一、用琼扩法测定胸膜肺炎嗜血杆菌的血清型（论文文献综述）
孙晨[1]（2019）在《副猪嗜血杆菌（HPS）发酵工艺研究及其疫苗的研制》文中进行了进一步梳理副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是一种共栖菌,它依附于猪的上呼吸道,也是一种机会菌,当机体免疫力下降时侵袭猪机体,感染后主要引起猪的多发性浆膜炎和关节炎。HPS对养猪业是一种潜在的威胁,一旦爆发会产生巨额的经济损失,是近年来危害养猪业最严重的细菌病之一,因此HPS也受到密切的关注。对于预防HPS病的爆发,主要通过灭活疫苗进行免疫,且灭活疫苗可产生良好的免疫保护能力。本实验基于已分离到的HPS菌株,通过不同的实验室方法对已分离的菌株进行鉴定和血清分型。利用已鉴定的HPS菌株进行摇瓶和反应器扩大培养菌体抗原的工艺化并对抗原培养条件进行优化。使用优化后的培养条件培养菌体抗原,试制灭活疫苗,并对试制疫苗进行安全性检验和效力检验以评价疫苗。本试验通过菌落及菌体形态学观察、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性检验、生化鉴定、PCR鉴定等方法对已分离到的菌株RPBS0904-11、RPBS0905-3和RPBS0912-1株进行鉴定,确定该三株菌均为HPS,并利用PCR鉴定和琼脂扩散试验（KRG）对已鉴定的菌株进行血清分型,最终确定菌株RPBS0904-11为HPS 4型、菌株RPBS0905-3为HPS 5型、菌株RPBS0912-1为HPS 12型。利用传统摇瓶培养对已鉴定的HPS培养条件进行探索,确定了优势培养条件下所使用的动物血清种类、辅酶（NAD）添加量以及培养基pH环境等;利用反应器培养已鉴定的HPS并对培养条件进行优化,确定优势培养条件下所需要的补料种类、补料速度及补料方式等。在此基础上,利用反应器优化工艺培养菌体抗原,试制HPS三价（4、5、12）灭活疫苗,使用多倍免疫剂量免疫仔猪进行疫苗安全性检验以评价疫苗的安全性;使用免疫剂量免疫豚鼠进行疫苗效力性检验以评价该疫苗的免疫效果,根据免疫后豚鼠抗体效价远高于有效抗体水平,认为试制疫苗具有良好的免疫效果。对比分析反应器工艺和摇瓶工艺疫苗,二种工艺生产的疫苗在内毒素含量、疫苗菌体蛋白含量以及疫苗的免疫效果方面近乎无差异,反应器工艺疫苗完全可以替代传统摇瓶工艺疫苗,为大规模菌体发酵培养生产提供了重要的理论和实验依据。
王正皓[2]（2018）在《四川省部分地区副猪嗜血杆菌的血清型调查及间接ELISA方法的构建》文中研究表明副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）作为一种猪呼吸道的条件致病菌,能引起猪的肺炎、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、脑膜炎和关节炎以及胸腔积液、心包积液、腹腔积液和关节积液,严重阻碍猪的生长育肥,并可致死亡,是保育猪威胁最大的病原菌之一。本研究从四川省部分地区的猪场采集疑似Hps感染病料进行Hps的分离、鉴定与分型,同时表达、纯化了Hps的YfeA蛋白,构建用于检测Hps抗体的间接ELISA方法。1.四川省部分地区Hps血清型调查2014年至2016年间,在四川省部分地区的规模化猪场及养猪合作社共采集649份病料,分离到288株Hps野毒,总分离率为44.38%,各年度分离率无显着差异。四川东部和西部地区发病情况基本一致,38周龄的猪分离率显着高于哺乳仔猪和8周龄以上的猪,冬、春季节分离率显着高于夏、秋季节。结合多重PCR和琼扩试验,对四川省部分地区Hps的血清型分布做了研究,结果表明,7.29%的分离株无法分型。2014年2016年,四川省部分地区以血清4型、5型最为流行,其次为血清7型,未能分离到血清3型、6型、10型和15型的菌株。2.Hps抗体检测间接ELISA构建通过构建重组质粒pET-28a-yfeA,经转化、诱导、超声破碎、纯化,得到大小为36 kDa、浓度为0.698 mg/mL的Hps YfeA蛋白。经方阵滴定实验,最终确定YfeA蛋白最佳包被浓度为0.25μg/孔,HRP-兔抗猪IgG最佳稀释度为1:4000,待检血清的最佳稀释度为1:40,封闭、稀释和显色条件也做了相应优化。经计算,试验的判定前提为:阳性对照-阴性对照>0.6,判定标准为:（样品OD450nm-空白对照）/（阳性对照-空白对照）≥0.4,判为阳性,反之判为阴性。经比较,该方法优于全菌抗原间接ELISA,并具有良好的批内和批间重复性,与进口商品化试剂盒的阳性和阴性符合率分别为79.2%和75%。
刘泽文,田永祥,袁芳艳,刘威,周丹娜,杨克礼[3]（2017）在《仔猪大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝检测方法的建立与应用》文中提出为建立大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断和定量检测方法,用纯化的大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原免疫家兔制备阳性血清,其琼扩效价分别达到1∶32、1∶32、1∶128;利用该阳性血清IgG致敏醛化的绵羊红细胞,确定了最适K88、K99、987P阳性血清IgG的质量浓度分别为40、160、80μg/mL。用该方法对同一批次的K88、K99和987P纤毛抗原进行3次检测,K88、K99和987P纤毛样品的RIHA效价均为1∶1 600、1∶1 600和1∶800。结果表明,该检测方法具有较好的特异性和可重复性,可用于大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断。
马丽娜[4]（2017）在《副猪嗜血杆菌群体基因组测序、分子分型和耐药性研究》文中认为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪格拉泽氏病的病原,它通过单独感染和与其他重要猪病病原的共感染或继发感染造成猪的严重损害和死亡,已成为危害世界养猪业的一种重要病原菌。由于早期体外分离培养困难导致对该菌的研究起步较晚,对其群体结构、遗传变异、分型和耐药等方面的基础研究非常缺乏。为了获得HPS的群体结构特征,本研究利用Illumina Hiseq 2000测序平台首先对50个HPS进行了全基因测序,测序菌株基因组大小2.13-2.49 Mb,GC含量39.38%-39.97%,预测基因2078-2417个/菌。结果显示:HPS基因组大小不同,GC含量稳定。以SH0165为参考基因组,通过挖掘并注释测序菌株中的单核苷酸多态性（SNP）、小片段插入缺失（Small InDel）、结构变异（SV）分析HPS的遗传变异。分析结果显示,HPS中存在广泛的SNP、Small In Del和SV,并在基因编码区（CDS）呈优势分布。在基因编码区,SNP主要为同义突变,显示了纯化选择压力;Small In Del主要通过框架改变引起CDS区变异,在整体水平上呈插入趋势;SV主要通过插入、缺失、反转和染色体内易位引起变异,绝大多数菌株缺失突变的数量均大于插入和反转,显示了HPS基因大片段的缺失趋势。与SH0165基因组比较,测序样品中的非同义突变、编码区发生的Small InDel和SV引起了基因变异。KEGG代谢通路分析显示:这些变异基因主要富集在ABC转运体、氨基酸生物合成和碳代谢通路上。综合使用胶免疫扩散（GID）传统血清定型、多重PCR分子血清定型（mPCR）、多位点序列分型（MLST）定型HPS田间分离株,探讨它们在HPS流行病学研究中的定型效力。在100个HPS中,GID和mPCR分别定型73个（73%）和93个（93%）菌株,二者结果一致性66%。mPCR将GID定型中不可分型（NT）菌株数从27个（27%）降至7个（7%）。荚膜位点分析显示,HPS荚膜位点型特异区域存在大量缺失和功能未知序列,这可能是mPCR定型中NT株产生和GID与mPCR定型结果不一致的原因。MLST分析将53个HPS分离株归为36个序列型（ST）,发现14个新的等位基因序列和23个新的ST。mPCR和MLST比较分析首次证实,一个ST归属唯一血清型。同一畜群可被不同血清型甚至是同一血清型不同ST菌株感染。血清型4、5、7、8分离株中存在优势ST。使用基因组学方法从11个测序HPS中预测到9种耐药基因,可产生对氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、氯霉素和β-内酰胺类抗生素的耐药性。抗生素敏感性检测表明绝大多数菌株对链霉素、卡那霉素和妥布霉素耐药,确证了氨基糖苷类耐药基因的耐药潜能,显示基于组学的耐药性分析可能为HPS耐药性研究提供一种有价值的手段。
邱渊皓[5]（2013）在《屠宰生猪肺脏病变及胸膜肺炎病原菌的分离鉴定》文中进行了进一步梳理在规模化生猪屠宰场进行内脏检疫的时候，经常可以看到感官健康生猪肺脏存在着不同病变情况。特别是胸膜肺炎的病例，它不但可以引起肺部的病变，而且还可以诱发胸膜上的炎症。屠宰场内对肺脏病变进行统计分析，是评估生猪呼吸道疾病发生情况的重要方式。为了解陕西关中地区屠宰生猪肺脏病变和病原菌感染的情况，本次实验从宏观角度上对屠宰生猪病变肺脏进行了统计分析，不同病变肺脏进行HE组织切片染色观察，并对胸膜肺炎病变肺脏组织进行病原菌的分离与鉴定，重点对胸膜肺炎放线杆菌进行血清型鉴定和相关毒力基因检测。对集约化生猪饲养过程中呼吸道疾病的防治提供回顾性数据支持，合理用药提出指导方向；对生猪屠宰检疫提供技术支持；并为陕西关中地区生猪胸膜肺炎的免疫防治提供流行病学依据。1.实验数据分别来两个大型规模化生猪屠宰场，25个生猪畜群共计4987份生猪肺脏样品。统计出明显发生病变的肺脏样本有3215份，占全部数据的64.5%。并利用屠宰场胸膜炎评估系统（SPES）对每个畜群随机选取100份肺脏进行胸膜炎的评价。其中出现不同程度胸膜炎症的病例占统计总数的57.4%。结果显示屠宰生猪整体病变肺脏比例明显，肺脏病变引发的胸膜炎发生较为普遍。2.对420份胸膜肺炎病变肺脏，利用细菌学常规分离技术，生化试验和PCR检测，最终确定胸膜肺炎放线杆菌39株，副猪嗜血杆菌11株，多杀巴氏杆菌17株和25株猪链球菌。胸膜肺炎放线杆菌占所有致病菌株总数的42.4%（39/92），在引发胸膜肺炎的过程中，起重要作用。实验结果表明，分离出来的四种致病菌之间没有特别的因果关系存在，没有单一的传染性因素引起胸膜肺炎的发生，各种传染性病原菌与集约化的饲养环境问题相结合，是导致胸膜肺炎的发生的根本原因。3.对本次屠宰生猪胸膜肺炎病变肺脏中分离得到的39株胸膜肺炎放线杆菌通过琼脂扩散试验和PCR技术，分别进行血清型鉴定和溶血毒力基因的检测。最终鉴定出血清1型13株，血清5型6株，血清7型20株，三种血清型菌株主要携带APXⅠ、APXⅡ、APXⅣ毒力基因。
李鹏[6]（2011）在《副猪嗜血杆菌分子流行病学及其OMP-P2基因抗原性与检测技术研究》文中认为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, H.parasuis）是猪Glasser’s病的病原体,猪上呼吸道的一种共栖菌,它可在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。目前,我国很多省市患病猪群中均可分离获得副猪嗜血杆菌,该菌已成为保育猪死亡的主要原因之一,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。但由于不同血清型及同一血清型的不同菌株之间抗原性差异较大,交叉保护性差；同时该菌的毒力因子和保护性抗原尚不十分清楚,因此,目前尚无有效的预防和控制措施。本研究对副猪嗜血杆菌的部分生物学特性及分子流行病学进行了研究,建立了P2-PCR检测方法,对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2（Out membarine protein P2, OMP P2）进行了克隆表达及ELISA抗原性试验,并通过攻毒保护试验证实了对高致病性毒株攻毒有较好的免疫保护效果。本研究内容分为以下5个部分：1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定与部分生物学特性比较将血清5型副猪嗜血杆菌参考株HS-DY05接种固体培养基TSA、PPLO琼脂、巧克力琼脂、胰（?）蛋白胨琼脂和液体培养基TSB、PPLO液体、胰（?）蛋白胨和马丁肉汤,通过观察菌落大小、平板计数试验,结果证明TSA和TSB是该菌的最适培养基。采集123份临床疑似副猪嗜血杆菌病病例,通过病理剖解、TSA和TSB分离培养、和生化鉴定,分离获得111株HPS分离株。HPS HB070214接种于TSB,37℃、180r/min培养10～12h,菌数可达到109cfu/mL。通过革兰氏染色镜检和电镜观察,HPS分离株具有形态多样性,并在荚膜和菌毛上有较大差异。对分离菌用22种常规的抗菌药物进行了纸片法药敏试验,结果表明,高敏比例在50%以上的药物依次有头孢哌酮、头孢西丁、头孢他啶、复方新诺明、多粘菌素、替米考星、头孢噻呋和头孢曲松。乙酰甲喹、强力霉素、氟苯尼考、利福平、恩诺沙星和磺胺六甲氧嘧啶等常用药物均已出现50.0%以上的耐药菌株。将15种血清型HPS接种仔猪,观察其致病作用,结果为：HPS血清6、7、8和11型HPS毒力很弱或没有致病性,血清4、5、12和13型HPS则具有很强毒力或致病性,血清1、2、9、10、11、14和15型HPS显示出中等的致病力,与国外报道的HPS各血清型的毒力特点基本一致。将15种血清型HPS菌液灭活后,免疫家兔制备血清,结果为HPS琼扩试验抗体效价在1：8以上,15种血清型菌株之间的相互交叉免疫保护反应,表明不同血清型HPS全菌高免血清存在广泛的交叉免疫反应,不同血清型HPS存在共同抗原。2. ERIC-PCR技术用于副猪嗜血杆菌分离株基因分析采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR方法,在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对分离自中国东南部发生Glasser’s病的不同猪场的111株副猪嗜血杆菌进行了指纹鉴定。结果显示：111株分离株显示出23种指纹图谱,前三种最流行的指纹图谱为ERIC-PCR ⅩⅩ（20/111）, ⅩⅩⅢ（9/111）和Ⅳ（8/111）。且在111株分离株中,来自不同地区的分离株分别表现出不同种类的指纹图谱。该试验表明ERIC-PCR方法可适用于对某一地区的副猪嗜血杆菌进行分子流行病学的研究和基因型的鉴定；试验结果还揭示了副猪嗜血杆菌在中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型。15种血清型的HPS参考株和111株HPS分离株的ERIC-PCR指纹图谱均显示各菌株均有一大小在1100bp左右的基因。该结果表明,中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型,ERIC-PCR方法可用于副猪嗜血杆菌分子流行病学研究,同时,为今后寻找HPS的共同抗原基因提供了理论依据。3.副猪嗜血杆菌OMP P2基因序列测定与基因分型根据HB070412ERIC-PCR指纹图谱中特异基因的测序结果,利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GENBANK中的HPS序列（ZP02477753）设计了一对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因（OMP P2）,并克隆到载体pMD18-T（T-Vector）,序列测定结果表明HB070412OMP P2基因全长1077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMP P2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。以此序列设计引物对15种血清型HPS参考株和分离株AH080412、AH080526、GX080413、JS070421、QD080725、ZJ080625和HB070214进行了OMP P2基因的扩增产物测序和序列分析,结果表明所测菌株的OMP P2可分为2个基因型：Genotype Ⅰ知Genotype Ⅱ。Genotype Ⅰ的OMP P2基因大小在1077bp到1095bp之间,Genotype Ⅱ的基因大小在1167bp到1203bp之间,Genotype Ⅰ知Genotype Ⅱ在氨基酸水平具有92.8%的同源性,在核苷酸水平的同源性则为96.6%；在蛋白水平Genotype Ⅰ比Genotype Ⅱ的OMP P2少27-42氨基酸,Genotype Ⅰ的菌株均为致病性菌株,而Genotype Ⅱ的菌株则不具致病性。4.副猪嗜血杆菌重组OMP P2蛋白的高效表达与抗原性研究用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65kDa,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。根据GenBank中副猪嗜血杆菌（HPS）的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了大小为1077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为60500的可溶性融合蛋白P2-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的30%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmo1/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达92.5%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化EL ISA反应条件,建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法（P2-ELISA）,并将所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为93.4%。结果表明,本试验建立的P2-ELISA与Synbiocits-ELISA具有同样高的特异性。小鼠免疫试验结果表明OMP P2蛋白对小鼠的攻毒保护率为80%。5.副猪嗜血杆菌OMP P2基因PCR检测方法的建立与应用通过反应条件的优化、特异性和敏感性的测定,建立了一种快速、简便、准确的PCR方法,用于检测副猪嗜血杆菌（HPS） OMP P2基因。PCR扩增片段大小为1080bp左右,最小检测量为1000个HPS。与胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌无特异性反应。用该法检测人工感染猪的肺脏、心脏和肾脏抽提的DNA,结果为阳性；检测肝脏、脾脏、脑组织样品抽提的DNA,结果为阴性。用该法检测人工感染发病仔猪及自然感染仔猪肺组织,并结合细菌分离培养,证明以肺脏组织为病料,通过细菌分离培养,再用PCR法鉴定分离菌体,可有效地用于HPS的特异诊断。检测116份来自发病猪场的患病仔猪肺脏病料,其中有110份为阳性,与16S rRNA PCR检测结果一致,表明该方法可用于Glasser’s病病原学检测。
贾付从[7]（2009）在《猪胸膜肺炎放线杆菌抗体ELISA检测试剂盒的研制及应用》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎（ine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的高度接触性、致死性呼吸道疾病。研究表明,与病原菌毒力相关的因子很多,包括毒素、荚膜多糖、外膜蛋白、脂多糖等,其中毒素既是主要的毒力因子,也是主要的免疫原。APP可产生4种毒素,其中Apx Ⅱ除血清型10外,其余血清型都能分泌此毒素；所有血清型的APP都能分泌ApxⅣ, ApxⅣ只有在APP感染宿主时才产生,而在体外培养条件下不表达。一、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制重组蛋白Apx Ⅱ表达和纯化经过改进,即在37℃,用0.8mM IPTG诱导4h；对早期建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌抗体的ApxⅡ-ELISA检测方法的反应条件进行优化,确定了最佳反应条件,抗原最适包被浓度为2.23μg/mL,包被时间为37℃1h后4℃过夜,封闭液为1%BSA/PBST,在37℃封闭lh。酶标二抗最适稀释浓度为1：20000。在此基础上研制成试剂盒,对其敏感性、特异性、重复性及稳定性进行测试。该试剂盒的批内和批间变异系数分别为2.52%～7.41%和2.96%-7.16%。与IHA试剂盒进行比较,符合率为86.7%。结果表明该试剂盒具有良好的特异性和敏感性,可快速准确的检测猪传染性胸膜肺炎。二、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制重组ApxⅣ蛋白表达和纯化经过改进,即在30℃,用0.6mM IPTG诱导6h；在早期建立的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测方法的基础上,本研究对抗原酶标板制备工艺,酶标二抗、阴阳性血清和试剂盒的保存条件进行了测试,并组装成试剂盒。该试剂盒的批内和批间的变异系数分别为2.65%-8.40%和2.69%-11.3%；试剂盒置于-20℃至少保存9个月,4℃保存3个月。与科前ApxⅣ-ELISA检测试剂盒比较,两者的符合率为67.5%。该试剂盒能区分野毒感染和疫苗免疫猪产生的抗体。三、ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用利用研制的ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒检测了不同日龄猪血清样品和大量临床血清样品。发现在同一批猪不同日龄采集的血清中,两种毒素抗体阳性率均呈现先降后升的趋势,用ApxⅡ-ELISA试剂盒检测时,50-60日龄猪抗体阳性率降到最低,而用ApxⅣ-ELISA检测时,90-110日龄猪抗体阳性率达到最低水平。ApxⅡ-ELISA试剂盒检出了临床样品阳性血清288份,阳性率为34.3%；ApxⅣ-ELISA试剂盒检出了阳性血清191份,阳性率为22.8%。
杨利[8]（2009）在《APP apxIVA基因序列特性及rApxIVA/rTbpB亚单位复合菌苗对小鼠的免疫研究》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎（Porcine Infectious Pleuropneumonia Syndrome,PIPS）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪高度接触性呼吸道传染病,是猪急性呼吸道疾病发生的重要原因。由于引起PIPS的病原血清型众多,毒力因子复杂,不同血清型细菌毒力因子构成不同,使疫苗免疫难以达到令人满意的效果。本研究以探讨APP两种在体内表达的蛋白ApxⅣA（胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素ⅣA）和TbpB（运铁蛋白结合蛋白B）对灭活疫苗免疫效果的影响为目的。研究从分析基因序列特性开始,采用PCR方法成功扩增APP血清1型apxⅣA基因5’端两个特征性氨基酸序列（N端疏水性区域和中部乙酰化位点区域）的编码序列,构建这两段序列的表达载体apxⅣA1-pET32a和apxⅣA2-pET32a。将所构建表达载体和实验室前期构建并鉴定的tbpB-pET32a载体分别转化表达宿主菌大肠杆菌BL21,在0.6 mmol/L IPTG浓度条件下诱导3 h表达重组蛋白rApxⅣA1、rApxⅣA2和rTbpB。Western-blot分析表明rApxⅣA1和rTbpB具有良好的抗体反应原性,rApxⅣA2的抗体反应原性很弱。rApxⅣA1和rTbpB作为亚单位疫苗按25μg/只/次的剂量分三次免疫小鼠,每次间隔两周,抗体监测结果表明两种重组蛋白单独或者是联合免疫小鼠都能诱导机体快速产生高水平抗体,在二免两周后抗体水平就达到活菌感染诱导机体产生的抗体水平。用APP1型4074株培养物制备灭活疫苗免疫小鼠（4×108CFU/只）,免疫方法同重组蛋白。抗体监测结果表明灭活疫苗免疫小鼠能诱导机体产生ApxⅠ抗体、ApxⅡ抗体和LPS1抗体,不能诱导CPS1抗体产生。将重组蛋白与细菌培养物混合后制备亚单位复合菌苗免疫小鼠,抗体监测结果表明,灭活苗不会影响重组蛋白诱导机体产生抗体的能力;重组蛋白的添加,对灭活疫苗中部分抗原诱导机体产生抗体的能力有一定影响。在所检测抗体中,灭活疫苗诱导Apx1和LPS1抗体产生的能力受重组蛋白的影响比较明显,ApxⅡ抗体产生能力不受影响。三免后MTT法分析各免疫组小鼠脾细胞增殖能力,结果表明重组蛋白的添加量对脾细胞增殖能力有影响,重组蛋白50μg（rTbpB和rApxⅣA1各25μg）免疫组小鼠脾细胞增殖能力最强,重组蛋白25μg免疫组小鼠脾细胞增殖能力低于50μg免疫组;25μg免疫组中,不同重组蛋白免疫效果差异不明显:在所有免疫组中,灭活苗免疫组小鼠脾细胞增殖能力最弱。攻毒试验结果表明,重组蛋白对同型（1型）细菌攻毒具有一定的免疫保护作用,rTbpB亚单位疫苗免疫能提供30%的保护率,rApxⅣA1亚单位疫苗免疫能提供20%的保护率,两者联合免疫能提供的免疫保护率为40%。灭活疫苗单独免疫提供的保护率为50%;与rTbpB或rApxⅣA联合免疫的保护率均为60%;与两种蛋白联合免疫提供的保护率为80%,重组蛋白能提高灭活疫苗的免疫保护率。对攻毒后死亡小鼠肺脏和存活一周的小鼠肺脏带菌量进行定量检测,结果表明不同疫苗免疫对APP的清除率不同。rTbpB免疫有助于降低细菌在肺脏的定殖能力,灭活疫苗免疫组小鼠肺脏带菌量在攻毒后一周变化不明显,rApxⅣA1免疫组小鼠肺脏带菌量在攻毒后一周出现明显上升。对于不同血清型（6型）攻毒,研究中所使用疫苗免疫后都不能产生很好的保护作用,除rApxⅣA/rTbpB亚单位复合菌苗免疫组有一只小鼠存活外,其余均在攻毒后死亡。在对apxⅣA基因3’端片段的克隆研究中,发现该片段在基因组外复制时具有特殊性,即PCR扩增能形成不同大小的扩增片段,T克隆后重复序列缺失重复结构。序列分析表明,apxⅣA基因重复区域序列由4个重复单元组成,长度分别为159 bp、144 bp、135 bp和84 bp,在L20株、HV114株和4074株apxⅣA基因中的排列方式可以表示为[(P144bp)(P159bp)(P135bp)]m[(P144bp)(P159bp)(P84bp)(P144bp)(P159bp)(P135bp)]n(P144 bp)（m=0 or 1、n≥1）。在紧邻重复区域的序列中设计引物扩增该重复区域,电泳显示PCR扩增产物中有多种扩增条带。回收1型4074株扩增产物中约1800 bp、1200 bp和600 bp的三种片段,与pGMT连接后转化大肠杆菌,获得重组质粒pGMT-A、pGMT-B和pGMT-C。测序结果显示,三种质粒中的插入片段核酸序列为扩增区序列的一部分,具体为上游引物结合位点到重复区之间39 bp、下游引物结合位点到重复区36 bp和144 bp重复单元在3’末端的一个重复。T克隆结果表明,PCR扩增产物中三种不同大小的产物都是扩增区域PCR扩增的结果,即同一模板经PCR扩增产生了不同大小的产物;这些产物插入T载体随质粒在大肠杆菌中复制后,丢失全部重复结构,仅留重复区1794 bp中的144 bp与重复区两侧序列重新连接成一个无重复结构的普通序列。对apxⅣA基因重复序列在基因组外复制稳定性的研究表明,重复序列在复制过程中具有丢失部分重复单元并最终丢失整个重复结构变成非重复序列的特性。这一特性与ApxⅣA蛋白的自我剪切活性是否有因果联系,以及这一现象是否在细菌基因组复制过程中同样发生,还有待进一步试验研究。
谢碧林[9]（2008）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫原性分析》文中提出一、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ融合蛋白的纯化及其间接ELISA检测方法的建立将猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,App）毒素ApxⅡ的融合表达质粒pET-ApxⅡ转化到BL21（DE3）,筛选高表达的克隆子用于诱导表达。应用亲和层析纯化ApxⅡ作为抗原包被ELISA板建立检测App的ApxⅡ-ELISA试剂盒。试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为10μg/mL,血清1:80稀释;一抗反应时间为90min,二抗反应时间为45min。与Cps-ELISA试剂盒平行检测172份临床血清显示该试剂盒具有良好的稳定性和重复性,并具有较高的特异性和敏感性。二、猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白A（OmlA）部分基因片段的克隆表达参照GenBank中App血清1、2、7型菌株的OmlA序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增外膜脂蛋白A（OmlA）部分基因,分别得到994bp、1003bp和1000bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中。经测序比较,与GenBank中公布的序列（AB007572、AB007573和AB007579）核苷酸同源性分别为100%。从T载体中切下目的片段后,定向克隆到pET32a（+）中,转化BL21（DE3）。经诱导后,进行SDS-PAGE实验,证明获得56kDa的融合蛋白,目的基因高效表达;免疫转印鉴定呈阳性,外膜蛋白OmlA部分基因片段体外成功表达。三、猪胸膜肺炎放线杆菌共同的外膜蛋白（AopA）部分基因片段的克隆表达参照GenBank中App的外膜蛋白AopA基因序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增外膜蛋白A（AopA）部分基因,得到1390bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中,经测序比较,与GenBank中公布的序列（U24492）核苷酸同源性为99%。从T载体中切下目的片段后,定向克隆到pET32a（+）中,转化BL21（DE3）,经诱导后,进行SDS-PAGE实验,证明获得69kDa融合蛋白,目的基因高效表达;免疫转印鉴定呈阳性,外膜蛋白AopA部分基因片段体外成功表达。四、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白ICR小鼠免疫试验通过基因工程技术分别表达了App的外膜蛋白rAopA、rOmlA1、rOmlA2和rOmlA7,分别免疫60只ICR小鼠,同时与rApxⅡ组合免疫96只ICR小鼠;三免后分别用最小致死剂量的Appl型菌（2×107CFU）和App7型菌（4×108CFU）攻毒。结果显示,试验组保护效果优于对照组;rOmlA7和rAopA与rApxⅡ组合免疫组的保护效果优于其他试验组和对照组,其中rOmlA7组合免疫的小鼠在抵抗Appl型菌攻击能力优于rOmlAl组合。试验证实App的外膜蛋白具有免疫原性,在抵抗App的攻击中起到一定的保护作用,且App的OmlA可能还可以提供交叉免疫保护。
雷连成[10]（2007）在《猪胸膜肺炎放线杆菌差减基因文库构建及免疫应答相关基因筛选》文中进行了进一步梳理本研究选择毒力强而没有交叉免疫保护的APP血清1型和5型菌株为对象,采用改良的代表性差异分析法（RDA）,分别构建了cDNA差异表达基因文库和基因组DNA差减基因文库,经southern blot验证和部分测序,系统分析1型和5型差异表达基因及基因组差异基因。并采用核糖体展示技术、免疫筛选技术及RT-PCR技术进行免疫应答相关基因筛选。结果表明,获得APP 1型17条上调表达基因,其中8条基因与痤疮丙酸杆菌功能基因同源性最高,基因序列同源率达到93-100%,1条为未知序列;6条为免疫应答相关基因。APP 5型31条基因上调表达,其中10条基因与痤疮丙酸杆菌功能基因的同源性达到98%,14条基因未发现已知的同源序列;14条为免疫应答相关基因。基因组差减文库中筛选到APP 1型8条主要差异基因,1条基因为未知序列;5型分离到10条主要差异基因,其中8条与APP L20血清型5b同源比例在93-100%,2条为未知序列。这些基因全部为免疫应答相关基因。痤疮丙酸杆菌（PA）曾是短小棒状杆菌（CP）的别名,本研究检测发现PA与APP抗血清存在很强的交叉免疫反应,PA活菌免疫小鼠,分别用APP 1型和5型10倍LD50攻毒,对APP 1型攻毒小鼠的保护率为95%,对APP 5型攻毒小鼠的保护率为90%。并且在攻毒后第15天小鼠体内APP菌全部被清除。本研究为建立APP特异的免疫诊断方法、新型多价基因工程疫苗及CP异源活疫苗的研究奠定了基础。
二、用琼扩法测定胸膜肺炎嗜血杆菌的血清型（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用琼扩法测定胸膜肺炎嗜血杆菌的血清型（论文提纲范文）
（1）副猪嗜血杆菌（HPS）发酵工艺研究及其疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 HPS病原学 |
| 1.1 形态及培养特性 |
| 1.2 HPS的毒力因子 |
| 1.3 血清分型及毒力研究 |
| 1.4 基因分型 |
| 2 HPS流行病学 |
| 3 致病机理 |
| 4 临床症状和病理变化 |
| 5 诊断 |
| 6 免疫应答 |
| 7 HPS病的治疗与预防 |
| 7.1 HPS病的治疗 |
| 7.2 HPS病的预防 |
| 8 HPS疫苗研究进展 |
| 9 疫苗生产及评价 |
| 9.1 疫苗生产 |
| 9.2 疫苗评价 |
| 10 本项目研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌(HPS)的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 菌株的复苏培养 |
| 2.2 菌株的革兰氏染色镜检 |
| 2.3 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性检验结果 |
| 2.4 生化检测结果 |
| 2.5 PCR鉴定结果 |
| 2.6 琼脂扩散试验方法(KRG)血清分型结果 |
| 2.7 PCR血清分型结果 |
| 2.8 菌种的保存及检验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附件1 |
| 附件2 |
| 第三章 副猪嗜血杆菌(HPS)生物反应器培养工艺研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 摇瓶培养HPS条件的研究结果 |
| 2.2 HPS生物反应器发酵条件研究 |
| 2.3 三价灭活疫苗(HPS 4、5、12型)的制备 |
| 2.4 三价灭活疫苗(HPS 4、5、12型)常规检验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 摇瓶培养条件的研究 |
| 3.2 生物反应器培养条件的研究 |
| 3.3 关于血清添加量和种子液接种量 |
| 参考文献 |
| 第四章 副猪嗜血杆菌(HPS)三价灭活疫苗的 免疫效果评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 副猪嗜血杆菌(HPS)三价灭活疫苗(4、5、12)安全性检验结果 |
| 2.2 微量凝集试验(MAT)检测结果 |
| 2.3 副猪嗜血杆菌(HPS)三价灭活疫苗(4、5、12)免疫效力检验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 全文结论 |
| 致谢 |
（2）四川省部分地区副猪嗜血杆菌的血清型调查及间接ELISA方法的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.Hps流行病学的研究现状 |
| 1.1 Hps的流行概况 |
| 1.2 Hps分型的研究现状 |
| 2.Hps疫苗的研究现状 |
| 2.1 Hps血清型间的交叉保护 |
| 2.2 Hps灭活苗 |
| 2.3 Hps基因工程减毒苗 |
| 2.4 Hps亚单位疫苗与核酸疫苗 |
| 3.Hps候选诊断抗原的研究现状 |
| 3.1 Hps全菌抗原 |
| 3.2 Hps蛋白抗原 |
| 4.本研究的目的与意义 |
| 第二章 四川省部分地区Hps的血清型调查 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 Hps分离鉴定 |
| 1.4 Hps分离株PCR血清分型 |
| 1.5 血清5&12型Hps分离株AGD分型 |
| 1.6 Hps分离株的保种 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 2014 ~2016年四川省部分地区Hps分离情况 |
| 2.2 Hps分离株mPCR&AGD血清分型情况 |
| 2.3 2014 ~2016年四川省部分地区Hps的血清型分布 |
| 3.讨论 |
| 第三章 Hps抗体检测间接ELISA构建 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要菌种、试剂及设备 |
| 1.2 YfeA蛋白的表达、纯化 |
| 1.3 基于YfeA蛋白的间接ELISA建立 |
| 1.4 全菌包被抗原测定 |
| 1.5 临床血清检测 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 YfeA蛋白的表达、纯化结果 |
| 2.2 基于YfeA蛋白的间接ELISA建立情况 |
| 2.3 全菌抗原测试结果 |
| 2.4 基于YfeA蛋白的间接ELISA临床应用结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 (1) |
| 附录 (2) |
| 附录 (3) |
| 附录 (4) |
| 作者简历 |
（3）仔猪大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 大肠杆菌纤毛抗原的制备 |
| 1.3 阳性血清的制备及纯化 |
| 1.4 绵羊红细胞的制备和醛化 |
| 1.5 大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝方法的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 纤毛抗原的制备 |
| 2.2 阳性血清的制备及血清效价的测定结果 |
| 2.3 RIHA抗体最佳致敏质量浓度的确定 |
| 2.4 特异性试验结果 |
| 2.5 重复性试验结果 |
| 2.6 临床应用结果 |
| 3 讨论 |
（4）副猪嗜血杆菌群体基因组测序、分子分型和耐药性研究（论文提纲范文）
| 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 副猪嗜血杆菌概述 |
| 1.1.1 副猪嗜血杆菌的发现、命名 |
| 1.1.2 副猪嗜血杆菌病原学和理化特性 |
| 1.1.3 格拉泽氏病 |
| 1.2 基因组学研究 |
| 1.2.1 基因组及人类基因组测序计划 |
| 1.2.2 基因组测序技术的产生和发展 |
| 1.2.3 细菌基因组学研究 |
| 1.2.4 副猪嗜血杆菌基因组学研究进展 |
| 1.3 副猪嗜血杆菌分型研究现状 |
| 1.3.1 传统血清分型和血清型流行性 |
| 1.3.2 分子定型方法 |
| 1.4 副猪嗜血杆菌耐药性研究现状 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌基因组测序、组装、注释 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂及培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌株形态和革兰氏染色特性鉴定 |
| 2.2.2 16S rRNA序列鉴定 |
| 2.2.3 测序文库构建 |
| 2.2.4 原始测序数据过滤和质量评估 |
| 2.2.5 基因组组装 |
| 2.2.6 基因预测 |
| 2.2.7 基因功能注释 |
| 2.2.8 平均核酸相似性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 菌株形态和革兰氏染色特性鉴定 |
| 2.3.2 16S rRNA序列鉴定 |
| 2.3.3 测序文库构建 |
| 2.3.4 原始测序数据过滤和质量评估 |
| 2.3.5 基因组组装 |
| 2.3.6 基因预测 |
| 2.3.7 基因功能注释 |
| 2.3.8 平均核酸相似性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 副猪嗜血杆菌遗传变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 单核苷酸多态性（SNP）分析 |
| 3.2.2 小片段插入缺失（Small InDel）分析 |
| 3.2.3 结构变异（SV）分析 |
| 3.2.4 共有SNP和Small InDel分析 |
| 3.2.5 DNA水平变异基因分析 |
| 3.2.6 DNA水平共有变异基因分析 |
| 3.2.7 变异基因在Core/accessory genome上的分布 |
| 3.2.8 进化分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 单核苷酸多态性（SNP）分析 |
| 3.3.2 小片段插入缺失（Small InDel）分析 |
| 3.3.3 结构变异（SV）分析 |
| 3.3.4 共有SNP和Small InDel分析 |
| 3.3.5 DNA水平变异基因分析 |
| 3.3.6 DNA水平共有变异基因分析 |
| 3.3.7 变异基因在Core/accessory genome上的分布 |
| 3.3.8 进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 副猪嗜血杆菌分型研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 培养基配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 传统血清定型 |
| 4.2.2 multiple PCR（mPCR）分子血清定型 |
| 4.2.3 荚膜位点检测与分型 |
| 4.2.4 多位点序列分型 |
| 4.2.5 传统血清分型、mPCR分型和荚膜位点分型比较 |
| 4.2.6 多位点序列分型与mPCR分型关联分析 |
| 4.2.7 ST流行性和优势ST分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 传统血清定型 |
| 4.3.2 multiple PCR（mPCR）分子血清定型 |
| 4.3.3 荚膜位点检测与分型 |
| 4.3.4 多位点序列分型 |
| 4.3.5 传统血清分型、mPCR分型和荚膜位点分型比较 |
| 4.3.6 多位点序列分型与mPCR分型关联分析 |
| 4.3.7 ST流行性和优势ST分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 副猪嗜血杆菌耐药性研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 耐药基因检测 |
| 5.2.2 耐药性检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 耐药基因检测 |
| 5.3.2 耐药性检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）屠宰生猪肺脏病变及胸膜肺炎病原菌的分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 屠宰健康生猪肺脏病变和胸膜肺炎研究进展 |
| 1.1 猪呼吸道疾病和肺脏病变研究情况 |
| 1.2 屠宰生猪胸膜炎研究情况 |
| 1.3 引起猪肺脏发生病变的常见疾病 |
| 1.3.1 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.3.2 喘气病 |
| 1.3.3 猪肺疫 |
| 1.3.4 猪流感 |
| 1.3.5 猪繁殖与呼吸障碍综合征 |
| 1.3.6 猪圆环病毒 |
| 1.3.7 肺丝虫 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌研究进展 |
| 1.4.1 病原学特征 |
| 1.4.2 流行病学 |
| 1.4.3 相关毒力因子 |
| 1.4.4 致病机理及其病理变化 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 屠宰生猪病变肺脏和胸膜炎的观察 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品的采集 |
| 2.1.2 仪器和试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 感官检验方式 |
| 2.2.2 不同肺脏病变判断标准 |
| 2.2.3 屠宰加工引起的肺脏变化 |
| 2.2.4 屠宰场胸膜炎评估系统 |
| 2.2.5 肺脏病理切片制作方法 |
| 2.2.6 数据的记录与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 肺脏病变统计 |
| 2.3.2 病理切片染色观察 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 胸膜肺炎病变肺脏的细菌分离与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 培养基 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 胸膜肺炎病料的采集 |
| 3.2.2 革兰氏染色镜检 |
| 3.2.3 病原菌生化试验 |
| 3.2.4 病原菌的 PCR 检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 细菌分离鉴定 |
| 3.3.2 细菌生化试验 |
| 3.3.3 病原菌 PCR 鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 胸膜肺炎放线杆菌的血清型与溶血毒素（APX）检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 菌株和试验动物 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 待检菌株抗原的制备 |
| 4.2.2 琼脂凝胶板的制备 |
| 4.2.3 琼扩法鉴定胸膜肺炎放线杆菌血清型 |
| 4.2.4 胸膜肺炎放线杆菌毒素型鉴定 |
| 4.2.5 小鼠致病力试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血清型鉴定结果 |
| 4.3.2 胸膜肺炎放线杆菌毒素型鉴定结果 |
| 4.3.3 胸膜肺炎放线杆菌毒素基因测序 |
| 4.3.4 胸膜肺炎放线杆菌对小鼠的致病性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）副猪嗜血杆菌分子流行病学及其OMP-P2基因抗原性与检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 副猪嗜血杆菌研究进展 |
| 1 副猪嗜血杆菌的理化特性 |
| 2 毒力及毒力因子 |
| 2.1 血清型与毒力 |
| 2.2 常见潜在毒力因子的研究 |
| 2.3 致病机理 |
| 2.4 病理变化 |
| 3. 流行病学 |
| 3.1 临床流行病学 |
| 3.2 血清流行病学研究 |
| 3.3 分子流行病学研究 |
| 4 诊断与防制 |
| 4.1 诊断 |
| 4.2 防制 |
| 研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定与部分生物学特性比较 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 固体培养基选择结果 |
| 2.2 液体培养基选择结果 |
| 2.3 生化鉴定结果 |
| 2.4 16S rRNA PCR鉴定结果 |
| 2.5 分离菌的背景情况统计 |
| 2.6 细菌分离培养及形态观察结果 |
| 2.7 药敏试验结果 |
| 2.8 HB070214半数致死量(LD50)测定 |
| 2.9 仔猪致病性试验结果 |
| 2.10 高免血清的制备及琼扩试验结果 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌的培养条件 |
| 3.2 HPS的形态特征观察 |
| 3.3 HPS的鉴定 |
| 3.4 HPS的耐药性 |
| 3.5 HPS对动物的致病力 |
| 3.6 各血清型间的交叉保护 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第三章 副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 副猪嗜血杆菌野生分离株的相关背景 |
| 2.2 ERIC-PCR方法对副猪嗜血杆菌参考株和野生分离株的分型结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第四章 副猪嗜血杆菌OMP P2基因的序列测定及分型 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 酶及主要试剂和设备 |
| 1.3 不同血清型菌株ERIC-PCR |
| 1.4 ERIC-PCR特异条带的克隆与测序 |
| 1.5 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.6 OMP P2基因在BL21中的诱导表达 |
| 1.7 SDS-PAGE分析 |
| 1.8 Western-blot分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同血清型菌株和7株分离株ERIC-PCR结果 |
| 2.2 ERIC-PCR特异条带的克隆与测序 |
| 2.3 Omp P2基因的扩增结果 |
| 2.4 OMP P2基因的克隆、鉴定与序列测定 |
| 2.5 原核表达重组质粒的构建 |
| 2.6 OMP P2基因的原核表达和Western blot分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 副猪嗜血杆菌重组OMP P2蛋白的高效表达与抗原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与抗体 |
| 1.2 载体与菌株及试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 P2-PCR扩增 |
| 1.5 原核表达载体的构建 |
| 1.6 重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 1.7 重组融合蛋白的纯化及免疫学活性检测 |
| 1.8 间接ELISA抗原性试验 |
| 1.9 小鼠免疫试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 HPS P2基因的克隆及序列分析 |
| 2.2 重组表达质粒的构建 |
| 2.3 重组融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 间接ELISA抗原性 |
| 2.5 小鼠免疫试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 副猪嗜血杆菌OMP P2基因PCR检测方法的建立与应用 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 PCR引物 |
| 1.4 HPS的复制 |
| 1.5 HPS的分离培养 |
| 1.6 细菌DNA提取 |
| 1.7 PCR反应 |
| 1.8 PCR灵敏性试验 |
| 1.9 PCR产物克隆与DNA序列分析 |
| 1.10 PCR方法的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR条件的确立 |
| 2.2 特异性试验 |
| 2.3 灵敏性试验 |
| 2.4 检测样品的选择 |
| 2.5 临床样品的检测与应用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 发表的论文及出版的着作 |
（7）猪胸膜肺炎放线杆菌抗体ELISA检测试剂盒的研制及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 毒力因子 |
| 4 致病机理 |
| 5 病理变化 |
| 6 临床症状 |
| 7 检测技术的研究进展 |
| 8 防治策略 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 Apx Ⅱ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）APP apxIVA基因序列特性及rApxIVA/rTbpB亚单位复合菌苗对小鼠的免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 猪传染性胸膜肺炎病原综述 |
| 1.1 病原形态学及生化特性 |
| 1.2 病原细菌APP分类 |
| 1.2.1 生物型 |
| 1.2.2 血清型 |
| 1.2.3 APP基因型 |
| 1.3 血清型分布 |
| 1.4 病原主要毒力因子及其在致病机理中的作用 |
| 1.4.1 定殖因子 |
| 1.4.2 细菌防御进攻因子 |
| 1.5 病原重要毒力因子分子生物学特性 |
| 1.5.1 毒素分子生物学 |
| 1.5.2 APP转铁结合蛋白分子生物学 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 血清学诊断方法 |
| 1.6.2 分子生物学诊断 |
| 1.7 猪传染性胸膜肺炎的免疫预防 |
| 1.7.1 灭活疫苗 |
| 1.7.2 亚单位疫苗 |
| 1.7.3 弱毒疫苗 |
| 1.7.4 ghosts疫苗 |
| 1.7.5 疫苗免疫途径的研究 |
| 2 APP apxIVA基因序列特性分析 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 材料 |
| 2.3.1 菌株和载体 |
| 2.3.2 序列及分析软件 |
| 2.3.3 引物设计 |
| 2.3.4 主要试剂 |
| 2.3.5 主要仪器 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 apxIVA基因序列结构特性分析 |
| 2.4.2 apxIVA基因序列在基因组外复制特性分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 apxIVA基因结构特性 |
| 2.5.2 apxIVA基因片段在基因组外复制的特性 |
| 2.5.3 apxIVA基因重复序列在基因组外复制中的变异模式 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 关于研究中使用的载体和宿主菌 |
| 2.6.2 apxIVA基因中重复序列类型 |
| 2.6.3 apxIVA基因中的重复序列对分子生物学操作的影响 |
| 2.6.4 重复序列稳定性的研究方法 |
| 2.6.5 重复序列在基因组外复制过程中不稳定性的机制 |
| 2.6.6 apxIVA基因中重复序列的生物学意义 |
| 2.7 小结 |
| 3 rApxIVA/rTbpB亚单位复合菌苗对小鼠的免疫研究 |
| 3.1 研究目的和意义 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 材料 |
| 3.3.1 质粒与菌株 |
| 3.3.2 引物 |
| 3.3.3 抗体 |
| 3.3.4 试验动物 |
| 3.3.5 主要试剂 |
| 3.3.6 主要仪器 |
| 3.4 方法 |
| 3.4.1 鼠抗APP感染血清的制备 |
| 3.4.2 细菌培养 |
| 3.4.3 重组蛋白制备 |
| 3.4.4 检测抗原的制备 |
| 3.4.5 SDS-PAGE电泳和Western blot分析 |
| 3.4.6 APP荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.4.7 疫苗制备及动物免疫 |
| 3.4.8 动物免疫 |
| 3.4.9 半数致死量(LD50)的测定 |
| 3.4.10 攻毒 |
| 3.4.11 血清特异性抗体监测 |
| 3.4.12 脾淋巴细胞转化试验 |
| 3.4.13 小鼠肺脏组织APP带菌量检测 |
| 3.4.14 小鼠肺脏病理变化 |
| 3.4.15 试验数据分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 菌种鉴定结果 |
| 3.5.2 细菌浊度与活菌数的关系 |
| 3.5.3 LD50测定结果 |
| 3.5.4 重组蛋白表达结果 |
| 3.5.5 ELISA包被抗原纯化结果 |
| 3.5.6 APP实时荧光定量PCR检测方法建立结果 |
| 3.5.7 血清抗体监测结果 |
| 3.5.8 脾淋巴细胞增殖结果 |
| 3.5.9 攻毒后疫苗免疫保护力 |
| 3.5.10 攻毒小鼠病理变化 |
| 3.5.11 疫苗对肺脏APP的清除效果 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 试验所用菌种 |
| 3.6.2 试验设计思路 |
| 3.6.3 抗体监测指标的选择 |
| 3.6.4 重组蛋白的表达与分析 |
| 3.6.5 重组蛋白免疫前处理 |
| 3.6.6 检测抗原的纯化 |
| 3.6.7 关于抗体监测结果 |
| 3.6.8 关于脾细胞增殖试验 |
| 3.6.9 疫苗免疫对小鼠的保护作用 |
| 3.6.10 关于荧光定量PCR方法及检测结果 |
| 3.7 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| pET-32A-C(+)VECTORS载体示意图 |
| 研究中所用试剂及培养基 |
| 序列分析结果 |
| 测序报告 |
| 论文发表 |
（9）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 病原学 |
| 3 流行病学 |
| 4 致病机理 |
| 5 毒力因子 |
| 6 临床症状与病理变化 |
| 7 检测技术的研究进展 |
| 8 防治策略 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究论文 |
| 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ融合蛋白纯化及其间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白A(OmlA)部分基因片段的克隆表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪胸膜肺炎放线杆菌共同的外膜蛋白(AopA)部分基因片段的克隆表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白ICR小鼠免疫试验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）猪胸膜肺炎放线杆菌差减基因文库构建及免疫应答相关基因筛选（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪胸膜肺炎病原研究进展 |
| 1 病原 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状 |
| 4 病理变化与发病机制 |
| 5 诊断 |
| 6 治疗 |
| 7 预防 |
| 8 综合防治 |
| 9 展望 |
| 第二章 差异表达基因筛选方法的研究进展 |
| 1 消减杂交技术 |
| 2 mRNA 差异显示技术 |
| 3 cDNA 代表性差异分析法 |
| 4 抑制性差减杂交技术 |
| 5 结语 |
| 第三章 蛋白质的展示技术原理及应用 |
| 1 体内筛选技术 |
| 2 体外展示技术 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细菌形态与染色 |
| 2.2 细菌培养 |
| 2.3 细菌生化特性 |
| 2.4 PCR 鉴定 |
| 2.5 血清型鉴定 |
| 2.6 毒力测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病料中APP 分离 |
| 3.2 APP 混合感染 |
| 3.3 PCR 对APP 的鉴定 |
| 3.4 APP 对小鼠毒力 |
| 4 小结 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌1、5 型毒力测定及交叉免疫保护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 半数致死量测定 |
| 2.2 免疫保护 |
| 3 讨论 |
| 3.1 交叉免疫保护 |
| 3.2 多价疫苗 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪胸膜肺炎放线杆菌1 型与5 型cDNA 差减文库构建及差异基因分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA 制备与纯化 |
| 2.2 cDNA 合成与酶切 |
| 2.3 RDA |
| 2.4 差减文库构建与克隆鉴定 |
| 2.5 差异基因测序、分析 |
| 2.6 southern 杂交 |
| 2.7 差减基因同源序列检索 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于APP 不同血清型的差异基因研究必要性 |
| 3.2 差异表达基因与交叉免疫保护 |
| 3.3 关于差异表达基因的验证 |
| 3.4 探针质量与杂交结果 |
| 3.5 DNA 探针结果和cDNA 探针杂交结果的比较分析 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪胸膜肺炎放线杆菌1 型与5 型基因组DNA 差减文库构建及差异基因分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 DNA 提取与纯化 |
| 2.2 DNA 酶切 |
| 2.3 RDA |
| 2.4 差减文库构建与鉴定 |
| 2.5 差异基因测序与分析 |
| 2.6 Southern 杂交分析 |
| 2.7 基因库同源序列检索 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因组DNA 差减与cDNA 差减 |
| 3.2 RDA 技术的影响因素 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪胸膜肺炎放线杆菌1 型与5 型差异表达基因核糖体展示及免疫应答相关基因筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 核糖体展示用上游引物PCR 合成 |
| 2.2 高免疫血清制备 |
| 2.3 差减基因文库改造 |
| 2.4 核糖体展示文库的构建 |
| 2.5 免疫应答相关基因的筛选 |
| 2.6 免疫应答相关基因的克隆、测序 |
| 2.7 免疫应答相关基因序列分析 |
| 2.8 基因库同源序列检索 |
| 3 讨论 |
| 3.1 核糖体展示技术 |
| 3.2 免疫筛选 |
| 3.3 差减基因与免疫应答相关基因 |
| 4 小结 |
| 第六章 猪胸膜肺炎放线杆菌1 型和5 型基因组差减基因核糖体展示文库构建及型特异免疫应答相关基因的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因组DNA 差异基因改造 |
| 2.2 核糖体展示文库的构建 |
| 2.3 免疫应答相关基因的筛选 |
| 2.4 免疫应答相关基因的克隆、测序 |
| 2.5 免疫应答相关基因序列分析 |
| 2.6 基因库同源序列检索 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因组型特异免疫应答相关基因 |
| 3.2 差异基因与免疫应答相关基因 |
| 4 小结 |
| 第七章 短小棒状杆菌对APP 感染免疫保护研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 血清检测结果 |
| 2.2 脾淋巴活性细胞检测 |
| 2.3 小鼠攻毒 |
| 2.4 病理切片观察 |
| 2.5 小鼠体内APP 的分离 |
| 2.6 小鼠体内APP 检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 CP 免疫与预防APP 感染 |
| 3.2 CP免疫保护的作用方式 |
| 3.3 CP 免疫预防APP 感染的效果 |
| 3.4 APP 1 型、5 型免疫保护机理的推断 |
| 3.5 CP 免疫预防APP 感染的意义 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
四、用琼扩法测定胸膜肺炎嗜血杆菌的血清型（论文参考文献）
- [1]副猪嗜血杆菌（HPS）发酵工艺研究及其疫苗的研制[D]. 孙晨. 南京农业大学, 2019(08)
- [2]四川省部分地区副猪嗜血杆菌的血清型调查及间接ELISA方法的构建[D]. 王正皓. 四川农业大学, 2018(02)
- [3]仔猪大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝检测方法的建立与应用[J]. 刘泽文,田永祥,袁芳艳,刘威,周丹娜,杨克礼. 华中农业大学学报, 2017(03)
- [4]副猪嗜血杆菌群体基因组测序、分子分型和耐药性研究[D]. 马丽娜. 中国农业科学院, 2017(02)
- [5]屠宰生猪肺脏病变及胸膜肺炎病原菌的分离鉴定[D]. 邱渊皓. 西北农林科技大学, 2013(02)
- [6]副猪嗜血杆菌分子流行病学及其OMP-P2基因抗原性与检测技术研究[D]. 李鹏. 南京农业大学, 2011(12)
- [7]猪胸膜肺炎放线杆菌抗体ELISA检测试剂盒的研制及应用[D]. 贾付从. 南京农业大学, 2009(06)
- [8]APP apxIVA基因序列特性及rApxIVA/rTbpB亚单位复合菌苗对小鼠的免疫研究[D]. 杨利. 四川农业大学, 2009(07)
- [9]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫原性分析[D]. 谢碧林. 南京农业大学, 2008(08)
- [10]猪胸膜肺炎放线杆菌差减基因文库构建及免疫应答相关基因筛选[D]. 雷连成. 吉林大学, 2007(03)