一、大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究（论文文献综述）
杨雨晴[1]（2021）在《ETEC 987P、K88重组干酪乳杆菌的构建及免疫效力评价》文中研究指明产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）引起的仔猪黄痢是当前集约化养猪的常见病和多发病,是一种导致初生仔猪腹泻的高度致死性传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失。ETEC有黏附素和肠毒素两种致病因子,ETEC入侵机体后首先是借助黏附素的黏附作用定植在肠道,不断繁殖,然后产生肠毒素导致腹泻,因此黏附素是ETEC致病的第一步,起到了决定性作用。ETEC常携带的黏附素为K88、K99、987P、F41。构建ETEC 987P和K88蛋白的重组干酪乳杆菌,并对重组干酪乳杆菌免疫原性进行分析。根据ETEC 987P和ETEC K88的基因序列,设计合成特异性引物,用原核表达体系分别构建表达了987P蛋白、K88蛋白和987P-K88融合蛋白,Western blot结果表明重组蛋白具备良好的反应原性,可用于后续试验。987P-K88基因连接至穿梭质粒p LA,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,将鉴定为阳性的重组质粒电转化进干酪乳杆菌中,得到了重组菌。对PCR鉴定为阳性的菌株进行Western blot鉴定,结果显示,获得大小约85 k Da的重组蛋白,可与抗987P、K88血清结合,具有很好的反应原性。对间接免疫荧光筛选出的阳性表达菌进行流式细胞术检测,随机筛选的10 000个重组菌中阳性率达92.81%。激光共聚焦检测表明蛋白成功展示于干酪乳杆菌表面。将获得的重组干酪乳杆菌命名为p LA-987P-K88/L.casei。为探讨重组干酪乳杆菌p LA-987P-K88/L.casei的免疫效果,试验选用5～6周龄SPF级BALB/c小鼠灌胃免疫重组菌,免疫三次。分别设立p LA-987P-K88/L.casei组、p LA-987P/L.casei组、p LA-K88/L.casei组、p LA/L.casei组、生理盐水组和空白对照组。间接ELISA方法检测小鼠血清Ig G和粪便、肠道、肺脏中s Ig A抗体水平,攻毒后计算试验组小鼠攻毒保护率。结果显示各免疫组Ig G和s Ig A抗体水平显着高于对照组（p<0.0001）,p LA-987P-K88/L.asei组抗体水平与p LA-987P/L.casei组和p LA-K88/L.casei组没有显着差异。末免14 d后进行攻毒试验,p LA-987P-K88/L.caseic组小鼠对ETEC参考菌株C83916（987P）和C83902（K88）的保护率分别为80%和90%。淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫重组菌后的细胞免疫水平显着高于p LA/L.casei组（p<0.001）。试验结果表明,重组干酪乳杆菌p LA-987P-K88/L.casei可诱导小鼠产生黏膜免疫、细胞免疫及体液免疫应答,有效的预防ETEC的感染。免疫p LA-987P-K88/L.casei相对于分别免疫p LA-987P/L.casei和p LA-K88/L.casei,更具经济效益,也为该病的多价重组乳酸菌口服疫苗的研制奠定了坚实的基础。
冯启峥[2]（2020）在《产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究》文中研究指明产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起旅行者、儿童及幼龄动物腹泻的主要病原菌之一,其引起的仔猪黄痢、仔猪白痢和断奶仔猪腹泻严重影响仔猪的健康,给养猪业造成了巨大经济损失。由于耐药菌株的出现使抗生素疗效明显下降,因此,生产上迫切需要新型、高效的药物或疫苗来保障仔猪哺乳期的健康。口服疫苗具有诱导肠道局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫的优点,为仔猪大肠杆菌病疫苗研究提供了新思路。ETEC产生的肠毒素主要有热不稳定肠毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）和热稳定肠毒素（Heat-stable enterotoxin,ST）,是主要致病因子。LT虽具有良好的抗原性,但自身的毒性限制了其作为抗原被直接用于动物的免疫。减毒LT突变体（Mutant heat-labile enterotoxin,mLT）的研究已有报道,但不同mLT突变菌株的构建及其生物学特性尚缺乏系统研究。本研究构建了3株产肠毒素性大肠杆菌的mLT突变菌株,旨在通过对其主要生物学特性系统地比较研究,为仔猪大肠杆菌性腹泻口服疫苗的研制筛选出较理想的候选菌株。本研究选择E.coli C83903（K88、STb、LT）为初始菌株,使用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统敲除est B基因获得E.coli C83903（35）est B后,对编码LT的基因elt定点突变,分别构建了E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、和E.coli mLT-R192G。经实验检测,3株突变菌在连续50次传代后基因突变位点遗传稳定;细菌生长曲线、菌毛的生长、对IPEC-J2细胞的黏附等生物学特性与初始菌比较无明显差异;耐药性无改变;对p H>2.5的胃液环境和0.3%的胆汁环境有良好的耐受性。为检测LT和mLT,本研究构建了E.coli p ET-32a-S1-BL21、E.coli p ET-32a-S2-BL21重组菌,表达纯化了重组蛋白LTA-S1、LTA-S2,免疫家兔并制备了兔抗LTA-S1和兔抗LTA-S2血清,其中兔抗LTA-S1血清效价较高,用于后续LT和mLT的检测。兔肠袢结扎试验和兔肠组织切片观察结果显示,3种不同mLT均有一定的肠毒性,其中E.coli mLT-S63K产生的mLT肠毒性最弱,且对肠组织造成的损伤最轻。Y1细胞毒性试验结果显示,E.coli mLT-S63K产生的mLT对Y1细胞的毒性最弱,毒力效价为103.48 TCID50/0.1m L,是初始菌E.coli C83903产生的LT毒性的1/10 000(107.61 TCID50/0.1m L)。将5周龄BALB/c小鼠随机分为6组（A、B、C、D、E、F）,每组25只,连续3天分别灌胃0.3 m L无菌PBS,3×1010CFU的E.coli C83903（35）est B（35）eltⅠ、E.coli C83903（35）est B、E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、E.coli mLT-R192G,间隔2 w共免疫3次。检测结果与对照组比较表明,突变菌对小鼠采食量、体重无影响,对回肠组织无损伤,安全性良好;用间接ELISA检测各组小鼠血清、肠黏液中特异性Ig G和s Ig A水平,结果显示,在初次免疫后的第14 d,从实验组小鼠血清和肠黏液检测到针对LTA-S1蛋白的特异性Ig G和s Ig A,抗体水平显着高于对照组（p<0.05）,其中E.coli mLT-R192G组在第35 d检测到的Ig G水平显着高于其他组（p<0.05）,而E.coli mLT-S63K组在第42 d检测到的s Ig A水平显着高于其他组（p<0.05）,在三免后的2周内仍能维持较高水平。针对K88菌毛蛋白和E.coli C83903全菌的特异性Ig G和s Ig A抗体水平检测结果表明,在首免后的第7 d可在部分免疫组的肠黏液中检出特异性s Ig A,其中E.coli mLT-A72R组产生s Ig A的速度最快,抗体水平在第21 d便显着高于其他组并能持续保持较高水平;E.coli mLT-S63K组的K88特异性Ig G自第21 d一直处于较高水平,第42 d时仍显着高于其他组（p<0.05）。针对E.coli C83903全菌所产生的特异性抗体,在第35 d E.coli mLT-S63K组的Ig G水平显着高于其他实验组（p<0.05）,同时该组与E.coli mLT-R192G组肠黏液中的s Ig A水平显着高于其他实验组（p<0.05）,并能在第42d仍维持较高水平。免疫组化试验结果显示,免疫后第35 d,E.coli mLT-S63K组和E.coli mLT-R192G组小鼠Peyer’s淋巴结组织切片可见大量Ig A阳性细胞,数量明显多于其他组。小鼠脾淋巴细胞增殖实验和流式细胞术检测结果表明,IFN-γ和IL-4阳性脾淋巴细胞数显着高于对照组,IFN-γ/IL-4的比值小于1;血清IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子检测结果表明,口服活菌均可有效刺激小鼠产生Th1、Th2以及Th17型细胞免疫反应,血清中IL-4的表达水平更高。结合淋巴细胞亚群的检测结果表明口服突变菌株诱导的细胞免疫以Th2型细胞为主。抗体中和试验结果表明,免疫组血清和肠黏液中的Ig G和s Ig A具有中和LT活性,三组突变株的血清中和抗体效价均为1:89.1,肠黏液的中和抗体效价均为1:44.7,但分别高于E.coli C83903（35）est B组的1:53.7与1:26.9。综上所述,本研究构建的三株mLT突变株具有良好的遗传稳定性,基因编辑操作对其主要生物学特性无显着影响。突变株的生物学特性符合口服疫苗候选菌株基本条件,口服免疫小鼠后能诱导产生局部黏膜免疫、体液免疫以及细胞免疫应答。其中E.coli mLT-S63K株毒性最小、免疫效果最好,可作为ETEC口服疫苗候选菌株进行后续研究。本研究为仔猪大肠杆菌性腹泻的新型疫苗研究提供了实验数据和候选菌株。
许崇利,许崇波,林一民[3]（2020）在《大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白多价卵黄抗体的制备》文中研究表明对已构建的重组菌株BL21（DE3）（pETXKSL3）进行鉴定,酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确.Western blot分析表明K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、K88ac和LTB抗体识别.以K88ac-ST1-LTB融合蛋白为抗原免疫蛋鸡制备卵黄抗体,ELISA法测定卵黄抗体效价可达1∶13 200.仔猪攻毒实验表明制备的卵黄抗体对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防有效率为96%,上述研究结果说明K88ac-ST1-LTB多价卵黄抗体对由ETEC引起的新生仔猪腹泻具有很好的预防效果,从而为最终开发出一种新型高效、可替代抗生素的防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻的特异性卵黄抗体生物防治制剂打下坚实基础.
胡佳[4]（2020）在《FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究》文中提出产肠毒素性大肠杆菌ETEC作为细菌性腹泻的主要病原菌,具有传播范围广、致病性强等特点,给畜牧业带来了巨大损失。ETEC的危害性源自于自身菌毛黏附素的定植功能以及肠毒素的毒害作用,本研究以致病菌ETEC本身作为菌株构建的宿主,利用Lpp’Omp A表面展示系统,将另一种类的黏附素展示到ETEC细胞表面,实现双黏附素共展示表达,并对其生物学特性及黏附保护作用进行评估,以期构建一种双重黏附能力的肠毒性大肠杆菌,为相应的ETEC疫苗或相关黏附抗原提供菌株基础。具体研究内容及相关结果如下:本试验构建了pQE-30-GFP报告质粒,通过对不同重组菌相对荧光强度的测定及显色所需时间的对比,筛选得到了含有Fan C黏附素的良好表达宿主菌BE311。为了增加宿主菌的黏附素黏附表达活性,本试验扩增了来自于E.coli K88黏附素基因fae G,利用over-lap PCR方法构建表面展示质粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G-TC,将构建的质粒转化到宿主菌BE311中,通过阳性克隆的筛选及四半胱氨酸（TC）-双砷系统对特异性标记的Fae G-TC表达产物的鉴定,证实外源的K88黏附素被成功展示在BE311菌体表面;对重组菌进行生长特性测定和诱导表达的结果表明,外源蛋白的表达未给菌株带来生长压力,fae G在经IPTG诱导后,能够稳定表达。在疏水性实验及IPEC-J2细胞黏附实验中,重组菌B311-fae G分别表现出了更好的体外疏水性和对上皮细胞的特异性黏附能力。为了进一步探讨重组菌的在动物肠道中对病原性大肠杆菌的竞争拮抗能力,本试验在实验室原有的基础上,构建了两种特异性荧光标记的ETEC菌株,分别是红色荧光的E.coli K99-m Cherry与绿色荧光的E.coli K88ab-GFP,通过这两种标记的复合病原菌的联合攻毒,发现在攻毒后第5天,能够显着地增加大鼠炎性因子相关基因和蛋白的上调表达。以该攻毒模型为基础,本试验特异性比较了单黏附素Fan C（源自于野生菌株BE311）与双黏附素FanC-FaeG（来源于重组菌株BE311-Fae G）对攻毒大鼠的病原菌拮抗作用,即发酵制备并诱导表达得到相应的大肠杆菌菌体,调整菌悬液浓度为109 CFU/m L,采用辐照的方式处死后,分别添加到大鼠饮水中预饲5天,然后利用109 CFU的复合标记菌株进行灌胃攻毒,分别测定不同处理下的大鼠生长性能及胃肠道分段和粪便中的标记的E coli数量。结果表明,FanC-FaeG组与阴性对照组的大鼠在生长性能方面无显着性差异（P>0.05）;攻毒后的12 h,在十二指肠、空肠及回肠中E coli数量:FanC-FaeG组<Fan C组<阳性对照;攻毒24 h时,粪便中FanC-FaeG组<Fan C组<阳性对照。因此,相较于单黏附素组,重组菌的双黏附特性能够更为显着地减少病原菌标记菌株在小肠内的特异性黏附,有效缓解攻毒后大鼠受到的病原菌侵袭,起到健康保护效果。综上所述,本研究构建了一株FanC-FaeG双黏附素共展示表达ETEC菌株,该菌株能够稳定高效表达外源K88黏附素,并具有强于单黏附素野生菌的黏附能力,在大鼠小肠内能够优先占据特异性结合位点,从而抑制病原菌的黏附,起到肠道保护作用,为疫苗开发或肠道保护制剂的研究提供了多抗原菌株基础。
杨德鸿,麦凯杰,朱元军,刘洋洋,罗翠芬,周庆丰,刘军发[5]（2019）在《国内外猪源产肠毒素大肠杆菌疫苗研究进展》文中研究表明仔猪腹泻是全球规模化猪场最常见的疾病之一,给养猪业带来了巨大的损失。产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原菌,黏附素和肠毒素是其重要的致病因子,ETEC通过黏附素定植于小肠上皮细胞,在增殖过程中不断产生肠毒素,引起大量水和电解质进入肠腔,导致仔猪腹泻。目前,疫苗免疫是预防ETEC最有效的方法,然而许多商品化大肠杆菌疫苗的临床免疫效果不佳,且地域局限性明显。因此,研制安全、高效、广谱的ETEC疫苗对养猪业具有重要意义。近年来,许多新型试验性ETEC疫苗被相继报道,如ETEC菌毛黏附素和肠毒素疫苗;一些新开发的疫苗,如亚单位疫苗、菌影疫苗、植物载体疫苗和囊泡疫苗等,具有不同的优势,在不同的动物试验中均表现出良好的免疫保护效果。文章简述了国内外学者在ETEC疫苗领域的研究进展,对猪源ETEC各类疫苗的优劣及应用研究情况进行了综述,以期为今后猪源ETEC疫苗的研究提供参考。
张鹏[6]（2019）在《安徽部分猪场产肠毒素大肠杆菌分离鉴定、生物学特性及灭活疫苗的初步研究》文中指出仔猪黄白痢多发生于仔猪初生及断奶前后,是规模化猪场最常见的猪病之一,也是最难根治的一种传染病。发病仔猪临床表现为食欲不振,消瘦,拉稀薄的黄痢或黏稠的白痢,严重甚至会引起死亡。该病主要病原是产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）,ETEC的主要致病因子是两种肠毒素,分别是耐热肠毒素（heat stable enterotoxin,ST）和不耐热肠毒素（heat labile enterotoxin,LT）,它们会引起仔猪腹泻,甚至死亡,严重影响养猪业的健康发展。由于ETEC具有较高的耐药性和致病性,其对养猪业的威胁需要引起高度重视。本研究经调查安徽部分地区规模化猪场仔猪黄白痢流行情况,分析ETEC致病因子、耐药情况以及血清型等生物特性,制备相应的灭活疫苗,研究其对小鼠免疫效果,为安徽部分地区规模化猪场ETEC的有效防治提供依据。1安徽部分地区猪场仔猪ETEC的分离鉴定及血清型分析在安徽6个地区17个规模化猪场采集初生到断奶后仔猪新鲜粪便、直肠拭子等479份,经麦康凯琼脂（MacConkey agar,Mac）增菌划线、单菌落形态鉴定、16SrRNA和特异性毒力基因的PCR鉴定及测序,分离得到110株ETEC,其中同时含有ST和LT基因的6株,仅含ST基因的97株,仅含LT基因的7株。通过PCR和血清凝集试验对110株ETEC菌株进行血清型鉴定,共定型52株,占总菌株数的47.3%。鉴定出的血清型主要有O8、O20、O128、O15、O25、O114、O3、O9、O137和O141等13种血清型,其中O8,O20,O128为优势血清型,分别占26.9%（14/52）,21.2%（11/52）和11.5%（6/52）。在6个地域均存在优势血清型。2安徽部分地区猪场仔猪ETEC耐药性及毒力测定使用13种药敏纸片对110株ETEC进行耐药分析,试验结果表明,多重耐药分布广泛,10重耐药及其以上的菌株占比为38.1%（42/110）,多集中于安徽中南部地区猪场。大部分对红霉素,强力霉素,阿莫西林,甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和四环素等高度耐药,耐药率均高达90%以上,如:红霉素94.5%（104/110）,强力霉素100%（110/110）,阿莫西林 91.8%（101/110）,甲氧苄啶/磺胺甲恶唑 94.5%（104/110）和四环素97.3%（107/110）。有51.8%（57/110）的菌株对头孢噻肟敏感,47.3%（52/110）的菌株对恩诺沙星敏感,对多粘菌素B的敏感率最高,达90%（99/110）。对31株优势血清型ETEC菌株进行毒力测定,其中O8血清型菌株14株,O20血清型菌株11株,O128血清型菌株6株,腹腔注射剂量为5×107CFU/只,每株菌攻毒6只小鼠。试验结果显示,O8血清型中有7株强毒株,O20血清型中有8株强毒株,O128有4株强毒株。选择O8强毒株FXYD4-1进行半数致死量（LD50）和最低致死量（MLD）的测定,结果显示O8强毒株FXYD4-1的LD50为5.1 × 106 CFU/只,MLD为 3×107CFU/只。3仔猪黄白痢灭活疫苗制备及对小鼠的免疫效果研究用优势血清型的强毒株和弱毒株分别制备单价灭活疫苗,其中包括O8血清型强毒株FXYD4-1和弱毒株QJZX2制成的疫苗、O20血清型强毒株FDDS1和弱毒株FXYQ1制成的疫苗以及O128血清型强毒株QJXW2-2和弱毒株YQBYZ2-4制成的疫苗,分别以2×108CFU/只腹腔免疫四周龄小鼠,一免后两周二免,二免后一周攻毒,攻毒菌株选择优势血清型强毒株,攻毒剂量为5×107CFU/只,结果表明,血清型O8强毒株FXYD4-1灭活苗对小鼠的保护率在66.7%（2/6）以上;而血清型O20弱毒株FXYQ1制备的灭活疫苗对小鼠的保护率在83.3%（1/6）以上;FXYD4-1和FXYQ1制备的灭活疫苗对O128血清型菌株攻毒小鼠的保护率均达100%。因此,进一步选取O8血清型强毒株FXYD4-1和O20血清型弱毒株FXYQ1混合制成二价灭活苗,对小鼠进行腹腔免疫,免疫剂量为2×108CFU/只,结果显示二价灭活苗对小鼠的保护率在50%以上（3/6）。对免疫前后小鼠血清中的抗体效价测定,表明一免后抗体效价有所上升,二免抗体效价显着高于一免抗体效价。
苏雅婷[7]（2019）在《肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究》文中研究指明在益生菌的选育、体内效价评定以及作用机制研究中,建立肠道攻毒模型可以提供一种有效的手段,即采用特定的病原菌,建立其特异性标记和检测方法,用于体内示踪和分布的研究。常规的模型以绿色荧光蛋白标记及特异性检测居多,但存在菌株遗传稳定性差、检测特异性不强等问题,尤其受到体内背景荧光干扰大的影响,测定结果准确性不高。本研究以肠毒性大肠杆菌作为通用病原菌,采用红色荧光蛋白标记的方法,尝试应用不同的分子标记模式,拟构建出荧光表达稳定、特异性更强的荧光标记菌株,为进一步建立病原菌的攻毒模型奠定菌株和方法学基础。具体研究内容和相关结果如下:（1）选择红色荧光蛋白mKate和mCherry作为报告基因,分别连入3种常见表达载体pET-28a、pET-9a和pQE30,得到6种重组质粒并分别转化至感受态细胞TOP10中。在无诱导剂的条件下,成功筛选得到两种重组质粒pQE30-mKate,pQE30-mCherry,其转化菌株菌落呈现明显红色。以这两种重组质粒为基础,进一步分别化转到不同类型的肠毒性大肠杆菌细胞（E.coli K88ab、E.coli K88ac、E.coli K99和E.coli 987P）中,根据菌落颜色筛选阳性克隆,挑选单菌落用于荧光检测以及酶切验证。结果表明,与其他质粒和表达宿主相比,在无诱导剂的条件下,重组质粒pQE30-mCherry能够实现在E.coli K99中高效表达,过表达的mCherry可泄露至胞外,其阳性转化子在平板上呈现鲜亮的红色,在荧光显微镜下能观察到明显红色荧光。经PCR分子鉴定,荧光标记菌株毒性基因未丢失,并且生长特性无明显变化。通过建立标记菌株E.coli K99-mCherry活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9998）,细胞浓度的检测限达到103 CFU/mL。（2）为增强荧光检测的灵敏度,拟通过增加其mCherry的拷贝数的方式来提高菌株的荧光表达量。分别采用mCherry多拷贝表达盒和多拷贝串联体这两种方式,来构建mCherry基因的双拷贝重组菌质粒,并分别转化E.coli K99进行异源表达。结果表明与单拷贝的重组菌E.coli K99-mCherry相比较,双拷贝的重组菌E.coli K99-2×mCherry和E.coli K99-×2mCherry的荧光强度均低于E.coli K99-mCherry,故单拷贝的mCherry基因在E.coli K99中的表达效果是最好的。（3）本试验首先探讨采用表面展示mCherry基因标记肠毒性大肠杆菌的方法,即通过over-lap PCR方法融合Lpp和OmpA作为锚定蛋白,构成重组质粒pQE30-Lpp’OmpA-mCherry,然后转化到宿主菌E.coli K99。通过镜检、分子鉴定、生长特性分析以及荧光蛋白表达稳定性等方式来评价标记菌株。结果表明,重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry菌株毒性基因未丢失,生长特性无明显变化,菌体的生长与其荧光信号同步,而且荧光表达的遗传稳定性较高。在不诱导的情况下,能通过肉眼观察到红色阳性克隆,在荧光显微镜下也能观察到明显的红色荧光。表明本研究实现了外源蛋白mCherry在肠毒性大肠杆菌中的组成型表达。通过建立标记菌株E.coli K99-mCherry活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9997）,得到细胞浓度的检测限为104 CFU/mL。（4）本试验进一步基于CRISPR/Cas9基因编辑技术来实现mCherry在E.coli K99菌株中定点插入标记。以大肠杆菌K12基因序列为参照,选取可插入外源基因的假基因yheO位点。根据所选假基因位点序列设计sgRNA,成功构建pTargetF-sgRNA载体。并以假基因yheO为模板扩增出yheO的左右同源臂,通过设计引物利用重叠延伸PCR将T5启动子、目的基因mCherry、左右同源臂以及线性化片段J23119（Spe I）-sgRNA-gRNA scaffold相连,最后与Kpn I和Sph I双酶切线性化载体pUC57进行连接反应,构建含有外源基因mCherry的基因编辑载体Donor。将测序成功的Donor载体转化至E.coli K99-Cas9感受态中,挑选验证成功的阳性克隆加入诱导剂IPTG,30℃振荡培养过夜,在42℃条件下培养处理16h以去除基因编辑载体。结果表明,mCherry的定点敲入构建的菌株与野生菌株相比,生长特性无明显变化,毒性基因未丢失,菌体的生长与其荧光的表达同步。遗传稳定性显示其荧光表达十分稳定。在初始诱导物诱导的情况下,单菌落呈现出肉眼可见的红色,在荧光显微镜下也能观察到明显的红色荧光。α-乳糖可取代常用诱导物IPTG,且在浓度为5 g/L时,使菌体的荧光表达量达到高值。通过建立基因编辑菌株活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9999）,细胞浓度的检测限达到104 CFU/mL。（5）通过综合比较三种不同方式构建的重组菌株中mCherry表达的遗传稳定性,筛选出一株最适的标记菌株,将其接种到大鼠胃肠道分段样品中进行特异性荧光检测,并以实验室前期构建的GFP标记的E.coli K99作为对照研究。结果表明,每隔24 h连续转接10次的继代实验发现采用CRISPR/Cas9技术构建的标记菌株荧光表达最为稳定;在实际样品检测中,相比于GFP标记的肠毒性大肠杆菌,mCherry标记菌株的荧光强度检测的变异系数显着降低（p=0.0328）,表明荧光蛋白mCherry在大鼠胃肠段中能克服背景荧光干扰,检测更准确。综上所述,本实验以肠毒性大肠杆菌K99作为通用病原菌,构建利用红色荧光蛋白标记的攻毒菌株,此重组菌能稳定表达红色荧光蛋白,排除动物胃肠道自发荧光干扰,为病原菌的特异性标记研究及动物攻毒模型的构建提供了方法学基础。
沙洲[8]（2017）在《大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响》文中进行了进一步梳理产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coil,ETEC）是导致动物腹泻的主要致病菌之一,该病常发生于幼龄动物,严重威胁畜牧养殖业的健康发展。ETEC可产生一种或几种肠毒素,其产生的耐热肠毒素为主要致病因素。近年来,由于治疗腹泻的药物价格不断提升及主要致病菌中耐药菌株的不断出现,使得通过新型微生态制剂对腹泻进行免疫预防成为当前研究的热点。酵母菌是人和动物重要的益生菌,它含有对机体有益的多种营养物质及生长因子,在增强动物生产性能的同时,促进肠道黏膜的发育并加强免疫功能,改善肠道菌群,且酵母菌是真核生物,其内的各种细胞器和多种酶能够作用于翻译后的蛋白修饰,基于此建立起来的酵母菌表面展示技术能够将基因的多样性通过正确折叠的蛋白准确表达出来。该技术可展示的蛋白种类多、分子数量大,且在筛选、纯化、活性测定等方面操作简便。目前,酵母菌表面展示技术已应用于多个研究领域,应用前景广阔。本研究旨在将大肠杆菌的耐热肠毒素（ST）融合蛋白展示在酿酒酵母菌表面,获得ST酵母基因工程菌,并探究其对大鼠肠道菌群、小肠黏膜结构及黏膜免疫的影响。为研发具有特异性免疫功能的微生态制剂奠定基础。主要研究内容和结果如下:1、应用表面展示技术构建ST酵母基因工程菌。利用Overlap PCR方法,将定点突变后的estA基因与estB基因连接,将融合基因片段连接至表面展示质粒pYD1中,构建表面展示质粒pYD1-estA-estB,将其电击转化至EBY100酿酒酵母菌中,筛选获得ST酵母基因工程菌,通过免疫荧光检测,证明ST融合蛋白成功展示在酿酒酵母菌表面。2、ST酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响。选取4-6周龄的SPF级SD大鼠90只,雌雄各半。随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,对各组分别灌服生理盐水、107 cfu/mL工程菌菌液、107 cfu/mL酿酒酵母菌菌液2mL/只,每日一次,持续灌服21天,再连续3天对每组大鼠灌服108 cfu/mL的大肠杆菌H10407菌液5mL/只,在灌服的第7、14、21天及攻毒3天后取所需的粪便样本,利用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,研究酵母基因工程菌对肠道菌群OTU（微生物可操作单元）和肠道内5种标志性细菌:类杆菌（Bacteroides）、梭菌（Clostridium）、肠球菌（Enterococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳杆菌（Lactobacillus）数量的影响,并测量肠道pH值。结果显示在灌服期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值、各细菌数量均不同程度的高于空白对照组,pH值均明显低于空白对照组。攻毒后,工程菌组的OTU值、类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量极显着高于其他两组（P<0.01）,工程菌组的pH值与灌服前无显着差异（P>0.05）。结果表明ST酵母基因工程菌能丰富肠道菌群多态性,增加肠道内重要细菌数量,降低肠道酸碱度。当攻毒后,工程菌能有效降低ETEC对肠道菌群及重要细菌的影响,维持肠道pH值稳定。3、ST酵母基因工程菌对大鼠小肠绒毛结构的影响。采集大鼠的十二指肠、空肠、回肠组织制作切片,测量并统计分析各组大鼠的十二指肠、空肠、回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度（V/C）的变化。结果表明,与空白对照组相比,工程菌组及酵母菌组的各段肠绒毛长度及V/C值有明显升高。灌胃大肠杆菌后,与工程菌组相比,空白对照组及酵母菌组的十二指肠与空肠绒毛长度、V/C值均不同程度降低;空肠隐窝深度极显着升高（P<0.01）;回肠V/C值极显着下降（P<0.01）。由此表明工程菌促进小肠绒毛的发育,加强肠道黏膜的吸收功能,有效抵御ETEC对小肠绒毛结构的损伤。4、ST酵母基因工程菌对大鼠肠道黏膜免疫的影响。利用ELISA、Real-time PCR技术研究肠道黏膜中的分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）及血清中免疫球蛋白G（IgG）含量变化,并对大鼠血清学指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血糖（GLU）、胆固醇（CHO）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）含量进行测定。由检测结果得出在前21天灌胃期间,工程菌组与酵母菌组sIgA、细胞因子水平均高于空白对照组,血清学指标无明显差异,工程菌组血清中IgG效价在第21天达到1:320。在攻毒ETEC后,工程菌组各项数据变化幅度最小,表明ST酵母基因工程菌能提高动物肠道黏膜免疫力,促进细胞因子的分泌,刺激机体产生免疫反应,对动物机体安全、无毒,且能降低ETEC对黏膜免疫力影响。综上所述,本研究成功构建展示大肠杆菌ST的酿酒酵母基因工程菌,试验结果证明,该工程菌不仅具有良好的益生作用,提高肠道黏膜免疫力,而且能有效预防及保护由ETEC引起的动物肠道菌群失调及小肠黏膜结构损伤。
关玮琨[9]（2016）在《基于假基因内插入的嵌合肠毒素重组减毒大肠杆菌口服疫苗候选菌株的研究》文中进行了进一步梳理产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC）是引起婴幼儿、幼龄动物腹泻的主要病原之一,它所引起的仔猪腹泻甚至死亡给畜牧业生产造成巨大的经济损失。流行病学调查结果显示,ETEC的耐药性在不断提高,而其黏附素的检出率却在下降,所以继续使用传统药物以及使用以黏附素为抗原的疫苗进行防治已达不到理想的预防效果,生产上急需新的有效疫苗得到研制与开发。为明确嵌合基因在具有天然佐剂功能的不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin-1,LT1）骨架上的插入位置,先制备了一株针对LT1,具有中和活性的特异性单克隆抗体,该单抗能有效的阻断LT1毒素与GM1受体的结合。通过生物信息学软件ABCpred预测,然后用单抗对LT1B进行分段筛选,鉴定出与GM1受体结合的肽段MBP-LT1B-7（61QKKAIERMKDTLRITY76）。以此为依据,在不影响段肽MBP-LT1B-7结构的位置插入外源基因。本研究以大肠杆菌K12基因序列为参照,使用在线服务软件ABCpred预测出6个可插入外源基因的假基因位置,分别是yaiT、yaiX、ygeO和ygeQ、wbbL、insN、eaeH+和ykgA。进一步经PCR鉴定发现我们分离并改造的野生E.coli O142:△STa菌株中yaiT和yaiX两个假基因位置可作为携带外源基因的插入点。分别以假基因yaiT和yaiX为模板扩增出假基因yaiT和yaiX的左右同源臂,连入pDOC-K质粒上,构建PRPL-Kil双向筛选平台质粒,然后将平台质粒与pACBSCE质粒共转化减毒E coli O142:△STa中。经L-阿拉伯糖诱导使其中的pACBSCE质粒表达I-Sce切割酶和Red重组酶,含有假基因yaiT和yaiX同源臂的PRPL-Kil操纵子分别被切下后与E.coli 0142:△STa中的yaiT和yaiX假基因位置发生同源重组,构建成0142（yaiT::PRPL-Kil）和0142（yaiX::PRPL-Kil）两株双向筛选平台。经鉴定当温度升高到43℃时平台中温敏开关打开,kill基因可杀死菌体起到反向筛选效果,表明平台具有相应生物活性。通过SOE-PCR构建嵌合类毒素基因,先将致弱的STaA13Q(以下简写为STa13)连在致弱的LT1R192G(以下简写为LT1192)操纵子B亚单位后端,再利用SOE-PCR的方法将STb和LT1天然转录终止子连到LT1192-STa13后,获得LT1192-STa13-STb操纵子。将LT1A分为LT1A1和LT1A2两段,再将STa13-STb从LT1 192-STa13-STb上克隆下来,与LT1A1相连获得LT1A1-(STa13-STb),最后再将LT1A2-LT1B-STa13-STb与其进行组装获嵌合基因LT1A1-(STa13-STb)-LT1A2-LT1B-(STa13-STb)操纵子。在其两端分别连上假基因 yaiT 和 yaiX的左右同源臂,构建pDOC-C同源重组系统,按照建立平台时的方法,用LT1 A1-(STa13-STb)-LT1A2-LT1 B-(STa13-STb)操纵子去替换插在不同假基因位置上的双向筛选平台,得到重组E.coliER-T和E.coliER-X。通过对重组菌毒性、模拟消化道环境耐受、口服安全性、生长性能、遗传稳定性、菌毛生长能力和肠道定植能力等检测,结果显示,重组E.coli ER-T和E.coli ER-X安全、遗传稳定,可在肠道定植。进一步以重组E.coli ER-T和E.coli ER-X对BALB/c小鼠进行口服免疫,检测各时间点小鼠特异性IgG及IgA抗体水平,结果显示:实验组小鼠首次免疫后7～21d,在其血清中均可检测到抗 LT1A（P<0.05）、LT1B（P<0.05）、STa（P<0.05）、STb（P<0.05）、F41（P<0.05）的IgG抗体。各实验组小鼠免疫后7～28d在其粪便中可检测出抗LT1A（P<0.05）、LT1B（P<0.05）、STa（P<0.05）、STb（P<0.05）、F41（P<0.05）的 IgA 抗体。首次免疫后 42d在小鼠乳汁、脾脏、肠黏液、肠系膜淋巴结中仍能检测到抗LT1A（P<0.05）、LT1B（P<0.05）、STa（P<0.05）、STb（P<0.05）、F41（P<0.05）的 IgG 和 IgA 抗体;在细胞增殖实验中,实验组脾细胞经STa毒素、LT1192-STa13重组蛋白、STb毒素、LT1192-STb重组蛋白、LT1毒素刺激后增殖效果明显好于对照组（P<0.05）;各组脾细胞培养上清液中的细胞因子IFN-γ和IL-4检测结果显示,免疫组小鼠IFN-γ水平有所上升但没有IL-4上升明显。体外中和试验和体内中和试验结果显示,口服免疫后的小鼠血清、脾细胞裂解液、肠黏液、肠系膜淋巴细胞裂解液对肠毒素具有中和作用。乳鼠攻毒保护试验结果显示,获得母源抗体的乳鼠具有抵抗肠毒素侵袭的能力。重组E.coli ER-T和E.coli ER-X免疫仔猪和妊娠母猪后进行IgG及IgA抗体检测、细胞增殖实验、细胞因子检测、体内中和试验以及体外中和试验所得结果的趋势与小鼠基本相似。攻毒保护试验中,免疫组仔猪肠绒毛的各项检测数据优于对照组仔猪,两者差异显着（P<0.05）,表明免疫后仔猪可以抵抗肠毒素攻击。本研究为增强大肠杆菌重组活载体疫苗的免疫效果,通过表位筛选确定了 LT1与GM1受体的结合域,构建了可以稳定表达嵌合肠毒素基因的重组减毒E.coliER-A和E.coli ER-B,探索了不同假基因携带外源基因的差异,为重组减毒大肠杆菌口服疫苗研究提供了科学的实验依据。
杨宇[10]（2015）在《腹泻仔猪源E.coli的分离及毒力因子分子流行情况调查》文中进行了进一步梳理致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的重要病原之一,给养猪业带来了严重的经济损失。为了了解湖南省部分地区腹泻仔猪源大肠杆菌的耐药性、毒力基因的流行情况,本研究从规模猪场腹泻仔猪中分离出705株腹泻仔猪源大肠杆菌,进行了以下相关试验：1.从9个猪场采集腹泻仔猪的肛门拭子和2011-2014年本实验室接收送检的PEDV（+）腹泻仔猪病料,利用麦康凯平板、革兰氏染色镜检和PCR方法共鉴定705株大肠杆菌。并通过K-B法检测各猪场分离的大肠杆菌对5类抗生素（四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、头孢类）中的9种药物的耐药性。结果显示：各猪场分离的大肠杆菌群体上对头孢噻吩、头孢曲松、恩诺沙星、阿米卡星的耐药性较低,对氧氟沙星、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、链霉素的耐药性较高。2.利用多重PCR方法对705株大肠杆菌分离株进行毒素基因（STa、STb、LT1、Stx2e、 eaeA）和黏附素基因（F4、F5、F6、F41、F18ab、F18ac）的检测。结果表明：共175株大肠杆菌检出毒素基因,检出率达24.5%（175/705）；共57株大肠杆菌检出黏附素基因,检出率达8.0%（57/705）；共22株大肠杆菌能同时检测出毒素基因和黏附素基因,检出率达3.1%（22/705）；根据毒素特征可将毒素基因阳性菌株分为五类：产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、吸附消除型大肠杆菌（AEEC）、产肠毒素大肠杆菌/产志贺毒素大肠杆菌（ETEC/STEC）和吸附消除型大肠杆菌/产志贺毒素大肠杆菌（AEEC/STEC）,统计发现分别占毒素基因阳性菌株的68.6%（120/175）、37.3%（28/175）、5.1%（9/175）、8.6%（15/175）和1.7%（3/175）,说明本文分离的腹泻仔猪源大肠杆菌以ETEC为主。3.另外,本研究还采用PCR方法对这705株大肠杆菌分离株进行溶血素基因（H1yA）和HPI毒力岛基因（irp2）检测,阳性率分别为：8.4%（60/705）和32.9%（235/705）。
二、大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究（论文提纲范文）
（1）ETEC 987P、K88重组干酪乳杆菌的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌概述 |
| 1.1.1 黏附素 |
| 1.1.2 肠毒素 |
| 1.1.3 ETEC疫苗的研究进展 |
| 1.2 乳酸菌概述 |
| 1.2.1 乳酸菌作为活疫苗载体的优势 |
| 1.2.2 乳酸菌作为活疫苗载体的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 ETEC987P、K88 原核表达载体构建及蛋白纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 其他实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 模板DNA的制备 |
| 2.2.3 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.4 原核表达载体构建与鉴定 |
| 2.2.5 重组载体的原核表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 抗血清的制备 |
| 2.2.8 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增结果 |
| 2.3.2 基因序列同源性比对 |
| 2.3.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.4 目的蛋白最佳诱导条件的确定 |
| 2.3.5 蛋白可溶性鉴定 |
| 2.3.6 Western blot鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 共表达ETEC987P、K88 重组干酪乳杆菌的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 菌株、质粒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒p LA-987P-K88 的构建与鉴定 |
| 3.2.2 重组干酪乳杆菌p LA-987P-K88/L.casei的构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒p LA-987P-K88 鉴定结果 |
| 3.3.2 p LA-987P-K88/L.casei鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 p LA-987P-K88/L.casei的免疫原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 菌株、实验动物 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫用重组干酪乳杆菌菌悬液的制备 |
| 4.2.2 试验动物分组 |
| 4.2.3 样品的采集 |
| 4.2.4 免疫效果评价 |
| 4.2.5 攻毒保护性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血清中抗987P、K88 特异性Ig G检测 |
| 4.3.2 粪便及肠道、肺脏冲洗液中s Ig A效价检测 |
| 4.3.3 脾脏T淋巴细胞增殖检测结果 |
| 4.3.4 攻毒保护性试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 仔猪大肠杆菌性腹泻简介 |
| 1.2 ETEC主要毒力因子 |
| 1.2.1 热稳定肠毒素 |
| 1.2.2 热不稳定肠毒素 |
| 1.2.3 K88菌毛 |
| 1.2.4 其他黏附素 |
| 1.3 ETEC疫苗研究进展 |
| 1.4 黏膜免疫 |
| 1.5 口服疫苗 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 简述 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 实验动物及细胞系 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要试剂和抗体 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 E.coli C83903△estB的构建 |
| 2.2.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的构建 |
| 2.2.3 突变菌株的部分生物学特性检测 |
| 2.2.4 mLT体内外毒性的测定 |
| 2.2.5 小鼠口服突变菌株的免疫效果评价 |
| 2.3 实验数据的统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 E.coli C83903△estB的构建 |
| 3.1.1 pTarget-T△estB质粒的鉴定结果 |
| 3.1.2 estB基因敲除菌株的鉴定结果 |
| 3.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的构建 |
| 3.2.1 pTarget-T-N425 质粒的构建及转化结果 |
| 3.2.2 pTarget-T-S63K/A72R/R192G质粒的构建及转化结果 |
| 3.2.3 基因编辑质粒的消除结果 |
| 3.3 突变菌株的部分生物学特性 |
| 3.3.1 遗传稳定性检测结果 |
| 3.3.2 菌毛生长能力的测定结果 |
| 3.3.3 生长曲线的测定结果 |
| 3.3.4 胃肠道环境耐受性的测定结果 |
| 3.3.5 耐药性的测定结果 |
| 3.3.6 黏附能力的测定结果 |
| 3.4 mLT体内外毒性的测定 |
| 3.4.1 LTA-S1、LTA-S2 蛋白的表达及多抗的制备结果 |
| 3.4.2 mLT体内外毒性的测定结果 |
| 3.5 小鼠口服突变菌株的免疫效果评价 |
| 3.5.1 突变菌株定植能力测定结果 |
| 3.5.2 突变菌株安全性检验结果 |
| 3.5.3 特异性抗体的测定结果 |
| 3.5.4 Peyer’s集合淋巴结免疫组化结果 |
| 3.5.5 淋巴细胞亚群的检测结果 |
| 3.5.6 淋巴细胞增殖实验结果 |
| 3.5.7 血清中细胞因子水平的测定结果 |
| 3.5.8 抗体中和活性的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mLT突变菌株的构建策略 |
| 4.2 mLT突变菌株的毒力分析 |
| 4.3 E.coli m LT-S63K的应用前景 |
| 4.4 本研究的局限性和后续研究的建议 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白多价卵黄抗体的制备（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 载体和菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 重组菌株BL21(DE3)(p ETXKSL3)鉴定和Western blot分析 |
| 1.4 卵黄抗体的制备 |
| 1.4.1 蛋鸡的免疫 |
| 1.4.2 卵黄抗体的提取纯化 |
| 1.4.3 卵黄抗体的效价检测 |
| 1.5 仔猪预防效果试验 |
| 1.6 仔猪攻毒保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 p ETXKSL3重组质粒酶切鉴定 |
| 2.2 K88ac-ST1-LTB融合蛋白SDS-PAGE分析和Western blot鉴定 |
| 2.3 卵黄抗体的纯化 |
| 2.4 卵黄抗体效价检测 |
| 2.5 仔猪预防效果试验 |
| 2.6 仔猪攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
（4）FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的危害 |
| 1.2 ETEC的毒力因子及致病机制 |
| 1.2.1 致病机制 |
| 1.2.2 黏附素 |
| 1.2.3 肠毒素 |
| 1.3 产肠毒素性大肠杆菌的防治 |
| 1.4 大肠杆菌表面展示的研究进展 |
| 1.4.1 基于外膜蛋白的展示系统 |
| 1.4.2 基于细菌表面附属物的展示系统 |
| 1.4.3 基于自转运蛋白的展示系统 |
| 1.5 研究内容及意义 |
| 第二章 ETEC表达宿主的筛选及黏附素双展示菌株的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 试剂、工具酶及培养基 |
| 2.2.3 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ETEC表达宿主的筛选 |
| 2.3.1.1 基于GFP的原核表达载体的构建 |
| 2.3.1.2 GFP转入不同大肠杆菌宿主 |
| 2.3.1.3 最佳表达宿主的菌株背景鉴定 |
| 2.3.2 应用表面展示技术构建双黏附素共表达ETEC菌株 |
| 2.3.2.1 重组质粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G的构建 |
| 2.3.2.2 双黏附素重组大肠杆菌的建立 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 绿色荧光蛋白GFP的 PCR扩增结果 |
| 2.4.2 p QE-30-GFP的阳性克隆鉴定结果 |
| 2.4.3 重组质粒在ETEC及工程菌中的表达 |
| 2.4.4 不同宿主菌表达GFP的相对荧光值测定 |
| 2.4.5 BE311的菌株种属鉴定结果 |
| 2.4.6 BE311毒力因子的检测 |
| 2.4.7 表面展示体系相关基因的PCR的扩增结果 |
| 2.4.8 重组质粒的双酶切验证结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组菌株的黏附素表达及黏附特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞 |
| 3.2.2 试剂及培养基 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 双砷-四半胱氨酸系统特异性检测 |
| 3.3.2 重组菌株生长特性研究 |
| 3.3.3 重组菌的诱导表达 |
| 3.3.4 重组菌表面疏水性测定 |
| 3.3.5 重组菌对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的黏附研究 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组菌BE311-Fae G-TC的荧光显微镜观察 |
| 3.4.2 重组菌BE311-Fae G与野生菌BE311 的生长曲线比较 |
| 3.4.3 重组菌BE311-Fae G的黏附素诱导表达 |
| 3.4.4 重组菌BE311-Fae G与野生株的疏水性比较 |
| 3.4.5 重组菌BE311-Fae G对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组菌株对ETEC体内拮抗模型的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株、载体及实验动物 |
| 4.2.2 试剂及培养基 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的改造 |
| 4.3.2 实验设计 |
| 4.3.3 肠道的取样处理方法 |
| 4.3.4 ETEC标记菌株的检测方法 |
| 4.3.5 数据处理与统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的抗性检测 |
| 4.4.2 E.coli K99-m Cherry-p QE30与E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的比较 |
| 4.4.3 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的稳定性检测 |
| 4.4.4 荧光体系下E.coli K99-m Cherry-p QE30 活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 4.4.5 大鼠肠道内回收标记菌株的可视化区分 |
| 4.4.6 大鼠肠道内标记菌株的回收统计结果 |
| 4.4.7 ETEC攻毒后大鼠肠道内炎症因子的基因表达水平测定 |
| 4.4.8 ETEC攻毒后大鼠肠道内炎症因子的蛋白浓度测定结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 FanC-FaeG双展示重组ETEC菌株在大鼠体内对攻毒菌株侵染的保护性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株和动物 |
| 5.2.2 试剂及培养基 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 菌株准备 |
| 5.3.2 动物实验方法 |
| 5.3.3 肠道和粪便的取样处理方法 |
| 5.3.4 数据处理与统计分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 攻毒后对大鼠生长性能的影响 |
| 5.4.2 攻毒后大鼠的脾脏、肝脏变化 |
| 5.4.3 攻毒后大鼠粪便中标记菌株的回收统计 |
| 5.4.4 攻毒后大鼠各肠段中标记菌株的回收统计 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）国内外猪源产肠毒素大肠杆菌疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 猪源ETEC病原学特征 |
| 2 猪源ETEC疫苗的研究 |
| 2.1 全菌灭活疫苗 |
| 2.2 基因工程疫苗 |
| 2.3 亚单位疫苗 |
| 2.4 弱毒疫苗 |
| 2.5 DNA疫苗 |
| 2.6 菌影疫苗 |
| 2.7 植物载体疫苗 |
| 2.8 囊泡疫苗 |
| 3 展 望 |
（6）安徽部分猪场产肠毒素大肠杆菌分离鉴定、生物学特性及灭活疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 产肠毒素大肠杆菌概述 |
| 1 仔猪黄白痢特征 |
| 2 ETEC的致病因子研究进展 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 血清型 |
| 2.3 致病因子 |
| 3 ETEC的耐药性研究进展 |
| 3.1 ETEC的耐药性现状 |
| 3.2 ETEC的耐药机制 |
| 4 ETEC疫苗的研究概况 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 仔猪ETEC的分离及血清型鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 采集样本 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 样本处理 |
| 1.5 分离鉴定 |
| 1.6 血清型鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品采集与菌株分离 |
| 2.2 ETEC菌株的鉴定 |
| 2.3 血清型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 仔猪ETEC的耐药性及毒力测定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.3 药敏试验 |
| 1.4 ETEC菌株的致病力测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 药敏试验 |
| 2.2 致病力测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 ETEC灭活疫苗对小鼠的保护效果研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.3 灭活疫苗制备方法 |
| 1.4 单价灭活疫苗免疫效果评估 |
| 1.5 二价灭活疫苗免疫效果评估 |
| 1.6 抗体效价测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同优势血清型单价灭活苗对小鼠的保护效果 |
| 2.2 二价灭活苗对小鼠的保护效果 |
| 2.3 抗体效价测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况 |
| 1.2 ETEC的毒力因子及致病机制 |
| 1.2.1 黏附素 |
| 1.2.2 肠毒素 |
| 1.3 ETEC的防治措施 |
| 1.4 荧光标记技术 |
| 1.4.1 荧光蛋白的结构和性质 |
| 1.4.2 荧光蛋白的标记方式 |
| 1.4.3 荧光蛋白的应用 |
| 1.5 攻毒模型的研究现状 |
| 1.6 研究意义及内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究技术路线 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 RFP表达载体的构建及ETEC表达宿主的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 基于RFP基因原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 RFP质粒转化宿主ETEC及阳性克隆的筛选 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 红色荧光蛋白mKate和 mCherry的 PCR扩增结果 |
| 2.4.2 重组质粒菌落PCR鉴定 |
| 2.4.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.4.4 重组质粒在工程菌及ETEC中的表达 |
| 2.4.5 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry的 PCR验证 |
| 2.4.6 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光显微镜观察 |
| 2.4.7 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光强度的测定 |
| 2.4.8 重组菌E.coli K99-mCherry的分子鉴定 |
| 2.4.9 重组菌E.coli K99-mCherry和菌株E.coli K99 生长曲线比较 |
| 2.4.10 重组菌E.coli K99-mCherry中 mCherry基因表达稳定性测定 |
| 2.4.11 荧光体系下E.coli K99-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 基因剂量对RFP标记ETEC的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 菌株和载体 |
| 3.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 多拷贝红色荧光蛋白mCherry重组质粒的构建 |
| 3.3.2 多拷贝重组质粒的转化E.coli K99 及荧光强度的测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 双拷贝重组质粒酶切鉴定 |
| 3.4.2 多拷贝菌株的荧光强度测定与比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 基于表面展示系统的ETEC-RFP特异性标记 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 菌株和载体 |
| 4.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 大肠杆菌表面展示表达载体的构建 |
| 4.3.2 E.coli K99 表面展示融合蛋白Lpp’OmpA-mCherry |
| 4.4 结果和分析 |
| 4.4.1 PCR扩增结果 |
| 4.4.2 重组质粒pLpp’OmpA双酶切鉴定 |
| 4.4.3 重组质粒pLpp’OmpA-mCherry双酶切鉴定 |
| 4.4.4 重组菌的双酶切鉴定 |
| 4.4.5 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry的分子鉴定 |
| 4.4.6 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry荧光显微镜观察 |
| 4.4.7 E.coli K99 表面展示mCherry的生物活性检测 |
| 4.4.8 E.coli K99 表面展示mCherry的表达稳定性检测 |
| 4.4.9 荧光体系下E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 系统介导的ETEC-RFP特异性标记 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 菌株和载体 |
| 5.2.2 培养基、工具酶和试剂 |
| 5.2.3 仪器与设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 质粒DNA的制备 |
| 5.3.2 大肠杆菌K12和K99 的基因组DNA的制备 |
| 5.3.3 大肠杆菌K99和DH5α感受态细胞的制备 |
| 5.3.4 基因敲入位点的选择 |
| 5.3.5 sgRNA的设计及基因编辑载体的构建 |
| 5.3.6 基因编辑菌株的筛选及基因编辑载体的去除 |
| 5.3.7 基因编辑菌株的荧光检测 |
| 5.3.8 基因编辑菌株分子背景鉴定 |
| 5.3.9 诱导剂对基因编辑菌株红色荧光蛋白表达的影响 |
| 5.3.10 基因编辑菌株生长特性曲线测定 |
| 5.3.11 基因编辑菌株稳定性的测定 |
| 5.3.12 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度标准曲线的建立 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 假基因位点的选择和验证 |
| 5.4.2 mCherry基因编辑菌株的构建及鉴定 |
| 5.4.3 基因编辑质粒的去除 |
| 5.4.4 基因编辑菌株荧光显微镜观察 |
| 5.4.5 基因编辑菌株的分子鉴定 |
| 5.4.6 不同诱导剂及其浓度对荧光蛋白表达量的影响 |
| 5.4.7 基因编辑菌株的生物活性检测 |
| 5.4.8 基因编辑菌株中mCherry的表达稳定性检测 |
| 5.4.9 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 ETEC-RFP标记菌株的综合评价及其在大鼠胃肠道样品中特异性荧光检测 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 菌株和试剂 |
| 6.2.2 实验动物 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 不同标记方法中mCherry基因表达稳定性的比较 |
| 6.3.2 胃肠道内容物样品处理方法 |
| 6.3.3 胃肠道内容物的荧光特异性检测 |
| 6.3.4 统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 标记菌株mCherry基因表达稳定性的比较 |
| 6.4.2 大鼠不同胃肠段内容物对荧光检测的干扰 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录B 基因编辑的序列 |
| 致谢 |
（8）大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 产肠毒素大肠杆菌的研究进展 |
| 第二章 微生态制剂的概述 |
| 第三章 酵母菌表面展示技术的概述 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 应用表面展示技术构建ST酵母基因工程菌 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 ST酵母基因工程菌对肠道菌群的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ST酵母基因工程菌对肠绒毛结构的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ST酵母基因工程菌对肠道黏膜免疫的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）基于假基因内插入的嵌合肠毒素重组减毒大肠杆菌口服疫苗候选菌株的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 大肠杆菌的结构及理化特性 |
| 1.2 致病性大肠杆菌的分类 |
| 1.2.1 产肠毒素大肠杆菌 |
| 1.2.2 肠致病性大肠杆菌 |
| 1.2.3 肠侵袭性大肠杆菌 |
| 1.2.4 肠出血性大肠杆菌 |
| 1.2.5 肠聚集性大肠杆菌 |
| 1.2.6 尿道致病性大肠杆菌 |
| 1.3 ETEC与仔猪腹泻 |
| 1.3.1 黏附素 |
| 1.3.2 肠毒素 |
| 1.4 大肠杆菌疫苗研究进展 |
| 1.4.1 大肠杆菌传统疫苗 |
| 1.4.2 大肠杆菌基因工程疫苗 |
| 1.5 同源重组技术 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、实验动物、细胞系及ELISA包被抗原 |
| 2.1.2 抗体、酶、培养基及其他试剂材料 |
| 2.1.3 PCR引物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Mab D5中和活性验证 |
| 2.2.2 LT1B的中和表位分析 |
| 2.2.3 假基因鉴定 |
| 2.2.4 双向筛选平台的构建 |
| 2.2.5 重组菌株E.coli ER-T和E.coli ER-X的构建 |
| 2.2.6 重组菌作为口服疫苗的可行性分析 |
| 2.2.7 E.coli ER-T和E.coli ER-X对小鼠的免疫学指标测定 |
| 2.2.8 E.coli ER-T和E.coli ER-X对猪的免疫学指标测定 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MABD5中和活性验证 |
| 3.1.1 MAbD5阻断LT1与GM1受体结合 |
| 3.1.2 体外中和试验 |
| 3.1.3 小鼠体内的中和试验 |
| 3.1.4 兔肠袢结扎试验 |
| 3.1.5 仔猪体内的中和试验 |
| 3.1.6 单抗治疗试验 |
| 3.2 LT1B亚单位B细胞抗原表位预测与分析 |
| 3.2.1 LT1B蛋白序列分析及其B细胞抗原表位预测 |
| 3.2.2 预测表位和鉴定表位在LT1B 3D结构上的定位分析 |
| 3.3 E.COLI O142: △STA中可能存在的假基因位置鉴定 |
| 3.4 基于∧噬菌体KIL基因双向筛选平台的构建 |
| 3.4.1 假基因左、右同源臂的扩增 |
| 3.4.2 重组打靶载的鉴定 |
| 3.4.3 双向筛选平台的PCR鉴定 |
| 3.4.4 双向筛选平台的反向筛选验证 |
| 3.5 重组菌株E.COLI ER-T和E.COLI ER-X的构建及鉴定 |
| 3.5.1 嵌合类毒素基因的构建及鉴定 |
| 3.5.2 打靶载体的鉴定 |
| 3.5.3 重组菌的验证 |
| 3.5.4 重组菌的PCR鉴定及测序 |
| 3.5.5 重组菌的Western blot分析 |
| 3.6 重组菌作为口服疫苗的可行性评价 |
| 3.6.1 细胞毒性实验 |
| 3.6.2 E.coli ER-T及E.coli ER-X对乳鼠的毒性 |
| 3.6.3 E.coli ER-T及E.coli ER-X对胃液环境的耐受性 |
| 3.6.4 E.coli ER-T及E.coli ER-X对肠液环境耐受性 |
| 3.6.5 E.coli ER-T和E.coli ER-X对胆汁的耐受性 |
| 3.6.6 E.coli ER-T和E.coli ER-X的口服安全性 |
| 3.6.7 E.coli ER-T和E.coli ER-X的生长曲线 |
| 3.6.8 E.coli ER-T和E.coli ER-X的电镜观察 |
| 3.6.9 E.coli ER-T和E.coli ER-X的遗传稳定性 |
| 3.6.10 E.coli ER-T及ER-X的定植能力 |
| 3.7 E.COLI ER-T及E.COLI ER-X对小鼠的口服免疫效果测定 |
| 3.7.1 免疫小鼠特异性抗体IgG测定 |
| 3.7.2 免疫小鼠特异性抗体sIgA测定 |
| 3.7.3 淋巴细胞增殖试验 |
| 3.7.4 细胞因子IFN-γ和IL-4的检测 |
| 3.7.5 体外中和试验 |
| 3.7.6 乳鼠体内中和试验 |
| 3.7.7 乳鼠攻毒保护试验 |
| 3.8 重组菌株对猪的口服免疫效果测定 |
| 3.8.1 E.coli ER-T及E.coli ER-X在猪肠道内的定植能力 |
| 3.8.2 免疫猪特异性IgG抗体测定 |
| 3.8.3 免疫猪特异性sIgA抗体测定 |
| 3.8.4 猪淋巴细胞增殖试验 |
| 3.8.5 细胞因子检测 |
| 3.8.6 体外中和试验 |
| 3.8.7 乳鼠体内中和试验 |
| 3.8.8 攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肠毒素作为疫苗抗原的必要性 |
| 4.2 口服疫苗对预防仔猪大肠杆菌性腹泻的前景 |
| 4.3 载体菌株的选择 |
| 4.4 重组基因的启动子选择 |
| 4.5 假基因内插入重组基因遇到的问题及思考 |
| 4.6 LT1B受体结合位点的筛选 |
| 4.7 重组基因的构建策略 |
| 4.8 重组菌的免疫效果分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（10）腹泻仔猪源E.coli的分离及毒力因子分子流行情况调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大肠杆菌生物学特性及分类 |
| 1.1.1 大肠杆菌生物学特性 |
| 1.1.2 大肠杆菌分类 |
| 1.2 仔猪大肠杆菌病 |
| 1.2.1 新生仔猪大肠杆菌性腹泻 |
| 1.2.2 断奶仔猪腹泻 |
| 1.2.3 水肿病 |
| 1.3 仔猪大肠杆菌病的免疫防制 |
| 1.3.1 全菌疫苗 |
| 1.3.2 菌毛疫苗 |
| 1.3.3 肠毒素疫苗 |
| 1.3.4 基因工程疫苗 |
| 1.3.5 商品化菌苗 |
| 1.4 大肠杆菌耐药性研究统计 |
| 1.5 大肠杆菌常见毒力因子 |
| 1.5.1 黏附素 |
| 1.5.2 肠毒素 |
| 1.5.3 其他毒力因子 |
| 1.6 常见毒力因子的流行病学调查 |
| 1.6.1 国外流行情况 |
| 1.6.2 国内流行情况 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第二章 不同规模猪场腹泻仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 采样猪群的临床资料 |
| 2.2.2 细菌分离鉴定结果 |
| 2.2.3 药物敏感性结果 |
| 2.3 讨论与分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 2011-2014年流行性腹泻阳性仔猪源大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PEDV阳性病料的临床背景资料 |
| 3.2.2 细菌分离鉴定结果 |
| 3.2.3 药物敏感性检测结果 |
| 3.3 讨论与分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 腹泻仔猪源大肠杆菌毒力因子的流行病学调查 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 调查大肠杆菌来源的选择 |
| 4.1.2 大肠杆菌毒力基因的PCR检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 大肠杆菌各毒力因子的鉴定结果 |
| 4.2.2 各猪场及PEDV(+)中大肠杆菌毒力基因检测结果 |
| 4.2.3 毒素基因、黏附素基因、溶血素基因及毒力岛基因的相关性 |
| 4.2.4 数据分类统计结果 |
| 4.3 讨论与分析 |
| 4.3.1 主要毒力基因调查结果分析 |
| 4.3.2 大肠杆菌分离株主要毒力因子检测结果与临床发病相关性分析 |
| 4.3.3 溶血活性表型与溶血素基因(HlyA)鉴定结果的相关性分析 |
| 4.3.4 临床上不同阶段腹泻仔猪源大肠杆菌毒力因子检测结果分析 |
| 4.3.5 PEDV(+)病料中大肠杆菌毒力因子检测结果分析 |
| 4.3.6 大肠杆菌病的防控 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要试剂配方 |
| 附录2 各猪场大肠杆菌毒力因子检测结果 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究（论文参考文献）
- [1]ETEC 987P、K88重组干酪乳杆菌的构建及免疫效力评价[D]. 杨雨晴. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究[D]. 冯启峥. 东北农业大学, 2020(04)
- [3]大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白多价卵黄抗体的制备[J]. 许崇利,许崇波,林一民. 四川师范大学学报(自然科学版), 2020(03)
- [4]FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究[D]. 胡佳. 中南民族大学, 2020(08)
- [5]国内外猪源产肠毒素大肠杆菌疫苗研究进展[J]. 杨德鸿,麦凯杰,朱元军,刘洋洋,罗翠芬,周庆丰,刘军发. 中国畜牧兽医, 2019(07)
- [6]安徽部分猪场产肠毒素大肠杆菌分离鉴定、生物学特性及灭活疫苗的初步研究[D]. 张鹏. 南京农业大学, 2019(08)
- [7]肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究[D]. 苏雅婷. 中南民族大学, 2019(08)
- [8]大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响[D]. 沙洲. 吉林农业大学, 2017(02)
- [9]基于假基因内插入的嵌合肠毒素重组减毒大肠杆菌口服疫苗候选菌株的研究[D]. 关玮琨. 东北农业大学, 2016(12)
- [10]腹泻仔猪源E.coli的分离及毒力因子分子流行情况调查[D]. 杨宇. 湖南农业大学, 2015(02)