一、胃针麻手术中肌间神经丛内三磷酸腺苷酶活性的组织化学观察（论文文献综述）
金婷婷[1]（2021）在《钙离子敏感受体激动剂R568对小鼠胃运动和摄食的影响及潜在机制探讨》文中提出目的:随着生活节奏的加快,人们饮食结构的改变,代谢性疾病的发病率逐年递增。肥胖,糖尿病,胃肠动力障碍等成为困扰人们的普遍问题。因此,深入探讨摄食,胃肠功能的调节机制将有助于我们寻找靶点,更有效地治疗代谢性疾病。已有的研究显示,钙离子敏感受体（Calcium sensing receptor,CaSR）表达于胃肠道内分泌细胞及肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）,对胃肠道内液体和电解质转运起着重要作用,在胃肠运动调控方面的作用也日渐被重视。因此,本研究旨在观察钙离子敏感受体激动剂R568对小鼠胃运动和摄食的调节作用并探讨其潜在机制。方法:R568灌胃对胃排空作用及机制探讨1.采用酚红排泄实验,观察给予不同浓度钙离子敏感受体激动剂R568灌胃及预先给予钙离子敏感受体阻断剂NPS-2143再给R568对小鼠胃排空的影响。2.采用荧光免疫组织化学染色方法,观察胃肌间神经丛CaSR与一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,nNOS）/胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）的共表达以及R568灌胃对ChAT神经元和nNOS神经元表达的影响。3.采用酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法,观察R568灌胃对小鼠去粘膜层的胃组织中乙酰胆碱（Acetylcholine,Ach）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）表达量的影响。4.采用辣椒素阻断迷走传入神经,观察迷走传入在R568调节胃排空中的作用。5.采用荧光免疫组织化学染色方法,观察R568灌胃对孤束核（Nucleus of the solitary tract,NTS）中 c-fos 表达的影响。6.采用ELISA方法,观察R568灌胃对小鼠血清及胃组织中胃泌素含量的影响。R568对胃平滑肌条作用及机制探讨7.采用离体平滑肌条收缩实验方法,观察R568对胃体、胃窦肌条收缩的影响;预先分别以NPS-2143、M受体阻断剂阿托品、一氧化氮合酶抑制剂N’-硝基-L-精氨酸（L-NAME）、阿托品+L-NAME或Na+通道阻滞剂河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）孵育肌条,再观察R568的效应,分析R568影响平滑肌收缩的潜在机制。8.采用荧光免疫组织化学染色方法,观察胃体、胃窦ENS内CaSR表达的情况。9.采用荧光免疫组织化学染色方法,观察CaSR与c-kit（ICC-MY）是否共表达。10.采用细胞内记录方法,观察R568对Cajal细胞（ICC-MY）放电频率和幅度的影响。R568灌胃对摄食的影响及机制探讨11.采用摄食分析法,观察R568单独灌胃或预先给予NPS-2143或缩胆囊素受体拮抗剂（L-364,718）再给R568对小鼠摄食量的影响。12.采用ELISA方法,观察R568灌胃对小鼠血清和胃组织中胃饥饿素（Ghrelin）、血清和近端小肠中胆囊收缩素（Cholecystokinin,CCK）、血清和远端小肠中酪酪肽（Peptide YY,PYY）及胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）含量的变化的影响。13.采用荧光免疫组织化学染色方法,观察R568灌胃对下丘脑室旁核（Paraventricular nucleus,PVN）,外侧区（Lateral hypothalamus,LHA）,弓状核（Arcuate nucleus,ARC）中 c-fos 表达的影响。结果:R568灌胃对胃排空作用及机制1.R568灌胃对胃排空的影响:研究结果显示,灌胃1.5 μg/g,3.0 μg/g,6.0 μg/g或12μg/g R568,小鼠的胃排空率呈剂量依赖性降低（P<0.05～0.01）。与3.0μg/g R568组相比,预先给予20μg/g NPS-2143再给R568,R568对胃排空的抑制作用被完全阻断（P<0.05）。本研究选择3.0 μg/g R568（ED50）用于后续实验。2.R568灌胃对小鼠ENS神经元表达的影响:荧光免疫组织化学染色研究结果显示,在小鼠胃肌间神经丛可观察到有CaSR免疫反应阳性神经元的表达;进一步研究发现,肌间神经丛内有部分CaSR免疫反应阳性神经元与nNOS或ChAT共表达。与对照组相比,R568灌胃后胃窦肌间神经丛内ChAT免疫反应阳性神经元的数目显着减少（P<0.01）,nNOS免疫反应阳性神经元表达的数目显着增加（P<0.05）。3.R568灌胃对小鼠体内Ach/NO表达量的影响:ELISA研究结果显示,与对照组相比,R568灌胃后胃体Ach、NO含量无明显差异（P>0.05）;而胃窦Ach的含量显着降低（P<0.01）,NO的含量显着增高（P<0.05）。4.辣椒素阻断迷走传入神经对R568抑制小鼠胃排空的影响:研究结果显示,辣椒素可以部分阻断R568对小鼠胃排空的抑制作用（P<0.05）。5.R568灌胃对小鼠NTS内c-fos表达量的影响:荧光免疫组织化学染色研究结果显示,与对照组相比,R568灌胃可以显着增加NTS内c-fos的表达（P<0.05）。6.R568灌胃对小鼠血清和胃组织中胃泌素表达量的影响:ELISA研究结果显示,与对照组相比,R568灌胃后血清和胃组织中胃泌素含量均显着增加（P<0.05）。R568灌胃对胃平滑肌条作用及机制7.离体平滑肌条收缩研究显示:R568对胃体肌条收缩无明显的作用（P>0.05）;R568能够抑制胃窦平滑肌条的收缩且呈剂量依赖性（P<0.05～0.01）;若预先以NPS-2143孵育胃窦平滑肌条,可完全阻断R568对其的抑制效应（P<0.01）;若预先以L-NAME孵育胃窦平滑肌条,R568对其抑制效应可被部分阻断（P<0.05）;预先以阿托品孵育胃窦平滑肌条,R568对其抑制效应仍存在（P<0.01）;预先阿托品+L-NAME孵育平滑肌条,可部分阻断R568对其抑制效应（P<0.05）;预先孵育TTX,R568对胃窦肌条收缩的抑制效应减弱（P<0.01）。8.小鼠胃体和胃窦ENS内CaSR的表达:荧光免疫组织化学染色方法研究显示,胃体ENS内CaSR含量明显低于胃窦ENS内CaSR含量（P<0.01）。9.R568对胃ICC兴奋性的影响:荧光免疫组织化学染色结果显示,在小鼠胃肌间神经丛可观察到c-kit免疫阳性细胞与部分CaSR免疫阳性细胞共表达。与对照组相比,R568孵育后,ICC放电频率和幅度均显着降低（P<0.01）。R568灌胃对摄食的影响及机制10.摄食研究显示,与对照组相比,R568灌胃小鼠0-1 h、1-2 h摄食量显着降低（P<0.01）。与R568灌胃组相比,R568+L-364,718组小鼠0-1 h,1-2 h摄食量显着增加（P<0.05）;NPS-2143+R568组小鼠0-1 h,1-2 h摄食量显着增加（P<0.05）。11.R568灌胃对小鼠血清和胃组织中Ghrelin,血清和近端小肠中CCK,血清和远端小肠中PYY及GLP-1含量的影响显示,与对照组相比,R568灌胃后血清、胃组织中Ghrelin显着降低（P<0.05,P<0.01）;血清和近端小肠CCK的含量显着增高（P<0.05,P<0.01）;而血清和远端小肠中PYY和GLP-1无明显变化（P>0.05）。12.R568灌胃对小鼠下丘脑摄食相关核团c-fos免疫阳性神经元表达的影响:荧光免疫组织化学染色方法研究显示,与对照组相比,R568使小鼠下丘脑PVN,LHA,ARC中c-fos免疫阳性神经元数目显着增多（P<0.01）。结论:胃肠道CaSR激活后抑制小鼠胃排空和胃窦平滑肌条收缩。胃排空的抑制和ENS胆碱能系统的抑制及氮能系统激活密切相关;该作用还和CaSR激活引起的迷走中枢兴奋有关。胃窦平滑肌条的抑制除了和ENS胆碱能系统抑制及氮能系统激活有关外还和抑制起搏Cajal细胞兴奋性有关。CaSR激活后抑制小鼠短时间内的摄食。其对摄食的抑制和降低Ghrelin的分泌,增加CCK的分泌以及调控下丘脑PVN/LHA/ARC内神经元的兴奋性相关。我们的研究可进一步完善能量代谢平衡理论,为临床治疗能量代谢紊乱相关疾病提供研究基础。
秦小腾[2]（2019）在《Gsα在平滑肌功能障碍疾病中的作用和机制研究》文中提出1研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是较为常见的大动脉慢性退行性病变,由于腹主动脉管壁发生损伤或病变而造成正常结构的破坏,在血流冲击下腹主动脉局部膨出,如腹主动脉直径超过正常值的1.5倍或超过3cm时,即可诊断为AAA。AAA的年发病率大约为20-40/10万人,在美国每年大约有1 1000人死于AAA。性别、年龄、吸烟和遗传因素等是AAA的主要危险因素,在74岁-84岁年龄段的人群中,约有12.5%的男性与5.2%的女性患有AAA。超过50%的AAA患者因腹背撕裂样疼痛而就医诊断为AAA破裂,此类患者的死亡率超过80%。目前AAA的治疗以手术和介入治疗为主,缺乏有效的药物治疗。因此深入探索AAA发病的分子机制,是寻找有效的药物治疗靶点的关键。AAA的主要病理学特征包括腹主动脉中层弹力板断裂或缺失、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）数量减少或功能异常、炎症细胞浸润等。AAA的主要分子机制包括细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）（主要是弹力蛋白和胶原蛋白）合成/降解失衡、氧化应激、血管新生、炎症因素以及VSMCs的凋亡、坏死和表型转化等。与其他终末分化的细胞不同,平滑肌细胞具有很强的可塑性。成熟的VSMCs主要表现为收缩表型,表达多种收缩型蛋白如平滑肌肌动蛋白α（alpha smooth muscle Actin,α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重链（smooth Muscle myosin heavy chain,SMMHC）、SM22等。当血管遭受损伤刺激时,收缩型的VSMCs会激活其增殖、迁移和合成的能力,表达上调多种合成型蛋白如波形蛋白（Vimentin）、骨桥蛋白（Osteopontin）等,同时收缩型蛋白的表达显着下降,我们将VSMCs的上述改变称为平滑肌细胞表型转化（smooth muscle cell phenotypic swtich）。平滑肌细胞表型转化与AAA密切相关,例如,编码α-SMA蛋白的ACTA2基因的突变会引起人类家族性胸主动脉瘤的形成和破裂;利用ACTA2敲基因小鼠进一步证实这一结果可能与NF-κB依赖的AngⅡ敏感性增高有关;另有研究分别利用AngⅡ和CaC12诱导小鼠AAA模型,结果显示平滑肌细胞特异性敲除SM22α会显着增大AAA的最大直径及动脉中层弹力板的降解程度,而过表达SM22α则与之相反。由此可见,VSMCs的收缩表型对于维持血管正常功能有重要意义。多种信号分子如KLF4、SRF、SP1、TGF-β1参与调控平滑肌细胞的表型,其中KLF4作为调控平滑肌细胞表型转化的关键分子受到广泛关注。一方面KLF4能够直接抑制α-SMA、SM22α和SMMHC启动子的转录活性;另一方面,KLF4可以竞争性抑制SRF与平滑肌细胞α-SMA、SM22α和SMMHC的基因启动子结合,并抑制SRF的辅助因子心肌素（Myocardin）的表达,从而参与平滑肌细胞表型转化的调控。KLF4通过调控平滑肌细胞表型转化广泛参与了 AAA、动脉粥样硬化、动脉钙化、血管内膜增生等众多疾病进程。KLF4与AAA关系十分密切,在小鼠和人AAA的平滑肌组织中,KLF4的表达含量均明显增高;动物实验研究发现KLF4能够通过调控平滑肌细胞表型转化,促进AAA的形成;而小鼠平滑肌细胞特异性敲除KLF4后,AAA的最大直径和弹力板的断裂程度均明显下降。Gsα是指G蛋白s家族的α亚基,广泛表达于多种细胞类型。Gsα主要通过激活腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase,AC）,增加第二信使环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,cAMP）的水平,从而激活PKA信号通路发挥其生理功能。Gsα功能失调与许多疾病密切相关,例如脂肪细胞特异性Gsα敲除小鼠表现为纤瘦的表型,耐寒性受损并且饮食诱导的产热增加;心肌细胞过表达Gsα的转基因小鼠表现为心肌收缩力显着增强,然而该小鼠随着年龄增长表现为心肌肥厚。我们的前期研究发现,平滑肌细胞特异性敲除Gsα能够导致小鼠慢性假性肠梗阻（Chronic intestinal pseudo-obstruction,CIP）的表型,小鼠肠道平滑肌α-SMA,SMMHC蛋白表达水平下降。然而Gsα调控平滑肌细胞表型转化的研究十分有限,Gsα是否通过影响平滑肌细胞表型调控的关键分子KLF4,进而调节平滑肌细胞表型转化和影响小鼠AAA进程尚不清楚。综上本研究提出如下假说:小鼠平滑肌细胞特异性敲除Gsα后,通过上调KLF4信号通路导致主动脉VSMCs从收缩表型向合成表型转化,从而加剧AngⅡ诱导的AAA的形成。本研究将通过构建平滑肌细胞特异性敲除Gsα的敲基因小鼠,利用皮下泵入AngⅡ的方法构建小鼠AAA模型,探究Gsα敲除对小鼠VSMCs表型转化和AAA的作用及机制,为临床上寻找AAA可能的药物治疗靶点提供实验数据支持。2研究目的（1）探讨Gsα在调控小鼠主动脉平滑肌细胞收缩表型中的作用及机制;（2）探究主动脉平滑肌Gsα在AngⅡ诱导的小鼠AAA模型中的作用及机制。3研究方法3.1构建平滑肌细胞特异性Gsα敲除小鼠将Gsαflox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠交配,F1代相互杂交得到Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠。该小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen（1mg/d）,即可在平滑肌细胞中特异性敲除Gsα,该小鼠命名为GsαSMKO小鼠。将Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠与ApoE-/-小鼠交配,F1代相互杂交得到ApoE-/-/Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠。该小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen（1mg/d）,即可在平滑肌细胞中特异性敲除Gsα,该小鼠命名为ApoE-/-/GsαSMKO双敲小鼠。使用Bimake鼠尾直接PCR试剂盒提取小鼠基因组DNA,PCR扩增Gsα、Cre和ApoE序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。3.2细胞实验采用贴块法提取小鼠原代主动脉平滑肌细胞,选用4-6代细胞进行实验。（1）KLF4 mRNA稳定性实验:原代主动脉平滑肌细胞分别转染GFP腺病毒和HuR过表达腺病毒,加入放线菌素D抑制转录,检测Oh、0.5h、1h和1.5h KLF4 mRNA含量,绘制曲线计算半衰期。（2）使用HuR的抑制剂CMLD-2刺激原代主动脉平滑肌细胞。（3）HuR siRNA转染:对照组和GsαSMKO小鼠的原代主动脉平滑肌细胞,分别转染CTR siRNA和HuR siRNA。（4）KLF4 siRNA转染:对照组和GsαSMKO小鼠的原代主动脉平滑肌细胞,分别转染CTR siRNA和KLF4 siRNA。（5）对照组和GsαSMKO小鼠的原代主动脉平滑肌细胞分别用PBS和AngⅡ（0.5μM）刺激25min。（6）RIP实验:在小鼠原代主动脉平滑肌细胞中验证HuR蛋白与KLF4 mRNA结合。3.3建立小鼠AAA模型10周龄ApoE-/-/Gsαflox/flox和ApoE-/-/GsαSMKO雄性小鼠分为以下四组:1)ApoE-/-/Gsαflox/flox+Saline组;2)ApoE-/-/Gsαflox/flox+AngⅡ组a;3)ApoE-/-/GsαSMKO+Saline组;4)ApoE-/-/GsαSMKO+AngⅡ组。其中,2)和4)组小鼠以皮下植入微量泵的方式泵入AngⅡ（1.44mg/kg/d）;1)和3)组皮下泵入生理盐水。所有小鼠从埋泵前两周进行高脂饲养,直至取材。3.4 Western blot检测 Gsα、HuR、KLF4、α-SMA、SM22、SMMHC、Calponin、Vimentin、Osteopontin、MMP2、Fibronectin、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ、P65、p-P65、GAPDH和β-actin蛋白水平的表达。3.5 RT-PCR检测Gsα HuR、KLF4、α-SMA、SMMHC、Vimentin、Osteopontin、TGF-βl、E-selectin、IL-6、IL-17C、ICAM-1、TNF-α、CCL-2、GAPDH和β-actin的mRNA表达水平。3.6组织病理学检测（1）取材对照小鼠和GsαSMKO小鼠的主动脉。HE染色观察血管结构;免疫荧光检测小鼠主动脉中Gsα和a-SMA的表达;免疫组化检测KLF4、HuR、α-SMA、Vimentin、SMMHC、Osteopontin的表达。（2）免疫组化检测对照组与AAA小鼠主动脉中Gsα的表达。（3）取材AAA实验中的四组小鼠,拍照大体主动脉照片。HE染色观察血管结构;VVG染色观察弹力板断裂并进行评分;免疫组化检测CD68、4-HNE、MMP2、Vimentin、Osteopontin的表达。3.7检测cAMP水平使用Enzo Life Science公司的Direct cAMP ELISA kit检测主动脉组织中cAMP水平。3.8临床AAA标本患者AAA标本来自于需要手术治疗的患者术中切除的AAA组织,对照组来自于同一患者术中切除的病变部位临近的非AAA主动脉组织。免疫组化检测对照组与AAA患者主动脉平滑肌中Gsα、α-SMA、KLF4和HuR的蛋白表达。3.9统计学分析统计数据采用均数±标准误（mean±SEM）表示,首先对数据进行正态分布检验,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间两两均数比较采用单因素方差分析。P<0.05认为统计数据有显着性差异。4实验结果4.1构建平滑肌细胞特异性敲除Gsα的敲基因小鼠并检验其敲除效率我们将Gsαflox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠杂交以产生F1代Gsαflox+/Cre+小鼠,Fl代相互杂交得到Gsαflox/flox/Cre+小鼠。该小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen,即可在平滑肌细胞中特异性敲除Gsα,该小鼠命名为GsαSMKO小鼠。同窝出生的Gsαflox/flox/Cre-小鼠注射等量Tamoxifen后,作为对照小鼠使用。免疫荧光、Western blot和RT-PCR结果均显示GsαSMKO小鼠的主动脉平滑肌中Gsα敲除效果良好,同时GSαSMKO小鼠主动脉组织中cAMP含量显着低于对照小鼠;而GSαSMKO小鼠和对照小鼠的巨噬细胞和成纤维细胞中Gsα表达水平无显着差异,说明平滑肌特异性敲除Gsα的敲基因小鼠构建成功。GsαSMKO小鼠与对照小鼠相比,体重、心率、左室射血分数明显下降,收缩压、舒张压无显着性差异。4.2敲除Gsα导致小鼠平滑肌细胞表型转化免疫组化、Western blot和RT-PCR结果均显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠主动脉平滑肌中收缩型蛋白α-SMA、SMMHC表达下降,合成型蛋白Vimentin、Osteopontin表达升高。RT-PCR结果显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠的主动脉组织中平滑肌细胞来源的细胞因子如TGF-β1、IL-6、E-selectin、IL-17C、ICAM-1、TNF-α和CCL-2的mRNA表达水平显着升高。Western blot结果显示,敲除Gsα导致小鼠主动脉平滑肌细胞对Ang Ⅱ的敏感性增加。HE结果显示,对照小鼠和GsαSMKO小鼠的主动脉直径、中膜厚度、平滑肌细胞核数目均无显着差异。4.3平滑肌细胞敲除Gsα可使HuR和KLF4表达水平增高Western blot和RT-PCR结果均显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠的主动脉平滑肌组织中KLF4和HuR表达水平显着增加。4.4 KLF4是HuR的靶基因RIP实验结果显示,HuR蛋白能够与KLF4的mRNA结合;KLF4 mRNA稳定性实验结果表明,HuR蛋白能够增加KLF4 mRNA的稳定性,延长KLF4 mRNA的半衰期;使用HuR的抑制剂CMLD-2刺激平滑肌细胞能够显着降低KLF4蛋白的表达。4.5平滑肌细胞敲除Gsα后,可通过上调HuR/KLF4信号通路,而导致平滑肌细胞表型转化Western blot结果显示,与对照组相比,GsαSMKO细胞中KLF4、HuR和Vimentin表达上调,α-SMA表达下调;对照组和GsαSMKO组的平滑肌细胞转染HuR siRNA后均能显着抑制KLF4和Vimentin的表达,增加α-SMA的表达;对照组和GsαSMKO组的平滑肌细胞转染KLF4 siRNA后,均能显着降低Vimentin的表达并增加α-SMA的表达。以上结果说明,平滑肌细胞敲除Gsα能够通过上调HuR/KLF4信号通路,而导致平滑肌细胞表型转化;抑制HuR或KLF4能够一定程度逆转平滑肌细胞表型转化。4.6平滑肌细胞敲除Gsα可显着加重AngⅡ导致的AAA我们将Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠杂交至ApoE-/-背景,得到ApoE-/-/GsαSMKO双敲小鼠,同窝出生的ApoE-/-/Gsαflox/flox小鼠作为对照,皮下泵入AngⅡ诱导AAA模型。与ApoE-/-/Gsαflox/flox小鼠相比,ApoE-/-/GsαSMKO小鼠的AAA成瘤率、瘤体最大直径和死亡率均明显增加,腹主动脉管壁结构破坏更明显,弹力板断裂更严重,AAA组织中CD68、MMP2、Vimentin和Osteopontin表达显着增高,而4-HNE表达无明显差异。4.9患者AAA组织中Gsα和α-SMA表达降低,HuR和KLF4表达升高免疫组化结果显示,与对照组相比,患者AAA平滑肌组织中Gsα和α-SMA的表达显着降低,HuR和KLF4的表达显着升高。5结论（1）敲除Gsα会导致小鼠主动脉平滑肌细胞发生表型转化;（2）平滑肌细胞敲除Gsα后,可通过上调HuR/KLF4信号通路,而导致平滑肌细胞表型转化;（3）平滑肌细胞敲除Gsα可显着加重Ang Ⅱ导致的AAA;（4）人类AAA的发生可能与Gsα/HuR/KLF4调控的主动脉平滑肌细胞表型转化相关。1研究背景慢性假性肠梗阻（Chronic intestinal pseudo-obstruction,CIP）是一种罕见的致残性肠动力障碍疾病。日本最近的一项全国性调查显示,每100万新生儿中约有3.7名CIP患儿,在15岁以下儿童中的发病率约为1/270000。CIP患者一般具有腹胀、呕吐、便秘及腹部疼痛等肠梗阻症状,与机械性肠梗阻相区别的是,CIP患者肠管内外并无实体性梗阻物存在,肠管亦无闭塞性病变。CIP病因多样,通常受遗传因素、药物毒副作用等因素影响,或者继发于其他疾病。目前临床中最常见的CIP病变形式是肠壁中的神经元和/或平滑肌病变,然而其分子机制尚不明确。由于消化系统长期功能失调,CIP患者常需要全胃肠外营养,因此患者生存质量差,有研究报告显示,CIP患者的生存率仅有19.7%。目前CIP患者常需手术治疗,严重者可能需要全胃肠移植。平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMCs）参与构成人体许多重要的脏器系统,主要发挥其收缩和舒张功能。平滑肌收缩功能异常与许多人类疾病的发生发展密切相关,如CIP、高血压、哮喘等,这些疾病在发病机制上都存在平滑肌收缩蛋白表达异常的特点。因此,研究SMCs收缩蛋白的表达调控机制,对于理解平滑肌收缩异常相关疾病的发生发展机制有重要作用,同时对于寻找这些疾病的新的有效治疗靶点有重要价值。目前研究发现,许多转录因子如血清反应因子（serum response factor,SRF）、心肌素（myocardin,Myocd）、Foxf1 等参与调控SMCs收缩蛋白的表达。SRF是一种普遍表达的转录因子,能够识别并结合目的基因的CArG[CC（A/T）6GG]盒,激活多种平滑肌收缩相关蛋白的表达。SRF对胃肠道平滑肌的生长、分化至关重要,成年小鼠SMCs特异性敲除SRF能够导致小鼠小肠α-SMA、SM22、SMMHC表达降低,小鼠出现CIP症状。Myocd是SRF的转录共激活因子,它能够与SRF结合形成Myocd/SRF蛋白复合体,增强SRF的功能。Foxf1对于维持SMCs的正常分化非常必需。以往研究发现Foxf1基因位点的杂合缺失和点突变存在于40%的肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位（ACD/MPV）患者中,该疾病表现为严重的胆囊、肺和胃肠道的发育不良。平滑肌特异性敲除Foxf1的新生小鼠表现为食管平滑肌层明显变薄,平滑肌收缩蛋白表达降低;而成年杂合子smFoxf1-/+小鼠的结肠表现为环形肌层变薄收缩功能减退。Foxf1调控SMCs生长、分化的机制尚不明确,一方面Foxf1能够直接结合并激活Telokin蛋白的启动子序列,直接调控其表达;另一方面,Foxf1可以结合SRF、Myocd或心肌素相关转录因子（myocardin related transcription factors,MRTFs）,与这些蛋白协同作用,共同调控Telokin的蛋白表达。结合小鼠平滑肌敲除Foxf1后所引起的胃肠道发育与功能障碍的表型,我们推测Foxf1极有可能与CIP密切相关。异源三聚体G蛋白,是动植物细胞内一种非常保守的蛋白家族,主要发挥跨膜信号传导的功能。G蛋白由α β、γ三个亚基构成,根据α亚基的不同G蛋白分为Gs、Gi、Gq、G12/13等类型。其中Gs蛋白的α亚基,即Gsα,能够接收G蛋白偶联受体传递的胞外信号,激活胞内的腺苷酸环化酶（adenylate cyclase,AC）,产生第二信使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）,进而激活下游蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）信号通路,PKA通过磷酸化下游多种目的分子发挥不同效应。PKA能够磷酸化激活cAMP反应元件结合蛋白 1（cAMP response elements binding Protein 1,CREB1）的丝氨酸 133位点,调节SMCs生长、增殖、迁移等功能。Gsα缺失或功能异常通常会导致众多器官组织的功能障碍,Gsα组织特异性敲基因小鼠表现为相应组织器官功能失调,严重的可在胚胎期或出生后死亡。目前针对Gsα蛋白的研究较多的集中于代谢性疾病、内分泌疾病和肿瘤相关疾病等,尚未有利用平滑肌特异性的Gsα缺陷小鼠进行疾病研究的报道。本研究中首次构建了 SMCs特异性Gsα敲除小鼠,在前期观察中发现该敲基因小鼠表现为胃肠食物潴留、小肠肿胀的现象,可能是CIP的表现。本研究提出如下科学假说:小鼠SMCs特异性敲除Gsα后,通过影响Foxf1信号通路,下调小肠平滑肌收缩相关蛋白如SMMHC、α-SMA、SM22,从而导致SMCs收缩功能障碍,引起CIP。本实验将首次对SMCs敲除Gsα后小鼠的表型特征进行详细描述,检测小鼠小肠的收缩功能障碍情况,探讨引起CIP的可能的信号通路,为进一步从分子机制水平理解CIP提供参考。2研究目的（1）研究小鼠平滑肌中敲除Gsα对小肠功能的影响;（2）探讨Gsα对小肠平滑肌收缩蛋白的调控机制;3研究方法3.1构建平滑肌特异性Gsα敲除小鼠将Gsαflox/flox小鼠与Acta2-Cre小鼠杂交,得到的F1代小鼠相互杂交获得Gsαflox/floxActa2-Cre小鼠。该小鼠从胚胎期开始即特异性的在SMCs中敲除Gsα,该小鼠命名为GsααSMKO小鼠。将Gsαflox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠交配,得到的F1代小鼠相互杂交获得Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠。小鼠成年后连续5天腹腔注射Tamoxifen（1mg/d）即可在SMCs中特异性的敲除Gsα,该小鼠命名为Adult GsαSMKO小鼠。提取小鼠基因组DNA,PCR扩增Gsα和Cre序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。3.2细胞实验贴块法提取小鼠原代小肠SMCs,选用4-8代细胞进行实验。1)毛喉素（Forskolin）分别刺激SMCs 0、24、48h后提取总蛋白;2)染色质免疫共沉淀实验（ChIP）:SMCs加入Forskolin刺激12h,检测CREB1蛋白是否与Foxf1启动子序列结合;3)双荧光素酶报告基因:构建含Foxf1启动子序列的野生型荧光素酶质粒（WT-luc）,接着构建另外一种荧光素酶质粒,该质粒也含有Foxf1的启动子序列,但是将其中能够被CREB1结合的CRE位点的关键序列突变掉,该质粒称为CRE突变型质粒（CRE-mutated-luc）。将上述两种质粒分别转染SMCs,加入Forskolin刺激24h,检测荧光素酶活性。3.3绘制生长曲线和生存曲线1)记录对照小鼠和GsαSMKO小鼠7-28天体重变化,绘制生长曲线;2)绘制对照小鼠和GSαSMKO小鼠从出生至28天的生存曲线;3)雄性对照小鼠和Adult GsαSMKO小鼠从注射Tamoxifen之日起,记录之后70天的体重数据,绘制生长曲线;4)对照小鼠和Adult GsαSMKO小鼠从注射Tamoxifen之日起,绘制之后100天的生存曲线;3.4全肠运输时间测定（Whole-Gut Transit Time Test）给小鼠经口灌胃木炭测试餐,监测小鼠粪便中黑色染料首次出现的时间。3.5小鼠小肠肠段收缩力的检测利用BL-420F生物机能实验系统与张力换能器,记录小肠肠段的自发收缩波形和收缩力;分别用KC1、ACh和电场刺激（EFS）刺激小肠肠段收缩,记录收缩波形,计算收缩力。3.6检测cAMP水平使用Enzo Life Science公司的Direct cAMP ELISA kit检测小肠平滑肌组织中cAMP的水平。1)测量对照小鼠和Adult GSαSMKO小肠平滑肌组织基础状态下cAMP水平;2)测量异丙肾上腺素（ISO）刺激后对照小鼠和Adult GsαSMKO小肠平滑肌组织中cAMP水平。3.7 Western blot提取小肠平滑肌的总蛋白,分别检测Gsα、CREB1、p-CREB1、Foxf1、MYH11、MLCK、ACTA2、CNN1、ADRB1、ADRB2、GAPDH和β-actin蛋白表达水平。3.8 RT-PCR提取小肠平滑肌的总RNA,分别检测ACTA2、MYH11、CNN1、MLCK、SRF、Myocd、Foxf1 和β-actin的mRNA表达水平。3.9组织病理学检测:1)免疫组化检测空肠和回肠组织中ACTA2、Gsα和Cre蛋白的表达;2)免疫组化检测主动脉组织中ACTA2和Gsα蛋白的表达;3)免疫组化检测患者CIP标本和对照组小肠的平滑肌组织中Gsα、Foxf1、CREB1和p-CREB1的蛋白表达情况;3.10 HE染色观察小肠结构、测量小肠直径以及平滑肌层厚度。3.11芯片分析收集对照小鼠和GsαSMKO小鼠的小肠平滑肌、对照组和CIP组患者的回肠平滑肌组织,提取总RNA,由南京Vazyme Biotech公司对转录组序列进行芯片分析。3.12临床CIP标本收集患者CIP标本来自于术中切除的CIP病变组织;对照组病人患有与胃肠动力障碍无关的疾病,选择手术中切除的病变部位临近的正常小肠组织。3.13统计学分析统计数据采用均数±标准误（mean±SEM）表示,先对数据进行正态分布检验,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间两两均数比较采用单因素方差分析。P<0.05认为统计数据有显着性差异。4实验结果4.1平滑肌特异性敲除Gsα的敲基因小鼠构建成功Western blot和免疫组化结果显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠的空肠、回肠和主动脉平滑肌中Gsα蛋白水平均显着下降。免疫组化结果显示,与对照小鼠相比,Adult GsαSMKO小鼠的空肠、回肠平滑肌层中Gsα蛋白水平均显着下降。4.2平滑肌特异性敲除Gsα导致小鼠出生后死亡出生后21天GsαSMKO小鼠体重相比对照小鼠下降34.1%,差异有统计学意义;GsαSMKO小鼠从出生后14天开始出现死亡,至生后28天全部死亡,而对照小鼠全部正常存活。4.3 GsαSMKO小鼠的平滑肌收缩功能异常基础状态下,GsαSMKO小鼠空肠和回肠的收缩张力均明显低于对照小鼠;分别使用KCl、ACh和EFS刺激收缩,GsαSMKO小鼠空肠和回肠的收缩张力均明显低于对照小鼠。4.4成年小鼠的平滑肌特异性敲除Gsα引发严重的肠梗阻与对照小鼠相比,Adult GsαSMKO小鼠的体重、摄食量和粪便排泄量均显着降低。Tamoxifen注射后3个月内,Adult GsαSMKO小鼠死亡率超过80%,对照小鼠全部存活;解剖发现Adult GsαSMKO小鼠回肠有明显的肿胀和食物残渣淤积。小鼠用木炭测试餐灌胃后,adult GsαSMKO小鼠首次出现黑便的时间是对照小鼠的三倍,差异有统计学意义。4.5成年小鼠平滑肌特异性敲除Gsα导致小鼠小肠平滑肌收缩功能受损HE染色分析发现,adult GsαSMKO小鼠的回肠的平均直径较对照组增加了1.6±0.3倍（3566±1011μm vs 2254±562μm）,差异有统计学意义。与对照小鼠相比,adult GsαSMKO小鼠回肠的平滑肌层显着增厚;其中adult GsαSMKO小鼠回肠的纵行肌层增厚2.4±0.5倍,环形肌层增厚2.1±0.4倍,差异有统计学意义。使用KCl刺激肠段收缩时,adult GsαSMKO小鼠的平均收缩力约为对照小鼠的25%,其中adult GsαSMKO小鼠的空肠收缩力约占对照小鼠空肠收缩力的34.3%,回肠的收缩力仅占对照小鼠的15.4%,差异均有统计学意义;使用Ach和EFS刺激也得到了类似的结论。4.6 Gsα敲除可下调平滑肌收缩蛋白的表达和cAMP/CREB1信号通路Western blot和RT-PCR结果显示,adult GsαSMKO小鼠平滑肌中收缩蛋白MYH11、ACTA2、CNN1及MLCK表达显着下降;调控平滑肌收缩蛋白的关键转录因子Myocd和Foxf1的表达显着降低。Gsα敲除后平滑肌中cAMP的基础水平较对照组显着降低;使用ISO刺激后,adult GsαSMKO小鼠的cAMP水平明显低于对照组。Western blot发现,adult GsαSMKO小鼠与对照小鼠相比,基础状态下和ISO刺激后,CREB1的总蛋白水平及其1 33位点丝氨酸的磷酸化水平均显着降低。4.7 CREB1与Foxf1基因的启动子序列结合并调控Foxf1的表达Forskolin能够显着增加SMCs中Foxf1蛋白的表达。利用JASPAR数据库分析发现,Foxf1的启动子序列中存在一个能够被CREB1识别的CRE位点。ChIP结果表明CREB1能够与Foxf1的启动子序列结合。双荧光素酶报告基因结果表明,CREB1能够激活Foxf1启动子。4.8 CIP患者的小肠平滑肌组织中Gsα、Foxf1、p-CREB1和CREB1的蛋白表达均下降转录组芯片测序结果表明,与对照组相比CIP患者的小肠平滑肌组织中Gsα、CREB1、Foxf1表达显着下调。免疫组化结果表明,与对照组相比CIP患者的小肠平滑肌组织中Gsα、Foxf1、p-CREB1和CREB1的表达水平均显着降低。5结论（1）平滑肌敲除Gsα能够导致小鼠生长发育迟缓和出生后1个月内死亡;（2）成年小鼠平滑肌敲除Gsα导致小鼠CIP的表型;（3）CREB1能够结合并激活Foxf1启动子,上调Foxf1蛋白的表达;（4）平滑肌中Gsα通过影响cAMP/CREB1/Foxf1信号通路,调控收缩相关蛋白的表达;（5）Gsα/CREB1/Foxf1信号通路可能参与了人CIP疾病进程。
徐岩[3]（2018）在《瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究》文中认为研究背景急性胃黏膜损伤（Acute gastric mucosal lesions,AGML）指胃黏膜屏障保护作用减弱,胃黏膜发生不同程度的水肿、溃疡、糜烂和出血,是一种常见的临床问题。尽管有很多治疗急性胃黏膜损伤的药物,但是胃黏膜损伤经常容易复发,并且患这种疾病病人的数量一直保持在一个稳定状态。过度、持续性伤害性应激是诱发急性胃黏膜损伤的一个关键性致病因素,胃是应激状态下最为敏感的器官之一。现有研究显示,各种困难复杂的手术、休克、严重感染、脓毒症、多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome or failure,MODS or MODF）和严重烧伤、创伤等都可引起AGML。特别是休克引起的低血流灌注,均能减少胃壁血流,损伤胃黏膜屏障,影响胃黏膜上皮细胞的功能,发生应激性胃黏膜水肿、溃疡甚至糜烂出血。与应激相关的胃黏膜损伤估计影响75%以上的急危重病人,其中3%-4%可发生严重的胃出血,这可使原有疾病加重或恶化,病死率明显升高。在ICU与应激相关的胃出血发生率为0.6%-6%。有研究表明应激性溃疡与胃酸分泌增多的关系不大,更依赖于胃黏膜血流量的减少、缺血缺氧和再灌注损伤。任何影响胃壁血流（Gastric wall blood flow,GWBF）的因素都会对胃黏膜上皮细胞（Gastric mucosal epithelial cells,GMEC）的功能产生影响,削弱胃黏膜保护屏障。胃酸增多显然能加重胃黏膜防御系统的负荷,但是应激性溃疡时胃酸一般不高,甚至减少。尽管如此,仍不能否定H+在应激性胃溃疡发病中的作用。由于胃黏膜屏障受损,H+浓度虽然不高,仍可逆行性扩散,出现胃壁内酸化,则可产生急性胃黏膜损害。此外,一些炎性介质的失控和代谢产物也会对胃黏膜的功能产生影响。尽管存在上述一些已经明确影响胃黏膜功能的因素,但是应激诱导急性胃黏膜损伤的病理生理机制仍然还不是很清楚。考虑急性胃黏膜损伤受多因素、多途径调控,因此,迫切需要寻找与急性胃黏膜损伤发病机制相关的新的信号分子和信号传导通路,为防治疗急性胃黏膜损伤提供靶点。目前认为,AGML的发生与神经和体液等诸多因素有关。瞬时受体电位锚蛋白1（Transient receptor potential ankyrin-1,TRPA1）和P物质（Substance P,SP）都丰富表达且共存表达于大鼠的胃组织和支配胃组织相应阶段胸8-胸11（T8-11）背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）,这样二者之间可能存在某种相互作用。Kondo T报道TRPA1参与大鼠内脏痛觉过敏的调节,预先鞘内注射和腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-030031或敲除TRPA1可以有效减轻大鼠胃扩张引起的伤害性刺激。给予P物质神经激肽-1受体拮抗剂SR140333和CP 99994可以分别有效减轻酒精引起的C57/BL6J小鼠胃损伤和SD大鼠浸水束缚应激引起的膀胱损伤。有报道TRPA1和P物质均可引起神经源性炎症和非神经源性炎症。在2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic-acid,TNBS）诱导的小鼠结肠炎模型,TRPA1对P物质的释放具有调控作用,但是二者在急性胃黏膜损伤中的作用尚不明确。研究目的冷水束缚应激（Water immersion restraint stress,WIRS）因为其良好的可重复性和临床相关性,被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此,本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型,初步探讨:1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响,观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate,AITC）,进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制,以及TRPA1对P物质释放的影响。研究方法雄性Wistar大鼠（weight 180-220g,6–8weeks old）,随机分为6组,空白对照组（Control group）,大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组（WIRS group）,大鼠在自制的鼠笼内冷水（16±1℃）浸泡6h,水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组（ITIH group）,大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-030031 10μl（10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亚砜）;腹腔注射HC-030031组（IPIH group）,大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031（150 mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纤维素）。冷水束缚应激6h后,取大鼠的背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜。AITC组,口服AITC 17mg/kg（AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐温的生理盐水中）,AITC对照组口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜,应用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin stain,HE）或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后,分别应用光学显微镜（Optical Microscope,OM）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）、免疫组织化学（IHC）分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胃黏膜中P物质浓度的变化。实验结果1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示,未经处理的Control组:胃黏膜结构正常,层次清楚,上皮完整,上皮层细胞排列紧密、规则,未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集,未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落,多发浅表溃疡,有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落,同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润,毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显,数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较,WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高（P<0.001）。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好,受损黏膜较表浅局限,仅有轻度充血、水肿,偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低（P<0.001）。AITC组:可见胃黏膜受损,上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿,可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较,AITC组胃黏膜损伤评分明显提高（P<0.001）。2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示,未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重,有些完全失去正常结构,轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较,胃黏膜细胞损伤评分明显提高（P<0.001）。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤,但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张,空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低（P<0.001）。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤,多伴有线粒体嵴减少或消失,但轮廓存在;粗面内质网局部扩张,偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较,AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高（P<0.001）。3.同Control组比较,WIRS组大鼠背根神经节（T8-11）和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加（P<0.001）。4.同WIRS组比较,鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003（1ITIH组或IPIH组）,有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中P物质释放（P<0.001）。5.同Control组比较,口服TRPA1特异性激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤,大鼠背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加（P<0.001）。结论1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤,使背根神经节（T8-11）和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关,其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤,其机制可能是HC-030031显着抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放,减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。3.TRPA1激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节（T8-11）、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中,P物质的释放主要由TRPA1调控。
郝尧坤[4]（2014）在《疏肝健脾方对肝郁脾虚型FD大鼠胃黏膜及平滑肌功能的影响》文中研究表明目的研究中药疏肝健脾方对肝郁脾虚型FD模型大鼠一般情况、胃排空率、血浆中VIP和SP含量,胃体黏膜中VIP2R、SP2R、MLCK的表达,以及胃体平滑肌细胞中IP3、 cAMP、Ca2+含量等指标的影响；基于胃黏膜分泌功能和平滑肌运动功能探讨FD发病机制,以及该方治疗FD的疗效机制。方法1.造模及治疗采用SPF级SD健康大鼠64只,雌性,体重200-220g。适应性喂养一周后开始造模。随机分为正常对照组,模型对照组,中药组,西药组,每组16只。模型组给予慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的方法进行造模,造模时间共14天；造模后中药组给予对应体积疏肝健脾方药液（1g/m1）,按8.54g/kg·d浓度给药（与人体体重等效剂量）,西药组给予对应体积的多潘立酮溶液（0.35mg/ml）,按2.7mg/kg·d浓度给药（与人体体重等效剂量）。模型对照组给予等量生理盐水,正常对照组给予等量蒸馏水灌胃,连续14天。2.检测观察大鼠造模前、后及治疗后的一般状况；采用胃排空实验,进行胃动力评测；采用放射免疫法检测大鼠血浆中VIP、SP的含量；采用免疫组织化学染色法检测大鼠胃体黏膜层VIP2R、SP2R、MLCK的表达,以及大鼠胃体肌层MLCK的表达；分离大鼠胃体肌层平滑肌细胞,制成平滑肌细胞悬液,采用Elisa法检测平滑肌细胞中IP3、cAMP含量,流式细胞仪检测Ca2+的含量。结果1.实验期间大鼠体重变化①造模前,四组之间体重差异无统计学意义（P=0.092）；②造模两周后,与正常对照组相比,模型对照组、中药组、西药组大鼠体重增加缓慢,差异均有统计学意义（P<0.001）；③治疗后,与模型对照组相比,中药组、西药组大鼠体重增长变快,差异有统计学意义（P<0.001）；而中药组、西药组之间差异无统计学意义（P=0.07）。2.胃排空率测定四组大鼠胃排空率存在统计学差异（F=60.643,P<0.001）；与正常对照组比较,模型对照组大鼠胃排空率降低,差异有统计学意义（P<0.001）；与模型对照组比较,中药组、西药组大鼠胃排空率升高,差异有统计学意义（P<0.001,P<0.001）；中药组、西药组之间差异无统计学意义。3.血浆中VIP、SP含量测定四组大鼠血浆VIP、SP含量存在统计学差异（VIP:F=4.650, P=0.008; SP:F=3.304, P=0.031）;与正常对照比较,模型对照组大鼠血浆中VIP含量升高、SP含量降低,差异有统计学意义（VIP:P=0.019; SP:P=0.031）;与模型对照组比较,中药组、西药组大鼠血浆中VIP含量降低、SP含量升高,差异有统计学意义（VIP:P=0.002,P=0.004; SP:P=0.008, P=0.015）;中药组、西药组两组之间大鼠血浆中VIP、SP含量差异无统计学意义（VIP:P=0.844; SP:P=0.708）;中药组、西药组大鼠血浆中VIP、SP含量与正常对照组比较,差异无统计学意义（VIP:P=0.392, P=0.509; SP:P=0.546, P=0.803）4.胃体黏膜中VIP2R、SP2R、MLCK表达4.1胃体黏膜层组织中VIP-2R表达镜下观察胃体组织中VIP-2R阳性表达主要分布在黏膜层,黏膜组织中VIP-2R阳性表达呈棕黄色,以胞浆膜染色为主,着色深。阳性细胞主要分布在黏膜固有层腺体细胞中。四组之间表达强度存在差异（F=5.756,P=0.003）,与正常组相比,模型组平均光密度降低,两者差异有统计学意义（P=0.001）,与模型组比较,中药组、西药组平均光密度升高,差异有统计学意义（P=0.018,P=0.003）,中药组、西药组之间平均光密度无统计学差异（P=0.3465）。4.2胃体黏膜层组织中SP-2R表达镜下观察胃体组织中SP-2R阳性表达主要分布在黏膜层,黏膜组织中SP-2R阳性表达呈棕黄色,以胞浆染色为主,着色较浅。阳性细胞主要分布在黏膜固有层腺体细胞中。四组之间存在差异（F=3.294,P=0.035）,与正常组相比,模型组平均光密度降低,两者差异有统计学意义（P=0.008）,与模型组比较,中药组、西药组平均光密度升高,差异有统计学意义（P=0.032,P=0.022）,中药组、西药组之间平均光密度无统计学差异（P=0.872）。4.3胃体黏膜中MLCK表达MLCK免疫阳性细胞分布极广,在黏膜下肌层、肌层平滑肌细胞中普遍均匀分布,平滑肌纤维呈浅棕色染色,核呈淡蓝色；胃体黏膜固有层腺体也有较强表达,腺体细胞中MLCK阳性表达呈棕黄色,以胞浆染色为主,着色深。四组之间存在差异（F=5.396,P=0.005）,与正常组相比,模型组平均光密度降低,两者差异有统计学意义（P=0.001）,与模型组比较,中药组、西药组平均光密度升高,差异有统计学意义（P=0.005,P=0.021）,中药组、西药组之间平均光密度无统计学差异（P=0.546）。4.4胃体肌层组织MLCK表达镜下观察胃体肌层细胞中MLCK阳性表达呈棕黄色,以胞浆染色为主,着色深。平滑肌细胞普遍染色,胞浆内着色均匀分布。四组之间不存在统计学差异差异（F=0.711,P=0.554）。5.胃体平滑肌细胞中IP3、cAMP、Ca2+含量的测定5.1平滑肌细胞内IP3的浓度测定四组之间IP3的浓度存在差异（F--5.027,P=0.007）；与正常组比较模型组大鼠胃体平滑肌细胞中IP3的浓度降低,差异有统计学意义（P=0.008）；与模型组比较,中药组、西药组IP3的浓度升高,差异有统计学意义（P=0.002,P=0.003）；中药组、西药组之间差异无统计学意义。5.2平滑肌细胞内cAMP的浓度测定四组之间cAMP的浓度存在差异（F=4.901,P=0.007）；与正常组比较模型组大鼠胃体平滑肌细胞中cAMP的浓度降低,差异有统计学意义（P=0.016）；与模型组比较,中药组、西药组cAMP的浓度升高,差异有统计学意义（P=0.005,P=0.002）；中药组、西药组之间差异无统计学意义（P=0.652）5.3平滑肌细胞内游离Ca2+含量测定四组之间的Ca2+浓度存在差异（F--9.413,P<0.001）；与正常组比较模型组大鼠胃体平滑肌细胞中Ca2+的浓度升高,差异有统计学意义（P<0.001）；与模型组比较,中药组、西药组Ca2+的浓度降低,差异有统计学意义（P=0.003,P<0.001）；中药组、西药组之间差异无统计学意义（P=0.159）。结论1.肝郁脾虚型FD模型大鼠存在,外周血中胃肠激素水平的异常,黏膜层腺体中VIP2R、SP2R、MLCK表达强度的下降,以及静息状态下胃体平滑肌细胞胞内Ca2+浓度异常增高、IP3、cAMP等第二信使水平下降等异常情况。因此,在胃肠神经内分泌系统紊乱基础上,大鼠胃黏膜分泌功能异常和平滑肌运动功能障碍可能是FD发病机制之一。2.中药疏肝健脾方可对肝郁脾虚型FD模型大鼠产生有效的治疗作用,可改善其精神饮食等一般状态,并促使其胃排空功能的改善,其治疗机制可能与改善大鼠胃黏膜分泌功能和平滑肌运动功能有关。
张北华[5]（2013）在《IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价》文中进行了进一步梳理研究背景肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和（或）粪便性状改变的功能性肠病,该病缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常,其患病率逐年增高,与精神心理因素和感染因素密切相关。腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是我国IBS最常见的类型,其发病机制复杂,包括内脏感觉过敏、肠道动力增强、脑肠作用异常、神经-内分泌-免疫网络异常等。近年来对IBS-D发病机制的研究逐渐深入到了分子水平,但还比较片面。中医学认为肝郁脾虚是其基本病机,肝郁脾虚证是其最主要的证型。西药作用靶点单一,难以解决IBS-D复杂的临床症状,中药复方具有多靶点作用整体治疗的优势。目前对IBS-D动物模型的研究尚处于探索阶段,其造模方法还不成熟,动物模型稳定性欠佳,深入全面研究IBS-D的发病机制需要建立一种稳定的重复性好的动物模型。进一步建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合动物模型有利于研究中药复方的作用机理,对于开发新药,发挥中医药治疗IBS-D的优势具有推动作用。第一部分:IBS-D大鼠模型制作方法的探索目的：探索建立IBS-D大鼠模型的理想制作方法材料和方法：本部分研究采用新生雌性SD大鼠造模,分为正常对照组、番泻叶高剂量组、中剂量组、低剂量组、高乳糖饲料组、醋酸灌肠组和5-HT腹腔注射组,每组10只。除正常组外,其余各组大鼠采用新生期母子分离法建立内脏高敏感模型,即出生后第2-14天,每天与母鼠分离3h,2月后选择体重大于250g的大鼠进行致泻造模。番泻叶高剂量组给予番泻叶煎剂4.5g/kg、中剂量组给予3g/kg、低剂量组给予2g/kg灌胃,灌胃体积为10ml/kg,连续7天,给予普通饲料喂养；高乳糖组采用高乳糖饲料喂养,7天后换用普通饲料；醋酸灌肠组给予4%的醋酸灌肠1ml,灌肠1次,普通饲料喂养,此后不做任何处理；5-HT腹腔注射组给予5-HT2.1mg/kg腹腔注射,连续7天,普通饲料喂养；正常组不给于任何处理。观察各组大鼠造模期间的腹泻率,造模后1周每天的大便积分（硬便1分,软便2分,不成形便3分）,造模前后的体重增长情况以及近端结肠的病理组织学变化。结果：（1）腹泻率：番泻叶高剂量组（4.5g/kg）、高乳糖饲料组和醋酸灌肠组大鼠腹泻率均为100%,其余各组均未出现腹泻。（2）体重增长量：与正常组大鼠相比,除番泻叶低剂量组大鼠体重无明显变化外,其余各组体重增长量均显着降低,具有显着性差异（P<0.01）,其中高乳糖饲料组和醋酸灌肠组大鼠体重出现明显的负增长。（3）大便积分：造模后番泻叶高剂量组和醋酸灌肠组大鼠6天内的平均大便积分显着高于正常组,具有显着性差异（P<0.05,P<0.01）。（4）近端结肠病理：高乳糖组可见淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润,细胞间质轻度水肿；醋酸灌肠组部分结肠与腹腔组织粘连、增厚,结肠缩短,近端结肠可见粘膜轻度充血,绒毛变钝,其余各组未见异常。结论：（1）母子分离+适当剂量的番泻叶灌胃是复制IBS-D动物模型较为合理的造模方法。（2）基于大便基本特征和病理组织学改变是判定IBS-D动物模型是否成功的重要依据之一。第二部分：IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价目的：建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型。材料和方法：本部分研究采用新生SD雄性大鼠造模,分为正常组、正常束缚组、母子分离组、分离+束缚组（模型组）和以方测证组,每组20只大鼠。基于第一部分研究结论选择母子分离+番泻叶灌胃复制IBS-D大鼠模型,采用慢性束缚应激复制肝郁脾虚证候模型,将二者叠加建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型。分三步造模,第一步：正常组和正常束缚组大鼠新生期母子不分离,其余各组于出生后第2-14天,每天与母鼠分离3h；第二步：各组大鼠2月龄时,正常组和母子分离组不处理,其余各组采用自制束缚架,束缚肩部和腹部,使其固定不动,每天束缚3h,连续3周；第三步：束缚造模期第2周开始每天上午9点给予以方测证组大鼠灌服痛泻要方煎剂（3g/kg,10ml/kg）,其余各组灌服生理盐水（10ml/kg）,第3周开始,正常束缚组、母子分离组和模型组每天上午9点灌服生理盐水,下午4点灌服番泻叶煎剂（4.5g/kg,10ml/kg）,乙方测证组上午灌服痛泻要方煎剂,下午灌服番泻叶煎剂,正常对照组上下午均灌服生理盐水。从宏观疾病特征、宏观证候特征和微观生物学指标三个方面对模型进行评价。宏观疾病特征评价方法：束缚造模前后检测各组大鼠的内脏敏感性（痛觉阈值）、测评束缚期间和造模后各组大鼠的大便积分（计分方法同前）。宏观证候特征评价方法：肝郁的评价于束缚造模期前后观察各组大鼠旷场行为学、糖水偏好率、悬尾不动时间,脾虚的评价通过观察各组大鼠在束缚期间的体重增长情况以及造模后的进食量。微观生物学指标评价：检测血清D-木糖、5-HT、BDNF、IgA、 IgG含量；采用流式细胞仪分析血液和胸腺组织的T淋巴细胞亚群分布,比较各组大鼠的脾脏指数；采用免疫组织化学的方法检测近端结肠和末端回肠组织中的肥大细胞和嗜铬细胞数目变化；评价近端结肠和末端回肠的病理组织学变化。结果：（1）痛觉阈值：造模结束后,母子分离组和模型组大鼠痛觉阈值较正常组明显降低（均P<0.01）,正常束缚组痛觉阈值与正常组无显着性差异,痛泻要方可提高模型组大鼠的痛觉阈值（P<0.01）。（2）大便情况：短期束缚应激可使大鼠排便粒数明显增加,长期束缚应激对大鼠排便粒数无明显影响,但可使其大便含水量增加,甚至不成形。造模结束后,5天内的平均大便积分模型组显着高于正常组、正常束缚组和母子分离组（均P<0.01）,痛泻要方对模型组大鼠的腹泻情况无明显改善。（3）体重增长量：造模结束后,正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠的体重增长量均较正常组降低（均P<0.01）,痛泻要方对模型组大鼠的体重无明显影响。（4）旷场实验：造模结束后,正常束缚组、母子分离组、模型组大鼠的穿格数和站立数均较正常组减少（均P<0.05）,痛泻要方可提高模型组大鼠的穿格数和站立数（P<0.05）。（5）糖水偏好率：造模结束后,正常束缚组、母子分离组和模型组的糖水偏好率均较正常组降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,痛泻要方可提高模型组大鼠的糖水偏好率（P<0.05）。（6）悬尾不动时间：造模结束后,正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠的悬尾不动时间较正常组延长（P<0.01,P<0.05,P<0.05）,痛泻要方可缩短模型组大鼠的悬尾不动时间（P<0.05）。（7）进食量：造模后正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠平均进食量与正常组比较无明显变化,痛泻要方可提高模型组的进食量（P<0.05）。（8）血清指标：造模结束后,血清D-木糖含量正常束缚组、母子分离组和模型组较正常组明显降低（均P<0.01）,痛泻要方对模型组大鼠的血清D-木糖含量无明显影响。血清5-HT正常束缚组与正常组比较无显着性差异,母子分离组和模型组较正常组升高（均P<0.01）,痛泻要方可降低模型组大鼠的血清5-HT含量（P<0.01）。血清BDNF各组之间无显着性差异。血清IgA母子分离组和模型组较正常组升高（均P<0.05）,正常束缚组和正常组无显着性差异；痛泻要方对模型组大鼠血清IgA水平无明显影响。血清IgG母子分离组和模型组与正常组无显着性差异,痛泻要方对模型组血清IgG无明显影响。（9）T淋巴细胞亚群比例：造模结束后,血液Th （CD3+CD4+CD8-）亚群比例正常束缚组、母子分离组和模型组较正常组升高（均P<0.05）,Tc （CD3+CD4-CD8+）亚群比例较正常组降低（均P<0.01）,胸腺T总细胞比例较正常组升高（均P<0.05）,痛泻要方对模型组的血液和胸腺T淋巴细胞亚群比例无明显影响。（10）脾脏指数：母子分离组和模型组较正常组降低（均P<0.01）,正常束缚组和正常组无显着性差异,痛泻要方对模型组脾脏指数无明显影响。（11）近端结肠肥大细胞数目：模型组较正常组增多（P<0.01）,正常束缚组和母子分离组与正常组无显着性差异,痛泻要方可显着减少模型组大鼠近端结肠的肥大细胞数目（P<0.01）。（12）嗜铬细胞数目：正常束缚组、母子分离组和模型组近端结肠和末端回肠中的肥大细胞数目均较正常组增多（均P<0.01）,痛泻要方对模型组大鼠近端结肠组织中的嗜铬细胞数目无明显影响。（13）组织病理：各组大鼠近端结肠和末端回肠病理检查未见明显异常。结论：（1）采用母子分离+慢性束缚应激+番泻叶灌胃可成功建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型。（2）采用慢性束缚联合母子分离法造模优于单一因素法。（3）本研究所建立的IBS-D肝郁脾虚型大鼠模型具有内脏高敏感性、肠道通透性增加、抑郁和免疫功能异常等多种特征。（4）根据IBS-D肝郁脾虚证患者的宏观疾病、证候特征和微观生物学指标评价动物模型是否成功的方法科学、合理,具有可行性。第三部分：IBS-D肝郁脾虚型大鼠模型结肠和脑的蛋白质组学研究目的：基于第二部分大鼠模型,从结肠和脑组织中筛选和鉴定与IBS-D发病相关的差异蛋白,并进行对比分析。材料和方法：采用第二部分正常组、正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠的近端和远端结肠和全脑组织样本进行蛋白质组学分析。利用iTRAQ技术筛选各组样本中的差异蛋白,采用Mascot软件对差异蛋白的质谱信息进行鉴定和定量分析,然后基于Uniprot和Gene Ontology数据库对鉴定到的差异蛋白进行功能注释,采用IPA软件分析各组差异蛋白涉及到的生物通路和相互作用关系。并采用实时荧光定量RT-PCR技术从基因水平对选定差异蛋白进行验证。结果：（1）与正常组比较,在正常束缚组大鼠结肠组织中筛选和鉴定出了542个差异表达蛋白（差异倍数>1.2,P<0.05）,其中309个上调,233个下调,脑组织中筛选和鉴定出了1884个差异蛋白,其中764个上调,1120个下调；母子分离组结肠组织中筛选和鉴定出了809个蛋白,其中415个上调,394个下调,脑组织筛选和鉴定出了2386个蛋白,其中1080个上调,1306个下调；模型组结肠组织中筛选和鉴定出了731个差异蛋白,其中424个上调,307个下调,脑组织中筛选和鉴定出了2567个差异蛋白,其中1187个上调,1380个下调。（2）正常束缚组、母子分离组和分离束缚组在结肠组织中有192个差异蛋白共同表达,在脑组织中有1501个差异蛋白共同表达。（3）在正常束缚组,有153个差异蛋白在脑和肠组织共同表达,母子分离组有280个差异蛋白在脑和肠组织共同表达,分离束缚组有239个蛋白在脑和肠组织中共同表达。三组均有55个差异蛋白在脑和肠组织中共同表达。（4）模型组结肠组织中差异倍数>3蛋白有6个,其中4个上调：S腺苷甲硫氨酸脱羧酶酶原、内凝集素蛋白、FH2区包含蛋白1、主要组织相溶性复合体Ⅱ类抗原；2个下调：磷脂酰肌醇特异的磷脂酶CX区包含蛋白3、血红蛋白α亚。这些蛋白主要参与了S腺苷甲硫氨酸合成、信号转导、肌动蛋白细胞骨架组装、免疫反应、脂质代谢、氧气转运过程。脑组织中差异倍数>4的蛋白有22个,其中4个上调：过氧化物酶膜蛋白PEX14、NADH泛醌氧化还原酶链2、唐氏综合症临界区域基因3、Lrba蛋白；18个下调：血红蛋白p亚基、胸腺旁腺素、神经生长因子、细胞色素C氧化酶6B1亚基、40s核糖体蛋白、ATP合成酶d亚基、线粒体输入内膜移位酶亚基Tim13、NADH脱氢酶黄素蛋白3、细胞色素C氧化酶5A亚基、浦肯野细胞蛋白4、ATP合酶藕联因子6、脂酰辅酶A结合蛋白、细胞色素C、金属硫蛋白3、肌动蛋白相互作用蛋白1、泛醌细胞色素C还原酶结合蛋白、甘油醛3磷酸脱氢酶、胸腺素p4。这些蛋白参与了蛋白质运输、电子传递、空泡运输、氧气转运、免疫、神经内分泌、rRNA转运、金属离子结合、肌动蛋白细胞骨架组装、核苷酸代谢等。在模型组肠组织中鉴定出的热休克蛋白27、免疫球蛋白J链表达上调、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基表达下调,这些蛋白与临床报道一致。（5）模型组结肠组织的差异蛋白功能主要与细胞组织结构、细胞的功能和修复、细胞死亡和生存、细胞形态、组织发育、细胞发育、细胞的生长和增殖、神经系统发育和功能、细胞与细胞的信号传导和相互作用、小分子生物化学等有关,脑组织的差异蛋白功能主要与细胞的组织结构、细胞的功能和修复、细胞死亡和生存、细胞形态、小分子生物化学、神经系统发育和功能、小分子转运、细胞发育、组织发育和核苷酸代谢等有关。（6）模型组大鼠结肠组织中的差异蛋白主要涉及了整合素信号、5-HT降解信号、抗原呈递通路、白介素4信号等27个生物通路,脑组织的差异蛋白主要涉及了间隙连接信号、上皮黏着连接信号、线粒体功能障碍等26个生物通路。结肠组织中存在9类差异蛋白相互作用网络,脑组织中存在12类差异蛋白相互作用网络。（7）结肠组织AQP8mRNA、NHE3mRNA表达水平与蛋白表达水平一致,结肠和海马BDNFmRNA表达与蛋白表达水平不完全一致。结论：（1）IBS-D肝郁脾虚证大鼠模型结肠和脑组织中存在大量差异表达的蛋白,部分蛋白与临床报道一致,该模型具备IBS-D的病理特征。（2） IBS-D肝郁脾虚证大鼠模型结肠和脑组织中存在大量共同表达的差异蛋白,表达方式多样,印证了IBS-D脑肠相互作用异常的机制。（3）慢性束缚应激、母子分离应激以及二者联合作用具有共同的分子生物学基础,二者联合对脑组织差异蛋白表达的影响具有协同作用。（4）IBS-D发病与多种蛋白质分子改变有关,深入研究各差异蛋白的功能可进一步阐明IBS-D的发病机制。
吴燕敏[6]（2012）在《槟榔对脾胃气滞小鼠胃肠起搏细胞的影响》文中认为目的：1.建立脾胃气滞小鼠模型，为研究促胃肠动力中药作用机制提供一个良好的实验平台。2.探讨槟榔对甘草诱导的脾胃气滞小鼠模型胃肠道组织中Cajal间质细胞的（ICC）形态、结构、分布及其与肠神经系统关系的影响。3.观察槟榔对脾胃气滞模型小鼠胃肠道ICC及一氧化氮（NO）的影响，探讨槟榔促胃肠动力的作用机制。方法：1.建立脾胃气滞小鼠模型：清洁级ICR小鼠60只，随机分为对照（NS）组和5个甘草（GC）组，每组10只，实验组分别给予不同浓度（5、10、15、20、25g/kg）的甘草溶液灌胃，NS组小鼠给予等体积生理盐水灌胃，共10d。每天分别记录六组小鼠日平均进食量及饮水量，并予以酚红法测定各组小鼠小肠推进率和胃排空率。2.清洁级ICR小鼠60只，随机分为2组：正常对照NS组15只，脾胃气滞组45只；脾胃气滞组造模后再随机分为模型对照GC组、槟榔（BL）组及莫沙必利（MS）组，每组15只。NS组、GC组、BL组及MS组每天分别给予等体积的生理盐水、生理盐水、槟榔溶液（5g/kg）及莫沙必利溶液（0.4mg/kg）灌胃，15d后用透射电镜观察各组结肠组织中ICC的形态、结构、数量、分布及其与肠神经系统的关系。3.清洁级ICR小鼠60只，随机分为2组：正常对照NS组15只，脾胃气滞组45只；脾胃气滞组造模后再随机分为对照GC组、BL组及Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）组，每组15只。NS组、GC组、BL组及L-NAME组每天分别给予等体积的生理盐水、生理盐水、槟榔溶液（5g/kg）及Nω-硝基-L-精氨酸甲酯溶液（3mg/kg）灌胃，15d后用免疫组化法观察各组结肠ICC阳性（c-kit+）及神经型一氧化氮合成酶阳性（nNOS+）细胞的面积变化。结果：1. GC较小剂量组对小鼠日平均进食量、饮水量、小肠推进和胃排空有一定程度的抑制作用；GC较大剂量组则有一定程度的促进作用。其中5、10、25g/kg剂量组日平均进食量及小肠推进率与NS组比较差异有统计学意义（P<0.05）；5、10g/kg剂量组日平均饮水量与NS组比较差异有统计学意义（P<0.05）；5、20、25g/kg剂量组胃排空率与NS组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2. NS组结肠组织ICC主要结构特点：细胞呈类纺锤状，有巨大的卵圆形核及向外延伸的长突起，胞质内有丰富的线粒体、滑面内质网和粗面内质网；GC组与NS组相比：ICC向外延伸的突起变短小，胞浆和细胞器明显减少，线粒体嵴模糊不清，内质网肿胀扩张，细胞核膜不完整；BL组、MS组与NS组相比：ICC向外伸展的突起变长，胞质内线粒体、内质网及核糖体增多。NS组环肌层和纵肌层内ICC与肠肌间神经元之间形成突触样连接，ICC突起包裹围绕神经纤维；GC组小鼠结肠组织中ICC与附近的肠肌间神经元轴突间突触样连接遭破坏，神经纤维结构变的模糊不清；而BL组及MS组小鼠结肠组织内ICC与周围的肠肌间神经元轴突间突触样连接增多。3.小鼠结肠组织c-kit+细胞面积：与NS组相比，GC组和L-NAME组小鼠结肠组织c-kit+细胞面积明显减少（P<0.01）；与GC组相比，BL组小鼠结肠组织c-kit+细胞面积明显增加（P<0.01）。小鼠结肠组织nNOS+细胞面积：与NS组相比， L-NAME组小鼠结肠组织nNOS+细胞面积明显减少（P<0.01）；与GC组相比，L-NAME组小鼠结肠组织nNOS+细胞面积明显减少（P <0.01）。结论：1.5g/kg剂量甘草诱导的脾胃气滞小鼠模型日平均进食量、饮水量较对照组减少，小肠推进和胃排空较对照组减慢，基本符合脾胃气滞证临床及病理生理学特征。2. ICC具有独特的超微结构，改变其与肠肌间神经系统解剖或结构上的特殊关系可能是槟榔调节胃肠功能的基础。3.槟榔对甘草诱导的脾胃气滞小鼠受损的ICC有修复作用，这可能是槟榔能促进胃肠动力作用的机制之一。
杜丽娟[7]（2011）在《便塞通合剂治疗慢传输型便秘的作用及机理研究》文中提出目的:采用复方地芬诺酯灌胃建立慢传输型便秘大鼠模型,研究PGP9.5、SS、AQP3、VIP在该模型中近端结肠粘膜的分布和表达,探讨便塞通合剂对慢传输型便秘动物模型通便的作用机制。方法:健康SD大鼠70只,将实验动物随机分为空白对照组、模型组、麻仁丸治疗组、莫沙必利治疗组、便塞通合剂高、中、低剂量治疗组,每组10只。空白对照组用生理盐水0.2ml/10g灌胃,模型组及各治疗组先根据复方地芬诺酯所选剂量10mg/kg灌胃,建立大鼠慢传输型便秘模型。模型建立后,治疗组分别以麻仁丸、莫沙必利和便塞通合剂高、中、低剂量灌胃治疗。观察慢传输型便秘模型大鼠排便粒数、粪便重量和组织学变化;应用免疫组织化学染色观察PGP9.5、SS、AQP3和VIP在结肠近段的分布和表达。应用彩色病理图像分析系统对阳性表达的平均光密度值（MD）进行半定量分析。结果:（1）模型组大鼠排便粒数与空白对照组相比明显减少（11.8±2.2粒/d vs 22.3±1.9粒/d, P<0.05）,粪便重量明显减轻（2.19±0.31g/粒vs 4.20±0.14g/粒, P<0.05）。便塞通合剂治疗后对STC模型大鼠排便粒数及重量有显着提高。（2）HE染色空白对照组大鼠结肠粘膜正常,模型组大鼠结肠粘膜有炎性细胞浸润,肌间神经丛神经细胞减少,可见空泡变性。便塞通合剂治疗后,近端结肠粘膜未见炎性细胞浸润,肌间神经纤维未见空泡变性。（3）模型组PGP9.5平均光密度值低于空白对照组,两组比较有显着差异（0.116士0.039 vs 0.423士0.024, P < 0.05）;模型组SS、AQP3、VIP平均光密度值高于空白对照组,两组比较有显着差异（0.331士0.034 vs 0.098士0.033;0.370士0.045 vs 0.115士0.029;0.223士0.025 vs 0.077士0.044, P均< 0.05）。便塞通合剂能抑制SS、AQP3、VIP在大鼠结肠近段的表达,而PGP9.5表达则呈逐渐上升趋势。（4）便塞通高、中剂量组作用优于低剂量组,呈一定的量效依赖关系,药物治疗组明显优于模型组。结论:便塞通合剂对STC大鼠结肠具有明显的推进作用,能促进STC大鼠排便。其促肠动力作用可能与便塞通合剂抑制结肠组织中SS、AQP3、VIP表达及促进肌间神经丛神经元修复有关。
叶源春[8]（2008）在《伴高脂血症重症急性胰腺炎大鼠的胃肠传输及肌间神经丛形态学改变的研究》文中提出目的:建立高脂血症（HL）及重症急性胰腺炎（SAP）大鼠模型;观察伴或不伴HL状态的SAP大鼠的胃肠传输改变以及肠肌间神经丛胆碱能和氮能神经的组织形态变化,探讨肠肌间神经丛改变与伴高脂血症大鼠SAP胃肠动力延迟的关系,以期进一步了解其胃肠动力障碍的形成机制。方法:将40只雄性SD大鼠分为4组:正常对照组（A组）、单纯SAP组（B组）、高脂对照组（C组）、高脂SAP组（D组）。具体方法:首先随机分为2组（N=20）,分别用基础饲料和高脂饲料（主要成份为88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇）喂养4周;4周后两组内再随机分为2组: SAP组和假手术组（n=10）;逆行胰胆管注射3.5%牛磺胆酸钠构建SAP模型,另外一组逆行胰胆管注射生理盐水。模型制备完成6小时后处死大鼠,取材并观察胰腺组织病理改变;检测血清淀粉酶（AMS）、甘油三酯（TG）及总胆固醇（TC）水平;用墨汁灌胃法分别测量4组大鼠胃肠传输距离,按Karnovsky-Root直接法和NADPH组织化学法观察回肠肌间神经丛胆碱能和氮能神经的组织形态学改变。结果:高脂对照组较正常对照组血TG及TC水平差异有显着性意义（P=0.0001﹤0.01）;与正常对照组相比,单纯SAP组血AMS明显升高,差异有显着性意义（P=0.0001﹤0.01）,胰腺出血、坏死严重,病理评分差异具有显着性意义,胃肠传输率明显延迟（P=0.003﹤0.01）,回肠肌间神经丛内胆碱能神经元密度明显降低（P=0.0001﹤0.01）,氮能神经元的密度均显着升高（P=0.0001﹤0.01）;与单纯SAP组相比,高脂SAP组血AMS水平明显降低（P=0.0001﹤0.01）,胰腺坏死、炎症改变更为明显,病理评分具有显着性差异（P=0.003﹤0.01）,胃肠传输明显延迟（P=0.0001﹤0.01）,胆碱能神经元密度下降（P=0.042﹤0.05）,氮能神经元密度明显升高（P=0.005﹤0.01）。肌间神经丛ACHE、NOS改变与胃肠传输率有线性回归关系（R2为0.531,P=0.001﹤0.01）。结论:高脂饲料喂养4周可以建立较为理想的高脂血症动物模型,结合传统的Aho逆行胰胆管注射法可成功建立高脂血症大鼠重症急性胰腺炎模型;SAP早期即出现胃肠传输延迟和胆碱能神经释放Ach减少以及氮能神经元NO释放的增加,肠肌间神经丛的改变与胃肠传输延迟间存在明显相关性,说明其可能是SAP大鼠胃肠动力障碍的主要机制之一。HL可加重SAP大鼠胰腺病理损害和胃肠动力障碍,肠肌间神经丛胆碱能神经和氮能神经改变更明显,也说明后者胃肠动力功能障碍有关,胃肠动力功能的紊乱等原因所导致的肠源性感染有可能是HL加重SAP进展因素之一。
温士旺[9]（2006）在《人食管下括约肌舒缩功能的调节机制》文中提出食管下括约肌（LES）是位于胃食管接合部特殊增厚的环形肌,人LES宽度约2～3cm。Liebermann-Meffert等首次提出LES由位于胃小弯侧呈半环形的钩状纤维（clasp fibres）和位于大弯侧呈斜行分布的套索纤维（sling fibres）共同构成。这两结构共同维持LES的关闭状态,并在胃食管接合部形成一高压带（15～30mmHg）。LES的正常功能是由兴奋性和抑制性神经,体液因素以及肌肉本身的肌源因素等共同调节,保障吞咽时舒张同时起到抗反流的作用。食管测压发现LES的压力是不对称的,高压区偏向左侧,即套索纤维方向,显然,套索纤维和钩状纤维在维持LES压力方面发挥不同作用。应用毒蕈碱受体拮抗剂阿托品可明显降低LES左侧的压力,且体外实验也证明套索纤维对乙酰胆碱（Ach）的敏感性更高。本实验分别研究毒蕈碱受体（M受体）亚型、一氧化氮（NO）在LES套索纤维和钩状纤维的药理学特性及M受体和神经型一氧化氮合酶（nNOS）的表达规律,以期对LES的生理学和药理学特性有更进一步的了解,并为食管运动功能障碍性疾病的临床治疗提供理论依据。第一部分人食管下括约肌毒蕈碱受体的药理学性质目的:乙酰胆碱是控制LES收缩的最主要的神经递质,它的受体是位于平滑肌细胞上的毒蕈碱受体。至今已证明出M受体存在5种基因型,然而只有M1～M4受体有相应的药理学分型。在许多物种介导LES收缩的M受体的功能亚型为M3受体,但人LES套索纤维和钩状纤维M受体药理学性质还知之甚少。本实验应用离体肌条张力测定技术测定M1～M4选择性拮抗剂在人LES套索纤维和钩状纤维中的拮抗参数（pA2）,并以下段食管环形肌和近胃底部环形肌为参照,探讨M受体亚型在这四种肌条中的药理学性质。方法:选取2004年3月至12月在我院因高位食管中段癌行食管大部切除术患者32例,男女各半,平均年龄55.6岁。手术室采集新鲜手术标本,锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,制备套索纤维、钩状纤维、食管体部环行肌和胃底环行肌的肌条,将其悬挂于含Krebs
李红岩[10]（2004）在《腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠VIP、SP的影响及其与结肠肌间神经丛病理变化的相关性》文中进行了进一步梳理目的：本课题应用大黄建立大鼠的慢传输型便秘模型，复制了便秘患者服用泻剂后的病理过程,观察了此模型结肠传输功能、结肠壁病理变化及结肠肌间神经丛血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）免疫反应性自然恢复情况。通过对腹舒胶囊的研究，观察治疗组肠道传输功能，结肠壁病理变化、超微结构变化及结肠壁肌间神经丛血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）的变化，以及结肠肌间神经丛VIP、SP免疫反应性的变化与结肠肌间神经丛病理变化的相关性，探讨中医药对慢传输型便秘预防、治疗的作用机制。材料与方法1 动物模型制备1.1 动物分组：选用清洁级健康成年SD大鼠72只，雌雄各半，按照随机化原则分为对照组及大黄组6组。1.2 用药方法：对照组饲以普通饲料；大黄组饲料中添加有大黄粉，开始剂量为100mg/kg.d,以后每日给予剂量为前一天的两倍，直至出现半数粪便变稀，然后每天保持此剂量直至80%的稀便消失，再在此基础上加倍给药，又有近半数粪便变稀。如此程序循环三次，待最后一次80%的稀便消失1周后停止给药，饲以普通软饲料待处理。2 动物处理及分组：大黄模型组动物，随机分为5组，随机抽取一组与正常组，测定肠道传输率的变化；并用<WP=4>HE染色、嗜银染色、免疫组织化学染色及电镜方法，观察各组动物结肠壁的病理及超微结构变化。剩余4组动物，分别采用腹舒胶囊、通便灵胶囊、生理盐水等药物灌胃治疗2周。测定肠道传输率的变化；用HE染色、嗜银染色、免疫组织化学染色及电镜方法，观察各组动物结肠壁的病理及超微结构变化。3 数据处理：本实验计量资料数据均采用xˉ±s表示，采用SPSS10.0 统计软件，选用成组设计的单因素方差分析方法进行统计，检验水准α=0.05；结肠传输功能结果，结肠肌间神经丛VIP、SP阳性神经免疫组织化学染色面密度值结果，提供全部数据，采用SPSS10.0 统计软件，选用成组设计的单因素方差分析方法进行统计，检验水准 α=0.05；结肠肌间神经丛VIP、SP阳性神经免疫组织化学染色半定量结果，检验方法采用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法）及多个样本两两比较的秩和检验（Nemenyi法），检验水准α=0.05。结果1 本实验大黄模型组动物体重明显低于正常对照组，治疗组各组动物体重无明显增加，与正常组对比有显着性差异（p<0.05）。各组动物肠道外观无明显差别，结肠粘膜无色素沉着。2 肠道传输功能：与正常对照组相比，大黄模型组肠道传输明显减慢（p<0.01）; 腹舒胶囊1倍量组、腹舒胶囊3倍量组、通便灵组、自然恢复组肠道传输较大黄模型组明显加快（P<0.01）；腹舒胶囊1倍量组、腹舒胶囊3倍量组、通便灵组肠道传输较自然恢复组明显加快<WP=5>（P<0.05）；腹舒胶囊1倍量组、腹舒胶囊3倍量组、通便灵组肠道传输速度无明显差异。3 光镜和电镜观察结果3.1 光镜（HE染色）：大黄模型组可见：粘膜慢性炎症；全层大量嗜酸性粒细胞浸润，以固有膜为主；固有膜水肿，粘膜内大量淋巴小结形成；粘膜下肌部分增厚，胶原纤维化；肌层胶原纤维增生，肌间神经丛神经细胞空泡变性，减少。腹舒胶囊1倍量组、腹舒胶囊3倍量组肌间神经丛神经细胞空泡变性减少；通便灵组、自然恢复组改善不明显。3.2 电镜3.2.1 正常对照组：可见到Cajal间质细胞、正常神经元、平滑肌细胞、有髓及无髓神经。3.2.2 大黄模型组：未找到Cajal间质细胞。神经元、神经胶质细胞、无髓有髓神经、平滑肌细胞可见十分明显的退行性改变。可见大量嗜酸型粒细胞浸润。3.2.3 腹舒胶囊1倍量组、腹舒胶囊3倍量组：神经髓索水肿减轻；平滑肌细胞密体增多；神经胶质细胞病变减轻。3.2.4 通便灵组、自然恢复组：神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞可见明显的退行性变。4 免疫组织化学结果4.1 VIP、SP免疫组化染色半定量分析结果：大黄模型组免疫反应性较正常对照组明显降低（P<0.01）；腹舒胶囊1倍量组、腹舒胶囊3倍量组免疫反应性较大黄模型组、通便灵组及自然恢复组均明显增高（P<0.05）；腹舒胶囊3倍量组与腹舒胶囊1倍量组相比，免疫反应性无明显差异<WP=6>（P>.05）；通便灵组、自然恢复组与大黄模型组对比，免疫反应性无明显差异（P>0.05）。4.2 对VIP、SP免疫组织化学图像分析的结果与半定量分析一致。结论1、应用大黄制备STC大鼠模型是探讨STC发病机制和研究开发STC新药的一个较好模型。2、ENS损伤与STC的发生、发展关系密切。3、长期应用蒽醌类泻剂对ENS有明显的损害作用，并可引起结肠肌间神经丛神经递质的变化。4、腹舒胶囊可促进结肠肌间神经丛神经递质数量及功能恢复，可促进结肠肌间神经丛病理变化的恢复；其治疗作用，可能与其促进结肠ENS结构及功能的恢复有关。5、腹舒胶囊在治疗STC方面具有较好的疗效，且多项指标优于阳性对照药通便灵胶囊。
二、胃针麻手术中肌间神经丛内三磷酸腺苷酶活性的组织化学观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胃针麻手术中肌间神经丛内三磷酸腺苷酶活性的组织化学观察（论文提纲范文）
（1）钙离子敏感受体激动剂R568对小鼠胃运动和摄食的影响及潜在机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要实验仪器 |
| 3 主要实验药品 |
| 4 试剂配制 |
| 5 实验设计 |
| 6 脑冰冻切片的制备 |
| 7 胃肌间神经丛铺片的制备 |
| 8 荧光免疫组织化学染色 |
| 9 胃排空的测定 |
| 10 辣椒素阻断迷走神经实验 |
| 11 电生理实验 |
| 12 平滑肌条收缩实验 |
| 13 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 14 摄食量的测定 |
| 15 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 R568 灌胃对小鼠胃排空的影响 |
| 2 R568 灌胃对小鼠CaSR/Ch AT和 CaSR/nNOS免疫阳性神经元表达的影响 |
| 3 R568 灌胃对小鼠去粘膜层胃组织内Ach/NO表达量的影响 |
| 4 迷走传入神经在R568 改变小鼠胃排空中的影响 |
| 5 R568 灌胃对小鼠NTS中c-fos表达的影响 |
| 6 R568 灌胃对小鼠血清和胃组织中胃泌素表达量的影响 |
| 7 R568 对离体胃肌条收缩的影响 |
| 8 CaSR在胃体和胃窦肌间神经丛内的表达情况 |
| 9 CaSR与c-kit在胃肌间神经丛的表达 |
| 10 R568 对起搏ICC放电频率和幅度的影响 |
| 11 R568 灌胃对小鼠摄食量的影响 |
| 12 R568 灌胃对小鼠血清及胃肠道组织内摄食相关肽含量的影响 |
| 13 R568 灌胃对小鼠下丘脑核团c-fos免疫阳性神经元表达的影响 |
| 14 实验设计思路及主要研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 胃肠道CaSR的生理功能及其在胃肠疾病中的作用 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）Gsα在平滑肌功能障碍疾病中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ血管平滑肌Gsα在腹主动脉瘤小鼠模型中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文ⅡGsα在小肠平滑肌收缩功能中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的SCI论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（3）瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 WIRS诱导AGML和DRG、胃组织和胃黏膜中TRPA1和SP表达上调 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 第二部分 HC-030031有效减轻WIRS诱导的AGML和抑制DRG、胃组织和胃黏膜中SP的释放 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 第三部分 AITC诱导AGML和DRG、胃组织和胃黏膜中SP释放 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 综述一、瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1) |
| 参考文献 |
| 综述二、P物质（Substance P，SP） |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及参与科研工作 |
| 致谢 |
（4）疏肝健脾方对肝郁脾虚型FD大鼠胃黏膜及平滑肌功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 现代医学对功能性消化不良的研究进展 |
| 一、发病趋势 |
| 二、发病机制 |
| 三、FD的治疗进展 |
| 第二节 中医对FD的认识和研究现状 |
| 一、当代中医对FD病因病机的研究 |
| 二、当代中医对FD的临床研究 |
| 第三节 胃肠激素与胃黏膜分泌及平滑肌运动功能 |
| 一、胃肠激素与胃黏膜分泌功能 |
| 二、胃肠激素与平滑肌运动功能 |
| 第四节 回顾与评价 |
| 第二章 动物实验部分 |
| 第一节 肝郁脾虚型FD大鼠模型建模及评价 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 第二节 大鼠胃排空实验 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 第三节 血浆中VIP、SP含量测定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 第四节 胃体黏膜中VIP2R、SP2R、MLCK表达测定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 第五节 平滑肌细胞中IP_3、cAMP、Ca~(2+)含量测定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结 |
| 第三章 讨论 |
| 第一节 对功能性胃肠疾病的几点思考 |
| 一、重视功能性胃肠疾病,突破二元论束缚 |
| 二、重视社会心理因素,开展多样化治疗 |
| 第二节 慢性应激与中医肝郁脾虚证内涵的探讨 |
| 第三节 从胃肠神经内分泌系统探讨FD发病机制及中药作用机制 |
| 一、胃肠神经内分泌系统及其特点 |
| 二、FD发病机制探讨 |
| 三、中药疏肝健脾方治疗FD疗效机制探讨 |
| 第四章 结语 |
| 一 结论 |
| 二 创新性 |
| 三 问题及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件1:统计学鹏合辆月 |
| 详细摘要 |
（5）IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRCT |
| 英文缩略语 |
| 综述一 IBS-D危险因素及其发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 IBS-D的病因病机及辨证分型研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述三IBS-D动物模型的国内外研究现状 |
| 参考文献 |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 腹湾型肠易激综合征大鼠模型制作方法的探索 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IBS-D肝郁脾虚证大鼠模型结肠和脑的蛋白质组学研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（6）槟榔对脾胃气滞小鼠胃肠起搏细胞的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 甘草诱导的脾胃气滞小鼠模型的建立 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 槟榔对脾胃气滞小鼠结肠 Cajal 间质细胞形态、结构、分布及其与肠神经关系的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 槟榔对脾胃气滞小鼠结肠 Cajal 间质细胞 c-kit 及一氧化氮合酶的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 工作总结 |
| 致谢 |
（7）便塞通合剂治疗慢传输型便秘的作用及机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：肠神经系统在慢传输型便秘中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）伴高脂血症重症急性胰腺炎大鼠的胃肠传输及肌间神经丛形态学改变的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 高脂血症重症急性胰腺炎大鼠模型的建立与评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 高脂血症 SAP 大鼠胃肠传输及肌间神经丛形态改变的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 志谢 |
| 附录一. 重症急性胰腺炎胃肠激素变化及其对胃肠道动力的影响 |
（9）人食管下括约肌舒缩功能的调节机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 人食管下括约肌舒缩功能的调节机制 |
| 引言 |
| 第一部分 人食管下括约肌毒蕈碱受体的药理学性质 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人食管下括约肌毒蕈碱受体的表达规律 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一氧化氮介导人食管下括约肌舒张的作用机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 神经型一氧化氮合酶在人食管下括约肌的表达规律 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 神经型一氧化氮合酶和胆碱乙酰转移酶在人食管下括约肌的分布规律 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 M受体与消化道平滑肌 |
| 综述二 一氧化氮与消化道平滑肌 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠VIP、SP的影响及其与结肠肌间神经丛病理变化的相关性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠VIP、SP的影响及其与结肠肌间神经丛病理变化的相关性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、胃针麻手术中肌间神经丛内三磷酸腺苷酶活性的组织化学观察（论文参考文献）
- [1]钙离子敏感受体激动剂R568对小鼠胃运动和摄食的影响及潜在机制探讨[D]. 金婷婷. 青岛大学, 2021
- [2]Gsα在平滑肌功能障碍疾病中的作用和机制研究[D]. 秦小腾. 山东大学, 2019(09)
- [3]瞬时受体电位锚蛋白1和P物质在急性胃黏膜损伤中的作用及机制研究[D]. 徐岩. 中国人民解放军海军军医大学, 2018(01)
- [4]疏肝健脾方对肝郁脾虚型FD大鼠胃黏膜及平滑肌功能的影响[D]. 郝尧坤. 广州中医药大学, 2014(01)
- [5]IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价[D]. 张北华. 中国中医科学院, 2013(02)
- [6]槟榔对脾胃气滞小鼠胃肠起搏细胞的影响[D]. 吴燕敏. 南京医科大学, 2012(02)
- [7]便塞通合剂治疗慢传输型便秘的作用及机理研究[D]. 杜丽娟. 川北医学院, 2011(11)
- [8]伴高脂血症重症急性胰腺炎大鼠的胃肠传输及肌间神经丛形态学改变的研究[D]. 叶源春. 福建医科大学, 2008(01)
- [9]人食管下括约肌舒缩功能的调节机制[D]. 温士旺. 河北医科大学, 2006(11)
- [10]腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠VIP、SP的影响及其与结肠肌间神经丛病理变化的相关性[D]. 李红岩. 河北医科大学, 2004(04)