一、人免疫缺损病毒1型gp41蛋白N端优势抗原表位相应肽段的化学合成(论文文献综述)
刘新生[1](2017)在《口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒和DC靶向性重组融合蛋白的构建及免疫效果研究》文中进行了进一步梳理口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,能造成严重的经济损失和社会影响。尽管目前传统疫苗在FMD防控中发挥着重要作用,但也存在缺点,如由于病毒灭活不彻底造成活病毒逃逸等。因此,研制安全、有效的新型疫苗是今后防控FMD的必然趋势。病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs),由于具有与天然病毒粒子相似的结构,及较高的免疫原性和安全性,已被广泛地应用到疫苗的开发和应用中。近年来,FMDV VLPs相关研究显示,相比于其它血清型FMDV,O型FMDV衣壳蛋白耐酸性较低,导致其在低pH值的昆虫细胞中组装效率差甚至不组装。因此,本研究以A型FMDV AF/72株的衣壳蛋白基因P12A为骨架,将O型FMDV O/BY/CHA/2010株的结构蛋白基因VP1嵌合入AF/72株的衣壳蛋白基因P12A中,形成O-A嵌合型FMDV衣壳蛋白基因P12A(O-VP1)。通过限制性酶切位点将密码子优化合成后的嵌合衣壳蛋白基因P12A(O-VP1)和AF/72株蛋白酶基因3C,插入到带双启动子的表达载体pFastBac?Dual中,构建质粒pFBDual-P12A3C(O-VP1),转化后筛选获得重组杆粒rBacmid-P12A3C(O-VP1),鉴定之后转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-P12A3C(O-VP1)。间接免疫荧光(IFA)和Western-blot检测结果显示,嵌合P12A(O-VP1)基因能够在Sf9正确表达并具有良好反应原性。电镜观察结果表明,嵌合P12A(O-VP1)能够被3C蛋白裂解并自组装形成与天然病毒粒子大小相似的VLPs。为了进一步评估嵌合VLPs的免疫原性,将表达的嵌合VLPs与ISA-206佐剂混合乳化制备成疫苗后免疫豚鼠。结果表明嵌合VLPs疫苗能够诱导豚鼠产生较高水平的抗O型FMDV体液和细胞免疫应答,加强免疫后用100 GPID50剂量的O型口蹄疫病毒攻击,嵌合VLPs免疫豚鼠的保护比例为4/5,而阴性对照则5/5全数发病。本研究为今后FMDV VLPs疫苗的设计和研制提供了新的思路和依据。近年来,通过将疫苗抗原特异性的靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)来改善疫苗的免疫原性已成为一种新的疫苗设计策略。DC-SIGN(DC-specific ICAM-grabbing non-integrin),又被称为CD209,是DC膜表面的一种C型凝集素受体,利用化学交联或基因工程方法将抗原与DC-SIGN配体结合可以使抗原特异性的靶向DC,进而显着提高疫苗的免疫效果。因此,本研究将DC-SIGN特异性配体HIV膜糖蛋白gp120和HCV包膜糖蛋白E2,分别与口蹄疫病毒AF/72株的主要抗原蛋白VP1进行重组融合,在昆虫细胞中表达2种DC靶向性重组融合蛋白VP1-gp120和VP1-E2,通过豚鼠免疫试验比较了它们及单独表达的VP1蛋白在豚鼠模型中的免疫原性。结果表明VP1-gp120和VP1-E2都能诱导豚鼠产生抗口蹄疫病毒特异性IgG抗体,刺激淋巴细胞特异性增殖及诱导产生较高水平的IFN-γ,且VP1-gp120和VP1-E2诱导抗口蹄疫病毒特异性IgG抗体的能力显着地强于VP1蛋白(p<0.01)。因此,靶向DC的融合设计表达能够在一定程度上提高抗原的免疫原性,为今后亚单位疫苗的研究提供了新的思路。
金洪涛[2](2007)在《HIV多表位重组疫苗的构建及其实验免疫研究》文中提出本文基于表位识别与递呈的免疫学理论,利用分子生物学、分子病毒学、生物信息学等技术和手段,本着平衡免疫应答、并重点加强CTL诱导的疫苗设计理念,进行了新型HIV重组疫苗抗原基因的分子设计,在HIV非结构蛋白基因与结构蛋白基因中选取了17个优势T细胞表位,插入嵌合抗原基因MEGp24中,获得了新型HIV疫苗多CTL表位嵌合抗原基因MEGNp24。自主构建了基于塞姆利基森林病毒(SFV)RNA复制子的自杀性DNA疫苗载体,并利用安全性真核表达载体质粒pVAX1,将多CTL表位嵌合抗原基因MEGNp24构建了两种DNA候选疫苗;进行了动物实验免疫研究;同时自主构建了新型鸡痘病毒转移载体,进行了候选重组鸡痘病毒疫苗的筛选,为多CTL表位疫苗的联合免疫研究提供了基础。实验免疫研究的特异性CTL检测与Th1/ Th2类细胞因子含量检测分析表明,衍生于SFV的自杀性DNA疫苗具有较强的免疫诱导作用,添加不同佐剂的DNA疫苗的比较结果发现添加佐剂能诱发更强的系统性免疫应答。本研究探讨了新型多表位抗原分子设计的理论和方法,对基于HIV非结构蛋白表位的重组核酸疫苗构建与实验免疫及重组鸡痘病毒疫苗的构建进行了深入研究,为有效HIV重组疫苗的研制与临床前实验研究奠定了基础。
唐清杰[3](2007)在《马铃薯X病毒载体介导的乙肝病毒表面抗原基因在烟草中的表达》文中研究指明与基因的稳定整合转化方法相比,植物病毒载体除了在研究植物与植物病原分子生物学、以及植物和病原相互作用中具有无可比拟的优势外,作为表达系统生产外源蛋白也具有良好的应用前景。马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)作为表达载体具有转化途径简单、可快速得到高拷贝的外源基因等优点,因此近年来无论在基础研究还是应用研究上都得到广泛的重视。乙型肝炎是危害全球人类健康最重要的传染病之一,它是由乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)侵染所引起的。由于HBV的保护性抗原表位(epitope,or antigen determinant )主要集中于HBsAg,目前所研制的所有乙肝基因工程疫苗都由HBsAg组成。当前对清除病毒及控制乙型肝炎发生的惟一经济有效的方法就是普遍接种乙肝病毒疫苗。目前疫苗的研制是建立在大肠杆菌和酵母培养系统之上的,虽然可行,但需要发酵技术和严格的纯化程序,其庞大的设备投资和高成本的投入对发展中国家是不合适的。因而利用植物表达外源基因以生产口服乙肝疫苗成为新的选择。本研究首先以报告基因β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)为研究对象,建立了以农杆菌转化和注射渗透法为基础的植物病毒载体介导的外源基因转化的技术体系,并对GUS基因的表达进行了检测分析,获得了侵染叶片组织为蓝色、非侵染叶片无颜色反应的定性分析结果。根据Genbank登记的乙肝病毒表面抗原小蛋白S基因HBsAg(s)序列AF223961设计引物,通过PCR扩增获得了681bpDNA片段,构建马铃薯X病毒表达载体PVXHBs,电转化农杆菌,使用注射渗透法侵染本生烟草的不同生长年龄的叶片、茎和根。在侵染后的第11天、第21天和第45天,通过ELISA检测重组HBsAg蛋白的表达水平,应用SDS-PAGE分析技术检测重组蛋白的分子量大小,以及利用Western blot分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:(1)HBsAg含量在烟草特定发育阶段有显着不同,HBsAg蛋白在幼小叶片中的表达水平远大于已伸展的叶片,叶片中表达量也远大于茎根中含量,约相差2-60倍。HBsAg蛋白表达量会随侵染后时间发生一定的变化,但因植株而异;另外有4株烟草在侵染后的第45天提取蛋白,没有检测到阳性结果,这也验证了PVX作为一种植物病毒表达载体,类似于瞬时表达体系。活性HBsAg蛋白含量最高可达267.81ng/ml,其占可溶性蛋白(total soluble protein, TSP)含量最高可达796.81ng/mg。(2)通过SDS-PAGE分析技术检测重组HBsAg蛋白的分子量大小,约为25 kDa。(3)利用Western blot分析重组HBsAg蛋白的免疫原性,重组蛋白可与鼠抗HBsAg单克隆抗体发生特异性反应。本研究建立了马铃薯X病毒表达外源蛋白的技术体系,在本生烟(Nicotiana benthamiana)中表达乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg),为研究利用植物病毒载体简单方便、低成本的生产药用蛋白提供一条快速高效的新途径。
薛水星,金冬雁,王哲,项文凯,吴长龙,邵一鸣,曾毅,侯云德[4](1992)在《人免疫缺损病毒1型gp41蛋白N端优势抗原表位相应肽段的化学合成》文中研究表明 利用代表优势抗原表位的合成寡肽作为抗原,检测人免疫缺损病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的血清抗体,是近年来在HIV检测方面的重要发展趋势。与病毒裂解物及基因工程表达产物等抗原相比,合成肽抗原在特异性、重复性及HIV-1与HIV-2的鉴别诊断等方面具有一定的优点。众多的研究资料表明,HIV穿膜蛋白gp41的N端显然含有比较保守的优势抗原表位,因此,目前文献中用于检测HIV抗体的合成肽多数都在这一区段内进行设计。
二、人免疫缺损病毒1型gp41蛋白N端优势抗原表位相应肽段的化学合成(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人免疫缺损病毒1型gp41蛋白N端优势抗原表位相应肽段的化学合成(论文提纲范文)
(1)口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒和DC靶向性重组融合蛋白的构建及免疫效果研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 引言 |
1.1 口蹄疫与口蹄疫病毒概述 |
1.2 病毒样颗粒研究进展 |
1.2.1 研究历史及现状 |
1.2.2 结构多样性 |
1.2.3 主要表达系统 |
1.2.4 在疫苗、免疫学检测及基础研究中的应用 |
1.2.5 面临的问题与挑战 |
1.3 DC-SIGN介导的树突细胞靶向系统 |
1.3.1 DC及DC-SIGN |
1.3.2 DC-SIGN配体 |
1.3.3 在疫苗研制中应用 |
1.4 口蹄疫基因工程疫苗研究进展 |
1.4.1 合成肽疫苗 |
1.4.2 亚单位疫苗 |
1.4.3 多表位疫苗 |
1.4.4 病毒样颗粒疫苗 |
1.4.5 病毒活载体疫苗 |
1.4.6 反向遗传疫苗 |
1.4.7 核酸疫苗 |
1.5 本研究的目的和意义 |
第二章 FMDV嵌合病毒样颗粒的表达及组装研究 |
2.1 材料 |
2.1.1 FMDV参考毒株、质粒及宿主菌株 |
2.1.2 限制性内切酶及其它试剂 |
2.1.3 主要耗材和仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 嵌合基因的设计、优化及合成 |
2.2.2 重组杆状病毒转移载体的构建 |
2.2.3 重组杆状病毒质粒的构建 |
2.2.4 Sf9细胞的复苏与培养 |
2.2.5 重组杆状病毒的获得 |
2.2.6 重组蛋白的间接免疫荧光检测 |
2.2.7 重组蛋白的WesternBlot检测 |
2.2.8 蔗糖密度梯度离心纯化 |
2.2.9 电镜观察 |
2.3 结果 |
2.3.1 FMDV嵌合衣壳蛋白基因P12A(O-VP1)和蛋白酶基因3C的优化及序列分析 |
2.3.2 重组转移质粒pFBDual-P12A3C(O-VP1)鉴定 |
2.3.3 重组杆状病毒质粒rBacmid-P12A3C(O-VP1)鉴定 |
2.3.4 重组杆状病毒rBac-P12A3C(O-VP1)的获得 |
2.3.5 重组杆状病毒rBac-P12A3C(O-VP1)的鉴定 |
2.3.6 表达产物间接免疫荧光分析 |
2.3.7 表达产物Westernblot检测 |
2.3.8 VLPs电镜观察 |
2.4 讨论 |
第三章 FMDV嵌合病毒样颗粒免疫保护效果研究 |
3.1 材料 |
3.1.1 试验动物 |
3.1.2 细胞和毒株 |
3.1.3 主要试剂 |
3.2 方法 |
3.2.1 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
3.2.2 病毒豚鼠半数感染量(GPID50)测定 |
3.2.3 豚鼠免疫方案 |
3.2.4 抗FMDV特异性血清抗体检测 |
3.2.5 微量中和抗体检测 |
3.2.6 淋巴细胞增殖试验 |
3.2.7 细胞因子检测 |
3.2.8 豚鼠攻毒保护试验 |
3.2.9 统计分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 细胞毒TCID50和豚鼠毒GPID50测定 |
3.3.2 豚鼠抗FMDV特异性血清IgG抗体水平 |
3.3.3 豚鼠抗FMDV特异性中和抗体水平 |
3.3.4 细胞因子水平 |
3.3.5 淋巴细胞特异性增殖情况 |
3.3.6 豚鼠攻毒保护结果 |
3.4 讨论 |
第四章 FMDVDC靶向性重组融合蛋白的构建及免疫效果研究 |
4.1 材料 |
4.1.1 FMDV参考毒株、质粒及宿主菌株 |
4.1.2 限制性内切酶及其它试剂 |
4.1.3 主要耗材和仪器 |
4.1.4 试验动物 |
4.2 方法 |
4.2.1 病毒RNA的提取 |
4.2.2 VP基因扩增及测序 |
4.2.3 重组融合蛋白基因VP1、VP1-gp120和VP1-E2的设计及合成 |
4.2.4 重组杆状病毒转移载体的构建 |
4.2.5 重组杆状病毒质粒的构建 |
4.2.6 Sf9细胞的复苏与培养 |
4.2.7 重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP1-gp120和rBac-VP1-E2的获得 |
4.2.8 重组蛋白VP1、VP1-gp120和VP1-E2的表达纯化 |
4.2.9 重组蛋白VP1、VP1-gp120和VP1-E2的WesternBlot检测 |
4.2.10 豚鼠免疫方案 |
4.2.11 抗FMDV特异性血清抗体检测 |
4.2.12 淋巴细胞增殖试验 |
4.2.13 细胞因子检测 |
4.2.14 统计分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 FMDV重组融合蛋白基因优化合成 |
4.3.2 重组转移载体和重组杆粒的鉴定 |
4.3.3 重组蛋白的表达与鉴定 |
4.3.4 豚鼠抗FMDV特异性血清IgG抗体水平 |
4.3.5 细胞免疫应答水平检测 |
4.4 讨论 |
第五章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(2)HIV多表位重组疫苗的构建及其实验免疫研究(论文提纲范文)
提要 |
引言 |
第一篇 文献综述 |
第一章 HIV 疫苗的进展与展望 |
1 AIDS 疫苗研究面临的问题 |
2 HIV 外膜糖蛋白的免疫原性与疫苗研究 |
3 细胞免疫的诱导与AIDS 疫苗研究 |
4 HIV 毒株多样性与AIDS 疫苗研发 |
5 AIDS 疫苗的临床实验研究 |
6 AIDS 疫苗的前景 |
第二章 质粒与保护性免疫:HIV DNA 疫苗研究 |
1 HIV DNA 疫苗 |
2 疫苗分子设计 |
3 疫苗制剂 |
4 基因佐剂 |
5 DNA 接种方式 |
6 DNA 疫苗与细胞免疫 |
7 结论 |
第二篇 研究内容 |
第一章 基于甲病毒复制子的DNA 表达载体构建 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二章 HIV 多CTL 表位抗原基因的设计与合成 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三章 HIV 多CTL 表位抗原分子重组DNA 疫苗构建 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第四章 重组鸡痘病毒转移载体构建与HIV多CTL表位基因重组鸡痘病毒的筛选鉴定 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第五章 HIV 多表位重组DNA 疫苗小鼠实验免疫研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
参考文献 |
攻博期间发表的学术论文和其它成果 |
中文摘要 |
Abstract |
导师简介 |
作者简介 |
(3)马铃薯X病毒载体介导的乙肝病毒表面抗原基因在烟草中的表达(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
一 文献综述 |
1 植物病毒表达载体 |
1.1 植物病毒表达载体的构建策略 |
1.1.1 基因置换策略 |
1.1.2 基因插入策略 |
1.1.3 抗原展示系统 |
1.1.4 基因互补型载体 |
1.1.5 多肽表达系统 |
1.2 植物病毒载体的接种方式 |
1.3 植物病毒表达载体的优缺点 |
1.3.1 植物病毒表达载体系统的优点 |
1.3.2 植物病毒表达载体系统的缺陷 |
1.4 植物病毒载体的应用前景 |
1.5 马铃薯X病毒表达载体 |
1.5.1 病毒基因组的结构与功能 |
1.5.2 病毒的复制、表达及其调控 |
1.5.3 系统侵染 |
1.5.4 PVX作为表达载体的应用 |
2 乙肝病毒表面抗原 |
2.1 HBV的结构 |
2.2 preS蛋白与HBsAg的免疫原性 |
2.3 HBV疫苗研究进展 |
2.3.1 利用微生物工程生产HBsAg蛋白 |
2.3.1.1 大肠杆菌系统表达的乙肝疫苗 |
2.3.1.2 病毒系统表达的乙肝疫苗 |
2.3.1.3 酵母系统表达的乙肝疫苗 |
2.3.2 利用哺乳动物基因工程生产HBsAg蛋白 |
2.3.3 利用植物基因工程生产HBsAg蛋白 |
二 材料与方法 |
1 材料和试剂 |
1.1 植物材料和菌株 |
1.2 酶和生化试剂 |
1.3 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 引物设计 |
2.1.1 Gus引物设计 |
2.1.2 HBsAg引物设计 |
2.2 基因的克隆 |
2.2.1 PCR 扩增Gus 基因 |
2.2.2 PCR 扩增HBsAg 基因 |
2.2.3 PCR 产物回收 |
2.3 克隆载体的构建及鉴定 |
2.3.1 PCR 回收产物与克隆载体pGEMT-Easy Vector 的连接 |
2.3.2 E. coli DH5α感受态细胞的制备 |
2.3.3 连接产物转化感受态细胞 |
2.3.4 重组质粒的提取 |
2.3.5 重组质粒的pcr 鉴定 |
2.3.6 重组质粒的酶切鉴定 |
2.3.7 重组质粒的序列分析 |
2.4 PVX表达载体的构建及鉴定 |
2.4.1 Gus/HBsAg 基因的获取 |
2.4.1.1 Gus/HBsAg 质粒的提取 |
2.4.1.2 Gus/HBsAg 质粒的纯化 |
2.4.1.3 Gus/HBsAg 质粒的酶切 |
2.4.1.4 Gus/HBsAg 基因的回收 |
2.4.2 PVX 表达载体的构建 |
2.4.3 Gus/HBsAg 基因与PVX表达载体的连接 |
2.4.4 连接产物的转化及鉴定 |
2.5 重组农杆菌工程菌株的获得及鉴定 |
2.5.1 重组质粒的获取 |
2.5.2 农杆菌感受态细胞的制备 |
2.5.3 农杆菌的转化(电激转化法) |
2.5.4 筛选与鉴定 |
2.6 本生烟草的侵染 |
2.6.1 菌液准备 |
2.6.2 注射渗透法侵染植株 |
2.7 报告基因GUS的组织化学检测 |
2.8 蛋白样品的ELISA分析 |
2.8.1 提取植物蛋白 |
2.8.2 时间分辨荧光免疫法定量试剂盒检测HBsAg |
2.8.2.1 试剂准备 |
2.8.2.2 试验操作 |
2.8.2.3 仪器检测 |
2.8.3 Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量 |
2.9 HBsAg蛋白的SDS-PAGE分析 |
2.9.1 按说明书安装电泳玻璃板 |
2.9.2 制胶 |
2.9.3 上样 |
2.9.4 电泳 |
2.9.5 银染法检定蛋白质纯度 |
2.10 HBsAg蛋白的Western Blot分析 |
2.10.1 SDS-PAGE电泳 |
2.10.2 电转移 |
2.10.3 封闭 |
2.10.4 免疫反应 |
2.10.5 HRP-DAB底物显色试剂盒检测显色反应 |
三 结果与分析 |
1 Gus基因的扩增 |
2 HBsAg基因的扩增 |
3 PVX表达载体的构建 |
4 PVX表达载体的鉴定 |
5 重组农杆菌的鉴定 |
6 报告基因(GUS)的检测 |
7 外源基因表达的ELISA检测 |
8 重组蛋白的SDS-PAGE(银染法染色)分析 |
9 外源基因表达的Western blot分析 |
四 讨论 |
1 马铃薯X病毒表达载体表达体系的研究 |
2 马铃薯X病毒表达载体在疫苗研制中的应用 |
3 马铃薯X病毒表达载体在基因功能研究中的应用 |
五 结论 |
参考文献 |
缩略词 |
附图 |
附录 |
致谢 |
四、人免疫缺损病毒1型gp41蛋白N端优势抗原表位相应肽段的化学合成(论文参考文献)
- [1]口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒和DC靶向性重组融合蛋白的构建及免疫效果研究[D]. 刘新生. 中国农业科学院, 2017(01)
- [2]HIV多表位重组疫苗的构建及其实验免疫研究[D]. 金洪涛. 吉林大学, 2007(03)
- [3]马铃薯X病毒载体介导的乙肝病毒表面抗原基因在烟草中的表达[D]. 唐清杰. 华南热带农业大学, 2007(03)
- [4]人免疫缺损病毒1型gp41蛋白N端优势抗原表位相应肽段的化学合成[J]. 薛水星,金冬雁,王哲,项文凯,吴长龙,邵一鸣,曾毅,侯云德. 病毒学报, 1992(04)