一、应用间接免疫荧光技术测定人血清中的脊髓灰质炎病毒抗体（论文文献综述）
戴诗雨[1]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中研究表明病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。
陈伟华,Nathalie,J.Schmidt[2]（1979）在《病毒感染的血清学诊断进展》文中认为 前言 在过去十年,不论在大规模的调查中,还是在较小的诊断实验室诊断中,由于微量技术的发展,某些血清学程序的自动化,试验程序的标准化以及更有效的更敏感的病毒抗原和抗血清的广泛应用,都使得病毒感染的血清学诊断更加可靠和有效。在病毒血清学试验中应用了采集滤纸圆片上的微量血液,简化了样品的收集和保存,特别是对于野外试验,更是如此。（但是已经证明,采样的滤纸片法不适合于IgM抗体的保存）。
禹玉婷[3]（2020）在《柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备及小鼠体内保护效力》文中指出手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）是主要在夏秋季节流行的病毒性疾病,由多种肠道病毒感染引起,曾经在全世界范围内多次暴发。目前,临床前研发的预防HFMD的主要候选疫苗为细胞基质全病毒灭活疫苗和病毒样颗粒（VLP）疫苗。然而,灭活疫苗中除EV-A71和CV-A16外,其它主要血清型病毒难于在人用疫苗基质细胞中生长。VLP具有产量大、易富集和易纯化的特点,是疫苗发展的主要趋势之一,目前在人用疫苗和兽用疫苗的研究领域都应用广泛。因此研究昆虫细胞杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,制备CV-A2 VLPs,具有重要的应用意义。肠道病毒对热极其敏感,温度升高容易诱导病毒粒子衣壳构象改变,从而影响疫苗的免疫原性和保护效力。因此,研发一种具备较好耐热特性的手足口病疫苗,将有效提升手足口疫苗的质量。本论文是由两个部分构成的,主要讨论了利用昆虫杆状病毒表达系统来构建病毒颗粒以及免疫学研究和疫苗候选株热稳定株的筛选及免疫学的初步研究。第一部分:昆虫病毒杆状系统兼有真核表达系统和原核表达系统的优势,最大的优点是,可以产生大量的重组蛋白,另外还可以同时在一个载体上表达多种重组蛋白,这使得它在未来药物研发、生物医药、疫苗生产、农业杀虫剂等方面均获得了广泛的应用。本部分主要利用杆状病毒表达系统来构建病毒样颗粒及其免疫学的研究作了详细的阐述,以期为疫苗研究提供一个新的,安全而有效的方法。本部分研究结果包括四章的内容:第一章:包括部分实验材料和实验方法中2.1、2.2和2.3的内容。第二章:应用分子生物学技术构建了重组质粒病毒pFastBacDual-P1/3CD,转化了DH10 BacTM感受态细胞,并转染昆虫细胞Sf9,成功获得重组杆状病毒rBacCVA2-P1/3CD,并传代鉴定。重组病毒感染细胞后,经纯化后,通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE电泳、Western-Blot和透射电镜等方法鉴定了重组rCV-A2 VLPs（insect）。第三章:由于肠道病毒VLP与肠道病毒感染细胞后的空心颗粒有相似的结构,因此制备CV-A2病毒颗粒样品,与前面描述的rCV-A2 VLPs（insect）的免疫原性进行比较。本研究用CV-A2 1580毒株在10层细胞工厂感染RD细胞,收获了病毒液。经过超滤浓缩、20%蔗糖垫底和CsCl等密度梯度离心精纯等一系列操作,获得较高纯度的病毒实壳和空壳两种颗粒。通过SDS-PAGE和Western-Blot对收获的颗粒进行了验证,为动物免疫原性提供了必要的病毒颗粒抗原。第四章:通过应用纯化的rCV-A2 VLPs（insect）、CV-A2 VLP（yeast cell表达的参考品）和CV-A2-1580R4/CHN XY/2017疫苗免疫Balb/c小鼠,对其免疫原性进行初步评价。分别用rCV-A2 VLPs（insect）、CV-A2 VLPs（yeast）、CV-A21580 EP和CV-A2 1580 FP抗原对昆明鼠在第3日龄第10日龄时进行免疫,之后使用CV-A2 1388强毒株昆明鼠进行病毒攻击实验。验证了rCV-A2-VLPs（insect）和CV-A2-VLP（yeast）疫苗免疫乳鼠后的保护作用。第二部分:良好的疫苗有强的免疫力,对热稳定,易于保存。如何增强疫苗的免疫原性是目前世界范围内疫苗研究的一个新领域。本部分主要在热选择的压力下,对候选株进行了筛选,为研发热稳定性良好的疫苗候选株奠定了基础。本部分研究结果包括四章的部分内容:第一章:包括部分实验材料和实验方法中2.4、2.5和2.6的内容。第五章:在热选择压力下,挑选出CV-A2 2703-5株和CV-A2 2703-52株为热处理株。在39.5℃-65℃范围内,对CV-A2 2703-5株和CV-A2 2703-52株进行了耐热处理能力的测试,对CV-A2 2703-52的10株克隆株及CV-A2 2703-5株进行了基因组测序,并与CV-A2-1580R4/CHN XY/2017序列比对,找到了影响热稳定的突变位点。第六章:用CV-A2 2703-5和CV-A2 2703-52毒株在10层细胞工厂感染RD细胞,成功扩增了抗原并收获了病毒液。经过超滤浓缩、20%蔗糖垫底和CsCl等密度梯度离心精纯等一系列操作,获得EP和FP的两种颗粒。通过SDS-PAGE和Western-Blot对收获的颗粒进行了验证,为动物免疫提供了必要的抗原蛋白。第七章:通过应用纯化的CV-A2 2703-5和CV-A2 2703-52疫苗免疫Balb/c小鼠,对其免疫原性进行初步评价。验证了CV-A2 2703-5和CV-A2 2703-52疫苗免疫乳鼠后的保护作用。
尹志超[4]（2019）在《柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病（HFMD）疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除了主要病原体肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）外,柯萨奇病毒B组1型（CVB1）也是引起HFMD的重要病原体。研究显示,CVB1感染还可导致无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎等以及与I型糖尿病有关。目前尚无针对CVB1的预防或治疗方法,亟需开展相关防治方法的基础与应用研究。为了进一步建立和完善相关研究技术和方法,本研究基于酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）建立了快速高效的CVB1新型中和抗体检测方法（Nt-ELISPOT）,为CVB1疫苗和药物研发及血清流行病学研究提供技术支持。本研究以自福建泉州地区分离的CVB1临床分离毒株XM0108株为对象开展相关研究,核酸序列进化分析显示该毒株与我国已报告的CVB1流行毒株高度相近,属于主要流行株。本研究首先对CVB1病毒进行培养与病毒颗粒纯化条件的摸索,建立了较为稳定高效的病毒培养与制备方法,初步建立了病毒原液的浓缩和纯化方法,进一步应用蔗糖密度离心方法获得了具有较高纯度的CVB1病毒颗粒。获得对CVB1病毒具有特异和较好反应性的单克隆抗体是建立基于ELISPOT技术的新型免疫检测方法的重要基础。本研究将经灭活处理后的病毒颗粒以腹腔注射的方式免疫小鼠,利用间接ELISA方法筛选获得了6株抗CVB1的单克隆抗体。通过分析相关单抗对CVB1病毒的结合活性与反应特异性本研究选取具有较好反应性能的2E6单抗作为Nt-ELISPOT检测方法的检测抗体。进一步通过系统摸索Nt-ELISPOT检测方法中酶标检测单抗稀释比例、病毒感染剂量与培养时间,本研究基于ELISPOT技术建立了具有快速和高通量特点的CVB1中和试验方法。与传统的基于细胞病变效应（CPE）的中和试验方法（Nt-CPE）,该方法可显着缩短检测时间（从5-7天缩短至1天）,并且两种方法的检测结果具有良好的一致性。本研究进一步应用建立的Nt-ELISPOT方法开展了CVB1中和性单克隆抗体的筛选,获得了6株CVB1中和性单克隆抗体。其中5株单克隆抗体亚型为IgG2a,一株为IgG1亚型。中和能力分析显示,其中8A10具有相对更优的中和活性。本研究进一步应用乳鼠感染模型初步评价了8A10与CVB1免疫抗血清的体内抗病毒感染效果。结果显示,8A10与CVB1免疫抗血清通过被动免疫方式可有效保护小鼠免于CVB1的致死性攻击。同时,本研究应用建立新型中和试验方法对厦门地区515份健康人群血清样本进行CVB1中和抗体水平检测。结果显示,上述血清样本的CVB1中和抗体阳性率为27%,其中20-39岁年龄组的血清中和抗体阳性率最高,这提示厦门地区存在CVB1的既往流行感染。综上所述,本研究建立了一种新型的CVB1中和抗体检测方法,可以快速、高效和高通量地应用于CVB1中和抗体的筛选评价以及相关血清流行病学调查,可为CVB1的防治方法研究提供重要支持。
王振华[5]（2012）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗的构建及免疫原性评价》文中进行了进一步梳理黏膜免疫系统是人和动物机体整个免疫网络的重要组成部分,又是具有独特结构和功能的独立免疫系统,在抵抗感染方面起着积极重要的作用。首先,黏膜表面与外界抗原（主要指病原微生物）接触,是机体抵抗感染的第一道防线；其次,黏膜免疫系统具有共同黏膜免疫共享机制,这一机制能将全身黏膜免疫状态达成一致；再次,黏膜免疫可同时诱发黏膜免疫和系统免疫应答。因此,黏膜免疫日益受到重视,改变免疫策略,设计黏膜免疫疫苗,对预防传染病的发生具有重要意义,也是传染病预防领域的新技术热点之一猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）一直是危害世界养猪业比较严重的疾病,给世界养猪业造成巨大的经济损失。由于其病毒的致病特点,使目前的商品化疫苗存在着缺陷,不能完全阻止经呼吸系统及胎盘传播猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）。鉴于此,本研究结合PRRSV的致病特点、免疫特性及生物学特性探索性的设计黏膜免疫新型疫苗,对预防该病具有重要意义。试验选取PRRSV的ORF6基因作为目的基因,乳酸乳球菌乳链菌肽控制表达（nisin controlled expression, NICE）系统为抗原递呈载体,构建重组乳酸乳球菌活载体疫苗,并对其免疫反应原性及佐剂效力进行评价。主要研究工作和结果如下：1、试验将PRRSV经Marc-145细胞培养后,进行RT-PCR扩增,获得大小为515bp的抗原基因ORF6,将其克隆到PMD19-T载体后测序,核苷酸序列未发生变异。根据测序结果和乳酸乳球菌表面表达载体PNZ8149特点,设计引物,扩增并纯化出两端含有Sac Ⅰ和NcoⅠ酶切位点的PRRSV的ORF6基因片段,将纯化后的ORF6基因与表达载体pNZ8149进行连接,连接产物采用电转化方法将其转入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞中构建重组菌,命名为PNZ8149/NZ3900-M/PRRS。进一步对PNZ8149/NZ3900-M/PRRS进行诱导,诱导剂乳链杆菌肽（Nisin）添加量为10ng/mL诱导时间分别为2h、4h、6h、8h、10h和12h, SDS-PAGE分析,在19KD处出现了预期的条带,表达了分子量为19KD的蛋白,诱导6h条带比较清晰,是最佳的诱导时间。间接免疫荧光实验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面且具有反应原性。试验结果表明,成功构建了以乳糖为选择标记的食品级重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS,为开发PRRSV的乳酸乳球菌黏膜免疫疫苗奠定了理论基础。2、将构建的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫BALB/c小鼠,将小鼠随机分成4组（n=30）,组Ⅰ鼻腔免疫PBS缓冲溶液,为空白对照组；组Ⅱ鼻腔免疫空载体菌株培养液,为载体对照组；组Ⅲ鼻腔免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS悬浮菌液,为鼻腔免疫实验组；组Ⅳ口服免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS悬浮菌液,为口服免疫实验组。各组试验动物被连续免疫（即：1d,2d,3d,11d、,12d,13d,21d,22d,23d）,免疫剂量为50ul,悬浮菌液细菌含量为1×1011CFU/mL。试验动物在最后一次免疫后0d、7d、14d、21d、28d分别被处死,每次每组处死6只,取血液、肠粘液、呼吸道冲洗液检测抗体,采用间接ELISA方法检测血清中特异性IgG和黏膜中s-IgA抗体含量,评价其动态变化情况,并在最后一次免疫后14d取脾脏进行细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10IFN-γ等活性检测。重组乳酸乳球菌经口服免疫和鼻腔免疫后均能刺激黏膜分泌特异性s-IgA,在整个免疫测定期间内,两试验组在呼吸道黏膜及消化道黏膜产生的特异性s-IgA抗体水平均极显着高于PBS对照组和载体对照组(（P<0.01）,两试验组间滴鼻免疫试验组高于口服试验组,且呼吸道黏膜s-IgA抗体水平差异极显着(（P<0.01）,消化道黏膜s-IgA抗体水平差异不显着（P>0.05）。在整个测定期间内粘膜抗体s-IgA保持稳定趋势,可能由于抗体测定时间比较迟或测定周期相对较短；同时在最后一次免疫后14天检测小鼠脾细胞悬液IL-5的活性,重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫组明显高于对照组,差异极显着（p<0.01）,口服免疫组和滴鼻组无显着差异（p>0.05）,IL-5的活性对黏膜免疫的调节起重要作用,协同其它细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-6等）刺激B细胞的增殖与分化,促进活化的B细胞分化成IgA+B细胞,合成分泌型IgA。重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫小鼠后,两试验组脾细胞悬液中IL-2和IFN-γ与对照组差异极显着（p<0.01）,滴鼻免疫组IL-2和IFN-γ水平高于口服免疫组,滴鼻免疫实验组IL-2和IFN-γ水平分别达到349.848pg/ml和173.276pg/ml,口服免疫实验组IL-2和IFN-γ水平分别达到335.455pg/ml和162.913pg/ml；IL-4水平在各组之间差异不显着（p>0.05）,但滴鼻免疫实验组略高于口服实验组,分别为21.466pg/ml和19.799pg/ml。重组菌试验组血清中特异性IgG抗体水显着高于PBS对照组和载体对照组,差异极显着(（P<0.01）；鼻腔免疫组抗体水平在最后一次免疫后7天达到最高,在整个测定时间内维持在高水平,口服免疫组抗体水平在最后一次免疫后21天达到最高水平,然后迅速下降。以上结果表明,重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS经口服及鼻腔免疫后,能诱导产生粘膜免疫反应,并同时激发Thl型系统免疫应答,即体液免疫和细胞免疫应答,并且滴鼻免疫途径优于口服免疫途径。3、将构建的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS抗原与黏膜佐剂CpG ODN联合鼻内免疫BALB/c小鼠,评价其佐剂效应。试验选取BALB/c小鼠90只,随机分为3组（n=30）,分别为重组菌对照组（组Ⅰ）、佐剂+重组菌实验组（组Ⅱ）和佐剂对照组（组Ⅲ）,佐剂免疫剂量每只小鼠为10ug,重组菌免疫剂量、免疫方法及检测指标同第二部分试验。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清特异性抗体IgG高于单独佐剂组和抗原组,呼吸道和肠道黏膜s-IgA水平高于单独佐剂组和抗原组,并且呼吸道黏膜s-IgA抗体水平高于肠道黏膜抗体；最后一次免疫后14天检测脾细胞悬液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5的活性。IL-2、IFN-γ和IL-5的活性佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组高于单独抗原组（p>0.05）,显着高于单独佐剂组（P<0.01）；IL-4水平在各组之间差异不显着（p>0.05）。结果表明CpG ODN能协同重组菌提高小鼠黏膜免疫和系统免疫反应,为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。
蔡毅君[6]（2009）在《肠道病毒分离鉴定及EV71快速高通量中和实验方法的建立》文中提出手足口病是儿童常见病,多种肠道病毒均可引起手足口病,其中以肠道病毒71型（EV71）为我国近几年手足口病的主要病原体。EV71导致的手足口病较常引起中枢神经系统损伤,重症患者比例以及病死率均明显高于其他肠道病毒,具有很重要的公共卫生意义。目前尚未有成熟的EV71快速诊断试剂和预防疫苗,开发相关诊断试剂与疫苗对于手足口病的防治具有重要意义。本研究目的是建立肠道病毒的分离鉴定技术平台,获得较为完整的EV71病毒库;建立新型的EV71中和抗体快速高通量检测方法:建立EV71动物感染模型。本研究结果将为EV71的防治研究提供重要的基础和工具。本研究通过病毒分离鉴定建立了一个较为完整的肠道病毒库,并且初步建立了EV71病毒的大规模生产,浓缩和纯化的工艺流程,已获得了具有较高滴度和纯度的EV71病毒颗粒。本研究建立了一系列EV71鉴定的方法,包括EV71滴度检测方法,免疫荧光方法,EV71中和抗体检测方法等。传统的TCID50方法是目前常用的EV71中和抗体的检测方法,该方法的实验周期长,工作量大,肉眼判断结果存在主观误差,难以满足大量标本的检测要求。鉴于传统TCID50方法所存在的问题,我们建立了快速、高通量的新型EV71中和抗体检测方法。本方法是应用酶标记的EV71单克隆抗体与EV71病毒蛋白结合,通过TMB显色使得被EV71感染的细胞显示出区别颜色标记,应用斑点自动扫描仪进行扫描和计数。本研究对该方法的敏感性,特异性,交叉反应性和重复性进行了考察,结果表明该方法具有较好的性能。同时我们应用该方法检测了大量的单抗和多抗的EV71中和抗体滴度,结果显示了该方法具有较好的应用前景。本论文也初步研究EV71的乳鼠感染模型,已经通过颅腔注射的方式将EV71病毒接种到乳鼠体内,并观察到乳鼠出现体重下降,颤抖,瘫痪甚至死亡等现象,在乳鼠的脑组织中检测到EV71病毒,为后期的疫苗研发等工作提供了基础。
范培虎[7]（2015）在《EV71和人类共同抗原的鉴定及其作为重症HFMD潜在致病机理的研究和高敏核酸酶联免疫荧光试验的建立》文中指出第一篇：EV71与人类共同抗原的鉴定及其作为HFMD重症潜在病因的研究手足口病主要是由肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型两种病原引起的以感染5岁以下儿童，手足口部出现疱疹溃疡以及发热等为主要症状的疾病。由于EV71的感染，少数病例可出现严重的神经症状，如无菌性脑干脑炎、急性致死性神经性肺水肿、肺出血、急性呼吸衰竭等严重中枢神经系统症状而导致死亡。因此，澄清EV71的致病机理对重症的控制、及时制定正确的治疗方案减少死亡率具有重要的意义。此前，尽管对EV71致死性神经性症状进行了大量研究，但其真正致病机理尚不明确。目前，EV71对中枢神经系统的致病机理研究主要包括病毒感染对神经元的直接损伤、致病性细胞因子（IP-10, MCP-1, IL-6, IL-8, and G-CSF等）在神经系统中急剧升高导致的神经组织损伤以及EV71与人脑蛋白共同抗体的自身反应性而引发的自身免疫对神经系统的损伤三方面原因的内容。本文鉴定了EV71病毒与人类共同抗原，并主要以机体针对共同抗原产生的具有自身反应性的抗体为出发点，论述了共同抗体在HFMD重症病因中潜在的作用。本研究通过对病毒蛋白质组与人类蛋白质组的比对分析，首次鉴定出在人类脑干部高表达的RNA聚合酶的转录调节复合物的亚基25（mediator complexsubunit25，MED25）与EV71的病毒蛋白1（VP1）存在共同表位PPGAPKP，并将两种共同抗原进行了体外表达，制备了针对该表位的单克隆抗体2H2，假病毒中和试验检测显示该抗体无中和活性。通过Western blot和ELISA试验证实了2H2与MED25，VP1以及EV71病毒样颗粒的结合活性。使用测定蛋白间相互作用的方法测定了共同抗体与自身抗原的结合活性及亲和常数（KD），KD=8.0×10-7，为中等亲和力强度。动物免疫实验证明了两种共同抗原均能够刺激机体产生高滴度的针对共同表位的共同抗体。同时对患者血清进行共同抗体检测，结果显示EV71感染者的血清中同样存在高滴度的共同抗体。应用小动物活体成像技术监测共同抗体在体内的分部情况来反映该抗体对自身抗原的反应性。结果显示，除主要分布在肝脏外，在脑干及延髓处亦有分布，表明共同抗体在活体内可能与自身抗原结合进而引发免疫反应。本研究首次鉴定了共同抗原并系统地证实了自身反应性抗体在体内的大量存在并与自身抗原在体内的结合反应，为EV71的重症致病机理在有关自身免疫反应性方面的进一步研究提供了确实而充分的实验和理论依据。同时，对EV71新型疫苗的开发与应用也有重要的指导意义。第二篇高灵敏性核酸酶联免疫荧光试验的建立酶联免疫吸附试验（ELISA）在传染性病原检测中着实是一种非常有效的方法。但是在应用中仍然存在不足，如在某些领域里其检测灵敏度很难达到要求。为了进一步提高该方法的灵敏性，几十年来，科学工作者做了很多努力。虽然已有很多改善和提高，但是目前该方法的灵敏度及实用性仍不能适应现代医学某些领域的发展和少数传染病复杂化的程度。为了进一步提高该方法的灵敏性，本研究首次将核酸酶和荧光探针用于免疫吸附试验，被称为核酸酶联荧光寡核苷酸试验（Nuclease-linked Fluorescence Oligonucleotide Assay，NLFOA）。在该方法中，具有高酶活性的核酸酶TurboNuclease用作标记酶，水解荧光探针中链接荧光素和淬灭基团的寡核苷酸链，致使淬灭基团对荧光素的淬灭作用消失而发出可检测的荧光。由于核酸酶的高效性和荧光探针的高荧光强度而使源于被检分子的检测信号得到一定程度的放大，从而提高灵敏度。同时，具有信号放大效应的表面偶联有大量链霉亲和素分子的金纳米颗粒也被用于此方法中，能够使被捕获的单个被检抗原分子通过纳米颗粒-亲和素复合物结合大量生物素化的标记核酸酶，使被检测信号进一步放大再次提高灵敏度。本研究在纳米颗粒直径、标记核酸酶使用浓度、纳米颗粒-亲和素复合物使用浓度和荧光探针使用浓度等方面对NLFOA进行了条件的优化。通过检测人类艾滋病毒重要的标志性蛋白分子p24，对NLFOA的检测灵敏性、特异性和重复性进行了评价。结果显示，NLFOA的最低检测限度为1.0pg/mL，低于传统ELISA的最低检测限度（10.0pg/mL）10倍。特异性在两次评价中均达到了100%，重复性在p24的高（100.0pg/mL）、中（50.0pg/mL）、低（1.5pg/mL）三个浓度水平的变异系数（CV）分别为7.8%、9.05%、8.4%，均低于被接受阈值10%。NLFOA是本实验室建立的一种高灵敏性检测抗原的方法，改变相应的抗体后可用与各种传染病抗原的检测。本方法首次把核酸酶和荧光探针应用与酶联免疫试验中，开拓了在免疫试验中使用核酸酶和荧光探针为底物新的思路，显着地提高了检测方法的灵敏性，为疾病的早期诊断避免病原的传播以及及时制定合理的治疗方案提供了强有力的技术手段。
张海丽[8]（2015）在《牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立》文中认为牛肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,为单股正链RNA病毒。病毒粒子无囊膜,为二十面体球形结构,粒子直径约为2530nm,基因组长度约为7500bp。2011年第9次国际病毒分类委员会分类报告将牛肠道病毒分类为EV-E和EV-F,其中EV-E分为EV-E1E4,EV-F分为EV-F1F6。牛肠道病毒的首次发现是在上世纪50年代末,由Kunin和Mc Ferran分别从健康牛粪便中分离得到,随后世界各地陆续有该病毒的分离报道,但中国关于此病毒的流行报道较少。牛肠道病毒的病原性并不明显,但由于其有时会侵犯其他器官而导致临床上各种综合征的出现。牛肠道病毒的感染宿主较广,包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。本研究从奶牛场采集两批粪便样本,第一批样本采自诊断为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）阳性的患病奶牛,第二批样本采自患有消化道疾病症状的奶牛,同时从该牛场采集获得9份牛血清,血清经BVDV抗原及抗体检测均为阴性。两批病料共先后分离得到10株病毒,经BVDV巢式RT-PCR检测均为阴性。因此,本研究对分离病毒按未知病毒进行鉴定,核酸型鉴定为RNA病毒;蚀斑纯化后电镜观察病毒粒子形态为无囊膜球形,直径约2530nm,符合小RNA病毒形态学特征;理化特性鉴定结果表明分离病毒具有耐酸、抗有机溶剂、对热敏感等特性;RT-PCR鉴定结果表明,两批病料分离毒株分别属于牛肠道病毒EV-E与EV-F,且同一批分离毒株同源性均在99%以上。故选取两批中最早出现病变的分离病毒继续后续试验并分别命名为HLJ-3531与HLJ-4149。血清中和试验研究表明,采自同一牛场的牛血清中2份含有HLJ-3531中和抗体,5份含有HLJ-4149中和抗体,免疫电镜试验进一步揭示了抗原抗体反应复合物的存在。病毒细胞嗜性分析显示,两株病毒均可感染牛、猪、兔、非洲绿猴、鸡、犬、仓鼠、猫等多种动物细胞,但对牛、仓鼠、非洲绿猴的细胞嗜性较强,对兔、犬、猪源的细胞嗜性较弱。重组牛IFNa/β/λ等对两株病毒的繁殖均有抑制作用。为分析两株病毒的基因序列及进化树关系,参考NCBI已公布序列,设计简并引物,采用重叠RT-PCR技术扩增HLJ-3531及HLJ-4149基因组。为确保基因序列的真实性及精确性,两株病毒的5’UTR均采用RACE法扩增,其余片段则采用高保真酶扩增。经序列拼接得到,HLJ-3531病毒株全基因序列为7448bp,HLJ-4149病毒株全基因序列为7437bp,均由5’UTR、开放阅读框（ORF）、3’UTR及ploy（A）尾巴组成。两株病毒全基因组核苷酸同源性为68.40%,ORF氨基酸同源性为73.40%。以VP1序列绘制进化树,分析显示HLJ-3531属EV-E2分支,与56/59/1株核苷酸同源性最高（77.71%）,与SD1182 II株氨基酸同源性最高（95.65%）;HLJ-4149属EV-F1分支,与IL/alpaca核苷酸同源性最高（81%）,与BEV-261氨基酸同源性最高（96%）。本研究以分离得到的两株病毒为研究对象建立了ICR乳鼠感染模型。两株病毒经BHK-21细胞连续传代3次后,取50μL病毒液（滴度为108TCID50/0.1m L）分别经腹腔注射感染乳鼠,在感染后4、7、14、21d取感染小鼠心、肝、肠、肺组织,进行半定量RT-PCR及HE染色检测,同时在感染后7、14、21d取感染小鼠血清分析小鼠体内抗体水平。结果表明,肉眼观察时,HLJ-3531株感染小鼠在21d可观察到肠黏膜出血症状,而HLJ-4149株感染小鼠在整个观察周期都未引起肉眼可观的病理变化;RT-PCR检测结果显示,两株病毒均不能感染心组织,可感染肝、肠、肺组织,HLJ-3531株感染小鼠整个检测周期中在肝、肠、肺中均能扩增到病毒特异性目的条带,而HLJ-4149株在感染后4、7、14d在肝、肠、肺中可检测到特异性条带,但病毒含量逐渐变少,21d已检测不到;HE染色结果显示,乳鼠在分别感染两株病毒后心组织都未出现病变,HLJ-3531株感染组小鼠在整个观察周期中肠、肝、肺组织都出现明显病变,且随感染时间的推移病变逐渐加剧,HLJ-4149株感染组小鼠肠、肝、肺组织出现病变,但其病理变化先随着时间的推移加剧（0→4→7d）,之后又开始慢慢恢复（7→14→21d）;血清中和试验显示,两株病毒感染组小鼠在第7d均已产生抗体,之后逐渐升高（14d）,HLJ-4149株感染组小鼠21d血清中抗体水平下降,而HLJ-3531组小鼠血清中依然存在较高滴度的中和抗体。致病性实验结果显示,两株病毒均可感染小鼠且引起组织病理变化,但引起病变的程度及持续时间存在差异。由于两株病毒分离自同一牛场,血清中和试验检测到同一牛血清中含有两种病毒的中和抗体,故怀疑牛场存在多重感染的现象。为验证两株病毒是否可以混合感染同一个体动物且引起病理变化,本研究以ICR乳鼠为动物模型模拟了多重感染。取等体积混合的病毒液50μL腹腔注射感染乳鼠,乳鼠在整个周期外观上与对照组相比都无明显差异,组织解剖时在14d与21d可观察到小鼠有肠黏膜出血的症状,且症状逐渐加强,21d时亦观察到肝脏肿大症状。组织RT-PCR与HE染色分析结果显示,两株病毒可同时感染同一个体且引起组织病理变化,所引起的病理变化强于单独感染组,病程亦比单独感染组较长,表明HLJ-3531株与HLJ-4149株在病毒感染过程中有协同效应。血清中抗体水平分析显示,同一个体中同时存在两株病毒的抗体,且随着感染时间的推移逐渐升高。本研究在国内外首次成功建立了牛肠道病毒乳鼠感染模型,初步研究了牛肠道病毒的致病性,为牛肠道病毒致病机制的深入研究提供了动物模型及物质基础。根据HLJ-3531全基因克隆序列拼接结果,设计全长c DNA构建引物,以pBluescript SK（-）为克隆载体,采取融合PCR与经典酶切法相结合的策略进行全长构建。HLJ-3531全基因序列分为两大片段3531-A与3531-B,在全序列5’端引入T7启动子序列。3531-A片段分为三个小片段,融合PCR获得。3531-B分为两个小片段,并在两片段重叠部分通过引物引入分子标记Nae I酶切位点（氨基酸同义突变）。含全长c DNA的重组质粒p BSK-3531鉴定正确后,线性化并转染能稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞系,产生病变后连续传代。RT-PCR、分子标记测序、间接免疫荧光、免疫电镜等鉴定结果显示重组病毒r HLJ-3531拯救成功,r HLJ-3531与亲本毒株具有相似的宿主嗜性、TCID50及生长曲线。本研究成功构建了牛肠道病毒HLJ-3531株的感染性克隆,并拯救出带有分子标记的重组病毒,为牛肠道病毒基因组的结构与功能、分子致病机制的研究及载体疫苗的构建等奠定了物质基础与技术平台。
刘泽[9]（2019）在《新型复合乳佐剂的制备及其在狂犬病疫苗中的运用和机制研究》文中研究说明狂犬病是由狂犬病毒感染引起的全球范围内广泛流行的人兽共患病,患者发病后病死率接近于100%。狂犬病毒感染后先在局部肌肉组织中复制和扩散,然后迅速沿末梢神经和神经周围间歇的体液上行进入中枢神经系统,上行过程中病毒在神经节细胞中大量复制。由于中枢神经系统被内皮细胞紧密包裹,中和抗体,补体蛋白等特异性免疫应答成分难以进入其中发挥作用,而且其中缺乏巨噬细胞,炎性因子等非特异性免疫应答成分。因此,一旦病毒进入中枢神经,即便机体产生了高滴度的中和抗体也不能为机体提供有效保护。目前广泛使用的无佐剂狂犬病疫苗往往要到14 DPI（day post inoculation）才能达到100%的阳转率,而在上世纪使用的铝佐剂狂犬病疫苗要到42 DPI才能达到100%的阳转率。探索能够激发机体快速或者持久产生特异性和非特异性免疫应答的佐剂对于狂犬病的防控至关重要。本研究将狂犬病疫苗毒株CTN-1-D15接种到人胚肺二倍体细胞中培养制备抗原。然后通过细胞ELISA方法检测抗狂犬病毒抗体以筛选佐剂成分,发现100 μ g/mL紫杉醇在3 DPI抗体滴度0D平均值为0.717,采用方差分析发现:它与其它佐剂成分实验组之间差异显着（p<0.01）,表明紫杉醇具有快速刺激抗体的能力;MF59在14 DPI使抗体滴度0D平均值为0.945,与无佐剂组（0D平均值为0.493）比较其差异显着（p<0.01）,说明它能刺激机体高水平中和抗体的产生。鉴于紫杉醇和MF59具有细胞毒性和过敏反应及持久性差的问题,本研究将二者联合以降低它们的使用浓度;另外辅酶Q10能够稳定细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性,它不但有利于三羧酸循环代谢而且利于线粒体驱动巨噬细胞产生炎性因子。配制时采用角鲨烯萃取混悬液中的辅酶Q10,再按照体积比（5.0%角鲨烯;0.5%吐温;0.5%司班）混匀后分散在琥珀酸-柠檬酸钠缓冲液中,然后在800psi条件下通过高压均质机使其达到水包油（O/W）的状态,再用0.01 M的PBS稀释1倍后加入20 μg/mL的紫杉醇制备而成,因其制备环节呈金黄色故命名为Golden05。将狂犬病Golden05佐剂疫苗分别在第0,3和7天对ICR小鼠进行肌肉免疫。然后用快速免疫荧光抑制灶试验（RFFIT）监测小鼠血清中和抗体滴度变化趋势,发现实验动物在5 DPI时开始产生有效的中和保护抗体（0.83 IU/mL）,当完成三针注射后的28 DPI时,抗体水平达到2.86 IU/mL,连续监测至免疫后第3个月,抗体均能够维持在较高水平（2.05 IU/mL）。并在14 DPI时,使用狂犬病标准攻毒株CVS-11对免疫后小鼠进行挑战试验,结果显示狂犬病Golden05佐剂疫苗的保护效果达到100%。分析其免疫学机制发现Golden05能显着提高体内细胞线粒体的SDH活性,并能够提高机体IFN-γ,TNF等前炎性因子的表达,产生非特异性免疫应答;同时促进CD8+T细胞的大量增殖,从而使浆细胞活化,能快速大量地产生中和抗体,激活特异性免疫应答。并在物理化学和动物安全性评价中,Golden05具有良好的稳定性和安全性。本研究通过维持细胞SDH活性,改良MF59并联合紫杉醇制备的复合乳佐剂能够快速且持久地诱导机体产生抗狂犬病毒特异性和非特异性的保护性免疫应答。
祁光宇[10]（2019）在《猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立及新型亚单位疫苗的研究》文中提出这几年,PEDV G2群的变异毒株在我国猪群中发病并导致流行,很难将患轮状病毒猪、传染性胃肠炎的猪在临床症状上很难进行区分。准确的检测是防制猪流行性腹泻的重要环节,以免疫层析法技术为基础建立的猪流行性腹泻病毒金标试纸条是一种具有快速、灵敏、特异的PEDV检测方法,对基层现场诊断具有广泛应用价值。目前PEDV的疫苗主要是全病毒灭活苗和弱毒苗两种,这些疫苗或多或少的存在缺点。因此,研发安全、高效的新型PEDV疫苗对防控PED具有十分重要的意义。通过RT-PCR技术扩增HB2015分离毒株N基因,对扩增的N基因进行测序分析,分析结果表明:与2014年德国毒株（GER-L00721-2014）、CH/JXJA/2017、法国毒株KR011756-FR001-2014)、河北毒株（JF700126.1-HB-HS-2010）同源性为99.5%99.9%。HB2015分离毒株与CV777、CH/S毒株之间的同源性为95.5%95.6%,存在小幅度的变异。HB2015分离毒株与2014年德国毒株（GER-L00721-2014）、CH/JXJA/2017、法国毒株（KR011756-FR001-2014）、河北毒株（JF700126.1-HB-HS-2010）同属于一个进化分支,HB2015分离毒株属于PEDV G2群的变异毒株。通过pET-32a-N原核表达重组N蛋白,对获得的重组N蛋白进行鉴定后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备单抗,对筛选出的单抗进行Western blotting鉴定、IFA分析和间接ELISA检验。试验结果表明:在大肠杆菌中成功表达的N蛋白具有较好抗原性。筛选出两株能稳定分泌抗PEDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E7和5D3。间接ELISA均不与猪蓝耳病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫O型抗原、口蹄疫A型抗原发生交叉反应为,腹水效价分别为1:32000和1:64000。两株单抗具有较好的特异性、稳定性和较高的抗体效价。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金,分别以单抗3E7和5D3制备免疫胶体金和检测线,再以羊抗鼠IgG作为质控线制备金标试纸条,对研制的金标试纸条进行特异性、敏感性和保存期试验。试验结果表明:免疫胶体金最佳单抗3E7标记量的范围在2030μg/mL。抗原标记的最佳pH值为8.0,NC膜上的检测线单抗5D3含量为0.9mg/mL,NC膜的质控线羊抗鼠IgG含量为1.0mg/mL。金标试纸条不与蓝耳病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫O型抗原、口蹄疫A型抗原发生反应。最低能够检测到225个TCID50的病毒量,4℃可以保存180天。通过分析了国内、外PEDV 31株的S基因核苷酸和S蛋白氨基酸序列的同源性,对S1的390-789aa编码的基因进行优化后,与P28、CD40L、IgG1Fc融合表达。将在杆状病毒系统表达的目的蛋白S1、S1-P28、S1-CD40L、S1-IgG1Fc分别与纳米佐剂和206佐剂乳化后,进行小鼠和猪免疫试验评价。试验结果表明:纳米S1-CD40L组疫苗中和抗体最好切均高于国家制定的标准（1:16）,无佐剂组免疫后血清中的检测,S1-CD40L免疫组的IFN-γ和IL-4均高于其它组,说明CD40L可以明显的增加免疫应答。
二、应用间接免疫荧光技术测定人血清中的脊髓灰质炎病毒抗体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用间接免疫荧光技术测定人血清中的脊髓灰质炎病毒抗体（论文提纲范文）
（1）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 病毒样颗粒疫苗的简介 |
| 1.1.2 病毒样颗粒疫苗的表达系统 |
| 1.1.3 病毒样颗粒疫苗发展面临的挑战和解决方案 |
| 1.2 寨卡病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 寨卡病毒的流行病学 |
| 1.2.2 寨卡病毒的分类 |
| 1.2.3 寨卡病毒结构和基因组结构 |
| 1.2.4 寨卡病毒的生命周期 |
| 1.2.5 寨卡病毒E蛋白的结构和功能研究 |
| 1.2.6 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3 脊髓灰质炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 脊髓灰质炎的流行现状 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒的生物学 |
| 1.3.3 脊髓灰质炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 克里米亚刚果出血热病毒的研究进展 |
| 1.4.1 CCHFV的生物学 |
| 1.4.2 CCHFV的临床流行病学 |
| 1.4.3 CCHF的预防 |
| 1.4.4 CCHFV疫苗的研究进展 |
| 1.4.5 CCHFV单克隆抗体的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 寨卡病毒样颗粒的构建和免疫原性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 抗体与抗体制备 |
| 2.1.4 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.1.5 ZIKV病毒蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1.6 ZIKV病毒样颗粒和病毒粒子的纯化与检测 |
| 2.1.7 ZIKV VLPs的免疫原性评价 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.2.2 ZIKV pr M和 E蛋白形成VLPs |
| 2.2.3 ZIKV VLPs的免疫原性研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于杆状病毒表达的VLP诱导合胞体现象的抗黄病毒药物筛选方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 抗体与抗体纯化 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.5 质粒的构建及转染实验 |
| 3.1.6 序列比对和进化分析 |
| 3.1.7 免疫荧光分析 |
| 3.1.8 ZIKV滴度测定(空斑实验) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导Sf9细胞形成合胞体 |
| 3.2.2 黄病毒E蛋白在Sf9细胞中的细胞定位研究 |
| 3.2.3 ZIKV prME和E蛋白形成VLPs |
| 3.2.4 基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体现象的抗病毒筛选 |
| 3.2.5 AMS通过影响病毒入侵抑制黄病毒感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 脊髓灰质炎病毒样颗粒的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 抗体与抗体制备 |
| 4.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PVⅡP1多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.2.2 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.3 PVⅡVP0,VP1和VP3 蛋白形成VLPs |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 克里米亚刚果出血热病毒样颗粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 5.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组杆状病毒v Ac-Gn Gc NP和 v Ac-Gn Gc的构建 |
| 5.2.2 CCHFV VLPs的纯化和鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、质粒与细胞系 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc胞外区的诱导表达 |
| 6.1.4 单克隆抗体制备的流程 |
| 6.1.5 小鼠血清和杂交瘤细胞上清识别能力的检测 |
| 6.1.6 单克隆抗体线性识别位点的鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 小鼠血清的检测 |
| 6.2.2 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的筛选 |
| 6.2.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体识别表位的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc宿主相互作用组的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 抗体 |
| 7.1.4 细胞转染 |
| 7.1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 7.1.6 非标定量质谱分析 |
| 7.1.7 生物信息学分析 |
| 7.1.8 免疫荧光和共聚焦实验 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 诱饵蛋白Gn/Gc及其宿主互作蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 7.2.2 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的非标定量质谱分析 |
| 7.2.3 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 7.2.4 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的相互作用网络分析 |
| 7.2.5 间接免疫荧光验证质谱结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 线粒体 |
| 7.3.2 内质网 |
| 7.3.3 细胞骨架 |
| 7.3.4 外泌体和囊泡 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备及小鼠体内保护效力（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 背景 |
| 2 CV-A2的生物学特征 |
| 3 手足口病疫苗的研究进展 |
| 4 病毒样颗粒(VLPs)的研究进展 |
| 5 肠道病毒免疫原性的研究 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 技术路线 |
| 第一章 实验材料和实验方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 毒株、质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的构建及鉴定 |
| 2.2 CV-A2-1580R4/CHN XY/2017 株抗原蛋白的制备及鉴定 |
| 2.3 rCV-A2 VLPs(insect)动物免疫效果评价 |
| 2.4 热稳定株的筛选及鉴定 |
| 2.5 CV-A22703-5和CV-A22703-52 抗原蛋白的制备及鉴定 |
| 2.6 热稳定株动物免疫效果评价 |
| 第二章 柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的构建及鉴定 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 目的基因的获得 |
| 1.2 重组质粒p Fast Bac Dual-P1/3CD的鉴定 |
| 1.3 CV-A2 P1/3CD重组Bacmid的构建 |
| 1.4 重组杆状病毒r Bac CVA2-P1/3CD的构建及扩增 |
| 1.5 重组杆状病毒r Bac CVA2-P1/3CD基因及表达产物的鉴定 |
| 2 小结 |
| 第三章 CV-A2-1580R4/CHN XY/2017 株抗原蛋白的制备及鉴定 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 CV-A21580毒株感染RD细胞 |
| 1.2 CV-A21580 毒株滴度测定(CCID_(50)/ml) |
| 1.3 CV-A21580毒株抗原蛋白的纯化与鉴定 |
| 2 小结 |
| 第四章 r CV-A2 VLPs(insect)动物免疫效果评价 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 佐剂Al(OH)_3吸附率检测 |
| 1.2 重组rCV-A2 VLPs(insect)免疫原性的初步研究 |
| 1.3 重组rCV-A2 VLPs(insect)疫苗免疫保护效果评价 |
| 2 小结 |
| 第五章 热稳定株的筛选及鉴定 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 间接免疫荧光检测毒株的热稳定特性 |
| 1.2 克隆株的热处理 |
| 1.3 CV-A22703-5和CV-A22703-52 的耐热处理曲线 |
| 1.4 CV-A22703-5和CV-A22703-52 与热稳定的相关位点 |
| 2 小结 |
| 第六章 CV-A22703-5和CV-A22703-52 抗原蛋白的制备及鉴定 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 CV-A22703-5和CV-A22703-52 抗原感染RD细胞 |
| 1.2 CV-A22703-5和CV-A22703-52 抗原滴度测定(CCID_(50)/ml) |
| 1.3 CV-A22703-5和CV-A22703-52 抗原的纯化与鉴定 |
| 2 小结 |
| 第七章 热稳定株动物免疫效果评价 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 佐剂Al(OH)3吸附率检测 |
| 1.2 CV-A22703-52 株和CV-A22703-5 株免疫原性的初步研究 |
| 1.3 CV-A22703-5和CV-A22703-52 疫苗免疫保护效果评价 |
| 2 小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 1.1 柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的构建及鉴定 |
| 1.2 CV-A2-1580R4/CHN XY/2017 株抗原蛋白的制备及鉴定 |
| 1.3 rCV-A2 VLPs(insect)动物免疫效果评价 |
| 1.4 热稳定株的筛选及鉴定 |
| 1.5 CV-A22703-5和CV-A22703-52 抗原抗原蛋白的制备及鉴定 |
| 1.6 热稳定株动物免疫效果评价 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（4）柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 CVB1的生物学基础 |
| 1.1病毒的发现和分类 |
| 1.2 病毒的形态结构特征及理化性质 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 肠道病毒的生活周期 |
| 2 肠道病毒的流行病学研究 |
| 2.1 肠道病毒与手足口病 |
| 2.2 CVB1的分子流行病学 |
| 3 肠道病毒的临床症状、病毒复制及治疗手段 |
| 3.1 肠道病毒的临床症状 |
| 3.2 CVB1与I型糖尿病 |
| 3.3 肠道病毒的复制 |
| 3.4 肠道病毒的诊断方法 |
| 3.5 肠道病毒的治疗方法 |
| 4 肠道病毒疫苗和动物模型相关研究进展 |
| 4.1 肠道病毒疫苗研究进展 |
| 4.2 动物模型相关研究进展 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 常用溶液及培养基配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养相关试验方法 |
| 2.2 病毒的培养、纯化及电镜观察 |
| 2.3 动物相关实验 |
| 2.4 肠道病毒结合抗体检测方法 |
| 2.5 肠道病毒中和检测方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 CVB1病毒株于基因序列分析 |
| 2 CVB1病毒培养体系的建立 |
| 2.1 细胞病变观察 |
| 2.2 病毒增长曲线 |
| 3 CVB1病毒颗粒的初步纯化 |
| 3.1 CVB1病毒颗粒的纯化及电镜复染观察 |
| 3.2 CVB1病毒颗粒的SDS-PAGE分析 |
| 4 CVB1特异性结合抗体的制备 |
| 4.1 多抗血清结合检测 |
| 4.2 结合抗体的筛选与性质鉴定 |
| 5 基于2E6建立针对CVB1新型中和试验方法 |
| 5.1 抗体特异性分析 |
| 5.2 HRP-2E6的适用浓度摸索 |
| 5.3 感染时间对检测结果的影响 |
| 5.4 一致性分析 |
| 6 CVB1 Nt-ELISPOT方法的应用 |
| 6.1 CVB1中和抗体的筛选 |
| 6.2 CVB1血清流行病学检测 |
| 讨论 |
| 1. CVB1病毒颗粒培养、纯化与鉴定 |
| 2. CVB1检测方法的优点与不足 |
| 总结与展望 |
| 小结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗的构建及免疫原性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 黏膜免疫系统及疫苗 |
| 1 黏膜免疫不同于系统免疫的特点 |
| 1.1 黏膜免疫系统的组成 |
| 1.2 黏膜免疫系统独立的结构体系 |
| 1.3 黏膜免疫应答 |
| 1.4 S-IGA功能 |
| 1.5 共同黏膜免疫机制 |
| 1.6 免疫反应 |
| 2 黏膜免疫系统的应用 |
| 2.1 黏膜免疫疫苗开发现状 |
| 2.1.1 呼吸道黏膜疫苗 |
| 2.1.2 肠道黏膜疫苗 |
| 2.1.3 生殖道黏膜疫苗 |
| 2.1.4 寄生虫黏膜免疫疫苗 |
| 2.2 黏膜免疫疫苗的接种途径 |
| 第二章 黏膜免疫抗原递呈活载体系统-NICE系统 |
| 1 黏膜免疫抗原递呈载体 |
| 2 乳酸菌与黏膜免疫 |
| 3 基因工程乳酸菌抗原递呈系统 |
| 3.1 基因工程乳酸菌表达载体类型 |
| 3.1.1 组成型表达载体 |
| 3.1.2 诱导型表达载体 |
| 3.2 乳酸菌乳链菌肽诱导表达系统 |
| 3.2.1 乳酸菌NICE系统的构成 |
| 3.2.2 NICE系统的优点 |
| 3.2.3 NICE系统作为黏膜疫苗抗原递呈活载体的应用 |
| 3.2.4 存在的问题及展望 |
| 第三章 黏膜免疫佐剂 |
| 1 细菌性物质 |
| 1.1 细菌毒素 |
| 1.1.1 CT和LT作为黏膜佐剂的应用 |
| 1.2 CPG ODN序列 |
| 1.2.1 CpG ODN作用机理 |
| 1.2.2 CpG ODN佐剂的应用现状 |
| 2 细胞因子 |
| 3 抗原传递系统 |
| 第四章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1 病原学特征 |
| 1.1 分类地位及生物学特性 |
| 1.2 病毒血凝性 |
| 1.3 PRRSV基因组成及其编码的蛋白功能 |
| 1.3.1 非编码区(5'NCR、3’NCR)和复制酶基因(ORFla、ORFlb) |
| 1.3.2 结构蛋白基因及其编码的蛋白质 |
| 1.3.2.1 非主要结构蛋白 |
| 1.3.2.2 主要结构蛋白 |
| 2 PRRSV的危害 |
| 2.1 抗体依赖性增强作用 |
| 2.1.1 ADE作用的机制 |
| 2.1.2 PRRSV的ADE的危害 |
| 2.2 病毒的持续性感染和继发感染 |
| 2.3 病毒的高度变异性 |
| 3 PRRSV的免疫 |
| 3.1 商品化疫苗的局限性 |
| 3.2 PRRSV免疫策略 |
| 第五章 研究的目的及意义 |
| 第二篇 研究部分 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因表达载体的构建 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、细胞 |
| 1.2 载体及菌株 |
| 1.3 工具酶及主要试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.4.1 病毒培养液 |
| 1.4.2 细菌培养基 |
| 1.4.3 感受态细胞制备及转化所用溶液 |
| 1.4.4 诱导剂Nisin处理 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 PRRSV ORF6基因提取纯化 |
| 2.1.1 引物设计合成 |
| 2.1.2 病毒扩增及总RNA提取 |
| 2.1.3 cDNA的合成 |
| 2.1.4 ORF6基因的扩增 |
| 2.1.5 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.1.6 靶基因的纯化回收 |
| 2.2 克隆载体PMD19-T-M的构建 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备 |
| 2.2.2 连接转化 |
| 2.2.3 质粒提取及鉴定 |
| 2.2.4 测序 |
| 2.3 表达PRRSV ORF6基因菌体的构建 |
| 2.3.1 表达PRRSV ORF6基因大肠杆菌的构建 |
| 2.3.2 表达PRRSV ORF6基因乳酸乳球菌的构建 |
| 2.4 基因工程重组菌的诱导表达 |
| 2.4.1 pET32a-M/PRRSV诱导表达及蛋白含量测定 |
| 2.4.2 PNZ8149/NZ3900-M/PRRS诱导表达 |
| 2.5 免疫活性检测 |
| 2.5.1 PNZ8149/NZ3900-M/PRRS诱导后产物间接免疫荧光分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 克隆载体PMD19T-M/PRRSV的构建 |
| 3.1.1 PMD19-M/PRRSV的鉴定 |
| 3.1.2 PMD19-M/PRRSV中ORF6基因测序鉴定 |
| 3.2 大肠杆菌表达系统的构建 |
| 3.2.1 pET32a-M/PRRSV的鉴定 |
| 3.2.2 M蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.2.3 M蛋白的纯化及含量测定 |
| 3.3 乳酸乳球菌表达系统的构建 |
| 3.3.1 重组质粒PNZ8149/NZ3900-M/PRRS的鉴定 |
| 3.3.2 M蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRRSV M蛋白的表达 |
| 4.2 乳链菌肽诱导表达(NICE)系统的选择 |
| 5 小结 |
| 第二章 重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS免疫原性检测 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 免疫原 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物选择及处理 |
| 2.2 免疫用试验材料的制备 |
| 2.2.1 免疫原制备 |
| 2.2.2 PNZ8149/NZ3900空载体菌液制备 |
| 2.3 样品采集及指标检测方法 |
| 2.3.1 免疫鼠黏膜中s-IgA检测 |
| 2.3.2 免疫鼠血清中特异抗体IgG检测 |
| 2.3.3 细胞因子(Cytokines)检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清特异性抗体IGG |
| 3.2 黏膜抗体s-IGA |
| 3.2.1 肠黏膜s-IgA |
| 3.2.2 呼吸道黏膜s-IgA |
| 3.3 细胞因子 |
| 3.3.1 细胞免疫评价因子IL-2、IL-4及IFN-γ |
| 3.3.2 黏膜淋巴因子IL-5 |
| 3.3.3 黏膜免疫耐受因子IL-10 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS诱导的免疫反应 |
| 4.1.1 黏膜免疫应答 |
| 4.1.2 系统免疫应答 |
| 4.2 黏膜免疫耐受 |
| 4.3 黏膜免疫接种途径 |
| 4.4 PRRSV感染的预防机制 |
| 5 小结 |
| 第三章 CPG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/C小鼠的佐剂效应 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 佐剂及免疫原 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物的选取及处理 |
| 2.2 免疫用试验材料的制备 |
| 2.3 样品采集及指标检测方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清IGG抗体 |
| 3.2 肠黏膜S-IGA |
| 3.3 呼吸道黏膜S-IGA |
| 3.4 细胞因子 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三篇 结论及创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）肠道病毒分离鉴定及EV71快速高通量中和实验方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1.EV71的分类和结构 |
| 2.EV71的基因型特征 |
| 3.EV71的复制周期 |
| 4.EV71的致病和传播 |
| 5.EV71的流行历史 |
| 6.EV71的检测 |
| 7.EV71中和实验方法 |
| 8.EV71动物模型的研究 |
| 9.EV71疫苗的研发 |
| 10.本论文研究的思路、目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果与分析 |
| 第一部分 肠道病毒的分离鉴定及肠道病毒库的建立 |
| 1.肠道病毒的分离 |
| 2.肠道病毒分离株的鉴定 |
| 3.肠道病毒库的建立 |
| 4.EV71培养及浓缩纯化 |
| 5.EV71鉴定方法的建立 |
| 第二部分 EV71快速高通量中和实验方法的建立 |
| 1.EV71酶联免疫斑点中和实验方法的建立 |
| 2.EV71酶联免疫中和实验方法的性能研究 |
| 3.EV71酶联免疫中和实验方法的初步应用 |
| 第三部分 EV71动物感染模型的初步研究 |
| 1.实验动物与EV71病毒株的选择 |
| 2.不同毒株EV71攻毒后对ICR乳鼠的存活率 |
| 3.不同毒株EV71攻毒后ICR乳鼠的病变发生率 |
| 4.不同毒株EV71攻毒后ICR乳鼠的体重变化情况 |
| 5.EV71攻毒后ICR乳鼠脑部组织切片的免疫组化检测 |
| 讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）EV71和人类共同抗原的鉴定及其作为重症HFMD潜在致病机理的研究和高敏核酸酶联免疫荧光试验的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略词 |
| 第一篇 肠道病毒 71 型与人类共同抗原的鉴定及其对神经系统潜在致病作用的研究 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手足口病概览 |
| 1.2 病毒学 |
| 1.3 病毒的致病机理 |
| 1.4 分子流行病学 |
| 1.5 机体对病毒的免疫反应及免疫病理 |
| 1.5.1 固有免疫反应 |
| 1.5.2 抗体反应 |
| 1.5.3 T 细胞免疫反应 |
| 1.6 本研究要解决的问题、实验思路及意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用化学药品 |
| 2.1.2 抗体和抗原 |
| 2.1.3 载体及细胞 |
| 2.1.4 其它试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病毒蛋白氨基酸序列与人体蛋白共同抗原表位的扫描 |
| 2.3.2 共同表位在病毒颗粒中位置的确定 |
| 2.3.3 共同表位抗原肽的合成 |
| 2.3.4 共同表位单克隆抗体的制备 |
| 2.3.5 MED25 真核表达质粒的构建 |
| 2.3.5.1 MED25 基因的 PCR 扩增 |
| 2.3.5.2 PCR 产物和质粒的酶切和连接 |
| 2.3.5.3 连接产物的转化与酶切鉴定 |
| 2.3.6 MED25 的真核表达和鉴定 |
| 2.3.7 MED25 与 2H2 和 MED25 多克隆抗体的免疫荧光共定位实验 |
| 2.3.8 MED25 截短蛋白（241-1080 bp）原核表达质粒的构建 |
| 2.3.9 MED25 截短蛋白的原核表达 |
| 2.3.10 MED25 截短蛋白的纯化 |
| 2.3.11 MED25 截短蛋白与 2H2 单抗的 ELISA 试验及 ELISA 抑制试验 |
| 2.3.12 MED25 截短蛋白与 2H2 之间亲和常数的测定 |
| 2.3.13 EV 71 VLP 和 MED25 兔高免血清的制备 |
| 2.3.14 EV 71 VLP 和 MED25 免疫血清以及 EV71 感染人血清中共同抗体的检测 |
| 2.3.15 小鼠脑组织的免疫组化 |
| 2.3.16 小动物活体成像技术检测抗共同抗原的抗体在体内的分部 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 EV71 VP1 蛋白与人类脑组织蛋白存在共同表位 |
| 3.2 共同表位位于病毒颗粒外表面峡谷斜坡上 |
| 3.3 单克隆抗体 2H2 的纯化及其与共同表位抗原肽和 EV71 VP1 的反应性 |
| 3.4 真核细胞表达质粒 pcDNA3.1-MED25XXH 构建 |
| 3.5 MED25-His 真核细胞内的表达和鉴定 |
| 3.6 MED25 蛋白的 2H2 和抗 MED25 抗体免疫荧光共定位 |
| 3.7 MED25 截短蛋白原核表达质粒 pET28a-MJDEXH 的构建 |
| 3.8 MED25 截短蛋白的表达与纯化 |
| 3.9 MED25 截短蛋白可有效地抑制 2H2 与 VLP 的结合反应 |
| 3.10 MED25 与 2H2 的亲和常数 |
| 3.11 MED25 和 VLP 高免血清以及 EV71 感染人血清中存在高水平的抗共同抗原的抗体 |
| 3.12 小鼠脑组织免疫组化 |
| 3.13 2H2 在体内与小鼠脑组织间的反应性 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二篇 高灵敏性核酸酶联免疫荧光探针试验的建立 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ELISA 方法的背景与现状 |
| 1.2 本研究目的、创新性及意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 缓冲液 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 核酸酶活性评估 |
| 2.2.2 酶-底物反应灵敏性测定 |
| 2.2.3 Turbo 核酸酶的生物素化及生物素化后活性鉴定 |
| 2.2.4 核酸酶联免疫荧光探针试验 |
| 2.2.5 NP-SA、bio-TN、荧光探针的最适工作浓度和纳米颗粒粒径的优化 |
| 2.2.6 NP-SA 和荧光探针底物信号放大效应的鉴定 |
| 2.2.7 灵敏性、特异性和重复性检测 |
| 2.2.8 NLFOA 与 ELISA 方法的灵敏性比较 |
| 2.2.9 NLFOA 与 ELISA 两种方法信噪比（S/N）的比较 |
| 2.2.10 统计方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 标记酶的选择 |
| 3.2 常用集中酶-底物系统和 TurboNclease-荧光探针系统的敏感性检测 |
| 3.3 NP-SA、bio-TN 和荧光探针的最适工作浓度 |
| 3.4 NP-SA 和荧光探针的信号放大效应 |
| 3.5 NLFOA 与 ELISA 对 p24 的检测灵敏性比较 |
| 3.6 NLFOA 的特异性和重复性 |
| 3.7 NLFOA 的信噪比（S/N） |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（8）牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 牛肠道病毒概述 |
| 1.1.1 形态结构与理化性质 |
| 1.1.2 基因结构及功能 |
| 1.1.3 病毒的分类 |
| 1.1.4 病毒的感染与复制 |
| 1.2 牛肠道病毒的流行现状 |
| 1.2.1 国外流行现状 |
| 1.2.2 国内流行现状 |
| 1.2.3 牛肠道病毒的检测技术 |
| 1.3 RNA病毒的反向遗传学研究 |
| 1.3.1 反向遗传学概述 |
| 1.3.2 RNA病毒反向遗传学发展历程 |
| 1.3.3 反向遗传学在肠道病毒中的应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物、病料、血清 |
| 2.1.2 细胞、病毒、培养基 |
| 2.1.3 质粒与菌株 |
| 2.1.4 酶类与主要试剂 |
| 2.1.5 主要设备和仪器 |
| 2.1.6 试剂配制 |
| 2.1.7 试验参考毒株序列信息 |
| 2.2 牛肠道病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的分离 |
| 2.2.3 病毒TCID50测定 |
| 2.2.4 病毒的蚀斑纯化 |
| 2.2.5 病毒的核酸型鉴定 |
| 2.2.6 随机RT-PCR鉴定第一批病料 |
| 2.2.7 RT-PCR鉴定第二批病料 |
| 2.2.8 病毒的鉴定 |
| 2.3 乳鼠感染模型的建立 |
| 2.3.1 感染模型的建立 |
| 2.3.2 多重感染模型的建立 |
| 2.4 牛肠道病毒的全基因克隆 |
| 2.4.1 引物设计 |
| 2.4.2 病毒m RNA的提取 |
| 2.4.3 5’RACE法扩增 5’端片段 |
| 2.4.4 其它目的片段扩增 |
| 2.4.5 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.4.6 PCR产物的连接与转化 |
| 2.4.7 重组质粒的鉴定及测序 |
| 2.4.8 全基因序列的拼接和分析 |
| 2.5 HLJ-3531株重组病毒的拯救 |
| 2.5.1 引物设计及连接策略 |
| 2.5.2 病毒RNA的提取 |
| 2.5.3 PCR反应扩增目的基因 |
| 2.5.4 克隆载体的构建 |
| 2.5.5 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建 |
| 2.5.6 重组病毒的拯救 |
| 2.5.7 重组病毒的鉴定 |
| 2.5.8 重组病毒生物学特性的研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 牛肠道病毒的分离鉴定 |
| 3.1.1 病毒的分离 |
| 3.1.2 病毒的TCID50测定 |
| 3.1.3 病毒的蚀斑纯化 |
| 3.1.4 病毒的核酸型鉴定 |
| 3.1.5 第一批病料PCR鉴定结果 |
| 3.1.6 第二批病料PCR鉴定结果 |
| 3.1.7 病毒的鉴定 |
| 3.2 乳鼠感染模型建立 |
| 3.2.1 感染模型建立 |
| 3.2.2 多重感染模型的建立 |
| 3.3 牛肠道病毒的全基因克隆 |
| 3.3.1 5’端的克隆 |
| 3.3.2 其他片段的扩增与鉴定 |
| 3.3.3 序列拼接及基因组结构分析 |
| 3.3.4 N-糖基化位点比较分析 |
| 3.3.5 进化树分析 |
| 3.3.6 VP1氨基酸比对 |
| 3.4 HLJ-3531株感染性分子克隆的建立 |
| 3.4.1 3531-A、3531-B片段的克隆 |
| 3.4.2 重组克隆载体构建结果 |
| 3.4.3 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建结果 |
| 3.4.4 重组病毒的拯救 |
| 3.4.5 重组病毒r HLJ-3531的鉴定 |
| 3.4.6 重组病毒r HLJ-3531的特性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 牛肠道病毒的分离鉴定 |
| 4.2 两株病毒的宿主嗜性分析 |
| 4.3 动物模型的建立及组织分布 |
| 4.3.1 感染动物的选择 |
| 4.3.2 感染方式的选择 |
| 4.3.3 感染组织分布 |
| 4.3.4 两株病毒乳鼠感染模型差异的分析 |
| 4.4 病毒的全基因序列克隆方法的分析 |
| 4.4.1 全基因克隆策略的选择 |
| 4.4.2 RACE扩增法及其影响因素 |
| 4.5 两株牛肠道病毒的分类分析 |
| 4.6 HLJ-3531的感染性克隆构建 |
| 4.6.1 全长c DNA构建策略 |
| 4.6.2 重组病毒的鉴定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）新型复合乳佐剂的制备及其在狂犬病疫苗中的运用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 狂犬病毒的组织培养和抗原制备 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 人胚肺二倍体细胞和狂犬病毒使用毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要耗材 |
| 1.4 仪器和设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 工作种子批的制备 |
| 2.2 带毒连续传代培养 |
| 2.3 培养条件的研究 |
| 2.4 病毒滴度的测定 |
| 2.4.1 小鼠LD_(50)测定方法 |
| 2.4.2 双抗体夹心ELISA方法的研究 |
| 2.4.3 细胞ELISA方法的建立 |
| 2.5. 数据统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 不同批次病毒原液小鼠LD_(50)检测结果 |
| 3.2. 双抗体夹心ELISA的非特异性干扰 |
| 3.3. 细胞ELISA检测结果 |
| 3.4. 体内法与体外法数据的比较 |
| 3.5. 狂犬病毒培养条件的确定 |
| 3.6. 相同批次连续收毒的实现 |
| 4. 本章小结 |
| 5. 讨论 |
| 第二章 狂犬病疫苗佐剂候选成分的筛选 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 细胞与病毒 |
| 1.2. 各种佐剂候选成分的药理学意义 |
| 1.3. 实验耗材 |
| 1.4. 实验设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 疫苗配制及分组 |
| 2.2. 动物免疫程序 |
| 2.3. 动物采血 |
| 2.4. 血清的灭活 |
| 2.5. 血清抗体的检测方法 |
| 2.5.1. 快速荧光灶抑制试验法(RFFIT) |
| 2.5.2. 细胞ELISA方法: |
| 3. 结果 |
| 3.1 细胞ELISA和RFFIT法在狂犬病抗体检测中的比较 |
| 3.2 佐剂候选成分的筛选 |
| 3.2.1. 抗狂犬病毒抗体产生的及时性 |
| 3.2.2. 高滴度抗狂犬病毒抗体的产生 |
| 4. 本章小结 |
| 5. 讨论 |
| 第三章 新型乳佐剂的制备和免疫效果及机制的研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验设备 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1. 新型乳佐剂的制备工艺 |
| MF59制备工艺 |
| 复合乳佐剂Golden05制备工艺 |
| 3.2. 新型Golden05乳佐剂的理化指标检测 |
| 3.3. 狂犬病Golden05佐剂疫苗的动物安全性评价 |
| 3.4. 狂犬Golden05佐剂疫苗的免疫效果研究 |
| 3.4.1. 抗体水平的监测 |
| 3.4.2. 小鼠中和试验法(仲裁法):NMT方法 |
| 3.4.3. 狂犬病Golden05佐剂疫苗的效价测定法(NIH法) |
| 3.5 狂犬Golden05佐剂疫苗的免疫机制的研究 |
| 3.5.1. 细胞炎性因子的测定 |
| 3.5.2. 体外细胞刺激ELISAPOT |
| 3.5.3. SDH活性测定 |
| 3.6. 狂犬Golden05佐剂疫苗的皮内免疫 |
| 3.7. 狂犬Golden05佐剂疫苗的粘膜挑战试验 |
| 3.8. 数据统计 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1. 新型乳佐剂Golden05的理化指标监测结果 |
| 4.2. 新型乳佐剂KML05的毒理学指标监测结果 |
| 4.3 狂犬病Golden05佐剂疫苗的免疫效果监测结果 |
| 4.3.1. 血清有保护性阳转率 |
| 4.3.2. 有效中和抗体的产生时间 |
| 4.3.3. 挑战实验/攻击实验 |
| 4.3.4. 中和抗体IgG的长效性试验 |
| 4.4. 免疫机制的细胞因子监测结果 |
| 4.4.1. ELISPOT检测脾脏中的IFN-γ和IL-4 |
| 4.4.2. 炎性因子的表达 |
| 4.4.3. 琥珀酸脱氢酶活性鉴定 |
| 4.5. 狂犬Golden05佐剂疫苗的皮内免疫的积极意义 |
| 4.5.1. 血清有效保护性阳转率 |
| 4.5.2. IgA的分泌水平 |
| 4.6. 狂犬Golden05佐剂疫苗抗粘膜感染 |
| 5. 本章小结 |
| 6. 讨论 |
| 6.1. 开展本研究的意义和佐剂研究进展 |
| 6.2. 琥珀酸脱氢酶的稳定剂在狂犬病疫苗佐剂中的价值 |
| 6.3. 不同的注射方式也会引起不同趋势的抗体滴度 |
| 6.4. 皂苷类天然化合物对狂犬病疫苗的辅佐作用 |
| 6.5. 关于Golden系列佐剂的讨论 |
| 6.6. 关于“MF59”引用问题的讨论 |
| 6.7. 关于新型乳佐剂与狂犬疫苗免疫机制的推论 |
| 6.8. 复合乳佐剂疫苗阻抑狂犬病毒的免疫逃逸 |
| 参考文献 |
| 附录1. 开展狂犬病毒实验的实验室生物安全管理和风险管理 |
| 附录2. 开展狂犬病毒实验的医学动物伦理认可 |
| 附录3. 来自世界卫生组织的专家共识 |
| 附录4. 各批次病毒原液通过脑内接种后小鼠的存活数统计(存活数/动物总数) |
| 附录5. 细胞ELISA检测病毒滴度结果值 |
| 附录6. 细胞ELISA检测检测免疫后小鼠抗体滴度和计算结果 |
| 附录7. ELISA实验所用溶液的配置 |
| 附录8. 常用实验技术 |
| 附录9. 关于狂犬病毒和狂犬病疫苗知识点的认识和展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立及新型亚单位疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 主要缩略词英汉对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.PEDV 的分类 |
| 2.PEDV基因组结构和功能 |
| 3.PEDV编码蛋白和功能 |
| 4.PED流行病学 |
| 4.1 国外PED流行病学 |
| 4.2 国内PED流行病学 |
| 5.PEDV进入细胞的影响因素 |
| 5.1 病毒受体的作用 |
| 5.2 激活水解 S 蛋白的条件 |
| 5.3 PEDV 病毒复制的环境要求 |
| 6.PEDV疫苗研究历史 |
| 6.1 北美PEDV疫苗研究历 |
| 6.2 亚洲PEDV疫苗研究历 |
| 7.PEDV的病原学和血清学诊断方法 |
| 7.1 PEDV病毒感染动力学和宿主对感染的反应 |
| 7.2 PEDV诊断 |
| 7.2.1 病毒学试验检测PEDV和病毒抗原 |
| 7.2.2 PCR检测PEDV核酸 |
| 7.2.3 检测PEDV特异性抗体的血清学试验 |
| 8.免疫色谱法或侧向流分析法 |
| 8.1 常规侧向流分析法(LFA) |
| 8.2 荧光微球免疫分析LFAs |
| 8.3 LFA材料 |
| 8.4 纳米颗粒 |
| 8.5 LFA检测 |
| 8.6 先进分析优化工具 |
| 9.本研究的目的意义 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒N基因的克隆、鉴定及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 目的基因、菌种和载体 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 琼脂糖凝胶电泳所用溶液 |
| 1.5 仪器和设备 |
| 1.6 目的基因的扩增 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因扩增 |
| 2.2 重组质粒的构建 |
| 2.3 目的基因核苷酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒N基因原核表达、纯化以及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株、主要试剂 |
| 1.2 常用缓冲溶液和培养基的制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 表达载体的构建与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pET-32a-N的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 细胞系、试验动物和病毒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 单抗制备常用溶液及其配制 |
| 1.5 动物免疫 |
| 1.6 骨髓瘤细胞的准备 |
| 1.7 饲养层细胞的制备 |
| 1.8 脾细胞的准备 |
| 1.9 细胞融合 |
| 1.10 杂交瘤细胞的制备 |
| 1.11 间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.12 杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.13 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 1.14 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 1.15 腹水的制备及抗体效价测定 |
| 1.16 单抗亚类的鉴定 |
| 1.17 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 1.18 单克隆抗体Western blot鉴定 |
| 1.19 杂交瘤细胞株稳定性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.2 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3 单抗效价测定 |
| 2.4 单抗亚类鉴定 |
| 2.5 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.6 单克隆抗体Western blot鉴定 |
| 2.7 单克隆抗体的IFA分析 |
| 2.8 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性 |
| 3 讨论 |
| 第五章 猪流行性腹泻病毒的金标试纸检测方法的初步建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 样品稀释 |
| 1.4 氯金酸水溶液 |
| 1.5 毒株 |
| 1.6 胶体金制备 |
| 1.7 胶体金标记抗体的制备 |
| 1.7.1 单抗纯化 |
| 1.7.2 免疫胶体金的制备和纯化 |
| 1.7.3 检测单抗及质控二抗标记量的确定 |
| 1.7.4 金标检测试纸条的组装 |
| 1.7.5 金标试纸条检测结果的判定 |
| 1.7.6 金标试纸条评价试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 单抗纯化效果鉴定 |
| 2.2 胶体金的制备 |
| 2.3 免疫胶体金的制备 |
| 2.4 检测带和质控带的硝酸纤维素膜(NC膜)蛋白浓度确定 |
| 2.5 金标试纸条评价试验 |
| 3 讨论 |
| 第六章 猪流行性腹泻病毒不同时间毒株S基因的同源性和遗传分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 31 株PEDV参考毒株S基因的核苷酸序列分析 |
| 2.2 31 株PEDV参考毒株S蛋白序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第七章 猪流行性腹泻病毒S1优化基因在重组杆状病毒的表达与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组杆状病毒转移载体构建和鉴定 |
| 2.2 重组杆粒构建和鉴定 |
| 2.3 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 2.4 表达蛋白间接免疫荧光鉴定 |
| 2.5 纯化蛋白SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.6 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第八章 猪流行性腹泻病毒亚单位纳米佐剂疫苗免疫评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠中和抗体检测结果 |
| 2.2 猪不同免疫组中和抗体检测结果 |
| 2.2.1 无免疫佐剂组IFN-γ含量检测 |
| 2.2.2 无免疫佐剂组IL-4 含量检测 |
| 3 讨论 |
| 第九章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
四、应用间接免疫荧光技术测定人血清中的脊髓灰质炎病毒抗体（论文参考文献）
- [1]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [2]病毒感染的血清学诊断进展[J]. 陈伟华,Nathalie,J.Schmidt. 兽医科技资料, 1979(S1)
- [3]柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备及小鼠体内保护效力[D]. 禹玉婷. 武汉生物制品研究所, 2020(01)
- [4]柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用[D]. 尹志超. 厦门大学, 2019(09)
- [5]猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗的构建及免疫原性评价[D]. 王振华. 四川农业大学, 2012(08)
- [6]肠道病毒分离鉴定及EV71快速高通量中和实验方法的建立[D]. 蔡毅君. 厦门大学, 2009(12)
- [7]EV71和人类共同抗原的鉴定及其作为重症HFMD潜在致病机理的研究和高敏核酸酶联免疫荧光试验的建立[D]. 范培虎. 吉林大学, 2015(08)
- [8]牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立[D]. 张海丽. 东北农业大学, 2015(03)
- [9]新型复合乳佐剂的制备及其在狂犬病疫苗中的运用和机制研究[D]. 刘泽. 北京协和医学院, 2019(02)
- [10]猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立及新型亚单位疫苗的研究[D]. 祁光宇. 甘肃农业大学, 2019(02)