一、肝片吸虫雷蚴、尾蚴的扫描电镜观察（论文文献综述）
周磊[1]（2020）在《青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查及西藏螺内寄生虫鉴定》文中提出青藏高原是我国四大牧区之一。传统的放牧方式是畜牧业的主要形式,畜牧业是当地的经济支柱。传统且粗犷的放牧方式,导致当地的寄生虫病频发,寄生虫病的肆虐对青藏高原的畜牧业经济造成了重大的损失。本研究首先对高原牦牛、藏羊开展了肝片吸虫的血清学调查,系统性的分析了2012-2017年间采集的牦牛血液样本3276份和藏羊血液样本1092份肝片吸虫的感染情况及潜在风险因素。其次,针对肝片吸虫的中间宿主螺进行研究,采集西藏自治区寄生虫病频发的五个地区的螺进行螺种鉴定,调查了螺体内寄生虫的感染情况。并通过肝片吸虫的线粒体基因cox1对牦牛肝片吸虫、螺内寄生虫进行了分子特征、单倍型研究。取得结果如下:1.牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查本次检测的四个高原地区均有肝片吸虫阳性检出,总体血清阳性率为44.3%。不同地区牦牛肝片吸虫阳性率为34.1%～72.0%;其中青海和甘肃牦牛肝片吸虫的阳性率高于四川牦牛,而西藏牦牛与四川牦牛肝片吸虫阳性率无统计学差异（P>0.05）。公牦牛和母牦牛肝片吸虫阳性率分别为43.3%和45.6%,无显着差异。不同年龄牦牛肝片吸虫阳性率为24.3%～47.3%;其中2～4岁牦牛（P<0.001）和4岁以上牦牛（P<0.001）肝片吸虫阳性率均显着高于0-1岁牦牛,而1-2岁牦牛与0-1岁牦牛肝片吸虫感染差异不显着（P>0.05）。不同年份牦牛肝片吸虫阳性率为18.5%～54.4%;其中2013年牦牛（P<0.001）、2014年牦牛（P<0.001）、2015年牦牛（P<0.01）、2016年牦牛（P<0.001）和2017年牦牛（P<0.001）均显着高于2012年牦牛。从整体水平看,2012～2017间牦牛肝片吸虫阳性率呈上升趋势。西藏四个地区均有藏羊肝片吸虫阳性检出,总体血清阳性率为37.1%。不同地区藏羊肝片吸虫阳性率为12.1%～61.6%;其中索县（P<0.05）、青龙乡（P<0.001）和班戈县（P<0.001）藏羊感染肝片吸虫的风险均显着高于聂荣县。公藏羊和母藏羊肝片吸虫阳性率分别为36.9%和37.4%,无显着差异。不同年龄藏羊肝片吸虫阳性率为23.9%～46.1%;其中1～2岁藏羊（P<0.001）和2岁以上藏羊（P<0.001）肝片吸虫阳性率均显着高于0-1岁藏羊。2.西藏地区螺种分布及螺内寄生虫感染情况调查当雄县、尼木县、曲水县、林芝县、波密县这五个地区,海拔高度分别为:5000m、3700m、3700m、2800m、2900m。共采集螺样本812只,其中当雄县采集样本40只,主要螺种为小土蜗,尼木县采集样本300只,主要螺种为耳萝卜螺,曲水县采集样本260只,主要螺种为耳萝卜螺,林芝县采集样本142只,主要螺种为耳萝卜螺,波密县采集样本70只,主要螺种为小土蜗。通过本次调查,发现西藏地区的淡水螺种类主要为耳萝卜螺和小土蜗,在高海拔和低海拔的区域都有小土蜗和耳萝卜螺的分布。螺内寄生虫的调查发现,螺体内存在雷蚴、子雷蚴、尾蚴、囊蚴这四个形态的寄生虫蚴虫。通过形态学观察,确定主要的寄生虫为肝片吸虫。此外,发现数量不多的尾部分叉的复殖吸虫尾蚴。经过统计发现,尼木县、曲水县、当雄县这三个地区的螺体内主要为肝片吸虫感染,感染率分别为:70.67%、26.15%、27.5%;林芝县的螺体内主要为肝片吸虫和复殖吸虫感染,感染率分别为:33.8%、4.93%;波密县螺体内未发现寄生虫感染。本次调查结果表明,西藏地区的螺内寄生虫的感染率高于其他地区,该结果也与西藏地区动物体内的寄生虫病感染率高的情况相吻合。3.牦牛肝片吸虫、螺内寄生虫分子特征研究提取牦牛肝片吸虫、螺内寄生虫DNA、PCR扩增cox1基因、序列纯化、基因测序,应用生物信息学软件DNAMAN、Mega等对cox1基因进行了多序列比对和进化分析。发现本次测序的肝片吸虫cox1序列仅有个别碱基差异。NJ进化树分析发现T4、T7、T9、T10、T14、T17、T34、T46分一个分支;T8和T15分一个分支;T26分一个分支;T58为一个分支;T44为一个分支;T56为一个分支;Y1、Y2、Y3、T33、T37、T43、T48、T55为一个分支。同源性分析发现本次获得的肝片吸虫cox1基因与之前报道的cox1参考基因的同源性为99.6%～100%。Pop ART 1.7分析发现22个肝片吸虫cox1基因共聚积成5个单倍型,其中T4、T7、T9、T10、T14、T17、T34、T46为一个单倍型;T8和T15为一个单倍型;Y1、Y2、Y3、T26、T33、T37、T43、T48、T55、T56为一个单倍型;T44为一个单倍型;T58为一个单倍型。Dna SP软件分析发现这些单倍型多样性和差异性指数分别为0.913和0.00092。
盛兆安[2]（2020）在《大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究》文中指出背景:片形吸虫病主要是由片形属的肝片吸虫和大片吸虫感染所致的人畜共患寄生虫病,对公共卫生安全造成严重威胁。片形吸虫在感染宿主的过程中会不断产生可溶性的分子及胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）调控宿主免疫微环境,在宿主体内建立持续感染。脊椎动物的胃肠道内共生微生物在维持免疫系统的发育和功能的同时,对宿主的营养和能量代谢平衡亦起着至关重要的作用。目前已经有大量的研究显示寄生虫与宿主肠道菌群具复杂的相互作用关系,本研究通过描绘大片形吸虫感染后对宿主肠道菌群与免疫相关分子相互关系,对宿主-寄生虫-肠道菌群的复杂关系深入探讨,为实验室研究转化临床应用奠定基础。方法:（1）通过大片吸虫囊蚴感染水牛、BALB/C小鼠,大片吸虫成虫ESP、15k EVs、100k EVs腹腔注射小鼠;（2）对涉及与寄生虫免疫相关的Th1型和Th2型免疫细胞因子、转录因子和Toll样受体,血清中特异性抗体等免疫学指标进行检测,初步推测大片吸虫感染所诱导的宿主免疫反应类型;（3）收集实验动物的肠道内容物,经Illumina Hi Seq测序平台进行16S r RNA测序分析,评价大片吸虫感染对肠道菌群构成和功能的影响;（4）使用差速离心的方法,对大片吸虫产生的两种不同形态的胞外囊泡15,000×g（15k EVs）和100,000×g（100k EVs）进行分离鉴定,使用shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行分析;（5）将免疫学指标与肠道菌群数据进行相关性分析,推断大片形吸虫感染与宿主肠道菌群的相互作用机制。结果:发现宿主对大片吸虫的易感性与Th2型免疫反应密切相关,大片吸虫感染早期诱导Th1/2混合型的免疫反应,慢性感染阶段则转为典型的Th2型免疫反应。血清中特异性的IgG和IgG1的抗体水平随感染进程呈上升趋势。表明大片吸虫感染所诱导的Th2型相关的细胞因子和IgG1可能是其在自然宿主水牛体内成功建立感染的关键。同时小鼠模型发现激活的ERK通路和抑制经典的TLRs-IKB-NF-κB（p65）通路,参与了大片吸虫诱导的Th2型免疫反应。依据不同离心力,成功分离鉴定了两种不同形态的胞外囊泡15k EVs和100k EVs,并经shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行鉴定,发现其中含有多种与免疫调控、诊断、疫苗候选分子相关的蛋白;体内实验发现ESP、15k EVs、100k EVs均可诱导小鼠Th2/Treg型免疫反应,并通过上调T细胞共抑制分子CLAT-4和PD-1,限制Th1型免疫的发展。水牛感染大片吸虫可显着降低水牛肠道菌群的α-多样性,肠道菌群的构成在不同胃肠道部位的结果差异较大。RDA/CCA分析在科水平上Peptostreptococcaceae和Family＿XIII与高水平的IgG1和IL4相关。F.gigantica感染显着减少水牛结肠中产短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFAs）菌群Lachnospiraceae＿NK3A20＿group、Alistipes的丰度,降低结肠SCFAs浓度,大片吸虫感染小鼠同样观察到可减少结肠中产SCFAs的uncultured＿bacterium＿Lachnospiraceae丰度,提示Th2型免疫反应与下调菌群产生SCFAs相关。大片吸虫感染与成虫ESP、15k EVs、100k EVs注射均可降低小鼠结肠内容物菌群的α-多样性的,RDA/CCA分析Bacteroidetes和Proteobacteria与Th2和Treg型细胞因子具较强的相关性,而Bacteroidaceae和Cyanobacteria可能参与了大片吸虫感染引起的宿主纤维化的进程。结论:大片吸虫感染可通过调控宿主的肠道菌群的结构与菌群代谢产物影响宿主的免疫应答,促进其在宿主体内存活。对大片吸虫-宿主-肠道菌群作用关系的深入了解有助于我们更好的防控片形吸虫病提供参考。
姜鹏[3]（2020）在《旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究》文中研究表明旋毛虫（Trichinella spiralis）是重要的食源性寄生线虫,其成虫寄生于宿主小肠黏膜内。幼虫能否侵入宿主肠黏膜,是旋毛虫感染宿主与致病的关键;然而,幼虫侵入肠黏膜的机制仍不清楚。形态学研究发现,侵入期幼虫的口孔并无齿（矛）状结构,因而,幼虫侵入肠黏膜并非单纯机械力作用,极可能是幼虫的蛋白酶介导了侵入过程。烯醇酶（enolase）是糖酵解过程的关键酶,也是一个多功能蛋白,在纤溶系统激活、肌肉再生、细胞应激、癌细胞转移及感染等过程中发挥重要功能。研究表明,烯醇酶参与了病原生物感染宿主的过程并发挥了重要作用。我们的前期研究发现,幼虫在与宿主小肠上皮细胞（IECs）共孵育后,旋毛虫烯醇酶基因（Ts-eno）的相对转录水平显着升高,旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的表达量明显增加;此外,在旋毛虫肠道感染性幼虫（IIL）的表面蛋白中也鉴定出了高丰度的Ts ENO;提示,Ts ENO参与了幼虫侵入宿主肠黏膜的过程,但尚不清楚Ts ENO在幼虫侵入过程中发挥作用的具体方式和分子机制。截至目前,已在多种病原体（细菌、原虫、蠕虫和昆虫）侵入宿主的过程中观察到烯醇酶结合宿主纤溶酶原（PLG）,促进纤溶系统激活,加速病原体入侵的现象。纤溶系统不仅在血管内发挥作用,在组织液中也广泛分布。生理状态下,由于纤溶酶原激活物（PAs）与纤溶抑制物（PAI-1和α2-AP）相互制约,机体内纤溶系统维持凝血与纤溶之间的动态平衡,避免出现纤溶亢进（出血倾向）或血栓形成。研究提示,烯醇酶在感染过程中可作为PLG的受体,打破纤溶系统的动态平衡,促进纤溶系统激活,利用纤溶酶（PLM）靶向降解细胞外基质（ECM）的作用,协助幼虫侵入,但分子机制尚不明确。Ts ENO能否作为宿主PLG的受体?能否结合宿主组织液中的PLG并与之发生相互作用?Ts ENO打破平衡态纤溶系统、促进纤溶系统激活的分子机制是什么?Ts ENO是否具有促进幼虫侵入宿主的功能?是本研究关注的科学问题。本研究应用生物信息学技术,深入分析了Ts ENO的分子生物学特征,构建了Ts ENO的3D分子模型,并与已解析晶体结构的人PLG分子进行对接,明确了Ts ENO结合宿主PLG并发生相互作用的方式和分子机制;在对Ts ENO进行系统的生物信息学研究基础上,体外表达、纯化出重组的Ts ENO（r Ts ENO）和定点突变的重组Ts ENO（M-r Ts ENO）,分别制备对应的抗血清;分析了Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录表达水平及Ts ENO的虫体组织定位;对r Ts ENO与宿主肠黏膜、PLG的结合能力进行了鉴定;分析r Ts ENO的酶活性,通过竞争性结合实验和PLG激活试验,验证了Ts ENO与PLG相互作用的分子机制;通过旋毛虫体外侵入细胞模型、动物试验和RNA干扰技术（RNAi）,从多个层次和不同角度,正、反向反复验证了Ts ENO通过激活宿主纤溶系统协助幼虫入侵肠黏膜的科学假设。材料与方法1.旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞旋毛虫河南猪源分离株（T.spiralis,T1）,昆明小鼠保种传代。实验动物为SPF级、雌性6周龄BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。表达载体p QE-80L及大肠杆菌BL21均为本实验室-80℃冷冻保存。细胞为本实验室分离、原代培养的胎鼠小肠上皮细胞（IECs）。2.Ts ENO的分子生物学特征及与PLG结合能力的分析和实验验证应用生物信息学技术,对Ts ENO（XP＿003371233）的分子生物学特征进行了系统分析;应用Signal P预测信号肽,使用I-TASSER构建Ts ENO的3D分子模型,采用SAVES及Super Pose评估和验证Ts ENO 3D分子模型质量,采用ZDOCK将Ts ENO与PLG（PDB ID:4DUR）进行分子对接,VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分析对接结果;明确结合关键位点后,使用I-TASSER构建定点突变的M-Ts ENO分子模型,对比分析关键位点突变产生的影响。将重组p QE-80L/Ts ENO、p QE-80L/M-Ts ENO转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达;Far-Western blot和ELISA检测r Ts ENO、M-r Ts ENO与PLG的结合情况;应用?-ACA,采用竞争性结合试验验证关键位点突变对结合的影响。3.Ts ENO促进纤溶系统激活的分子机制及实验验证应用VMD、Lig Plot+（DIMPLOT）及PDBe PISA分别分析Ts ENO、M-Ts ENO与决定PLG活性的关键色氨酸残基（Trp761）之间的相互作用;计算色氨酸残基（Trp761）在与Ts ENO、M-Ts ENO结合前后相互作用面积（2）、相互作用残基的溶液可及表面积(AASA)、溶剂化能（ΔiG）、氢键、二硫键及疏水相互作用的变化,测量并比较Trp761与其相互作用残基间的距离;测定纯化复性后r Ts ENO、M-r Ts ENO的酶比活力;应用PLG激活试验,观察r Ts ENO、M-r Ts ENO结合并激活PLG产生纤溶酶（PLM）的情况,观察PAs存在与否对r Ts ENO、M-r Ts ENO激活PLG产生PLM的影响,验证Ts ENO通过与PLG的活性决定残基（Trp761）发生相互作用促进纤溶系统激活的分子机制。4.Ts ENO在旋毛虫侵入宿主过程中的作用研究Real-time PCR分析Ts-eno在旋毛虫各期的转录水平,IFA检测Ts ENO在虫体的定位;Far-Western blot检测肌幼虫（ML）排泄分泌抗原（ES）与PLG的结合;IFA检测r Ts ENO与小鼠肠黏膜组织特异性结合;应用旋毛虫幼虫-IECs体外侵入模型,观察不同浓度r Ts ENO、不同稀释度的抗r Ts ENO血清对旋毛虫幼虫体外侵入IECs单层的促进及抑制作用;设计、合成特异性靶向Ts-eno的小干扰RNA（si RNA）,使用电穿孔法导入旋毛虫幼虫体内,应用Western blot检测si RNA对Ts ENO表达水平的抑制情况,通过RNAi反向验证Ts ENO在幼虫侵入过程中的功能;应用r Ts ENO免疫60只BABL/c小鼠后,将旋毛虫肌幼虫以300条/鼠的剂量感染BALB/c小鼠,分别于感染后第5 d和42 d,收集肠道成虫和肌幼虫,统计回收虫数、减虫率、肌肉虫荷（LPG）和生殖力指数（RCI）,分析r Ts ENO免疫小鼠后对幼虫侵入的影响,验证Ts ENO在幼虫侵入肠黏膜过程中的功能。5.统计学分析应用IBM SPSS 21.0统计分析软件包对结果数据进行统计学描述、假设检验及图表绘制,检验水准设定为α=0.05。结果1.Ts ENO的分子生物学特征及其与PLG结合的关键位点确定切除信号肽的Ts ENO长473 aa,约51.95 k Da;Ts ENO与常见寄生虫烯醇酶的序列一致性为62.09%～98.91%,具有烯醇酶家族特征性MOTIF,结构域、金属结合位点、激活位点和底物结合口袋呈现高度保守特征。Verify 3D发现Ts ENO分子模型82.24%残基的3D-1D评分≥0.2,ERRAT计算出Ts ENO的全局质量因子为90.753,拉氏图显示Ts ENO在允许区域内分布的残基占比为98.8%。Super Pose三维结构多重比对结果表明,Ts ENO的结构与5种已解析晶体结构的寄生虫相关烯醇酶（3QTP、1OEP、4G7F、3OTR和5WRO）高度一致;在碳骨架和全分子的均方根偏差（RMSD）最大仅分别为2.03和2.18。Ts ENO和PLG具有结构互补性,赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在结合时发挥关键作用,其中Lys90与PLG的Ser383形成氢键。Ts ENO与M-Ts ENO在碳骨架和全分子间的RMSD仅分别为2.63和3.30,但将M-Ts ENO与PLG对接时,M-Ts ENO出现在相互作用面上的赖氨酸残基仅有Lys116。Far-Western blot发现,r Ts ENO、M-r Ts ENO均能特异性结合PLG,但相同条件下M-r Ts ENO的识别条带明显弱于r Ts ENO。ELISA表明,与r Ts ENO相比,M-r Ts ENO的PLG结合能力明显下降,下降幅度最高达45.37%。不同浓度的ε-ACA均能与r Ts ENO或M-r Ts ENO竞争性结合PLG,ε-ACA的竞争性抑制作用具有随浓度升高而增强的线性趋势(Fr Ts ENO=3532.392,FM-r Ts ENO=3499.730,P均<0.01);不同浓度ε-ACA对r Ts ENO的竞争性抑制作用显着高于M-r Ts ENO（t=3.411,P<0.05）。浓度为25 mmol/L时,ε-ACA对r Ts ENO、M-r Ts ENO的竞争性抑制率分别为64.25%和33%。2.Ts ENO促进纤溶系统激活机制的分析与验证对Ts ENO-PLG蛋白复合物的分析发现,Ts ENO的Glu303与决定PLG活性的关键残基Trp761间的平均距离为7.28 1.60,二者可以通过疏水相互作用结合在一起,Glu303与Trp761在结合时的埋入面积(ABSA)分别为33.97 2和29.55 2,ΔiG依次为-0.24 kcal/mol和0.47 kcal/mol。Trp761与M-Ts ENO（Glu303Ala）的Lys90、Ser91,以及与M-Ts ENO（Lys90 Ala、Lys289Ala、Lys291Ala和Lys300Ala）的Phe48、Tyr93之间,均存在疏水相互作用;Trp761与Lys90、Ser91之间的距离分别为5.35 0.43和7.27 1.41,与Phe48、Tyr93之间的距离分别为5.57 0.51和6.76 0.84。单因素方差分析表明,Trp761与不同相互作用残基之间距离的差异具有统计学意义（F=10.546,P<0.01）;根据相互作用残基间的空间几何构型,Trp761（PLG）在与Glu303（Ts ENO）相互作用时产生的空间位移最大（7.28）;互作产生的位移在一定程度上减少了Trp761对PLG底物结合口袋（由催化残基His603、Asp646和Ser741组成）的物理阻挡,有利于PLG的激活。Ts ENO催化糖酵解途径中2-PGA PEP反应的活性位点（Glu246、Lys382）在突变前后均未出现在与PLG的相互作用面上。在37℃、p H=7.5的反应条件下,r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应（2-PGA?PEP）时的酶比活力分别为36.77 20.22 U/mg和34.63 16.86 U/mg,逆向反应时依次为16.73 10.70 U/mg和17.20 13.82 U/mg;r Ts ENO和M-r Ts ENO催化正向反应时（2-PGA?PEP）的Km值分别为0.78 mmol/L和0.80 mmol/L,最大反应速率Vmax分别为0.42μmol/min/mg和0.40μmol/min/mg。含有Mg2+的缓冲体系可使r Ts ENO和M-r Ts ENO达到最佳酶催化活力,Zn2+、Mn2+、Fe2+和Cu2+的促进作用不及Mg2+,K+、Ni2+、Al3+、Ca2+和Li+对该酶促反应仅有非常微弱的启动作用,而Cr3+则对r Ts ENO和M-r Ts ENO的酶活性具有完全的抑制作用。PLG或t-PA单独与r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原或ES抗原相互作用时,各组OD405值之间的差异不具有统计学意义(FPLG=1.355,Ft-PA=1.013,P均>0.05);当PLG与t-PA共同存在时,t-PA可以激活PLG并产生PLM,添加不同的蛋白后,各组OD405值之间的统计学差异具有显着性(FPLG+t-PA=344.875,P<0.05);r Ts ENO、M-r Ts ENO、肌幼虫可溶性抗原和ES抗原均明显地促进PLG的激活、增加PLM的产生量（P<0.05）;其中以肌幼虫可溶性抗原的促进作用最强,随后依次为r Ts ENO、M-r Ts ENO和ES。3.Ts ENO在旋毛虫侵入IECs单层及肠黏膜过程中的作用Real-time PCR结果表明,Ts-eno在旋毛虫肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、3 d成虫（3 d AW）、6 d成虫（6 d AW）和新生幼虫（NBL）均转录,以ML期相对转录水平最高（F=7.878,P<0.05）。IFA检测发现,Ts ENO在ML、6 h IIL、24 h IIL、3 d AW、6 d AW和NBL各发育期均表达,主要定位在杆状体、表皮及胚胎中。Far-Western blot证实,ES抗原中包括特异性结合PLG的52 k Da蛋白;IFA结果表明,r Ts ENO可以与小鼠肠黏膜组织特异性结合。体外侵入实验表明,不同浓度r Ts ENO组幼虫侵入数均高于PBS对照(t2=4.564,t4=7.920,t6=24.588,t8=19.100,t10=30.237,P均<0.05),幼虫侵入率具有随r Ts ENO浓度升高而增加的趋势（F=410.744,P<0.01）;抗r Ts ENO血清对幼虫侵入的抑制率最高达51.26%,抑制率具有随血清稀释倍数增加而降低的趋势（F=557.494,P<0.05）。使用si RNA-97干扰幼虫可使Ts ENO的表达量降低53.56%,对幼虫侵入IECs单层造成的抑制率为49.82%。以r Ts ENO免疫BALB/c鼠后,5 d成虫减虫率为31.79%,42 d肌幼虫减虫率为47.15%;r Ts ENO免疫组的LPG及RCI均低于佐剂组和PBS对照组(FLPG=39.375,FRCI=46.533;P均<0.01)。结论1.旋毛虫烯醇酶（Ts ENO）的4个赖氨酸残基（Lys90、289、291和300）在Ts ENO与宿主纤溶酶原（PLG）结合时发挥重要作用。2.Ts ENO 4个赖氨酸残基的定点突变,导致M-r Ts ENO与PLG的结合能力显着降低;在与t-PA共同存在时,r Ts ENO能明显地促进PLG激活。3.重组Ts ENO具有促进幼虫侵入的功能,可诱导产生特异性免疫保护;Ts ENO是旋毛虫侵入宿主肠黏膜时的重要蛋白,可能是研制新型抗旋毛虫疫苗/药物的候选靶标。
侯林静[4]（2019）在《大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化》文中研究表明本研究目的是从大片形吸虫分泌排泄产物（Fasciola gigantila Excretory-Secretory Products,FgESP）凝胶过滤层析组分及其鉴定蛋白成分中筛选出大片形吸虫病早期诊断抗原并建立诊断方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断试剂盒奠定基础。本研究通过制备成虫FgESP,进行凝胶过滤层析,从中收集第一个波峰及其附近层析组分,依次命名为F1、F2、F3、……Fn等。以不同层析组分作为抗原,筛选出检测效果较优层析组分。同时将效果较好层析组分进行质谱分析,选取有潜在诊断价值的3个候选抗原进行原核表达。以较优层析组分作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清反应,建立并优化间接ELISA方法;分别将3个重组蛋白及其混合蛋白作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清及感染大片形吸虫4周小鼠血清反应,进行间接ELISA方法优化。应用优化好的ELISA方法检测0～14周水牛血清以及广西部分地区700份奶牛血清Ig G抗体水平,比较Fg ESP与较优层析组分作为诊断抗原的结果。本研究筛选检测效果较好层析组分为F21、F22与F23。将效果较好的层析组分进行质谱分析,结果含有硫氧还蛋白过氧化物酶1（Thioredoxin Peroxidase-1,TPx-1）、组织蛋白酶 B3（Cathepsin B3,Cat B3）和组织蛋白酶L1（Cathepsin L1,Cat L1）、热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）和微管蛋白（Tubulin proteins）等潜在诊断价值的候选抗原。筛选出TPx-1、Cat B3和Cat L1作为诊断候选抗原,进行原核表达。FgTPx-1表达形式为可溶性蛋白和包涵体两种,FgCat B3和FgCat IL1表达形式均为包涵体。FgTPx-1、FgCat B3和FgCat L1重组蛋白分子量分别为46 kDa、40 kDa和39 kDa。效果较优的层析组分F22作诊断抗原的最优条件是包被浓度为0.157 μg/mL,水牛血清稀释倍数为1:400,二抗稀释倍数为1:40000,阴阳临界值为0.391。F22层析组分最优浓度为常用FgESP抗原用量（2.5 μg/mL）的1/16。通过间接ELISA优化结果显示FgTPx-1和FgCat B3单个蛋白对水牛阴阳性血清反应P/N值较小。FgTPx-1和FgCat B3浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清稀释倍数为1:100时P/N值较大。FgCat L1用水牛血清和小鼠血清优化时,均在抗原浓度为0.157 μg/mL,血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白浓度为0.313μg/mL,水牛血清比例为1:100时P/N值较大,混合蛋白浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白与FgCat L1在0～14周实验感染水牛血清检测时,实验组OD450nm值整体呈上升趋势,混合蛋白阴阳性差值在1～8周检测时略低于FgCat L1。将FgESP、F22、FgCat IL1与混合蛋白进行间接ELISA诊断比较,用实验感染水牛第4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400,P/N值最大,其次为FgESP。用水牛标准血清优化,4个诊断抗原P/N值均较大。用实验感染小鼠4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400时,P/N值最大,4个诊断抗原阴阳性差异均较大。FgESP与小鼠血清灵敏性略低于其他蛋白,其中FgCat L1与混合蛋白作为诊断抗原时,阴阳性差异大,但两者P/N值较接近。F22检测水牛0～14周血清抗体水平结果为从第2周抗体水平明显开始升高,快速升至4周后呈平缓上升趋势,FgESP检测结果为从第2周抗体水平明显升高,抗体水平呈平缓上升趋势。抗F22-IgG水平均明显高于抗FgESP-IgG水平。FgESP和F22层析组分检测0～14周水牛血清的准确率为100%。普查广西部分地区700份奶牛血清,F22的阳性检出率为50.43%,FgESP的阳性检出率为45.29%。F22建立的间接ELISA方法效果较好。本研究发现有效层析组分主要集中于第一个峰、获得检测效果较优层析组分F22并建立了以层析组分F22为诊断抗原的间接ELISA方法。本研究原核表达的FgTPx-]、FgCat L1和FgCat B3三种重组蛋白,可为进行进一步功能研究奠定基础。FgESP、F22和FgCat L1与混合蛋白对大片形吸虫病的诊断结果表明,F22、FgCat L1诊断效果较好,混合蛋白无明显优势,其中F22可进行水牛大片形吸虫病较早期诊断,为开发大片形吸虫病早期诊断试剂盒奠定基础。
李烨[5]（2019）在《鸭三种吸虫线粒体全基因组的扩增与进化分析》文中研究说明鸭吸虫病是一类对鸭危害较严重的寄生虫病。目前对鸭吸虫的研究多数集中在形态学、流行病学、病原诊断及综合防治等方面,关于其分子生物学方面的基础研究相对较少。因此本研究拟对鸭体内宫川棘口吸虫（Echinostoma miyagawai）、舟形嗜气管吸虫（Tracheophilus cymbius）和鸭对体吸虫（Amphimerus anatis）三种吸虫的线粒体全基因组序列进行扩增及进化分析,探讨三种吸虫与其他吸虫的亲缘关系及分类地位。利用PCR方法分别扩增三种吸虫的线粒体全基因组序列,以线粒体串联的12个蛋白质编码基因氨基酸序列为基因标记,采用最大简约法（MP）、最大似然法（ML）及贝叶斯法（BI）构建系统发生树,探讨实验中三种吸虫与其它相关吸虫的亲缘关系。结果显示宫川棘口吸虫、舟形嗜气管吸虫和鸭对体吸虫线粒体全基因组全长分别为14 416 bp、13 733bp和14 588 bp;每个线粒体基因组都含有36个基因,包括12个蛋白质编码基因、22个tRNA序列和2个rRNA序列,所有基因均在同一条链上且转录方向相同。宫川棘口吸虫和舟形嗜气管吸虫有1个非编码区,鸭对体吸虫有2个非编码区;宫川棘口吸虫、舟形嗜气管吸虫和鸭对体吸虫线粒体全基因组AT含量分别为65.29%、62.80%和59.80%;比较发现宫川棘口吸虫与卡普罗尼棘口吸虫（Echinostoma caproni）同源性最高（88.5%）,舟形嗜气管吸虫与日本棘隙吸虫（Echinochasmus japonicus）的同源性最高（76.4%）,鸭对体吸虫与猫后睾吸虫（Opisthorchis felineus）和东方次睾吸虫（Metorchis orientalis）同源性分析最高（83.6%）。进化结果显示,每一目形成一个独立分支;除圆圃棘口吸虫外,每一科又形成一个单独分支。宫川棘口吸虫（棘口科）、舟形嗜气管吸虫（环肠科）和片形科吸虫聚集到了棘口目的大分支中,其中宫川棘口吸虫与棘口属（除了圆圃棘口吸虫外）聚集在一个小分支中,圆圃棘口吸虫与片形科吸虫聚集到一个小分支中,据此可以推测棘口科应是复系;鸭对体吸虫与其它后睾科吸虫聚集到了一个小分支上,与传统的形态学分类一致。宫川棘口吸虫与舟形嗜气管吸虫的亲缘关系较鸭对体吸虫近。本研究首次获得了宫川棘口吸虫、舟形嗜气管吸虫和鸭对体吸虫的线粒体全基因组序列,不仅对吸虫线粒体基因组库数据进行了补充,也为三种吸虫的遗传变异、分子分类及进化研究奠定了基础。
马江霞[6]（2018）在《额尔齐斯河鳅科鱼类复口吸虫分类及群落生态学研究》文中进行了进一步梳理额尔齐斯河（中国段）是我国唯一一条注入北冰洋水系的国际河流,孕育着大量极寒质优的冷水性鱼类,其中小型低栖的鳅科鱼类在额尔齐斯河分布广、数量大。本文以鳅科鱼类为研究对象,应用鱼类寄生虫常规调查方法,结合形态学与分子生物学分类技术,并统计群落生态学相关参数,对鳅科鱼类寄生的复口吸虫（Diplostomidae）进行了分类鉴定、群落组成、群落结构及种间关系的研究。结果如下:（1）于2014年7月至2017年10月野外调查了额尔齐斯河鳅科鱼类眼部寄生虫,综合形态学和分子生物学方法对其物种进行鉴定,对待鉴定种的玻片标本进行了形态测量、描述和绘制形态图,并将虫体的部分ITS1-5.8S-ITS2基因序列与Gen Bank的比对,运用邻接法构建各宿主寄生虫序列的系统发育NJ树,鉴定为默氏复口吸虫（Diplostomum mergi）、伪匙型复口吸虫（Diplostomum pseudospathaceum）、匙型复口吸虫（Diplostomum spathaceum）和脑瘤宫吸虫（Tylodelphys cerebralis）,其中脑瘤宫吸虫为中国复口吸虫（Diplostomidae）新纪录种。（2）应用群落生态学统计与聚类分析方法,分析了鳅科鱼类复口吸虫感染情况及群落生态。发现新疆高原鳅（Triplophysa strauchii）感染强度最大,单尾可寄生357只。构建的三类寄生虫群落中,北方须鳅（Barbatula barbatula nuda）物种丰富,伴随着较高的群落多样性和均匀度指数,北方须鳅群落结构最稳定。新疆高原鳅与小体高原鳅（Triplophysa minuta）寄生虫群落结构极相似,而北方须鳅与小体高原鳅寄生虫群落结构中等相似,不同宿主寄生虫群落存在差异性。建立宿主与寄生虫之间的线性回归模型,复口吸虫的寄生与宿主体长呈显着正相关（P<0.01）,复口吸虫的寄生可能是种累积效应。经聚类分析可将复口吸虫群落聚为2类:（1）新疆高原鳅、小体高原鳅寄生虫群落;（2）北方须鳅寄生虫群落。（3）分析高原鳅Triplophysa sp.寄生虫的感染情况及复口吸虫群落特征,共检获寄生虫5种,分别为毛细线虫（Capillaria sp.）、舌状绦虫（Ligula sp.）、默氏复口吸虫（Diplostomum mergi）、伪匙形复口吸虫（Diplostomum pseudospathaceum）和脑瘤宫吸虫（Tylodelphys cerebralis）,其中三种复口吸虫是群落优势种,总感染率18.90%,平均感染强度1.30±2.98,平均感染丰度0.55±1.72,群落多样性指数1.0297,均匀度指数0.9373,生态优势度指数0.3800,群落物种多样性和丰富度指数较低。L左与R右群落的生态优势度指数均低于群落多样性指数,且L左与R右群落相似性指数0.8369,L左与R右寄生虫群落结构合理且相似性极高。R右较L左的群落结构稳定,L左与R右平均感染强度成对样本检验差异性不显着（P>0.05）,复口吸虫的寄生对宿主左右眼球无特异性。
杨英楠[7]（2017）在《白头翁皂苷提取物PSD抗日本血吸虫和曼氏血吸虫的药效研究》文中认为第一部分PSD抗日本血吸虫活性的研究目的研究（Pulsatilla saponin D,PSD）对小鼠体内发育不同阶段的日本血吸虫的灭杀效果。方法将感染过日本血吸虫尾蚴的ICR小鼠根据体重随机分为2批进行实验,每批分为6个组,每组10只小鼠。第1批感染血吸虫尾蚴后的14天开始给药,第2批感染尾蚴后的第35天开始给药。在感染后14-18天和35-39天进行尾静脉注射,剂量组（分别为10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg）,每天给药2次,连续给药5天;吡喹酮组以300mg/kg剂量口服灌胃（PO）吡喹酮,1次量灌胃;青蒿琥酯组以300mg/kg剂量经口服灌胃（PO）青蒿琥酯,1次量灌胃;以感染后未治疗组作为对照。感染49天后通过摘除眼球进行血液采集,解剖小鼠并收集虫体计算数量,计算减虫率和减雌率,摘取肝脏用4%KOH消化,计算减卵率。结果PSD组检获平均虫荷数与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组的减虫率与对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组检查获得的平均雌虫数与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组的减雌率与对照组相比有明显差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组检获平均虫卵数与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）。结论低剂量组（10mg/kg）、中剂量组（20mg/kg）和高剂量组（40mg/kg）的PSD对于感染后的小鼠均有不同程度的治疗效果:在相同的成长期内,不同剂量的PSD作用于小鼠体内日本血吸虫,高剂量（40mg/kg）组的杀虫效果比其他剂量组效果明显;在同剂量的条件下,PSD对感染35天龄的成虫治疗效果优于14天龄童虫的治疗效果。在所有的不同剂量的实验组中,减雌率高于减虫率,与感染后未治疗的对照组相比,雌虫的数量减少明显。第二部分PSD抗曼氏血吸虫活性的研究目的观察PSD对小鼠体内发育不同阶段曼氏血吸虫的杀虫效果。方法将感染曼氏血吸虫尾蚴的小鼠根据体重随机分2批进行实验,每批4个组,每组10只小鼠。第1批感染后第14天开始给药,第2批感染后第42天开始给药。在感染后第14-18天和第42-46天尾静脉注射40mg/kg PSD,每天2次,连续注射5天;吡喹酮组以300mg/kg剂量经口服灌胃吡喹酮,1次量灌胃;青蒿琥酯组以300mg/kg剂量经口服灌胃青蒿琥酯,1次量灌胃;以感染后未治疗的对照组进行对照。感染第56天后通过摘除眼球取血并解剖小鼠,收集虫体计数,计算减虫率和减雌率。取肝脏用4%KOH消化并计算减卵率。结果PSD组检获平均虫荷数与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组的减虫率与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组检获平均雌虫数与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组的减雌率与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）,PSD组检获平均虫卵数与未经过治疗的对照组相比有显着差异（*P<0.05,**P<0.01）。结论同一剂量PSD（40mg/kg）对小鼠体内不同发育阶段的曼氏血吸虫有不同程度的治疗效果:42天龄成虫杀灭效果好于14天龄童虫杀灭效果;在所有单一剂量（40mg/kg）的实验治疗组中,减雌率要高于减虫率,与感染后未治疗的对照组相比,雌虫的数量减少明显;PSD可显着降低42天虫龄小鼠体内的总虫荷数量及雌虫的数量。第三部分PSD对于已经感染日本血吸虫的小鼠体内免疫调控的机制和其杀虫作用的初步研究目的将肝脏组织进行包埋切片,在光学显微镜下观察PSD对感染了日本血吸虫小鼠肝脏组织病理学的影响,并检测相关体内免疫因子的动态变化,进而研究PSD对小鼠日本血吸虫病引发的炎症反应的影响;通过扫描电子显微镜进行扫描观察血吸虫表皮的形态变化,来初步探索PSD对日本血吸虫的作用机理。方法将感染日本血吸虫的ICR小鼠根据体重随机分为2批,每批6组,每组10只。第1批感染后第14天开始给药,第2批感染后第35天开始给药。在感染后14-18d组和35-39d尾静脉注射不同剂量的PSD（10mg/kg,20mg/kg和40mg/kg）,每天2次,连续5d;吡喹酮组以300mg/kg剂量经口灌服吡喹酮,1次量灌胃;青蒿琥酯组经口服灌胃青蒿琥酯（300mg/kg）,1次量灌胃;以感染但是未治疗组作为对照。感染7周后通过摘除小鼠眼球的方式采集血液并解剖小鼠,将肝脏组织包埋切片,在光镜下观察PSD对肝脏肉芽肿的影响;参照产品说明书,用夹心法ELISA测定血清中IgG、TNF-α、IL-4和IL-17。将ICR小鼠感染30条尾蚴,42天之后,用枸橼酸钠（0.3%）溶液灌注冲虫,获得无菌的日本血吸虫成虫。用4ml RPMI 1640含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml链霉素和80μl兔红细胞的培养基对日本血吸虫成虫进行培养,12小时后,将培养基更换含不同浓度的PSD（3.75、7.5、15、30、60μg/ml）培养基中培养72小时。所有的虫体均在37℃,含5%CO2和95%空气的环境中培养7天,培养基每3天更换一次,观察PSD对体外日本血吸虫成虫的杀伤作用。用含有60μg/ml的PSD的培养基培养无菌的日本血吸虫成虫4个小时,然后放置于10%的戊二醛缓冲液中,保持4℃,4小时;PBS溶液（1%）,4℃,2小时。PBS洗完后,将虫体放置在乙醇中脱水,并在液态的CO2中干燥。最后,将标本用扫描电子显微镜扫描,观察PSD对虫体表皮的影响。结果感染日本血吸虫但是并未治疗的对照组小鼠肝脏的组织结构明显改变,表现出炎性浸润和产生大量肉芽肿的特点,与未治疗的对照组相比,经PSD治疗后的小鼠肝脏内肉芽肿炎症的大小显着降低。通过PSD（20mg/kg）对感染14-18天和35-39天的小鼠进行治疗发现,肝脏中炎性细胞的数量显着减少,肝小叶的结构恢复并接近正常组织,大部分肝细胞呈现出正常的状态。通过ELISA的方法对PSD对小鼠免疫反应的影响进行测定,结果表明:与感染组相比,PSD（20mg/kg）能有效降低IgG,TNF-α,IL-4和IL-17的表达,表现出最佳的免疫调节作用。此外,扫描电子显微镜的检查结果显示治疗组雄性虫体表皮呈现异常结构,间结节皮层区呈现广泛的水肿、糜烂和脱皮。结论20mg/kg和10mg/kg PSD的治疗剂量都可以显着降低肉芽肿的炎性反应,降低血吸虫虫卵对肝的损伤。通过扫描电子显微镜观察,60μg/ml PSD治疗组雄性虫体表面损伤最为严重,受损的皮层脱落,并暴露出皮下组织。这些结果表明,PSD具有一定的抗血吸虫活性的作用。
岳东梅[8]（2017）在《大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析》文中指出片形吸虫不仅感染牛羊等反刍动物,而且也可感染人体,严重威胁着人和动物的健康。因此,建立高效准确的诊断方法是防控该病的研究重点。片形吸虫包括肝片形吸虫、大片形吸虫及其中间型,目前对于大片形吸虫及其中间型的相关研究相对较少。因此,本研究选择大片形吸虫为研究对象,通过对大片形吸虫排泄分泌（ES）抗原与宿主的互作,旨在筛选、鉴定及分析出具有诊断潜力的蛋白,为建立大片形吸虫的诊断方法奠定基础。本研究分为三部分。第一部分,对大片形吸虫的鉴定。首先,将采自广西南宁的144条片形吸虫虫体进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。形态学鉴定这144条虫体均为片形吸虫。对这144条虫体的核糖体第二内转录间隔区（ITS-2）序列进行了扩增、测序,结果表明144个PCR样品的测序结果区别于肝片形吸虫及中间型,而均与大片形吸虫ITS-2序列（GenBank accession AJ557569）匹配率达99.7%,从而判定分离得到的144条片形吸虫均为大片形吸虫,不含中间型。第二部分,大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选。首先,利用体外培养方法收集大片形吸虫虫卵,对虫卵进行体外培养孵出毛蚴感染淡水螺,使其在淡水螺体内生长发育,直至尾蚴逸出螺体脱尾形成囊蚴,收集形成的囊蚴（感染虫卵后35 d）,并进一步用囊蚴经口感染水牛（约500个囊蚴/头）,在水牛感染后的14 d、42 d、70 d、98 d,分别采血制备血清。其次,利用体外培养方法分别收集大片形吸虫ES抗原,将收集的ES抗原免疫家兔制备阳性血清,用间接ELISA方法检测其抗体效价,结果表明ES抗原制备的阳性血清效价可达到1:1 000,说明大片形吸虫ES抗原的免疫原性较好,可用于后续的试验。然后,将大片形吸虫ES抗原分别与水牛各时间段的血清互作,通过免疫共沉淀和LC-MS/MS（质谱）试验,共获得了465个非冗余蛋白。进一步用BlastP同源性比对、UniProt鉴定,找到57个已知蛋白,分别在42 d、70 d和98 d的蛋白有13（22.8%）个、5（8.8%）个和7（12.3%）个,同时存在于42 d和70 d、70 d和98 d、42 d和98 d的可被鉴定的蛋白分别有8（14%）个、5（8.8%）、1（1.8%）个,同时存在于42 d、70 d和98 d可被鉴定的蛋白有18（31.6%）个。进一步用生物信息学分析,预测α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶等蛋白具有诊断价值。第三部分,对筛选出的具有代表性的α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶进行克隆、原核表达,并探索其作为片形吸虫病诊断抗原的可行性。结果表明,成功克隆了片段长为1 356 bp、能编码452个氨基酸、理论分子量为48.99 kDa的α-微管蛋白基因和片段长为1 572 bp、能编码523个氨基酸、理论分子量为56.38 kDa的亮氨酸氨肽酶基因。这两个蛋白的二级结构预测都以无规卷曲为主,抗原表位在整个序列均有分布。三级结构的主要功能区域都在N端。将α-微管蛋白基因插入载体pGEX-6P-1（+）,亮氨酸氨肽酶基因插入载体pET-30a分别进行原核表达。发现经IPTG诱导表达的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT分子量约为76 kDa（含载体携带的26 kDa的GST标签）,且以融合蛋白形式表达,经Glutathione-Sepharose beads纯化后,获得了较高纯度的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT;经IPTG诱导表达的重组蛋白pET-30a-FgLAP分子量约为56 kDa,以包涵体形式表达,经Ni-NTA His bind Resin纯化后获得较高纯度的重组蛋白pET-30a-FgLAP。这两个重组蛋白分别与大片吸虫ES抗原免疫家兔后制备的阳性血清、水牛感染大片吸虫不同期的阳性血清反应,经Western Blot分析证实均具有免疫反应性。本研究通过以上三个部分的试验,成功鉴定出大片形吸虫ES抗原中与宿主互作的蛋白,包括465个非冗余蛋白。利用生物信息学分析,筛选出57个已知蛋白,并进一步鉴定出具有代表性的α-微管蛋白基因和亮氨酸氨肽酶基因。通过对这两个基因的克隆、表达及免疫反应性分析,推断出它们在大片形吸虫病诊断中具有很大的潜力。
宋云[9]（2017）在《云南大理片形吸虫扫描电镜观察和分子生物学鉴定》文中研究指明[目的]观察云南大理片形吸虫头锥部分（口吸盘、腹吸盘、生殖孔、体棘）的超微结构,用分子生物学方法对该地区片形吸虫的虫种进行鉴定,为云南大理片形吸虫的生物学特性及遗传变异提供基础信息。[方法]1.云南大理片形吸虫部分结构的扫描电镜观察:从大理泰兴农贸市场自然感染片形吸虫的4头黄牛肝胆管中获得了片形吸虫各10条,用生理盐水冲洗去血迹后各自分装到装满生理盐水的玻璃瓶中,依次标记为1、2、3、4号。从4号瓶中选取两条较完整的虫体编号为A、B号,从3号瓶选取了两条较完整的虫体编号为C、D号。剪取四条虫体头锥部分经冷藏过夜处理后按照制作扫描电镜标本的步骤:取材、固定、脱水、包埋、切片、染色后放在电子显微镜下进行观察。2.提取片形吸虫成虫基因组DNA:1号瓶中获得较完整虫体6条,编号为1-6号;2号瓶中获得虫体2条,编号7-8号,取这些虫体前端1/3部分,生理盐水冲洗,再用超纯水冲洗4到5遍,装于已消毒的1.5ml离心管。用手持式研磨仪捣碎虫体,将所得组织碎片参照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒说明书上的方法提取片形吸虫成虫DNA,用核酸定量仪检测8个样品的DNA浓度。3.PCR扩增和测序:扩增片形吸虫的核糖体ITS-2基因片段、线粒体cox1部分基因片段及线粒体nad5部分基因片段,将所得扩增产物送至大连宝生物公司测序。4.序列分析:用DNAStar7.0软件将所得序列与之前报道的标准序列进行相似性比较。[结果]1.除C号虫体未见明显的生殖孔以外,其他三条片形吸虫都具有片形吸虫的典型结构:口吸盘、腹吸盘、生殖孔以及遍布虫体的体棘。口吸盘直径在310μm-540μm之间,腹吸盘直径在450μm-600μm之间。对这些虫体的口、腹吸盘放大后显示具有两种形式的乳突:圆锥形乳突和纤毛样乳突。将虫体部分体棘高倍放大后发现其呈现横向生长于虫体表面的具有基底较宽,端部较窄的圆弧状结构,端部生长有锯齿样结构。2.8条片形吸虫进行分子生物学鉴定后显示:其中2条经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后显示大片形吸虫的目的条带,因此这两条鉴定为大片形吸虫;另外6条经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后显示肝片形吸虫的目的条带,这6条鉴定为肝片形吸虫。3.PCR扩增云南大理片形吸虫的线粒体cox1基因部分序列测序显示其种内分歧度为0.9%-2.3%,种间分歧度3.0%-10.0%;线粒体nad5基因部分序列其种内分歧度为0.9%-1.2%,种间分歧度为 5.0%-13.0%。[结论]1.云南大理片形吸虫部分结构的扫描电镜结果显示四条片形吸虫有三条是肝片形吸虫,一条是大片形吸虫。除一条片形吸虫未观察到明显的生殖孔以外,其余三条片形吸虫都具有口腹吸盘、生殖孔,且虫体表面均生长一些致密的体棘,而且口吸盘处体棘比腹吸盘处致密。2.在以核糖ITS-2基因为分类遗传标记的研究基础之上,云南大理存在两种片形吸虫:肝片形吸虫与大片形吸虫。3.通过对这8条片形吸虫样品的核糖体ITS-2基因和线粒体cox1、nad5基因部分序列进行测序显示该地区片形吸虫之间呈现种间差异大于种内差异的特点。
邢国强[10]（2016）在《Nrf2信号通路抑制后对细粒棘球蚴原头节生长的影响》文中研究指明目的:本实验以体外培养的细粒棘球蚴原头节为研究对象,观察维甲酸（RA）对细粒棘球蚴原头节内Nrf2信号通路的抑制作用,并进一步探讨Nrf2信号通路抑制后体外对细粒棘球蚴原头节的作用。方法:无菌条件下,从自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏中获取细粒棘球蚴原头节,并置RPMI 1640培养基中体外培养。将不同浓度的RA（2、4、6、8和10μmol/L）体外作用于细粒棘球蚴原头节,并设立空白对照组。采用共聚焦免疫荧光技术检测原头节内Nrf2的定位及表达变化;通过WST法及ELISA法测定RA作用后原头节GST及HO-1的活性变化。各组原头节经0.1%伊红溶液染色后于光镜下观察活力及形态变化,实验独立重复3次,并绘制活力曲线。用扫描电子显微镜（SEM）观察原头节表面超微结构改变。不同浓度RA作用原头节24h、48h后,用caspase-3检测试剂盒检测caspase-3酶活性。结果:免疫荧光定位表明Nrf2绿色荧光主要分布于细粒棘球蚴原头节的细胞质中,8μmol/LRA作用后,绿色荧光强度及定位均未见明显改变。RA作用后的原头节GST和HO-1活性均显着下降（P<0.05）,且呈时间及剂量依赖性。不同浓度RA均有抑制原头节生长的作用,以8μmol/L和10μmol/LRA对原头节杀伤作用较明显,至培养第5d,8μmol/L组原头节活力仅为9.58%,而10μmol/L组原头节已全部死亡。随着药物作用时间的延长,RA对原头节的杀伤作用越明显。SEM观察显示,RA可明显破坏原头节表面超微结构,引起虫体表层塌陷、顶突变形及微毛脱落,当药物浓度及作用时间增加后,损伤加重,出现顶突界面缺损、吸盘变形,体表还可见大量虫蚀样改变及指状突起。此外,不同浓度RA作用原头节24h、48h后,caspase-3酶活性较正常对照组显着增高（P<0.05）。结论:1.维甲酸可有效抑制细粒棘球蚴原头节内Nrf2调控的下游GST、HO-1的活性,但对Nrf2的表达水平没有影响。2.维甲酸体外作用可明显抑制细粒棘球蚴原头节生长,促进其凋亡。
二、肝片吸虫雷蚴、尾蚴的扫描电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝片吸虫雷蚴、尾蚴的扫描电镜观察（论文提纲范文）
（1）青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查及西藏螺内寄生虫鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 淡水螺概况 |
| 1.2.1 淡水螺类与环境的关系 |
| 1.2.2 椎实螺的生物学分类、生活史及形态特征 |
| 1.3 西藏地区主要螺种简介 |
| 1.3.1 耳萝卜螺 |
| 1.3.2 小土蜗 |
| 1.4 西藏螺地区螺内寄生虫病概况 |
| 1.4.1 复殖吸虫 |
| 1.4.2 肝片吸虫 |
| 1.5 寄生虫病对畜牧业的危害 |
| 1.6 寄生虫病的预防与治疗 |
| 1.6.1 预防防治 |
| 1.6.2 治疗 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样本来源与采集方法 |
| 2.1.2 ELISA检测试剂盒 |
| 2.1.3 主要器材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 血清学检测 |
| 2.2.2 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 牦牛肝片吸虫检测结果 |
| 2.3.2 藏羊肝片吸虫检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 西藏地区螺类分布及螺内寄生虫调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本来源与采集方法 |
| 3.1.2 样本的保存与运输 |
| 3.1.3 主要器材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 螺类的初步分类 |
| 3.2.2 螺的解剖与测量。 |
| 3.2.3 螺的形态学鉴定 |
| 3.2.4 螺内寄生虫的分离 |
| 3.2.5 寄生虫的形态学鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 螺的形态鉴定 |
| 3.3.2 西藏地区的螺类分布 |
| 3.3.3 肝片吸虫形态 |
| 3.3.4 复殖吸虫蚴虫的收集及形态学观察 |
| 3.3.5 西藏螺内寄生虫种类及感染率情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 椎实螺的地理分布 |
| 3.4.2 不同海拔高度椎实螺的分布情况 |
| 3.4.3 螺内寄生虫的感染情况 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 西藏地区螺内肝片吸虫、牦牛肝片吸虫的分子特征研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样本来源与采集方法 |
| 4.1.2 主要器材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 虫体DNA提取 |
| 4.2.2 PCR扩增 |
| 4.2.3 电泳 |
| 4.2.4 测序 |
| 4.2.5 序列比对及进化分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肝片吸虫的PCR扩增结果 |
| 4.3.2 序列比对与进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概述 |
| 1.1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行现状 |
| 1.1.3 片形吸虫病的防控现况 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的相互作用机制 |
| 1.2.1 片形吸虫的生活史 |
| 1.2.2 片形吸虫宿主适应性 |
| 1.2.3 宿主抗片形吸虫感染的机制 |
| 1.2.4 宿主的免疫应答与片形吸虫感染的互作关系 |
| 1.2.5 片形吸虫的免疫逃避策略 |
| 1.3 蠕虫感染与肠道菌群之间相互作用研究进展 |
| 1.3.1 蠕虫感染对微生物丰富度和多样性的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对宿主代谢的影响 |
| 1.3.3 蠕虫与肠道菌群相互作用关系的假设 |
| 1.3.4 蠕虫-微生物相互作用关系的应用 |
| 1.3.5 片形吸虫与肠道菌群的可能机制 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 大片吸虫感染对水牛宿主免疫微环境的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.2.3 主要设备、仪器 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物感染及取材 |
| 2.3.2 RNA的分离及反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR检测(RT-q PCR) |
| 2.3.4 血清抗体检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 水牛感染大片吸虫肝门淋巴结免疫学指标变化 |
| 2.4.2 水牛感染大片吸虫脾脏免疫学指标变化 |
| 2.4.3 水牛感染大片吸虫血清中抗大片吸虫ESP特异性抗体检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大片吸虫胞外囊泡的分离鉴定与蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 3.2.3 主要的仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 大片吸虫ESP和 EVs的收集 |
| 3.3.2 蛋白浓度定量分析 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 粒径检测 |
| 3.3.5 Western blot鉴定胞外囊泡所含蛋白质 |
| 3.3.6 Shotgun鉴定100k胞外囊泡中蛋白 |
| 3.3.7 小鼠免疫与感染 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 大片吸虫成虫ESP、EVs的分泌特征 |
| 3.4.2 大片吸虫成虫15k EVs、100k EVs鉴定 |
| 3.4.3 虫体回收 |
| 3.4.4 肝脏病理损伤评分 |
| 3.4.5 血清中ALT、AST的变化 |
| 3.4.6 血清中特异性抗体的变化 |
| 3.4.7 大片吸虫成虫100k EVS的蛋白组整体分析 |
| 3.4.8 大片吸虫成虫100k EVS鉴定的蛋白分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠T细胞分化相关TLR-ERK通路的初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物及材料 |
| 4.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要的实验仪器、设备 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠囊蚴感染分组 |
| 4.3.2 小鼠腹腔注射分组 |
| 4.3.3 样品收集 |
| 4.3.4 RT-q PCR检测 |
| 4.3.5 抗体ELISA检测 |
| 4.3.6 动物病理组织切片的制备 |
| 4.3.7 组织匀浆的制备 |
| 4.3.8 细胞因子ELISA检测 |
| 4.3.9 Western blot检测 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 小鼠感染大片吸虫囊蚴结果 |
| 4.4.2 大片吸虫 成虫 ESP、15k EVs和100k EVs腹腔注射小鼠模型 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 大片吸虫感染对水牛胃肠道菌群的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂/耗材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 测序数据的分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.5.1 肠系膜淋巴结、肝门淋巴结、脾脏和肝脏TLRs在感染组和对照组的表达情况 |
| 5.5.2 α-多样性分析 |
| 5.5.3 主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCo A) |
| 5.5.4 水牛感染大片吸虫对胃肠道菌群各分类水平组成 |
| 5.5.5 LEf Se(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size,LEf Se)分析 |
| 5.5.6 CCA/RDA分析 |
| 5.5.7 结肠中SCFAs水平检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物及材料 |
| 6.2.2 主要试剂、耗材 |
| 6.2.3 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 小鼠囊蚴感染对结肠内容肠道菌群构成的影响 |
| 6.4.2 腹腔注射小鼠模型结肠内容物菌群分析结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 水牛RT-qPCR使用引物 |
| 附表2 小鼠RT-qPCR使用引物 |
| 附表3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（3）旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 旋毛虫烯醇酶的分子生物学特征及其与纤溶酶原的相互作用机制研究 |
| 1 方法 |
| 1.1 TsENO序列信息的获取 |
| 1.2 TsENO的理化性质分析 |
| 1.3 TsENO的疏水性分析 |
| 1.4 TsENO的亚细胞定位分析 |
| 1.5 TsENO的跨膜区分析 |
| 1.6 TsENO的信号肽预测 |
| 1.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 1.8 TsENO的结构域分析 |
| 1.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 1.10 TsENO的抗原位点预测 |
| 1.11 TsENO的二级结构分析 |
| 1.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 1.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 1.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 1.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 1.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 1.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 1.18 PLG活性决定位点(Trp761)与Ts ENO的相互作用分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO的序列信息 |
| 2.2 TsENO的理化性质 |
| 2.3 TsENO的疏水性分析结果 |
| 2.4 TsENO的亚细胞定位分析结果 |
| 2.5 跨膜区分析 |
| 2.6 信号肽预测 |
| 2.7 Ts ENO的模体(MOTIF)分析 |
| 2.8 TsENO的结构域分析 |
| 2.9 TsENO的序列保守性分析及进化树构建 |
| 2.10 TsENO抗原位点及空间结构预测 |
| 2.11 TsENO的二级结构分析: |
| 2.12 TsENO蛋白结合位点的预测 |
| 2.13 Ts ENO3D分子模型的构建及模型质量评估 |
| 2.14 Ts ENO与 PDB库中已知寄生虫烯醇酶晶体的三维结构比对 |
| 2.15 小鼠PLG与人PLG分子结构的比对与相似性分析 |
| 2.16 Ts ENO与人PLG的分子对接 |
| 2.17 Ts ENO与 PLG的相互作用分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 2.18 PLG的关键氨基酸(Trp761)与Ts ENO的相互作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 TsENO与 PLG相互作用的验证及Ts ENO在旋毛虫侵入时的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 旋毛虫种株、实验动物、表达质粒、菌株及细胞 |
| 1.5 旋毛虫各期虫体的收集与抗原制备 |
| 1.6 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 1.7 rTsENO的酶活性分析 |
| 1.8 Real-time PCR检测Ts-eno的转录水平 |
| 1.9 IFA检测Ts ENO在虫体表面的表达 |
| 1.10 石蜡切片IFA检测TsENO在虫体内部的组织定位 |
| 1.11 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.12 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 1.13 IFA检测TsENO与小肠上皮组织的特异性结合 |
| 1.14 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 1.15 纤溶酶原激活试验 |
| 1.16 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 1.17 干扰TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 1.18 rTsENO的免疫保护作用 |
| 1.19 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsENO与 M-TsENO的重组表达、纯化与复性 |
| 2.2 rTsENO与 M-rTsENO的酶活性分析 |
| 2.3 Real-time PCR检测Ts-eno在旋毛虫不同发育期的转录水平 |
| 2.4 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体表面的表达情况 |
| 2.5 TsENO在旋毛虫不同发育阶段虫体的表达与定位 |
| 2.6 Far-Western blot检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.7 ELISA检测rTsENO与 PLG的结合 |
| 2.8 IFA检测rTsENO与小肠黏膜组织的特异性结合 |
| 2.9 赖氨酸类似物(?-ACA)竞争性结合试验 |
| 2.10 纤溶酶原激活试验 |
| 2.11 rTsENO及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响 |
| 2.12 抑制TsENO的表达对IIL侵入IECs的阻断作用 |
| 2.13 rTsENO的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 烯醇酶在寄生虫侵入宿主中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 片形吸虫概述 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行情况 |
| 1.1.3 片形吸虫病防控 |
| 1.2 片形吸虫病诊断研究 |
| 1.2.1 用于检测抗体的诊断抗原 |
| 1.2.1.1 应用ESP及其纯化产物作诊断抗原的研究 |
| 1.2.1.2 应用重组蛋白作诊断抗原的研究 |
| 1.2.1.3 应用其它物质作诊断抗原的研究 |
| 1.2.2 用于检测抗原的诊断抗体 |
| 1.3 片形吸虫试剂盒的研究 |
| 1.4 课题研究目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫分泌排泄产物凝胶过滤层析组分和重组蛋白FgTPx-1、FgCatB3与FgCat L1的制备及质谱分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂、耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大片形吸虫分泌排泄产物制备 |
| 2.2.2 大片形吸虫层析组分制备及筛选 |
| 2.2.2.1 FgESP凝胶过滤层析 |
| 2.2.2.2 层析组分收集 |
| 2.2.2.3 间接ELISA筛选较优层析组分 |
| 2.2.3 大片形吸虫分泌排泄产物及层析组分质谱 |
| 2.2.3.1 蛋白提取和浓度测定 |
| 2.2.3.2 蛋白酶解 |
| 2.2.3.3 肽段脱盐 |
| 2.2.3.4 肽段质谱鉴定 |
| 2.2.3.5 质谱数据搜库 |
| 2.2.4 重组蛋白制备 |
| 2.2.4.1 设计引物 |
| 2.2.4.2 FgTPx-1目的基因PCR扩增 |
| 2.2.4.3 pMD18-FgTPx-1克隆质粒构建 |
| 2.2.4.4 pET32α-FgTPx-1、pET28α-FgCat B3及pET28α-FgCat L1表达质粒的构建 |
| 2.2.4.5 阳性克隆小量表达与鉴定 |
| 2.2.4.6 蛋白大量表达及破菌检测 |
| 2.2.4.7 可溶性蛋白纯化 |
| 2.2.4.8 包涵体蛋白纯化 |
| 2.2.5 重组蛋白质谱鉴定 |
| 2.2.6 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大片形吸虫分泌排泄产物浓度测定 |
| 2.3.2 层析组分收集和浓度测定 |
| 2.3.3 层析组分的筛选 |
| 2.3.4 大片形吸虫分泌排泄产物及部分层析组分质谱结果 |
| 2.3.5 目的基因扩增结果 |
| 2.3.6 克隆载体、表达载体构建结果 |
| 2.3.7 蛋白诱导表达检测 |
| 2.3.8 纯化蛋白检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 大片形吸虫分泌排泄产物及层析组分质谱结果分析 |
| 2.4.2 蛋白表达结果分析 |
| 第三章 大片形吸虫分泌排泄产物凝胶过滤层析组分和重组蛋白FgTPx-1、FgCatB3及FgCat L1作诊断抗原建立及优化间接ELISA方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂、耗材 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 F22层析组分作诊断抗原建立及优化间接ELISA方法 |
| 3.2.2 重组蛋白作诊断抗原优化间接ELISA方法 |
| 3.2.3 应用间接ELISA方法检测实验感染水牛和广西部分地区自然感染奶牛血清抗体水平 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 F22层析组分作诊断抗原间接ELISA方法优化结果 |
| 3.3.2 重组蛋白作诊断抗原间接ELISA方法优化结果 |
| 3.3.3 间接ELISA应用结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 F22层析组分优化分析 |
| 3.4.2 重组蛋白优化分析 |
| 3.4.3 各个抗原诊断效果分析 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 项目资助 |
（5）鸭三种吸虫线粒体全基因组的扩增与进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 几种鸭体内重要的吸虫 |
| 1.1.1 宫川棘口吸虫 |
| 1.1.2 舟形嗜气管吸虫 |
| 1.1.3 鸭对体吸虫 |
| 1.2 吸虫线粒体基因组研究进展 |
| 1.2.1 吸虫线粒体基因组全序列测定完成概况 |
| 1.2.2 吸虫线粒体基因组的特点 |
| 1.3 线粒体基因组的应用 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 虫体采集 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 主要仪器设备、试剂、培养基、应用的生物信息学软件 |
| 3 方法 |
| 3.1 三种吸虫的鉴定 |
| 3.2 虫体总DNA的提取 |
| 3.3 三种吸虫线粒体基因组各部分的扩增 |
| 3.3.1 三种吸虫线粒体基因组PCR反应条件体系 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.3 PCR产物的纯化 |
| 3.4 三种吸虫线粒体基因组的拼接和分析 |
| 3.5 三种吸虫线粒体基因组的比较分析 |
| 3.6 系统发生的研究 |
| 4 结果 |
| 4.1 三种吸虫的鉴定结果 |
| 4.1.1 三种吸虫的形态学鉴定 |
| 4.1.2 宫川棘口吸虫的分子生物学鉴定 |
| 4.2 三种吸虫线粒体全基因组序列扩增 |
| 4.2.1 宫川棘口吸虫序列PCR结果 |
| 4.2.2 舟形嗜气管吸虫序列PCR结果 |
| 4.2.3 鸭对体吸虫序列PCR结果 |
| 4.3 三种吸虫线粒体基因组序列分析 |
| 4.3.1 三种吸虫线粒体基因组的特征分析 |
| 4.3.2 三种吸虫的t RNA基因和r RNA基因 |
| 4.3.3 三种吸虫的非编码区 |
| 4.3.4 三种吸虫的基因排列顺序和密码子使用情况 |
| 4.4 三种吸虫与其它复殖吸虫同源性比较分析 |
| 4.5 亲缘关系分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 吸虫线粒体全基因组的特征分析 |
| 5.2 吸虫线粒体12个蛋白质编码基因及基因排布情况 |
| 5.3 吸虫线粒体t RNA基因和r RNA基因 |
| 5.4 进化分析 |
| 6 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）额尔齐斯河鳅科鱼类复口吸虫分类及群落生态学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文略缩词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 复殖吸虫研究概况 |
| 1.2 复口吸虫研究概况 |
| 1.3 鱼类寄生虫群落生态学 |
| 1.4 鳅科鱼类简介 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第2章 额尔齐斯河鳅科鱼类复口吸虫分类学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 额尔齐斯河鳅科鱼类复口吸虫群落生态学研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 额尔齐斯河高原鳅Triplophysa sp.寄生虫种类及复口吸虫群落生态学研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 实验用品及常用试剂的配制 |
| 附录Ⅱ 鱼体标本 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）白头翁皂苷提取物PSD抗日本血吸虫和曼氏血吸虫的药效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 PSD抗日本血吸虫作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、仪器与试剂 |
| 三、溶液配置 |
| 四、实验方法 |
| 结果 |
| 一、PSD对日本血吸虫虫荷数的影响 |
| 二、PSD对日本血吸虫减虫率的影响 |
| 三、PSD对日本血吸虫雌虫数量的影响 |
| 四、PSD对日本血吸虫减雌率的影响 |
| 五、PSD对日本血吸虫虫卵数和减卵率的影响 |
| 讨论 |
| 第二部分 PSD抗曼氏血吸虫作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、仪器与试剂 |
| 三、溶液配置 |
| 四、实验方法 |
| 结果 |
| 一、PSD对曼氏血吸虫虫荷数的影响 |
| 二、PSD对曼氏血吸虫减虫率的影响 |
| 三、PSD对曼氏血吸虫雌虫数量的影响 |
| 四、PSD对曼氏血吸虫减雌率的影响 |
| 五、PSD对曼氏血吸虫虫卵数和减卵率的影响 |
| 讨论 |
| 第三部分 PSD对感染日本血吸虫的ICR小鼠免疫调控的作用及其杀虫机制的初步研究 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、仪器与试剂 |
| 三、溶液配置 |
| 四、实验方法 |
| 结果 |
| 一、PSD对肝脏内肉芽肿的影响 |
| 二、PSD对免疫反应的调节作用 |
| 三、PSD对体外培养日本血吸虫成虫的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述：血吸虫病肝纤维化发病机制及相关药物作用靶点的研究进展 |
| 参考文献 |
| 本课题所获的基金资助 |
| 附录 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（8）大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行情况 |
| 1.1.4 防控 |
| 1.2 大片形吸虫病诊断的研究进展 |
| 1.2.1 经典方法 |
| 1.2.2 免疫诊断方法 |
| 1.2.3 吸虫抗原的检测 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 大片吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 大片形吸虫形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 大片形吸虫ITS |
| 3.1.3 大片形吸虫ITS |
| 3.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 3.2.1 大片形吸虫ES抗原免疫家兔后制备多抗的间接ELISA结果 |
| 3.2.2 免疫共沉淀SDS |
| 3.2.3 质谱数据分析 |
| 3.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 3.3.1 大片形吸虫FgAT和FgLAP基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 FgAT和FgLAP的理化特性、结构功能域和三级结构预测 |
| 3.3.3 重组质粒pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的双酶切结果 |
| 3.3.4 重组蛋白的诱导表达结果 |
| 3.3.5 重组蛋白pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的纯化结果 |
| 3.3.6 目的蛋白的Western Blot分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 4.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 4.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）云南大理片形吸虫扫描电镜观察和分子生物学鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 研究一 云南大理片形吸虫成虫的扫描电镜观察 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 研究二 云南大理片形吸虫核糖体ITS-2基因的分子鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究三 云南大理片形吸虫线粒体cox1 nad5基因部分序列的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验创新性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）Nrf2信号通路抑制后对细粒棘球蚴原头节生长的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 材料 |
| 1.实验原头节采集 |
| 2.主要实验试剂 |
| 3.主要实验仪器 |
| 4.主要溶液配制 |
| 方法 |
| 1.细粒棘球蚴原头节的获取及体外培养 |
| 2.RA体外作用于细粒棘球蚴原头节 |
| 3.共聚焦免疫荧光技术检测Nrf2在细粒棘球蚴原头节的表达 |
| 4.WST试剂盒检测原头节GST活性 |
| 5.ELISA试剂盒检测原头节HO-1 活性 |
| 6.光学显微镜观察原头节形态和活力变化 |
| 7.扫描电子显微镜观察原头节表面超微结构变化 |
| 8.RA作用后原头节内caspase-3 活性检测 |
| 9.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.荧光共聚焦显微镜观察细粒棘球蚴原头节Nrf2的定位及表达变化 |
| 2.RA体外作用后细粒棘球蚴原头节GST和HO-1 的活性变化 |
| 3.RA体外作用对细粒棘球蚴原头节形态的影响 |
| 4.RA体外作用对细粒棘球蚴原头节活力的影响 |
| 5.RA体外作用对细粒棘球蚴原头节表面超微结构的影响 |
| 6.RA体外作用后细粒棘球蚴原头节caspase-3 酶活性的变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
四、肝片吸虫雷蚴、尾蚴的扫描电镜观察（论文参考文献）
- [1]青藏高原牦牛、藏羊肝片吸虫血清学调查及西藏螺内寄生虫鉴定[D]. 周磊. 西藏大学, 2020(12)
- [2]大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究[D]. 盛兆安. 广西大学, 2020
- [3]旋毛虫烯醇酶激活宿主纤溶系统促进幼虫侵入肠黏膜机制的研究[D]. 姜鹏. 郑州大学, 2020(02)
- [4]大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化[D]. 侯林静. 广西大学, 2019(01)
- [5]鸭三种吸虫线粒体全基因组的扩增与进化分析[D]. 李烨. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [6]额尔齐斯河鳅科鱼类复口吸虫分类及群落生态学研究[D]. 马江霞. 新疆农业大学, 2018
- [7]白头翁皂苷提取物PSD抗日本血吸虫和曼氏血吸虫的药效研究[D]. 杨英楠. 苏州大学, 2017(06)
- [8]大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析[D]. 岳东梅. 黑龙江八一农垦大学, 2017(08)
- [9]云南大理片形吸虫扫描电镜观察和分子生物学鉴定[D]. 宋云. 昆明医科大学, 2017(02)
- [10]Nrf2信号通路抑制后对细粒棘球蚴原头节生长的影响[D]. 邢国强. 石河子大学, 2016(02)