一、绵羊肠毒血症的病原分离与鉴定（论文文献综述）
韩四娥[1]（2021）在《牛A型产气荚膜梭菌分离鉴定与疫苗菌株筛选》文中提出本文对取自内蒙古、山西、四川等地奶牛场22头猝死牛肠、肝、肺、心等135份病料,划线10%绵羊鲜血琼脂平板初步分离培养,出现双溶血环菌落平板42个,从中选取106个单菌落（菌株）进行产气荚膜梭菌分型PCR检测,检出103个菌株为A型产气荚膜梭菌,3个菌株为C型产气荚膜梭菌。对103个菌株扩繁培养,经菌液毒素毒力（小鼠最小致死量）测定,获得毒力≤0.1m L菌株30株,后经进一步筛选,获得1株毒力（小鼠最小致死量）≤0.025m L、纯粹检验合格的菌株,命名为CNM0708株。对筛选CNM0708菌株进一步进行培养特性、生化鉴定、血清型鉴定、分子生物学、毒力传代稳定性、动物致病性、免疫原性等鉴定。结果表明,该菌株为革兰氏阳性粗大杆菌,两端钝圆,培养菌液毒素的小鼠MLD≤0.025m L。血平板厌氧培养24h,出现半透明、灰白色的圆形菌落,菌落周围有明显α、β双溶血环。石蕊牛乳培养基培养出现“爆烈发酵”现象;生化鉴定结果符合产气荚膜梭菌生化特性;对培养菌液提取毒素进行血清中和试验,符合A型产气荚膜梭菌血清型特性。筛选CNM0708菌株经16S r DNA基因测序结果及α毒素基因核苷酸序列与Genbank上公布的参考菌株比对,同源性分别达99.70%、98.1%～100%。CNM0708菌株培养菌液对牛,及提取毒素对牛、兔、鼠有致病性,均可引起接种动物死亡。将筛选CNM0708菌株制备种子批,扩量培养菌液,经灭活脱毒、离心与上清液浓缩后制备免疫原性试验抗原,免疫实验动物兔,一免后21日采血,测定每0.1m L血清中和效价达1;对靶动物牛二次免疫后14d,免疫牛5头与对照牛2头分别颈静脉攻击致死量A型产气荚膜梭菌毒素。对照牛2/2死亡,免疫牛5/5保护。本试验分离、筛选CNM0708菌株为A型产气荚膜梭菌,免疫原性良好,可作为疫苗研发用菌株。
李健伟[2]（2021）在《G蛋白偶联受体120抗产气荚膜梭菌感染的作用及其机制研究》文中研究指明产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,又称魏氏梭菌）是重要的人畜共患病病原菌,严重危害畜牧养殖业发展和人类健康,是全球重要的公共卫生问题之一。由于单耐、多耐药菌株大量出现、耐药谱扩大以及多种血清型混合感染等,亟需新型预防和治疗手段。G蛋白偶联受体120（G-protein coupled receptor 120,GPR120）作为膜蛋白受体,具有典型的7次跨膜结构特征,通过激活胞内G蛋白和信号转导分子,进而引发生物学效应。目前,关于GPR120生物学功能的报道主要集中于作为ω-3脂肪酸受体参与调控肥胖、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝以及某些自身炎症性疾病等的发生。尽管已经对GPR120功能有了一定认识,但对于其在抗感染免疫反应中的功能和作用机制仍然知之甚少。病原菌的感染性和致病力很大程度上取决于病原菌与宿主免疫系统的相互作用,仅从病原角度考虑很难对其进行有效防控。天然免疫是宿主防御病原感染的第一道防线,研究机体的抗感染免疫反应,找到干预靶标,有利于疾病的防控。本课题研究了GPR120在宿主防御产气荚膜梭菌感染中的作用。利用WT和GPR120-/-小鼠构建产气荚膜梭菌肌肉感染（气性坏疽）模型,首先分析GPR120是否影响宿主对产气荚膜梭菌的易感性。结果发现,与WT小鼠相比,GPR120-/-小鼠对产气荚膜梭菌气性坏疽更为易感,主要表现为肌肉组织中荷菌量更多,病理损伤更为严重以及募集了大量中性粒细胞和巨噬细胞。此外,产气荚膜梭菌感染显着促进WT小鼠肌肉组织中细胞因子/趋化因子IL-1β、TNF-α和KC的表达,但与WT小鼠相比,GPR120-/-小鼠肌肉组织中IL-1β的表达水平显着减少,TNF-α表达水平无明显差异,KC表达水平显着增加。上述结果说明,GPR120参与了宿主抗产气荚膜梭菌感染的免疫防御,能抑制产气荚膜梭菌增殖,减轻组织病理损伤,在宿主防御产气荚膜梭菌感染中发挥着不可或缺的保护作用。由于GPR120在产气荚膜梭菌感染小鼠肌肉组织中主要表达于募集的炎性细胞,还发现GPR120表达于巨噬细胞,且产气荚膜梭菌能显着上调其表达,故以小鼠巨噬细胞作为体外研究的主要细胞,以明确GPR120限制产气荚膜梭菌感染的分子机制。基于体内研究结果,产气荚膜梭菌感染后,与WT小鼠相比,GPR120-/-小鼠肌肉组织中炎性细胞因子IL-1β的表达水平显着减少,而非炎性体信号介导的促炎细胞因子TNF-α表达水平无明显差异。与此同时,近年来研究表明NLRP3炎性体在宿主防御病原微生物感染方面发挥重要作用,因此我们分析GPR120介导的抗感染保护作用是否依赖于NLRP3炎性体信号。结果表明,GPR120缺失显着抑制产气荚膜梭菌诱导的K+依赖性NLRP3炎性体信号活化。同时,我们利用WT和NLRP3-/-小鼠构建产气荚膜梭菌气性坏疽模型,对比分析GPR120和NLRP3的抗感染作用。结果发现,与GPR120-/-小鼠相类似,NLRP3-/-小鼠对产气荚膜梭菌气性坏疽较WT小鼠更为易感,主要表现为肌肉组织病理损伤更为严重、荷菌量更多、大量的炎性细胞浸润以及IL-1β的表达水平显着减少,TNF-α表达水平无明显差异,KC表达水平显着增加。此外,GPR120和NLRP3缺失均抑制巨噬细胞对产气荚膜梭菌的清除杀伤能力,并表现出趋同效应。上述结果说明,GPR120介导的抗感染保护作用依赖于NLRP3炎性体。已知NLRP3炎性体的激活需要2个信号:信号I阶段主要通过IL-1R1、TLRs、TNFR1、TNFR2等配体来激活NF-κB信号通路,促进NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β等表达;信号II阶段主要为NLRP3炎性体的装配,介导细胞焦亡并剪切分泌具有生物活性的IL-1β和IL-18到细胞外。结果发现,GPR120缺失并不影响NLRP3、pro-IL-1β、GSDMD-FL和ASC等蛋白表达,但显着抑制ROS产生、ASC斑点的形成以及K+依赖性NLRP3炎性体活化。上述结果说明,GPR120调控NLRP3炎性体信号并不依赖于对第一信号的调节作用,而是依赖于对第二信号的调节作用,具体机制有待进一步验证。综上所述,本研究证明GPR120参与宿主抗产气荚膜梭菌感染的免疫防御,能抑制产气荚膜梭菌增殖和组织病理损伤,且GPR120介导的抗感染保护作用依赖于NLRP3炎性体,发现产气荚膜梭菌病新的潜在干预靶标,为后续深入开展靶向GPR120信号用于防治动物和人产气荚膜梭菌病的药物及疫苗研发和临床用药提供理论和实验基础。
马迎晖[3]（2021）在《陕西部分牛养殖场和屠宰场产气荚膜梭菌的分离鉴定及PFGE分析》文中认为产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种引起人兽共患病的重要病原体,在自然界中广泛存在,引起人气性坏疽和人食物中毒、动物肠毒血症及坏死性肠炎,对健康养殖和食品安全造成了很大困扰。本研究采集2个养殖场养殖环节及挤奶环节和1个屠宰场屠宰及分割环节的样品,通过分离鉴定产气荚膜梭菌,确定其血清型,并应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对本实验室分离鉴定的300株菌进行分析,揭示产气荚膜梭菌在牛养殖、挤奶及屠宰过程中的分布、污染关键控制点及传播规律。获得以下结果:1.养殖场采样313份,阳性率为27.91%,养殖环节分离率为27.91%（36/129）,挤奶环节分离率为40.76%（75/184）,分离到252株A型菌,85.32%携带aty.cpb2毒素基因。屠宰场采样102份,阳性率为35.29%,屠宰环节分离率为38.33%,分割环节分离率为30.95%,包括38株A型菌和37株D型菌,其中86.67%携带aty.cpb2,37.33%携带cpe。所有菌株均不携带cons.cpb2。陕西省牛养殖场流行菌株为A型菌,屠宰场流行菌株为A型和D型菌。2.对牛养殖场和屠宰场共300株菌进行PFGE聚类分析,所有菌株相似度在46.4%～100%之间。根据相似度≥90%将300株菌划分为154个基因型,分离菌株具有遗传多样性,同一养殖场、屠宰场或场间牛只携带的部分菌具有相同PFGE型,陕西养殖场和屠宰场中流行的产气荚膜梭菌有7个优势PFGE基因型。相似度为100%的亚型有37个,其中有30个亚型菌株间血清型毒素型相同,说明PFGE型相同时菌株间血清型和毒素型大概率（81.1%）相同。3.养殖环节粪便是工具和饲料污染的主要原因;挤奶环节体表携带的菌及人员操作不卫生是奶样污染的主要原因,主要来源为体表,通过空气、器具、人员进行传播;屠宰加工环节剥皮和分割刀具是牛肉产气荚膜梭菌污染的主要原因,牛肉的污染来自养殖环节的粪便并通过屠宰加工的进程进行传播。产气荚膜梭菌突破了养殖场和屠宰场的细菌防控屏障污染牛奶和牛肉,对消费者健康造成威胁。综上所述,本研究明确了陕西部分地区养殖场及屠宰场产气荚膜梭菌的污染情况和优势血清型,并应用PFGE技术探明陕西部分地区牛养殖场和屠宰场产气荚膜梭菌优势PFGE基因型及其污染控制关键点,为有效防控产气荚膜梭菌的污染和传播提供科学依据。
李常挺[4]（2020）在《广西肉牛新发再发疫病的诊断和病原分析》文中研究表明近年来广西肉牛产业呈现快速发展的良好态势,随着牛只存栏数量的增长和饲养密度的增大,疫病发生的风险也越来越大。为了了解并掌握广西肉牛的疫病流行与发生情况,发现新的疫病以及过去曾严重流行得到控制、现在又重新危害养牛业的再发疫病,2018-2019年在广西肉牛肉羊创新团队疫病控制专家团队带领下,通过临床接诊、现场采样、病理剖检和类症鉴别方法,结合实验室诊断,发现了4种可能危害产业发展的重要疫病病原,现将结果报告如下:1、牛丘疹性口炎病毒。发病犊牛体温正常、表现流涎、口腔糜烂,无异物接触和口腔损伤史。刮取病牛齿龈糜烂充血增生物和痂皮病料,PCR检测口蹄疫病毒、病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛流行热病毒均为阴性;该病料样品扩增出91 bp的条带,测序结果与Gen Bank的牛丘疹性口炎病毒基因序列比对,其核苷酸同源性为95.56%,表明样品含有牛丘疹性口炎病毒,结合发病犊牛的临床特征性症状,可以确定该犊牛感染牛丘疹性口炎病毒而引起发病。2、牛乳头瘤病毒。病牛的特征性临床症状主要是在头部、颈部和背部皮肤出现明显的瘤状物,突出于皮肤表面,大小不一,椰菜花样,最大的瘤状物直径可达8 cm,精神、食欲、体温等均无异常。瘤状物压片镜检未发现寄生虫,涂片染色镜检也未见细菌。瘤状物制作的病理组织切片观察可见表皮和真皮增生、癌细胞呈梭形或星形,癌巢中心细胞角化过度,呈同心圆状结构,形成典型的癌珠。PCR检测瘤状物病料为牛乳头瘤病毒阳性。设计5对引物扩增病毒全基因组,胶回收PCR产物,克隆,筛选阳性质粒送测序。采用生物学软件MEGA对获得的全基因组序列进行分析,发现其与牛乳头瘤病毒-1型处在同一分支。3、牛源志贺氏菌。某牛场突发一起高热不退、呼吸急促、腹泻拉血便的急性病例,病牛死亡前表现前后脚划动、似游泳的神经症状。从病死牛的肠道中分离获得1株革兰氏阴性杆菌,经表型特征、16Sr RNA基因序列比对和生化试验,鉴定是志贺氏菌。以0.5麦氏比浊菌浓度进行小鼠致病力试验,接种细菌的10只健康小鼠24 h内全部死亡,死亡率100%。体外抑菌试验结果表明,头孢噻肟钠、头孢曲松钠和环丙沙星对该菌有作用,临床联合应用头孢曲松钠和环丙沙星,有效减少牛只的急性死亡。4、A型产气荚膜梭菌。2019年4-10月,广西百色、合浦、河池、北海、南宁等地出现牛突发的急性猝死病例,现场病理剖检可见死亡牛腹部明显膨胀,十二指肠和空肠出血,肠系膜淋巴结充血肿大,肺出血。从上述5个病例的肠粘膜内容物中均分离获得革兰氏阳性粗大杆菌,经表型特征、生化试验和产气荚膜梭菌特异性引物PCR鉴定,该菌为A型产气荚膜梭菌;其他脏器均未分离出细菌。接种分离菌的10只健康小鼠36 h全部死亡,死亡率100%。体外抑菌试验结果表明,分离菌对青霉素、头孢噻肟钠、头孢拉定钠、头孢曲松钠和氨苄西林5种药物敏感。结论:通过对4类病例的病原检测,结合资料查新,可以确定牛丘疹性口炎病毒、牛乳头瘤病毒、牛源志贺氏菌为广西肉牛新发疫病的病原。A型产气荚膜梭菌为广西肉牛再发疫病的病原。这4种新发再发病原对广西肉牛养殖具有一定潜在的威胁,下一步的工作重点将对病原学开展深入研究和研发新型快捷检测技术,为广西肉牛疫病防控提供技术支撑。
苗永强[5]（2020）在《产气荚膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析》文中研究表明产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）又称魏氏梭菌（C.welchii）,呈杆状,革兰阳性菌,广泛存在于自然界中,是一种危害性较强的人畜共患病病原体,主要引起人和多种动物的食物中毒,创伤性坏疽或气性坏疽,分泌性、坏死性或者出血性肠炎,肠毒血症,痢疾等。该病具有发病急、病程短、死亡率高的特点,经常会导致动物的急性死亡,对人类健康及养殖业具有较大的威胁。产气荚膜梭菌本身并无侵袭力,致病性主要由其分泌外毒素作用所致。根据4种主要毒素α（CPA）、β（CPB）、ε（Etx）、iota（Cpi）的产生情况将产气荚膜梭菌划分为A、B、C、D、E 5种毒素型。由于产气荚膜梭菌所致的疾病具有发病急、病程短的特点,往往不能及时发现,导致常规药物很难得到理想效果,疫苗是最主要的预防手段。当前广泛使用的疫苗主要为多联苗。这些疫苗主要成分为灭活菌体或者是类毒素或者是将其混合组成,其具有一些缺点如抗原成分复杂,有效抗原成分少,易引起免疫副反应,重组疫苗可能是一个解决方案。已有研究证明表达产气荚膜梭菌α毒素C末端CPA247-370能够赋予小鼠高的保护率;具有H106P突变的ε毒素(rETXH106P)的毒性显着降低,且依然具有相当的免疫原性,具有成为基因工程疫苗候选蛋白的潜力;本实验室前期研究证明,β毒素(CPB108-305)具有多个抗原表位、毒性显着降低,而且诱导的保护水平与灭活β毒素类毒素疫苗无明显差异。鉴于以下三方面的原因:（1）α、β、ε毒素广泛存在于五种毒素型中;（2）产气荚膜梭菌往往是多种毒素联合致病;（3）重组多价毒素保护效力高于单价毒素。因此我们用基因工程手段将这三种毒素(CPA247-370、CPB108-305、rETXH106P)串联表达,预防多种毒素型的感染。在本研究中我们用柔性氨基酸将其串联,成功构建了Cp-abx(CPA247-370-CPB108-305-rETXH106P)。毕赤酵母（P.pastoris）真核系统具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰功能,我们尚不清楚重组融合蛋白Cp-abx(CPA247-370-CPB108-305-rETXH106P)是否存在一些需要修饰的潜在的特殊结构,这些翻译后修饰对于其免疫原性有何影响。此外,大肠杆菌（E.coli）原核表达系统已广泛作为外源基因的表达工具,虽然不具有翻译后修饰功能,但也有诸多优点如表达量高、操作简单。本研究选用毕赤酵母（P.pastoris）真核系统及大肠杆菌（E.coli）原核表达系统来表达Cp-abx(CPA247-370-CPB108-305-rETXH106P)。在体内体外评估了重组蛋白的安全性,发现重组蛋白安全稳定。将两种重组蛋白与弗氏不完全佐剂充分混合作为免疫原免疫小鼠,评价两种重组蛋白的免疫效果,筛选出适合的表达系统。此外,松花粉多糖具有免疫调节作用,在小鼠免疫期间口服松花粉多糖以评价其效果。本实验设计的Cp-abx融合基因序列交由公司分别根据大肠杆菌与毕赤酵母的密码子偏好进行优化后合成。将合成后的基因分别经PCR扩增后克隆到Blunt3载体中,之后转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株并扩增,经PCR与测序鉴定正确之后,用两种内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别将pET-28a（+）空质粒和Blunt3-Cp-abx双酶切,并用T4 DNA连接酶连接并转化到到DH5α感受态细胞进行鉴定,鉴定正确后扩增,提取质粒并用热激法转化到BL21（DE3）感受态细胞中,鉴定正确后命名为pET-28（a）-Cp-abx。同时将空质粒也转入BL21（DE3）感受态细胞中作为阴性对照命名为pET-28（a）-vector。在毕赤酵母中选用pPIC9分泌型表达质粒,融合片段正确连接pPIC9表达质粒之后,用限制性核酸内切酶SacⅠ将其与空质粒进行单酶切线性化,用电转化法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中,阳性转化子鉴定正确并命名为pPIC9-Cp-abx。空质粒作为阴性对照,命名为pPIC9-vector。将pET-28（a）-Cp-abx进行扩增,并在对数生长期前加入IPTG进行诱导,分别取诱导后0、1、2、3、4、5和6 h的菌液,4℃离心,收集上清与菌体并超声破碎,发现融合蛋白以包涵体形式存在。同样,将构建好的pPIC9-Cp-abx用甲醇进行诱导表达,并取0、1、2、3和4d的菌液,4℃离心,收集上清与菌体。SDS-PAGE分析表明,在两种表达体系下的蛋白凝胶层析中都出现了分子大小是71.15 kDa的目的条带,Western Blotting印迹分析进一步证明了SDS-PAGE中的目标条带与目标蛋白相对应,且重组大肠杆菌诱导表达后蛋白主要以包涵体形式存在;重组毕赤酵母诱导表达后蛋白主要在上清中,为分泌表达。将表达蛋白进行镍柱纯化,之后再用SDS-PAGE检测,只有71.15kDa单一目的条带。此外,融合蛋白在毕赤酵母中的表达量低于在大肠杆菌中的表达量。将纯化后的蛋白用BCA法测量蛋白浓度后与IFA佐剂等比例混合并搅拌均匀,制成相同浓度的免疫原。将180只5-6周龄SPF小鼠平均分为6组,分别接种pPIC9-Cp-abx;pPIC9-Cp-abx且口服PPPS;pET28a（+）-Cp-abx;pET28a（+）-Cp-abx且口服PPPS;商品疫苗（羊三联四防疫苗）和磷酸盐缓冲液对照组（PBS）。每隔一周免疫一次,连续免疫三周。随后我们检测了抗体水平,外周血淋巴细胞转化率以及外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞的数目。此外,检测了外周血以及小肠中细胞因子（IL-2,IL-4,IFN-γ）的水平,并用攻毒保护试验评价了重组蛋白的保护效果。实验结果显示,毕赤酵母和大肠杆菌表达的重组蛋白添加佐剂,在免疫期间口服松花粉多糖能够诱导与商品疫苗同等的保护力（100%,6/6）,且显着优于其他组,此外,未口服松花粉多糖的重组融合蛋白组也显示出较高水平的保护率（83.3%,5/6）。本研究将实验室前期筛选出的与β毒素具有相似免疫效果的保护性抗原表位与已有研究证明的α和ε的有效抗原表位进行串联,经密码子优化后分别表达于大肠杆菌和毕赤酵母中,研究证明二者表达出来的蛋白安全无毒,均能诱导机体的免疫保护,对小鼠有显着的保护作用。此外,松花粉多糖具有一定的免疫增强作用,在一定程度上增强了机体的免疫应答。另外,在大肠杆菌中表达的量高于在毕赤酵母中表达的量,而诱导的保护水平无明显差异,这说明毕赤酵母中的一些翻译后修饰并不会显着改变Cp-abx的诱导的免疫保护水平。我们推荐将大肠杆菌作为融合蛋白表达的优选的表达宿主,具有作为预防产气荚膜梭菌疫苗的潜力。本研究为产气荚膜梭菌新型疫苗的研究提供了理论基础。
李昌明[6]（2020）在《C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗的制备及其免疫效果评价》文中指出梭菌病是由梭菌属（Clostridium）中致病性菌种引起的疾病的总称。通常包括产气荚膜梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌等。其中对于我国威胁最大的便是产气荚膜梭菌和腐败梭菌。梭菌病发病急促,病程短,死亡率高。动物一旦发病往往来不及治疗便发生死亡。因而免疫接种是预防本病的最为直接有效的方法。目前国内的三联四防疫苗其主要抗原成分多为菌体或类毒素,而腐败梭菌作为一种严格厌氧菌,本身的培养难度大,产毒能力弱,使得疫苗的防护能力大打折扣。通过基因工程表达的重组腐败梭菌α毒素可以保留天然毒素的免疫原性,同时生产工艺简单,可以用于三联四防疫苗的升级换代。因此,本研究拟制备C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗。在本研究中,对C型产气荚膜梭菌（NCTC 3180）和D型产气荚膜梭菌（NCTC 8346）进行复苏、增菌和产毒。利用一次性细菌滤器过滤除菌获得毒素溶液。并利用本实验室构建完成的表达重组腐败梭菌α毒素的质粒通过原核表达系统生产重组蛋白。将C、D型产气荚膜梭菌天然毒素和重组腐败梭菌α毒素按一定比例混合后经过甲醛灭活后,加入白油佐剂制得二联二价疫苗。对制备的疫苗进行物理性状检查、无菌检查、安全性检查和动物保护试验。结果表明,上述所制备的毒素在用终浓度为0.3%的甲醛灭活96 h后能够完全灭活,且能够保持良好的抗原性。制备的二价二联疫苗检验结果符合中华人民共和国兽用生物制品质量标准。在对小鼠免疫0.2 mL疫苗后,保护率可达100%。对6-7月龄的绵羊接种5 mL疫苗21天后,通过间接ELISA和毒素中和试验对绵羊血清中抗体效价水平进行评估,发现绵羊血清中抗C型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:3200,抗D型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:6400,抗腐败梭菌毒素的抗体效价为1:6400;而中和效价分别为400,800和800。根据《中国兽药典》2010年版三部的规定,血清中和效价对快疫达到1（即0.1 mL免疫动物血清可中和1 MLD毒素）,对肠毒血症达到3（即0.1 mL免疫动物血清可中和3 MLD毒素）,即可判为疫苗合格。说明本实验所制备的疫苗效价高且安全可靠,可以用于针对牛羊等反刍动物的梭菌病的预防,并未为将来研制三联四防疫苗打下基础。
张秀坤[7]（2020）在《腐败梭菌α毒素阻断ELISA抗体检测方法的建立》文中研究指明腐败梭菌（Clostridium septium）是人的气性坏疽以及猪、马、牛、羊、鸡、鹿等多种动物的恶性水肿病的主要病原,产生的α毒素（Clostridium septicum alpha toxin,CSA）是其分泌的几种外毒素中最主要致死性毒力因子和免疫原,具有溶血活性,能够导致机体细胞坏死。腐败梭菌感染羊引起羊快疫,发病羊病程多呈急性经过,发病后迅速死亡,病死率高,给我国畜牧业带来巨大经济损失。疫苗免疫是防治羊快疫的主要手段,由于缺乏体外抗体检测方法。该类疫苗免疫后效果评价多采用血清-毒素中和后经尾静脉注射小鼠,根据小鼠死亡情况判定血清中和抗体效价的方法,该方法操作繁琐,难以用于临床大量样本的免疫效果评价。为此,本研究拟通过制备腐败梭菌α毒素单克隆抗体,建立腐败梭菌α毒素阻断ELISA检测方法,以期用快速、简便、高通量的体外检测方法替代动物检验法,用于疫苗的效力检验及疫苗免疫后效果评价。本研究采用原核表达系统,通过缺失腐败梭菌α毒素的第212222位共11个氨基酸序列,使其丧失毒力,对腐败梭菌重组α毒素无毒突变体进行体外表达,目的蛋白主要以可溶性形式表达。将表达的蛋白进行纯化,获得浓度为0.76mg/mL的目的蛋白,经Western blot鉴定该重组α毒素蛋白具有良好的反应原性。提取腐败梭菌天然α毒素,制备类毒素后以30 MLD/只小鼠的剂量免疫BALB/c小鼠,经三次基础免疫后测定血清效价,选取效价较高的小鼠进行加强免疫并融合,使用体外表达的重组α毒素蛋白以间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选并对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,最终获得七株强阳性单克隆杂交瘤细胞株,其中374、333、932、443和447五株杂交瘤细胞对腐败梭菌天然α毒素识别能力较强。经亚型鉴定,374、333和932三株为IgG,其余为IgM或IgA,中和试验结果表明仅932株具有中和活性。因此对932株单抗进行腹水制备及辛酸硫酸铵沉淀法纯化,纯化后浓度为3.02mg/mL;经间接ELISA检测,效价可达1:256000。利用获得的单克隆抗体初步建立阻断ELISA检测方法,通过方阵滴定实验对最佳抗原包被条件、最佳封闭方式、最佳抗体作用条件、酶标二抗作用时间、显色液作用时间等分别进行了筛选和优化,确定最佳抗原包被条件为以4μg/mL的浓度在4℃条件下包被12h,最佳封闭方式为5%脱脂乳37℃条件下封闭2h,最佳抗体作用条件为将单抗进行1:512000稀释后37℃孵育45min,酶标二抗作用条件为1:15000倍稀释后37℃孵育45min,显色液作用条件为室温避光显色15min。在确定最佳反应条件后,检测实验室保存的90份经小鼠中和试验验证的阴性羊血清样品,确定该阻断ELISA方法的阴、阳性临界值。重复性试验结果表明,该方法具有良好的批内和批间重复性。阻断ELISA试验与小鼠中和试验和细胞中和试验的相关性测定结果表明,阻断ELISA检测结果与两种中和试验检测结果呈正相关,且阻断ELISA检测方法的敏感性高于中和试验。本研究以腐败梭菌天然α毒素为免疫原,重组表达的α毒素无毒突变体蛋白为筛选抗原,成功制备出1株特异性高、反应性强且具有中和活性的单克隆抗体,在此基础上建立了腐败梭菌α毒素阻断ELISA检测方法,并对其特异性及敏感性进行了验证,有望用于羊快疫灭活疫苗的效力检验及疫苗免疫后效果评价。
史客松[8]（2020）在《产气荚膜梭菌β1毒素诱导巨噬细胞焦亡机制的研究》文中进行了进一步梳理产气荚膜梭菌广泛分布于自然界,作为一种重要的条件性致病菌,可引起人类及动物食物中毒、创伤性气性坏疽、坏死性肠炎和肠毒血症等传染性疾病。该菌产生的多种外毒素在其致病性中扮演了重要角色;对毒力因子的细胞毒性机理进行深入研究,将为治疗、诊断产气荚膜梭菌病提供治疗靶点和防控战略。其中β1毒素是该菌产生的主要致死性毒素之一。产气荚膜梭菌β1毒素可引起出血性、坏死性肠炎和肠毒血症等炎症性疾病。而细胞焦亡是一种伴随着炎性因子释放的程序性死亡方式。产气荚膜梭菌β1毒素导致宿主炎性因子释放是否由细胞焦亡所产生,目前尚未见报道。因此,本研究利用基因重组技术获得纯化的重组产气荚膜梭菌β印毒素（rCPB1）,对其毒性进行了初步检测。通过分析rCPB1作用巨噬细胞后,焦亡相关信号分子的表达变化,探究β1毒素是否刺激细胞发生焦亡并释放炎性因子;建立了 RAW264.7细胞的Caspase 1干扰模型,对rCPB1引起的巨噬细胞焦亡途径进行进一步探究,为揭示产气荚膜梭菌β1毒素激活巨噬细胞焦亡,进而引发机体炎症性疾病的可能机制提供理论依据。主要取得了以下研究结果/:（1）利用基因重组技术,获得重组β1毒素蛋白的大肠杆菌表达菌株,对表达条件进行优化后,获得rCPB1包涵体;对包涵体蛋白进行变复性与纯化,去除内毒素后对小鼠单核巨噬白血病细胞（RAW264.7）和人单核巨噬细胞（THP-φ）进行细胞毒性检测,其ID50分别约为25 μg/mL和22μg/mL,实验结果表明成功获得具有生物学毒性的rCPB1蛋白。（2）rCPB1蛋白作用RAW264.7、THP-φ和小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）后,细胞内NLRP3、Caspase 1、GasderminD、IL-18和IL-1β等焦亡相关信号分子表达水平上调;表明rCPB1诱导巨噬细胞发生焦亡。（3）利用RNA干扰技术建立了 RAW264.7细胞的Caspasel干扰细胞模型;Caspase 1的表达下调后,可相对减轻rCPB1处理后RAW264.7的质膜的破裂,减少细胞内空泡的形成,Caspase 1、GasderminD、IL-18和IL-1β等焦亡相关信号分子的表达比未干扰组有所下调,说明rCPB1可能通过依赖于Caspase 1的经典细胞焦亡途径诱导RAW264.7细胞发生焦亡。综合以上实验结果,我们推测rCPB1作用巨噬细胞后,可促进NLRP3炎性小体的组装,活化Caspase 1前体,活化后的Caspase 1剪切Gasdermin D,进而形成质膜孔道,导致炎性因子IL-18 和 IL-1β 的释放,造成巨噬细胞焦亡。该研究结果将为产气荚膜梭菌 β1 毒素的细胞毒性机理提供新的研究方向。
朱凯宗[9]（2019）在《山东地区鹿肠毒血症的综合诊断及致病性研究》文中指出魏氏梭菌,又称产气荚膜梭状芽孢杆菌,属于芽孢杆菌科,梭状芽孢杆菌属,魏氏梭菌种,属温和厌氧菌,革兰阳性、两端钝圆的大杆菌,属于典型的条件致病菌。该菌能产生多种外毒素或酶类,目前发现的外毒素多达12种（α、γ、ε、θ、κ、μ和ν）,四种毒素（α、β、ε和ι）起主要致病作用,根据细菌产生的毒素不同,可将此菌分为A–E五个血清型。该菌会引起猪、牛、鸡坏死性肠炎或是肠毒血症等。本文对鹿肠毒血症病例进行综合诊断,并对分离菌株进行致病性试验。山东某地区发生了鹿的突然死亡,发病鹿群具有典型的鹿肠毒血症临床症状,鹿群发病急,死亡率高达50%以上,患者均为营养较好的青壮年鹿,死亡鹿均表现为腹部膨气。病理剖检,尸僵完全,黏膜发绀;各脏器出现出血斑或弥漫性出血。病理组织学检测结果发现大量细胞多发生坏死,肠道以弥漫性出血为主。镜检肠内容物的涂片,可见到一种革兰氏阳性、有荚膜的粗大杆菌。厌氧环境下培养后在TSC琼脂平板上,形态为圆形、突起、表面光滑,菌落中央呈黑色。卵黄琼脂平板上生长呈灰色至灰黄色、表面光滑半透明的圆形菌落,菌落周围及底部形成乳白色的混浊带。细菌生化试验鉴定结果发现与产气荚膜梭菌结果一致。经过多重PCR鉴定,产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果发现只在324bp处出现一条亮带。与NCBI的参考株序列进行序列比对,发现12个分离株的序列与其它已发表的产气荚膜梭菌序列同源性在97%以上,说明分离株为A型产气荚膜梭菌。试验中我们将肠毒素和分离得到的A型产气荚膜梭菌进行了致病性试验,发现该菌对小鼠和雏鸡同样具有很强的致病性。通过对流行鹿产气荚膜梭菌的分型,发现目前流行较多的依然是A型产气荚膜梭菌。
张汇宁[10]（2019）在《山东省泰安市不同来源的鸡产气荚膜梭菌分离鉴定、耐药性及基因分型研究》文中指出产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是动物和人类重要的细菌病原体。可以通过产生各种外毒素引起人类食物中毒,也能使鸡致病形成坏死性肠炎（NE）。为了调查泰安市部分养鸡场及零售鸡产品中产气荚膜梭菌的流行特征,本研究从泰安市6个不同养鸡场采集疑似坏死性肠炎样品以及两批淘汰蛋鸡样品,同时在泰安市禽产品交易市场采集零售鸡产品样品。通过选择性培养基进行产气荚膜梭菌的分离,利用PCR方法鉴定分离菌株的主要毒素基因。药物敏感纸片扩散法（Kirby-Bauer氏法）用于分离菌株的耐药性研究。使用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）的方法,对部分分离菌株进行分型分析。在采集的420份样品中,共分离出209株产气荚膜梭菌,阳性率30.7%。其中包括零售鸡产品分离得到153株;疑似坏死性肠炎样品25株;淘汰鸡31株。PCR结果显示:所有的分离株均为A型产气荚膜梭菌,并且β2毒素基因检出率为11.5%,比相关报道的检出率低。药敏试验结果显示:菌株对庆大霉素的耐药率最高,达到87%;其次是杆菌肽,达到73%;林可霉素耐药率也在50%以上。淘汰鸡分离株的多重耐药率达到100%,最高出现5重耐药;疑似坏死性肠炎分离株出现85%的多重耐药率,最高出现7重耐药;禽产品交易市场的鸡源分离株有70%的多重耐药性,最高出现6重耐药。MLST技术用于分离菌株的分型分析,参照文献中已建立的方法,对其中的34株产气荚膜梭菌进行分型,结果呈现出24种ST型,4个克隆复合群。为了更好地研究分离菌株的遗传演化关系,本研究从GenBank数据库中下载了11株鸡源产气荚膜梭菌用于比对分析,并产生了10种新的ST型。为了评估鸡源产气荚膜梭菌污染可能带来的公共卫生学风险,本研究同时加入了5株来自本次采样的禽产品交易市场摊主的粪便分离株。结果显示:来源鸡的产气荚膜梭菌MLST分型呈现多样化,但克隆簇CC-2菌株在所分析菌株中是一个流行的基因型,占比总分析菌株的38%;优势ST型为ST-4,占比总分析菌株的18%,来自同一只疑似坏死性肠炎病鸡不同部位的分离株表现出单一ST型。在不同摊位销售的部分鸡肝、鸡心分离株出现同一个ST型。人源菌株形成了5个新的ST型。分离自人的菌株与部分来自零售鸡产品的菌株亲缘关系相近,位于同一克隆群中,提示可能某一类基因型的产气荚膜梭菌菌株在人和鸡之间存在流行传播现象。
二、绵羊肠毒血症的病原分离与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绵羊肠毒血症的病原分离与鉴定（论文提纲范文）
（1）牛A型产气荚膜梭菌分离鉴定与疫苗菌株筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌病概述 |
| 1.2 A型产气荚膜梭菌 |
| 1.2.1 形态学特征 |
| 1.2.2 培养特性 |
| 1.2.3 生化特性 |
| 1.2.4 定型血清中和特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 诊断与防控 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 参考菌株及定型血清 |
| 2.1.4 培养基的配制 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病原分离、培养、镜检 |
| 2.2.2 PCR分型鉴定 |
| 2.2.3 菌种划线纯分离 |
| 2.2.4 小鼠最小致死量(Minimum Lethal Dose,MLD)测定 |
| 2.2.5 纯粹检验 |
| 2.2.6 筛选菌株 |
| 2.2.7 主要培养特性鉴定 |
| 2.2.8 生化鉴定 |
| 2.2.9 定型血清鉴定(毒素中和试验) |
| 2.2.10 细菌16S rDNA基因测序与α毒素基因核苷酸序列的测定 |
| 2.2.11 毒力传代稳定性试验 |
| 2.2.12 培养菌液对牛的致病性试验 |
| 2.2.13 提取毒素对动物的致病性试验 |
| 2.2.14 免疫原性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病原分离、培养结果 |
| 3.1.1 平板培养 |
| 3.1.2 培养、镜检 |
| 3.2 PCR分型鉴定结果 |
| 3.3 纯分离培养结果 |
| 3.4 小鼠最小致死量(MLD)测定 |
| 3.5 纯粹检验结果 |
| 3.6 菌株筛选结果 |
| 3.7 主要培养特性鉴定 |
| 3.7.1 溶血特性结果 |
| 3.7.2 “爆烈发酵”结果 |
| 3.8 生化鉴定结果 |
| 3.9 定型血清中和结果 |
| 3.10 细菌16S rDNA基因测序与α毒素基因核苷酸序列的测定结果 |
| 3.10.1 细菌16S rDNA基因测序结果 |
| 3.10.2 α毒素基因测序结果 |
| 3.11 毒力传代稳定性试验结果 |
| 3.12 培养菌液致病性试验结果 |
| 3.13 分离株毒素对动物致病性试验结果 |
| 3.13.1 对兔致病性试验结果 |
| 3.13.2 对牛致病性试验结果 |
| 3.14 免疫原性试验结果 |
| 3.14.1 兔免疫原性试验结果 |
| 3.14.2 牛免疫原性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）G蛋白偶联受体120抗产气荚膜梭菌感染的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简介 |
| 1.2 GPR120 的研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 GPR120 在产气荚膜梭菌感染中的作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 GPR120 限制产气荚膜梭菌感染的分子机制初探 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 致谢 |
（3）陕西部分牛养殖场和屠宰场产气荚膜梭菌的分离鉴定及PFGE分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 牛养殖场和屠宰场产气荚膜梭菌污染及检测研究进展 |
| 1.1 产气荚膜梭菌概述 |
| 1.2 产气荚膜梭菌在养殖业中的流行情况 |
| 1.3 肉的产气荚膜梭菌污染及防控措施 |
| 1.4 细菌分子生物学分型技术 |
| 1.5 PFGE产气荚膜梭菌分型及溯源的应用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 牛养殖场和屠宰场产气荚膜梭菌的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 样品处理与增菌培养 |
| 2.2.3 细菌纯化及鉴定 |
| 2.2.4 细菌血清型鉴定 |
| 2.2.5 毒素基因检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 产气荚膜梭菌的分离鉴定 |
| 2.3.2 纯化菌株血清型鉴定结果 |
| 2.3.3 毒素基因检测结果 |
| 2.3.4 养殖环节样品中产气荚膜梭菌分离情况 |
| 2.3.5 挤奶环节样品中产气荚膜梭菌分离情况 |
| 2.3.6 屠宰环节样品中产气荚膜梭菌分离情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 产气荚膜梭菌分离株的PFGE分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 菌株 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细菌培养 |
| 3.2.2 制备小胶块 |
| 3.2.3 细胞裂解 |
| 3.2.4 清洗胶块 |
| 3.2.5 酶切 |
| 3.2.6 脉冲场凝胶电泳 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛养殖过程中分离菌株的PFGE分析结果 |
| 3.3.2 牛挤奶过程中分离菌株的PFGE分析结果 |
| 3.3.3 牛屠宰过程中分离菌株的PFGE分析结果 |
| 3.3.4 牛养殖场和屠宰场中产气荚膜梭菌分离株的PFGE分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）广西肉牛新发再发疫病的诊断和病原分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肉牛业的发展概况 |
| 1.2 新发再发疫病的定义 |
| 1.3 肉牛新发再发疫病的研究状况 |
| 1.3.1 牛丘疹性口炎研究进展 |
| 1.3.2 牛乳头瘤研究进展 |
| 1.3.3 志贺氏菌病研究进展 |
| 1.3.4 产气荚膜梭菌病研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 牛丘疹性口炎的诊断和病原分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 样品来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床检查与样品采集 |
| 2.2.2 引物合成及PCR扩增 |
| 2.2.3 牛丘疹性口炎病毒基因序列测定及同源性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床检查结果 |
| 2.3.2 PCR扩增结果 |
| 2.3.3 牛丘疹性口炎病毒基因核苷酸序列测定及同源性分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 牛乳头瘤的诊断和病原分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 样品来源 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病变观察和显微镜检查 |
| 3.2.2 病理组织切片的制作 |
| 3.2.3 PCR扩增 |
| 3.2.4 BPV全基因组测序数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病变观察和显微镜检查结果 |
| 3.3.2 病理组织切片观察结果 |
| 3.3.3 PCR扩增结果 |
| 3.3.4 BPV全基因组测序数据分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 牛源志贺氏菌的诊断和病原分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 病料来源及试验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 发病情况调查及病理剖检 |
| 4.2.2 细菌分离培养 |
| 4.2.3 细菌16Sr RNA基因扩增及遗传进化分析 |
| 4.2.4 生化试验 |
| 4.2.5 药敏试验 |
| 4.2.6 致病性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 发病情况调查及病理剖检结果 |
| 4.3.2 细菌分离培养结果 |
| 4.3.3 细菌16Sr RNA基因扩增及遗传进化分析结果 |
| 4.3.4 生化试验结果 |
| 4.3.5 药敏试验结果 |
| 4.3.6 致病性试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 牛产气荚膜梭菌的诊断和病原分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器设备 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 病料来源及试验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 流行病学调查 |
| 5.2.2 细菌分离培养 |
| 5.2.3 生化试验 |
| 5.2.4 药敏实验 |
| 5.2.5 致病性试验 |
| 5.2.6 病理组织切片的制作 |
| 5.2.7 细菌PCR扩增和产气荚膜梭菌毒素分型鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 流行病学调查结果 |
| 5.3.2 细菌分离结果 |
| 5.3.3 生化试验结果 |
| 5.3.4 药敏试验结果 |
| 5.3.5 致病性试验结果 |
| 5.3.6 病理切片观察结果 |
| 5.3.7 细菌PCR扩增和产气荚膜梭菌毒素分型鉴定结果 |
| 5.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）产气荚膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简介 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌的生物学特性 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌的基因组学 |
| 1.1.3 产气荚膜梭菌的主要毒素 |
| 1.1.4 产气荚膜梭菌的致病性 |
| 1.1.5 产气荚膜梭菌的检测技术 |
| 1.1.6 产气荚膜梭菌的防治 |
| 1.2 产气荚膜梭菌疫苗 |
| 1.3 重组蛋白表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 松花粉多糖研究概述 |
| 1.4.1 多糖的生物活性 |
| 1.4.2 松花粉多糖研究现状 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 主要培养基及其配制 |
| 2.2 Cp-abx融合蛋白抗原决定簇软件分析 |
| 2.3 大肠杆菌表达载体PET28a-abx的构建 |
| 2.3.1 重组产气荚膜梭菌Cp-abx基因合成与扩增 |
| 2.3.2 重组产气荚膜梭菌Cp-abx基因克隆及测序 |
| 2.3.3 重组pET28a(+)-Cp-abx表达载体的构建 |
| 2.3.4 大肠杆菌阳性转化子的构建 |
| 2.3.5 大肠杆菌诱导表达、鉴定和纯化 |
| 2.3.6 大肠杆菌Cp-abx融合蛋白SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 2.3.7 大肠杆菌Cp-abx融合蛋白纯化及含量测定 |
| 2.4 毕赤酵母表达载体pPIC9-abx的构建 |
| 2.4.1 重组毕赤酵母Cp-abx基因扩增 |
| 2.4.2 重组产气荚膜梭菌Cp-abx基因克隆及测序 |
| 2.4.3 pPIC9-Cp-abx重组表达载体的构建 |
| 2.4.4 毕赤酵母阳性转化子的构建 |
| 2.4.5 Cp-abx融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定及纯化 |
| 2.4.6 Cp-abx融合蛋白SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 2.4.7 Cp-abx融合蛋白纯化和含量测定 |
| 2.5 产气荚膜梭菌毒素提取 |
| 2.5.1 菌种复苏 |
| 2.5.2 生长曲线绘制 |
| 2.5.3 产气荚膜梭菌外毒素的提取 |
| 2.5.4 SDS-PAGE检测产气荚膜梭菌毒素蛋白 |
| 2.5.5 粗提毒素的半数致死量(LD50)测定 |
| 2.6 融合蛋白与粗提毒素毒性对比分析 |
| 2.6.1 体内毒性分析 |
| 2.6.2 体外毒性分析 |
| 2.7 Cp-abx融合蛋白免疫效果评价 |
| 2.7.1 免疫原制备 |
| 2.7.2 安全性检验 |
| 2.7.3 动物免疫试验 |
| 2.7.4 数据分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 Cp-abx融合蛋白抗原决定簇软件分析 |
| 3.2 大肠杆菌表达载体PET28a-abx的构建 |
| 3.3 Cp-abx融合蛋白在大肠杆菌原核表达、鉴定及纯化 |
| 3.4 毕赤酵母表达载体pPIC9-Cp-abx的构建 |
| 3.5 Cp-abx融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定及纯化 |
| 3.6 Cp-abx融合蛋白纯化和含量测定 |
| 3.7 产气荚膜梭菌毒素提取 |
| 3.8 融合蛋白与粗提毒素毒性分析 |
| 3.8.1 体内毒性分析 |
| 3.8.2 体外毒性分析 |
| 3.9 融合蛋白免疫效果的研究 |
| 3.9.1 血清抗体水平的测定 |
| 3.9.2 血清中细胞因子分泌结果分析 |
| 3.9.3 外周血CD_4~+、CD_8~+淋巴细胞含量的变化 |
| 3.9.4 外周血淋巴细胞转化率的测定 |
| 3.9.5 攻毒保护作用 |
| 3.9.6 组织切片分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
（6）C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗的制备及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 基金资助 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 梭菌属细菌概述 |
| 1.2 产气荚膜梭菌研究进展 |
| 1.3 腐败梭菌研究进展 |
| 1.4 产气荚膜梭菌和腐败梭菌的诊断 |
| 1.5 产气荚膜梭菌和腐败梭菌在国内外的流行情况 |
| 1.6 产气荚膜梭菌和腐败梭菌感染的致病机制及防治措施 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、表达质粒及实验动物 |
| 2.1.2 相关培养基的配制 |
| 2.1.3 相关试剂的配制 |
| 2.1.4 实验所需试剂、材料及引物 |
| 2.1.5 主要实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 C型产气荚膜梭菌天然毒素的获取 |
| 2.2.1.1 C型产气荚膜梭菌参考株的复苏和增菌 |
| 2.2.1.2 C型产气荚膜梭菌革兰氏染色和PCR鉴定 |
| 2.2.1.3 C型产气夹膜梭菌天然毒素的制备 |
| 2.2.1.4 C型产气夹膜梭菌天然毒素的粗提 |
| 2.2.2 D型产气夹膜梭菌天然毒素的获取 |
| 2.2.2.1 D型产气夹膜梭菌参考株的复苏和增菌(同2.2.1.1) |
| 2.2.2.2 D型产气荚膜梭菌革兰氏染色和PCR鉴定(同2.2.1.2) |
| 2.2.2.3 D型产气夹膜梭菌天然毒素的制备(同2.2.1.3) |
| 2.2.2.4 D型产气夹膜梭菌天然毒素的粗提(同2.2.1.4) |
| 2.2.3 腐败梭菌天然毒素的制备 |
| 2.2.3.1 腐败梭菌参考株的复苏 |
| 2.2.3.2 腐败梭菌的革兰氏染色和PCR鉴定 |
| 2.2.3.3 腐败梭菌天然毒素的制备 |
| 2.2.3.4 腐败梭菌天然毒素的粗提(同2.2.1.4) |
| 2.2.4 重组腐败梭菌α毒素的制备 |
| 2.2.4.1 表达重组腐败梭菌α毒素质粒的转化 |
| 2.2.4.2 重组腐败梭菌α毒素蛋白的表达 |
| 2.2.5 天然和重组毒素SDS-PAGE鉴定 |
| 2.2.6 重组腐败梭菌α毒素western-blot检测 |
| 2.2.7 蛋白浓度的测定 |
| 2.2.7.1 各毒素的蛋白浓度的确定 |
| 2.2.7.2 蛋白浓度标准曲线的建立 |
| 2.2.8 天然毒素对于小鼠的最小致死量的测定 |
| 2.3 二价二联疫苗的制备 |
| 2.3.1 毒素的灭活 |
| 2.3.2 二价二联疫苗的制备 |
| 2.3.3 二价二联疫苗的检测 |
| 2.3.3.1 稳定性检测 |
| 2.3.3.2 甲醛及硫柳汞的检验 |
| 2.3.3.3 无菌检验 |
| 2.3.3.4 安全性检验 |
| 2.4 疫苗的效力检验 |
| 2.4.1 疫苗对小鼠的免疫保护效果比较 |
| 2.4.2 疫苗对于绵羊的免疫保护效果检验 |
| 2.4.2.1 间接ELISA法测定绵羊血清抗体含量 |
| 2.4.2.2 毒素中和试验 |
| 3.结果 |
| 3.1 毒素的制备 |
| 3.1.1 C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的复苏 |
| 3.1.2 C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的PCR鉴定 |
| 3.1.3 表达重组腐败梭菌α毒素阳性克隆菌株的筛选 |
| 3.1.4 C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的天然毒素粗提结果 |
| 3.1.5 腐败梭菌天然毒素和重组α毒素的鉴定 |
| 3.1.6 标准蛋白曲线的建立 |
| 3.2 各天然毒素的毒力测定结果 |
| 3.3 类毒素灭活时间测定结果 |
| 3.4 二价二联疫苗的检验 |
| 3.4.1 二价二联疫苗的物理性状检验 |
| 3.4.2 二价二联疫苗的无菌检验 |
| 3.4.3 二价二联疫苗的甲醛和硫柳汞残留量测定 |
| 3.4.4 二价二联疫苗的安全性检验 |
| 3.4.5 二价二联疫苗对于小鼠的保护率结果 |
| 3.4.6 免疫绵羊血清间接ELISA的检测 |
| 3.4.7 免疫绵羊的血清中和试验结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 制备C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌二价二联疫苗的意义 |
| 4.2 外毒素制备过程中温度的选择和灭活处理 |
| 4.3 各毒素的配比 |
| 4.4 重组腐败梭菌蛋白的免疫原性 |
| 4.5 血清抗体消长规律和攻毒保护试验结果的研究 |
| 4.6 C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌抗毒素血清的研究 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 |
（7）腐败梭菌α毒素阻断ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 梭菌属概述 |
| 1.1.1 梭菌属生物特性 |
| 1.1.2 主要致病性梭菌概述 |
| 1.2 腐败梭菌研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 病理变化 |
| 1.2.5 致病机理 |
| 1.2.6 诊断 |
| 1.2.7 防治 |
| 1.3 腐败梭菌α毒素 |
| 1.3.1 α毒素的理化特性及生物学特性 |
| 1.3.2 α毒素的结构与功能 |
| 1.3.3 α毒素的免疫原性 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 腐败梭菌α毒素制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 腐败梭菌天然α毒素制备 |
| 2.3.2 重组腐败梭菌α毒素无毒突变体制备 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 腐败梭菌天然α毒素制备 |
| 2.4.2 重组腐败梭菌α毒素无毒突变体制备 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂与耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠免疫 |
| 3.3.2 细胞融合 |
| 3.3.3 单克隆抗体筛选 |
| 3.3.4 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.3.5 单克隆抗体针对抗原表位鉴定 |
| 3.3.6 细胞中和试验 |
| 3.3.7 单克隆抗体的大量制备 |
| 3.3.8 单克隆抗体的纯化及效价测定 |
| 3.3.9 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.3.10 单克隆抗体亲和常数测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 小鼠免疫 |
| 3.4.2 细胞融合 |
| 3.4.3 阳性杂交瘤孔的克隆 |
| 3.4.4 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.4.5 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.4.6 单克隆抗体针对抗原表位鉴定 |
| 3.4.7 中和试验 |
| 3.4.8 腹水制备 |
| 3.4.9 单克隆抗体纯化效果鉴定 |
| 3.4.10 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.4.11 单克隆抗体亲和常数测定结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 阻断ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 主要试剂与耗材 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 制备包被抗原 |
| 4.3.2 阻断ELISA基本操作步骤 |
| 4.3.3 最佳抗原包被浓度以及阴、阳性血清工作浓度的确定 |
| 4.3.4 单抗以及酶标抗体工作浓度的确定 |
| 4.3.5 包被液以及包被条件的确定 |
| 4.3.6 封闭液以及封闭条件的确定 |
| 4.3.7 单克隆抗体作用条件的确定 |
| 4.3.8 底物显色液作用条件的确定 |
| 4.3.9 阴阳性临界值的确定 |
| 4.3.10 特异性试验 |
| 4.3.11 重复性试验 |
| 4.3.12 阻断ELISA与细胞中和试验相关性测定 |
| 4.3.13 阻断ELISA与小鼠中和试验相关性测定 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 最佳抗原包被浓度以及阴、阳性血清工作浓度的确定 |
| 4.4.2 单抗及酶标抗体工作条件的确定 |
| 4.4.3 包被液以及包被条件的确定 |
| 4.4.4 封闭液以及封闭条件的确定 |
| 4.4.5 单抗作用条件的确定 |
| 4.4.6 底物显色液作用条件的确定 |
| 4.4.7 阴、阳性临界值的确定 |
| 4.4.8 特异性试验 |
| 4.4.9 重复性试验 |
| 4.4.10 阻断ELISA与细胞中和试验相关性 |
| 4.4.11 阻断ELISA与小鼠中和试验相关性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）产气荚膜梭菌β1毒素诱导巨噬细胞焦亡机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩写词对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 产气荚膜梭菌概述 |
| 1.2 产气荚膜β1毒素研究进展 |
| 1.3 细胞焦亡 |
| 1.4 NLRP3炎性小体 |
| 1.5 Gasdermin家族 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 产气荚膜梭菌β1毒素重组蛋白的表达纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 产气荚膜梭菌β1毒素重组蛋白诱导巨噬细胞焦亡的初探 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 产气荚膜梭菌β1毒素重组蛋白诱导巨噬细胞焦亡途径的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）山东地区鹿肠毒血症的综合诊断及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1.1 国内流行状况及危害 |
| 1.2 病原形态及生化特征 |
| 1.3 细菌的类型及毒素的生物学研究 |
| 1.4 致病机制 |
| 1.5 病理学变化 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.7 本试验的研究目的和意义 |
| 试验一 鹿肠毒血症的综合诊断 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 方法与步骤 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病理组织学诊断 |
| 1.4.3 显微镜检查 |
| 1.4.4 生化鉴定检测 |
| 1.4.5 应用多重PCR进行鉴定和分型 |
| 1.4.6 PCR产物胶回收及鉴定 |
| 1.4.7 连接 |
| 1.4.8 DH5α的制备 |
| 1.4.9 转化 |
| 1.4.10 重组质粒鉴定 |
| 1.4.11 测序分析 |
| 1.4.12 药敏试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 流行病学分析 |
| 2.2 临床症状 |
| 2.3 剖检病变 |
| 2.4 病理组织学检测 |
| 2.5 病料涂片镜检结果 |
| 2.6 细菌的分离培养 |
| 2.7 细菌生化鉴定的结果 |
| 2.8 多重PCR鉴定结果 |
| 2.9 同源性及进化分析 |
| 2.10 药敏试验结果 |
| 2.11 干预治疗 |
| 3 讨论 |
| 试验二 鹿产气荚膜梭菌的致病性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 肠内容物毒素测定结果 |
| 2.2 分离菌毒力测定结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）山东省泰安市不同来源的鸡产气荚膜梭菌分离鉴定、耐药性及基因分型研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简述 |
| 1.2 产气荚膜梭菌病流行情况 |
| 1.3 产气荚膜梭菌病的致病机制 |
| 1.4 多位点序列分型 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.1.4 主要试剂及溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 细菌的分离及纯化 |
| 2.2.3 菌种保存 |
| 2.2.4 细菌的形态及生化鉴定 |
| 2.2.5 细菌的DNA模板提取 |
| 2.2.6 血清型鉴定 |
| 2.2.7 毒素基因检测 |
| 2.2.8 药敏试验 |
| 2.2.9 耐药基因检测 |
| 2.2.10 多位点序列分型(MLST) |
| 3 结果 |
| 3.1 菌株分离结果 |
| 3.2 零售鸡产品阳性率 |
| 3.3 选择培养基细菌菌落形态 |
| 3.4 镜检结果 |
| 3.5 PCR鉴定结果 |
| 3.5.1 血清型鉴定 |
| 3.5.2 β2 毒素基因的检测 |
| 3.6 药敏试验结果 |
| 3.6.1 耐药性结果 |
| 3.6.2 耐药基因检测结果 |
| 3.6.3 多重耐药性结果 |
| 3.7 多位点序列分型(MLST) |
| 3.7.1 管家基因扩增 |
| 3.7.2 MLST分析 |
| 3.7.3 MLST与耐药性 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 产气荚膜梭菌分离状况分析 |
| 4.2 毒素基因检测及耐药性 |
| 4.3 多位点序列分型(MLST) |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、绵羊肠毒血症的病原分离与鉴定（论文参考文献）
- [1]牛A型产气荚膜梭菌分离鉴定与疫苗菌株筛选[D]. 韩四娥. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [2]G蛋白偶联受体120抗产气荚膜梭菌感染的作用及其机制研究[D]. 李健伟. 内蒙古大学, 2021(12)
- [3]陕西部分牛养殖场和屠宰场产气荚膜梭菌的分离鉴定及PFGE分析[D]. 马迎晖. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]广西肉牛新发再发疫病的诊断和病原分析[D]. 李常挺. 广西大学, 2020
- [5]产气荚膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析[D]. 苗永强. 山东农业大学, 2020
- [6]C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗的制备及其免疫效果评价[D]. 李昌明. 山东农业大学, 2020(11)
- [7]腐败梭菌α毒素阻断ELISA抗体检测方法的建立[D]. 张秀坤. 中国兽医药品监察所, 2020(09)
- [8]产气荚膜梭菌β1毒素诱导巨噬细胞焦亡机制的研究[D]. 史客松. 宁夏大学, 2020(03)
- [9]山东地区鹿肠毒血症的综合诊断及致病性研究[D]. 朱凯宗. 青岛农业大学, 2019(03)
- [10]山东省泰安市不同来源的鸡产气荚膜梭菌分离鉴定、耐药性及基因分型研究[D]. 张汇宁. 山东农业大学, 2019(01)