一、应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究（论文文献综述）
黄新民,陈琨[1]（1994）在《应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究》文中认为利用鸭胚肝细胞成功地培养了鸭肝炎病毒．并呈现典型ＣＰＥ，向其细胞维持液中加入１％的鸭胚尿囊液，ＣＰＥ的维持时间可延长至６０小时．将该病毒的细胞培养物回归鸭胚和雏鸭，其致病力不见明显减弱．鸭胚中和试验证明，鸭肝炎病毒在鸭胚肝细胞上形成ＣＰＥ的能力能被特异抗血清所中和．
吴培福,张国中,韩博,苏敬良[2]（2009）在《应用鸭胚肝细胞扩增鸭肝炎病毒》文中进行了进一步梳理
刘建[3]（2004）在《鸭肝炎病毒的分离与检测》文中研究说明本实验通过鸭胚尿囊腔接种，对我国几个省市采集的12份死于疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离，获得12个病毒分离株。这些分离株对10日龄鸭胚的致死率为100％，人工感染6日龄雏鸭的致死率为0-100％不等。死亡鸭呈角弓反张姿势，剖检可见肝脏肿大，有出血点或出血斑。将12株分离株经鸭胚传至第5代，收集鸭胚尿囊液毒测定这些毒株的ELD50为10-7.32／0.2ml-10-3.5／0.2ml不等。用鸡抗1型DHV及新型DHV的血清和12株分离株进行中和试验，结果表明：有7株为新型DHV，有2株为1型DHV，还有3株无法确定其血清型。 通过对新型弱毒株（B株）进行鸭胚传代致弱后，稀释成不同倍数对1日龄雏鸭进行免疫，并于10日龄时用新型鸭肝炎强毒攻毒，观察雏鸭的死亡情况。由结果可知，B20株在20倍稀释时，保护率达100％，而稀释到100倍时则完全失去保护作用。同时对免疫的雏鸭采血，中和试验测定血清的效价。免疫雏鸭在第10天时抗体水平达到高峰，然后呈逐渐下降趋势。结果表明，B株经过鸭胚传代致弱后在毒力下降的同时仍保留一定的免疫原性，可以作为疫苗的候选株。 此外，本实验用鸭胚肝细胞（DEL）培养了新型鸭肝炎病毒，并详细观察了鸭肝炎病毒引起的细胞病变，发现该病毒适于鸭胚肝细胞上培养。通过细胞免疫荧光染色，发现肝细胞本身自发荧光，不适于免疫荧光检测；采用感染新型鸭肝炎强毒后死亡鸭的肾细胞做滴片进行荧光染色，可检测到病毒抗原存在，为临床上快速诊断新型鸭病毒性肝炎提供一种检测方法。
张彬[4]（2015）在《DHBV衣壳蛋白靶向核酸酶抗病毒初步研究》文中进行了进一步梳理根据本实验室提交的鸭乙型肝炎病毒（Duck hepatitis B virus, DHBV）CH4株（登录号EU429324）基因的序列信息以及GenBank上金黄色葡萄球菌核酸酶（登录号CP006630.1）的序列信息,设计DHBV衣壳蛋白（Cap）基因和金黄色葡萄球菌核酸酶（SNase）基因的特异性引物。以DHBV病料和金黄色葡萄球菌为模板,对DHBVCH4株Cap基因和金黄色葡萄球菌SNase基因进行PCR扩增。开展了以下研究：1.金黄色葡萄球菌核酸酶基因的原核表达及活性分析利用PCR方法对金黄色葡萄球菌核酸酶SNase基因进行扩增,将SNase基因连接至pGM-T载体并进行酶切鉴定及测序,回收目的基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-32a（+）-SNase,转入大肠杆菌表达菌Rosetta, IPTG诱导表达,收集表达的核酸酶蛋白,同时利用TDA变色法检测该酶的生物学活性。结果表明：成功扩增了SNase基因,大小为468bp,与预期片段大小一致；进一步构建了重组原核表达质粒pET-32a（+）-SNase,转化至表达菌Rosetta,通过IPTG的诱导表达,重组原核表达质粒pET-32a（+）-SNase成功表达分子量大小约为35 KDa核酸酶蛋白；同时检测出表达的重组核酸酶蛋白具有核酸酶活性,为后续实验选择核酸酶作为抗病毒因子奠定了基础。2.鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白与金黄色葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达、活性分析及其抗血清的制备根据实验室提交GenBank的DHBV CH4株（登录号EU429324）完整Cap基因序列和GenBank上金黄色葡萄球菌核酸酶（登录号CP006630.1）的序列,结合重叠延伸PCR原理分别设计引物。以实验室保存DHBV阳性血清提取DNA作为模板,扩增Cap基因,同时提取金黄色葡萄球菌基因组扩增SNase基因,利用融合PCR技术扩增Cap-SNase融合基因：连接到pGM-T载体上,经酶切和测序鉴定后,目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组原核表达质粒pET-32a（+）-Cap-SNase,转入表达菌Rosetta;为了提高融合蛋白表达量,对诱导条件（温度、IPTG浓度、时间）进行优化,经IPTG诱导表达,获的融合表达蛋白；表达重组融合Cap-SNase蛋白经Ni-NTA柱亲和层析纯化,用兔抗鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白多克隆抗体检测纯化的重组融合蛋白,并进一步将纯化的蛋白免疫昆明鼠,制备多克隆抗体；同时TDA变色法检测纯化的融合蛋白是否具有核酸酶蛋白的生物学活性。结果表明,成功扩增融合基因Cap-SNase,大小为1236bp,与预期片段大小一致；构建了重组表达质粒pET-32a（+）-Cap-SNase,转化至表达菌Rosetta,诱导表达蛋白,分子量大小约为60KDa；经过诱导条件的优化,最终确定了蛋白表达的最优条件为：在37℃C、IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L条件下诱导6 h,蛋白表达量达到最高值。重组融合蛋白主要以包涵体的形式存在。亲和层析纯化蛋白条带单一,同时检测表达的融合蛋白仍然具有核酸酶的活性,进一步将纯化的融合蛋白免疫昆明鼠后,成功制备出其多克隆抗体,双向琼脂扩散实验检测抗体滴度为1：8。鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白和金黄色葡萄球菌核酸酶融合蛋白的成功表达且具有核酸酶活性为后续真核表达奠定了理论基础,同时制备的鼠多克隆抗体为后续实验提供了实验素材。3.DHBV衣壳蛋白靶向核酸酶真核表达系统的构建及瞬时表达选择15日龄鸭胚,提取鸭胚肝脏用于培养鸭胚肝细胞；构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Cap-SNase;转染鸭胚肝细胞,收集转染后48 h的鸭胚肝细胞,提取鸭胚肝细胞总RNA,用特异性引物反转录后进行PCR扩增,从核酸水平检测真核表达质粒的表达情况,同时提取鸭胚肝细胞蛋白从蛋白水平检测,通过Western blotting检测Cap-SNase融合蛋白表达情况；检测表达融合蛋白核酸酶的生物学活性。结果表明,成功培养了鸭胚肝细胞,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1 （+）-Cap-SNase;真核表达质粒转染鸭胚肝细胞后,提取转染后鸭胚肝细胞总RNA,能够从核酸水平上检测到真核表达质粒表达转录产生的mRNA;用制备的鼠多克隆抗体作为一抗进行检测,通过Western blotting检测结果显示真核表达质粒在鸭胚肝细胞中成功表达,分子量大约为47 KDa；同时,融合蛋白仍然具有核酸酶的生物学活性。4.应用衣壳蛋白靶向灭活策略抗鸭乙型肝炎病毒感染初步研究根据实验室所构建的pMD18-T-PreS/S质粒,建立荧光定量PCR标准曲线,通过标准曲线计算未知样品中病毒的含量。在体外培养鸭胚肝细胞转染真核表达质粒pcDNA3.1 （+）-Cap-SNase,人工接种鸭乙型肝病毒,收集不同时间点的细胞上清,用于提取细胞上清病毒基因组,荧光定量检测不同时间点细胞上清中病毒的含量,同时设置PBS空对照组和空质粒pcDNA3.1（+）组。荧光定量数据通过SPSS20.0进行统计分析,结果表明：应用质粒pMD18-T-PreS/S质粒成功构建荧光定量PCR标准曲线；荧光定量数据分析结果显示不同实验组不同时间点细胞上清中DHBV含量均没有显着性差异（P>0.05）。
熊文[5]（2018）在《磷酸化修饰增强淫羊藿苷缓解DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞损伤作用及其机制研究》文中提出淫羊藿（Epimedium davidii Franch）为我国传统的补益中草药,具有“益精气,坚筋骨,补腰膝,强心力”之功效。随着近年来对其药理学功能研究的日益深入,人们发现淫羊藿苷（Icariin,ICA）为淫羊藿的主要药理有效成分。诸多临床和实验药理研究表明,ICA具有抗病毒、抗氧化、免疫增强等效果。然而,由于黄酮类成分水溶性较差,在实际临床应用时经常会造成一定的不便。为了提高ICA的生物利用率,更好地发挥其抗病毒效果,便于在临床推广应用,通过混合磷酸盐法成功的对ICA进行了磷酸化修饰,得到磷酸化淫羊藿苷（phosphated Icariin,pICA）。在本项目组前期的试验中,我们发现感染1型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV-1）可以导致雏鸭发生严重的肝损伤,且这种肝损伤与其体内严重的氧化应激存在显着的相关性,这说明DHAV-1感染雏鸭引起的炎症损伤与氧化应激损伤有着密切联系,当引入ICA与pICA治疗之后,雏鸭体内炎症因子水平显着下降、抗氧化酶活性明显提升,最终存活率得到显着提升,表现出良好的治疗效果,这种疗效可能与ICA与pICA的抗炎症作用及抗氧化应激作用有关。但上述研究仅局限于整体动物水平,其中的分子机制仍不清楚。因此,为了更深入的探究ICA与pICA的抗DHAV-1机理,验证之前在体内试验中的猜测,本文在体外鸭胚肝细胞（Duck embryonic hepatocytes,DEHs）上研究了 ICA与pICA对DHAV-1引起的炎症反应、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡及细胞增殖的影响。本试验分为以下六个部分:试验Ⅰ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs炎症反应作用的研究本试验旨在研究DHAV-1诱导DEHs产生炎症反应的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先采用ELISA和q-PCR检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及其基因mRNA表达水平,之后用q-PCR和WB法检测了受炎症反应影响的NF-κB途径中的关键调控节点如TLR家族关键因子（TLR 2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、Myd88）的基因 mRNA 表达水平及对 TLR2、TLR 4、Myd88及NF-κB p65蛋白表达水平的影响。结果显示感染DHAV-1后DEHs分泌的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量显着升高,相关基因mRNA表达结果亦证实了这一现象,同时 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、Myd88 基因 mRNA 表达及 TLR 2、TLR4、Myd88蛋白表达亦显着增强,促进了 NF-κBp65蛋白磷酸化。而加入ICA和pICA后则显着降低了炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及基因mRNA表达,降低了 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR 7、Myd88 基因 mRNA 表达及 TLR 2、TLR 4、Myd88蛋白表达同时抑制了 NF-κB p65蛋白磷酸化。说明DHAV-1可以通过TLR从Myd88依赖型和非Myd88依赖型两种途径激活NF-κB通路,最终引起细胞的炎症反应。ICA与pICA则可以降低上述指标,通过降低机体炎症程度来起到治疗作用。同时相比较于ICA,pICA更能缓解炎症反应。试验Ⅱ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs氧化应激作用的研究本试验旨在研究ICA与pICA对DHAV-1诱导DEHs发生氧化应激的缓解效果。首先通过ELISA检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的氧化应激相关指标SOD、MDA、CAT、GSH和GSH-Px,之后通过加入H2O2这一促氧化剂（分为先加入DHAV-1后加入H2O2和先加入H2O2后加入DHAV-1两种方式）来反向干预验证ICA与pICA的抗氧化作用,最后用Reed-Muench法检测了 H2O2干预前和干预后,ICA与pICA对病毒本身毒力有无影响。试验结果显示,DHAV-1处理后DEHs的MDA含量显着上升而SOD、CAT、GSH、GSH-Px活性显着下降,ICA与pICA则可以降低DEHs的MDA含量,增加SOD、CAT、GSH、GSH-Px活性。在两种不同顺序干预方式中,加入H2O2后的干预实验组抗病毒效果均低于未加入H2O2干预的对照组,同时干预前后,ICA与pICA组病毒TCID50均小于VC组,而H2O2干预后的各组TCID50又一一大于干预前各组TCID50。本章试验说明ICA与pICA在体外可以通过降低MDA含量、提高相关抗氧化酶活性来起到抗氧化作用,而H2O2的干预试验反向证明了在体外ICA与pICA的抗氧化作用对于抗DHAV-1来说是必需的,此外,相比于ICA,pICA更能显着提高SOD与GSH-Px等抗氧化酶的酶活性。试验Ⅲ ICA与pICA对DHAV-1诱导的DEHs氧化应激的调控机制本试验旨在研究ICA与pICA缓解DHAV-1在体外造成DEHs氧化应激的具体调控机制。首先用WB法检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的SOD和GSH-Px的蛋白表达,之后用q-PCR法检测了抗氧化应激相关因子Nrf2、NQO1、HO-1、GST、GCLC和GCLM基因mRNA表达,最后用WB法检测了 MAPKs信号通路相关ERK1/2、JNK、p38蛋白表达。试验结果显示,pICA的SOD与GSH-Px蛋白丰度显着高于 ICA,而感染 DHAV-1 的 DEHs 中 Nrf2、NQO1、HO-1、GST、GCLC 和GCLM基因mRNA表达均显着降低,而加入ICA与pICA后Nrf2、NQO1、HO-1、GST、GCLC和GCLM基因mRNA表达均有一定回升,其中pICA组GST和GCLC基因mRNA表达显着高于ICA组而ICA组GCLM基因mRNA表达显着高于pICA组。MAPKs信号通路相关蛋白结果显示感染DHAV-1后DEHs中ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化显着升高而ICA和pICA可以显着降低ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化,同时pICA组还显着低于ICA组。本章试验说明DHAV-1可以显着降低Nrf2基因mRNA表达从而抑制下游NQO1、GST、HO-1、GCLC及GCLM基因mRNA表达,造成严重的氧化应激损伤,而ICA与pICA则可以通过提高上游Nrf2基因mRNA表达从而提高下游NQO1、GST、HO-1、GCLC及GCLM基因mRNA表达来起到抗氧化作用。DHAV-1还可以促进MAPKs信号通路中ERK1/2、JNK和p38的蛋白磷酸化而pICA比ICA可以更显着的抑制ERK1/2、JNK和p38的蛋白磷酸化,这说明ICA与pICA不仅可以通过提高机体抗氧化活性来抵御病毒,也有可能通过影响MAPKs介导的其他途径如炎症、细胞凋亡、细胞增殖等来起到抗病毒作用,而pICA的抗氧化性更优于ICA。试验Ⅳ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导的DEHs线粒体损伤的作用研究本试验旨在研究DHAV-1造成DEHs线粒体损伤的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先通过流式细胞仪检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的线粒体膜电势、线粒体内ROS水平及Ca2+浓度,之后检测了 COX和SDH的酶活,最后通过化学发光检测仪检测了 ATP的含量。试验结果显示DHAV-1可以显着降低线粒体膜电势,升高线粒体内ROS水平和Ca2+浓度,同时抑制COX和SDH的酶活,导致ATP含量显着下降。而加入ICA与pICA作用后,可以维持线粒体膜电势稳定,降低线粒体内ROS水平,降低Ca2+浓度,同时提高COX和SDH的酶活,维持ATP的稳定生成。这说明DHAV-1可以通过氧化应激来破坏线粒体膜通透性来改变线粒体结构,抑制线粒体呼吸链酶活性,从而降低ATP生成来起到致病作用,而ICA和pICA可以通过维持线粒体氧化呼吸链和三羧酸循环等内部功能的稳定来抵御DHAV-1对线粒体的损伤。此外,pICA对线粒体功能的保护性更优于ICA。试验Ⅴ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs细胞凋亡作用的研究本试验旨在研究DHAV-1诱导DEHs细胞凋亡的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先通过流式细胞仪观察感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的细胞凋亡情况,之后通过q-PCR法比较了 DHAV-1、ICA和pICA对相关凋亡因子如Caspase家族（Caspase 3、Caspase 8、Caspase9）和 Bcl-2 家族（Bcl-2、Bax）基因 mRNA 表达的影响,最后通过WB法比较了 DHAV-1、ICA和pICA对Caspase 3、Caspase 8蛋白表达的影响。试验结果显示感染DHAV-1后DEHs的细胞凋亡率显着升高,同时Bcl-2基因mRNA表达显着下降,Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的基因mRNA表达显着上升,Caspase3、Caspase 8蛋白表达显着上升。加入ICA与pICA后,DEHs的细胞凋亡率显着下降,Bcl-2 基因 mRNA 表达显着上升,Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的基因mRNA表达显着下降,Caspase 3、Caspase 8蛋白表达显着下降。这说明DHAV-1可以通过上调Bax基因mRNA表达和下调Bcl-2基因mRNA表达,最终上调凋亡启动因子Caspase 8、Caspase 9和凋亡执行因子Caspase 3来促进DEHs细胞凋亡。而ICA与pICA可以通过升高Bcl-2/Bax比值来抑制线粒体孔道生成、抑制下游凋亡相关因子Caspase8、Caspase9和Caspase3来起到抑制细胞凋亡的治疗效果。此外,相比较于ICA,pICA能更好得抑制DHAV-1诱导的细胞凋亡。试验VIICA与pICA缓解DHAV-1抑制DEHs细胞增殖作用的研究本试验旨在研究DHAV-1抑制DEHs细胞增殖的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先通过流式细胞仪观察感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的细胞周期情况,之后通过q-PCR法和WB法比较了 DHAV-1、ICA和pICA对相关增殖因子CCND1和PCNA的基因mRNA表达及PCNA的蛋白表达的影响,最后通过WB法观察了对细胞增殖相关通路关键蛋白AKT和CREB的影响。试验结果显示显示感染DHAV-1后DEHs的细胞周期G0/G1期显着升高而S+G2/M期显着下降,CCND1基因mRNA和PCNA基因mRNA表达及蛋白表达显着下降,AKT及CREB蛋白磷酸化被抑制,而加入ICA和pICA后则可以降低G0/G1期比率升高S+G2/M期比率,提高CCND1和PCNA的基因mRNA表达及PCNA蛋白表达,提高AKT及CREB的蛋白磷酸化。这说明DHAV-1可以通过抑制AKT磷酸化从而抑制下游CREB蛋白磷酸化,进而影响CCND1和PCNA的表达,从而降低S+G2/M期细胞比率,使细胞周期的G1/G0期陷入阻滞并最终抑制细胞增殖。而ICA与pICA则可以通过激活AKT及使CREB磷酸化,提高CCND1和PCNA的表达,使DNA可以正常合成,从而加强细胞增殖。此外,相比于ICA,pICA能更好的拮抗DHAV-1对AKT蛋白磷酸化的抑制。最后通过Spearman相关性分析得出炎症损伤、氧化应激损伤、线粒体损伤、细胞凋亡及细胞增殖间存在强相关性,说明DHAV-1诱导的肝细胞损伤确实与这些途径有着密切联系。
姚方珂[6]（2018）在《几种中药成分及修饰物体外抗鸭肝炎病毒增殖作用的研究》文中进行了进一步梳理鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒DHAV引起的一种急性、传播迅速、高发病率和高度致死性传染病,给养鸭业带来了巨大的经济损失。目前,市场上的抗DHAV药物存在较多不足,研发新的抗DHAV药物对鸭病毒性肝炎的防治极其重要。本课题通过MTT法,初步比较筛选出体外具有良好抗DHAV-1作用的中药成分。同时,根据DHAV-1 VP1基因相对表达的动态变化,分析了 DHAV-1的复制周期,并研究了槲皮素和黄芩苷对DHAV-1复制周期的影响。再根据药物的特性和抗病毒活性,对栀子苷进行磷酸化修饰,对槲皮素进行磷脂复合物合成,比较了修饰前后其抗病毒作用。上述研究,可以为鸭肝炎病毒的防控和治疗提供参考资料,也为今后抗病毒药物的研发奠定基础。试验Ⅰ:几种中药成分抗鸭肝炎病毒作用的比较本试验旨在初步比较筛选出具有良好抗DHAV-1作用的中药成分,为后续的试验奠定基础。在本试验中,通过MTT法测得7种中药成分的安全浓度和其体外抗DHAV-1的效果。结果表明,槲皮素和黄芩苷表现出较好的抗DHAV-1作用,其最高的病毒抑制率分别为185.86%和146.37%,木犀草素、高良姜素和橙皮素表现出一般的抗病毒作用,其最高的病毒抑制率分别为71.06%、69.23%、65.67%,而柚皮素的抗病毒作用最差,其最高的病毒抑制率为15.03%。综合评价以槲皮素和黄芩苷、栀子苷效果较好。试验Ⅱ:槲皮素和黄芩苷对DHAV-1体外复制周期的影响本试验旨在探索在DHAV-1复制周期中,槲皮素和黄芩苷体外抗病毒的作用和机制,为鸭肝炎病毒的防控和治疗提供参考资料。本试验中,通过实时荧光定量PCR检测在复制周期中DHAV-1 VPI基因相对表达的动态变化,并通过电子显微镜观察病毒吸附鸭胚肝细胞的形态。基于复制周期的研究,通过设置槲皮素和黄芩香作用的不同时间段,采用实时荧光定量PCR检-测在吸附、复制、释放三个过程中病毒基因相对表达水平。结果表明,DHAV-1在感染90 min后吸附完成,电镜下可见吸附在细胞表面的病毒颗粒。经过约5 h的早期蛋白合成阶段,病毒的复制持续约13 h。而且,DHAV-1的释放在32 h后达到稳定状态。槲皮素和黄芩苷在体外均可以表现出较好的抗DHAV作用,它们不仅可以降低病毒产生的细胞病变,还可以影响病毒的增殖,其中,槲皮素能显着降低复制过程中病毒VP1基因的表达,因而对病毒的复制阶段有抑制作用,具有一定的特异性,而黄芩苷则能显着降低复制和释放过程中病毒VP1基因的表达,对病毒的复制和释放均有抑制作用,范围更加广泛。试验Ⅲ:栀子香磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物的制备及其抗DHAV-1作用本试验旨通过结构修饰,改善栀子苷和槲皮素在生物活性和生物有效性方面的不足,为抗鸭肝炎病毒的药物研发提供资料。在本试验中,通过三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法对栀子苷进行磷酸化修饰,以提高其抗病毒活性;通过溶剂法对树皮素进行磷脂复合物合成,以提高其生物有效性。同时,采用红外光谱、质谱分析等,对两种修饰物进行了鉴定。此外,还通过MTT法和荧光定量PCR检测并比较了两种修饰物的抗病毒活性。结果表明,成功获得了栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物。其中,栀子苷磷酸化修饰的最佳条件是:pH为8.5,反应温度为70℃,反应时间为4h,而且修饰物中有一个磷酸基团取代了栀子苷的羟基,经过磷酸化修饰后,栀子苷的病毒抑制率从52.63%提高至73.09%,VP1基因表达量显着降低至0.411,其抗病毒活性得到了提高。槲皮素磷脂复合物是与槲皮素和大豆卵磷脂完全不同的一种新物质,它能够在较低的浓度表现出较好的病毒抑制率和抑制病毒VP1基因表达的活性,因而槲皮素磷脂复合物不仅保留了槲皮素较好的抗DHAV-1的生物活性,还具有更好的生物有效性。
贾袁媛[7]（2013）在《鸭胚原代肝细胞抗乙肝模型的建立及应用》文中研究指明乙型肝炎是一种世界范围内流行的严重传染病，目前尚无根治的特效药物和方法。由于乙肝病毒（HBV）宿主范围窄，建立细胞及动物模型比较困难，大大限制了抗HBV药物的发展。因此，建立一种简便、有效的乙肝模型对于深入研究肝炎的发病机制和开发新型抗乙肝药物具有重要意义。本课题以绍兴麻鸭受精卵孵化的感染鸭胚为原材料，探索了鸭胚肝细胞的分离及原代培养技术，建立了基于鸭胚原代肝细胞的鸭乙肝病毒（DHBV）DNA的荧光定量PCR检测方法，并利用建立的鸭胚原代肝细胞模型研究了几种天然提取物的抗乙肝活性，从而验证了该模型的特异性、灵敏性和可行性。1.鸭胚肝细胞的分离及原代培养采用绍兴麻鸭受精卵孵化的鸭胚作为材料，首先利用普通PCR技术筛选出先天感染阳性鸭胚，然后以先天阳性鸭胚为基础进行细胞模型的构建。具体是通过以下几方面条件的优化：（1）鸭胚胚龄的选择：选择15、16、17、18、19、20、21、22、23、24日的鸭胚进行比较，结果表明18-22日龄的鸭胚效果较好；（2）胰酶消化液浓度及时间的选择：选择浓度为0.15%，0.25%，0.35%，消化时间分别为5min、10min、15min进行比较，结果表明浓度为0.25%的胰酶浓度，消化时间10min时，效果最佳；（3）离心转速大小的选择：选择1000r、3000r、5000r、7000r的转速进行比较，结果表明3000r或5000r效果较好；（4）胎牛血清的浓度选择：选择胎牛血清的浓度为5%、10%、15%、20%进行比较，结果表明血清浓度为10%时即可满足原代细胞培养需要；（5）进口血清和国产血清的选择：选择GIBCOTM的血清与国产四季青血清进行对比，在培养24h、48h、72h、96h、120h分别进行观察，结果表明国产血清与进口血清的生长情况没有大的差别，出于经济考虑选择国产血清；（6）冰浴时间的选择：分别选择5min、10min、15min、20min、25min的冰浴时间，结果表明冰浴时间选择15min或20min，细胞生长情况较好；（7）培养基的选择：选择RPMI Medium1640和DMEM两种培养基进行对比，结果表明两种培养基在进行原代培养时差别不大；（8）生长因子的选择：选择胰岛素和氢化可的松琥珀酸氢钠两种生长因子分别进行添加和共同添加，结果表明在两种生长因子共同添加的时候效果最好；（9）细胞接种密度的选择：选择2×105copies.mL-1，4×105copies.mL-1，6×105copies.mL-1，8×105copies.mL-1，10×105copies.mL-1五种密度进行比较，结果表明（4-8）×105copies.mL-1的密度时细胞生长较好。通过对鸭胚肝细胞分离和原代培养条件的摸索和优化，确立了鸭胚肝细胞的原代培养方法和最优参数，为抗乙肝药物评价模型的建立打下了基础。2.鸭胚肝细胞中鸭乙肝病毒DNA定量检测方法的建立为了建立准确、快速、特异的DHBV-DNA SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，我们采用了一对跨越DHBV基因组正负两链的特异性引物，并且将DHBV基因组扩增产物克隆到了PMD-18T载体上，然后以该重组质粒为模板进行梯度稀释，构建标准曲线，进行了特异性、灵敏性、重复性分析。结果表明，建立的方法可以特异性定量检测DHBV-DNA，在1.0×102-1.0×108copies·μL-1范围内具有较好的线性关系，扩增效率为103.8%，相关系数r2为0.995，灵敏度为1.0×102copies·μL-1，重复性检验差异最大系数为3.03%。因此，建立的荧光定量PCR检测方法具有特异性、灵敏性、准确性等优点，完全可以用于DHBV-DNA的定量检测和抗乙肝病毒药物的筛选与评价。3．基于鸭胚肝细胞模型的天然产物抗乙肝活性评价采用已建立的基于鸭胚原代肝细胞的抗乙肝药物评价模型，以拉米夫定作为阳性对照药物，研究3种天然提取物对DHBV-DNA复制的影响，以验证模型的可靠性。结果表明：（1）蒲公英提取物处理鸭胚肝细胞后，对感染肝细胞DHBV-DNA复制具有不同程度抑制作用，且随着时间延长，抑制作用逐渐增强。在作用3天后，50-100μg/ml剂量对DHBV-DNA具有显着抑制作用（P<0.01），在作用6天后，1-100μg/ml剂量对DHBV-DNA均有显着抑制作用（P<0.01），且100μg/ml剂量的抑制作用优于药物拉米夫定。（2）菊苣酸作用鸭胚肝细胞3天后，25-100μg/ml剂量显着降低了DHBV-DNA水平（P<0.01），在作用6天后，1-100μg/ml剂量显着降低了DHBV-DNA水平（P<0.01）。（3）齐墩果酸作用鸭胚肝细胞3天后，10-100μg/ml剂量显着抑制了DHBV-DNA复制（P<0.01），在作用6天后，1-100μg/ml剂量显着抑制了DHBV-DNA复制（P<0.01）。总之，本论文以鸭胚原代肝细胞为基础，研究了鸭胚肝细胞中DHBV-DNA的荧光定量PCR检测方法，建立了一种基于鸭胚原代肝细胞的抗乙肝药物评价模型，并运用此模型开展了几种天然产物的抗乙肝作用研究。该模型的建立为今后深入研究乙肝的发病机制和筛选新型抗乙肝药物提供了有力的工具。
翁瑞文[8]（2007）在《DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用》文中研究指明目前全世界大约有4亿人感染了乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV），每年因此有30万人成为肝癌患者，每年因HBV感染而死亡的人数为50—120万；全世界有1／3的人在其一生中会感染上HBV，HBV慢性感染率从2％—20％不等，对于HBV的研究一直是热点问题。DHBV与HBV同属嗜肝DNA病毒科，DHBV与HBV在复制形式、致病机理等方面有着众多的相似之处，所以鸭乙肝模型一直被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的动物模型；多年来对于DHBV检测一直采用斑点杂交，该方法具有可进行大规模检测、价格便宜等优势，但精确性不高；而且目前鸭乙肝模型评价药效一般给药10天，这对于药效温和的中药抑制DHBV作用评价则时间太短，且斑点杂交精确性也不高；鸭胚肝细胞模型一直在国外被认为是唯一一类病毒直接感染、复制的原代细胞模型，很受重视。而其培养上清中的DHBV变化要用斑点杂交进行评价则很困难，且不准确。因此本研究建立了DHBV体内外模型的定量评价体系，并用该评价体系对中药复方的抑制DHBV作用进行了评价。1通过对Genbank中所公布的所有DHBV全基因序列进行对比，找出保守序列，设计了DHBV荧光定量PCR引物和探针，并构建了包含该套引物探针靶序列的DHBV荧光定量PCR标准品质粒。用探针检测标准品后表明，该方法在8个浓度梯度范围具有良好的线性关系，能够很好的检测最高2×107—2copy／25μL反应体系。批内差异最大只有2.03％，批间最大变异系数仅为2.47％。2通过对NP-40提取法、辛酸钠提取法和达晖生物公司的血清病毒DNA提取试剂盒的对比，最终表明了辛酸钠法与达晖生物试剂盒提取效果相似，NP—40法效果较差。辛酸钠法是适合于DHBV荧光定量PCR标本提取的高效、经济的方法。3用普通PCR方法对100只1日龄广东麻鸭进行DHBV阳性筛选，用筛选所得先天感染DHBV的鸭作为模型动物对扶正利湿活血复方水煎剂进行抑制DHBV效果评价，共给药1个月，分别于开始给药当天（D0）、给药第10天（D10）、给药第20天（D20）、给药第30天（D30）及停药第5天（P5）采集血清，用荧光定量PCR法进行检测，结果表明，扶正利湿活血复方高、低剂量组在给药后第10、20、30天时均可使先天感染鸭乙肝模型血清DHBV载量明显降低，停药5天后也有一定抑制作用。4分别对DHBV先天感染和后天感染的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV在载量动态变化进行检测，结果表明，先天感染的鸭胚肝细胞中，细胞接种后第1天上清中的病毒含量最高，第2天则有所下降，随后逐渐上升，至第6天后达到稳定波动，但都达不到第一天的水平。但是先天感染DHBV鸭胚肝细胞上清中DHBV载量都在108内波动。因此较为稳定。在后天DHBV感染的鸭胚肝细胞中，DHBV感染时间是在细胞长成单层以后，但其上清中仍然出现了DHBV感染后第一天DHBV载量最高，第二天大幅下降，第三天逐步上升，一直至DHBV感染后第11天达到最高值。这与以前用斑点杂交检测认为DHBV感染后第六天培养上清中的DHBV达到高峰明显不同。但后天感染DHBV的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量波动幅度较大，波动范围为1e5—1e8copy／ml之间。本研究分别以20ul、50ul、100ulDHBV阳性血清感染鸭胚肝细胞，这三种DHBV感染剂量均在第11天时DHBV达到高峰，DHBV含量只在感染后前2天有明显差别，随后均无明显区别。5用先天感染DHBV的鸭胚肝细胞对扶正利湿活血复方的水提物和醇提物进行抑制DHBV药效评价，共给药5天，结果表明，扶正利湿活血复方水提物3个剂量组均无明显抑制鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV作用，而其醇提物则显示明显抑制作用，这表明扶正利湿活血复方水煎剂在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。扶正利湿活血复方醇提物显示了明显抑制鸭胚肝细胞培养上清中DHBV的作用，说明醇提物中的成分不同于水提物，其中可能含有直接抑制DHBV作用的物质，值得进一步研究。本文完整的建立了荧光定量PCR检测DHBV的方法，使DHBV检测敏感性、精确性大大提高；建立了经济而精确高效的血清DHBV提取方法，整合于DHBV定量PCR方法中，使DHBV定量检测可以经济而精确的大规模应用。首次将鸭乙肝动物模型给药时间延长至1月，使之更适合于中药抑制HBV药效评价；首次用荧光定量PCR方法检测了先天感染、后天感染DHBV的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化，并表明先天感染鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量变化在一个数量级之内，比后天感染更适合于抗HBV药效体外评价。通过这些建立了抗DHBV药效体内外定量评价体系，在抗HBV药物体内外模型研究方面作出了创新性工作，提高了模型的精确性、敏感性。本文还利用建立的抗DHBV药效体内外定量评价体系评价了中药扶正利湿活血复方的抑制DHBV作用，表明该复方水煎剂在给药1月内在体内能够明显降低血清中的DHBV载量；体外在上药5天内，水提物3个剂量均无明显抑制DHBV作用，而醇提物3个剂量均有一定抑制DHBV作用。说明水煎剂体内抑制DHBV可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。本文DHBV定量评价体系如再建立DHBVcccDNA定量检测方法则更加全面；扶正利湿活血复方的抑制DHBV效果仍需要更多重复以确定其效果。
张建坡[9]（2014）在《新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及生物学特性分析》文中认为鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起的雏鸭的一种烈性传染病。该病主要危害雏鸭，年龄越小死亡率越高。临床表现角弓反张，病理变化主要是肝炎和出血。该病呈世界流行，是目前危害养鸭业重要的传染病之一。该病主要病原是是禽甲型肝炎病毒（DHAV）。主要包含传统的DHAV-1型和台湾新型DHAV-2和韩国新型DHAV-3三型。中国的新型鸭肝炎病毒与韩国新型之间核苷酸同源性最高，氨基酸最为相似。目前新型鸭肝炎病毒的防治是中国养鸭业的当务之急，新型鸭肝炎病毒与传统DHAV-1病毒在血清学上不存在交叉保护作用，用传统的DHAV-1弱毒疫苗或卵黄抗体来防治鸭病毒性肝炎存在很大漏洞，也是目前该病防制上的一个最关键的问题。1.本研究在临床实习中采集病料，从中分离到新型鸭肝炎病毒，并通过RT-PCR检测和动物回归实验等进行了鉴定。2.制备鸭胚肝肾原代细胞培养模型。通过病毒接毒传代实验来检测病毒在细胞上能否稳定增殖并观察是否产生病变，以此对该病毒的细胞适应性等部分生物学特性进行分析。通过研究发现，传统Ⅰ型鸭肝炎病毒能在鸭胚原代肝肾细胞上增殖并产生病变，而新型鸭肝炎病毒不能在鸭胚原代肝肾细胞上稳定增殖和也不能产生病变。通过病毒在鸭胚尿囊腔的增殖和主要结构蛋白VP1的分析，为后期建立快速酶免诊断方法奠定基础。结合其生物学特性分析，为该病的防制提供理论依据。
彭广东[10]（2007）在《鸭肿头败血症病毒XD株的鸭胚原代细胞培养特性及免疫电镜观察研究》文中提出鸭肿头败血症病毒（Duck Swollen Head Septicemia Virus，DSHSV），隶属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，鸭肿头败血症病毒呈球形，大小约65～80nm，无囊膜，该病毒核酸类型为双链RNA，基因组大于19Kbp。该病2002年首次报道，主要以病鸭头部肿大，全身弥漫性出血为特征。本试验通过对鸭胚日龄，胰酶浓度和营养液小牛血清浓度的选择，经过反复试验，采用14日龄鸭胚，经0.125％胰酶消化15～20min，使用含15％小牛血清的营养液成功培养鸭胚肝细胞，采用20日龄鸭胚，经0.25％胰酶消化5～10min，使用含20％小牛血清的营养液成功培养鸭胚肾细胞。通过鸭肿头败血症病毒（DSHSV）在鸭胚成纤维细胞，鸭胚肝细胞，鸭胚肾细胞上的培养特性观察，发现鸭肿头败血症病毒在鸭胚成纤维细胞和鸭胚肾细胞上不生长，病毒首次接种于鸭胚肝细胞上，24h开始出现细胞病变效应（CPE），48h细胞病变达一半以上，随着在鸭胚肝细胞上继续传代，能稳定的出现一致的细胞病变，同时病变时间开始提前，细胞在接毒后8h开始出现细胞病变效应，几乎所有的细胞都可见明显的细胞病变，主要表现为细胞界限变清晰，胞核肿胀，胞内颗粒增多，16h原肿胀且颗粒增多的细胞出现明显的脱落，并且漂浮在细胞培养液中，脱落细胞约占50％。由于周边细胞脱落，未脱落细胞占据原飘落细胞的位置，使得单个细胞体积变大，细胞间隙增宽，接种24h后原致密的单层肝细胞因为病变细胞脱落而产生大量的空斑，细胞脱落约75％。病毒液中悬浮大量散在的脱落细胞。经纯化的鸭肿头败血症毒添加弗氏佐剂后，制备兔抗鸭肿头败血症病毒血清，处理后的鸭肿头败血症肝细胞毒和该血清做免疫电镜观察，观察到大小约65～70nm的球形鸭肿头败血症病毒粒子，另外通过鸭胚肝细胞毒回归鸭胚，发现整个胚体及头部出血，呈“红胚”，喙严重变型。通过免疫电镜观察和鸭胚回归实验证明在鸭胚肝细胞上的细胞病变为鸭肿头败血症病毒引起。
二、应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究（论文提纲范文）
（2）应用鸭胚肝细胞扩增鸭肝炎病毒（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 鸭胚肝细胞培养 |
| 1.3 病毒复苏 |
| 1.4 鸭胚肝细胞感染 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸭胚肝细胞单层生长状态 |
| 2.2 感染细胞病变 |
| 2.2.1 不同毒株在北京鸭鸭胚肝细胞上引起的病变 |
| 2.2.2 不同毒株在樱桃谷鸭鸭胚上引起的病变 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸭胚肝细胞培养 |
| 3.1.1 鸭胚日龄的选择 |
| 3.1.2 血清浓度的选择 |
| 3.1.3 接种浓度的选择 |
| 3.1.4 细胞换液 |
| 3.2 鸭胚肝细胞攻毒 |
（3）鸭肝炎病毒的分离与检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 型鸭肝炎(Duck Hepatitis Type 1) |
| 2.2 型鸭肝炎(Duck Hepatitis Type 2) |
| 3.3 型鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Type 3) |
| 4 新型鸭肝炎病毒 |
| 第二章 雏鸭肝炎病毒的分离及中和鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 第三章 新型鸭肝炎病毒在鸭胚肝细胞上的培养及检测方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法: |
| 3 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 1 关于病毒的分离 |
| 2 中和试验 |
| 3 鸭胚肝细胞的培养 |
| 4 关于病毒的细胞培养及鸭胚回归试验 |
| 5 关于新型鸭肝炎病毒抗原检测 |
| 6 动物保护试验 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）DHBV衣壳蛋白靶向核酸酶抗病毒初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一章 金黄色葡萄球菌核酸酶基因原核表达及活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、质粒和试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌基因组的提取 |
| 1.2.3 金黄色葡萄球菌核酸酶基因的扩增 |
| 1.2.4 感受态细胞DH5α的制备 |
| 1.2.5 重组质粒pGM-T-SNase的构建及鉴定 |
| 1.2.6 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.7 重组融合蛋白pET-32a(+)-SNase的诱导表达 |
| 1.2.8 核酸酶活性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌SNase基因的扩增 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌SNase基因的T克隆质粒鉴定 |
| 2.3 金黄色葡萄球菌SNase基因原核表达质粒的鉴定 |
| 2.4 SDS-PAGE分析 |
| 2.5 重组表达蛋白核酸酶活性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 DHBV衣壳蛋白与金黄色葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达、活性分析及其抗血清的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、质粒和试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌基因组的提取 |
| 1.2.3 鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白与金黄色葡萄球菌核酸酶融合基因的扩增 |
| 1.2.4 重组质粒pGM-T-Cap-SNase的构建 |
| 1.2.5 原核表达质粒的构建 |
| 1.2.6 重组融合蛋白pET-32a(+)-Cap-SNase的诱导表达、鉴定和纯化 |
| 1.2.7 重组融合蛋白的纯化 |
| 1.2.8 融合蛋白核酸酶活性检测 |
| 1.2.9 多克隆抗体制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸭乙型肝炎病毒Cap基因与金黄色葡萄球菌SNase基因融合基因的扩增 |
| 2.2 重组原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.3 融合蛋白Cap-SNase在大肠杆菌中的表达 |
| 2.4 融合蛋白诱导条件的优化 |
| 2.5 融合蛋白的纯化以及Western blotting分析 |
| 2.6 融合蛋白核酸酶活性分析 |
| 2.7 多克隆抗体的制备 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白靶向核酸酶真核表达质粒的构建及瞬时表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、质粒和试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 重组真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.3 重组表达载体pcDNA3.1(+)-Cap-SNase质粒的大量提取 |
| 1.2.4 鸭胚肝原代细胞的培养 |
| 1.2.5 重组表达质粒转染 |
| 1.2.6 真核表达融合蛋白的鉴定 |
| 1.2.7 核酸酶活性的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2 鸭胚肝细胞的培养 |
| 2.3 转染鸭胚肝细胞表达融合蛋白的鉴定 |
| 2.4 表达融合蛋白核酸酶活性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 应用衣壳蛋白靶向灭活策略抗鸭乙型肝炎病毒感染初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、质粒和试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标准品质粒的制备与荧光定量引物的设计 |
| 1.2.2 实时荧光定量PCR反应条件的优化以及标准曲线的构建 |
| 1.2.3 荧光定量检测抗病毒效果 |
| 1.2.4 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 实时荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2 标准曲线的构建 |
| 2.3 荧光定量检测对DHBV增殖的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间完成的学术论文目录 |
（5）磷酸化修饰增强淫羊藿苷缓解DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞损伤作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 绪论 |
| 文献综述 |
| 第一章 1型鸭肝炎病毒研究进展 |
| 1 DHAV的分类及其导致的鸭病毒性肝炎流行病学和临床症状 |
| 1.1 DHAV的分类 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 致病机理 |
| 2 诊断方法 |
| 2.1 中和实验 |
| 2.2 电镜检测 |
| 2.3 酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 2.4 分子生物学诊断 |
| 2.5 其他诊断方法 |
| 3 防治措施 |
| 3.1 预防手段 |
| 3.2 治疗措施 |
| 参考文献 |
| 第二章 淫羊藿苷和化学修饰的研究进展及其抗DHAV-1的前期研究 |
| 1 淫羊藿苷的研究进展 |
| 1.1 淫羊藿的分布及主要活性成分 |
| 1.2 ICA的药理作用 |
| 1.3 ICA在兽医方面的应用 |
| 2 化学修饰的研究进展 |
| 3 ICA与其化学修饰产物抗DHAV-1的前期研究 |
| 3.1 ICA的磷酸化修饰 |
| 3.2 ICA与pICA抗DHAV-1所致雏鸭肝损伤研究 |
| 3.3 ICA和pICA抗DHAV-1造成的雏鸭氧化应激作用 |
| 3.4 ICA和pICA抗DHAV-1感染鸭胚肝细胞及增殖的作用 |
| 3.5 ICA和pICA免疫增强作用研究 |
| 3.6 ICA与pICA抗DHAV-1感染雏鸭的前期研究总结 |
| 4 本试验研究目的 |
| 参考文献 |
| 试验研究 |
| 第三章 ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs炎症反应作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸭胚肝细胞(Duck embryonic hepatocytes,DEHs)的制备 |
| 1.5 ICA与pICA对DEHs分泌炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的影响 |
| 1.6 ICA与pICA对炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α基因mRNA表达的影响 |
| 1.7 ICA与pICA对TLR家族相关因子基因mRNA表达的影响 |
| 1.8 ICA与pICA对TLR家族及NF-κB相关蛋白表达的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ICA与pICA对DEHs分泌炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的影响 |
| 2.2 ICA与pICA对炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α基因mRNA表达的影响 |
| 2.3 ICA与pICA对TLR家族相关因子基因mRNA表达的影响 |
| 2.4 ICA与pICA对TLR家族及NF-κB相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs氧化应激作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 DEHs的制备 |
| 1.5 ICA与pICA对DHAV-1感染鸭胚肝细胞氧化应激相关指标的影响 |
| 1.6 H_2O_2致DEHs氧化损伤的有效浓度筛选 |
| 1.7 ICA与pICA对H_2O_2诱导的氧化损伤DEHs抗DHAV-1感染的能力的影响 |
| 1.8 H_2O_2诱导的氧化损伤对DHAV-1感染鸭胚肝细胞毒力的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ICA与pICA对DHAV-1感染鸭胚肝细胞氧化应激相关指标的影响 |
| 2.2 H_2O_2诱导DEHs氧化损伤有效浓度筛选结果 |
| 2.3 ICA与pICA对H_2O_2诱导的氧化损伤DEHs抗DHAV-1感染的能力的影响 |
| 2.4 H_2O_2诱导的氧化损伤对DHAV-1感染鸭胚肝细胞毒力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 ICA与pICA对DHAV-1诱导的DEHs氧化应激的调控机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 DEHs的制备 |
| 1.5 ICA与pICA对DEHs中SOD、GSH-Px蛋白表达的影响 |
| 1.6 ICA与pICA对抗氧化相关基因mRNA表达的影响 |
| 1.7 ICA与pICA对MAPKs信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 1.8 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ICA与pICA对DEHs中SOD和GSH-Px蛋白表达的影响 |
| 2.2 ICA与pICA对抗氧化相关基因mRNA表达的影响 |
| 2.3 ICA与pICA对MAPKs信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 ICA与pICA缓解DHAV-1诱导的DEHs线粒体损伤作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 DEHs的制备 |
| 1.5 ICA与pICA对鸭胚肝细胞线粒体膜电位的影响 |
| 1.6 ICA与pICA对鸭胚肝细胞线粒体内ROS的影响 |
| 1.7 ICA与pICA对鸭胚肝细胞细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响 |
| 1.8 ICA与pICA对鸭胚肝细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响 |
| 1.9 ICA与pICA对鸭胚肝细胞内ATP含量的影响 |
| 1.10 ICA与pICA对鸭胚肝细胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 1.11 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ICA与pICA对鸭胚肝细胞线粒体膜电位的影响 |
| 2.2 ICA与pICA对鸭胚肝细胞线粒体内ROS水平的影响 |
| 2.3 ICA与pICA对鸭胚肝细胞细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响 |
| 2.4 ICA与pICA对鸭胚肝细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响 |
| 2.5 ICA与pICA对鸭胚肝细胞内ATP含量的影响 |
| 2.6 ICA与pICA对鸭胚肝细胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs细胞凋亡作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 DEHs的制备 |
| 1.5 ICA与pICA对DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞凋亡的影响 |
| 1.6 ICA与pICA对鸭胚肝细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响 |
| 1.7 ICA与pICA对鸭胚肝细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1.8 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ICA与pICA对DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞凋亡的影响 |
| 2.2 ICA与pICA对鸭胚肝细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 2.3 ICA与pICA对鸭胚肝细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第八章 ICA与pICA缓解DHAV-1抑制DEHs细胞增殖作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 DEHs的制备 |
| 1.5 ICA与pICA对鸭胚肝细胞细胞周期的影响 |
| 1.6 ICA与pICA对鸭胚肝细胞增殖相关基因表达的影响 |
| 1.7 ICA与pICA对鸭胚肝细胞PCNA蛋白表达的影响 |
| 1.8 ICA与pICA对鸭胚肝细胞细胞增殖相关通路蛋白表达的影响 |
| 1.9 炎症损伤、氧化应激损伤、线粒体损伤、细胞凋亡及细胞增殖评价指标间相关性分析 |
| 1.10 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ICA与pICA对鸭胚肝细胞细胞周期的影响 |
| 2.2 ICA与pICA对鸭胚肝细胞增殖相关基因mRNA表达的影响 |
| 2.3 ICA与pICA对鸭胚肝细胞PCNA蛋白表达的影响 |
| 2.4 ICA与pICA对鸭胚肝细胞细胞增殖相关通路蛋白表达的影响 |
| 2.5 炎症损伤、氧化应激损伤、线粒体损伤、细胞凋亡及细胞增殖评价指标间相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）几种中药成分及修饰物体外抗鸭肝炎病毒增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸭肝炎病毒的研究进展 |
| 1.1 命名与分类 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 复制周期概述 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 防控策略 |
| 2 中药抗病毒的研究进展 |
| 2.1 中药成分抗病毒作用的机制 |
| 2.2 抗病毒中药成分 |
| 3 中药成分修饰的研究进展 |
| 3.1 磷酸化 |
| 3.2 硫酸化 |
| 3.3 磷脂复合物 |
| 3.4 其他修饰方法 |
| 4 本课题的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 几种中药成分抗鸭肝炎病毒作用比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.2 细胞培养试剂配制 |
| 1.3 试验药物 |
| 1.4 病毒准备 |
| 1.5 鸭胚肝细胞单层的制备及DHAV-1的感染 |
| 1.6 7种中药成分细胞安全浓度的测定 |
| 1.7 7种中药成分体外抗病毒作用的比较 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 7种中药成分细胞安全浓度的测定结果 |
| 2.2 7种中药成分体外抗病毒作用比较结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 槲皮素和黄芩苷对病毒复制周期的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 鸭肝炎病毒(DHAV-1)在鸭胚肝细胞中的复制周期 |
| 1.4 槲皮素和黄芩苷对病毒复制周期的影响 |
| 1.5 RNA的提取与实时荧光定量PCR |
| 1.6 two-ddCt法 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸭肝炎病毒(DHAV-1)在鸭胚肝细胞中的复制周期 |
| 2.2 槲皮素和黄芩苷体外抗DHAV-1感染细胞的作用 |
| 2.3 槲皮素和黄芩苷体外抗病毒感染细胞作用的机制 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物的制备及其抗DHAV1作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 栀子苷磷酸化修饰物的制备及分析 |
| 1.4 槲皮素磷脂复合物的制备 |
| 1.5 栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物安全浓度的测定 |
| 1.6 栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物抗病毒作用的测定 |
| 1.7 栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物对病毒基因复制的影响 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 栀子苷磷酸化修饰结果 |
| 2.2 槲皮素磷脂复合物 |
| 2.3 栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物的安全浓度 |
| 2.4 栀子苷磷酸化修饰物和槲皮素磷脂复合物的体外抗病毒作用 |
| 2.5 栀子苷及磷酸化修饰物和槲皮素及磷脂复合物对病毒VP1基因表达的影响与比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）鸭胚原代肝细胞抗乙肝模型的建立及应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 图清单 |
| 表清单 |
| 1 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎研究概况 |
| 1.1.1 乙肝病毒的病原学 |
| 1.1.2 乙肝病毒的复制 |
| 1.1.3 乙肝的流行病学 |
| 1.1.4 抗 HBV 药物现状 |
| 1.2 乙型肝炎模型研究进展 |
| 1.2.1 乙型肝炎动物模型研究进展 |
| 1.2.2 乙型肝炎细胞模型研究进展 |
| 1.3 研究意义 |
| 实验材料 |
| 1 实验动物 |
| 2 试验药物 |
| 3 试剂 |
| 4 主要仪器 |
| 5 试剂配制 |
| 2 鸭胚肝细胞的分离和原代培养 |
| 2.1 鸭胚肝细胞的分离培养 |
| 2.2 鸭胚肝细胞原代培养条件的优化 |
| 2.2.1 原代培养鸭胚胚龄的选择 |
| 2.2.2 原代培养消化液浓度及时间的选择 |
| 2.2.3 原代培养离心转速大小的选择 |
| 2.2.4 原代培养血清浓度的选择 |
| 2.2.5 原代培养国产血清与进口血清的选择 |
| 2.2.6 原代培养冰浴时间的选择 |
| 2.2.7 原代培养培养基的种类选择 |
| 2.2.8 原代培养细胞因子的选择 |
| 2.2.9 原代培养细胞接种密度的选择 |
| 2.3 鸭胚肝细胞原代培养结果 |
| 2.3.1 刚分离出来的鸭胚原代肝细胞 |
| 2.3.2 培养两天后的鸭胚原代肝细胞 |
| 2.3.3 培养五天后的鸭胚原代肝细胞 |
| 2.3.4 培养十天后的鸭胚原代肝细胞 |
| 2.3.5 培养十九天后的鸭胚原代肝细胞 |
| 2.3.6 培养二十天后的鸭胚原代肝细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 3 鸭胚肝细胞中 DHBV-DNA 定量检测方法的建立 |
| 3.1 PCR 筛选先天阳性鸭胚 |
| 3.1.1 试验方法 |
| 3.1.2 试验结果 |
| 3.2 DHBV-DNA 定量 PCR 标准品的制备 |
| 3.2.1 定量 PCR 标准品制备路线图 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 试验结果 |
| 3.3 DHBV-DNA 荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线的建立 |
| 3.3.1 试验方法 |
| 3.3.2 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 天然产物抗 DHBV-DNA 作用及其机理研究 |
| 4.1 MTT 法检测药物的细胞毒性 |
| 4.1.1 试验方法 |
| 4.1.2 试验结果 |
| 4.2 三种天然产物抗 DHBV-DNA 作用研究 |
| 4.2.1 试验方法 |
| 4.2.2 试验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对乙型病毒性肝炎的认识 |
| 1.1 乙型肝炎病毒的病原学 |
| 1.2 乙型肝炎病毒的流行病学与危害 |
| 1.3 乙肝的传播途径 |
| 1.4 乙型病毒性肝炎的危害 |
| 2 中医对乙型病毒性肝炎的认识 |
| 3 乙型病毒性肝炎致病机理的研究进展 |
| 3.1 有关 HBV 与肝细胞膜受体的结合 |
| 3.2 其它因素介导的 HBV 与肝细胞的结合 |
| 3.3 有关机体自身的免疫反应 |
| 4 乙型病毒性肝炎的动物模型研究进展 |
| 4.1 感染 HBV 的动物模型 |
| 4.2 与 HBV 相似的其他嗜肝 DNA 病毒的动物模型 |
| 4.3 复制 HBV 的小鼠模型 |
| 5 乙型病毒性肝炎的细胞模型研究进展 |
| 5.1 原代肝细胞 |
| 5.2 肝癌细胞系 |
| 5.3 非肝源细胞系 |
| 6 现代医学对乙型病毒性肝炎治疗的研究进展 |
| 6.1 抗乙肝病毒药物治疗疗效评价指标 |
| 6.2 抗乙肝病毒药物治疗的研究现状 |
| 6.3 免疫调节剂与基因治疗 |
| 6.4 治疗性疫苗 |
| 6.5 病毒壳体化抑制剂 |
| 6.6 联合治疗 |
| 7 中药抗乙型病毒性肝炎的研究进展 |
| 7.1 反相间接血凝实验 |
| 7.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 7.3 利用体外细胞培养筛选抗 HBV 中草药 |
| 7.4 以嗜肝 DNA 病毒感染动物作模型评价中草药抗 HBV 活性 |
| 8 抗乙型病毒性肝炎疗效评估检测方法的研究进展 |
| 8.1 免疫学检测方法及应用 |
| 8.2 分子生物学检测方法及应用 |
| 第二部分 实验部分 |
| 1 荧光定量 PCR 检测 DHBV 方法的建立 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 2 血清 DHBV 提取方法的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 扶正利湿活血复方对鸭乙肝模型血清 DHBVDNA 影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 原代培养鸭胚肝细胞上清 DHBV 载量动态变化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 扶正利湿活血复方对先天感染鸭胚肝细胞培养上清中 DHBV 的抑制作用 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录(英文缩略词) |
| 致谢 |
（9）新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 鸭病毒性肝炎研究进展 |
| 1.1 鸭病毒性肝炎 |
| 1.2 鸭肝炎病毒 |
| 1.2.1 病毒分型及理化特性 |
| 1.2.2 新型鸭肝炎病毒分子特征 |
| 1.2.3 主要结构蛋白 VP1 及其克隆表达分析 |
| 1.3 鸭病毒性肝炎流行病学 |
| 1.4 临床症状和病理变化 |
| 1.5 诊断 |
| 1.6 防制 |
| 实验研究 |
| 第二章 鸭肝炎病毒的分离鉴定及细胞适应性研究 |
| 1. 材料、试剂及仪器设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 毒株的分离与鉴定 |
| 2.1.1 病料的采集与处理 |
| 2.1.2 毒株的分离和鉴定 |
| 2.2 鸭胚肝肾原代细胞制备及冻存复苏 |
| 2.2.1 鸭蛋孵化 |
| 2.2.2 鸭胚肝细胞制备及条件优化 |
| 2.2.3 鸭胚肾原代细胞制备及条件优化 |
| 2.2.4 鸭胚肝肾细胞的冻存和复苏 |
| 2.3 新型鸭肝炎病毒在细胞上的适应性研究 |
| 2.3.1 细胞的接毒与收毒 |
| 2.3.2 细胞毒的盲传与及 RT-PCR 鉴定 |
| 2.3.3 DHAV-N 病变后的纯度检测 |
| 2.3.4 间接免疫荧光法检测鸭肝炎病毒 |
| 3.结果 |
| 3.1 实验毒株的 RT-PCR 鉴定结果 |
| 3.2 病毒尿囊液的制备 |
| 3.3 DELD50 测定结果 |
| 3.4 动物回归实验 |
| 3.5 鸭胚原代肝细胞和原代肾细胞培养图片 |
| 3.6 鸭胚肝细胞在 96 孔板中细胞接种量的确定 |
| 3.7 鸭病毒性肝炎接毒的病变情况 |
| 3.8 细胞接毒三次后的 RT-PCR 鉴定结果 |
| 3.9 病毒的传代情况 |
| 3.10 DHAV-3 病变后的纯度检测 |
| 3.11 间接免疫荧光结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介、发表文章 |
（10）鸭肿头败血症病毒XD株的鸭胚原代细胞培养特性及免疫电镜观察研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭肿头败血症病研究概述 |
| 1.1.1 鸭肿头败血症病原特性 |
| 1.1.2 DSHS流行病学 |
| 1.1.3 DSHS临床症状 |
| 1.1.4 DSHS病理变化 |
| 1.1.5 DSHS诊断技术研究及防治措施 |
| 1.2 动物细胞培养概述 |
| 1.3 禽胚原代细胞在病毒培养中的应用 |
| 1.4 免疫电镜技术的应用 |
| 1.4.1 免疫电镜技术简史 |
| 1.4.2 免疫电镜技术在病毒诊断上的应用 |
| 1.5 目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂和溶液的配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸭胚接种 |
| 2.2.2 鸭胚毒鸭胚半数致死量(DELD_(50))测定 |
| 2.2.3 鸭胚成纤维细胞制备 |
| 2.2.4 鸭胚肝细胞制备 |
| 2.2.5 鸭胚肾细胞制备 |
| 2.2.6 DSHSV在鸭胚原代细胞上的生长试验 |
| 2.2.7 细胞培养毒验证实验 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 鸭胚毒DELD_(50)测定结果 |
| 3.2 鸭胚成纤维细胞生长情况 |
| 3.3 鸭胚肝细胞生长情况 |
| 3.4 鸭胚肾细胞生长情况 |
| 3.5 鸭肿头败血症病毒在鸭胚成纤维细胞上培养特性 |
| 3.6 鸭肿头败血症病毒在鸭胚肝细胞上培养特性 |
| 3.7 鸭肿头败血症病毒在鸭胚肾细胞上培养特性 |
| 3.8 细胞培养毒验证实验 |
| 3.8.1 细胞毒鸭胚回归试验 |
| 3.8.2 鸭胚肝细胞毒DELD_(50)测定 |
| 3.8.3 DSHSV-XD株纯化及病毒蛋白含量测定 |
| 3.8.4 兔抗DSHSV高免血清制备及免疫电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文题目 |
四、应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究（论文参考文献）
- [1]应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究[J]. 黄新民,陈琨. 中国畜禽传染病, 1994(01)
- [2]应用鸭胚肝细胞扩增鸭肝炎病毒[J]. 吴培福,张国中,韩博,苏敬良. 中国兽医杂志, 2009(06)
- [3]鸭肝炎病毒的分离与检测[D]. 刘建. 中国农业大学, 2004(03)
- [4]DHBV衣壳蛋白靶向核酸酶抗病毒初步研究[D]. 张彬. 四川农业大学, 2015(07)
- [5]磷酸化修饰增强淫羊藿苷缓解DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞损伤作用及其机制研究[D]. 熊文. 南京农业大学, 2018(07)
- [6]几种中药成分及修饰物体外抗鸭肝炎病毒增殖作用的研究[D]. 姚方珂. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]鸭胚原代肝细胞抗乙肝模型的建立及应用[D]. 贾袁媛. 中国计量学院, 2013(03)
- [8]DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用[D]. 翁瑞文. 广州中医药大学, 2007(06)
- [9]新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及生物学特性分析[D]. 张建坡. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [10]鸭肿头败血症病毒XD株的鸭胚原代细胞培养特性及免疫电镜观察研究[D]. 彭广东. 四川农业大学, 2007(02)