一、含有地龙溶栓酶的保健品和药品（论文文献综述）
龚玲[1]（2015）在《MTs调控参环毛蚓重金属富集机制及其平喘作用的研究》文中研究指明目的：参环毛蚓的药材习称为“广地龙”,是国内外药材市场中公认的地龙优质产品。然而广地龙重金属超标问题一直制约其进一步发展。本团队通过实验研究,发现药材重金属超标与其动物所具有的重金属富集和耐受生理特性有直接关系,并且已确认重金属富集作用与金属硫蛋白（MTs）相关。但是,更深层次地解释参环毛蚓重金属富集现象如何产生?其调控机制如何?在不影响已有药效的前题下,如何从源头上控制药材重金属超标等问题一直未能解决。本文试图从MTs入手,系统阐明MTs在调控参环毛蚓重金属富集中的作用,明确其重金属调控机理,同时通过动物实验考察MTs对哮喘小鼠气道炎症和气道高反应的影响,为揭示参环毛蚓重金属富集特性的分子生物学机制奠定基础,也为进一步制定解除广地龙药材重金属富集策略,保证其药材安全有效提供依据。方法：1.采用划线法活化含有pET-32a（+）-MT-2重组质粒及pET-32a（+）对照质粒保存菌株,IPTG诱导其表达,使用SDS-PAGE和Western Blot检测及确认其表达情况。2.不同浓度重金属镉胁迫处理表达重组MT-2基因菌株,分别采用平板涂布观察法及原子吸收法考察其提高重金属耐受及富集特性。3.将MT-2重组转化菌经IPTG诱导表达后,离心获得菌体,再经超声和溶菌酶破菌后SDS-PAGE分析其表达形式,并利用Ni柱纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化,同时体外建立自由基损伤DNA模型,通过琼脂糖电泳考察纯化MT-2重组蛋白抗氧化损伤的能力。4.结合GenBank数据库中有关蚯蚓Actin序列,设计引物,通过PCR扩增,扩增产物交由华大基因生物公司测序,Blast相似性搜索验证扩增和测序结果的准确性。根据获知内参Actin基因及MT-2 cDNA序列设计引物,通过荧光定量PCR研究不同浓度重金属胁迫处理下参环毛蚓体内MT-2 mRNA转录水平的变化。5.根据已知的MT-2 cDNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增MT-2基因的编码区序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。6.采用BALB/c哮喘小鼠模型,使用全身体积扫描系统进行气道反应性测定,取其肺部组织病理组织切片进行HE、PAS染色,用台盼蓝染色法对其细胞灌洗液（BALF）中总细胞数计数,同时使用ELISA分别检测小鼠血清中的IgE以及BALF中IL4、IL5、IL13的水平。结果：1. SDS-PAGE电泳表明重组MT-2蛋白成功表达,Western blot证实了表达产物的正确性,表明MT-2重组菌株可用于后续实验。2.重金属耐受性实验表明,表达MT-2重组蛋白的菌株耐镉的能力明显高于空白对照菌,且镉的最高耐受剂量可达250 μ M。重金属富集实验表明,较空白对照菌,表达MT-2重组蛋白的菌株重金属富集能力显着增强。在低剂量组镉离子（10μM和20pM）处理下,MT-2重组菌吸附重金属的含量分别为对照菌的1.9和8.8倍；而在高剂量组镉离子（250μM和500μM）处理下,MT-2重组菌吸附重金属的含量分别为对照菌的4.4和8.3倍。结果表明,金属硫蛋白在抗重金属毒害、重金属富集方面具有重要作用。3. SDS-PAGE分析,MT-2重组蛋白的表达形式有可溶和不可溶两种形式,主要以可溶形式为主。将收集菌体裂解上清液经Ni纯化试剂盒可获得纯度较高的MT-2重组蛋白。体外琼脂糖凝胶电泳显示,MT-2重组蛋白可明显保护自由基引起的DNA损伤,且与其剂量呈正相关。4.经PCR扩增、测序后获得参环毛蚓Actin部分cDNA序列,再经Blast相似性搜索,结果表明Actin基因片段的扩增和测序结果准确和可靠性,可用于参环毛蚓定量PCR的研究。MT-2基因实时定量PCR结果表明,重金属镉可显着诱导MT-2 mRNA的表达,表达水平呈一定的剂量-效应关系。镉诱导3天时,mRNA的表达已显着升高,经镉诱导7天时,其表达水平达到最高。5.经PCR扩增、测序后获得2826 bpMT-2基因编码区序列,将该序列与已知的MT-2cDNA序列（登录号为KC787373.1）进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1534bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个参与调控MT-2表达的特异响应重金属MRE元件。6.对小鼠气道阻力值的测定发现,生理盐水和不同浓度的乙酰甲胆碱激发后,哮喘模型组小鼠气道阻力显着高于空白组（p<0.01）,而MTs组与模型组比无明显变化,不具有统计学意义（p<0.05）；模型组小鼠BALF中总细胞高于空白组（p<0.01）,MTs组与模型组比总细胞数无明显下降,无统计学意义；模型组血清IgE和BALF中IL4、IL5及IL13的水平明显高于空白组（p<0.01）,MTs与模型组比,无统计学意义。结论：本研究从蛋白、基因以及整体水平等多个层面,明确了MTs介导参环毛蚓重金属富集作用机制以及其调控机理,同时还明确了MTs是使机体免受重金属毒害的应激产物,且对广地龙平喘功效几无贡献。研究结果表明MTs可作为进一步解除或阻断其重金属离子富集的重要靶点,既为今后利用基因工程技术保障药用部位的品质夯实了基础,又为培育参环毛蚓优良新品种,从源头上保证临床用药安全有效开辟了新途径。
赵旭壮[2]（2012）在《蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究》文中研究指明蚯蚓是一种常用的动物药材，其体内含有丰富的蛋白质和活性物质。蚯蚓与人类关系十分密切，除作为传统中药外，还可提取蚓激酶、多种氨基酸等活性成分。蚓激酶是从蚯蚓中提取的一类具有纤溶酶活性的蛋白质，具有溶解血栓的作用，是目前最具有开发前景的纤溶药物之一。蚯蚓体内含还有多种氨基酸，本文采用多种酶水解法对蚯蚓提取物中蛋白浆液水解，研究了蚯蚓中的复合氨基酸。本文主要综述了目前研究现状，对蚯蚓部分有效成分开展了基础研究。本论文采用分级盐析法对赤子爱胜蚯蚓中蚓激酶的提取工艺进行研究，通过纤维蛋白溶解圈面积和蚯蚓蛋白质含量的比值来表征蚓激酶的比活力。并通过单因素实验设计研究了提取缓冲液pH、第一次盐析硫酸铵浓度、第二次盐析硫酸铵浓度对蚓激酶提取的影响，并用SDS-PAGE测定了酶的分子量，并探讨了金属离子对酶活力的影响。在复合氨基酸的制备中，对蚯蚓进行了脱脂、脱色、除臭试验进行了研究，选取提取温度、水解时间、pH、底物浓度对水解条件的影响。并采用正交实验设计考察最佳提取温度、最佳提取时间、最佳pH、最佳底物浓度，优化了提取工艺条件。蚓激酶的提取工艺结果表明，蚓激酶的最佳提取条件为：缓冲液pH为7.5，第一次盐析时最佳饱和硫酸铵浓度为40%，第二次盐析硫酸铵浓度为80%，此条件下蚓激酶的比活力最高。提高酶活力的离子为K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+，而Pb2+为抑制剂。通过电泳实验可知，蚯蚓中提取的蛋白质的分子量分布很广，从15kDa到90kDa都有分布，主要分布在15kDa、50kDa、70kDa和90kDa附近。通过对蚯蚓的脱脂、脱色、除臭试验研究，得出以下结论：①就脱脂、除臭、脱色的方法而言，索式提取法优于浸提法。②就溶剂的脱脂、除臭、脱色的性能而言，研究所选溶剂以丙酮最佳。③当以丙酮为溶剂时，索式提取法、液固比为2：1的条件下，回流时间的延长对脱色、脱脂、脱臭无影响，均可获得白色、无臭的蚯蚓蛋白，脱脂率可达100%；而无水乙醇在相同条件下（索式提取法、液固比为2∶1），回流时间的延长对脱色无影响，对脱脂效果微有增长，但除臭效果甚差，不能根除腥味。本实验采用多种蛋白酶对蚯蚓浆液进行水解，由于不同蛋白酶的酶切位点不同，这样就可以使水解更为彻底。中性蛋白酶水解20g蛋白浆液，在底物浓度为3%，调节pH为7.0左右，保持温度为40℃，水解2h后，测得氨基氮含量为33.62mg/100mL；碱性蛋白酶水解20g蛋白浆液，在底物浓度为2%，调节pH为8.0左右，保持温度为50℃，水解2h后，测得氨基氮含量为41.32mg/100mL；胰蛋白酶水解20g蛋白浆液，在底物浓度为3%，调节pH为8.0左右，保持温度为50℃，水解3h后，测得氨基氮含量为57.43mg/100mL。
程果[3]（2011）在《蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究》文中认为本文为了探索蚯蚓提取物中的镇痛有效成分,对蚯蚓体内镇痛活性物质进行了分离纯化,研究其镇痛活性和作用,研究方法和结果如下：一.分离纯化：利用30%硫酸铵沉淀法对蚯蚓组织匀浆进行蛋白分离,分离产物利用27mm（MD34）透析袋（MW：12000-14000）进行透析。采用CM Sephadex C-50阳离子交换层析从蚯蚓蛋白粗提物中分离纯化出5个波峰,并采用Bulbring法筛选出其中两种可能具有镇痛活性的组分,分别为ACAE-C和ACAE-D;再利用Sephadex G-75凝胶过滤层析进一步分离纯化得到4个波峰,分别为ACAE-C1、ACAE-C2、ACAE-D1、ACAE-D2。利用SDS-PAGE样品凝胶,在Biosens SC805凝胶成像系统上成像,以Marker为对照,通过系统软件计算样品分子量,ACAE-C1分子量大约为28.3kD, ACAE-D1分子量约为26.4～32.3kD之间,ACAE-D2分子量约为26.0～31.8kD之间。二.镇痛成分的作用研究：1.小鼠热板法,测定了经Bulbring法筛选出的2个镇痛活性组分的镇痛作用。实验发现,ACAE-C和ACAE-D能够有效的提高痛阈,延长小鼠发生舔足反应的时间2.醋酸扭体法,实验发现,ACAE-C和ACAE-D能够有效的提高痛阈,减少小鼠因疼痛引起的扭体反应,并发现,蚯蚓提取物对痛阈的影响强度与剂量成正比,给药60min后,镇痛效果最佳,从而进一步证实了ACAE-C和ACAE-D的镇痛效果。3.Bulbring法,制备大鼠膈肌-膈神经离体模型,分别刺激膈神经和膈肌,筛选具有镇痛活性组分,并研究其作用靶点。实验发现,ACAE-C1组分对电刺激膈神经引起的肌肉收缩具有一定的抑制作用,对电刺激膈肌引起的肌肉收缩现象没有影响,其对电刺激神经引起的肌肉收缩的抑制作用抑制率可以达到50%-55%。三.动物实验采用经硫酸铵沉淀法制备的蚯蚓蛋白粗提物对小鼠Ⅱ度烫伤模型进行治疗,发现通过创面涂抹进行了5倍稀释或10倍稀释的蚯蚓蛋白粗提物,可以有效增加烫伤愈合面积,提高烫伤愈合率,加快结痂和痂皮脱离速度。通过免疫组织化学染色诊断发现,在烫伤初期蚯蚓蛋白粗提物可以加速肉芽组织对创面的充填,烫伤中后期可以加速血管细胞再生和减少炎性细胞的浸润。本实验首先通过CM Sephadex C-50阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析,从蚯蚓蛋白组分中分离纯化到一种具有镇痛活性较强的物质的ACAE-C1,该组分是一种小分子蛋白质,分子量约为28.3kD；其次研究了各级纯化产物对动物镇痛作用的影响,发现ACAE-C和ACAE-D具有镇痛活性；再次利用蚯蚓蛋白组分对小鼠Ⅱ度烫伤进行治疗,发现该组分具有加速创面愈合,减少炎性产物渗出的作用。
吾玛尔·阿布力孜,宋曼殳,阿不都拉·阿巴斯[4]（2008）在《背暗异唇蚓蛋白酶解工艺的研究》文中进行了进一步梳理采用木瓜蛋白酶（papain）和碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L）分别水解新疆产背暗异唇蚓（Allolobophora caliginosa trapezoides, Duges 1828）的蛋白,以氨基酸含量为衡量指标,通过单因素与正交试验设计,对最佳酶条件进行比较筛选研究,并分析了酶解液氨基酸含量。结果表明:采用木瓜蛋白酶最佳酶解条件为:温度 50℃、pH7.5、酶浓度 0.3%、作用时间 8h,而碱性蛋白酶的最佳酶解条件为:温度 50℃、pH7、酶浓度 0.3%、作用时间 8h,在此条件下,酶解背暗异唇蚓蛋白的水解液氨基酸含量分别可达到16.55mg/ml 和29.48mg/ml,Alcalase 2.4L蛋白酶对背暗异唇蚓的酶解效率比木瓜蛋白酶高。因此,需要制造新型富含氨基酸、微量元素及小肽添加剂时,可选用Alcalase 2.4L。
郭金明[5]（2008）在《单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究》文中进行了进一步梳理血栓性疾病是严重危害人类健康的常见多发病,心脑血管疾病中有很大比例本质为血栓病,它主要危害心、脑、肺等的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在我国,每年有超过260万人死于心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万人,并且,这类疾病的发病率曾逐年上升趋势。纤溶疗法是治疗血栓性疾病的主要手段之一,迄今溶栓药物已发展了三代,但距理想的溶栓药物尚有差距。寻找和开发新型溶栓剂仍是心脑血管疾病治疗的重要内容。鉴于海洋生物活性物质具有独特的优点,海洋生物日益成为新药开发的珍贵资源。本实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:单环刺螠纤溶酶在单环刺螠体腔液及内脏等组织内含量丰富,经优化工艺可提取多种酶活力组分,很可能是一组同工酶。我们试用两套工艺均能制得单环刺螠纤溶酶UFEⅠ,达电泳纯,经过提取分离纯化工艺的酶纯化倍数可达11-12倍,产品酶得率可达27.0-30.0%。单环刺螠纤溶酶经Native-PAGE电泳分析,该酶纯度已经达到99%;经SDS-PAGE和飞行质谱测定其分子量约为23,800Da;糖含量测定表明,该酶不是一种糖蛋白。单环刺螠纤溶酶,在45℃以下时酶活力稳定,6 h内酶的活性基本保持不变;在10种不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11）的缓冲液中于室温下放置24 h,酶活无明显改变。单环刺螠纤溶酶的最适反应温度为45℃,最适pH约为6.5。Ag+离子对单环刺螠纤溶酶有抑制作用,Mn2+和Mg2+离子对酶有活化作用。其他金属离子。以酪蛋白为底物,根据双倒数作图法（Lineweaver-Burk plot）求出的酶反应的动力学常数为:Km=3.48×10-3mol·L-1,Vmax=1.20×10-2mol·L-1·min-1。单环刺螠纤溶酶对纤维蛋白具有很高的亲和性,不仅可以降解纤维蛋白,还具有较高的激酶活性,这使得该酶能够激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地溶解纤维蛋白。体外抗凝、溶栓实验结果表明:与蚓激酶相比,单环刺螠纤溶酶具有更好的抗凝作用和溶栓效果,而且对血红细胞损伤较小。综上所述,由于单环刺螠纤溶酶分子量小、酶活性稳定、溶栓活性强、对血红细胞损伤小等优点,做为溶栓剂具有潜在的应用开发价值。
吴文如[6]（2008）在《地龙种质资源与品质评价研究》文中认为地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris（Chen）、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera（Michaelsen）的干燥体。前一种习称“广地龙”,后三种习称“沪地龙”,为常用动物类中药,具有清热定惊,通络平喘,利尿的功效。现代研究表明,地龙具有降压、抗血栓、抗心律失常、抗癌、抗溃疡、解热镇痛、镇静、平喘、抗菌等多种药理作用,几乎涉及人体各个系统,因此近年来地龙的需求量与日俱增。长期以来地龙类药用动物处于自然生长状态,药材来源多为野生采集,人工养殖尚未较大规模开展,地龙药材的产量和质量易受采集方法、环境以及自然气候影响而不定。且由于地龙类药用原动物品种较多,尚缺乏真实有效的鉴别方法,经常出现误采误收的现象,导致各地市场上的广地龙药材品种混杂,价格变化较大,药材品质优劣参差不齐等问题,极大地影响了地龙的生产与发展。为了确保地龙资源的可持续发展与利用,我们在广东省惠州市博罗县建立了地龙（参环毛蚓）规范化养殖基地,并在此基础上对现有地龙的资源种类、分布进行调查,研究了其生物学特性、遗传多样性和地理背景系统,建立药材综合品质评价指标。研究的结果概括如下:一、文献综述查阅了大量与本研究相关的国内外文献资料,系统的总结了前人的研究成果与存在的问题,针对地龙药材资源与鉴定、药材质量控制与评价、安全性研究等方面存在的薄弱环节提出了本论文的研究内容与目标。二、地龙类药用动物的种质资源调查对地龙药材进行了药源调查和分类学研究,结果表明:地龙全国均有分布,广东、广西为“广地龙”药材主要产区;上海、浙江、江苏为“沪地龙”主要产区;其余各地习用品种为“土地龙”。全国地龙主要商品来源为“广地龙”。我国地龙药材的原动物主要有14种和变种,分别隶属于钜蚓科、正蚓科的3个属。三、地龙类药用动物的物种鉴别通过实地捕捉或委托采集的方式收集到国内地龙主要产区的16个不同地点的蚯蚓样品共351条,利用经典动物分类学方法对所收集的样本进行鉴别,发现广东省主要分布着参环毛蚓Pheretima.aspergillum（E Perrier）,其中也少量分布有白颈环毛蚓P.californica（Kinberg）和壮伟环毛蚓P.robusta（E.Perrier）;广西地区除了分布有参环毛蚓aspergillum（E Perrier）外,还分布有数量均比较多的通俗环毛蚓P.vulgaris（Chen）和白颈环毛蚓P.californica（Kinberg）,以及少量的威廉环毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）和壮伟环毛蚓P.robusta（E.Perrier）;湖北省主要为背暗异唇蚓Allolbophora caliginoa erapezoides（Ant.Duges）,赤子爱胜蚓Eiseniafoetida（Savigny）,通俗环毛蚓P.vulgaris（Chen）以及少量的威廉环毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）;福建省则分布着较多的壮伟环毛蚓P.robusta（E.Perrier）。进一步证实了广东与广西为广地龙（参环毛蚓）的主要产区。比较了样品不同处理保存方法的优缺点,建议用于性状鉴别的标本,采用福尔马林保存;用于理化分析样品可直接晒干保存;用于分子生物学实验,需提取基因组DNA的原动物样品,应迅速定种后用少量70%乙醇或者生理盐水浸泡,密封在试管中,—20℃冻存。使用体视镜对样品的体表特征以及内部构造的观察,并与相关标准文献进行比较的性状鉴别方法,基本都可以准确的对样品进行鉴别定种,获得相关的种质资源分布状况。根据研究的结果,为便于快速准确的对药用蚯蚓进行鉴别分类,我们编制了14种地龙原动物的分种检索表和分种检索图。本研究结果表明,采用传统分类学指标,可较方便地对形态特征保存完好地蚯蚓样品进行鉴别分类。四、地龙类药用动物的ISSR分子鉴定研究利用ISSR分子标记技术对地龙不同种质资源进行了DNA水平的分子鉴定研究。以筛选到的8个ISSR引物对供试的7个样品进行ISSR-PCR扩增,共扩增出137条带,其中多态性条带有127条,占92.7%;利用NTSYSpc-2.10e软件对ISSR表型数据矩阵进行聚类分析,用SimQual程序求Nei-Li相似系数矩阵,探讨其亲缘关系。种质间相似系数最小为0.43;最大的为0.66,说明地龙种质的遗传多样性较为丰富。聚类分析结果表明,供试材料在相似系数为0.56处分为4个类群,第Ⅲ类群和第Ⅳ类群中各种质之间的亲缘关系较近,而第Ⅰ类群与第Ⅱ类群亲缘关系较远,同属蚯蚓内个体间的亲缘关系较近,不同属间个体的遗传距离较远。这与它们在形态鉴别分类上的结果相一致。五、地龙药材的多组分的含量测定以及HPLC指纹图谱研究（一）HPLC法测定地龙中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量本研究测定了不同产地地龙药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量,建立了广地龙质量控制的客观指标。方法:用0.9%生理盐水超声提取地龙药材,采用反相高效液相色谱法,以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50%甲醇为流动相,梯度洗脱,检测波长254nm,柱温27℃,进样量10μl,可同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷等4种成分的含量。结果:尿嘧啶的线性范围为0.0075-0.24μg（r=0.9993）,平均回收率99.82%,RSD为2.34%;次黄嘌呤的线性范围0.0250-0.8μg（r=0.9992）,平均回收率101.93%,RSD为1.45%;尿苷的线性范围0.0125-0.4μg（r=0.9992）,平均回收率97.53%,RSD为1.73%;肌苷的线性范围0.0500-1.6μg（r=0.9991）,平均回收率102.06%,RSD为2.44%。该方法重现性,回收率较好,可用于广地龙尿嘧啶等4种成分的含量测定。（二）地龙水溶性成分的指纹图谱研究建立了地龙水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱,旨在反映地龙内在化学信息,全面评价地龙的质量。采用高效液相色谱法,梯度洗脱,对17份地龙样品测定,以主要的11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积作为地龙指纹图谱的相关技术参数,得出的11个主要共有峰的相对保留时间重现性好,相对峰面积有明显差别,对获取的指纹图谱数据进行相似度分析,建立了地龙的指纹图谱,可用于地龙的鉴别和质量的评价。运用SPSS分析软件对所采集图谱数据进行了聚类分析,采用离差平方和法,利用欧氏距离作为样品的测度。17个样品基本分为四大类。从聚类结果来看,广东、广西产地的地龙药材,亲缘关系较近,所含化学成分及其比值比较相似;海南产地药材比较相似;而沪地龙的亲缘关系和化学成分则与它们明显区分开来。这也印证了不同产地,不同品种的地龙药材所含的化学成分存在一定的差异。故在生产中建议固定品种和产地。六、地龙中重金属及有害元素的检测采用紫外分光光度法测定了地龙中重金属的含量,分析波长215nm。标准曲线的回归方程为:y=0.7231x+0.043,相关系数R2=0.9968,结果表明检测质量分数在0～50μg/g范围内具有良好的线性关系。平均加样回收率为99.97%。该法简便、快速、重现性好,能在一次操作中测出中药中大部分重金属的含量。适用地龙药材实际生产中重金属的检测。对9批地龙药材测定结果表明,各样品中重金属元素含量差异较大,且大都超出《中华人民共和国药典》2005版一部附录ⅨE规定的应不超过百万分之三十。地龙药材中的重金属超标问题值得我们关注。七、生态环境与地龙药材品质的相关性研究（一）地龙生态环境因子的考察与分析对道地药材广地龙主要产区的分布和环境情况进行了调查,并采集了广地龙产区以及非道地药材产区11个土壤样本,拟通过对广地龙主要产区的生态环境的调查和生长土壤（水分、DH值、重金属等）的分析,以考察与地龙质量相关的环境因子,了解其产地适宜性,为广地龙的规范化养殖提供理论上的支持。地龙产区的环境因子考察结果表明:广东、广西、福建、海南四个省份地处中国东部沿海,气候、地势条件优越,适合广地龙生长发育。产区土壤样品测试分析结果表明:含水量为25%左右的土壤较适合参环毛蚓生存。其生长发育的最适pH值为6.8～7.6。广地龙（参环毛蚓）能够在砷（4.929-16.000mg/kg）、镉（0.999-8.604mg/kg）、铬（26.830-110.168mg/kg）、铜（44.900-349.356mg/kg）、镍（94.400-480.088mg/kg）、铅（15.084-114.715mg/kg）、锌（11.163-601.859mg/kg）含量范围的土壤中生存,对土壤重金属的耐受性与其他蚓种相似。地龙产区工业发展与药材的质量优劣有重要关联。工业发展向环境中排放的重金属越多,对该产区的地龙药材的质量下降值影响越大。（二）地龙中重金属含量与环境的相关性研究1.广地龙对重金属富集动力学特性研究本实验应用半静态条件下的双箱动力学模型,将不同浓度重金属条件下养殖过的参环毛蚓经浓硝酸—过氧化氢低温消解处理后测定重金属含量,探讨参环毛蚓对土壤中Cd、Hg、Pb三种重金属离子的生物富集规律。结果:地龙在Pb高、中、低浓度的富集速率分别为k1=1.232,K2=1.325,K3=1.058;对Cd的高、中、低浓度富集速率分别为k1=0.1792,K2=0.1753,K3=0.1382;对Hg的富集呈现出波动性。结论:广地龙从土壤中富集Pb的能力明显高于Cd,且随着时间的推移而增大;对Hg的富集作用是先快速吸收,积累到一定浓度时,再快速排出,而后再度吸收。2.重金属对参环毛蚓金属硫蛋白wMT诱导机制研究金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸（Cys）、能被金属诱导表达的金属结合蛋白。蚯蚓体内因存在特殊的金属硫蛋白（wMT）,对土壤中的重金属有富集作用,导致体内重金属元素含量较高。本实验通过对参环毛蚓进行不同重金属诱导30天后,提取wMT蛋白,采用银饱和分析法,结合原子吸收ASS对蚯蚓体内wMT的含量进行测定。以探讨重金属诱导参环毛蚓wMT的有关机制。初步分析得出参环毛蚓体内wMT含量受到不同重金属的诱导影响,大小依次为:Cu＞Cd＞Zn＞Pb;且总的看来内脏中含有的wMT含量高于肌肉中,这也表明wMT主要在蚯蚓的内脏中表达。八、地龙药材的质量标准研究在大量实验性研究和检测的基础上,对《中华人民共和国药典》（一部,2005年版）有关“地龙”的药材质量标准作了部分修订。增加了地龙药材的含量测定项,选择次黄嘌呤和肌苷作为地龙药材含量测定的指标,规定本品按干燥品计算,含次黄嘌呤不得少于0.2 mg/g;含肌苷不得少于0.3 mg/g。另对性状、炮制等项进行了补充。产地加工方法中添加“除去两头所带泥土”;性状项增加了“除前后两端外,腹部已经剖开,内脏除去或偶有残留”的描述。炮制项建议添加“除去杂质和体内泥沙”。本研究建立了地龙药材的含量测定方法,完善了质量标准,为地龙药材的较全面的质量控制提供依据。九、结论与展望本论文对地龙种质的多样性进行了较为系统的研究,这为种质资源的进一步利用提供了参考。研究建立了地龙药材多组分含量测定方法和HPLC的指纹图谱,以及地龙药材重金属含量的紫外分光光度测定法,完善了地龙药材的质量指标体系,为药材的质量控制提供了依据。对地龙药材质量与生态环境因子的关系进行了研究,为改善地龙种质和药材质量提供了借鉴。其中地龙重金属富集以及WMT蛋白诱导机制等工作还可做进一步的探讨和研究。
何琳[7]（2007）在《广地龙配方颗粒质量标准规范化研究及地龙凝胶剂的研制》文中研究指明1.目的为了更好地控制广地龙配方颗粒的质量,保证临床疗效,本研究在中医药理论和《中药配方颗粒质量标准研究的技术要求》指导下,对广地龙饮片入选标准、广地龙配方颗粒质量标准进行系统研究,对指标成分次黄嘌呤和琥珀酸进行药效学验证。同时研制地龙凝胶剂并进行初步的药效学评价。2.方法研究内容主要包括:广地龙饮片的入选标准,广地龙配方颗粒的质量标准及稳定性研究,指标成分次黄嘌呤和琥珀酸止咳平喘的药效学验证,地龙凝胶剂的制备及治疗烫伤的药效学初探等。广地龙饮片入选标准研究中,采用薄层色谱法鉴别氨基酸、琥珀酸及氯仿提取物,建立高效液相色谱法及高效毛细管电泳法分别测定次黄嘌呤和琥珀酸含量的方法。高效液相法测定次黄嘌呤含量的色谱条件:色谱柱为ODS-EP 5μm ,4.6 mm×150 mm,流动相为水-甲醇-四氢呋喃（100﹕0.5﹕0.5）,流速为1.0 ml/ min ,检测波长λ=254 nm,柱温为室温,理论板数按次黄嘌呤峰计算不低于3888。高效毛细管电泳测定琥珀酸含量的条件:以未涂层融硅毛细管（50 cm×75μm）为分离柱,1mmol/L Tris-10 mmol/L H3BO3-0.5%四乙烯五胺-0.025 mmol/L CTAB （pH=11.45）体系为电泳介质,分离电压为-10KV。还对广地龙饮片进行杂质、水分及浸出物等项目的检查。配方颗粒采用传统汤剂的制备方法,并通过离心除杂、喷雾干燥及制粒获得。以次黄嘌呤的含量为指标,用正交设计法优选有效成分的最佳提取工艺。配方颗粒的薄层鉴别和含量测定与饮片类似,并按照2005版中国药典一部规定的颗粒剂项下对广地龙配方颗粒装量差异、溶化性和含水量进行检查。初步稳定性实验采用实验室留样观察三个月。指标成分的药效学验证分别以组胺和乙酰胆碱混合溶液引喘法及雾化氨水引咳法来评价次黄嘌呤和琥珀酸的止咳平喘作用。地龙凝胶剂的制备选用卡波姆为凝胶基质,并含有甘油和丙二醇等附加成分。药效学实验则分别以烫伤后面积,含水量,羟脯氨酸含量变化以及肉眼观察和病理切片来评价。3.结果广地龙饮片入选标准研究中改进了2005版中国药典一部地龙项下氨基酸薄层鉴别方法,增加丙氨酸的斑点,并增加了琥珀酸的斑点鉴别;HPLC测得不同产地的广地龙次黄嘌呤含量为0.54～1.25 mg/g;HPEC测得药材中琥珀酸（产地:广西）含量为0.8 mg/g。广地龙配方颗粒制备研究中,确定最佳提取工艺条件为:取广地龙30g,剪碎,加入12倍量的水,浸泡1小时,煎煮3次,过滤,合并煎煮液,浓缩。广地龙配方颗粒质量标准研究中,配方颗粒的次黄嘌呤含量测定方法色谱条件与饮片一致,不同批号的配方颗粒次黄嘌呤含量为1.5～3.3mg/袋。稳定性实验:实验室留样观察三个月,按质量标准项目检查,包括外观、鉴别、检查、含量测定、卫生学,均符合规定。小鼠的哮喘和咳嗽实验证明次黄嘌呤、琥珀酸有止咳平喘疗效。选择这两个成分作为指标成分是合理的。地龙凝胶剂治疗烫伤实验中受伤面积数据表明广地龙无糖凝胶和广地龙含糖凝胶对烫伤有治疗作用。含水量实验数据表明广地龙无糖凝胶和广地龙含糖凝胶可减少水肿。羟脯氨酸含量测定数据表明广地龙含糖凝胶使烫伤部位恢复较快。4.结论本研究建立的广地龙饮片和配方颗粒质量控制方法规范,科学,通过药效学的验证,说明以次黄嘌呤和琥珀酸含量作为控制广地龙饮片及配方颗粒质量的合理性,为广地龙及其产品的质量控制提供科学依据。另外本课题对广地龙促进伤口的愈合作用的制剂及药效学的进行初步研究,为今后广地龙外用制剂的开发奠定了一定的基础。
王佃亮[8]（2006）在《一种新型海洋纤溶酶的研究》文中提出血栓性疾病是西方富裕国家人类死亡的首要原因。它主要危害心、脑、肺的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在美国,每年大约有60万人发生肺栓塞,其中约20万人死亡;每年约有100万人发生急性心肌梗塞,其中20多万人需要住院进行治疗。在我国,每年大约有200万人死于栓塞性心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万。并且,这类疾病的发病率也有逐年上升趋势。血栓性疾病的主要治疗手段是溶栓,迄今溶栓剂已发展了三代,但都有一定的副作用。有鉴于此,我们从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:1.单环刺螠纤溶酶在单环刺螠的血液及内脏组织中含量丰富,其大量制备工艺为:体腔液及内脏混合物经匀浆、PBS抽提、（NH4）2SO4分级盐析、超滤、Q.Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75、Sephacry S-100层析分离,最终获得纯酶。经过优化的本工艺可以高效率地提取这种新型海洋纤溶酶,并达到了电泳纯,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条带。2.经SDS-PAGE和Native-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,单环刺螠纤溶酶分子量约为10,380 Da。与已经发现的陆地生物来源的纤溶酶以及海洋生物来源的纤溶酶相比,分子量相对较小。而苯酚-硫酸法测定糖含量表明,单环刺螠纤溶酶含糖量极低,所以可能不是糖蛋白。3.与蚓激酶类似,单环刺螠纤溶酶既可直接水解纤维蛋白,又具有激酶活性,通过激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地水解纤维蛋白。因而该酶具有很高的纤维蛋白亲合性和酶活力。以尿激酶为对照,测得酶的比活力为5256 U/mg。4.单环刺螠纤溶酶体外抗凝实验结果表明,不同浓度的酶均具有显着的抗凝作用,并且酶浓度越高,抗凝效果也越好。在酶浓度相同的情况下,单环刺螠纤溶酶的抗凝效果要优于蚓激酶。而且,单环刺螠纤溶酶作用相对温和,对细胞损
鲍世铨,曾耀辉[9]（1994）在《蚯蚓在医药保健方面的综合利用研究》文中认为对中药蚯蚓进行现代生物技术处理,可同时得到四个有药用价值的组分,大分子组分具有一定的抗癌作用;中等分子组分具有溶性活性;小分子组分富含氨基酸及多种矿质元素和微量元素;另外还可得到一个可治疗烧、烫伤的组分.对其主要组分进行了基础生化特性及药用价值研究.这四个组分均可进一步开发为药品或保健品.蚯蚓进行综合利用,能科学、合理和有效地利用生物资源,充分发挥其各组分的药用价值.
二、含有地龙溶栓酶的保健品和药品（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、含有地龙溶栓酶的保健品和药品（论文提纲范文）
（1）MTs调控参环毛蚓重金属富集机制及其平喘作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 中药地龙的研究概论 |
| 1.1.1 地龙活性成分及临床药理作用的研究概况 |
| 1.1.2 地龙药材资源及其开发利用现状 |
| 1.1.3 地龙药材质量的研究概况 |
| 1.2 蚯蚓重金属富集相关研究概论 |
| 1.2.1 蚯蚓重金属耐受和富集特性的研究概况 |
| 1.2.2 蚯蚓重金属耐受富集机制的研究动态 |
| 1.3 金属硫蛋白的研究概论 |
| 1.3.1 金属硫蛋白的基本性质研究 |
| 1.3.2 金属硫蛋白转录调控机制研究 |
| 1.3.3 金属硫蛋白其他生物学功能研究 |
| 1.4 文献研究小结 |
| 1.4.1 本项目研究的立题依据 |
| 1.4.2 本项目研究的目的和意义 |
| 1.4.3 本项目研究的研究内容及技术路线 |
| 第二章 参环毛蚓MT-2重组蛋白重金属镉富集及耐受能力研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 配制试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 MT-2原核表达及Western Blot验证 |
| 2.3.2 MT-2重组蛋白提高重金属镉耐受特性的研究 |
| 2.3.3 MT-2重组蛋白重金属镉富集特性的研究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 表达蛋白SDS-PAGE电泳检测及WESTERN BLOT鉴定 |
| 2.4.2 MT-2重组蛋白重金属镉耐受特性的研究 |
| 2.4.3 MT-2重组蛋白重金属镉富集特性的研究 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 参环毛蚓MT-2重组蛋白抗氧化损伤特性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 配制试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MT-2重组蛋白表达形式的确定 |
| 3.3.2 MT-2重组蛋白的纯化 |
| 3.3.3 MT-2重组蛋白的DNA保护实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MT-2重组蛋白表达形式的确定 |
| 3.4.2 MT-2重组蛋白的纯化 |
| 3.4.3 重组MT-2蛋白DNA保护 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 参环毛蚓MT-2基因重金属诱导特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验样品 |
| 4.2.2 养殖土壤 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 参环毛蚓内参Actin基因的扩增 |
| 4.3.2 镉暴露下参环毛蚓MT-2基因表达水平分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 内参Actin基因序列的研究 |
| 4.4.2 MT-2基因在重金属镉诱导下的表达 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 4.5.1 Actin内参基因的研究 |
| 4.5.2 不同浓度镉对MT-2基因的诱导表达 |
| 第五章 参环毛蚓MT-2基因及启动子的克隆研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 配制试剂 |
| 5.2.3 引物设计 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 参环毛蚓基因组DNA提取 |
| 5.3.2 参环毛蚓MT-2编码区序列扩增 |
| 5.3.3 参环毛蚓MT-2基因启动子序列扩增 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 参环毛蚓基因组DNA的提取质量检测 |
| 5.4.2 参环毛蚓MT-2基因编码区序列扩增 |
| 5.4.3 参环毛蚓MT-2基因启动子的克隆 |
| 5.4.4 参环毛蚓MT-2基因启动子序列分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 MT-2基因编码区的扩增 |
| 5.5.2 MT-2基因启动子的克隆 |
| 第六章 金属硫蛋白在广地龙平喘作用的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 金属硫蛋白的制备 |
| 6.2.2 实验动物 |
| 6.2.3 实验试剂 |
| 6.2.4 配制试剂 |
| 6.2.5 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 动物处理 |
| 6.3.2 动物一般情况观察 |
| 6.3.3 气道高反应性测试 |
| 6.3.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)中总细胞计数 |
| 6.3.5 小鼠血清IgE水平的检测 |
| 6.3.6 BALF中细胞因子的测定 |
| 6.3.7 肺组织病理学检查 |
| 6.3.8 数据处理 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 动物一般情况 |
| 6.4.2 小鼠气道阻力值测定结果 |
| 6.4.3 支气管肺泡灌洗液中总细胞计数 |
| 6.4.4 小鼠血清IgE测定结果 |
| 6.4.5 BALF细胞因子的测定结果 |
| 6.4.6 肺组织病理学检查 |
| 6.5 小结与讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 7.1 实验总结 |
| 7.2 创新之处 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表文章 |
| 致谢 |
| 附件1: 统计学处理合格证明 |
（2）蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蚯蚓的习性及成分 |
| 1.2 蚯蚓的应用情况 |
| 1.2.1 在药物和保健品方面的应用 |
| 1.2.2 在动物饲养方面的应用 |
| 1.2.3 在农业利用方面的应用 |
| 1.2.4 在治理环境污染方面的应用 |
| 1.2.5 在食品方面的应用 |
| 1.3 蚯蚓系列产品的加工与利用 |
| 1.3.1 地龙干 |
| 1.3.2 蚯蚓粉 |
| 1.3.3 蚯蚓液 |
| 1.4 有效成分的研究现状 |
| 1.4.1 蚓激酶 |
| 1.4.2 蚯蚓中的复合氨基酸 |
| 第二章 蚓激酶的提取工艺及其性质研究 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蚓激酶比活力测定方法与原理 |
| 2.2.2 蚯蚓提取物蛋白质含量的计算 |
| 2.2.3 蚓激酶活力测定 |
| 2.3 酶的提取条件与性质实验结果与分析 |
| 2.3.1 单因素实验结果与分析 |
| 2.3.1.1 缓冲液 pH 对提取条件影响 |
| 2.3.1.2 硫酸铵饱和度对盐析的影响 |
| 2.3.2 正交试验设计 |
| 2.3.3 金属离子对蚓激酶酶活力影响 |
| 2.4 实验结论 |
| 2.5 实验讨论 |
| 第三章 蚓激酶的分子量测定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 实验结论 |
| 第四章 复合氨基酸的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 鲜活蚯蚓的处理 |
| 4.2.2 冷冻蚯蚓脱脂脱色除臭 |
| 4.2.3 酶解法制备蚯蚓氨基酸 |
| 4.2.4 甲醛滴定法测氨基氮含量 |
| 4.2.5 蚯蚓氨基酸制备工艺影响因素研究 |
| 4.2.6 正交实验条件设计 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 不同方法对脱脂、脱色、除臭效果的影响 |
| 4.4.2 不同液固比对脱脂、脱色、除臭效果的影响 |
| 4.4.3 不同溶剂对脱脂、脱色、除臭效果的影响 |
| 4.4.4 不同回流时间对脱脂、脱色、除臭效果的影响 |
| 4.4.5 蚯蚓氨基酸的影响因素分析 |
| 4.4.6 蚯蚓氨基酸的制备优化结果分析 |
| 4.5 实验结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果 |
| 致谢 |
（3）蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蚯蚓有效成分分离纯化及作用的研究进展 |
| 1.1 蚯蚓抗菌肽 |
| 1.2 蚯蚓纤溶酶相关成分的分离纯化及作用 |
| 1.3 蚯蚓抗氧化系成分的分离纯化及作用 |
| 2 动物源性镇痛物质分离纯化的研究进展 |
| 2.1 蝎毒镇痛活性物质分离纯化及作用 |
| 2.2 蛇毒镇痛活性物质分离纯化及作用 |
| 2.3 蜘蛛镇痛活性物质分离纯化及作用 |
| 2.4 蚯蚓镇痛抗损伤有效物质的分离纯化及作用 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二章 蚯蚓镇痛活性物质的分离纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验样品与动物 |
| 1.2 主要的试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 蚯蚓蛋白组分粗提 |
| 2.2 CM Sephadex C-50阳离子交换层析 |
| 2.3 膈神经-膈肌模型筛选活性组分 |
| 2.4 Sephadex G-75凝胶过滤层析 |
| 2.5 凝胶过滤层析产物对离体神经性兴奋性的影响 |
| 2.6 分子量测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 蚯蚓粗提物的制备 |
| 3.2 蚯蚓提取物CM Sephadex C-50阳离子交换层析色谱 |
| 3.3 活性组分筛选(Bulbring法制备大鼠膈肌-膈神经模型) |
| 3.4 蚯蚓提取物Sephadex G-75凝胶过滤层析 |
| 3.5 蚯蚓镇痛活性成分对离体神经性兴奋性的影响 |
| 3.6 分子量的测定 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 蚯蚓蛋白组分的粗提工艺优化和材料筛选 |
| 4.2 CM Sephadex C-50阳离子交换层析的材料选择和工艺优化 |
| 4.3 Sephadex G-75凝胶过滤层析的材料选择及工艺优化 |
| 4.4 蚯蚓镇痛活性成分对离体神经性兴奋性的影响 |
| 4.5 蚯蚓镇痛活性分离纯化技术的改良方向 |
| 4.6 分离纯化工艺小结 |
| 第三章 蚯蚓镇痛活性物质的作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验样品与动物 |
| 1.2 主要的试剂及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 镇痛粗提产物对小鼠烫伤的影响 |
| 2.2 阳离子交换层析产物镇痛作用的测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 镇痛提取物对小鼠烫伤的影响 |
| 3.2 阳离子交换层析产物的镇痛作用 |
| 4 讨论与分析 |
| 4.1 镇痛提取物对小鼠烫伤的治疗作用 |
| 4.2 镇痛活性的功用 |
| 5. 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）背暗异唇蚓蛋白酶解工艺的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 分析检测 |
| 1.4.1 粗蛋白质测定 |
| 1.4.2 氨基酸组成分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素试验 |
| 2.1.1 反应温度对水解效果的影响 |
| 2.1.2 pH对水解效果的影响 |
| 2.1.3 反应时间 |
| 2.1.4 加酶量 |
| 2.2 正交试验 |
| 3 讨论 |
（5）单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 血栓性疾病概述 |
| 1.1 血栓性疾病危害与类型 |
| 1.2 凝血和抗凝的基本原理 |
| 1.2.1 凝血系统 |
| 1.2.2 抗凝系统 |
| 1.2.3 纤溶系统 |
| 1.2.3-1 纤溶系统的组成 |
| 1.2.3-2 纤维蛋白降解过程及其调控 |
| 1.3 血栓性疾病的治疗 |
| 1.4 治疗血栓性疾病的药物 |
| 1.4.1 抗凝血药物 |
| 1.4.2 抗血小板药物 |
| 1.4.3 溶栓药 |
| 1.4.3-1 第一代溶栓药 |
| 1.4.3-2 第二代溶栓药 |
| 1.4.3-3 第三代溶栓药 |
| 1.4.4 现有溶栓药的作用途径 |
| 1.4.5 抗血栓的中草药 |
| 1.5 临床常用纤溶酶与具有临床应用前景的纤溶酶 |
| 1.5.1 动物来源纤溶酶 |
| 1.5.2 微生物来源纤溶酶 |
| 1.5.2-1 葡激酶(staphylokinase,SAK) |
| 1.5.2-2 纳豆激酶(nattokinase,NK) |
| 1.5.2-3 根霉(Rhizopus chinensis)12# |
| 1.6 海洋生物来源的心脑血管药物及活性物质 |
| 1.6.1 海洋生物多糖类及其衍生物 |
| 1.6.2 海洋生物中蛋白及糖蛋白类 |
| 2 海洋无脊椎动物单环刺螠研究 |
| 2.1 生态习性及环境 |
| 2.2 形态解剖 |
| 2.3 分类与进化 |
| 2.4 营养 |
| 2.5 生物活性物质 |
| 2.6 单环刺螠的潜在开发价值与未来展望 |
| 3 立论依据 |
| 3.1 选题依据与背景情况 |
| 3.2 课题研究的目的与意义 |
| 第二章 单环刺螠纤溶酶UFEI的筛选与分离纯化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛋白浓度测定: |
| 2.2.2 以酪蛋白为底物Folin-酚试剂法测定酶活力: |
| 2.2.2-1 Folin-酚试剂的制备: |
| 2.2.2-2 标准曲线的制备 |
| 2.2.3 酶的纤溶活性确定: |
| 2.2.4 统计学方法: |
| 2.3 纤溶酶的制备工艺 |
| 2.3.1 工艺A |
| 2.3.2 工艺B |
| 3 结果 |
| 3.1 酶粗品的制备 |
| 3.2 酶的分离纯化 |
| 3.3 酶UFEIa的分离纯化收率 |
| 3.4 酶的纤溶活性确定: |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 酶UFEIa的纯度鉴定和分子量测定 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试剂与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纤溶酶组分纯度的测定: |
| 2.2.2 SDS-PAGE电泳操作步骤: |
| 2.2.3 分子量测定: |
| 2.2.4 统计学方法: |
| 3 结果 |
| 3.1 单环刺螠纤溶酶的非变性和变性凝胶电泳 |
| 3.2 质谱图谱 |
| 3.3 电泳后酶区带活性的检验 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 单环刺螠纤溶酶的酶学性质研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 温度对酶反应的影响(琼脂糖纤维蛋白平板法) |
| 2.2.2 pH对酶反应的影响(琼脂糖纤维蛋白平板法) |
| 2.2.3 金属离子对酶反应的影响(酪蛋白为底物Folin-酚试剂法) |
| 2.2.4 底物浓度对酶反应速度的影响(以酪蛋白为底物Folin-酚试剂法) |
| 2.2.5 激酶活力测定 |
| 2.2.5-1 平板制作 |
| 2.2.5-2 溶液配制 |
| 2.2.5-3 蛋白水解酶活性测定 |
| 2.2.5-4 激酶活性测定 |
| 2.2.5-5 样品效价计算 |
| 2.2.6 酶蛋白的糖含量测定(王秀奇等,1999) |
| 2.2.7 统计学方法: |
| 3 结果 |
| 3.1 温度对酶反应的影响 |
| 3.2 pH对酶反应的影响 |
| 3.2.1 以琼脂糖纤维蛋白平板法测得不同pH条件下酶的稳定性 |
| 3.2.2 酶的最适反应pH: |
| 3.3 金属离子对酶反应的影响 |
| 3.4 底物浓度对酶反应速度的影响 |
| 3.5 酶的动力学常数 |
| 3.6 激酶活力测定结果 |
| 3.7 单环刺螠纤溶酶的糖含量 |
| 4 讨论 |
| ⅰ 单环刺螠纤溶酶作为溶栓剂的可能作用机制 |
| ⅱ 酶学性质的研究 |
| 5 小结 |
| 第五章 单环刺螠纤溶酶的体外抗凝和溶栓活性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蚓激酶的提取: |
| 2.2.2 单环刺螠纤溶酶抗凝活性检测 |
| 2.2.3 UFEIa和EFE体外溶栓比较研究 |
| 2.2.4 统计学方法: |
| 3 结果 |
| 3.1 酶的抗凝效果 |
| 3.2 酶对血红细胞形态和释放量的影响 |
| 3.3 两种酶不同浓度下水解血栓速度的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）地龙种质资源与品质评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 概况 |
| 一、地龙的本草考证 |
| (一) 药用历史与名称 |
| (二) 产地与分布 |
| (三) 鉴别与分类 |
| (四) 采收与入药 |
| (五) 毒性、性味、功效与应用 |
| 二、地龙现代研究概况 |
| (一) 种质分类 |
| (二) 种质鉴定 |
| (三) 养殖加工 |
| (四) 化学成分 |
| (五) 质量评价 |
| (六) 药理作用 |
| (七) 临床应用与民间用药经验 |
| (八) 小结 |
| 三、存在的主要问题 |
| 四、研究目标、内容、技术路线 |
| (一) 研究目标 |
| (二) 研究内容 |
| (三) 技术路线 |
| 第二章 地龙药源调查与种质分类研究 |
| 一、地龙药源调查 |
| 二、地龙类药用动物的种质分类研究 |
| (一) 钜蚓科Megascolecidae |
| (二) 正蚓科Lumbricidae |
| (三) 链胃蚓科Moniligastridoe，杜拉属Drawida |
| 三、结论和讨论 |
| 第三章 地龙类药用动物的物种鉴别 |
| 一、仪器与材料 |
| 二、方法与结果 |
| 三、小结与讨论 |
| 第四章 地龙类药用动物的ISSR分子鉴定研究 |
| 一、仪器与材料 |
| (一) 主要仪器设备 |
| (二) 主要试剂 |
| (三) 主要溶液的配制 |
| (四) PCR扩增体系 |
| (五) 实验材料 |
| 二、实验方法 |
| (一) 基因组DNA的提取和检测 |
| (二) ISSR反应体系 |
| (三) 引物的筛选 |
| (四) 扩增与产物的检测 |
| (五) 数据处理与统计分析 |
| 三、结果与分析 |
| (一) 样品总DNA的检测结果 |
| (二) ISSR-PCR反应体系和扩增程序的优化 |
| 四、结论与讨论 |
| (一) PCR反应体系与扩增程序 |
| (二) 不同样品的ISSR-PCR产物电泳图谱 |
| (三) 扩增产物的多态性分析 |
| (四) 样品的遗传距离分析 |
| (五) 讨论 |
| 第五章 地龙药材的含量测定以及HPLC指纹图谱研究 |
| 一、HPLC法测定地龙中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量 |
| (一) 仪器与材料 |
| (二) 方法与结果 |
| (三) 讨论 |
| 二、地龙药材水溶性成分的指纹图谱研究 |
| (一) 仪器与材料 |
| (二) 方法与结果 |
| (三) 讨论 |
| 第六章 地龙药材中重金属及有害元素的检测 |
| 一、仪器与材料 |
| (一) 仪器 |
| (二) 药品与试剂 |
| 二、实验方法 |
| (一) 溶液的制备 |
| (二) 方法学考察 |
| 三、结果与讨论 |
| (一) 重金属测定结果 |
| (二) 讨论 |
| 第七章 生态环境与地龙药材品质的相关性研究 |
| 一、地龙药材产区生态因子的考察与分析 |
| (一) 地龙生活习性调查 |
| (二) 广地龙主要产区分布 |
| (三) 广地龙主要产区环境调查 |
| (四) 广地龙主要产区土壤样本的测定分析 |
| 二、地龙重金属含量与环境的相关性研究 |
| (一) 广地龙对重金属富集动力学特性研究 |
| (二) 重金属对参环毛蚓金属硫蛋白(wMT)诱导机制研究 |
| 第八章 地龙药材的质量标准研究 |
| 一、地龙质量标准草案 |
| 二、地龙质量标准起草说明 |
| 第九章 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 综述 |
| 附录Ⅱ 附图 |
| 附录Ⅲ |
| 附录Ⅳ |
| 附录Ⅴ |
| 致谢 |
（7）广地龙配方颗粒质量标准规范化研究及地龙凝胶剂的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 广地龙饮片及配方颗粒质量标准规范化研究 |
| 第一章综述 |
| 1 地龙历史文献概述 |
| 1.1 本草考证 |
| 1.2 古代临床应用 |
| 2 地龙现代文献概述 |
| 2.1 资源分布 |
| 2.2 鉴别 |
| 2.3 化学成分 |
| 2.4 药理研究情况 |
| 2.5 临床应用情况 |
| 3 讨论 |
| 第二章广地龙饮片质量标准研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 薄层鉴别 |
| 2.2 检查 |
| 2.3 HPLC 测定次黄嘌呤含量 |
| 2.4 HPCE 测定琥珀酸含量 |
| 3 讨论 |
| 第三章 广地龙配方颗粒的制备 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 提取工艺 |
| 2.2 除杂、浓缩及干燥 |
| 2.3 制粒 |
| 3 讨论 |
| 第四章广地龙配方颗粒的质量标准研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 薄层鉴别 |
| 2.2 检查 |
| 2.3 广地龙配方颗粒次黄嘌呤的含量测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章广地龙配方颗粒稳定性试验研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 1.1 试药 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法与结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章广地龙止咳平喘成分药效学验证 |
| 1 仪器、试药与动物 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 动物分组及给药途径 |
| 2.2 止咳实验 |
| 2.3 平喘实验 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 广地龙凝胶剂的制备及烫伤的药效学研究 |
| 第一章广地龙凝胶剂的制备 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法与结果 |
| 2.1 广地龙提取液的制备 |
| 2.2 广地龙凝胶的制备 |
| 2.3 质量评价 |
| 3 讨论 |
| 第二章 地龙治疗烫伤的初步药效学实验 |
| 1 动物与试药 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 试药 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 动物分组及烫伤实验 |
| 2.2 评价指标 |
| 2.3 小白鼠创面愈合情况 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文及专着 |
| 致谢 |
（8）一种新型海洋纤溶酶的研究（论文提纲范文）
| 摘 要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述和立论依据 |
| 第一节 文献综述 |
| 1 溶栓剂的国内外研究现状及发展趋势 |
| 1.1 血栓性疾病及其危害 |
| 1.2 凝血与抗凝的基本原理 |
| 1.2.1 凝血系统 |
| 1.2.2 抗凝系统 |
| 1.2.3 纤溶系统 |
| 1.3 血栓性疾病的治疗 |
| 1.3.1 血栓性疾病的治疗策略 |
| 1.3.2 不同治疗策略的评价与联用 |
| 1.4 溶栓剂分类与作用途径 |
| 1.4.1 传统分类 |
| 1.4.2 现有分类系统的缺陷 |
| 1.4.3 现有溶栓剂的作用途径 |
| 1.5 新型天然溶栓剂与具有临床应用前景的纤溶酶 |
| 1.5.1 动物来源 |
| 1.5.2 微生物来源 |
| 1.5.3 植物来源 |
| 1.6 新型溶栓剂的开发及发展趋势 |
| 1.6.1 现有溶栓剂的主要缺陷 |
| 1.6.2 新型溶栓剂的来源及开发途径 |
| 1.6.3 溶栓剂的发展趋势 |
| 2 海洋心脑血管药物及活性物质研究概况 |
| 2.1 研究现状 |
| 2.1.1 糖类及其衍生物 |
| 2.1.2 脂类 |
| 2.1.3 蛋白及糖蛋白类 |
| 2.1.4 氨基酸及多肽 |
| 2.1.5 甾醇、皂甙、核苷、萜类及生物碱 |
| 2.1.6 含氮混合物 |
| 2.1.7 三丙酮胺及喹啉酮 |
| 2.1.8 其他 |
| 2.2 开发策略与前景展望 |
| 2.2.1 海洋心脑血管药物研究的难点 |
| 2.2.2 海洋心脑血管药物的开发策略 |
| 2.2.3 前景展望 |
| 3 海洋无脊椎动物单环刺螠研究进展 |
| 3.1 生物学特性 |
| 3.1.1 形态解剖 |
| 3.1.2 区系分布 |
| 3.1.3 分类 |
| 3.1.4 生态习性 |
| 3.1.5 耐受力 |
| 3.1.6 生活史 |
| 3.1.7 人工培养与繁殖 |
| 3.2 细胞、生化及分子生物学研究 |
| 3.2.1 生物活性物质 |
| 3.2.2 分类地位 |
| 3.2.3 消化与营养 |
| 3.2.4 硫化物耐受机制 |
| 3.2.5 发育 |
| 3.3 应用情况及潜在开发价值 |
| 3.3.1 海洋功能保健品 |
| 3.3.2 海洋药物 |
| 3.3.3 海洋环境保护 |
| 3.3.4 未来展望 |
| 第二节 立论依据 |
| 1 选题依据与背景情况 |
| 2 课题研究的目的与意义 |
| 2.1 课题研究的目的 |
| 2.2 课题研究的意义 |
| 第二章 单环刺螠纤溶酶的寻找与分离纯化 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 单环刺螠 |
| 1.2 Wistar 大鼠 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 1.4 不同组织粗提物的制备 |
| 1.5 具有溶栓作用效果的纤溶酶的筛选 |
| 1.6 酶活力测定 |
| 1.7 蛋白浓度测定 |
| 1.8 纤溶酶的分离纯化步骤 |
| 1.8.1 酶的抽提 |
| 1.8.2 粗品制备 |
| 1.8.3 酶的精制 |
| 1.9 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同组织粗提物的溶栓作用效果 |
| 2.2 酶的分离制备工艺 |
| 2.2.1 层析纯化 |
| 2.2.2 纯度鉴定与分子量测定 |
| 2.2.3 制备工艺路线 |
| 2.2.4 分离纯化总结 |
| 3 讨论 |
| 3.1 纤溶酶在单环刺螠体内的分布 |
| 3.2 单环刺螠体内纤溶酶含量丰富 |
| 3.3 单环刺螠纤溶酶可能包含一组同工酶 |
| 3.4 单环刺螠纤溶酶制备工艺的优化 |
| 3.5 小分子量纤溶酶作为溶栓药物具有潜在的优越性 |
| 4. 小结 |
| 第三章 单环刺螠纤溶酶的物理化学性质研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 糖含量测定 |
| 1.3 酶活力测定 |
| 1.4 温度对酶稳定性的影响 |
| 1.5 pH 对酶稳定性的影响 |
| 1.6 金属离子对酶稳定性的影响 |
| 1.7 温度对酶活力的影响 |
| 1.8 pH 对酶活力的影响 |
| 1.9 金属离子对酶活力的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶蛋白的糖含量 |
| 2.2 酶的热稳定性 |
| 2.3 酶的pH 稳定性 |
| 2.4 酶的金属离子稳定性 |
| 2.5 最适温度 |
| 2.6 最适pH |
| 2.7 酶的激活剂与抑制剂 |
| 3 讨论 |
| 3.1 铁离子对酶活性的调控作用 |
| 3.2 酶的稳定性及最适反应条件的意义 |
| 4 小结 |
| 第四章 单环刺螠纤溶酶的激酶活性与动力学研究 |
| 前言 |
| １材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 酶活力测定 |
| 1.2.1 平板制作 |
| 1.2.2 溶液配制 |
| 1.2.3 测定 |
| 1.3 激酶活性测定 |
| 1.4 底物浓度对酶反应速度的影响 |
| 1.5 测定酶的动力学参数 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶的活力测定 |
| 2.2 激酶活性测定 |
| 2.3 底物浓度与酶反应速度的关系 |
| 2.4 酶的动力学常数 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单环刺螠纤溶酶作为溶栓剂的作用机制 |
| 3.2 底物浓度对酶反应速度的影响 |
| 4 小结 |
| 第五章 单环刺螠纤溶酶的体外抗凝与溶栓研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 蚓激酶提取 |
| 1.3 酶的抗凝活性检测 |
| 1.4 酶的溶栓活性检测 |
| 1.5 酶的血栓溶解率计算 |
| 1.6 单环刺螠纤溶酶与蚓激酶组分比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 单环刺螠纤溶酶的抗凝效果 |
| 2.1.1 酶的抗凝效果观察 |
| 2.1.2 不同浓度的酶的抗凝效果 |
| 2.1.3 酶对细胞损伤的显微镜观察 |
| 2.2 单环刺螠纤溶酶的溶栓效果 |
| 2.2.1 酶的溶栓效果观察 |
| 2.2.2 不同浓度酶的溶栓效果 |
| 2.2.3 酶对细胞损伤的显微镜观察 |
| 2.2.4 酶对 Wistar 大鼠血栓的溶解作用 |
| 2.3 酶的血栓溶解率 |
| 2.4 单环刺螠纤溶酶与蚓激酶所含的组分 |
| 3 讨论 |
| 3.1 酶活性对溶栓及抗凝作用效果的影响 |
| 3.2 酶的毒性与副作用 |
| 3.3 临床应用前景 |
| 4 小结 |
| 论文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩写 |
| 致谢 |
（9）蚯蚓在医药保健方面的综合利用研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 一、大分子组分(组分Ⅰ) |
| 二、中等分子组分(组分Ⅱ) |
| 三、小分子组分(组分Ⅲ) |
| 四、 |
| 结论与讨论 |
四、含有地龙溶栓酶的保健品和药品（论文参考文献）
- [1]MTs调控参环毛蚓重金属富集机制及其平喘作用的研究[D]. 龚玲. 广州中医药大学, 2015(10)
- [2]蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究[D]. 赵旭壮. 西华大学, 2012(02)
- [3]蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究[D]. 程果. 湖南农业大学, 2011(04)
- [4]背暗异唇蚓蛋白酶解工艺的研究[J]. 吾玛尔·阿布力孜,宋曼殳,阿不都拉·阿巴斯. 食品科学, 2008(09)
- [5]单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究[D]. 郭金明. 中国海洋大学, 2008(03)
- [6]地龙种质资源与品质评价研究[D]. 吴文如. 广州中医药大学, 2008(09)
- [7]广地龙配方颗粒质量标准规范化研究及地龙凝胶剂的研制[D]. 何琳. 广东药学院, 2007(12)
- [8]一种新型海洋纤溶酶的研究[D]. 王佃亮. 中国海洋大学, 2006(03)
- [9]蚯蚓在医药保健方面的综合利用研究[J]. 鲍世铨,曾耀辉. 中国生化药物杂志, 1994(03)