) |
| 3.2.5 蔗糖-6-乙酯溶液标准曲线的绘制 |
| 3.2.6 脂肪酶酶活测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 有机溶剂的筛选 |
| 3.4 脂肪酶的筛选 |
| 3.4.1 缓冲溶液类型的影响 |
| 3.4.2 水含量的影响 |
| 3.4.3 乙酸乙烯酯量的影响 |
| 3.4.4 蔗糖量的影响 |
| 3.4.5 酶量的影响 |
| 3.4.6 缓冲溶液初始pH值的影响 |
| 3.4.7 温度的影响 |
| 3.4.8 反应进程 |
| 3.4.9 产物的高效液相和液质联用分析结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 叔戊醇/缓冲溶液两相体系假丝酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂及仪器 |
| 4.2.2 蔗糖乙酸酯合成方法 |
| 4.2.3 蔗糖-6-乙酯的鉴定 |
| 4.2.4 产物分析方法(HPLC-ELSD) |
| 4.2.5 蔗糖-6-乙酯溶液标准曲线的绘制 |
| 4.2.6 脂肪酶酶活测定 |
| 4.3. 结果与讨论 |
| 4.3.1 缓冲体系的影响 |
| 4.3.2 底物摩尔比的影响 |
| 4.3.3 叔戊醇体积含量的影响 |
| 4.3.4 初始pH的影响 |
| 4.3.5 反应温度的影响 |
| 4.3.6 反应进程 |
| 4.3.7 产物的高效液相和液质联用分析结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附图 |
四、利用酵母生产人造血液（论文参考文献）
- [1]毕赤酵母表达重组人血清白蛋白（rHSA）的条件优化试验研究[D]. 杨刚刚. 河南师范大学, 2012(12)
- [2]重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化[D]. 孟凡红. 大连理工大学, 2006(03)
- [3]双水相萃取偶联柱层析分离纯化重组白蛋白[D]. 张帆. 大连理工大学, 2011(09)
- [4]人工血液前瞻性研究[J]. 樊晶,温志刚. 微生物学免疫学进展, 2001(03)
- [5]人血清白蛋白/人白介素-11在毕赤酵母中的克隆与表达[D]. 孙慧碧. 江南大学, 2008(03)
- [6]脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的选择性研究[D]. 刘敏. 浙江工业大学, 2011(08)
- [7]重组人血清白蛋白的药学应用研究进展[J]. 殷艺伟,陈建华. 药学进展, 2006(02)
- [8]论基因工程对人类社会的影响[A]. 张家菁,王常民. 第十六届中国科协年会——分5生态环境保护与绿色发展研讨会论文集, 2014
- [9]烟草的营养及药用价值[J]. 侯维志,杨凤华,胡怀明. 中国林副特产, 1998(04)
- [10]浅谈烟草的食用及药用价值[J]. 杨凤华,谷红梅,李季秋. 牡丹江医学院学报, 1998(02)