一、我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究（论文文献综述）
刘耀宝[1]（2017）在《不同地理株间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究》文中研究表明间日疟原虫（Plasmodiumvivax）是全球地理分布最为广泛的人体疟原虫种,也曾是我国疟疾流行区的主要疟原虫种。由于间日疟原虫具有独特的生物学特性,间日疟的控制和消除比恶性疟难度更大,在大多数恶性疟和间日疟混合流行地区,常发现在疟疾控制取得成效,疟疾发病率下降的同时,间日疟所占的比例却在增加,一些国家在恶性疟得到有效控制或消除后的几年甚至几十年内仍存在间日疟的流行。当前我国已进入消除疟疾阶段,虽然除云南边境地区外,我国大部分原疟疾流行地区已无本地感染疟疾病例,但我国每年由境外输入的疟疾病例超过3000例,其中输入性间日疟约占20%-25%。世界卫生组织消除疟疾的考核评估判定标准之一是“连续3年没有本地蚊媒传播的疟疾病例”,由于我国原主要疟疾流行区的媒介按蚊均能传播间日疟,因此在发现间日疟病例后,不仅需要判定其是否为输入性病例,还需要评估是否存在输入再传播风险的可能。目前,在我国消除疟疾行动计划中,输入性疟疾病例的判定仍依赖于个案流行病学调查,所有存在媒介按蚊地区发现的输入性间日疟疫点均认为有再传播风险,需要采取包括媒介控制在内的疫点处置措施。因此,探索研究判定间日疟原虫感染来源的分子鉴别技术和境外输入性疟原虫株与本地疟疾传播媒介之间的适配性（易感性）,并评估输入性疟疾病例引起本地继发传播的风险,对消除疟疾和消除后的防止输入再传播均具有重要意义。本研究结合我国消除疟疾阶段的实际需求,第一部分采用微卫星分子标记对我国中部和南部地区的间日疟原虫株进行了基因多态性和群体遗传学分析,并对我国与其它国家间日疟原虫株的基因型数据进行了比较分析,探索判定间日疟原虫感染来源的分子鉴别方法;第二部分通过对我国不同地区间日疟原虫株的Pvs47基因多态性和群体遗传学研究以及与东亚、东南亚和南美地区间日疟原虫株Pvs47基因序列的比较分析,为输入性间日疟引起本地传播风险评估提供科学依据。第一部分基于微卫星标记的间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究一、中国中部和南部地区间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构分析目的:对我国中部地区和南部地区间日疟原虫株的基因多态性和群体遗传结构进行分析,为建立间日疟原虫感染来源分子鉴别技术提供依据。方法:收集2007-2012年我国中部和南部间日疟流行区的间日疟原虫样本（n=236）,采用9个微卫星分子标记和毛细管电泳技术进行基因分型,利用亚太地区消除疟疾组织（Asia Pacific Malaria Elimination Network,APMEN）间日疟原虫基因型数据共享平台（VivaxGEN）进行数据处理,对间日疟原虫的多克隆感染情况、群体基因多态性、连锁不平衡水平和群体遗传结构进行分析。结果:1.南部地区间日疟原虫株多克隆感染比例（70.4%,38/54）高于中部地区（51.4%,93/181）,差异具有统计学意义（P<0.01）;南部地区间日疟原虫株的平均期望杂合度（HE=0.85±0.07）高于中部地区（HE=0.73±0.13）,差异具有统计学意义（P<0.01）;南部地区间日疟原虫株等位基因丰度（Rs=11.89）高于中部地区间日疟原虫株等位基因丰度（Rs=8.17）,差异具有统计学意义（P<0.01）;南部地区间日疟原虫株各微卫星位点的平均等位基因数和特有等位基因数均多于中部地区。2.中部地区间日疟原虫株（/AS=0.147,P<0.01）和南部地区间日疟原虫株（/AS=0.136,P<0.01）均存在明显的连锁不平衡,且中部地区高于南部地区。中部地区不同年份的间日疟原虫株也具有明显的连锁不平衡,且连锁不平衡水平从2008 年（IAS=0.137,P<0.01）、2009 年（/AS=0.190,P<0.01）到 2010 年（IAS=0.264,P<0.01）有逐年增加的趋势。3.STRUCTURE分析结果显示中部地区和南部地区的间日疟原虫株可分为多个遗传亚群。K=4时,ΔK值最大,中部地区群体遗传结构复杂,南部地区群体遗传结构较为单一。K=2时,南部地区92.59%（50/54）的虫株来源于遗传亚群2（pop2）,1.85%（1/54）的虫株来源于遗传亚群1（popl）,5.56%（3/54）的虫株为混合来源;中部地区43.09%（78/181）的虫株来源于遗传亚群1（pop1）,34.81%（63/181）的虫株来源于遗传亚群2（pop2）,22.1%（40/181）的虫株为混合来源。4.中部地区和南部地区之间的间日疟原虫株具有一定的群体遗传分化（FST=0.0696,P=0.00007）。中部地区2008年与2010年之间的间日疟原虫株群体遗传分化最大（FST=0.0389,P=0.012）,2008 与 2009 年（FST=-0.0001,P=0.422）,2009与2010年（FST=0.034,P 0.034）之间的遗传分化较小。5.进化树和主成份分析均显示中部地区和南部地区间日疟原虫株在遗传地位上有交叉。Mantel检验分析显示,中部地区间日疟原虫株的遗传距离与地理距离之间具有一定的相关性（r=0.08,P=0.036）,遗传距离与样本采集时间之间也具有一定的相关性（r=0.05,P=0.01）。结论:1.我国南部地区间日疟原虫株的基因多态性在个体水平（多克隆感染）和群体水平（期望杂合度）上均显着高于我国中部地区,与我国南部地区间日疟的流行强度高于中部地区的情况较为吻合。2.我国中部地区和南部地区的间日疟原虫株均具有明显的连锁不平衡,且南部地区的连锁不平衡水平低于中部地区,同样提示我国南部地区间日疟的流行强度高于中部地区。3.我国中部地区间日疟原虫株的群体遗传结构较为复杂,南部地区间日疟原虫株的群体遗传结构较为单一;中部地区和南部地区之间的间日疟原虫株具有一定的群体遗传分化;中部地区和南部地区间日疟原虫株在遗传地位上有交叉;中部地区间日疟原虫株之间的遗传距离具有一定的时空相关性。4.建立了我国中部地区和南部地区间日疟株微卫星基因型数据库,并纳入了亚太地区消除疟疾组织（APMEN）间日疟原虫基因型数据共享平台（VivaxGEN）,为进一步开展间日疟原虫感染来源分子鉴别技术的研究打下了基础。二、我国与其它国家间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构比较分析目的:对我国与其它国家间日疟原虫株的基因多态性和群体遗传结构进行比较分析,探索建立间日疟原虫感染来源分子鉴别技术。方法:通过国际合作,利用APMEN间日疟原虫基因型数据共享平台（VivaxGEN）,对埃塞俄比亚、伊朗、不丹、马来西亚、印度尼西亚、韩国、中国南部地区以及中国中部地区的间日疟原虫株进行基因多态性和群体遗传结构进行比较分析,并基于STRUCTURE和Weka软件对境外输入性间日疟病例进行感染来源分析。结果:1.不同国家之间的间日疟原虫株多克隆感染比例差异较大（4.2%-97.2%）,伊朗间日疟原虫株的多克隆感染比例最高（97.2%）,韩国间日疟原虫株的多克隆感染比例最低（4.2%）。中国中部地区和南部地区间日疟原虫株的多克隆感染比例均较高,分别为51.4%和70.4%。2.共发现78个特有等位基因,其中特有等位基因个数最多的为印度尼西亚（25个）,最少的为韩国（0个）,中国中部地区发现7个特有等位基因,中国南部地区发现10个特有等位基因。微卫星位点MS20的短片段等位基因（150bp）仅在中国和韩国的间日疟原虫样本中发现,其在韩国、中国中部地区和中国南部地区的等位基因频率分别为98.8%、60.9%和22.4%。3.群体遗传结构STRUCTURE分析结果显示,K=2时,间日疟原虫株的2个遗传亚群与间日疟原虫热带株和温带株的地理分布相吻合;K=4时,非洲虫株主要属于pop1,伊朗虫株主要属于pop2,不丹、马来西亚、印度尼西亚以及中国南部地区虫株主要属于pop3,中国中部地区和韩国的虫株主要属于pop4;K=6时,中国中部地区和韩国的间日疟原虫株也出现了遗传结构分化。进化树和主成份分析均发现,中国中部地区间日疟原虫株与韩国株的遗传距离相近,可聚为一类,但与非洲和东南亚的间日疟原虫株的遗传距离较远;我国南部地区间日疟原虫株与东南亚国家的间日疟原虫株之间的遗传距离较为接近。4.基于STRUCTURE分析,对30例输入性间日疟病例感染来源判定的平均符合率为85%。我国中部地区的间日疟原虫株与埃塞俄比亚间日疟原虫株可分为2个遗传亚群（pop1和和pop2）,埃塞俄比亚间日疟原虫株98.20%的遗传信息来自pop1,而中国中部地区间日疟原虫株的96.3%遗传信息来自pop2,5例有埃塞俄比亚旅行史间日疟病例均可判定为pop1来源。中国中部地区间日疟原虫株和东南亚（马来西亚和印度尼西亚）间日疟原虫株也可分为2个遗传亚群（pop1和pop2）,东南亚间日疟原虫株97.50%的遗传信息来自popl,中国中部地区间日疟原虫株94.20%的遗传信息来自pop2,10例有东南亚旅行史的间日疟病例中,9例可判定为pop2来源,判定准确率为90%。5.基于Weka分析,采用4个微卫星位点（MS8,MS10,MS16,MS20）对来自非洲、中东、南亚/东南亚和东亚4个地区的493例间日疟病例感染来源分类的符合率为90.47%,对中国中部地区和埃塞俄比亚的172例间日疟样本感染来源分类的符合率达99.42%;采用2个微卫星位点组合（MS8,MS20）对中国中部地区和东南亚的235例间日疟样本来源分类的符合率达98.70%。结论:1.首次发现我国中部地区存在间日疟原虫微卫星MS20位点短片段（150bp）等位基因,该间日疟原虫地理株特有等位基因可作为我国中部地区本地和输入性间日疟鉴别的分子标记。2.初步建立了以微卫星位点为基础的不同感染来源间日疟原虫分子鉴别技术。采用4个微卫星位点（MS8,MS10,MS16,MS20）对中国中部地区和非洲间日疟原虫感染来源鉴别的准确率达99.42%;采用2个微卫星位点（MS8,MS20）对中国中部地区和东南亚国家间日疟原虫感染来源鉴别的准确率达98.70%。第二部分间日疟原虫Pvs47基因多态性和群体遗传学研究目的:研究不同地区间日疟原虫株Pvs47基因多态性和群体遗传学特征,为输入性间日疟病例本地传播风险评估提供科学依据。方法:对我国中部地区、南部地区以及部分从东南亚国家输入的间日疟原虫株（n=212）进行Pvs7 基因测序,与 Genbank（n=76）和 PlasmoDB（n=68）数据库中已报道的间日疟原虫株Pvs47基因序列一起构建数据库,并进行基因多态性和群体遗传学分析。结果:1.对356例间日疟原虫株的Pvs47基因序列进行分析,共发现34个单核苷酸多态性位点。Pvs47平均核苷酸多样性指数π为0.0039,其中东南亚间日疟原虫株Pvs47的基因多态性最高（π=0.00424）,东亚间日疟原虫株Pvs47的基因多态性最低（π=0.00029）,我国中部地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平（π=0.00091）略高于东亚地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平（π=0.00029）,但明显低于我国南部地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平（π=0.00253）。2.东亚与南美间日疟原虫种群之间的遗传分化最大（FST=0.92,GST=0.60）,我国中部地区与东亚间日疟原虫种群之间的遗传分化最小（FST=0.06,GSt=0.04）。我国南部地区与东南亚间日疟原虫种群之间的遗传分化较小（FST=0.08,GST=0.03）,但我国中部地区与东南亚间日疟原虫种群之间的遗传分化较大（FST=0.37,GST=0.20）。3.共发现52个Pvs47DNA单体型和47个Pvs47氨基酸单体型。47个氨基酸单体型中,东南亚的单体型最多（28个）,东亚的单体型最少（3个）,中国中部和南部地区的单体型分别为12个和11个。每个间日疟原虫种群均存在特有氨基酸单体型（1-21个）,在频率大于1%的特有单体型中,东南亚1个（Hapaa40）,我国南部地区 1 个（Hapaa8）,南美 2 个（Hapaa1 和 Hapaa45）。Hapaa2 是我国中部地区和东亚的优势氨基酸单体型,分别占我国中部地区间日疟原虫株的80%（112/140）和东亚间日疟原虫株的95.1%（39/41）,而东南亚地区Hapaa2仅占3.0%（2/67）,我国南部地区Hapaa2占28.9%（13/45）,南美未发现Hapaa2。Hapaa1是南美的优势单体型,占南美间日疟原虫株的74.6%（47/63）,其它地区均未发现Hapaa1。4.遗传进化树分析显示,47个氨基酸单体型可分为2个主要的遗传进化枝。其中,进化枝1中的10个单体型主要在我国中部地区流行,进化枝2中的23个单体型主要在东南亚地区流行。7个在我国南部地区流行的单体型在2个进化枝中均有发现,1个东亚特有单体型与我国中部地区的单体型聚为一枝,4个南美特有单体型均位于进化枝2,且遗传地位相近。5.Network分析显示,Pvs47DNA单体型分布具有明显的地理来源聚集性。我国中部地区和东亚的单体型聚为一类,我国南部地区和东南亚的单体型聚为一类,南美的单体型聚为一类。结论:1.首次发现不同地区间日疟原虫株Pvs47基因的基因多态性和群体遗传结构存在明显差异,Pvs47单体型具有地理来源特异性。2.我国南部地区间日疟原虫株与东南亚间日疟原虫株的Pvs47基因遗传地位相近,单体型聚为一类,提示输入性间日疟原虫株与当地媒介的适配性强,近距离输入病例引发本地传播的风险较大。3.我国中部地区间日疟原虫株与东南亚等地区间日疟原虫株的Pvs47基因遗传地位较远,单体型具有地理来源特异性,提示输入性间日疟原虫株与当地媒介的适配性较差,远距离输入病例引发本地传播的风险较小,这可能是由东南亚国家和非洲输入的间日疟病例尚未在我国中部地区引起输入再传播的重要分子机制之一。
钟敏,蔺应学,王英[2]（2014）在《分子生物学技术在按蚊近缘种鉴定的应用进展》文中指出按蚊是传播疟疾等疾病的主要媒介生物,按蚊属包括几个甚至十几个近缘种组成的复合体,某些近缘种之间的形态极其相似,但其生态习性却明显不同,传病能力也有显着差异,因此正确进行蚊种鉴定对疾病预警等非常重要。单纯靠传统的形态学鉴定已不能满足按蚊近缘种和种内变异鉴别的需要,近年来,分子生物学技术在鉴定按蚊近缘种方面已成为研究的热点,本文就PCR技术、DNA探针、RAPD、RFLP、分子标志等分子生物学技术在按蚊近缘种鉴定的应用进展进行综述。
郑学礼[3]（2014）在《我国蚊媒研究概况》文中提出蚊类不仅吸血骚扰,而且传播多种严重疾病。本文就我国疟疾媒介鉴定及基因特征,登革热媒介白纹伊蚊基因特征与易感性做了综述,并就淋巴丝虫病媒介与乙脑媒介做了概要。
刘春晓[4]（2013）在《口岸蚊类信息化数据平台构建及其在实验室质控的应用》文中研究说明背景蚊传疾病（mosquito-borne diseases）在世界范围内的威胁日益严重。例如原本流行在非洲的西尼罗热,1999年-2012年在美国爆发流行；登革热、基孔肯雅热的流行区域也在不断扩大。WHO估计,每年感染登革病毒的人群可能达到1亿人。我国广东省每年都有登革热的流行,2010年我国东莞地区还爆发了输入性基孔肯雅热疫情。2008年全国各口岸共发现输入性传染病病例136例,其中输入性登革热病例85例,输入性基孔肯雅热病例5例,占输入性传染病病例总数的66%。大部分蚊传疾病,没有可靠的疫苗,也没有特异性治疗手段。蚊媒监测和控制就成为这些传染病防制的主要手段。蚊媒监测一方面可以了解媒介蚊虫的种群构成、密度大小、季节消长等；另一方面,还可以对蚊传疾病的流行进行预警。因此,国境口岸高度重视蚊媒监测工作,对口岸区域、出入境交通工具等进行了系统的监测。蚊虫传播传染病的能力有种属特异性。不同蚊种传播疾病的效能相差极大,有的不传播疾病,有的高度危险。因此,对蚊虫进行准确的分类鉴定,是蚊传疾病防制的基础。传统的形态学分类依赖鉴定者的主观判断,需要丰富的实践经验,往往需要十几年甚至数十年的积累才能成就一个形态学鉴定专家。大部分实验室缺乏经验丰富的形态学鉴定专家。目前蚊虫分类鉴定主要参考资料是工具书和检索表,但工具书使用的都是模式图,与镜下实际观测视觉差距较大。一些近似种和复合种团,形态差距细微,鉴定就更为困难,单纯依赖形态特点鉴定常常出现争议。口岸实验室对蚊虫分类鉴定的能力参差不齐。2005-2007年,全国口岸共捕获输入性蚊虫28.8万余只,针对部分港口的抽样调查发现,入境船舶蚊虫携带率高达18%-48%。但是这些上报数据中,有三分之一的蚊虫没有分类到种。目前,口岸蚊虫分类鉴定工作存在的问题主要有：专业人才缺乏、鉴定参考资料单一、鉴别能力参差不齐、监测数据没有包括关键的地理和生态信息、数据缺乏共享机制等；更重要的是,尚未建立一个质量控制体系来评估全国各口岸实验室分类鉴定的准确性。这些问题,在疾控系统各级病媒生物实验室也或多或少存在。研究目的1、建立高效的口岸蚊类辅助鉴定方法。研究开发图文并茂的电子化自助检索鉴定系统,改变目前鉴定参考资料单一的局面。2、探索建立基于基因的蚊类鉴定方法。研究从遗传本质上,基于基因对蚊虫进行分类鉴定的方法,提供基因鉴定检索。3、建立口岸蚊类信息化数据平台。通过平台实现数据共享,并能对监测数据自动化、智能化分析和预警,为决策提供支援。4、建立口岸蚊虫分类鉴定实验室质量控制体系。从实验室内部、实验室间两个角度对口岸实验室蚊虫分类鉴定工作进行质量控制。研究方法1、建立常见蚊类形态学数据库采集蚊幼虫,在实验室饲养、羽化,获得鉴定细节完整无缺的标本,经形态学权威专家分类鉴定,制作标准化实物标本。对实物标本的每一个鉴定细节进行高分辨图像采集,获得细节图片,并辅以详尽文字介绍,制作电子化标本。在低倍镜下对整只蚊标本进行多层级拍照,利用multi-focus image fusion技术进行多焦面图像合成,获得兼顾景深和清晰度的整体图片。利用DHTML技术对整体图片和细节图片进行准三维合成,制作常见蚊种的数字化标本。2、建立常见蚊类COI基因数据库探索利用蚊虫线粒体细胞色素氧化酶第一亚基（COI）基因序列鉴定我国常见蚊种的可行性。采集常见蚊种,利用通用引物,扩增COI基因序列,并测序。采用Biodeit软件对序列进行校正,利用MEGA5.0软件进行基因同源性比较和系统进化树分析。探讨COI基因作为我国常见蚊种分类依据的可行性。通过采集蚊种自行测定、基因条形码数据库（BOLD）匕对分析下载等方法,建立常见蚊种COI基因数据库。3、建立口岸蚊类信息化数据平台利用制作的电子化和数字化标本,借助Oracle数据库,基于J2EE技术搭建口岸蚊类信息化数据平台,研发多种形式的辅助鉴定方法。完善监测数据的地理信息、生态信息等,并对数据进行共享。利用GIS技术原理,设计分析模块,实现监测数据自动化、智能化分析。综合各监测点蚊类监测数据,以及相应的地理信息、生态信息等,利用空间分析、时间分析等方法进行预警。4、建立蚊虫分类鉴定实验室质控体系利用蚊虫的标准化实物标本作为鉴定工作的实物参考标准。利用电子化、数字化标本作为鉴定工作的数码参考标准。建立基于ISO:IEC17025的蚊虫鉴定实验室质量管理体系。利用制作的标准化实物标本,开展成蚊形态学鉴定实验室能力验证活动。研究结果1、常见蚊类形态学数据库制作了标准化实物标本11属59种,共2000余只蚊虫标本,涵盖了国境口岸常见的种类。蚊虫标本均由实验室饲养羽化的方法获得,并经权威形态学专家双人鉴定。制作了5属41种蚊的电子化标本,占国境口岸已发现种类的51%,涵盖了常见蚊种（种群构成超过1%）。电子化标本包括：每一个鉴别细节高清晰数码照片、相对应的准确详尽的文字描述；蚊种的生态习性、与传染病关系等资料。数字化标本的种类也是5属41种蚊虫。每种蚊虫建立一张准三维图片,整体视觉上与体视镜低倍视野下肉眼观测的图片无差异。点击任意鉴别细节,都可实现局部放大,出现该细节的高清晰实拍图。这是通过图像合成技术,调用预先在高倍镜下拍摄的图片实现的。2、常见蚊类COI基因数据库共测得常见14种40株成蚊COI基因序列,蚊虫采集自云南普洱、广东广州、广东深圳三地。序列分析表明,各蚊种COI基因扩增片断稳定,各株序列均无缺失,核苷酸长度为415bp。序列的A+T碱基含量范围为69.1%-71.5%,同蚊种不同地理株之间同源性介于97.5%-100%,不同种之间的同源性介于83.5%-93.7%。种内遗传距离介于0-2.5%,种间遗传距离介于6.6%-18.8%。基因聚类分析发现,同种不同地理株首先聚为一类,其次各属蚊种分别聚类,如库蚊属、伊蚊属、阿蚊属,再后是库蚊亚科的三个属聚类,按蚊亚科则聚类为不同的分支,和形态学分类相一致。对复合种团的近似蚊种也可以有效区分。表明使用该段序列对常见蚊虫分类可行。通过采集蚊种自行测定、基因条形码数据库（BOLD）比对分析下载等方法,建立了常见36种蚊种的基因化数据库,包括了复合种团。数据库内容包括核苷酸序列、实验方法、参考文献等部分。使用者可以根据数据库提供的方法进行序列测定,也可以查阅附后的参考文献进行测定。3、信息化数据库平台的建立利用数据库资源为核心,建立基于检验检疫系统内部网络的信息化数据平台,使得各口岸实验室可以方便访问。该平台提供4种辅助鉴定模式：①层级分类检索。采用二叉树式设计,结构层级来自我国蚊种检索表,每一个鉴定细节都配有实拍的高清晰图片和电子化介绍,与镜下观测的实物之间无差异,检测人员可以按照层级,逐步完成分类鉴定。②图片比对检索。选定数据库种中蚊虫鉴定细节图片,直接与待测蚊对比,快速缩小范围,进而确定具体种类。③特征检索。根据提示选定待测蚊的几个鉴别细节特征,在数据库中进行检索。通过检索定位到某些种、属,一一对比相应的标本图片及描述,完成鉴定。④基因检索。输入待测蚊种COI基因的全部或部分序列,系统自动比对,根据同源性从高到低,给出最相近3个种,并提供同源性比率。信息化数据库平台具有监测数据录入、监测点的地理和生态信息收集、数据分析、质量控制等功能；可对监测鉴定数据进行自动化、智能化分析,生成相应的分析图表,还可以结合地理信息、生态信息、监测数据进行空间预警,提供决策支援。利用信息化数据平台的分析思路,我们分析了广东省2001-2006年登革热疫情空间分布模式,表明广州市周边及潮汕地区是广东省登革热流行高发区,与其后的流行数据一致。信息化数据平台的辅助鉴定、数据分析等设计思路,得到了WHO专家的高度认可,将在此基础上搭建全球蚊类监测信息平台。WHO与国家质检总局已经签署初步合作协议。4、数据库在实验室质控的应用利用建立的实物标本、电子化和数字化标本作为实验室鉴定质控溯源依据,参照ISO:IE17025体系,在深圳国检局医学媒介生物实验室建立了质量控制体系,并通过了CNAS的评审,成为全国首家通过CNAS认可的同类实验室。利用制作的蚊虫标准化实物标本,作为盲样,对全国的同类实验室开展了“成蚊形态学鉴定能力验证”工作,这是我国首次开展该项工作。共有28家实验室参加,一次通过率为：85.7%。三种目标蚊种：中华按蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊鉴定总准确率为96.2%。四种干扰蚊种：骚扰阿蚊、埃及伊蚊、三带喙库蚊、微小按蚊鉴定总准确率：81.2%,其中微小按蚊鉴定准确率最低,为68.5%。对口岸部分实验室分发标准化标本,作为实验室鉴定工作的实物参考标准。信息化数据平台中的电子化标本、数字化蚊标本,作为口岸实验室鉴定工作的数码参考标准。数字化准三维标本还可作为盲样进行实验室在线鉴定比对,是实验室间质量控制的新手段。结论本研究为蚊媒准确鉴定及监测数据分析、实验室质控提供了系统的解决思路。以自行建立的蚊类鉴定相关数据库作为核心资源,搭建了“口岸蚊类信息化数据平台”。平台形成了一套图文并茂的常见蚊类鉴定指导资料,提供四种辅助鉴定模式,改变了目前单一的“检索表+模式图”的鉴定方式。该平台数据还可作为培训教材,提高各实验室鉴定工作的技术水平。更重要的是,数据库的图片均来自标准化标本,可以作为参考标准,对日常检测鉴定进行质量控制。通过实验研究,表明COI基因作为我国常见蚊虫分类依据可靠,对复合种团的近似种也能有效区分,但受样本数量限制,对复合种团的分类鉴定还需要进一步收集更多的样品进行确认。口岸蚊类信息化数据平台有蚊虫COI基因鉴定检索功能,从基因水平上为蚊虫鉴定提供了有效手段。基于口岸蚊类信息化数据平台建立的实验室质量控制体系可靠。以标准标本为核心建立的质控体系,通过了CNAS的认可。利用标准化标本,组织了我国首次蚊类形态学鉴定能力验证活动,一方面了解了同类实验室整体技术水平,另一方面也证明了标准化标本作为质控的可靠性。信息化数据平台集成了监测点的地理、生态数据,具有综合分析功能,可自动化、智能化分析,还可以进行预警,为决策提供依据。
林琳[5]（2011）在《应用微卫星DNA标志研究我国雷氏按蚊群体遗传结构》文中研究说明雷氏按蚊Anopheles lesteri Baisas & Hu 1936,隶属按蚊属（Genus Anopheles）、赫坎按蚊种团（An. hyrcanus group）,分布于菲律宾、中国、日本、韩国和关岛等地,就医学重要性而言,仅在我国中部具有较高的传疟效能。多年的调查显示,雷氏按蚊在我国不同地理分布区,生态习性和传病能力也存在一定差异,故亟待深入研究雷氏按蚊的群体的遗传差异。本研究应用分子特征首先鉴别我国的按蚊样本;在研究雷氏按蚊多态微卫星DNA位点特征的基础上,应用多态的微卫星DNA位点检测我国雷氏按蚊群体遗传结构。依据分子特征鉴别我国的按蚊样本,提高了准确性,在一定程度上补充和更新了各地按蚊的本地资料。雷氏按蚊不同群体的遗传差异程度,以及群体分化等问题的阐明,可望为制定媒介区的疟疾控制策略提供理论依据。课题研究策略如下:首先,对我国不同分布地的按蚊样本依据rDNA的2个标志,即ITS2和D3,进行分子鉴定;之后,对课题组已分离的雷氏按蚊微卫星DNA位点应用现场样本进行GENESCAN扫描,研究各位点的基本特征;应用获得的多态微卫星位点检测我国雷氏按蚊的群体内和群体间的遗传差异。取得如下主要结果:1.本研究分子鉴定的样本来自云南、湖北、贵州、河南、广东、山东、辽宁、陕西和海南共126个样本,序列分析结果显示包括:中华按蚊（An. sinensis）（n=44）、迷走按蚊（An. vagus）（n=22）、暗灰按蚊（An. pullus） （n=18）、微小按蚊（An. minimus）（n=13）、林氏按蚊（An. lindesayi）（n=10）、克莱按蚊（An. kleini）（n=4）、筠连按蚊（An. junlianensis）（n=4）、腹簇按蚊（An. kochi）（n=4）、比伦按蚊（An. belenrae）（n=3）、贵阳按蚊（An. kweiyangensis）（n=3）和乌头按蚊（An. aconitus）（n=1）。2.序列分析发现存在4类无法定名的种类,即LL1、LL2、LL3和LL4,除LL4外,其他3类均与赫坎按蚊种团成员种最为近似,应是该种团的新成员种。另外,在多种按蚊中发现个体内的碱基双峰现象,提示这些按蚊物种近期分化活跃,处于隐种形成中（speciation）。3.应用分子鉴定确认的雷氏按蚊现场57个样本,研究了雷氏按蚊11个多态微卫星DNA的基本特征,为进一步检测雷氏按蚊的群体遗传结构提供了新的分子标志。4.应用9个多态的微卫星DNA位点检测了采自我国17个,以及韩国1个采集地的雷氏按蚊样本共216个,各行政省份合并后成1个群体,将获得的9个群体进行后续分析。5.雷氏按蚊群体内遗传差异的分析结果可见,平均期望杂合度和观察杂合度的范围为0.4848（江苏）～0.7134（辽宁）和0.3309（江苏）～0.4704（韩国）;在辽宁群体中自有等位基因最多（9）,而云南群体无自有等位基因;近交系数范围为0.2101（海南）～0.5037（湖北）,平均为0.3508;经检验,总共30个位点偏离哈代-温伯格平衡,辽宁群体中的位点最多（7）,在韩国、云南和湖北群体无位点偏离;连锁不平衡的检验结果显示,存在连锁关联的共38对位点（P<0.01）,位点ANL10与ANL11在所有群体中均出现连锁关联,其他位点无规律。6.雷氏按蚊群体间遗传差异分析时去除江苏群体（实验室品系）,以及位点ANL11。分析结果可见,成对群体间的FST范围为-0.0127（辽宁与韩国）～0.2539（云南与海南）;Mantel检验结果显示群体间遗传差异与地理距离为正相关关系,群体遗传结构符合地理隔离模型;分子变异等级分析显示雷氏按蚊的变异主要存在于群体内,占总变异的86.55%,群体间的变异仅占总变异的13.45%;贝叶斯法的分析结果均显示所有群体可分为2个支,分支I包括广东和辽宁群体,分支II包括即韩国、河南、湖北、广东、海南和四川群体。7.雷氏按蚊群体的稳定性和规模的分析结果可见,河南、湖北、海南和辽宁共4个群体经历了近期群体的扩张;基于连锁不平衡模型,群体规模的范围为1.2（湖北）～33.7（广东）,总体的群体规模为44.6,95%置信区间为40.6～49.0。8.综合分析雷氏按蚊的群体遗传结构,可以推测雷氏按蚊的祖先群体来自云南,其他群体均为扩散而至,向北、东迁移和扩散,在途中定殖,为适应当地生态环境出现一定比例的变异。雷氏按蚊分布广泛,地理屏障虽在一定程度上阻碍基因的交流,但群体间差异并不大,群体遗传结构符合地理隔离模型（Isolation-by-distance Model）。因其在我国中部的医学重要性,故在分布地长期、大量使用杀虫剂,导致雷氏按蚊的群体数量较小,存在大量近交,偏离哈代-温伯格平衡的现象。
彭淑琼,刘春晓,赵纯中,徐云庆[6]（2010）在《分子生物学技术在蚊虫分类中的应用》文中进行了进一步梳理由于蚊虫中存在许多由形态相似的隐种组成的种团或复合体,沿用传统的方法对其分类和鉴别较为困难,因此,寻找合适的特征和方法成为新世纪蚊虫分类工作者研究的重点内容之一。分子鉴别是较为活跃的研究领域之一,它以遗传的本质DNA为依据来阐明物种间的差别,从分子水平上鉴别物种,具有客观、准确的特点,在蚊虫分类中广为应用。而应用分子标志研究群体遗传结构是近年来进展最为迅速的领域之一,目前公认mtDNA部分基因序列和微卫星DNA较为理想。
孙立新,吴汉霞,张荣波,丁永健,朱国强,杨庆贵,朱临[7]（2010）在《蚊分类鉴定研究进展》文中研究说明综述了蚊分类学研究进展,重点阐述了形态学、生物化学、细胞染色体技术和分子生物学技术等在蚊分类中的应用,文中指出采用各种不同的分类方法,才能多层次、多方面、系统地研究蚊虫分类鉴别,才能反映种间亲缘关系、分类进化的全貌,才能够更客观、更科学地进行蚊虫分类鉴别。
张晨昊,杨毅梅[8]（2009）在《分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用》文中指出寄生虫在生物学上有差异的亚种和株具有不同的致病性,其分类学对于寄生虫病的病原学、流行病学和防治等方面具有实际意义。DNA分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记,具备多态性高、无基因多效性、能够明确辨别等位基因等优点。本文综述第1代（限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA等）、第2代（微卫星锚定PCR、简单重复序列间扩增等）和第3代（单核苷酸多态性）分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用。
林岩[9]（2009）在《白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性研究及登革热流行因素的Logistic回归分析》文中研究说明【目的】研究福建省不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2基因序列特征及分析福建省登革热流行的影响因素,并探讨不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性,为进一步了解登革热流行的危险因素以及登革热防制提供依据。【方法】在闽东福鼎市、闽北武夷山市、闽中涵江区和闽南东山县分别现场采集5个点的白纹伊蚊幼虫,实验室饲养,收集羽化成蚊,用75%酒精-20℃保存,PCR特异扩增白纹伊蚊rDNA ITS2,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性的分析。选择福建省不同地区35个村（点）为调查点,设计登革热流行病学调查表,就调查点的地理环境类型、人口密度、往返东南亚地区的流动人口、白纹伊蚊幼虫密度、防蚊设施使用率、输入性登革热病例6项杜会因素和自然因素进行Logistic回归分析。【结果】1.PCR特异扩增福建省四个不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2,在琼脂凝胶电泳上获得500bp左右的扩增片段。序列分析福建不同地理环境的白纹伊蚊在rDNA ITS2表现了基因的多态性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,而同一地理环境的5只白纹伊蚊rDNA ITS2基因序列没有差异。2.Logistic回归分析福建省登革热流行因素,白纹伊蚊幼虫密度、输入性登革热病例和往返东南亚地区的流动人口3个变量被选入回归方程,其相对危险度分别为7.25、9.83和5.64。【结论】不同地理环境白纹伊蚊在rDNA ITS2区表现了基因的多态性,可能与经纬度、海拔高度、气温、降雨量和湿度等有一定的关系。登革热在有往返东南亚地区流动人口,有登革热输人病例,且白纹伊蚊幼虫密度高的地区发生的危险性大,这为制定科学的登革热防制措施提供了依据。
孙恩涛,张锡林,秦志辉[10]（2007）在《媒介按蚊遗传标记的研究进展》文中进行了进一步梳理按蚊是疟疾、丝虫病和多种虫媒病毒病的传播媒介。按蚊种团、复合体内的近缘种在生态习性、媒介效能和对化学杀虫剂的敏感性等方面均存在一定差异。因此按蚊种团、复合体的分类鉴定与遗传多态性研究受到广泛关注。多线染色体的研究,对按蚊分类鉴定的发展起着积极作用,而多种分子标记为按蚊系统发育和种群遗传学的研究提供了新方法。目前,分子标记已从经典分子标记和高度多态性分子标记发展到基因组DNA单核苷酸多态性的检测和鉴定。笔者综述了近年来按蚊遗传标记的国内外研究进展。
二、我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究（论文提纲范文）
（1）不同地理株间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 基于微卫星标记的间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究 |
| 一、中国中部和南部地区间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 二、我国与其它国家间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构比较分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 间日疟原虫Pvs47基因多态性和群体遗传学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:分子流行病学在消除疟疾监测中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 本文使用的缩略词表 |
| 附录 |
| 本课题得到的基金资助 |
| 致谢 |
（2）分子生物学技术在按蚊近缘种鉴定的应用进展（论文提纲范文）
| 1 聚合酶链反应技术 |
| 2 DNA探针技术 |
| 3 随机引物扩增多态性DNA |
| 4 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术 |
| 5 分子标志 |
| 5.1 mt DNA-COI |
| 5.2 r DNA-ITS2 |
| 5.3 微卫星DNA |
| 6 结语 |
（3）我国蚊媒研究概况（论文提纲范文）
| 1疟疾媒介研究 |
| 2淋巴丝虫病媒介研究 |
| 3登革热媒介研究 |
| 4流行性乙性脑炎(JE)媒介研究 |
| 5问题与展望 |
（4）口岸蚊类信息化数据平台构建及其在实验室质控的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 国境口岸蚊类标本数据库的建立 |
| 1. 背景 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 实物标准化标本的制作 |
| 2.2 实物标本的电子化 |
| 2.3 数字化标本的制作 |
| 2.4 质量控制 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 实物化蚊类标本库 |
| 3.2 电子化蚊类标本库 |
| 3.3 数字化蚊类标本库 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 国境口岸开展蚊媒监测的重要性 |
| 4.2 国境口岸蚊媒监测中的问题 |
| 4.3 蚊类实物标本库的建立 |
| 4.4 电子化与数字化标本 |
| 第二章 常见蚊类COI基因数据库的建立 |
| 1. 背景 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 常见蚊类COI基因序列测定方法 |
| 2.2 常见蚊类COI基因数据库的建立 |
| 2.3 质量控制 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 COI基因序列扩增 |
| 3.2 同源性比较和系统进化树 |
| 3.3 基因化数据库 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 基因鉴定方法的筛选 |
| 4.2 蚊种的采集 |
| 4.3 基于COI基因序列蚊虫分类 |
| 4.4 蚊种COI基因数据库 |
| 第三章 信息化数据平台的建立 |
| 1. 背景 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 用户需求收集 |
| 2.2 网络平台开发 |
| 2.3 网络平台调试 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 信息化平台架构 |
| 3.2 信息化平台的主要内容和功能 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 电子信息平台建设 |
| 4.2 自助鉴定平台 |
| 4.3 监测数据与分析 |
| 4.4 基于GIS的空间预警探讨 |
| 4.5 兼容性和可拓展性 |
| 第四章 数据库在实验室质控的应用 |
| 1. 背景 |
| 2. 蚊形态学鉴定实验室质控体系的建立 |
| 2.1 实验室质量控制方法 |
| 2.2 蚊类形态学鉴定实验室质量控制 |
| 3. 蚊类形态学鉴定实验室能力验证活动的开展 |
| 3.1 蚊类鉴定实验室能力验证活动的意义 |
| 3.2 能力验证活动的设计与实施 |
| 3.3 能力验证活动结果 |
| 3.4 技术分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 实验室内部质量控制 |
| 4.2 实验室间质量控制 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 博士期间取得的主要成果 |
| 致谢 |
| 统计合格证明 |
（5）应用微卫星DNA标志研究我国雷氏按蚊群体遗传结构（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、雷氏按蚊的分类地位 |
| 二、雷氏按蚊的生物学 |
| 三、微卫星 DNA 检测按蚊群体遗传结构 |
| 四、雷氏按蚊的分子群体遗传结构 |
| 五、本课题的研究内容和意义 |
| 第一部分:应用核糖体 DNA 序列分子鉴定我国的按蚊样本 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果和讨论 |
| 四、结语 |
| 第二部分 雷氏按蚊多态微卫星 DNA 位点的特征研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 四、结语 |
| 第三部分 应用多态微卫星 DNA 位点研究我国雷氏 按蚊群体遗传结构 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果与讨论 |
| 四、结语 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）分子生物学技术在蚊虫分类中的应用（论文提纲范文）
| 1 分子标志 |
| 1.1 核糖体DNA (rDNA) |
| 1.1.1 rDNA-ITS2 |
| 1.1.3 rDNA-28S |
| 1.2 线粒体DNA (mtDNA) |
| 1.3 微卫星DNA |
| 1.4 其他 |
| 2 PCR和基因测序技术 |
| 3 RAPD技术 |
| 4 PCR-RFLP技术 |
| 5 DNA探针技术 |
（7）蚊分类鉴定研究进展（论文提纲范文）
| 1 形态学分类鉴定 |
| 2 生物化学分类鉴定 |
| 3 细胞染色体分类鉴定 |
| 4 分子生物学分类鉴定 |
| 4.1 DNA探针技术 |
| 4.2 PCR技术 |
| 4.3 RAPD技术 |
| 4.4 RFLP技术 |
| 5 结论 |
（8）分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用（论文提纲范文）
| 1 分子标记技术的发展 |
| 1.1 第1代分子标记技术 |
| 1.2 第2代分子标记技术 |
| 1.3 第3代分子标记技术 |
| 2 原虫 |
| 2.1 婴儿利什曼原虫 (Leishmania infantum) |
| 2.2 阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis) |
| 2.3 弓形虫 (Toxoplasma) |
| 2.4 微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum) |
| 2.5 间日疟原虫 (Plasmodium vivax) |
| 3 吸虫 |
| 3.1 片形吸虫 (Fasciola) |
| 3.2 福建棘隙吸虫 (Echinochasmus fujianensis) |
| 3.3 血吸虫 (Schistosoma) |
| 3.4 并殖吸虫 (Paragonimus) |
| 3.5 毛毕属吸虫 (Trichobilharzia) |
| 4 绦虫 |
| 4.1 细粒棘球绦虫 (Echinococcus granulosus) |
| 4.2 带绦虫 (Taenia) |
| 5 线虫 |
| 5.1 对盲囊线虫 (Contracaecum) |
| 5.2 蛔虫 (Ascaris) |
| 5.3 马来丝虫 (Brugia malayi) |
| 5.4 旋毛虫 (Trichinella spiralis) |
| 6 节肢动物 |
| 6.1 蚊 |
| 6.2 蜱 |
| 7 问题与展望 |
（9）白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性研究及登革热流行因素的Logistic回归分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 白纹伊蚊rDNA ITs2 基因多态性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 登革热流行因素的Logistic 回归分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
（10）媒介按蚊遗传标记的研究进展（论文提纲范文）
| 1 传统遗传标记 |
| 1.1 细胞遗传学 |
| 1.2 同工酶的研究 |
| 2 经典的遗传标记 |
| 2.1 线粒体DNA (mtDNA) |
| 2.2 核糖体DNA (rDNA) |
| 3 高度多态性遗传标记 |
| 3.1 微卫星DNA (Microsatellite DNA) |
| 3.2 随机扩增多态性DNA (RAPD) |
| 3.3 单核苷酸多态性 (SNPs) |
| 4 结语 |
四、我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究（论文参考文献）
- [1]不同地理株间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究[D]. 刘耀宝. 苏州大学, 2017(06)
- [2]分子生物学技术在按蚊近缘种鉴定的应用进展[J]. 钟敏,蔺应学,王英. 中国热带医学, 2014(12)
- [3]我国蚊媒研究概况[J]. 郑学礼. 中国病原生物学杂志, 2014(02)
- [4]口岸蚊类信息化数据平台构建及其在实验室质控的应用[D]. 刘春晓. 南方医科大学, 2013(03)
- [5]应用微卫星DNA标志研究我国雷氏按蚊群体遗传结构[D]. 林琳. 第二军医大学, 2011(09)
- [6]分子生物学技术在蚊虫分类中的应用[J]. 彭淑琼,刘春晓,赵纯中,徐云庆. 中国国境卫生检疫杂志, 2010(03)
- [7]蚊分类鉴定研究进展[J]. 孙立新,吴汉霞,张荣波,丁永健,朱国强,杨庆贵,朱临. 中国国境卫生检疫杂志, 2010(02)
- [8]分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用[J]. 张晨昊,杨毅梅. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2009(03)
- [9]白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性研究及登革热流行因素的Logistic回归分析[D]. 林岩. 福建医科大学, 2009(10)
- [10]媒介按蚊遗传标记的研究进展[J]. 孙恩涛,张锡林,秦志辉. 中国媒介生物学及控制杂志, 2007(04)