一、在老鼠骨髓中发现干细胞（论文文献综述）
黄林峰[1]（2021）在《基于RNA-seq技术对肾虚血瘀型股骨头坏死差异基因筛选及生物信息学分析》文中提出目的1.采用生物信息学方法分析GEO芯片数据,探索激素性股骨头坏死的差异基因表达谱及相关分子作用机制。2.通过转录组学高通量测序方法,筛选肾虚血瘀型股骨头坏死的诊疗相关的生物标志物并探索差异表达基因在股骨头坏死发展过程中的分子调控机制。3.研究差异表达基因对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法1.基于GEO数据库对激素性股骨头坏死的差异基因表达谱及相关分子作用机制研究。（1）利用GEO2R对基因表达综合数据库（GEO）中筛选出的激素性股骨头坏死芯片数据进行基因差异表达分析。STRING-db数据库用来完成蛋白质-蛋白质互作关系网络（PPI）构建并通过R语言软件筛选关键蛋白;通过DAVID数据库进行基因本体（GO）功能富集分析;最后,DAVID数据库用于实现基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。2.基于RNA-seq技术对肾虚血瘀型股骨头坏死差异表达基因及其调控机制的研究（1）以外周血单核细胞为研究对象,分别选取4例肾虚血瘀型股骨头坏死患者（SIONFH组）,4例SLE无股骨头坏死患者（SLE组）,以及4例正常人（对照组）,利用高通量转录组测序技术（RNA-seq）筛选各组差异表达基因;（2）采用STRING数据库构建差异表达基因的蛋白互作网络,利用生物信息学方法预测、分析差异表达基因及其可能参与肾虚血瘀型股骨头坏死的生物学过程及相关调控机制;3.股骨头坏死差异表达基因调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究（1）分离、提取并培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,选取第3代生长良好的细胞进行实验。（2）构建Kdm5d基因沉默表达质粒,通过腺相关病毒转染rBMSCs细胞并表达相应的产物,观察沉默Kdm5d表达后对SD大鼠rBMSCs成骨分化的影响,观察内容包括碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色、荧光定量分析相关基因表达实验等。结果1.基于GEO数据库对激素性股骨头坏死的差异基因表达谱及相关分子作用机制（1）GEO芯片数据分析显示,相较于对照组,SIONFH患者外周血血清中存在差异表达基因1836个,其中1088个基因表达上调,748个表达下调。核心基因包括ITGAM、TLR4、MAPK3、PTPRC、STAT3、TLR2、CXCL8、TLR8等,差异表达基因涉及破骨细胞分化、核转录因子NF-kappa B信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、HIF-1信号通路等。2.基于RNA-seq技术对肾虚血瘀型股骨头坏死差异表达基因及其调控机制的研究（1）采用RNA-seq技术及生物信息学方法分析,结果显示,SIONFH组与对照组比较的差异表达基因共169个,上调基因38,下调基因131个;SIONFH组与SLE组比较差异表达基因共74个,上调基因31,下调基因个43;（2）GO富集分析结果表明,SIONFH组与对照组比较的差异表达基因参与免疫反应、先天免疫反应、炎症反应等生物过程;SIONFH组与SLE组比较的差异表达基因调控氧气输送、免疫反应、炎症反应、抗原处理和递呈等生物过程。（3）KEGG富集分析显示,SIONFH组与正常组之间的差异基因涉及多种信号途径,包括TNF信号通路、NF-kappa B信号途径、Ⅰ型糖尿病信号通路、吞噬体信号通路等;SIONFH组与SLE组比较的差异基因参与调控趋化因子信号通、Ⅰ型糖尿病信号通路、类风湿性关节炎信号通路等。3.股骨头坏死差异表达基因调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究（1）与空白对照组（Control组）比较,Kdm5d#1组、Kdm5d#2组茜素红染色面积显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）;Kdm5d#1组茜素红染色面积明显低于Kdm5d#2组,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）ALP染色结果显示,Control组阳性染色细胞最多,着色最深,其次是Kdm5d#2组;Kdm5d#1组阳性染色细胞少于空白对照组。（3）与Control组比较,Kdm5d#1组大鼠骨髓间充质干细胞Kdm5d、Runx2、Opn、Ocn、Alp表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与空白对照组比较,Kdm5d#2组大鼠骨髓间充质干细胞Kdm5d、Opn、0cn表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与空白对照组相比,Kdm5d#2组大鼠骨髓间充质干细胞Alp、Runx2表达无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.多个关键差异表达基因调控多条信号途径介导SIONFH的发生,一些关键基因有可能是SIONFH诊断的新生物标志物或治疗的潜在靶点,研究进一步揭示了 SIONFH复杂的分子机制。2.众多关键基因及多种信号途径可能在肾虚血瘀型股骨头坏死的进程中发挥重要作用;研究结果可能为肾虚血瘀型股骨头坏死的早期预防、诊断治疗或靶向药物的研发提供重要的理论依据。3.沉默基因Kdm5d表达能够使大鼠骨髓间充质干细胞矿化结节及碱性磷酸酶活性显着降低,同时下调BMSC成骨相关基因Runx2、Opn、Ocn、Alp的表达,Kdm5d可能通过调控Runx2、Opn、Ocn、Alp的表达影响骨髓间充质干细胞成骨分化。
杨昊[2]（2020）在《Navitoclax（ABT263）改善骨关节炎中炎症微环境和减轻软骨破坏的研究》文中研究指明研究背景骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是最常见的一种与年龄相关的慢性关节疾病,并且随着人群寿命逐渐延长和老龄化逐渐加重,在全球范围内变得越来越流行。以往研究表明骨性关节炎是一种多因素的退行性关节疾病,目前该病发病率极高,并且会导致身体残疾、生活质量下降和生活成本增加等一系列问题。现有研究认为OA是以慢性进行性软骨退变为主要病理表现,伴有临近骨组织的非正常重塑及骨赘形成,并同时累及半月板、滑膜、脂肪等多种组织的全关节疾病。在这其中,关节软骨作为关节中的重要组成部分,发挥支撑及分散电荷负载等重要功能,其结构完整性在OA中遭到严重破坏。软骨细胞作为软骨组织中的唯一细胞成分,具有分泌软骨基质和维持软骨表型的重要功能,多种因素包括与年龄相关的衰老以及外界各种应激事件（如创伤和辐射等）可通过激活炎症及活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）等途径引起软骨细胞衰老,并伴随一系列衰老相关改变,如肥大化,增殖分化能力减弱甚至丧失,这些改变均会阻碍机体自身的软骨修复,逐步导致软骨降解,并最终演变为OA。由此可见,软骨细胞的衰老在OA的发生发展中扮演着重要的角色。研究表明,细胞衰老的主要表现是生长周期停滞、代谢改变以及增殖能力丧失,与细胞衰老有关的标志物包括衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）、衰老相关异质染色体、p53,p21和p16的表达上调。细胞衰老可由机体的衰老引起,同时也可以促进组织的衰老。在创伤导致的OA中,p16INK4a阳性的衰老软骨细胞会在软骨组织中逐渐累积,同时会过度分泌各种细胞因子（如白细胞介素1和6）和生长因子（如表皮生长因子、转化生长因子）和基质降解酶（如基质金属蛋白酶（MMPs）等）,上述特征也被称为衰老相关分泌表型（SASP）。随着SASP持续分泌,会逐渐形成关节内衰老微环境（intra-articular senescent microenvironment,IASM）,使周围正常软骨细胞加速衰老,显着抑制软骨祖细胞及间充质干细胞的增殖分化能力,加剧OA的进展。另有研究发现,衰老细胞相较正常细胞具有更强的抵御外界不良刺激的能力,其自身具有的抗凋亡生存机制（如抗凋亡蛋白BCL-2,BCL-xl表达上调）使其能够抵抗凋亡及SASP的影响,在炎性及衰老微环境中继续存活。研究发现,通过转基因手段靶向清除早衰小鼠膝关节内荧光标记的p16INK4a阳性衰老细胞可以减轻关节腔炎症同时延缓创伤性OA的进展,但此转基因方法操作较为复杂且涉及伦理问题。最新研究发现的一类新型小分子药物“senolytics”可以选择性清除衰老细胞,获得与转基因方法相似的效果。Navitoclax（也称为ABT263）作为一种近些年发现的新型senolytic药物,能特异性抑制抗凋亡蛋白BCL家族中的BCL-2、BCL-xl及BCL-w蛋白,激活Caspase信号通路从而诱导细胞凋亡。研究发现ABT263能选择性清除经全身电离辐照（Total-body irradiation,TBI）诱导的早衰小鼠造血系统中的衰老造血干细胞,从而增强早衰小鼠身体中的干细胞功能,恢复组织活力。已有文献报道,ABT263可诱导癌细胞凋亡而被用于治疗淋巴细胞白血病及小细胞肺癌,但其在骨关节炎中的应用研究未见报道。针对这一问题,本课题主要针对ABT263能否通过诱导细胞凋亡的方式选择性清除OA关节软骨组织中的衰老细胞以从而改善OA炎症环境这一问题进行探究。我们首先验证了ABT263能有效清除经电离辐射（IR）诱导的衰老大鼠软骨细胞,然后我们研究了ABT263对二维及三维培养下的OA软骨细胞中SASP表达的影响,证明其能通过诱导衰老细胞凋亡改善炎症微环境。此外,我们还验证了关节内注射ABT263可减轻Sprague-Dawley（SD）大鼠膝关节创伤性骨性关节中的软骨及软骨下骨损伤。目的:本研究以大鼠和人OA软骨及软骨细胞为模型,探讨Navitoclax（ABT263）通过清除骨关节炎中衰老软骨细胞从而发挥减轻炎症及减少软骨破坏的作用及其可能的细胞和分子机制。方法:第一部分:ABT263对正常软骨细胞活性的影响及对衰老软骨细胞清除效率的探究1、原代软骨细胞的分离提取及扩增首先从全膝关节置换术中获取人OA关节软骨块组织,并根据以往文献方法提取人原代OA软骨细胞。参考以往文献方法,从SD大鼠关节软骨组织中提取分离原代软骨细胞。两种原代软骨细胞均在体外培养扩增,并采用特殊染色对软骨细胞进行形态学鉴定,将原代和P1代细胞用于后续体外实验。2、电离辐照（ionization irradiation,IR）诱导衰老大鼠软骨细胞为了建立体外衰老软骨细胞模型,采用x射线辐照法诱导大鼠软骨细胞衰老。原代软骨细胞在一定条件下辐照,照射后细胞继续培养3天,接着按1:3传代,传代后继续培养7天,随后采用SA-β-gal染色、结晶紫染色和q PCR验证其衰老相关表型。3、ABT263对正常大鼠软骨细胞活性的影响为探究ABT263对正常软骨细胞是否具细胞毒性作用,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测两组不同浓度梯度的ABT263处理正常大鼠软骨细胞24小时、48小时以及72小时的细胞活性,设置两组不同的浓度梯度,以明确ABT263产生细胞毒性作用的浓度范围。4、ABT263对辐照诱导的衰老软骨细胞的清除效率探究为了研究ABT263对辐照诱导的衰老软骨细胞的清除效率,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）对ABT263处理24小时、48小时以及72小时后的细胞增殖-毒性作用进行检测。采用相差显微镜观察并比较衰老软骨细胞在不同浓度ABT263影响下的细胞生长状况,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并对凋亡细胞比例进行统计分析。第二部分:ABT263改善人OA软骨细胞炎症微环境并维持细胞表型的研究1、研究人OA软骨组织及原代OA软骨细胞中的衰老细胞从全膝关节置换术中获取OA软骨组织块,选取退变严重部位的软骨与非负重部位外观近似正常的软骨组织进行切片,并提取原代OA软骨细胞,随后采用SA-β-gal染色、HMGB1免疫组化染色对OA软骨块及原代软骨细胞中的衰老细胞进行评价。2、不同浓度ABT263对micromass culture的OA软骨细胞的影响为探究ABT263对OA软骨细胞的适宜浓度,采用micromass方法培养OA软骨细胞21天,用不同浓度的ABT263分别处理3天和10天。后者在处理3天后更换普通培养基继续培养一周,随后用SA-β-gal染色检测其中衰老细胞情况。3、ABT263对monolayer culture及pellet culture中炎症微环境的影响OA软骨细胞用ABT263处理3天后立即进行检测,另一组继续培养1周后于第10天进行评估。随后应用SA-β-gal染色、流式细胞仪、免疫荧光检测其中衰老细胞及细胞凋亡情况。应用q PCR及western blot检测其中炎症因子表达。OA软骨细胞及骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）pellet culture 21天后进行免疫组化染色评估,并用q PCR及western blot定量检测细胞微球中衰老基因及炎症因子的m RNA及蛋白表达水平。4、ABT263对monolayer culture及pellet culture中软骨细胞表型的影响OA软骨细胞在ABT263处理后第3天和10天,以及应用pellet culture体系培养OA软骨细胞及BMSC 21天后,分别应用q PCR及western blot方法对COLII、ACAN及SOX9的m RNA水平及蛋白表达进行检测,以探究ABT263对软骨细胞表型及干细胞成软骨分化的影响。第三部分:关节腔注射ABT263削弱大鼠创伤性骨关节炎软骨及软骨下骨破坏并减轻炎症1、DMM手术建立大鼠创伤性骨关节炎模型选取4-6周龄的雄性SD大鼠,通过切断其内侧半月板胫骨韧带,建立内侧半月板失稳（Destabilization of the medial meniscus,DMM）的OA模型。假手术（sham）组采用内侧切口暴露膝关节腔,然后用缝线封闭切口。于术后4周进行关节腔注射。2、关节腔内注射ABT263及对软骨的组织学评价为探究ABT263在大鼠关节腔内的适宜浓度,DMM术后4周采用不同浓度（0.25、1和5 u M）的ABT263进行大鼠膝关节腔注射。每周注射两次,连续给药两周,随后应用H&E和Safranin O/fast green染色评价实验组和对照组膝关节情况并进行组织学评分。3、离体大鼠膝关节micro-CT扫描、免疫组化染色及RT-q PCR检测在4次关节腔注射结束后,将实验大鼠处死并进行取材固定。取大鼠全膝关节进行micro-CT扫描及三维重建评估软骨下骨损伤情况。应用免疫组化染色和q PCR定性定量分析关节软骨中衰老相关基因、炎症因子和软骨基质蛋白的表达情况,探究ABT263在大鼠关节腔内的生物学效应。结果:第一部分:ABT263对正常软骨细胞活性的影响及对衰老软骨细胞清除效率的探究1、一定浓度范围内的ABT263对正常大鼠软骨细胞无细胞毒性作用CCK-8结果显示,ABT263浓度在2.5 u M内对正常大鼠软骨细胞无细胞毒性作用。对OA软骨细胞而言,ABT263在浓度小于3 u M时没有展现出明显的细胞毒性作用。2、ABT263对辐照诱导的衰老软骨细胞具有浓度依赖的清除作用经x射线辐照后的大鼠软骨细胞展现出细胞衰老的相关特征,胞浆中出现大量SA-β-gal阳性染色,殖能力明显减弱,衰老相关基因的表达明显增高。CCK-8结果显示,ABT263对衰老大鼠软骨细胞的细胞活性具有明显抑制作用,且随浓度增高,抑制效应越强。相差显微镜观察与流式细胞检测提示,ABT263通过促进衰老软骨细胞凋亡发挥对Sn Cs的清除作用,且清除效应随浓度增加而增强。第二部分:ABT263改善人OA软骨细胞炎性微环境并维持细胞表型的研究1、人OA软骨组织中存在一定比例的SA-β-gal阳性衰老细胞SA-β-gal染色提示晚期OA软骨组织和原代OA软骨细胞中存在SA-β-gal阳性的衰老细胞,组化染色结果提示HMGB1在晚期OA软骨组织中表达减弱,部分于软骨细胞核外表达。2、2.5 u M和5 u M ABT263能有效清除micromass culture中的衰老软骨细胞OA软骨细胞micromass culture 21天后用不同浓度的ABT263分别处理3天和10天,SA-β-gal染色结果提示仅2.5和5.0 u M浓度的ABT263能够有效清除SA-β-gal阳性Sn Cs,较低浓度的ABT263对SA-β-gal阳性Sn Cs无明显清除作用。3、ABT263促进衰老软骨细胞凋亡并改善二维及三维培养中的OA炎性微环境SA-β-gal染色、HMGB1荧光结果提示ABT263显着降低OA软骨细胞中的Sn Cs比例,并在一周后持续抑制Sn Cs数量。流式细胞检测提示ABT263处理3天后细胞凋亡比例增加,western blot显示c-Caspase3蛋白表达上升,提示ABT263通过c Casp3信号通路介导衰老软骨细胞凋亡。二维培养下,SASP的表达可在没有ABT263的一周后持续受到抑制。免疫组化染色结果显示ATB263可显着减少OA软骨细胞三维培养中的SASP蛋白表达,q PCR及western blot定量检测结果与上述免疫组化染色结果一致,提示ABT263通过促进衰老软骨细胞凋亡能在一定程度上改善OA炎性微环境。4、ABT263有利于维持monolayer culture及pellet culture中的软骨细胞表型Monolayer culture下,q PCR及western blot结果提示ACAN在第10天的m RNA及蛋白表达均有显着增加,提示软骨基质中蛋白多糖合成显着增强。对于pellet culture,番红O染色结果提示OA软骨细胞及HBMSC中蛋白多糖合成增加,western blot结果显示COLII及ACAN蛋白表达显着增加,提示三维培养下的软骨基质合成增强。第三部分:关节腔注射ABT263削弱DMM大鼠创伤性骨关节炎软骨及软骨下骨破坏并减轻炎症1、关节腔注射ABT263减轻DMM大鼠创伤性OA带来的软骨及软骨下骨损伤H&E和Safranin O/fast green染色结果提示,溶剂注射组中胫骨侧软骨表面磨损较为严重,而ABT263注射组的软骨表面破坏相对较轻,并显示出相对完整的软骨结构,提示关节腔注射ABT263能减轻创伤性骨关节炎带来的软骨破坏。与溶剂注射组相比,ABT263注射组较低的OARSI评分也提示其软骨损伤程度较轻,表明ABT263对创伤性骨关节炎中的软骨具有一定的保护作用。Micro-CT扫描和三维重建结果显示,溶剂注射组软骨下骨结构塌陷,表面粗糙不平,而ABT263注射组的软骨下骨表面相较而言更加光滑平整。2、关节腔注射ABT263减少关节软骨中p16阳性Sn Cs数量并减轻炎症免疫组化结果提示p16阳性Sn Cs数量有所下降,HMGB1在软骨细胞中表达升高,同时MMP13表达减弱。q PCR定量分析结果提示p16、p21、IL1β、IL6、MMP13及ADAMTS5表达显着下调,同时COLII和ACAN表达上升,提示大鼠膝关节软骨中炎症反应减轻,软骨基质分解代谢作用减弱。结论和意义:基于上述研究结果可得出以下结论:1、人OA软骨组织及原代OA软骨细胞中存在一定比例的Sn Cs;2、适宜浓度的ABT263可有效清除衰老软骨细胞而不影响正常软骨细胞活性;3、ABT263通过Caspase3信号通路诱导衰老软骨细胞凋亡从而改善OA软骨细胞炎性微环境,并有助于维持软骨表型;4、关节腔注射ABT263对创伤性OA中的软骨及软骨下骨具有一定的保护作用,同时减轻关节腔炎症水平,抑制软骨分解代谢,促进软骨基质的合成。意义:本研究为临床治疗OA提供了新的思路,证明了通过小分子药物靶向清除衰老细胞可能作为一种从发病源头上延缓OA进展的手段。另外,本研究开辟了小分子药物ABT263的新的应用领域,为该类药物治疗OA提供了研究理论基础,揭示了OA作为小分子药物ABT263的新适应症的一种潜在可能性。
吴加东[3]（2020）在《雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松中“骨生成/血管形成”的基础研究》文中研究表明第一部分铁蓄积对小鼠、成骨细胞中mTOR水平及小鼠骨量的影响目的:研究铁蓄积—mTOR表达之间的关系,探索mTOR在铁蓄积骨质疏松中可能存在的作用。方法:1、动物实验:制作外源性铁蓄积小鼠模型,将20只8周龄野生（Wt）雄性小鼠（C57/BL6）随机分为两组,分别腹腔注射枸橼酸铁胺（Wt+FAC组,n=10）和生理盐水（Wt+Saline组,n=10）,FAC和Saline使用均为40mg/kg,每周3次,持续两月;制作内源性铁蓄积小鼠模型,将10只8周龄铁调素敲除（△Hep）的转基因雌性小鼠和10只8周龄野生（Wt）雌性小鼠予以卵巢切除（OVX）,分别为△Hep+OVX组、Wt+OVX组,饲养两月。两月后检测上述小鼠的体重并取血清和骨组织标本。血清铁蛋白（Fer）、mTOR浓度采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。肝脏和股骨行普鲁士蓝（Perls）铁染色,电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）检测肝铁含量,股骨微型计算机断层扫描（Micro-CT）检测骨量及骨密度（BMD）后用电感耦合等离子体发射质谱仪（ICP-MS）测量骨铁含量。胫骨mTOR基因表达、蛋白表达分别采用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹实验（Western Blot）检测。2、细胞实验:实验组将h FOB1.19细胞、RAW264.7细胞用含200μM、50μM浓度FAC的培养基进行干预72h（iron组）,对照组用磷酸盐缓冲液（PBS）干预（cont组）。两组细胞培养基中铁离子浓度用ELISA法检测,mTOR基因表达、蛋白表达分别采用RT-PCR、Western Blot检测。结果:1、在体研究:各组小鼠体重无统计学差异（p>0.05）。在外源性FAC干预后,Wt+FAC组较Wt+Saline组,血清Fer浓度、肝铁含量、骨铁含量、肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显着增加（p<0.05）,同时血清mTOR浓度、mTOR在肝脏和胫骨中的基因表达和蛋白表达水平亦显着上升（p<0.05）。在内源性铁调素敲除后,△Hep+OVX组较Wt+OVX组,血清铁蛋白浓度、肝铁含量、骨铁含量、肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显着增加（p<0.05）,同时血清mTOR浓度、mTOR在肝脏和胫骨中的基因表达和蛋白表达水平亦显着上升（p<0.05）,而且骨量、BMD明显减少（p<0.05）。2、离体研究:在外源性FAC干预后,h FOB1.19细胞培养基中铁离子浓度明显增加（p<0.05）,同时mTOR基因表达、蛋白表达均显着上升（p<0.05）。RAW264.7细胞培养基中铁离子浓度较对照组cont组明显增加（p<0.05）,但mTOR基因表达、蛋白表达两组均无显着差异（p>0.05）。结论:mTOR水平伴随铁浓度增加而上升,铁蓄积可能通过增加的mTOR促进OVX小鼠骨量丢失形成“铁蓄积骨质疏松”。第二部分雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的骨生成作用目的:研究mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapa）对铁蓄积高转换骨质疏松中骨生成的影响。方法:1、动物实验:将16只8周龄野生（Wt）雌性小鼠和48只8周龄铁调素敲除（△Hep）的转基因雌性小鼠予以卵巢切除（OVX）,分为四组（Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组和△Hep+OVX+Rapa组）。Rapa为腹腔注射,3mg/kg/day,持续两月。CMC为Rapa溶剂,注射剂量及持续时间同Rapa。末次注射结束后四组小鼠处死取血清和骨组织标本。用股骨微型计算机断层扫描（Micro-CT）检测股骨骨量及骨密度（BMD）等参数,扫描电镜（SEM）、H-E染色检测骨量及骨小梁结构,碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨细胞骨形成能力,生物力学实验检测股骨弯曲弹性模量、弯曲能量、最大弯曲应力、弯曲刚性系数,血清成骨指标（ALP、PINP、Ocn）采用ELISA检测,成骨基因（Runx2、SP7、ALP）表达采用RT-PCR检测。2、细胞实验:将h FOB1.19细胞分为四组（cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组）,cont组作为对照组,iron组用含200μM浓度FAC的培养基进行干预72h,iron+si-MT组和iron+si-NC组为成骨细胞分别行mTOR特异性si RNA转染和空白转染后再用含200μM浓度FAC的培养基进行干预72h。用碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨细胞活性,用茜素红染色（ARS）检测成骨细胞骨矿化能力,成骨基因（Runx2、SP7、ALP）表达采用RT-PCR检测,成骨蛋白（Runx2,Ocn）表达用Western Blot检测。结果:1、在体研究:股骨Micro-CT显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组BMD、BV/TV、TB.N、TB.Th、Conn D明显减少,TB.Sp、SMI明显增加,而△Hep+OVX+Rapa组较△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组BMD、BV/TV、TB.N、TB.Th、Conn D增加,TB.Sp、SMI减少（p<0.05）。股骨电镜、胫骨HE染色显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组骨量及骨小梁明显减少,使用雷帕霉素后骨量及骨小梁明显改善（p<0.05）,胫骨ALP染色亦表明△Hep+OVX组使用雷帕霉素后成骨细胞骨形成明显增加（p<0.05）。生物力学显示,与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组弯曲弹性模量、弯曲能量、最大弯曲应力、弯曲刚性系数明显降低,注射雷帕霉素后明显恢复（p<0.05）。与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组血清成骨指标（ALP、PINP、Ocn）、骨组织成骨基因（Runx2、SP7、ALP）表达明显减少,雷帕霉素干预后明显增加（p<0.05）。2、离体研究:ALP染色和茜素红染色显示,与cont组相比,iron组和iron+si-NC组的成骨细胞活性及矿化能力明显下降,iron+si-MT组较iron组和iron+si-NC组明显改善（p<0.05）。与cont组相比,iron组和iron+si-NC组的成骨基因（Runx2、SP7、ALP）和成骨蛋白（Runx2,Ocn）表达明显降低,iron+si-MT组较iron组和iron+si-NC组明显恢复（p<0.05）。结论:雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中可以提高骨量及成骨活性,具有改善骨生成作用。第三部分雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的血管形成作用目的:研究mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapa）对铁蓄积高转换骨质疏松中血管形成的影响。方法:1、动物实验:利用实验第二部分Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组、△Hep+OVX+Rapa组标本。RT-PCR、Western Blot分别检测骨组织中促血管生成Slit3基因及蛋白表达水平。备用胫骨作冰冻切片,血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）抗体、内皮粘蛋白（EMCN）抗体双染,共聚焦显微镜观察H亚型血管数目及分布。2、细胞实验:利用实验第二部分cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组成骨细胞,将各自培养基分别培养四组相同人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。用划痕实验、小管形成实验分别检测HUVEC迁移能力、管形成能力,免疫荧光检测各组HUVEC中EMCN表达情况。结果:1、在体研究:与Wt+OVX组相比,△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组Slit3基因表达、蛋白表达、H亚型血管数目及分布明显减少,使用雷帕霉素后明显增加（p<0.05）,但△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组无明显差异（p>0.05）。2、离体研究:与cont组培养基培养的HUVEC相比,iron组和iron+si-NC组培养基培养的HUVEC其迁移能力、管形成能力明显抑制,EMCN表达明显减少,iron+si-MT组上述指标明显恢复（p<0.05）。结论:雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中可以促进Slit3基因表达、蛋白表达、增加H亚型血管数目及分布,mTOR抑制后HUVEC活性增强,具有改善血管形成作用。第四部分雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的机制研究目的:研究雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的作用机制。方法:1、细胞实验:利用实验第二部分cont组、iron组、iron+si-NC组、iron+si-MT组成骨细胞,将各自培养基分别培养四组相同HUVEC。RT-PCR、Western Blot（或ELISA）检测细胞中mTOR、STAT1、Cxcl9、VEGF、KDR（VEGF受体）、p KDR等相关基因及通路蛋白表达水平。免疫荧光检测成骨细胞和HUVEC中KDR的磷酸化水平。2、动物实验:利用实验第二部分Wt+OVX组、△Hep+OVX组、△Hep+OVX+CMC组、△Hep+OVX+Rapa组标本。RT-PCR、Western Blot检测骨组织中mTOR、STAT1、Cxcl9、VEGF、KDR（VEGF受体）、p KDR等相关基因及通路蛋白表达水平。结果:1、离体研究:h FOB1.19细胞在接受FAC干预后（即iron组）mTOR及其下游STAT1、Cxcl9、VEGF等基因、蛋白表达上升,p KDR表达下降,在mTOR特异性si-RNA转染后（即iron+si-MT组）,上述指标明显恢复（p<0.05）。iron组和iron+si-NC组无明显差异（p>0.05）。2、在体研究:铁调素敲除的转基因去卵巢小鼠（即△Hep+OVX组）较Wt+OVX组,骨组织中mTOR及其下游STAT1、Cxcl9、VEGF等基因、蛋白表达上升,p KDR表达下降,在使用雷帕霉素后（即△Hep+OVX+Rapa组）,上述指标明显恢复（p<0.05）。△Hep+OVX组和△Hep+OVX+CMC组无明显差异（p>0.05）。结论:铁蓄积通过mTOR/STAT1/Cxcl9通路,抑制p KDR,使VEGF及KDR有效结合减少,从而影响高转换骨质疏松骨量恢复。雷帕霉素可以靶向mTOR,改善“骨生成/血管形成”,具有成骨作用。
李建君[4]（2020）在《VEGF-Ax对大鼠骨髓间充质干细胞成血管分化的调节作用及其促血管生成能力的研究》文中指出研究背景:血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）在血管生成的调控中起到关键作用。VEGF-A包括多种亚型。起初,人们认为不同的VEGF-A亚型是通过VEGF-A的mRNA的可变剪切产生,且这些亚型在血管生成的过程中起到各异的调节作用,包括促进血管生成和拮抗血管生成两个方面。它们也因此被命名为VEGFxxxa或者VEGFxxxb,例如VEGF165b,VEGF121a等。其中“xxx”代表最终蛋白质序列中存在的氨基酸数量,而“a/b”代表VEGF-A基因6号染色体第8外显子的不同片段:CDKPRR/SLTRKD。最近有研究发现,VEGF-A 的 mRNA 程序性翻译通读（programmed translational readthrough,PTR）过程可以产生一种新的VEGF-A亚型,这种亚型使用非经典终止密码子在VEGF-A基因的羧基末端产生一段包含22个氨基酸的延伸,因此被命名为VEGF-Ax,x代表“extend”。有意思的是,VEGF-Ax的功能尚未定论,特别是关于VEGF-Ax调节血管生成的结论是矛盾的。有两个团队分别得出VEGF-Ax具有“促进”或“拮抗”血管生成作用。研究方法:我们首先提取了大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）,进行了干细胞多向分化潜能鉴定及干细胞表面特异性标记物的鉴定。随后设计针对大鼠VEGF-Ax的过表达慢病毒。在基因层面过表达VEGF-Ax后,用流式细胞术检测细胞的凋亡及周期状况,用CCK-K及EdU染色来检测细胞的增殖情况,用划痕实验及transwell实验来检测细胞的迁移能力,用 Western blot 检测 MMP-2,MMP-9,E-cadherin 和 N-cadherin等Wnt/β-catenin通路关键蛋白,用小管形成实验、流式细胞术以及裸鼠皮下血管形成实验检测VEGF-Ax对干细胞血管形成的影响,用Western blot检测CD31,VEGFR2,vWF,cdh5等成血管相关蛋白的表达情况来检测细胞血管分化的情况,以及免疫组化检测裸鼠皮下新生组织的CD31,VEGFR2,vWF表达情况。另一方面,我们使用内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）激动剂诱导BMMSCs凋亡,然后使用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,CCK-K及EdU染色来检测细胞的增殖情况,Western blot检测细胞内质网应激关键蛋白及凋亡相关蛋白表达水平。研究结果:VEGF-Ax可以促进BMMSCs的增殖和迁移,刺激BMMSCs向内皮样细胞样（EC-like）细胞的分化,上调内皮细胞相关标记,并在体内和体外促进血管生成。并保护BMMSCs免受因为ERS诱导的细胞凋亡。研究意义:我们的研究首先探讨了 VEGF-Ax对大鼠BMMSCs细胞生物学功能的影响。我们还通过刺激ERS诱导的细胞凋亡研究了 VEGF-Ax对BMMSCs的保护作用。这些研究首次证明,VEGF-Ax可以刺激BMMSCs向内皮样细胞的分化。我们还研究了 VEGF-Ax通过Wnt/β-catenin途径对BMMSCs的增殖和迁移的调节作用,并证明VEGF-Ax保护BMMSCs免受ERS诱导的细胞凋亡。这项研究的长期前景是为VEGF-A功能基团的作用提供证据。
赵晨[5]（2020）在《脂肪干细胞来源外泌体对膝骨关节炎的疗效及作用机制的研究》文中研究表明研究背景:骨性关节炎（osteoarthritis,OA）是全世界中老年人群最常见的骨关节疾病,是引起膝关节疼痛和致残的主要原因,但是目前还没有预防或治愈膝骨性关节炎的治疗方法。由于间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有免疫调节和分化的潜能,越来越多的研究将其应用于缺损组织的再生,脂肪干细胞（Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs）是MSCs的类型之一,与其他组织的MSCs具有相似的表面标志物和分化潜能,但相比其他组织来源的MSCs,ADSCs具有量大、易获取的优势,其已经被成功应用于治疗OA动物模型。外泌体是由细胞分泌的一种囊泡,其内部含有蛋白质、DNA、RNA和脂质等具有生物活性的物质,能够通过旁分泌、邻分泌和内吞三种方式被受体细胞吸收,并影响受体细胞的生物过程,研究发现MSCs来源的外泌体在损伤的软骨中具有修复作用。Wnt信号通路在维持关节的完整性上非常重要,β-catenin水平的过度和不足会分别通过增强病理性成熟和凋亡破坏关节软骨细胞的平衡,在OA软骨组织中存在β-catenin水平的上调。自噬是进化保守的过程,细胞内部的维护有赖于持续自噬的作用,研究表明OA中自噬具有保护软骨的作用,并且在其他疾病和细胞的研究中发现Wnt/β-catenin信号通路可以负向调控自噬反应。目前对于ADSCs来源外泌体治疗OA的疗效及相关机制研究尚有限,ADSCs来源外泌体是否会调节软骨细胞中β-catenin及自噬,从而影响软骨细胞的性能尚未见研究。因此,本研究将从以下三个方面进行研究:（1）抽脂术及直接切取脂肪组织中获取的ADSCs其细胞性能是否有差异;（2）动物体内观察ADSCs及ADSCs来源外泌体对OA模型大鼠滑膜及软骨组织的治疗效果及它们之间的比较;（3）ADSCs来源外泌体对OA患者来源滑膜成纤维细胞和软骨细胞的作用以及对软骨细胞中β-catenin和自噬的影响。第一部分脂肪干细胞及其外泌体的提取及鉴定目的:从抽脂术及髋关节置换术中获取的脂肪组织中提取ADSCs,并且从ADSCs培养基中提取外泌体,对ADSCs的表型、分化能力及外泌体形态、标志蛋白的表达进行鉴定。方法:采用胰酶与胶原酶联合消化的方式从抽脂术及髋关节置换术获得的脂肪组织中提取ADSCs,采用流式细胞术分析细胞的表面标志。将ADSCs向成骨、成脂、成软骨诱导,以茜素红、油红O及阿利新蓝染色鉴定成骨、成脂、成软骨潜能,荧光定量PCR检测诱导后OCN、PPARγ、COL2A1 mRNA的表达,采用CCK8检测ADSCs的增殖能力,比较两种来源ADSCs三系分化及增殖能力的差异。通过超速离心法获取ADSCs来源的外泌体,采用透射电镜及Western blot鉴定外泌体。结果:从抽脂术来源和髋关节置换术来源脂肪组织中获取的细胞为形态一致的成纤维样细胞,表面标志物均为CD31、CD34、CD45阴性表达,而CD73、CD90、CD105阳性表达,符合ADSCs表面标志物的表达,抽脂术来源和髋关节置换术来源的ADSCs具有相似的增殖能力和三系分化潜能;从两种来源ADSCs培养基中通过超速离心法能够获取直径在50nm～100nm之间的外泌体,特异性标记蛋白CD9和CD63阳性。结论:抽脂术和髋关节置换切取脂肪组织获取的ADSCs表面标志物、三系分化潜能及增殖能力相似,均能通过超速离心法从培养基中获取外泌体。第二部分ADSCs及其来源外泌体对OA模型大鼠的治疗效果的研究目的:观察ADSCs及其来源外泌体对OA模型大鼠行为学、滑膜组织及软骨组织的影响。方法:应用Hulth法制备OA大鼠模型,选取24只OA造模4周后的SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组各8只。A组为对照组,采用60μL生理盐水关节腔注射;B组为ADSCs组,将1×106个ADSCs以60μL生理盐水重悬后注射至OA大鼠膝关节;C组为外泌体组,采用ADSCs来源外泌体(1011颗粒/m L)关节腔注射治疗。所有大鼠均每周接受2次注射,共干预8周。观察大鼠干预后行为学指标、滑膜及关节面病理切片以及相关基因、蛋白的表达情况。结果:所有大鼠在治疗期间均未出现并发症。在造模成功后采用ADSCs、ADSCs来源外泌体治疗8周,结果显示B组和C组大鼠疼痛刺激反应、步态、活动度和肿胀均比A组症状轻,差异具有统计学意义（P<0.05）;而B组和C组之间比较无明显差异（P>0.05）。滑膜HE染色显示A组滑膜组织中存在大量淋巴细胞的浸润,滑膜细胞增生,复层化。而B组和C组滑膜组织中滑膜细胞及间质淋巴细胞减少,炎症反应减弱,滑膜细胞状态趋于正常。番红O-固绿染色显示A组软骨结构紊乱,软骨细胞固缩,番红O-固绿染色减弱,潮线破坏;而B组和C组软骨结构相对完整,软骨细胞正常,番红O-固绿染色颜色深,潮线相对完整。A组改良Mankin’s评分平均为8.6分,B组和C组分别为3.4分和3.6分,A组明显高于B组和C组,差异具有统计学意义（P<0.05）,而B组和C组之间比较无明显差异（P>0.05）,表明A组软骨破坏要比B组、C组严重。A组滑膜组织中TNF-α基因及蛋白的表达要明显高于B组、C组,IL-10基因及蛋白的表达低于B组、C组;软骨组织基因及蛋白检测显示B组、C组II型胶原基因和蛋白表达高于A组。结论:ADSCs来源外泌体治疗OA模型大鼠的疗效与ADSCs相似,均能减轻滑膜组织的炎症反应,并且对软骨组织具有修复作用。第三部分ADSCs来源外泌体对OA患者滑膜成纤维细胞及软骨细胞的作用及相关机制的研究目的:探索ADSCs来源外泌体对OA患者来源滑膜成纤维细胞炎症因子分泌及软骨细胞的抗凋亡及迁移的影响。方法:分离获取OA患者来源的滑膜成纤维细胞及软骨细胞,将ADSCs来源外泌体干预活化状态下滑膜成纤维细胞,观察干预后炎症因子的表达情况;将ADSCs来源外泌体与H2O2干预的软骨细胞进行共培养,观察其对软骨细胞凋亡的影响;软骨细胞接受滑膜成纤维细胞条件培养基及ADSCs来源外泌体干预,观察迁移能力的变化,检测β-catenin及自噬指标的改变。结果:ADSCs来源的外泌体与OA患者来源的活化状态下成纤维滑膜细胞共培养,结果显示活化状态下成纤维滑膜细胞在外泌体治疗后能显着减少IL6、TNF?α和NF?κB的炎症生物指标的水平,同时增加抗炎指标IL-10的水平。在观察到ADSCs来源外泌体能够减轻活化状态下滑膜成纤维细胞的炎症后,本研究继续研究了ADSCs来源外泌体对关节软骨细胞氧化应激情况下凋亡的影响。本研究将关节软骨细胞培养后以H2O2干预,用来模拟关节滑膜中M1巨噬细胞诱导的氧化应激反应,在H2O2干预后会明显增加软骨细胞的凋亡;在加入ADSCs来源外泌体干预后,结果显示随着外泌体浓度的增加,软骨细胞凋亡数量明显减少。根据ADSCs来源外泌体对软骨细胞凋亡实验结果,10×1010 particles/m L外泌体浓度对软骨细胞干预最为明显,后续实验我们均采用该浓度进行。为了观察活化状态下滑膜成纤维细胞条件培养基对软骨细胞迁移的影响及ADSCs来源外泌体的干预作用,我们分为对照组、条件培养基组和外泌体+条件培养基组。本研究显示软骨细胞在条件培养基培养下MAPLC3B mRNA表达降低,而CTNNB1、P62 mRNA表达升高,蛋白检测显示LC3II/I比例降低,β-catenin、P62蛋白表达升高;在外泌体干预后MAPLC3B mRNA表达升高,而CTNNB1、P62 mRNA表达降低;对相应蛋白检测显示LC3II/I比例升高,β-catenin、P62蛋白表达降低。既往研究显示β-catenin可以调控自噬的降解,本研究中结果显示外泌体增加自噬的同时降低了β-catenin的表达,这提示外泌体可能通过减少β-catenin,增加细胞内的自噬反应,从而促进了软骨的迁移。为了证实自噬对软骨细胞迁移的影响,我们采用自噬抑制小分子药物3-MA（20μM）干预,结果显示3-MA干预后软骨细胞迁移能力明显降低,基因检测显示3-MA干预后P62 mRNA升高,MAP1LC3B mRNA表达下降,β-catenin mRNA的表达与外泌体干预比较无明显差异,而相比对照组比较降低,蛋白检测也显示LC3II/I比例降低,P62蛋白表达升高,而β-catenin无明显改变。结论:ADSCs来源外泌体能够减少活化状态下滑膜成纤维细胞促炎因子的释放,增加抗炎因子的表达,减少氧化应激状态下软骨细胞的凋亡,同时它通过调节β-catenin/自噬通路,增加软骨细胞的自噬,促进其迁移能力的提高,从而起软骨修复的作用。
胡晓烨[6]（2019）在《Ars2介导miRNA调控急性髓系白血病细胞周期的分子机制研究》文中提出研究背景与意义:急性髓系白血病（AML）是获得性髓系细胞恶性增生引起的高度异质性的克隆性疾病,是成人最常见的急性白血病,约占成人白血病发病率的70%。近年来,随着化疗和支持疗法的不断发展,AML患者的治疗完全缓解率和长期生存率得到明显提高。但仍有20%-30%患者复发,5年总生存率仅为40%-50%。改善初治完全缓解率,克服缓解后复发,成为AML治疗的难点之一。时至今日,分子靶向治疗趋近成熟并已成为当下癌症治疗的主要手段之一,随着对AML分子生物学研究的深入,越来越多的异常基因和异常的信号传导通路被发现,这些基因和信号通路为临床肿瘤靶点治疗提供了广阔的思路和可能性,更加有助于新药或者新型疗法的开发与实践,对肿瘤临床医疗有着重要意义。非编码核糖核酸（non-coding RNA,ncRNA）曾被认为是细胞中的废弃物,不调控细胞增殖相关进程,但随着研究不断深入,ncRNA的功能被不断挖掘出来。非编码RNA以序列长度分类有长链非编码RNA（long-non-coding RNA）,短链非编码RNA（short-non-coding RNA,snoRNA）微小非编码RNA（micro RNA,miRNA）。其中miRNA在近年来受到学界的广泛关注,其中在肿瘤方面miRNA的研究也越发深入,部分miRNA的表达会引起肿瘤的发生（onco miRNA）,而有些miRNA表达则会抑制肿瘤生命进程（Tumor Suppressor miRNA）。这种对肿瘤正面或负面的作用机制大部分是靠miRNA调控相应蛋白表达而完成的。同时miRNA也受RNA酶等蛋白调控翻译剪切等过程。砷拮抗蛋白-2（Arsenic resistance protein 2,Ars2）是一种高度保守蛋白,研究表明Ars2与mRNA 5`端帽式结构复合物（cap-binding complex、CBC）相结合,并与其他酶或蛋白一起调控RNA合成、剪切、翻译等功能,其中也包括miRNA的合成、剪切等功能。随着各种科学研究的深入,发现miRNA在肿瘤的形成、增殖过程中起着及其关键的作用,但仍有新的miRNA被不断地发现,并被证明参与到肿瘤进程中。有临床样本显示,Ars2在AML样本中高表达,并与患者预后情况呈明显相关性,但Ars2在AML中的调节机制尚未阐明。结合miRNA近年来的研究,由Ars2表达异常引起的部分miRNA表达异常很有可能是AML发病的诱因之一。以此为出发点,本课题旨在于发掘Ars2在AML形成以及增殖过程中调节的miRNA,以及阐明Ars2通过miRNA调节AML增殖的作用机制,为临床靶向治疗提供基础依据。研究目的:发现Ars2与AML的相关性,探索Ars2在AML中的功能,在体内与体外水平验证Ars2对AML发生增殖所起的作用,研究Ars2通过调控miRNA表达从而影响AML增殖的作用机制,探讨Ars2在AML临床治疗中的应用价值。研究方法:通过查阅多个癌症基因数据库,探寻Ars2在AML患者骨髓中的表达量与AML患者预后的相关关系,使用qRT-PCR检测临床样本中Ars2表达量是否异常。对U937细胞株使用慢病毒载体感染,构建Ars2高表达、Ars2干扰（shArs2）与Ars2阴性对照（Control）细胞株在细胞生殖上的差异,流式细胞技术确定Ars2对AML细胞系的细胞周期有调控作用,再通过Western Blot实验检测细胞周期相关蛋白,筛选出U937在高表达和敲降Ars2之后发生变化的蛋白。构建THP-1、HL-60、K562细胞相应的高表达和敲降细胞株,以相同的技术手段对Ars2在AML中所起作用进行验证。使用慢病毒感染系统构建shArs2-U937细胞株,对CBP80进行免疫共沉淀实验,比较Ars2敲降前后,与CBP80相结合的Ars2蛋白的变化情况。再将shArs2-U937中Ars2进行免疫共沉淀实验,Western Blot检测与Ars2结合的CBP80蛋白变化情况。从而反应Ars2与CBP80是否直接结合。根据miR-6734-3p在染色体上的定位,设计miR-6734-3p前体pri-miR-6734-3p引物,qRT-PCR检测pri-miR-6734-3p表达量,通过观察pri-miR-6734-3p的变化,判断pri-miR-6734-3p在剪切过程中是否被Ars2调节。免疫共沉淀实验检测在Ars2上结合的RNA剪切酶Drosha/Pasha和Dicer1变化情况,判断Ars2调控pri-miR-6734-3p剪切的具体节点。将Control-U937与shArs2-U937细胞株送至广州锐博生物技术有限公司生物公司（Ribobio,Guangzhou,China）进行高通量miRNA芯片检测,并筛选出Ars2正向调节的miRNA集群。通过多个miRNA数据库进行碱基拟合运算,进行靶点预测,找出能与p27/Kip1 3`端序列结合的miRNA集群。再经由qRT-PCR验证,筛选出受Ars2调控且可与p27/Kip1 3`端序列结合的miRNA。使用miRNA mimic将U937中特定miRNA高表达,Western Blot和qRT-PCR实验验证该miRNA是否抑制p27/kip1在蛋白和mRNA水平的表达。于RNA22数据库（cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/）中计算出miRNA与p27/Kip1 3`端序列具体的结合位点,再构建相应序列的双荧光素酶报告基因,使用双荧光素酶实验验证靶点序列的有效性。构建miR-6734-3p高表达与低表达U937细胞株,流式细胞实验验证miR-6734-3p对AML细胞周期G1期的影响。qRT-PCR检测病人样本中miR-6734-3p mRNA表达量与正常人样本中表达量的差异。通过尾静脉注射构建小鼠AML模型,分为生理盐水组,U937组,shArs2-U937组。记录各组生存时间与小鼠体重变化;40天取各组小鼠肝肾切片,免疫组化检验病变情况;取小鼠股骨中骨髓,流式细胞检测小鼠骨髓中AML浸润情况。研究结果:1.公共数据库显示Ars2表达量与病人预后相关,Ars2表达量越高预后越差。公共数据库统计结果与临床样本PCR检测结果显示Ars2在AML病人样本中高表达。2.Ars2调控AML细胞增殖与克隆形成能力,Ars2表达量越高AML增殖速率与克隆形成能力越快,Ars2表达缺失AML增殖速率变慢,克隆成球能力变弱。而Ars2是通过调控细胞周期进程来影响AML细胞增殖速度的。3.在AML中Ars2与CBC结合,募集miRNA剪切酶Drosha对pri-miRNA行使剪切功能,从而维持miR-6734-3p的正常合成。miR-6734-3p正常表达时抑制p27表达,当Ars2缺失时会引起miR-6734-3p表达量降低,p27表达量增高,最终导致AML细胞周期G1期阻滞。经实验检测,miR-6734-3p在AML病人样本中高表达。4.小鼠白血病模型中Ars2表达量与AML增殖速度呈现正相关,Ars2缺失可减缓AML浸润速度,推迟小鼠病变时机,延长AML小鼠存活时间。研究结论:1.Ars2高表达会引起AML患者预后情况变差,相较于正常样本,在AML中Ars2呈现高表达趋势。2.Ars2可以调节AML细胞周期从而对AML细胞系生殖速率起正向调控作用。3.在AML中Ars2与CBC结合,募集RNA酶DROSHA维持miRNA剪切,Ars2表达缺失时miR-6734-3p表达量降低,其抑制p27的作用减弱,从而引起AML细胞周期G1期阻滞。miR-6734-3p在AML患者样本中高表达。4.在AML小鼠模型中Ars2调控AML增殖等过程,并呈现量效趋势。5.Ars2与miR-6734-3p在临床治疗上具有成为治疗癌症靶点的潜力与价值。
李欣欣[7]（2018）在《鸭胚胎期腿肌发育不同阶段差异表达基因和miRNAs的筛选与功能验证》文中研究表明腿肌和胸肌是水禽骨骼肌的重要组成部分,两者在肌纤维类型、发育规律等方面存在显着差异。前人的研究主要集中于胸肌的发育特征及其调控机制方面,而腿肌发育的分子机理研究报道较少。因此,本研究以发育不同时期樱桃谷肉鸭胚胎期腿肌为研究材料,首先,从组织学和基因表达水平解析胚胎期腿肌发育规律;其次,利用RNA-seq和miRNA-seq技术筛选鸭胚胎期腿肌发育不同时期的差异表达基因、差异表达miRNAs以及调控的差异信号通路;再次,从细胞水平探讨在发育不同时期均存在显着差异的miR-33a调控鸭成肌细胞增殖的的分子机制;最后,从细胞水平探讨卵泡抑素（Follistatin,FST）调控鸭成肌细胞增殖的分子机制。研究结果如下:（1）鸭胚胎期腿肌发育过程主要分为成肌细胞增殖期、肌管期和肌纤维期,且三个时期对应的关键发育时间点:11胚龄（E11）、19胚龄（E19）和27胚龄（E27）。（2）RNA-seq结果的分析表明,E11与E19相比存在1182个显着差异表达的基因（DEGs）（FDR≤0.01）,875个上调,307个下调;E19与E27相比存在1967个DEGs（FDR≤0.01）,1052个上调,915个下调;E11与E27相比存在1484个DEGs（FDR≤0.01）,654个上调,830个下调。研究发现从肌管发育成肌纤维阶段的差异基因数多于成肌细胞发育成肌管阶段。（3）miRNA-seq结果的分析表明,E11与E19相比存在194个显着差异表达的已知miRNAs（FDR≤0.01）,105个调,89个下调;E19与E27相比存在550个显着差异表达的已知miRNAs（FDR≤0.01）,156个上调,394个下调;E11与E27相比存在369个显着差异表达的已知miRNAs（FDR≤0.01）,143个上调,226个下调。研究发现从肌管发育成肌纤维阶段的差异miRNAs数多于成肌细胞发育成肌管阶段。（4）miRNA-seq结果预测出新miRNAs在发育的不同时期差异如下:E11与E19相比存在7个显着差异表达的新miRNAs（FDR≤0.01）,5个上调,2个下调;E19与E27相比存在25个显着差异表达的新miRNAs（FDR≤0.01）,3个上调,22个下调;E11与E27相比存在9个显着差异表达的新miRNAs（FDR≤0.01）,2个上调,7个下调。研究发现肌管发育成肌纤维阶段比成肌细胞发育成肌管阶段存在更多的差异新miRNAs,差异新miRNAs在肌管发育成肌纤维的过程中发挥重要的调控作用。（5）RNA-seq和miRNA-seq的KEGG分析表明,p53信号转导通路、MAPK信号转导通路、细胞周期信号转导通路上富集的差异基因较多;采用荧光定量PCR方法验证了p53信号通路上Zinc finger protein RFP-like 1、DNAJC6、ZSWIM2、CDKL2、CDK14、CCNB3、RRM2、CCNB2、Cytochrome c-like共9个基因的mRNA水平的表达量,其表达趋势与转录组测序结果一致。该研究暗示此三个信号通路可能是调控鸭胚胎期腿肌发育差异的重要信号通路。（6）miRNA-seq结果的分析表明miR-33a的表达在腿肌发育的三个时期间存在显着差异,miR-33a的表达量在鸭成肌细胞增殖期显着高于其余两个时期;在成肌细胞中过表达miR-33a后能通过靶向抑制IGF-1、FST和CCND1,并抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制鸭成肌细胞增殖。（7）过表达FST基因的结果表明,FST过表达能增强成肌细胞活性和促进成肌细胞增殖,FST过表达促进鸭成肌细胞增殖的机制主要通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来实现。综上所述,本研究从组织和细胞水平探讨了鸭胚胎期腿肌发育不同时期在基因表达和miRNAs表达上的差异,并对影响鸭胚胎期腿肌发育的关键miRNAs、调控基因及调控的信号通路进行了功能研究,为系统全面的阐述骨骼肌发育的分子机制奠定理论基础。
张勇[8]（2017）在《低能量冲击波和骨髓间充质干细胞对慢性环孢素肾病大鼠的治疗研究》文中研究说明背景:冲击波属于机械波,做为无创物理治疗方法已经应用临床30余年。从最初的体外碎石治疗,再发展到骨不连、疼痛治疗,特别是在上世纪发现低能量冲击波对于慢性缺血性疾病的改善治疗作用,使得冲击波的应用范围越来越广阔。慢性肾脏疾病是我国的常见病多发病,我国约有1.2亿慢性肾脏疾病患者,然而对于绝大多数的肾脏疾病,特别是慢性肾功能不全目前还缺乏有效的治疗手段。肾脏局部微循环障碍、小管间质纤维化在慢性肾脏疾病发生发展中起至关重要的作用。低能量冲击波治疗作为一种新型治疗手段是否也能对慢性肾功能不全有效目前尚未有报道。干细胞治疗技术是目前医学研究的热点,近年来关于干细胞治疗慢性肾脏疾病基础及临床研究有大量报道,干细胞治疗业已被证实在急性肾损伤、肾小管损伤修复、缺血性肾脏病、肾间质纤维化防治方面有一定疗效。在体外实验中低能量冲击波曾有报道可以增强干细胞的分化和迁徙能力,那么在体内是否也能增强干细胞治疗的作用,目前尚未有相关文献报道。为了证实以上的假说,我们选取慢性环孢霉素肾病模型作为治疗对象,环孢霉素是肾脏病领域治疗的常见药物,主要用于肾移植排斥、肾病综合征、自身免疫系统疾病等的治疗,但其副作用是可能引起慢性环孢素肾病,其主要病理特征有入球小动脉透明样变性、灶状和条带状肾间质纤维化、肾小管萎缩、炎性细胞浸润。缺血性损害是其肾毒性的主要机制,而这也正是低能量冲击波和骨髓间充质干细胞治疗的长处所在。为此在本研究中我们选取环孢素肾病模型,使用低能量冲击波和骨髓间充质干细胞进行干预,观察低能量冲击波、干细胞技术是否对慢性肾脏病有治疗效果,同时观察低能量冲击波、干细胞技术间是否有协同作用,探索低能量冲击波应用于慢性肾脏病治疗的可行性以及其与干细胞共同应用的前景。研究目的:观察低能量冲击波、干细胞治疗技术是否对慢性环孢素肾病具有治疗作用,两者间能否有协同作用,并初步探讨其机制。研究方法:1.使用不同能量级（6、8、10、12KV）的冲击波干预正常SD大鼠,动态监测肾脏功能（血肌酐、尿素氮）及大鼠生长情况变化,28d切取肾脏进行组织形态学评估,同时测定部分细胞因子的表达水平,为下一步实验选取合适的冲击波能量级。2.实验大鼠分成5组:c组:正常对照组;h组:模型组;l1、l2、l5组:8KV冲击波干预组,分别于第7、14,21天给予冲击波治疗,l1组（每次左右肾各100次）、l2组（每次左右肾各冲击200次）、l5组（每次左右肾各冲击500次）;,动态监测肾脏功能（血肌酐、血尿素氮）及大鼠生长情况变化,28d切取肾脏进行组织形态学评估,同时测定部分细胞因子（α-SMA、TGF-β1、NF-κB、VEGF）的表达水平。3.实验大鼠分成5组:c组:正常对照组;h组:模型组;l组:低能冲击波干预组;b组:干细胞治疗组;bl组:低能冲击波联合干细胞治疗组,动态监测肾脏功能（血肌酐、血尿素氮）及大鼠生长情况变化,28d切取肾脏进行组织形态学评估,同时测定部分细胞因子（α-SMA、TGF-β1、NF-κB、VEGF）的表达水平。结果:1.与正常对照组比较,低能量冲击波治疗组（6KV、8KV）在肾组织形态上无明显改变,10KV组的肾脏组织中可见到少量的肾脏淤血情况,12KV干预组大鼠皮肤可见瘀斑,肾脏表面也可见到有散在的出血点,肾组织内有较多的肾脏淤血情况,肾小管可以见到浊肿发生。肾功能和体重情况,与正常对照组比较,不同能量级冲击波干预组的血肌酐、血尿素氮、体重变化趋势无明显差别,差异不具有统计学意义。肾间质纤维化（RIF）评分,与正常对照组比较,低能量冲击波治疗组（6KV、8KV）肾间质纤维化评分无明显差别,10KV和12KV的RIF评分较正常组升高,差异具有显着性。2.与c组比较,h组与冲击波治疗组（l1、l2、l5组）在体重、血肌酐、血尿素氮水平均显着升高,差异具有统计学意义。与h组相对比,l1、l2组血肌酐、血尿素氮水平有明显下降,体重增加。但是l5血肌酐、尿素氮、体重水平与h组大鼠无显着差异。肾组织形态上,模型组与治疗组都出现了明显的肾脏损害,RIF评分均显着升高。与h组比较,l1、l2组RIF评分显着下降,但是l5组与h组之间比较RIF评分高于模型组,差异有统计学意义。在机制初步探索上,与肾脏病进展密切相关的因子α-SMA、TGF-β1、NF-κB、VEGF在模型组和干预组之中表达均明显上升。与H组比较,L1、L2组的上述因子表达程度有所下降,而L5组大鼠的肾脏上述因子表达水平比模型组大鼠显着升高,差异有统计学意义。3.与C组比较,H组与治疗组（L、B、BL组）的血肌酐、尿素氮水平均显着升高,体重显着下降。与H组比较,L、B、BL组对大鼠的血肌酐、尿素氮水平有明显下降,体重增加。肾组织形态上,模型组与治疗组都出现了明显的肾脏损害,RIF评分均显着升高;与H组比较,L、B、BL组RIF评分显着下降。细胞因子表达上α-SMA、TGF-β1、NF-κB、VEGF在模型组和治疗组之中均明显上升。但是BL组与B组比较,在血肌酐、尿素氮水平、体重、RIF评分、细胞因子表达水平上均无显着差异。结论:适量的低能量冲击波治疗和骨髓间充质干细胞治疗对慢性环孢素肾病大鼠有改善作用,两者间在体内未发现协同作用,两者改善肾功能的机理仍需进一步的研究。
裴飞[9]（2016）在《人牙本质基质材料复合人骨髓间充质干细胞用于牙根再生的研究》文中研究指明研究背景各种原因造成的牙齿缺失是人类的常见疾病,对患者的咀嚼、发音、美观甚至心理健康都等有显着影响。而目前,针对牙齿缺失的修复方法有很多,但最接近真牙,经久耐用的方法却较少。种植牙作为修复牙齿缺失一种良好的方法,可以与牙槽骨较好的结合（骨结合）,但种植牙缺乏一种重要的天然牙根结构,即牙周组织[1]。因此,牙齿再生已成为国际口腔医学研究的热点。然而,要再生一个完整的牙,需要突破很多科学难点,解决很多再生医学共同的难题[2-4]。近几年有学者提出生物牙根的概念,即利用组织工程方法,用自然界存在的或人工合成的、且具有一定空间结构的、有良好生物相容性的材料为载体,将一些具有成牙能力的细胞以特定方式“种植”到这种载体支架上,然后提供这些细胞增殖、生长和分化所需要的的生长因子微环境。通过细胞相互间的黏附、生长、增殖和分化,在体外或体内形成具有一定牙周韧带结构的牙根[3]。单纯的牙根构建不涉及调控牙冠的形态和大小,在牙齿组织工程研究中具有独特的优势,如果能再生出一个具有牙周韧带结构的生物牙根,并在其基础上进行桩冠修复,将有望成为一种理想的修复牙缺失的再生医学治疗方法[3-5]。这种具有生物活性的且有一定天然牙根结构的组织工程牙根有很大可能取代目前临床上使用的种植义齿修复术。牙根再生是全牙再生的关键科学问题,牙根再生的实现对于临床应用具有重要的意义,可为牙冠构建或全牙构建提供新的研究策略。种子细胞、支架材料和诱导微环境是生物牙根构建的核心部分[6]。目前,已有学者利用组织工程技术,使用牙源性间充质干细胞和生物支架材料在体内或者体外成功的构建了具有牙周膜、牙骨质和牙槽骨的生物牙根[7]。然而,在此构建中应用的种子细胞均为牙源性干细胞[8-9]。虽然牙源性间充质干细胞具有良好的成牙分化能力,但实际临床上该类细胞仅能通过拔除正常牙齿才能获得,且获得的数量有限,因此在临床上获取患者自体牙源性间充质干细胞受到一定限制[4]。例如,对于无牙颌病人及全口牙缺失或者不愿拔出牙齿的患者,如何获取到这些牙源性细胞,是一个有可能阻碍今后牙根再生在临床上应用的问题。在牙源性干细胞来源受到限制的情况下,探索利用人体中已成功分离出的具有转分化能力的多种成体干细胞进行牙齿再生成为必然的选择。如何诱导非牙源性干细胞牙向分化,建立效果明确且稳定的诱导体系,是解决牙齿再生细胞来源问题的关键。来源于骨髓的间充质细胞（英文全称为Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,简称BMMSCs）是一种具有较强增殖能力和多向诱导分化潜能的细胞,大量研究表明BMMSCs已被广泛应用于骨组织工程。除此之外,BMMSC具有分化成其他组织甚至其他胚层细胞的可塑性,而且BMMSCs易于获取,可以从患者自身获得,避免了免疫排斥的问题[10]。人牙本质基质材料（英文全称为human Treated Dentin Matrix,简称h TDM）已有研究证明是理想的牙组织工程的支架材料,人牙本质基质材料本身是一种细胞外基质,对细胞没有毒性,并且具有良好的生物学性能。同时h TDM含有利于成牙的生长因子,这样为细胞的生长提供了一个良好的微环境,本研究在以上研究的基础上,通过h TDM复合BMMSCs的体外及体内实验,探究其BMMSCs的成牙能力。为组织工程方法实现牙根再生的研究提供依据。目的在以上研究的基础,本实验利用改良的处理方法处理离体牙,从而得到新型人牙本质基质生物支架材料;在体外探究人牙本质基质材料对人骨髓间充质干细胞生长、增值分化等生物学特性的影响,并且通过体内、体外实验探究人骨髓间充质干细胞在人牙本质基质生物支架材料作用下,是否能够进行成牙方面的分化。为以后的牙根再生的研究及临床应用奠定基础。材料和方法1.本实验用骨髓从临床进行正颌外科手术修复颌面部畸形的患者取得,经过患者同意后,于术中切取患者上下颌骨时收集剩余的骨组织。采用组织块培养的方法,进行骨髓间充质干细胞的分离培养。2.本研究通过改良的梯度脱矿方法对人牙本质基质进行处理后得到的TDM,扫描电镜下牙本质小管充分暴露,并且管间和管周牙本质纤维组织变的十分疏松。3.通过流式细胞术的方法对对本实验细胞表面分子进行鉴定。4.利用细胞免疫组化的方法对本实验的细胞进行来源鉴定。5.通过成脂、成骨实验,探究本实验获取的骨髓间充质干细胞的分化能力6.光镜观察TDM于骨髓间充后生物学特征的改变。7.采用real time PCR检测经过h TDM浸提液诱导之后的骨髓间充质干细胞的成牙基因的表达的情况。8.h TDM复合BMMSCs移植到裸鼠皮下,体内实验探究TDM探究BMMSCs的成牙能力结果1采用组织块培养法将颌骨剪碎的骨块接种培养瓶,96h后首次换液,一周后光学显微镜下可见颌骨组织块周围有细胞长出,绝大部分为梭形、多边形。然后细胞逐渐增多。传代后细胞的形态变得更加多样化。2将收到的新鲜的离体牙制作与牙根相似外形的TDM,材料约有1mm厚,表面形态十分光滑而且规则。电镜下可见牙本质小管充分暴露,并且管间和管周牙本质纤维组织变的十分疏松。3培养细胞制作细胞爬片,固定后采用Vimentin、CK14进行免疫组化染色,确定细胞来源。Vimentin染色成阳性、CK14染色成阴性4网,流式细胞仪上机,进行细胞表面CD分子检测。检测指标包括:CD105、D31、CD34、CD90、CD73、CD25、CD26、CD146、CD8b等。5人骨髓间充质干细胞的成脂、成骨实验表明人骨髓间充质干细胞有较强的成脂成骨能力。6经过h TDM作用人骨髓间充质干细胞后,TDM有利于细胞的生长,发现细胞数目增加,细胞在材料表面有良好的附着。7采用real-time PCR定量检测TDM的浸提液诱导h BMSCs3、7天后,h BMSCs的成牙相关基因表达明显增加。8 h TDM复合BMMSCs移植到裸鼠皮下2个月后,发现TDM表面出现新生的牙本质。结论1.采用组织块培养法能够分离得到人骨髓间充质干细胞。2.骨髓间充质干细胞来源于不表达上皮源性相关蛋白,表达间充质细胞来源的相关标志,并且表达干细胞特性。3.h TDM能够促进h BMSCs的牙向分化。
邱慧玲[10]（2013）在《肿瘤干细胞促卵巢癌淋巴管生成及转移的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理卵巢癌为女性常见恶性肿瘤，死亡率居妇科恶性肿瘤首位，卵巢癌的侵袭性生长与转移是其预后不良的主要原因。研究已经发现卵巢癌组织中的脉管生成在肿瘤侵润生长与转移中扮演重要角色，但一直以来关于肿瘤脉管生成的研究主要集中在血管方面，对淋巴管的研究较少。临床观察发现高淋巴管密度与卵巢癌腹膜转移、远处转移及淋巴结转移显着相关，淋巴管生成在肿瘤淋巴转移起了重要作用。随着淋巴管特异性内皮细胞标记物的发现和淋巴管生成调控因子研究的深入，淋巴管生成对肿瘤侵袭转移的重要性逐渐得以认识，但其机制尚未明确。近年来，肿瘤干细胞理论研究结果显示肿瘤组织内存在着极少数能自我更新、多向分化、高致瘤性的肿瘤干细胞是肿瘤发生、侵袭、转移和复发的根源。对卵巢癌的研究有类似发现，卵巢癌的发生、侵袭、转移与其体内存在的数量极少的肿瘤干细胞相关。而肿瘤的生长、侵袭和转移除肿瘤细胞自身的生物学行为以外，尚有血管、淋巴管生成以提供养料，同时肿瘤组织的脉管生成在肿瘤的转移中起重要作用。因此，研究肿瘤干细胞与淋巴管内皮细胞间的相互作用，以探索肿瘤干细胞在卵巢癌淋巴转移中的作用有重要意义。另外，肿瘤干细胞通过何种机制参与卵巢癌的淋巴转移？目前研究的热点集中在SDF-1/CXCR4信号轴，SDF-1/CXCR4信号轴参与体内多种生理、病理过程，与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。新近的研究还发现SDF-1/CXCR4轴与肿瘤淋巴转移相关。卵巢癌患者腹水中检测到高水平SDF-1，卵巢癌组织高表达CXCR4，SDF-1在淋巴组织中高表达，高表达CXCR4的肿瘤细胞受SDF-1的趋化作用而发生淋巴转移。然而SDF-1在卵巢癌干细胞与淋巴管生成中的作用尚未见报道，需进一步研究。卵巢癌的淋巴管生成和转移除了肿瘤干细胞的参与外，循环中淋巴管内皮祖细胞是否具有同样重要作用尚不清楚。实验已经发现外周血中骨髓来源的淋巴管内皮祖细胞参与了淋巴管新生，新近研究还发现肿瘤患者出现外周血淋巴管内皮祖细胞增多，淋巴管内皮祖细胞被动员参与肿瘤淋巴管生成。淋巴管内皮祖细胞参与淋巴管新生的机制极其复杂，涉及动员、趋化迁移、分化等多个环节，目前仅认为VEGF-C/VEGFR-3信号途径在其中起着重要的调控作用，具体机制尚不清。在本研究中，首先，我们采用无血清悬浮培养法富集卵巢癌A2780细胞系中的细胞球，以CD133作为标记分子，用流式细胞仪从细胞球中分选出CD133+细胞，通过对CD133+自我更新、多向分化、致瘤性、干细胞标志基因等多种生物学特征进行检测，其生物学行为具备目前肿瘤干细胞的生物学特点，鉴定其为卵巢癌干细胞，为后续实验展开打下基础。然后，我们利用Transwell小室对CD133+细胞和本课题组前期建株的人淋巴管内皮细胞共培养，观察共培养时两种细胞的相互作用。一方面观察共培养对淋巴管内皮细胞增殖的影响，用酶联免疫吸附实验检测上清液中细胞因子VEGF-C的浓度，同时观察共培养对淋巴管内皮细胞迁移的影响，用RayBio人细胞因子抗体芯片对淋巴管内皮细胞上清液进行细胞因子芯片筛查，对其中差异表达的趋化因子SDF-1用酶联免疫吸附实验进行验证，并进一步观察了上调和下调SDF-1对淋巴管内皮细胞迁移的影响。另一方面我们用WB检测了CD133+细胞CXCR4蛋白的表达，观察了共培养对卵巢癌CD133+细胞侵袭的影响，以及共培养后卵巢癌CD133+细胞VEGF的表达。与此同时我们用流式细胞仪检测了卵巢癌患者外周血中淋巴管内皮祖细胞/CD34+VEGFR3+细胞的含量，酶联免疫吸附实验检测了患者外周血中VEGF-C、SDF-1的浓度，对淋巴管内皮祖细胞和患者临床资料进行相关性分析，并对淋巴管内皮祖细胞与外周血VEGF-C、SDF-1的浓度进行了相关性分析。主要的结果和结论如下：1、卵巢癌A2780细胞系中存在极少量的CD133+细胞，可通过悬浮条件培养法富集，流式细胞仪分选得到CD133+细胞。悬浮培养方法简单，重复性强，CD133+细胞比例稳定在0.2%左右。卵巢癌CD133+细胞能自我更新、多向分化，致瘤性强，多种干细胞标志基因高表达，符合肿瘤干细胞的特征。CD133是其特异性表面标志，能用于后续卵巢癌干细胞研究中干细胞的分选和鉴定。2、卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养对淋巴管内皮细胞和卵巢癌干细胞生长均产生作用。观察发现共培养时淋巴管内皮细胞增殖增加，ELISA检测共培养上清液VEGF-C含量明显升高。共培养时时淋巴管内皮细胞迁移增加，其共培养上清液中出现多种细胞因子差异表达，39种细胞因子上调，5种细胞因子下调，ELISA检测验证上清液中上清液SDF-1含量明显升高，在上调和下调了SDF-1的共培养体系中，SDF-1对淋巴管内皮细胞的迁移产生影响，100ng/ml SDF-1促进淋巴管内皮细胞迁移的作用明显，而拮抗剂AMD3100在75ug/ml则明显抑制淋巴管内皮细胞的迁移。观察还发现卵巢癌干细胞CXCR4高表达，卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养时卵巢癌CD133+细胞侵袭能力增加，WB结果显示共培养后卵巢癌干细胞VEGF表达上调。3、卵巢癌患者外周血中淋巴管内皮祖细胞含量升高，与患者肿瘤淋巴转移和临床分期相关。同时卵巢癌患者外周血中SDF-1和VEGF-C水平明显升高，淋巴管内皮祖细胞水平升高与SDF-1升高有相关性。综上所述，CD133是卵巢癌A2780干细胞的特异标志因子，卵巢癌干细胞可用悬浮培养结合流式细胞仪分离。卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养时两细胞生长互相作用，共培养时淋巴管内皮细胞增殖迁移增加，卵巢癌干细胞侵袭能力加强。SDF-1/CXCR4信号轴参与了其中的调控。卵巢癌患者外周血淋巴管内皮祖细胞升高，淋巴管内皮祖细胞与肿瘤淋巴转移相关，并与外周血SDF-1升高有相关性。
二、在老鼠骨髓中发现干细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、在老鼠骨髓中发现干细胞（论文提纲范文）
（1）基于RNA-seq技术对肾虚血瘀型股骨头坏死差异基因筛选及生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 RNA-sEQ测序技术在骨科疾病的应用 |
| 1.2 激素性股骨头坏死发病机制相关学说 |
| 1.2.1 血管内凝血学说 |
| 1.2.2 脂质代谢紊乱学说 |
| 1.2.3 骨细胞调亡学说 |
| 1.2.4 骨髓间充质干细胞分化学说 |
| 1.2.5 骨质疏松学说 |
| 1.3 激素性股骨头坏死发病机制相关信号途径 |
| 1.4 股骨头坏死的中医学研究 |
| 1.4.1 中医学对股骨头坏死的病因病机认识 |
| 1.4.2 医家对股骨头坏死中医辨证的研究 |
| 1.4.3 股骨头坏死的基因组学研究 |
| 第二章 基于GEO数据库对激素性股骨头差异表达基因谱的及相关分子作用机制研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 数据的获取和预处理 |
| 2.1.2 基因差异表达分析 |
| 2.1.3 蛋白质相互作用网络构建 |
| 2.1.4 GO富集分析和KEGG富集分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 基因差异表达分析 |
| 2.2.2 蛋白相互作用分析 |
| 2.2.3 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.2.4 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 多种信号途径参与调控激素性股骨头坏死 |
| 2.3.2 GO富集分析揭示生物过程 |
| 2.3.3 关键靶点基因及信号途径参与调控激素性股骨头坏死 |
| 2.3.4 第二章小结 |
| 第三章 基于RNA-SEQ技术对肾虚血瘀型股骨头坏死差异表达基因及其调控机制的研究 |
| 背景 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂耗材 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 临床资料收集 |
| 3.2.2 外周血单核细胞(PBMCs)收集及处理 |
| 3.2.3 标本总RNA提取 |
| 3.2.4 检测RNA浓度及纯度 |
| 3.2.5 cDNA文库构建及质控 |
| 3.2.6 上机测序及统计学分析 |
| 3.2.7 差异表达基因筛选及富集分析可视化呈现 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 转录组测序结果质量分析 |
| 3.3.2 差异表达基因筛选与分析 |
| 3.3.3 蛋白相互作用网络构建 |
| 3.3.4 GO富集分析及可视化 |
| 3.3.5 KEGG富集分析及可视化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 股骨头坏死的中医病因病机 |
| 3.4.2 中医学对股骨头坏死辩证分型的认识 |
| 3.4.3 股骨头坏死中医辨证与基因组学研究 |
| 3.4.4 肾虚血瘀型股骨头坏死关键基因及调控机制 |
| 3.4.5 第三章小结 |
| 第四章 股骨头坏死差异表达基因调控BMSC成骨分化的研究 |
| 背景 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 实验设计方案 |
| 4.2.2 大鼠骨髓间充质干分离与培养细胞培养 |
| 4.2.3 大肠杆菌培养(摇菌) |
| 4.2.4 DNA提取 |
| 4.2.5 碱性磷酸酶染色 |
| 4.2.6 茜素红染色及矿化结节沉积 |
| 4.2.7 实时荧光定量PCR法检测BMSCs中Runx2、Opn、Alp、Ocn mRNA表达 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 骨髓间充质干细胞形态学观察 |
| 4.3.2 各组质粒转染病毒AAV293 |
| 4.3.3 各组ALP染色及活性检测比较 |
| 4.3.4 各组茜素红染色情况比较 |
| 4.3.5 成骨相关基因Kdm5d、Opn、Runx2、Ocn、AlpmRNA表达水平比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 骨髓间充质干细胞与股骨头坏死 |
| 4.4.2 Alp、Runx2、Opn、Ocn对骨髓间充质干细胞的影响 |
| 4.4.3 第四章小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）Navitoclax（ABT263）改善骨关节炎中炎症微环境和减轻软骨破坏的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 ABT263对正常软骨细胞活性的影响及对衰老软骨细胞清除效率的探究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 ABT263改善人OA软骨细胞炎性微环境并维持细胞表型 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 关节腔注射ABT263削弱大鼠创伤性骨关节炎软骨及软骨下骨破坏并减轻关节腔炎症 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 靶向衰老细胞治疗骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松中“骨生成/血管形成”的基础研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 一、骨代谢的组成 |
| 二、骨代谢与骨质疏松 |
| 三、铁蓄积与骨质疏松 |
| 四、mTOR与铁蓄积骨质疏松 |
| 参考文献 |
| 第一部分 铁蓄积对小鼠、成骨细胞中mTOR水平及小鼠骨量的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的骨生成作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 雷帕霉素在铁蓄积高转换骨质疏松中的血管形成作用 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述1 铁稳态对 mTOR 信号通路的影响 |
| 参考文献 |
| 综述2 mTOR 信号通路及在间充质干细胞中的调控 |
| 参考文献 |
| 综述3 mTOR 和骨代谢关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英汉主要缩略词表 |
| 在读期间撰写论文及科研情况 |
| 致谢 |
（4）VEGF-Ax对大鼠骨髓间充质干细胞成血管分化的调节作用及其促血管生成能力的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 大鼠骨髓间充质干细胞提取以及过表达VEGF-Ax模型的建立 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第2章 大鼠VEGF-Ax对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移、成血管分化的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第3章 大鼠VEGF-Ax保护大鼠骨髓间充质干细胞免受内质网应激导致的细胞凋亡 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 第5章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）脂肪干细胞来源外泌体对膝骨关节炎的疗效及作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脂肪干细胞及其外泌体的提取及鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 脂肪组织的获取 |
| 2.3.2 脂肪干细胞提取 |
| 2.3.3 ADSCs冻存及复苏 |
| 2.3.4 表面标志物鉴定 |
| 2.3.5 三系分化鉴定 |
| 2.3.6 细胞总RNA的提取、反转录 |
| 2.3.7 实时荧光定量PCR |
| 2.3.8 ADSCs增殖检测 |
| 2.3.9 外泌体提取 |
| 2.3.10 外泌体鉴定 |
| 2.3.11 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ADSCs形态和表面标志物鉴定 |
| 3.2 ADSCs三系分化鉴定及分化能力的比较 |
| 3.3 增殖能力的比较 |
| 3.4 外泌体鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs干细胞及其来源外泌体对OA模型大鼠的治疗效果的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 动物造模 |
| 2.3.3 分组及干预方法 |
| 2.3.4 行为学观察 |
| 2.3.5 膝关节样本收集及病理切片 |
| 2.3.6 番红O-固绿染色 |
| 2.3.7 组织总RNA的提取及反转录 |
| 2.3.8 实时荧光定量PCR |
| 2.3.9 蛋白提取 |
| 2.3.10 Western blot |
| 2.3.11 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 并发症及行为学观察 |
| 3.2 滑膜及软骨病理观察 |
| 3.3 基因及蛋白的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADSCs来源外泌体对OA患者滑膜成纤维细胞及软骨细胞的作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 OA患者滑膜组织中活化状态滑膜细胞的分离 |
| 2.3.2 软骨细胞分离培养 |
| 2.3.3 氧化应激下软骨细胞凋亡实验 |
| 2.3.4 条件培养基获取 |
| 2.3.5 迁移实验 |
| 2.3.6 总RNA提取及反转录 |
| 2.3.7 实时荧光定量PCR |
| 2.3.8 细胞蛋白提取 |
| 2.3.9 Western Blot |
| 2.3.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ADSCs来源外泌体缓解活化状态滑膜成纤维细胞炎症 |
| 3.2 ADSCs来源外泌体对软骨细胞凋亡的影响 |
| 3.3 ADSCs来源外泌体对软骨细胞迁移的影响 |
| 3.4 自噬抑制对软骨细胞迁移的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脂肪来源干细胞对骨性关节炎的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注释表 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（6）Ars2介导miRNA调控急性髓系白血病细胞周期的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Ars2 在急性髓细胞白血病中的表达情况及对预后的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Ars2 调控急性髓细胞白血病细胞增殖及细胞周期 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 Ars2 调控AML细胞周期的分子机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Ars2 调控AML发病的体内实验研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Ars2与miRNAs在白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）鸭胚胎期腿肌发育不同阶段差异表达基因和miRNAs的筛选与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 骨骼肌的发育 |
| 1.1.1 胚胎期骨骼肌发育 |
| 1.1.2 出生后骨骼肌发育 |
| 1.2 调控骨骼肌发育的分子机制 |
| 1.2.1 调控骨骼肌发育的相关基因 |
| 1.2.2 调控骨骼肌发育的相关miRNAs |
| 1.2.3 禽类骨骼肌发育相关miRNAs研究现状 |
| 1.2.4 调控骨骼肌发育相关的信号通路 |
| 1.3 RNA-seq和miRNA-seq技术在畜禽研究中的应用 |
| 1.3.1 RNA-seq技术在畜禽研究中的应用 |
| 1.3.2 miRNA-seq技术在畜禽研究中的应用 |
| 1.4 本研究目的意义、内容与技术路线 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 鸭胚胎期腿肌发育特征研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 常用的分析软件 |
| 2.2.4 测定指标与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鸭胚胎发育过程中腿肌的重量变化分析 |
| 2.3.2 鸭胚胎发育过程中腿肌的形态变化分析 |
| 2.3.3 鸭胚胎期腿肌发育过程中MRFs家族主要基因的mRNA表达模式 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸭胚胎期腿肌发育不同阶段的调控机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验动物 |
| 3.2.2 主要试验试剂及仪器 |
| 3.2.3 常用生物学软件及数据库 |
| 3.2.4 RNA-seq试验流程 |
| 3.2.5 miRNA-seq试验流程 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RNA-seq结果及生物学功能分析 |
| 3.3.2 miRNA-seq结果及生物学功能分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 RNA-seq和miRNA-seq测序数据分析 |
| 3.4.2 调控鸭胚胎期腿肌发育的主要信号通路 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 miR-33a调控鸭成肌细胞增殖的机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 试验步骤 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 过表达miR-33a和干扰miR-33a的效率鉴定 |
| 4.3.2 过表达miR-33a和干扰miR-33a对鸭成肌细胞活性与增殖的影响 |
| 4.3.3 miR-33a对IGF-1,FST和CCND1的调控影响 |
| 4.3.4 miR-33a在调控成肌细胞增殖过程中对PI3K/Akt/mTOR通路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸭卵泡抑素调控成肌细胞增殖的机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2.3 试验步骤 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 过表达FST对鸭成肌细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 过表达FST对PI3K/Akt/mTOR通路上相关基因表达的影响 |
| 5.3.3 添加LY294002抑制剂和过表达FST对成肌细胞增殖的影响 |
| 5.3.4 添加LY294002抑制剂和过表达FST对PI3K/Akt/mTOR通路的影响 |
| 5.3.5 添加Rapamycin抑制剂和过表达FST对成肌细胞增殖的影响 |
| 5.3.6 添加Rapamycin抑制剂和过表达FST对PI3K/Akt/mTOR通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结 |
| 6.1 本研究的主要结果与结论 |
| 6.2 本研究的创新之处 |
| 6.3 还需要完善和解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（8）低能量冲击波和骨髓间充质干细胞对慢性环孢素肾病大鼠的治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 低能量冲击波治疗安全性检验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低能量冲击波对慢性环孢素肾病大鼠的治疗作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 低能量冲击波联合骨髓间充质干细胞治疗慢性环孢素肾病 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（9）人牙本质基质材料复合人骨髓间充质干细胞用于牙根再生的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语缩略词索引 |
| 引言 |
| 第一部分 人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 天然支架材料及诱导微环境的制备和构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 人牙本质基质材料复合人骨髓间充质干细胞体内、外实验的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 利用组织工程技术构建生物牙根的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（10）肿瘤干细胞促卵巢癌淋巴管生成及转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 卵巢癌干细胞的分离及生物学特征分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 卵巢癌干细胞与淋巴管内皮细胞共培养的实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 淋巴管内皮祖细胞对卵巢癌患者淋巴转移的影响研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 卵巢癌干细胞分离的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 SDF-1/CXCR4 与肿瘤的侵袭转移 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
四、在老鼠骨髓中发现干细胞（论文参考文献）
- [1]基于RNA-seq技术对肾虚血瘀型股骨头坏死差异基因筛选及生物信息学分析[D]. 黄林峰. 广州中医药大学, 2021
- [2]Navitoclax（ABT263）改善骨关节炎中炎症微环境和减轻软骨破坏的研究[D]. 杨昊. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [3]雷帕霉素改善铁蓄积高转换骨质疏松中“骨生成/血管形成”的基础研究[D]. 吴加东. 苏州大学, 2020(06)
- [4]VEGF-Ax对大鼠骨髓间充质干细胞成血管分化的调节作用及其促血管生成能力的研究[D]. 李建君. 南方医科大学, 2020(01)
- [5]脂肪干细胞来源外泌体对膝骨关节炎的疗效及作用机制的研究[D]. 赵晨. 苏州大学, 2020(06)
- [6]Ars2介导miRNA调控急性髓系白血病细胞周期的分子机制研究[D]. 胡晓烨. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [7]鸭胚胎期腿肌发育不同阶段差异表达基因和miRNAs的筛选与功能验证[D]. 李欣欣. 四川农业大学, 2018(02)
- [8]低能量冲击波和骨髓间充质干细胞对慢性环孢素肾病大鼠的治疗研究[D]. 张勇. 第二军医大学, 2017(11)
- [9]人牙本质基质材料复合人骨髓间充质干细胞用于牙根再生的研究[D]. 裴飞. 郑州大学, 2016(03)
- [10]肿瘤干细胞促卵巢癌淋巴管生成及转移的作用及机制研究[D]. 邱慧玲. 第三军医大学, 2013(11)